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Prétraitement d’un isolat de protéines de lin par haute
pression hydrostatique : impacts sur la structure protéique,
l’hydrolyse enzymatique et les capacités antioxydantes des
hydrolysats finaux
Mémoire
Véronique Perreault
Maîtrise en sciences et technologies des aliments Maître ès sciences (M.Sc.)
Québec, Canada
© Véronique Perreault, 2016
iii
Résumé
Les graines de lin sont des oléagineux largement cultivés au Canada. Cependant,
les résidus générés suite au processus d’extraction de l’huile contiennent une importante
quantité de protéines et peuvent être valorisées dans l’alimentation humaine en raison,
principalement, de certaines fractions peptidiques possédant des propriétés bioactives.
Dans le cadre de ce travail, l’influence des hautes pressions hydrostatiques (HPH) sur un
isolat de protéines de lin a été étudiée concernant les modifications de la structure
protéique, l’hydrolyse enzymatique ainsi que l’activité antioxydante des hydrolysats.
Ainsi, des solutions protéiques de lin (1% m/v) ont été soumises à un traitement de HPH
à 600 MPa pendant 5 et 20 minutes, à 20°C et comparés à des échantillons non-
pressurisés. Deux traitements subséquents d’hydrolyse ont été effectués suite au
traitement ou non de pressurisation : une première hydrolyse trypsique suivie d’une
deuxième par la pronase. Dans un premier temps, la caractérisation de l’isolat protéique
de lin pressurisé et non pressurisé a été réalisée par spectrofluorimétrie et par une analyse
de la taille des particules afin d’étudier l’effet de la pressurisation sur les HPH la matrice
protéique végétale. Par la suite, les hydrolysats protéiques ont été caractérisés par HPLC-
MS et leur capacité antioxydante a été déterminée par ORAC. Les résultats ont démontré
que le niveau de pressurisation et la durée du traitement ont un impact sur la structure
protéique en induisant la dissociation des protéines, et la formation d’agrégats. Ceux-ci
seraient occasionnés par la décompression ou créés durant l’entreposage des isolats. Suite
à l’hydrolyse enzymatique des solutions protéiques pressurisées ou non par la trypsine
seule et par la trypsine-pronase, les analyses chromatographiques ont révélé que la
concentration de certains peptides a été modifiée lorsque la trypsine seule était utilisée
après un traitement à HPH. Enfin, les HPH ont amélioré la capacité antioxydante des
hydrolysats obtenus lors de l’hydrolyse trypsine-pronase comparativement au contrôle
non-pressurisé.
v
Abstract
Flaxseed is an oilseed widely cultivated in Canada. However, residues generated
after oil extraction contains large amount of proteins and then can be much-valued in
human diet due to its bioactive peptide fractions. The influence of high hydrostatic
pressure (HHP) on flaxseed protein isolate was studied especially in terms of protein
structures, enzymatic hydrolysis and final hydrolysate antioxidant activity. Flaxseed
protein solutions (1% w/v) were subjected first to 600 MPa HHP treatments during 5 and
20 minutes at 20°C and were compared to non-pressurized samples. Two subsequent
hydrolysis treatments were performed on pressure or non-pressure treated samples:
tryptic hydrolysis was carried out and another hydrolysis was performed using pronase on
tryptic hydrolysates. Firstly, the characterization of treated and untreated flaxseed protein
isolates was done by spectrofluorometric and particle size analyses. Thereafter, flaxseed
hydrolysates were analyzed by HPLC-MS and antioxidant capacity by ORAC. These
results demonstrated that the pressurizing level and duration had an impact on proteins
structure, inducing the dissociation of protein leading subsequently to aggregates. These
aggregates were formed by decompression or during further storage. After enzymatic
hydrolysis of pressurized or non-pressurized samples by trypsin and trypsin-pronase,
chromatographic analyses showed that HHP treatments modified the concentration of
certain peptides of the tryptic hydrolysates only. Finally, HHP increases antioxidant
capacity (ORAC) of final trysin-pronase hydrolysates when compared to a control.
vii
Table des matières
Résumé .......................................................................................................................................... iii
Abstract .......................................................................................................................................... v
Table des matières ....................................................................................................................... vii
Liste des tableaux ......................................................................................................................... xi
Liste des figures .......................................................................................................................... xiii
Liste des abréviations .................................................................................................................. xv
Remerciements ............................................................................................................................ xix
Avant-propos .............................................................................................................................. xxi
Introduction ................................................................................................................................... 1
Chapitre 1 : Revue de littérature ................................................................................................. 5
1. Les graines de lin ....................................................................................................................... 7
1.1 Utilisations des graines de lin ....................................................................................... 7
1.1.1 En alimentation humaine ................................................................................................ 7
1.1.2 Comme aliments fonctionnels ........................................................................................ 7
1.2 Composition des graines de lin ..................................................................................... 9
1.2.1 L’huile ............................................................................................................................ 9
1.2.2 Les fibres alimentaires .................................................................................................. 10
1.2.3 Les lignanes .................................................................................................................. 10
1.2.4 Les protéines ................................................................................................................. 11
2. Modes de libération des peptides ........................................................................................... 13
2.1 Hydrolyse chimique .................................................................................................... 13
2.2 Fermentation ............................................................................................................... 14
2.3 Hydrolyse enzymatique .............................................................................................. 15
3. Bioactivité des peptides de graines de lin .............................................................................. 18
3.1 Généralités .................................................................................................................. 18
3.2 Propriétés antioxydantes ............................................................................................. 19
3.2.1 Définitions .................................................................................................................... 19
3.2.2 Classification des antioxydants .................................................................................... 21
3.2.2.1 Antioxydants primaires .............................................................................................. 21
3.2.2.2 Antioxydants secondaires .......................................................................................... 23
3.3 Peptides antioxydants ................................................................................................. 25
viii
3.3.1 Peptides antioxydants du lin ......................................................................................... 25
3.3.2 Caractéristiques générales des peptides antioxydants .................................................. 26
4. Hautes pressions hydrostatiques ............................................................................................ 27
4.1 Historique ................................................................................................................... 27
4.2 Principe de fonctionnement ........................................................................................ 29
4.3 Avantages et inconvénients ........................................................................................ 30
4.3.1 Avantages ..................................................................................................................... 30
4.3.2 Désavantages ................................................................................................................ 31
4.4 Impacts sur les protéines ............................................................................................. 31
4.4.1 Principes physiques ...................................................................................................... 32
4.4.2 Liaisons affectées ......................................................................................................... 34
4.4.2.1 Interactions électrostatiques...................................................................................... 34
4.4.2.2 Liaisons hydrophobes ................................................................................................ 35
4.4.2.3 Liaisons hydrogènes .................................................................................................. 35
4.4.2.4 Forces de Van der Waals .......................................................................................... 35
4.4.2.5 Liaisons covalentes .................................................................................................... 36
4.4.3 Impacts sur l’hydrolyse enzymatique des protéines ................................................ 36
Chapitre 2 : Hypothèse et objectifs ............................................................................................ 39
1. Hypothèse ................................................................................................................................. 41
2. Objectifs ................................................................................................................................... 41
Chapitre 3: Pretreatment of flaxseed protein isolate by high hydrostatic pressure: impacts
on protein structure, enzymatic hydrolysis and final hydrolysate antioxidant capacities. ... 43
Résumé ......................................................................................................................................... 45
Abstract ........................................................................................................................................ 47
1. Introduction ............................................................................................................................. 49
2. Materials and methods ............................................................................................................ 51
2.1 Materials ..................................................................................................................... 51
2.2 Flaxseed protein isolate .............................................................................................. 51
2.3 High hydrostatic pressure treatment ........................................................................... 52
2.4 Flaxseed protein hydrolysis ........................................................................................ 53
2.5 Analyses ..................................................................................................................... 53
2.5.1 Electrophoresis ............................................................................................................. 53
2.5.2 Spectrofluorimetry ........................................................................................................ 54
ix
2.5.3 Particle size distribution ............................................................................................... 54
2.5.4 Peptide profiles and molecular weights ........................................................................ 55
2.5.5 Antioxidant activity ...................................................................................................... 55
2.5.6 Statistical analyses ........................................................................................................ 56
3. Results and discussion ............................................................................................................. 56
3.1 Electrophoretic analyses ............................................................................................. 56
3.2 Spectrofluorimetry ...................................................................................................... 58
3.3 Particle size analyses .................................................................................................. 60
3.4 Peptides analyses ........................................................................................................ 61
3.5 Antioxidant capacity ................................................................................................... 65
4. Conclusions .............................................................................................................................. 67
Supplementary material ............................................................................................................. 68
Chapitre 4: Discussion générale, conclusion et perspectives ................................................... 73
1. Retour sur l’hypothèse ............................................................................................................ 75
2. Conclusion ................................................................................................................................ 76
3. Perspectives .............................................................................................................................. 77
Bibliographie ................................................................................................................................ 79
xi
Liste des tableaux
Tableau 1. Composantes fonctionnelles des graines de lin (adapté de Muir & Westcott, 2003) ................................................................................................................................... 8 Tableau 2. Propriétés biologiques des protéines des graines de lin (adapté de Rabetafika et al., 2011) ......................................................................................................................... 9 Tableau 3. Composition en acides aminés de la graine de lin et du soya (adapté de Shim et al., 2014) ....................................................................................................................... 12 Tableau 4. Liste non-exhaustive des enzymes communément utilisées pour l’hydrolyse enzymatique des protéines (adapté de Luna-Vital et al., 2015). ....................................... 16 Tableau 5. Effet de la pression sur le volume des protéines pour les différentes interactions (adapté de Rivalain et al., 2010). ................................................................... 36 Table 6. RP-HP LC and MS results for peaks presenting significant differences after tryptic hydrolysis of controls and HHP samples............................................................... 64 Table 7. RP-HPLC results for peptides obtained by tryptic hydrolysis of untreated flaxseed protein isolate and flaxseed protein isolate exposed to HHP treatment at 600 MPa during 5 and 20 min, respectively. ........................................................................... 69 Table 8. RP-HPLC results for peptides obtained by trypsin+pronase hydrolysis of untreated flaxseed proteins isolate and flaxseed protein isolate exposed to HHP treatment at 600 MPa during 5 and 20 min respectively. ................................................................. 72
xiii
Liste des figures
Figure 1. Caractéristiques générales des protéines de la graine de lin (adaptée de Rabetafika et al., 2011) ..................................................................................................... 11 Figure 2. Propriétés bioactives (non-exhaustives) d’hydrolysats protéiques de lin recensées dans la littérature .............................................................................................. 19 Figure 3. Réaction d’oxydation et mécanisme de transfert d’électron des antioxydants (tiré de Yehye et al., 2015) ................................................................................................ 22 Figure 4. Structures du BHT et BHA ............................................................................... 22 Figure 5. Système de pressurisation de la compagnie Hiperbaric (http://www.hiperbaric.com/en/)....................................................................................... 29 Figure 6. Effet de la présence de cavités à l’intérieur des protéines lors d’un traitement de pressurisation (adapté de Silva et al., 2014) ..................................................................... 33 Figure 7. Effets de la pression dans les phénomènes de dénaturation et de dissociation des protéines (adapté de Silva et al., 2001) (∆V signifie volume de dissociation et les points rouges représentent des molécules d’eau) .............................................................. 34 Figure 8. Non-reducing SDS-PAGE patterns of (a) control and pressure treated flaxseed protein isolate at 600 MPa for (b) 5 min and (c) 20 min. Protein standard marker was run on pattern (d). .................................................................................................................... 57 Figure 9. Tyrosine (a) and tryprophan (b) fluorescence intensities of control and pressure-treated flaxseed isolate at 600 MPa during 5 or 20 min. .................................... 59 Figure 10. Particle size distributions of non-pressurized and pressure-treated flaxseed protein isolate at 600 MPa during 5 or 20 min. ................................................................ 61 Figure 11. RP-HPLC profiles of tryptic hydrolysates of flaxseed protein isolate of (a) control and the three treatments overlaid between retention times of (b) 5 and 30 min, (c) 30 and 50 min and (d) 50 and 62 min. .............................................................................. 63 Figure 12. Antioxidant capacity of non-pressurized and pressure-treated trypsin-pronase flaxseed protein hydrolysates. ........................................................................................... 66
xiv
Figure 13. RP-HPLC profiles of flaxseed protein hydrolysates obtained by hydrolysis with trypsin-pronase of untrated flaxseed protein isolate after 2h of hydrolysis at 40°C and at atmospheric pressure .............................................................................................. 63
xv
Liste des abréviations
ACE : de l’anglais «angiotensin converting enzyme» ou enzyme de conversion de
l’angiotensine
ACS : de l’anglais «American chemical society»
a.u.: de l’anglais «arbitrary unit» ou unité arbitraire
AWA : de l’anglais «acetone, water, acetic acid» ou acetone, eau et acide acétique
β : Bêta
Da : Dalton
EDMF : Électrodialyse avec membrane de filtration
E/S : Ratio enzyme sur substrat
FPH : de l’anglais «flaxseed protein hydrolysate» ou hydroysat protéique de lin
FPI : de l’anglais «flaxseed protein isolate» ou isolat protéique de lin
HCl : Acide chlorhydrique
HPH/HHP : Haute pression hydrostatique ou de l’anglais «high hydrostatic pressure»
kDa : Kilodalton
MPa : Mégapascal
MS : Spectrométrie de masse
m/v : Masse sur volume
m/z : Masse sur charge
N : Normale
NAFs : Aliments fonctionnels et nutraceutiques
NaOH : Hydroxyde de sodium
ORAC : de l’anglais «oxygen radical absorbance capacity» ou capacité
d’absorption des radicaux oxygénés
PAGE : de l’anglais «polyacrylamide gel electrophoresis» ou électrophorèse sur
gel de polyacrylamide
psi : de l’anglais «pound-force per square inch» ou livre force par pouce carré
PTFE : Polytétrafluoroéthylène
RP-HPLC : de l’anglais «reverse phase high performance liquide chromatography» ou
chromatographie liquide à haute performance en phase inverse
xvi
SDS : de l’anglais «sodium dodecylsulfate» ou dodécylsulfate de sodium
TE : de l’anglais «Trolox equivalent» ou équivalent Trolox
TFA : Acide trifluoroacétique
xvii
Le commencement de toutes les sciences,
c’est l’étonnement de ce que les choses
sont ce qu’elles sont.
Aristote
xix
Remerciements
La première personne qui mérite de sincères remerciements est mon directeur de
maîtrise, le Dr. Laurent Bazinet. D’abord merci pour votre confiance, pour m’avoir
accueilli dans votre équipe et pour m’avoir offert un projet aussi intéressant et stimulant.
Votre grande générosité, votre disponibilité, votre écoute et vos précieux conseils ne sont
que quelques-unes de vos qualités. Vous avez su instaurer dans votre équipe une belle
entraide entre les étudiants et une belle atmosphère de travail. Travailler avec vous et
dans votre équipe était un véritable plaisir, qui s’achève trop rapidement. Un grand merci
également à mon co-directeur de recherche, le Dr. Alain Doyen. Vous aussi étiez très
présent pour répondre à mes questions et merci pour vos encouragements. Vos bons
conseils ont su m’aider à faire avancer ce projet, je vous en suis très reconnaissante.
Merci également au Dr. Jean Amiot pour avoir accepté d’évaluer ce mémoire.
Bien que nous n'ayons pas travaillé longuement ensemble, merci Elodie Rozoy
pour l’aide que tu m’as apportée en début de projet. Jacinthe Thibodeau, toujours de
bonne humeur et toujours prête à nous aider. Tu as grandement contribué à ce projet, que
ce soit pour les analyses effectuées ou simplement par les conseils au quotidien. Ta
personnalité pétillante contribuait à ensoleiller mes journées, merci pour toutes ces
conversations, j’espère que nous pourrons les poursuivre.
Merci à Diane Gagnon pour son support technique au laboratoire et à Véronique
Richard pour les analyses effectuées. Merci aussi au Dr. Dominique Michaud de m’avoir
permis de faire des analyses dans son laboratoire et à sa professionnelle de recherche
Marie-Claire Goulet pour son aide précieuse dans la réalisation des expériences.
Un grand merci à Loïc Hénaux, pour l’aide que tu m’as apportée et pour nos
longues discussions sur ce projet, à trouver des solutions et des explications aux
problèmes rencontrés. Ta présence dans ce projet a été aussi très appréciée. Merci aussi à
mes amis de plus longue date, Marjorie, Gabrielle, Laura, Joannie, Carole-Anne et à ceux
que j’ai côtoyé jours après jours pendant la maîtrise et avec qui j’ai eu tant de plaisir,
xx
Alice, Anne-Violaine, Élodie, Laura, Mathieu, Mathilde, Sagar, Sergey, Shyam,
Stéphanie, Valérie, Vanessa et Yolande.
Un énorme merci à ma famille, surtout à mes parents Marie-Claude et Yves, de
même qu’à ma sœur Amélie. Vous m’avez appris que le mérite s’obtient avec le travail et
la persévérance. Merci tellement pour votre support. Merci Maxime, ta présence, ta
compréhension et ton amour sont très importants pour moi.
Enfin, merci au Fonds de recherche du Québec – Nature et technologies
(FRQNT) pour le soutien financier de ce projet.
xxi
Avant-propos
Ce mémoire est composé de quatre chapitres. Les travaux présentés ont été
réalisés sous la direction du Dr. Laurent Bazinet, professeur titulaire et la co-direction du
Dr. Alain Doyen, professeur adjoint, tous deux exerçant au sein du département des
Sciences des aliments de l’Université Laval.
Le premier chapitre est une revue de littérature incluant un portrait général de
l’état des connaissances actuelles sur les graines de lin et leur contenu protéique, sur le
processus d’hydrolyse enzymatique, l’activité antioxydante ainsi que sur le procédé de
haute pression hydrostatique. La problématique associée à cette étude sera également
détaillée à la fin du chapitre, de même que les objectifs.
Le second chapitre présente l’hypothèse de recherche ainsi que les objectifs qui en
découlent en vue de valider cette dernière.
Le troisième chapitre fait l’objet d’un article scientifique soumis pour publication
dans la revue «Food Chemistry» et portant le titre «Pretreatment of flaxseed protein
isolate by high hydrostatic pressure: impacts on protein structure, enzymatic hydrolysis
and final hydrolysate antioxidant capacities». Celui-ci est rédigé en anglais et il est
précédé d’un résumé écrit en français. Les auteurs sont Véronique Perreault, Loïc
Hénaux, Laurent Bazinet ainsi que Alain Doyen. Étant première auteure de l’article, j’ai
procédé aux manipulations en laboratoire, aux analyses, à l’interprétation des résultats, de
même qu’à sa rédaction. Loïc Hénaux, stagiaire et co-auteur a également participé à
certaines manipulations et analyses. Laurent Bazinet, en tant que directeur du projet et
co-auteur, a supervisé les travaux, révisé et corrigé l’article. Enfin, Alain Doyen, dernier
auteur de l’article a aussi supervisé les travaux, révisé et corrigé l’article.
Enfin, le quatrième et dernier chapitre contient une discussion générale, les
conclusions du projet et met de l’avant les nombreuses perspectives intéressantes de ce
projet.
1
Introduction
Le terme «aliment fonctionnel», introduit au Japon au milieu des années 1980, fait
référence aux aliments contenant des ingrédients qui procurent des effets bénéfiques à la
santé, en plus de répondre aux besoins nutritifs de l’organisme. Par la suite, en 1994,
l’Institute of Medecine’s Food and Nutrition Board a défini les aliments fonctionnels
comme étant un aliment ou un ingrédient bénéfique à la santé au-delà des nutriments
qu’il contient (Hasler, 1998). Selon Santé Canada, les aliments fonctionnels sont des
produits qui ressemblent aux aliments traditionnels mais qui démontrent des effets
physiologiques bénéfiques. Les nutraceutiques, quant à eux font partie des produits de
santé naturels (PSN) et sont définis comme des produits dérivés des aliments, utilisés
sous la forme médicinale, par exemple des pilules et qui démontrent également des effets
physiologiques bénéfiques (Shahidi, 2009).
Même si, 2500 ans plus tôt, Hippocrate a proclamé «Que ta nourriture soit ton
médicament et que ton médicament soit dans ta nourriture» (Hasler, 1998; Oomah &
Mazza, 1999), cette expression a encore aujourd’hui beaucoup de sens puisque depuis
environ vingt ans, la demande des consommateurs pour les aliments fonctionnels et
nutraceutiques (NAFs) a nettement augmenté (Basu, Thomas, & Acharya, 2007; Doyen
et al., 2014). L’âge vieillissant de la population, les coûts associés aux soins de santé
grandissants, la demande croissante pour des aliments santé et la règlementation des
aliments sont tous des facteurs qui ont contribué à cet engouement pour les NAFs
(Oomah & Mazza, 1999). De plus, de nombreuses études épidémiologiques ont établi que
les relations entre les habitudes alimentaires et les risques de maladies avaient un impact
direct sur la santé. En effet, certaines maladies telles le diabète de type II, différents types
de cancers, les maladies cardiovasculaires et dégénératives affectent un grand nombre de
personnes et sont reliées aux habitudes alimentaires (Espin et al., 2007). Les
consommateurs sont donc de plus en plus conscientisés à cette réalité. Certains aliments
d’origine végétale sont reconnus pour réduire le risque d’occurrence de ces maladies.
2
Ainsi, augmenter la consommation ou consommer des NAFs d’origine végétale est donc
recommandé (Espin et al., 2007).
Les graines de lin sont des oléagineux largement cultivés dans le monde et le
Canada est l’un des principaux pays producteurs avec une production de 816 000 tonnes
en 2014-2015 (Flax council of Canada, 2015; Udenigwe & Aluko, 2011). Ces graines
gagnent de plus en plus en popularité en raison de leurs composantes nutritionnelles
(Udenigwe & Aluko, 2011). Les graines de lin sont une excellente source d’acide α-
linolénique, de fibres alimentaires et de lignanes (Udenigwe et al., 2009). De plus, ces
oléagineux sont riches en lysine, en arginine et en acides aminés ramifiés. Les graines de
lin, compte tenu de leurs composantes, peuvent donc être considérées comme des
aliments fonctionnels ou nutraceutiques. Leur incorporation dans l’alimentation par le
biais d’aliments riches en graines de lin, apportant des avantages bénéfiques et
spécifiques pour la santé est très intéressante. L’Institut National du Cancer aux États-
Unis utilise même le terme «designer foods» pour qualifier les composantes de la graine
de lin en raison de tous les bénéfices qu’elles peuvent apporter à l’organisme (Singh et
al., 2011). En effet, selon diverses études, les graines de lin ont une influence positive sur
la prévention de certains cancers (Udenigwe & Aluko, 2010 ; Hasler, 1998). Elles ont
également des propriétés anti-inflammatoires (Oomah, 2001) et inhibitrices de l’enzyme
de conversion de l’angiotensine (Dodin et al., 2008). Par ailleurs, certaines études ont
démontré que lorsque les protéines des graines de lin sont hydrolysées sous forme de
peptides, ceux-ci présentent différentes bioactivités (Doyen et al., 2014; Marambe et al.,
2008; Udenigwe & Aluko, 2010). L’hydrolyse enzymatique est la dégradation des
protéines en peptides, sous l’action d’une ou plusieurs enzymes (Chalamaiah et al.,
2012). À cet effet, Doyen et al. (2014) ont rapporté que les protéines de lin,
lorsqu’hydrolysées avec la trypsine et la pronase pouvaient libérer des peptides ayant des
activités anti-diabétique et antihypertensive. De plus, Marambe et al. (2008) ainsi
qu’Udenigwe & Aluko (2010) ont déterminé que des hydrolysats de protéines de lin,
générés par différentes enzymes (flavourzyme, thermolysine, papaïne, ficine, alcalase et
pronase), présentent des capacités antioxydantes. Les antioxydants agissent au niveau
cellulaire afin de réduire la concentration en radicaux libres, molécules produisant des
3
dommages aux cellules et aux tissus, ce qui se traduit par l’apparition de certaines
maladies (diabète, athérosclérose, etc.) (Alashi et al., 2013; de Castro & Sato, 2015;
Makinen et al., 2012). Malgré ces études, à ce jour, les protéines des graines de lin ne
sont pas utilisées de façon optimale dans l’alimentation humaine.
Certaines études ont rapporté que l’hydrolyse enzymatique des protéines de lin
produit des peptides bioactifs. Toutefois l’hydrolyse enzymatique conventionnelle
d’hydrolysats protéiques présente toujours des inconvénients concernant leur processus
d’élaboration. En effet, l’hydrolyse enzymatique est un processus long, qui génère de
faibles rendements d’hydrolyse et qui utilise des enzymes coûteuses (Buyn & Kim,
2001). Une technologie appelée traitement à hautes pressions hydrostatiques (HPH) est
apparue à l’échelle industrielle à la fin des années 1980 au Japon comme technologie
novatrice de conservation des aliments afin de remplacer le procédé d’ionisation (Datta &
Deeth, 1999; Doyen, 2012; Tonello, 1998). Cependant, puisque les aliments sont des
matrices complexes, diverses études se sont rapidement penchées sur l’impact des HPH
sur les protéines. En effet, il a été observé que les HPH provoquaient la coagulation des
protéines du blanc d’œuf (Royer, 2002; Silva et al., 2014; Tonello, 1998). Plus
récemment, diverses études effectuées sur la β-lactoglobuline (Knudsen et al., 2002;
Penas et al., 2006) et sur des protéines végétales telles que le soya (Penas et al., 2004), le
pois (Chao et al., 2013) ou la lentille (Garcia-Mora et al., 2015) ont montré une
augmentation de l’hydrolyse enzymatique des protéines lorsque celles-ci étaient
préalablement soumises à un traitement à HPH. Ainsi, l’utilisation des HPH pourrait être
une solution efficace pour augmenter et faciliter l’hydrolyse enzymatique des protéines.
L’effet des HPH sur une matrice protéique se traduit par une augmentation du nombre de
peptides générés, donc du degré d’hydrolyse, en raison d’un dépliement partiel des
protéines, offrant ainsi différents sites de clivage aux enzymes et permettant la liaison
plus facile avec les protéines (Knudsen et al., 2002; Stapelfeldt et al., 1996). De même,
puisque ce traitement permet l’augmentation du degré d’hydrolyse, différentes études ont
également rapporté une augmentation de l’activité bioactive des peptides générés, par
exemple l’activité antioxydante (Zhang et al., 2012) ou l’activité inhibitrice de la rénine
et de l’enzyme de conversion de l’angiotensine (ACE) (Chao et al., 2013).
4
Dans ce contexte, le but de cette étude est d’améliorer les rendements d’hydrolyse
en peptides antioxydants par l’ajout d’un prétraitement à HPH des protéines. Ainsi
l’objectif général est d’étudier l’impact d’un prétraitement des protéines de lin par HPH
avant l’étape d’hydrolyse enzymatique sur la concentration finale de peptides
antioxydants. Les objectifs spécifiques seront donc d’étudier les effets des HPH sur la
structure protéique de même que sur les profils peptidiques et l’activité antioxydante
obtenus après hydrolyse enzymatique avec la trypsine et trypsine-pronase.
5
Chapitre 1
Revue de littérature
7
1. Les graines de lin
Les graines de lin font partie des premières plantes cultivées de façon domestique.
Cependant, cela ne fait que quatre cents ans que le lin est apparu en Amérique du Nord
lorsque des immigrants européens en ont apporté en Nouvelle-France, lors de la
colonisation (Muir & Westcott, 2003). Les graines de lin sont donc utilisées par l’être
humain depuis des milliers d’années et ont des utilisations très variées. Ces graines
possèdent aussi plusieurs composantes nutritionnelles intéressantes.
1.1 Utilisations des graines de lin
1.1.1 En alimentation humaine
Depuis l’an 1000 avant l’ère commune, les graines de lin ont été consommées
dans les plats à base de céréales par plusieurs civilisations. Encore aujourd’hui, dans les
marchés nord-américains, les graines de lin, sous différentes formes peuvent être
retrouvées : graines de lin entières, l’huile de lin et mêmes des aliments ayant des graines
de lin volontairement rajoutées. Concernant l’huile contenue dans les graines de lin, cette
dernière est utilisée depuis plusieurs milliers d’années mais c’est dans la première moitié
du vingtième siècle que l’huile de lin est devenue une source d’huile comestible en
Europe et en Amérique du Nord (Muir & Westcott, 2003).
1.1.2 Comme aliments fonctionnels
L’effet médicinal des graines de lin est connu depuis de très nombreuses années.
En effet, autour de 500 ans avant l’Ère commune, Hippocrate a exprimé que les graines
de lin permettaient de soulager les douleurs abdominales. Au premier siècle, Tacitus a
évoqué les vertus des graines de lin et au huitième siècle, Charlemagne, convaincu de
8
leur importance, a mis sur pied des lois afin d’exiger leur consommation (Flax council of
Canada, 2015; Goyal et al., 2014).
Les graines de lin sont maintenant considérées comme des aliments fonctionnels
car elles contiennent des nutriments et des composantes qui favorisent la santé et qui
peuvent prévenir certaines maladies. Ces composantes sont les fibres alimentaires, l’acide
α-linolénique, les lignanes (Muir & Westcott, 2003), de même que les protéines (Oomah,
2001; Rabetafika et al., 2011; Shim et al., 2014).
Les tableaux suivants présentent les constituants des graines de lin ayant des
propriétés biologiques importantes. Le Tableau 1 présente les propriétés biologiques des
composantes des graines de lin, tandis que le Tableau 2 présente les propriétés
biologiques des protéines des graines de lin seulement.
Tableau 1. Composantes fonctionnelles des graines de lin (adapté de Muir & Westcott, 2003)
Composantes des graines de lin Bénéfices sur la santé
Fibres alimentaires Fibres solubles Réduction du cholestérol total sanguin Réduction du glucose sanguin Fibres insolubles Effet laxatif Acide alpha-linolénique* Réduction du cholestérol total sanguin Réduction de la production d’éicosanoïdes dérivés de l’acide
arachidonique Réduction de l’inflammation Réduction du risque de maladie coronarienne Réduction du risque d’accident vasculaire cérébral Lignanes Prévention du cancerǂ Notes *L’acide alpha-linolénique est l’acide gras omega-3 essentiel ǂDonnées sur les effets anticancer des lignanes sont disponibles seulement sur les animaux
9
Tableau 2. Propriétés biologiques des protéines de graines de lin (adapté de Rabetafika et al., 2011)
Propriétés biologiques Réference
Anti-cholestérol and anti-hyperglyceridémie Marambe et al. (2008) Anti-hypertensif Marambe et al. (2008); Udenigwe & Aluko (2010) Antioxidant Udenigwe et al. (2009); Udenigwe & Aluko (2010) Anti-inflammatoire Udenigwe et al. (2009) Contre les maladies neurodégénératives Omoni & Aluko (2006) Anti-fongique Xu et al. (2008) Effet antithrombotique Tolkachev & Zhuchenko (2000)
1.2 Composition des graines de lin
1.2.1 L’huile
Les acides gras des graines de lin sont extraits et concentrés lors de la production
d’huile. En effet, l’huile, concentrée dans les embryons, est généralement retirée des
graines par pression à froid ou par une extraction à l’aide de solvants (Singh et al., 2011).
Comparativement aux autres huiles végétales, l’huile de lin contient la plus grande teneur
en acides gras oméga-3, soit l’acide α-linolénique (Gebauer et al., 2006; Marambe et al.,
2008; Udenigwe & Aluko, 2011). En effet, les graines de lin sont composées de 35 à 45%
d’huiles et 45 à 52% de ce pourcentage représente l’acide α-linolénique. Les graines de
lin contiennent également d’autres acides gras, tels que l’acide oléique, l’acide linoléique,
l’acide palmitique ainsi que l’acide stéarique, mais en plus faibles proportions (Singh et
al., 2011). De plus, la composition de l’huile de lin est faible en acides gras saturés,
modérée en acides gras monoinsaturés et riche en acides gras polyinsaturés, ce qui en fait
une huile de qualité, contenant les acides gras essentiels à l’organisme (Singh et al.,
2011).
10
1.2.2 Les fibres alimentaires
Les graines de lin sont également une excellente source de fibres alimentaires et
représentent environ 28% des graines de lin sur une base sèche (Muir & Westcott, 2003).
Les fibres alimentaires des graines de lin peuvent se décomposer en fibres solubles et
insolubles. Les proportions des fibres solubles et insolubles varient entre 20:80 et 40:60
(Muir & Westcott, 2003; Singh et al., 2011). La majeure partie de la fraction insoluble
consiste en de la cellulose et de la lignine, tandis que la fraction soluble est constituée
principalement de gommes de mucilage. Les gommes de mucilage comptent pour 8% du
poids des graines de lin et sont constituées de polysaccharides (L-rhamnose, L-galactose,
L-fructose, D-xylose et L-arabinose par exemple) qui deviennent visqueux lorsqu’ils sont
mélangés avec de l’eau ou d’autres fluides ayant des propriétés laxatives (Goyal et al.,
2014; Shim et al., 2014, Singh et al., 2011).
1.2.3 Les lignanes
Les lignanes sont des composés di-phénoliques qui s’accumulent dans les tissus
ligneux, c’est-à-dire dans les graines et les racines de nombreuses plantes. Même si les
lignanes, concentrées dans les téguments, sont présentes dans la plupart des plantes, les
graines de lin sont les végétaux contenant la plus grande quantité de celles-ci. En effet, le
lin contient huit cents fois plus de lignanes que les autres oléagineux, céréales, fruits ou
légumes (Goyal et al., 2014; Imran et al., 2015). Le lin est principalement composé de
lignanes phyto-oestrotènes, par exemple le sécoisolaricirésinol diglucoside (SDG)
(Lamblin et al., 2008). Le SDG est converti par les bactéries des intestins en lignanes
entérodiol et entérolactones, ce qui procure des effets bénéfiques sur la santé en raison
de leurs activités antioxydantes et leurs faibles activités oestrogéniques (Goyal et al.,
2014; Muit & Westcott, 2003). Le lin contient également d’autres lignanes, telles le
matairesinol, lariciresinol et le pinoresinol en quantités considérables (Goyal et al.,
2014; Imran et al., 2015).
11
1.2.4 Les protéines
Selon la Commission Canadienne des Grains, les graines de lin entières
comprennent environ 20% de protéines. Toutefois, des études ont rapporté que le contenu
protéique des graines de lin varie entre 10 et 31%, voire même 37% (Oomah & Mazza,
1993; Shim, et al., 2014; Truksa et al., 2003). Une fois déshuilées, le contenu protéique
du tourteau grimpe jusqu’à 35 à 40% (Sammour, 1999) ce qui en fait un produit à haute
teneur en protéines.
La Figure 1 résume les caractéristiques générales des protéines de la graine de lin.
Essentiellement, le lin comprend deux principaux types de protéines de stockage, soit les
globulines et les albumines, communément appelées linine 12S et conlinine 2S. Celles-ci
totalisent respectivement 58-66% et 20-42% des protéines. Ces protéines globulaires sont
donc les protéines majoritaires des graines de lin (Shewry et al., 1995). En plus petite
proportion, on retrouve des protéines de structure telles les prolamines et les gluténines
(Rabetafika et al., 2011; Truksa et al., 2003). Concernant les deux protéines de stockage,
la 12S est soluble dans des solutions salines alors que la 2S est soluble dans l’eau (Chung
et al., 2005). De plus, les protéines de la fraction 12S ont de hauts poids moléculaires
compris entre 252 et 298 kDa alors que les 2S ont des poids moléculaires plus faibles,
c’est-à-dire entre 16 et 17 kDa (Rabatafika et al., 2011; Udenigwe & Aluko, 2011).
Figure 1. Caractéristiques générales des protéines de la graine de lin (adaptée de Rabetafika et al., 2011)
12
De surcroît, tel que présenté au Tableau 3, la composition en acides aminés de la
graine de lin est comparable à celle du soya, notamment concernant les acides aminés
leucine, arginine, acide aspartique et acide glutamique, qui sont présents en plus grande
quantité dans ces deux oléagineux (Alashi, et al., 2013; Oomah, Mazza, 1993; Shim et
al., 2014). Enfin, pour les protéines de la graine de lin seulement, elles contiennent
également une grande quantité d’acides aminés ramifiés et les peptides composés de ces
acides aminés ont des propriétés bioactives (Nwachukwu et al., 2014).
Tableau 3. Composition en acides aminés de la graine de lin et du soya (adapté de Shim et al., 2014)
Acide aminé
Graines de lin brunes (NorLin)1
Graines de lin jaunes (Omega)1
Soya2
g/100 g protein
Alanine (Ala) 4.4 4.5 4.1
Arginine (Arg) 9.2 9.4 7.3
Acide aspartique (Asp) 9.3 9.7 11.7
Cystine (Cys) 1.1 1.1 1.1
Acide glutamique (Glu) 19.6 19.7 18.6
Glycine (Gly) 5.8 5.8 4.0
Histidine (His)a 2.2 2.3 2.5
Isoleucine (Ile)a 4.0 4.0 4.7
Leucine (Leu)a 5.8 5.9 7.7
Lysine (Lys)a 4.0 3.9 5.8
Méthionine (Met)a 1.5 1.4 1.2
Phénylalanine (Phe)a 4.6 4.7 5.1
Proline (Pro) 3.5 3.5 5.2
Serine (Ser) 4.5 4.6 4.9
Thréonine (Thr)a 3.6 3.7 3.6
Tryptophane (Trp)a 1.83 NDb NDb
Tyrosine (Tyr) 2.3 2.3 3.4
Valine (Val)a 4.6 4.7 5.2
a Acides aminés essentiels pour les humains.
b Non déterminé.
Données prises à partir de 1Oomah and Mazza (1993b), 2Friedman and Levin (1989), and 3Bhatty and
Cherdkiatgumchai (1990).
Afin d’obtenir des peptides bioactifs à partir des protéines de graines de lin,
différentes méthodes d’hydrolyse sont présentées à la section suivante.
13
2. Modes de libération des peptides
L’hydrolyse est un processus nécessaire pour libérer les peptides compris dans la
séquence d’acides aminés des protéines (Roblet et al., 2014). Diverses méthodes de
libération des peptides existent, telles que l’hydrolyse chimique comprenant l’utilisation
d’un acide ou d’une base, la fermentation, ou encore l’hydrolyse enzymatique.
2.1 Hydrolyse chimique
L’hydrolyse chimique des protéines résulte du clivage des liaisons peptidiques par
l’action d’un acide ou d’une base (Kristinsson & Rasco, 2000). L’hydrolyse acide
moyennant l’acide chlorhydrique est le traitement le plus commun. Bien qu’elle soit
simple, peu dispendieuse et qu’elle permette de produire des ingrédients permettant
d’accroître des saveurs, elle comporte toutefois de nombreuses limitations reliées à
l’industrie alimentaire. En effet, ce type d’hydrolyse est difficile à contrôler, détruit
certains acides aminés selon les conditions utilisées et ne présente aucune sélectivité de
coupure (Fountoulakis & Lahm, 1998; Kristinsson & Rasco, 2000; Rutherfurd-
Markwick, 2012; Tavano, 2013). Également, l’hydrolyse chimique produit
inévitablement des hydrolysats contenant des peptides et des acides aminés ayant une
composition chimique et des propriétés fonctionnelles variables. De plus, l’hydrolyse est
réalisée sous des conditions intenses de pH et de température, générant ainsi des produits
possédant de plus faibles qualités nutritionnelles et fonctionnelles (Clemente, 2000;
Kristinsson & Rasco, 2000). Enfin, une grande quantité de base (NaOH) est nécessaire
pour neutraliser l’hydrolysat final, générant par la même occasion un produit final riche
en sel, ce qui est également un inconvénient (Kristinsson & Rasco, 2000).
14
2.2 Fermentation
La fermentation est une façon efficace de produire des peptides à partir de
protéines alimentaires et cette méthode est moins coûteuse que l’hydrolyse enzymatique,
puisque les micro-organismes sont une source non-dispendieuse de protéases : le coût
associé pour les cultiver n’est pas très élevé et cela ne requiert pas beaucoup
d’équipement. De plus, ces micro-organismes sont sécuritaires (Singh et al., 2014;
Zambrovicz et al., 2013). Des protéases issues de micro-organismes telles que des
bactéries lactiques peuvent être utilisées pour la production de peptides par fermentation
(Zambrovicz et al., 2013).
L’utilisation de bactéries lactiques est une façon courante de production de
peptides à partir de protéines d’origine animale ou végétale (Aguirre et al., 2008). En
effet, différentes souches sont disponibles telles que Lactococcus (L.) lactis,
Lactobacillus (Lb.) helveticus et Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Ces bactéries
ont une grande spécificité et peuvent libérer une large quantité de peptides contenant
généralement entre 4 et 8 acides aminés (Singh et al., 2014). L’utilisation de bactéries
lactiques est surtout associée à la fermentation des produits laitiers (Chaves-Lopez et al.,
2014; de Castro & Sato, 2015). Cependant, plusieurs études utilisent la fermentation par
les bactéries lactiques pour obtenir des peptides à partir du soya (Aguirre et al., 2014;
Aguirre et al., 2008; Leroy & De Vuyst, 2014; Yang et al., 2000) et de la graine de lin
(Pihlanto et al., 2012). En effet, les études menées sur les protéines des graines de lin
utilisant des souches de L. helveticus et B. subtilis ont produit des composés possédant
des effets cardiovasculaires bénéfiques (Pihlanto et al., 2012). Cependant, rien dans la
littérature ne mentionne les propriétés antioxydantes des peptides de lin produits par
fermentation.
15
2.3 Hydrolyse enzymatique
L’hydrolyse enzymatique et la fermentation, tel que mentionné précédemment
font toutes deux intervenir des enzymes. Toutefois, lors d’une hydrolyse enzymatique,
l’enzyme doit être pure. L’hydrolyse enzymatique est un procédé mené en conditions
douces, facile à contrôler et qui offre des produits à spécificité définie (Zambrovicz et al.,
2013). Les enzymes sont des catalyseurs biologiques qui accélèrent certaines réactions
chimiques et qui demeurent intactes à la fin de la réaction. De ce fait, les protéases qui
sont elles-mêmes des protéines, s’autolysent en partie. Différents facteurs affectent
l’activité des enzymes, telles que leur spécificité, leur concentration et celle du substrat,
le degré de dénaturation de la protéine, le pH, la force ionique ainsi que la température
(Alashi et al., 2013). Ces facteurs influencent également le degré d’hydrolyse, de même
que la nature des séquences peptidiques (Sarmadi & Ismail, 2010). En effet, la spécificité
de l’enzyme est un facteur très important qui détermine les sites de coupure de la protéine
et donc la nature des peptides résultant de l’hydrolyse (Alashi et al., 2013).
Dépendamment de l’enzyme utilisée, différents peptides peuvent être obtenus (Tavano,
2013; Wang & Gonzalez de Mejia, 2005). La trypsine, la pepsine et la chymotrypsine
sont les enzymes les plus utilisées dans les procédés d’hydrolyse enzymatique. Les
enzymes sont également classées selon leur mécanisme d’hydrolyse, c’est-à-dire, si ce
sont des endopeptidases ou des exopeptidases, tel que présenté au Tableau 4. Les
endopeptidases hydrolysent les liens peptidiques à l’intérieur de la protéine aléatoirement
et produisent de relativement gros peptides. Les exopeptidases, quant à elles, libèrent
systématiquement les acides aminés à partir de l’extrémité C ou N terminale.
Généralement, les peptides issus d’une exoprotéase sont composés d’acides aminés libres
et de petits peptides allant jusqu’à douze acides aminés (Clemente, 2000; Tavano, 2013).
Par conséquent, plusieurs protéases peuvent être utilisées pour l’hydrolyse enzymatique
de protéines et la spécificité de celles-ci doit être prise en compte pour la production de
peptides.
16
Tableau 4. Liste non-exhaustive d’enzymes communément utilisées pour l’hydrolyse protéique (adapté de Luna-Vital et al., 2015).
Enzyme Classe Site de coupure Référence
Alcalase Endopeptidase Large spécificité, préférence pour les acides aminés non chargés (Ser, Thr, Asp, Glu)
Markland & Smith (1971)
Flavourzyme Endo- et exopeptidase
Non spécifique, coupe à partir des extrémités C-terminales Blinkovsky et al., (1999)
Pancréatine Endo- et exopeptidase
Mélange de plusieurs enzymes digestives : endopeptidases trypsine, chymotrypsine et élastase coupent aux extrémités C-terminales des acides aminés basiques, aromatiques et aliphatiques. Exopeptidases carboxydase A et B coupent aux extrémités carboxyles libres mais préfèrent les extrémités C-terminales des acides aminés hydrophobes et basiques.
Lawers & Scharpé (1997)
Papaïne Endo- et exopeptidase
Grande spécificité, coupe les liens peptidiques des acides aminés hydrophobes Leu ou Gly.
Ménard & Storer (1998)
Pepsine Endopeptidase Coupent les liens peptidiques des acides aminés hydrophobes, de préférence les acides aminés aromatiques. Grande susceptibilité à l’hydrolyse des acides aminés contenant un groupement sulfhydrile situés près d’un acide aminé aromatique. Coupe préférentiellement le groupement carboxyle de Phe et Leu. Coupe minoritairement le groupement carboxyle de Glu.
Sweeney & Walker (1993)
Trypsine Endopeptidase Coupe aux extrémités C-terminales des acides aminés Lys et Arg.
Vandermarliere et al., 2013
α-chymotrypsine Endopeptidase Coupe aux extrémités C-terminales des acides aminés Tyr, Phe, Trp et Leu. Hydrolyse de façon secondaire à partir des extrémités C-terminales des acides aminés Met, Ile, Ser, Thr, Val, Gly et Ala.
Sweeney & Walker (1993)
L’hydrolyse enzymatique produit généralement trois différents effets sur les
molécules protéiques : la réduction du poids moléculaire, l’augmentation du nombre de
groupements ionisables, par exemple α-NH4+ et α-COO- et finalement une plus grande
exposition des groupements hydrophobes, préalablement enfouis au centre de la molécule
(Kristinsson & Rasco, 2000; Panyam & Kilara, 1995; Zhao et al., 2011). En effet, les
protéines natives sont très compactes et ont une structure tridimensionnelle bien définie
en fonction de la séquence d’acides aminés et de leurs caractéristiques (acide, basique,
polaire, apolaire) ainsi que la présence de ponts disulfures. En raison de la structure
tertiaire des protéines, les acides aminés acides et basiques ont tendance à être en contact
17
avec le solvant du milieu extérieur, favorisant ainsi les interactions par la formation de
liens hydrogène. Les acides aminés hydrophobes, eux, sont davantage situés au cœur de
la protéine due à leur faible affinité pour le milieu externe. De même, la structure
quaternaire est formée par des interactions non-covalentes, En effet, ce sont des
interactions électrostatiques et hydrogène qui relient des sous-unités permettant de la
formation de la structure quaternaire. Des liens hydrophobes peuvent également y
participer, mais on s’attend plutôt à les retrouver enfouis au cœur des sous-unités,
contribuant ainsi à la structure tertiaire repliée. Toutes ces interactions peuvent influencer
le processus d’hydrolyse enzymatique, puisque les enzymes, selon leur sélectivité vis-à-
vis du substrat, doivent dans certains cas être en mesure d’atteindre la cavité hydrophobe
de la structure tridimensionnelle (Tavano, 2013).
Bien que l’hydrolyse enzymatique présente des avantages considérables,
comparativement à l’hydrolyse chimique et à la fermentation, ce procédé comporte
certains désavantages. Entre autres, l’hydrolyse enzymatique est dispendieuse et utilise de
grandes quantités d’enzymes qui ne peuvent pas être réutilisées par la suite (Buyn &
Kim, 2001; Kristinsson & Rasco, 2000), sauf dans le cas où des réacteurs continus sont
utilisés (Wichmann, Wandrey, Buckmann, & Kula, 1981). Également, le rendement de la
réaction n’est pas toujours très élevé. Par exemple, l’hydrolyse de la β-lactoglobuline,
avec la pepsine et la chymotrypsine, en raison de la configuration du substrat, génère un
très faible rendement d’hydrolyse (Reddy, Kelle, & Kinsella, 1988). Il est aussi
nécessaire d’inactiver les enzymes à la fin de l’hydrolyse en faisant varier la température
et le pH, ce qui requiert certaines quantités d’acides ou de base, engendrant au final des
coûts supplémentaires. De plus, il est difficile de contrôler l’étendue de la réaction, en
terme de degré d’hydrolyse, ce qui génère des produit non-homogènes, c’est-à-dire
possédant des masses moléculaires différentes si la matière à hydrolyser n’est pas
standardisée (Buyn & Kim, 2001; Kristinsson & Rasco, 2000). Également, il faut prendre
en compte le temps élevé de réaction (Buyn & Kim, 2001; Fountoulakis & Lahm, 1998).
Enfin, les conditions reliées à l’hydrolyse enzymatique diffèrent selon le substrat et les
enzymes utilisées, mais dépend également des bioactivités recherchées.
18
3. Bioactivité des peptides de graines de lin
3.1 Généralités
Les peptides bioactifs issus de l’hydrolyse enzymatique sont des portions
spécifiques de protéines qui ont un impact positif sur le corps humain et qui ultimement
ont un impact positif sur la santé (Marambe et al., 2008). Ces derniers sont inclus dans les
structures primaires protéiques et sont inactifs jusqu’au moment de leur hydrolyse ou au
cours de la digestion, où ils pourront exercer leurs différentes fonctions bénéfiques dans
l’organisme (Korhonen & Pihlanto, 2003). Les peptides bioactifs contiennent
généralement entre 3 et 20 acides aminés (Korhonen & Pihlanto, 2003) et leur taille est
également un facteur à considérer. Ainsi, les peptides bioactifs libérés peuvent agir
positivement différents systèmes du corps humain (cardiovasculaire, digestif,
endocrinien, immunitaire ainsi que le système nerveux) grâce à leurs effets
antimicrobiens, antioxydants, anti-thrombotiques, anti-hypertensifs, immunomodulateurs
et opioïdes (Alashi et al., 2013; Chalamaiah, Kumar, Hemalatha, & Jyothirmayi, 2012;
Hernandez-Ledesma et al., 2011). Cependant, il faut distinguer les analyses réalisées in-
vitro et in-vivo puisqu’il n’existe pas de corrélation entre les deux en raison de la
biodisponibilité. En effet, dans les analyses in-vitro, la réactivité, la stabilité et
l’entreposage dans les tissus ne sont pas pris en considération (Sarmadi & Ismail, 2010).
Il est donc important de protéger les peptides bioactifs lors de leur passage dans le tractus
gastro-intestinal, dû aux diverses conditions acides et basiques ainsi qu’aux différentes
protéases qu’on y retrouve. Par ailleurs, les peptides de faible poids moléculaire, surtout
les di- et tripeptides, sont généralement plus facilement absorbés par l’organisme et sont
plus efficaces que les peptides de plus haut poids moléculaire ainsi que les acides aminés
libres (Matthews, 1983; Wu, Aluko, & Muir, 2008). Par conséquent, les protéines
alimentaires, dont celles du lait et les protéines d’oléagineux, tels le soya et les graines de
lin, sont des sources potentielles de peptides bioactifs. En effet, et comme l’ensemble des
protéines, la graine de lin, suite à son hydrolyse, libère divers peptides. Ces peptides
peuvent exercer plusieurs effets bénéfiques au sein du corps humain. Ces propriétés sont
19
illustrées à la Figure 2. Pour ce projet, seules les propriétés antioxydantes seront
abordées.
Figure 2. Propriétés bioactives (non-exhaustives) d’hydrolysats protéiques de lin recensées dans la littérature
3.2 Propriétés antioxydantes
Les graines de lin possèdent une activité antioxydante. À ce sujet, le stress
oxydatif et les antioxydants seront définis. De même, la classification des antioxydants et
leurs méthodes de mesures in-vitro seront abordées dans cette section.
3.2.1 Définitions
3.2.1.1 Stress oxydatif
Le stress oxydatif se définit comme un manque d’équilibre au niveau des espèces
réactives oxygénées/azotées et la capacité de l’organisme à contrer cette action par
différents systèmes de protection dont les antioxydants (Pisoschi & Pop, 2015). Le stress
oxydatif est donc une agression de l’organisme par des espèces chimiques oxygénées
et/ou azotées (He et al., 2013). Ces espèces chimiques sont générées lors de la respiration
cellulaire en condition aérobie, au niveau des mitochondries (Makinen et al., 2012). Ce
sont entre autres, des radicaux libres tels que les superoxydes (O2·-) et les radicaux
20
hydroxyles (·OH) ou encore des espèces non-radicalaires oxygénées tels le peroxyde
d’hydrogène (H2O2) et l’oxygène singulet (1O2) (Pisoschi & Pop, 2015). Les radicaux
libres possèdent des électrons non appariés sur leur dernière orbitale. Ils sont donc très
réactifs et peuvent exister de façon indépendante sous cette forme (Pisoschi & Pop,
2015). Les espèces réactives oxygénées peuvent produire des dommages aux cellules et
aux tissus, engendrant ainsi certaines maladies comme le diabète, l’athérosclérose,
l’arthrite et même certains types de cancers (de Castro & Sato, 2015; Makinen et al.,
2012). Les antioxydants sont connus pour agir au aussi niveau cellulaire afin de réduire
les concentrations de ces radicaux libres (Alashi et al., 2013).
3.2.1.2 Antioxydants
Les antioxydants sont des substances ou des composés qui, lorsqu’ils sont
présents en faibles quantités, comparativement aux substrats oxydables, peuvent retarder
ou prévenir l’oxydation de ce substrat (Halliwell, 1990). Trois mécanismes d’action pour
les antioxydants existent. Ils peuvent agir en arrêtant les réactions de propagation des
radicaux libres par l’échange d’au moins un proton avec un radical libre. Ils peuvent
diminuer et/ou bloquer la formation de radicaux libres par la complexation de métaux
grâce à leur pouvoir chélateur d’ions métalliques. Enfin, ils peuvent diminuer la
concentration d’espèces réactives oxygénées (Bazinet & Doyen, 2015; Yehye et al.,
2015). Cependant, les antioxydants les plus efficaces seraient ceux qui interrompent la
production en chaîne de radicaux libres (Yehye et al., 2015). Les antioxydants peuvent
capter les radicaux libres selon différents facteurs tels que leur réactivité chimique, le
résultat de la réaction entre l’antioxydant et le radical, de même que les interactions avec
d’autres antioxydants, leur concentration et leur mobilité dans l’environnement (de
Castro & Sato, 2015).
21
3.2.2 Classification des antioxydants
Il existe deux grandes classes d’antioxydants, soit les antioxydants primaires et
secondaires.
3.2.2.1 Antioxydants primaires
Les antioxydants primaires préviennent la formation de radicaux libres impliqués
dans les processus d’auto-oxydation. En effet, ce sont les réactions d’oxydation qui
enclenchent les réactions en chaîne, générant ainsi des radicaux libres. Le principal rôle
de ces antioxydants est le transfert d’un proton à un radical libre afin d’arrêter la réaction
(Bazinet & Doyen, 2015; Gutteridge, 1994; Pisoschi & Pop, 2015). Les polyphénols, la
vitamine E et K et le β-carotène sont des exemples d’antioxydants primaires, de même
que les antioxydants synthétiques BHT et BHA (Hudson, 1990).
La Figure 3 présente une proposition de mécanisme de formation des radicaux
libres, de même que le mécanisme d’action des antioxydants dans le processus afin de
réduire le stress oxydatif. L’équation 1 s’appelle l’amorçage ou l’initiation. Dans
l’organisme, cette étape peut être initiée par la respiration cellulaire comme mentionné
précédemment. Ensuite, l’équation 2 représente l’étape de propagation des radicaux libres
où intervient l’oxygène. Une fois la réaction amorcée, elle se poursuivra jusqu’à
l’intervention d’un antioxydant. Dans la Figure 3, l’antioxydant est représenté par ArOH
et donnera un de ses électrons pour mettre fin à la propagation des radicaux. Enfin, deux
molécules antioxydantes peuvent même partager leurs électrons pour stopper la réaction
(Bisby et al., 2008; Johnson, 2002; Solomons, 2000).
22
Le BHT (hydroxytoluène butylé) et le BHA (hydroxyanisole butylé) tel que
présentés à la Figure 4, sont deux antioxydants primaires synthétiques ajoutés aux
aliments (Zhang et al., 2008). Lorsqu’ils cèdent un électron du groupement OH, il se
forme un radical sur ce même groupement et celui-ci est stabilisé par résonance dû au
cycle aromatique des molécules (Johnson, 2002). Toutefois, ces antioxydants artificiels
soulèvent des questionnements en raison de leurs risques potentiels pour la santé. Il est
donc important d’identifier et de caractériser des antioxydants naturels (Makinen et al.,
2012; Zhang et al., 2008).
Figure 3. Réaction d’oxydation et mécanisme de transfert d’électron des antioxydants (tiré de Yehye et al., 2015)
Figure 4. Structures du BHT et BHA
23
3.2.2.2 Antioxydants secondaires
Les antioxydants secondaires sont également appelés antioxydants synergétiques,
car lorsqu’ils sont combinés avec des antioxydants primaires, ils peuvent capturer
l’oxygène moléculaire, régénérer les antioxydants primaires par le don d’un électron et
les stabiliser en créant un environnement acide (Pisoschi & Pop, 2015).
Les antioxydants secondaires font davantage référence aux agents chélateur d’ions
métalliques et aux capteurs d’espèces réactives oxygénées (Bazinet & Doyen, 2015;
Pisoschi & Pop, 2015). L’EDTA ainsi que les acides citrique et tartrique sont également
des chélateurs d’ions métalliques communs. En effet, les agents chélateurs possèdent des
électrons non appariés leur permettant de former des complexes stables avec les ions
métalliques. Ainsi, les ions chélatés ne peuvent plus catalyser les réactions d’oxydation
(Bazinet & Doyen, 2015; Sarmadi & Ismail, 2010). Les antioxydants secondaires, par
exemple l’acide ascorbique, agissent également sur les espèces réactives oxygénées en
leur fournissant des électrons (Bazinet & Doyen, 2015; Hudson, 1990).
3.2.3 Méthodes de mesure de la capacité antioxydante
Différentes méthodes in-vitro et in-vivo peuvent être utilisées pour déterminer
l’activité antioxydante des peptides. Toutefois, seules les méthodes in-vitro seront
détaillées.
L’EC50 est souvent utilisé pour déterminer l’efficacité des antioxydants. En effet,
l’EC50 est la quantité d’antioxydant requise pour réduire la concentration en radicaux
libres de 50%. Donc, plus un antioxydant est puissant, plus la valeur d’EC50 est faible
(Alashi et al., 2013). Les mesures spectroscopiques sont majoritairement utilisées en ce
qui concerne l’analyse in-vitro des antioxydants. Différentes méthodes, ciblant chacun un
mécanisme spécifique peuvent être utilisé. En effet, il y a le DPPH (2,2-diphenyl-1-
picryl-hydrazyl), le FRAP (ferric-reducing antioxidant power) et l’ORAC (oxygen radical
24
absorbance capacity). D’autres existent toutefois, mais seules celles-ci seront détaillées,
car ce sont les plus utilisées.
Le réactif DPPH est un radical stable qui réagit avec les groupements donneurs
d’électrons des antioxydants, se traduisant par un changement de coloration, passant du
violet au jaune (Alashi et al., 2013; de Castro & Sato, 2015; Yehye et al., 2015).
Les ions métalliques de transitions tel le Fe2+ peuvent catalyser la formation
d’espèces réactives oxygénées. La chélation de ces ions peut prévenir ou réduire leur
incidence (He et al., 2013). Le FRAP mesure donc la réduction du Fe3+ du TPTZ (2,4,6-
Tripyridyl-S-Triazine) en Fe2+, par le passage de la couleur bleue pâle à foncée,
traduisant la capacité d’un antioxydant à céder un électron ou un hydrogène (Alashi et al.,
2013; de Castro & Sato, 2015; He et al., 2013).
Enfin, l’ORAC mesure la capture des radicaux peroxydes. Pour ce faire, une
source de radicaux peroxydes oxydants est utilisée, soit le 2,2’azobis(2-
amidinopropane)dihydrochloride (AAPH). Celui-ci, en présence d’oxygène, réagit avec
un indicateur fluorescent, soit la fluorescéine pour donner un produit non-fluorescent. En
présence d’un antioxydant, la fluorescence demeure et reflète sa capacité à céder un
hydrogène (Alashi et al., 2013; de Castro & Sato, 2015). L’ORAC utilise la cinétique,
c’est-à-dire la protection de l’oxydation en fonction du temps pour déterminer la capacité
antioxydante. Au début du processus d’analyse, aucune perte de fluorescence ne survient
et cette étape est appelée la phase de latence puisqu’une compétition entre les radicaux
peroxydes, l’antioxydant et l’indicateur, soit la fluorescéine se produit (Bisby et al.,
2008). L’aire sous la courbe de cinétique est proportionnelle à la capacité d’absorption des
radicaux oxygénés de l’antioxydant (Cao et al.,1993). Le Trolox C est un analogue de la
vitamine E, un antioxydant, et est utilisé comme standard dans les analyses ORAC. La
phase de latence se poursuit jusqu’à ce que le Trolox C soit consommé. Par la suite, il est
possible d’observer une diminution de l’intensité de fluorescence en fonction du temps.
L’efficacité d’un antioxydant se mesure donc par l’intégration de l’aire sous la courbe
(Bisby et al., 2008).
25
3.3 Peptides antioxydants
Selon la littérature, l’hydrolyse de protéines alimentaires à l’aide d’enzymes
génère certains peptides possédant des propriétés antioxydantes (Samaranayaka & Li-
Chan, 2011). Ces antioxydants peuvent agir à titre de capteurs de radicaux libres ou
même d’agents chélateurs d’ions métalliques (Ghribi et al., 2015). Cela a notamment été
démontré sur des protéines contenues dans les oléagineux tels les graines de lin
(Marambe et al., 2008), le canola (Cumby et al., 2008; Zhang et al., 2008) et le soya
(Chen et al., 1995), de même que sur des protéines du lait, telles les caséines et la β-
lactoglobuline (Pihlanto, 2006). Cependant, il existe très peu d’informations dans la
littérature concernant les séquences des peptides antioxydants du lin. Pour cette raison,
les principales caractéristiques des peptides antioxydants seront basées sur celles des
peptides d’autres sources reportées dans la littérature..
3.3.1 Peptides antioxydants du lin
Plusieurs études portant sur l’activité antioxydante des hydrolysats protéiques de
lin, grâce à l’utilisation de diverses enzymes, ont démontré que certaines fractions
peptidiques spécifiques avaient la capacité de prévenir l’oxydation. Par exemple,
Marambe et al. (2008) ont réalisé l’hydrolyse enzymatique des protéines de lin à l’aide de
Flavourzyme®, à différents ratios enzyme/substrat et différentes durées d’hydrolyse. Ils
ont révélé une activité antioxydante des peptides obtenus, celle-ci étant plus importante
lorsque le degré d’hydrolyse est plus faible et que les peptides sont de plus hauts poids
moléculaires. De plus, Udenigwe & Aluko (2010) ont d’abord effectué l’hydrolyse
enzymatique des protéines de lin avec la thermolysine pendant cinq heures, car elle clive
spécifiquement les liaisons en position N-terminale des acides aminés hydrophobes
phénylalanine, tyrosine, leucine, isoleucine et valine. D’autres enzymes ont été choisies
en raison de leurs spécificités (papaïne, ficine, alcalase et pronase) et utilisées pour
effectuer une seconde hydrolyse de cinq heures. Des analyses ont été effectuées par la
méthode DPPH sur la combinaison d’enzymes présentant le plus haut ratio de Fischer
(acides aminés ramifiés/acides aminés aromatiques), soit la thermolysine suivie de la
26
pronase. En effet, ils ont déterminé que cet hydrolysat possédait une capacité
antioxydante. Par ailleurs Udenigwe et al. (2009) ont également effectué l’hydrolyse
enzymatique des protéines des graines de lin à l’aide de sept enzymes (pepsine, ficine,
trypsine, papaine, thermolysine, pancréatine et alcalase). Ils ont démontré que l’hydrolyse
avec la papaine et l’alcalase produisait des peptides possédant une capacité antioxydante
lorsqu’analysé avec la méthode DPPH. Entre autres, la spécificité de l’enzyme et la taille
des peptides influençait la capacité antioxydante des peptides.
Cependant, les séquences des peptides antioxydants propres aux protéines des
graines de lin n’ont pas été déterminées. Malgré cela, d’après la littérature, pour d’autres
sources végétales de peptides antioxydants, les caractéristiques générales que détiennent
les peptides antioxydants sont néanmoins connues et sont présentées dans la section
suivante.
3.3.2 Caractéristiques générales des peptides antioxydants
La composition en acides aminés des peptides est un facteur important pour leur
activité antioxydante. En effet, le tryptophane, la tyrosine et la phénylalanine en raison de
leur noyau aromatique, de même l’histidine grâce à son groupement imidazole, ont la
capacité de piéger les radicaux. Plus précisément, l’électron libre du groupement O.
forme une double liaison avec l’oxygène, qui provoque une délocalisation des électrons à
l’intérieur du cycle aromatique, De cette façon, par résonance, ces molécules
demeureront stables (Sarmadi & Ismail, 2010; Singh et al., 2014; Zhang et al., 2008).
Aussi, les acides aminés hydrophobes Valine, Leucine et Alanine permettent une
augmentation des interactions des peptides avec les lipides, ce qui favorise la captation
des radicaux provenant des lipides. L’acide aspartique et glutamique (acides aminés
acides) et l’histidine, de même que la lysine et l’arginine (acides aminés basiques) sont
d’une grande d’importance au sein de la structure des peptides antioxydants car les
groupements carboxyles et aminés agissent comme chélateurs d’ions métalliques et
comme donneurs d’atomes d’hydrogènes. Enfin, la cystéine, interagit directement avec
les radicaux libres en raison de son groupement thiol afin de protéger les biomolécules du
27
stress oxydatif (Qian et al., 2008; Sarmadi & Ismail, 2010). Il importe donc de trouver
des méthodes afin de produire davantage de peptides contenant ces caractéristiques afin
d’améliorer la capacité antioxydante. Ainsi, les HPH présentées à la section suivante
pourraient être appropriées.
4. Hautes pressions hydrostatiques
Les HPH sont une technologie qui a la capacité de modifier la structure des
protéines (Silva et al., 2001) afin de surmonter certains des inconvénients de l’hydrolyse
enzymatique mentionnés précédemment, dont l’étendue de la réaction, permettant ainsi
d’obtenir un degré d’hydrolyse final plus élevé (Knudsen et al., 2001). Dans cette section,
un bref historique de cette technologie ainsi que son principe de fonctionnement, ses
avantages et inconvénients, de même que son impact sur les protéines seront présentés.
4.1 Historique
Le concept de pression en tant que paramètre thermodynamique a été démontré
bien après la température, grâce aux expériences menées par Pascal en 1648 qui désirait
comprendre les observations de Galilée en 1640 et de Torricelli en 1644 sur le vide
(Demazeau & Rivalain, 2011). Au 18e siècle, les recherches ont conduit à la découverte
que l’eau est un liquide compressible. C’est à partir de cette découverte que les premières
avancées concernant l’utilisation des hautes pressions hydrostatiques ont débuté, au
milieu du 19e siècle (Doyen, 2012).
Ainsi, plusieurs recherches se sont intéressées aux effets de l’utilisation d’une
pression hydrostatique. Roger en 1892 et en 1895 a démontré que l’utilisation de la
pression pourrait inactiver les bactéries (Demazeau & Rivalain, 2011; Tonello, 1998). Un
peu plus tard, en 1897, Büchner a pressurisé des levures de bière entre 40 et 50 MPa et a
pu tout de même induire la fermentation des composés glucidiques. Ainsi, il a été observé
que la fermentation de la bière n’a pas nécessairement besoin d’organismes vivants. Cette
28
recherche a été la première à associer l’utilisation des HPH à l’activité enzymatique
(Demazeau & Rivalain, 2011). Enfin, Hite en 1899 a été le premier à utiliser les HPH
pour la préservation des aliments. En effet, le lait, lorsque soumis à différentes conditions
de pressions, présentait une réduction de sa flore bactérienne, ainsi qu’un retardement de
son acidification (Chawla et al., 2011; Demazeau & Rivalain, 2011; Hite, 1899; Tonello,
1998).
À la fin des années 1980, la technologie des HPH a été réintroduite à l’échelle
industrielle au Japon par le ministère de la Recherche, de l’Industrie et du Commerce
désirant appliquer des technologies de conservation novatrices pouvant remplacer le
procédé d’ionisation. Les premiers aliments traités et mis sur le marché étaient des
confitures de fraise, kiwi et pomme (Datta & Deeth, 1999; Doyen, 2012; Tonello, 1998).
Par la suite, d’autres pays ont adopté cette technologie ayant permis une diversification
des produits traités, par exemple des viandes, des jus de fruits ou encore des sauces à
salade (Chawla et al., 2011).
Comme mentionné précédemment, les HPH ont pour but premier d’inhiber la
croissance microbienne permettant de conserver le produit et d’augmenter sa durée de vie
(San Martin et al., 2002). Cependant, les aliments traités (jus, viande, poisson, etc.) étant
des matrices complexes, les recherches scientifiques se sont rapidement focalisées sur
l’impact des HPH sur les composants alimentaires, en particulier sur les protéines. Cet
aspect a été étudié dès 1914, lorsqu’il a été observé que les protéines du blanc d’œuf
coagulaient sous l’action des HPH (Royer, 2002; Silva et al., 2014; Tonello, 1998). Par la
suite, d’autres études plus récentes ont été menées afin de comprendre précisément l’effet
des HPH sur les structures protéiques ainsi que les principes physiques impliqués (Silva
et al., 2014).
29
4.2 Principe de fonctionnement
Pour que le traitement soit efficace, l’aliment doit contenir une quantité minimale
d’eau, ce dernier étant le transmetteur de pression. De plus, et de par les contraintes de
déformation imposées par la pressurisation, l’aliment doit être emballé dans un contenant
souple, imperméable et pouvant résister à une pression très importante. La Figure 5
présente un système à HPH d’échelle industrielle. Ainsi, l’aliment est inséré dans une
enceinte remplie d’eau, l’eau étant le fluide responsable de la transmission de la pression.
L’enceinte est fermée et l’aliment est comprimé jusqu’à l’obtention de la pression ciblée
durant un temps déterminé par l’opérateur. La pression s’exerce de façon instantanée et
uniforme (pression isostatique). À la fin du traitement, la décompression est
généralement instantanée pour les procédés industriels, l’eau est évacuée de la cuve et le
produit pressurisé est récupéré (Doyen, 2012; Thakur & Nelson, 1998; Tonello, 1998).
Trois façons de permettent de générer la pression à l’intérieur de l’enceinte, soit
par pression directe, indirecte ou par le chauffage du système de transmission de la
pression. D’abord, la compression par pression directe se fait de façon à réduire le
volume de l’enceinte par l’action d’une pompe hydraulique. La compression indirecte,
quant à elle, utilise un amplificateur ou une pompe à haute pression pour compresser
Figure 5. Système de pressurisation de la compagnie Hiperbaric (http://www.hiperbaric.com/en/)
30
l’eau directement dans l’enceinte. C’est souvent la méthode utilisée en industrie
alimentaire pour pressuriser les aliments par hautes pressions hydrostatiques. Enfin, la
troisième méthode n’est pas utilisée dans l’industrie alimentaire, mais elle implique de
chauffer le système de transmission de pression à l’intérieur de l’enceinte pour créer de
l’expansion en augmentant la température (San Martin et al., 2002; Thakur & Nelson,
1998).
4.3 Avantages et inconvénients
4.3.1 Avantages
Les principaux avantages du procédé à HPH sont listés ci-après :
o L’élimination ou la réduction importante du chauffage, ce qui permet d’éviter la
dégradation des aliments en raison d’un traitement thermique. Ainsi, les
composantes nutritionnelles et organoleptiques des aliments sont conservées
(Chawla et al., 2011; Datta & Deeth, 1999; San Martin et al., 2002).
o Le procédé peut être effectué sur une large gamme de température, les
températures de réfrigération étant préconisées à l’échelle industrielle (Rastogi et
al., 2007; Thakur & Nelson, 1998).
o La pression appliquée est isostatique, c’est-à-dire qu’elle est exécutée de façon
instantanée et uniformément partout à l’intérieur de l’enceinte et à l’intérieur de
l’aliment, par opposition à un traitement de chaleur, où on observe un gradient de
température dans le produit (Norton & Sun, 2008; Thakur & Nelson, 1998;
Tonello, 1998).
o La pression à appliquer ne dépend pas de la masse ou de la géométrie de l’aliment
et l’aliment le subit qu’une déformation minime (Rastogi et al., 2007; Tonello,
1998; Truong et al., 2015).
31
o La durée de vie des aliments est augmentée en raison de la destruction des micro-
organismes d’altération et favorisant grandement l’innocuité des aliments
(Chawla et al., 2011, Doyen, 2012; San Martin et al., 2002; Rastogi et al., 2007).
4.3.2 Désavantages
Bien que la technologie utilisant les HPH présente de nombreux avantages, il est
important de distinguer certains inconvénients :
o Le coût d’investissement pour un tel appareil est très élevé (Tonello,
1998).
o Au niveau de l’inhibition microbienne, seules les cellules végétatives sont
détruites. Les spores bactériennes sont très résistantes et ne sont pas
détruites au niveau de pressurisation utilisé en industrie alimentaire (100-
600 MPa). Leur inactivation requiert de très hautes pressions combinées à
un traitement de chaleur (San Martin et al., 2002; Thakur & Nelson, 1998).
o La pressurisation d’aliments secs ou possédant une faible activité de l’eau
n’est pas efficace (Tonello, 1998)
4.4 Impacts sur les protéines
La technologie des HPH utilise des pressions très élevées, allant généralement de
400 à 600 MPa selon la nature du produit traité. Cette pression correspond à celle
pouvant être mesurée à une profondeur marine hypothétique de 40 à 60 km (Doyen,
2012). À ces pressions, des effets se produisent inévitablement sur la structure des
protéines pures ou en mélange au sein des matrices alimentaires complexes.
32
4.4.1 Principes physiques
L’effet des HPH est expliqué par l’énergie interne thermodynamique. En effet,
l’impact de la pression sur un système moléculaire, comme les protéines, est gouverné
par le principe de Le Châtelier. Celui-ci stipule qu’un système à l’équilibre tend à
minimiser les effets d’une perturbation externe. Autrement dit, si une pression est
appliquée, l’équilibre va se déplacer du côté des réactifs qui occupent le plus petit volume
(Aertsen et al., 2009; Cioni & Gabellieri, 2011). Ainsi, tel que mentionné à l’équation (1),
K(p) et K(0) sont les constantes d’équilibre de la réaction à la pression p. T, R et ∆V
représentent respectivement la température, la constante de gaz parfaits et le changement
de volume. Le volume est donc le seul paramètre affecté par la pression, même si la
température du système augmente légèrement (environ 1 °C/100 MPa) en raison de la
compression adiabatique et diminue lors de la décompression adiabatique (Aertsen et al.,
2009; Cioni & Gabellieri, 2011).
(1)
La diminution du volume des protéines sous pression a une incidence sur
différents facteurs. D’abord, l’hydratation des acides aminés hydrophobes enfouis au
centre de la molécule, maintenant exposés au milieu, se produit (Boonyaratanakornkot et
al., 2002; Royer, 2002; Silva et al., 2014). Également, le phénomène d’électrostriction
des groupements chargés se crée. L’électrostriction est la contraction d’une molécule
d’eau autour d’autres molécules d’eau, ce qui crée un champ électrique. La création d’un
champ électrique déstabilise les liaisons électrostatiques (Chéret, 2005). C’est donc le
phénomène d’électrostriction qui explique que le volume molaire partiel des ions devient
négatif (Bockris & Reddy, 2007; Boonyaratanakornkot et al., 2002; San Martin et al.,
2002). Enfin, une perte du volume libre survient, provenant de défauts dans la structure
repliée (Silva et al., 2001; Silva et al., 2014).
33
L’utilisation des HPH peut affecter la conformation des protéines, menant à leur
dissociation, leur agrégation ou la gélation dépendamment des conditions utilisées tel que
le type de protéine, le pH, la composition du solvant et la force ionique (Doyen, 2012;
Dumay et al., 1994; Messens et al., 1997). La structure des protéines natives est
constituée de cavités et tel que présenté à la Figure 6, lorsque les protéines sont soumises
à un traitement de HPH, l’eau pénètre dans les cavités. En raison des phénomènes
mentionnés précédemment (hydratation des groupements hydrophobes, électrostriction et
perte du volume libre), des changements se produisent dans la structure protéique
(Boonyaratanakornkot et al., 2002; Hummer et al., 1998; Silva et al., 2014).
La Figure 7 présente les changements de structure que peuvent subir les protéines
sous l’influence de la pression. Lorsque l’eau entre dans les cavités des protéines, un
phénomène de dénaturation peut survenir (Figure 7a) en raison du bris des liaisons
intermoléculaires et la formation d’interactions avec l’eau. Par ailleurs, une dissociation
des protéines en dimères ou monomères peut également se produire (Figure 7b), ce qui
démontre bien l’effet sur les structures quaternaires (Balny & Masson, 1993; Pin et al.,
1990; Silva et al., 2001; Silva & Weber, 1993). Toutefois, les monomères peuvent former
des interactions entre eux pour former des agrégats stabilisés par des liaisons covalentes
et non-covalentes (Lopez-Fandino, 2006; Olsen et al., 2003).
Figure 6. Effet de la présence de cavités à l’intérieur des protéines lors d’un traitement de pressurisation (adapté de Silva et al., 2014)
34
4.4.2 Liaisons affectées
Au sein d’une structure protéique complexe, les HPH agissent principalement au
niveau des liaisons non-covalentes soient les liaisons hydrogène, électrostatiques,
hydrophobes et les forces de Van der Waals (Balny & Masson, 1993; Heremans, 1982;
Lopez-Fandino, 2006; Puppo et al., 2004). Ces interactions sont responsables de la
stabilisation des niveaux de structure secondaires, tertiaires et quaternaires des protéines.
Ainsi, les HPH créent une perturbation au sein des protéines (Dufour et al., 1995). Le
Tableau 5 présente les effets sur le volume des hautes pressions pour les différentes
interactions des protéines.
4.4.2.1 Interactions électrostatiques
Dans les protéines, les paires d’ions s’attirent et des interactions de courte portée
se produisent avec des acides aminés chargés positivement et négativement jusqu’à une
distance de 4 Å ou moins. Les paires d’ions stabilisent ainsi les niveaux de structure
tertiaires et quaternaires (Boonyaratanakornkit et al., 2002). Les HPH engendrent la
dissociation des paires d’ions, ce qui mène à l’électrostriction, donc à la diminution du
Figure 7. Effets de la pression dans les phénomènes de dénaturation et de dissociation des protéines (adapté de Silva et al., 2001) (∆V signifie volume
de dissociation et les points rouges représentent des molécules d’eau)
35
volume. Cette dissociation peut ainsi induire la dénaturation des protéines
(Boonyaratanakornkit et al., 2002; Rivalain et al., 2010).
4.4.2.2 Liaisons hydrophobes
Les interactions hydrophobes sont très sensibles à la pression et sont impliquées
dans le maintien des structures tertiaire et quaternaire des protéines (Balny & Masson,
1993). Sous pression, les interactions électrostatiques sont déstabilisées, ce qui a pour
effet d’entraîner la dissociation des sous-unités, favorisant le dépliement de celles-ci et
ainsi l’exposition des acides aminés hydrophobes qui y sont enfouis
(Boonyaratanakornkit et al., 2002; Chao et al., 2013; Ruan & Balny, 2002). Également,
ce sont les interactions hydrophobes qui entraînent une plus grande diminution du volume
des protéines sous pression (Rivalain et al., 2010).
4.4.2.3 Liaisons hydrogènes
Sous l’effet de la pression, la longueur des liaisons hydrogènes auraient tendance
à diminuer. Également, la pressurisation entraîne l’hydratation des protéines, ce qui réduit
le nombre de liaisons hydrogènes intramoléculaires, favorisant la formation de liaisons
hydrogènes intermoléculaires (Boonyaratanakornkit et al., 2002; Knudsen et al., 2002).
De plus, selon les conditions de pression appliquées, les liaisons hydrogènes sont
stabilisées ou légèrement déstabilisées, selon le volume de dissociation (Rivalain et al.,
2010).
4.4.2.4 Forces de Van der Waals
Les forces de Van der Waals, interactions faibles produites par les atomes et les
molécules, sont induites par les effets de polarisation, c’est-à-dire lorsque les atomes sont
situés près les uns des autres. Lorsque les protéines sont pressurisées, ces forces peuvent
contribuer à les déstabiliser. En effet, il y a un transfert des interactions faibles entre les
36
acides aminés pour favoriser la formation d’interactions entre l’eau et les protéines. Les
interactions entre l’eau et les protéines sont augmentées sous pression, ce qui provoque
des liaisons plus courtes et plus fortes, se traduisant par une diminution du volume des
protéines (Boonyaratanakornkit et al., 2002; Knudsen et al., 2002).
4.4.2.5 Liaisons covalentes
Les liaisons covalentes, quant à elles, représentent principalement les liaisons
peptidiques CO-NH et dictent la structure primaire des protéines et elles ne sont pas
affectées par les hautes pressions (Boonyaratanakornkit et al., 2002). De même, les ponts
disulfures sont également des liaisons covalentes. Ils maintiennent la structure tertiaire et
quaternaire et ne sont pas affectés par les hautes pressions (Lee et al., 2006).
Tableau 5. Effet des HPH sur le volume protéique et impact sur les différents types d’interaction (adapté de Rivalain et al., 2010).
4.4.3 Impacts sur l’hydrolyse enzymatique des protéines
En raison du changement de structure protéique lors de la pressurisation, cela a
également comme conséquence de modifier les fonctions des enzymes (Dufour et al.,
1995). En effet, la pression peut modifier la cinétique des réactions enzymatiques, dû au
changement de conformation du substrat. Ce changement de conformation permet
l’exposition de certains liens peptidiques, préalablement enfouis au centre des protéines
natives (Olsen et al., 2003; Quiros, 2007). L’hydrolyse enzymatique s’en trouve donc
facilitée, car plus de sites de coupures sont alors accessibles (Chicon et al., 2006b;
Type d'interaction ∆Vdissociation (mL/mol) Effet de la pression
Covalente +10 Stabilisation Ionique -10 Déstabilisation Hydrogène +3 à -1 Stabilisation ou faible déstabilisation Hydrophobe <0 (-10 à -20) Déstabilisation
37
Quiros, 2007). L’augmentation de l’hydrolyse enzymatique modifie le profil peptidique
et favorise la génération d’un plus grand nombre de peptides libérés (Udenigwe & Aluko,
2012). Plusieurs études ont démontré que l’utilisation des HPH permet une augmentation
de l’hydrolyse enzymatique et donc du degré d’hydrolyse. Des travaux effectués sur la β-
lactoglobuline ont montré que son hydrolyse enzymatique était augmentée lorsque des
traitements de HPH étaient appliqués préalablement ou simultanément à l’hydrolyse
enzymatique (Chicon et al., 2006a). En effet, de telles observations ont été validées pour
différentes enzymes, telles la trypsine, la chymotrypsine et la pepsine à des niveaux de
pressurisation de 200 à 400 MPa pour des temps de traitement compris entre 15 à 30
minutes (Chicon et al., 2006b; Dufour et al., 1995; Knudsen et al., 2002; Penas et al.,
2006). De même Quiros et al. (2007) ont étudié l’effet de l’hydrolyse enzymatique de
l’ovalbumine simultanément à sa pressurisation et ont également conclu que le profil
peptidique est modifié et que l’hydrolyse enzymatique pouvait être améliorée. Ils ont par
ailleurs démontré que les HPH permettent aussi d’améliorer la bioactivité des hydrolysats
générés. En effet, lorsque l’ovalbumine est hydrolysée simultanément au traitement de
pressurisation (200 et 400 MPa), certains peptides possédant une activité antihypertensive
étaient libérés plus rapidement. D’autre part, diverses protéines d’origine végétale telles
que le soya (Penas et al., 2004), le pois (Chao et al., 2013) et la lentille (Garcia-Mora et
al., 2015) ont été étudiées. Tel que mentionné précédemment, les auteurs ont également
conclu que l’hydrolyse enzymatique augmentait suite à un traitement de HPH réalisée en
tant que prétraitement de la protéine (avant hydrolyse) ou simultanément à l’hydrolyse
enzymatique. Garcia-Mora et al., (2015) ont également étudié l’effet des HPH sur
l’augmentation de la bioactivité des peptides de lentille générés. Les activités
antioxydante et antihypertensive des peptides étaient améliorées lors de l’hydrolyse
enzymatique avec la Savinase simultanément au traitement de pressurisation à 300 MPa.
Chao et al. (2013) ont quant à eux déterminé qu’un prétraitement de pressurisation (200-
600 MPa) préalablement à l’hydrolyse enzymatique avec l’alcalase favorisait la
production de peptides antihypertenseurs.
38
Ainsi, les HPH pourraient être une solution efficace pour faciliter et améliorer
l’hydrolyse enzymatique, pallier à ses inconvénients mentionnés précédemment et même
augmenter la production de peptides bioactifs.
39
Chapitre 2
Hypothèse et objectifs
41
Au chapitre 1, il a été mentionné que les peptides issus de l’hydrolyse
enzymatique des protéines de graines de lin possédaient différentes bioactivités dont une
activité antioxydante (Marambe et al., 2008; Udenigwe & Aluko, 2010). Les HPH
modifient la structure protéique, permettant l’exposition de liens peptidiques enfouis au
cœur des protéines natives (Olsen et al., 2003; Quiros, 2007). Cette technologie à HPH
peut donc mener à l’augmentation de l’hydrolyse enzymatique et à une modification du
profil peptidique (Udenigwe & Aluko, 2012). Ainsi, davantage de peptides possédant une
activité antioxydante peuvent être libérés (Zhang et al., 2012). Ainsi, le chapitre 2
propose une hypothèse de recherche en lien avec la revue de littérature évoquée au
chapitre 1.
1. Hypothèse
L’application des HPH sur les protéines de la graine de lin modifie leur structure
protéique, augmente leur hydrolyse enzymatique par la génération de profils
d’hydrolysats différents et améliore l’activité antioxydante des hydrolysats finaux.
2. Objectifs
o Étudier les modifications de structure des protéines non pressurisées (natives) et
pressurisées.
o Caractériser les profils peptidiques des hydrolysats obtenus suite à l’hydrolyse
enzymatique des protéines natives et pressurisées.
o Déterminer les propriétés antioxydantes des hydrolysats témoin et obtenus suite à
la pressurisation des protéines.
43
Chapitre 3
Pretreatment of flaxseed protein isolate by high hydrostatic pressure: impacts on protein structure, enzymatic
hydrolysis and final hydrolysate antioxidant capacities.
45
Résumé
L’effet des hautes pressions hydrostatiques (HPH) sur la structure protéique du lin
et les profils peptidiques obtenus après hydrolyse enzymatique a été étudié. Ainsi, un
isolat protéique de lin (1% m/v) a été soumis à un prétraitement par les HPH (600 MPa, 5
ou 20 min à 20 °C). Par la suite, les protéines pressurisées ont été hydrolysées par la
trypsine seule ou par la trysine puis la pronase (trypsine-pronase). Les analyses de
spectrofluorimétrie ont montré que le niveau de pression appliqué ainsi que la durée de
pressurisation ont altéré la structure protéique puisque l’exposition de la tyrosine a été
modifiée. Également, les HPH ont induit la dissociation des protéines, ce qui a permis la
formation d’agrégats de plus grande taille selon la durée du traitement appliquée. Excepté
quelques peptides spécifiques dont la concentration a été modifiée, des profils
peptidiques similaires ont été obtenus après l’hydrolyse trypsique des isolats pressurisés.
Cependant, les hydrolysats générés par la condition par trypsine-pronase ont montré une
capacité antioxydante (ORAC) supérieure aux contrôles, confirmant que le prétraitement
de pressurisation augmente la libération de peptides antioxydants.
47
Abstract
The effect of high hydrostatic pressure (HHP) was investigated on flaxseed
protein structure and peptide profiles obtained after protein subsequent hydrolysis.
Isolated flaxseed protein (1% w/v) was pretreated with HHP (600 MPa, 5 min or 20 min
at 20 °C) prior to hydrolysis using trypsin only and trypsine-pronase. Fluorescence
spectroscopy showed that HHP treatment as well as processing duration had an impact on
flaxseed protein structure since exposition of tyrosine was modified. It was also
demonstrated that HHP treatment induced dissociation of flaxseed proteins and generated
higher molecular weight aggregates as a function of processing duration. Except for some
specific peptides which concentration was modified, similar peptide profiles were
obtained after tryptic hydrolysis of pressure-treated proteins. Finally, trypsine-pronase
hydrolysates demonstrated higher antioxidant capacity (ORAC) compared to control
which confirmed that pressure pretreatment of flaxseed protein isolate prior to hydrolysis
enhanced the generation of antioxidant peptides.
49
1. Introduction
Flaxseed is one of the most important oilseeds cultivated worldwide, especially in
Canada (Singh, Mridula, Rehal, & Barnwal, 2011) where 847,000 metric tonnes were
produced in 2014-2015 while expectations for 2015-2016 should reach about 975,000
metric tonnes (Agriculture and Agri-Food Canada, 2015). Flaxseed is generally processed
by cold pressing or solvent extraction to recover flaxseed oil for human consumption and
industrial applications while flaxseed waste materials were typically used in animal
feeding (Singh et al., 2011; Udenigwe, Adebiyi, Doyen, Li, Bazinet, & Aluko, 2012;
Udenigwe & Aluko, 2011). However, due to intensive exploration for innovative ways to
improve food by-products valorization, recent works demonstrated that flaxseed protein
hydrolysates exhibited specific bioactive activities and consequently represent an
interesting high added-value product for the nutraceuticals and functional food industries.
Flaxseed protein hydrolysates (FPH) were produced after enzymatic hydrolysis of
flaxseed globulins named linin 11S and 12S which represents 58-66% of the total protein
content and albumins conlinin 2S which represents 20-42% of the total protein fraction
(Chung, Lei, & Li-Chan, 2005; Madhusudhan & Singh, 1985; Rabetafika, Van
Remoortel, Danthine, Paquot, & Blecker, 2011; Truksa, MacKenzie, & Qiu, 2003).
Marambe, Shand, & Wanasundara (2008) demonstrated that flaxseed protein treated with
Flavourzyme® inhibited angiotensin converting enzyme (ACE) and hydroxyl radical
scavenging activities which suggests that FPH could act as antihypertensive and
antioxidant agents. Moreover, hydrolysis of flaxseed protein with pepsin, ficin, trypsin,
papain, thermolysin, pancreatin and alcalase showed an in vitro inhibition against ACE
and renin activities (Udenigwe, Lin, Hou, & Aluko, 2009). Another study demonstrated
that flaxseed protein hydrolysate recovered after alcalase digestion induced modification
of calmodulin structure, a protein known to be involved indirectly in the appearance of
neurodegenerative diseases (Omoni & Aluko, 2006). In addition, antioxidant and
antihypertensive bioactive peptides were recovered after flaxseed protein hydrolysis
using thermolysin and pronase (Udenigwe & Aluko, 2010). Recently, a fractionation
50
technology named electrodialysis with filtration membrane (EDMF) was used to improve
peptide purification and bioactivities. Thus, a tryptic-pronase FPH separated by EDMF
allowed the recovery of arginine-rich fractions which may contribute to reduce high
blood pressure and could be used as a source of antihypertensive agents (Udenigwe et al.,
2012). More recently, Doyen, Udenigwe, Mitchell, Marette, Aluko, & Bazinet, 2014
recovered specific FPH fractions after EDMF separation which demonstrated anti-
diabetic and antihypertensive activities.
Lately, high hydrostatic pressure (HHP) technology was used to improve
digestibility and enhanced protein hydrolysate bioactivities. Indeed, hydrostatic
pressurization applied to pea (Chao, He, Jung, & Aluko, 2013), lentil (Garcia-Mora,
Penas, Frias, Gomez, & Martinez-Villaluenga, 2015), soybean (Penas, Prestamo, &
Gomez, 2004), ovalbumin (Quiros, Chichon, Recio, & Lopez-Fandino, 2007) and β-
lactoglobulin (Knudsen, Otte, Olsen, & Skibsted, 2002; Maynard, Weingand, Hau, &
Jost, 1998) proteins modified peptide profiles ((Dufour, Herve, & Haertle, 1995) and
enhanced production of bioactive peptides (Chao et al., 2013; Garcia-Mora et al., 2015).
These results were obtained by the property of HHP to induce modification of protein
structure and conformation which enhanced the exposition of cleavage sites for enzyme
resulting in an increase of enzyme activity and degree of hydrolysis (Bonomi et al., 2003;
Chicon et al., 2006b; Olsen et al., 2003).
In this context, the aim of this work was to study the impact of HHP treatment on
flaxseed protein structure, as well as peptide profiles and antioxidant activity obtained
after subsequent enzymatic hydrolysis using trypsin and trypsin-pronase enzymatic
hydrolysis.
51
2. Materials and methods
2.1 Materials
Defatted flaxseed meal (Bioriginal Food & Science Corporation, Saskatoon, SK,
Canada) was kindly given by Dr. Aluko (University of Manitoba). Meal contained 36.1 ±
0.1% proteins, 5.38 ± 0.02% ashes and 5.96 ± 0.07% humidity. Cellulase from
Aspergillus niger and trypsin from bovine pancreas were purchased from Sigma-Aldrich
(Saint-Louis, MO, USA). Pronase from Streptomyces griseus was obtained from Roche
Diagnostics GmbH (Mannheim, Germany). NaOH pellets ACS were purchased from
BDH (Radnor, PA, USA) and HCl Certified ACS Plus from Fisher Scientific (Oakville,
ON, Canada).
2.2 Flaxseed protein isolate
Flaxseed protein isolate was prepared according to the method described by
Udenigwe et al., (2009). Briefly, 250 g of defatted and grinded flaxseed meal were
suspended in 5 L of deionized water (5% w/v) and stirred with a magnetic stirrer. The
flaxseed solution was adjusted to pH 5.0 with 6N HCl at 37°C and afterward 5 g of
cellulase were added (2% w/w, activity of powder of 1.6 U/mg). In order to initiate fibre
hydrolysis and to improve protein extraction, the mixture was stirred for 4h. At the end,
the pH was raised to 10.0 with 2N NaOH to inhibit cellulase activity. The resulting
suspension was cooled at 4°C and centrifuged at 7000 rpm for 20 min. The supernatant
was collected and stored overnight at 4°C. Then, flaxseed proteins were precipitated by
decreasing the pH to 4.2 with 6N HCl and the suspension was centrifuged at 7000 rpm
for 20 min. All the extractions were pooled together. The resulting precipitate was
collected and washed thrice with water acidified at pH 4.2 and centrifuged at 7000 rpm
for 10 min. A small volume of water was added and the pH was adjusted to 7.0 with 2N
NaOH. The suspension was freeze-dried and stored at 4°C in a vacuum dessicator. This
52
product was used as the flaxseed protein isolate (FPI) and contained 82% protein
determined with the Dumas combustion method (Truspec, LECO Corporation, St.Joseph,
MI, USA) using a conversion factor of 6.25 to convert from percentage nitrogen to
protein content (Simonne, Simonne, Eitenmiller, Mills, & Cresman, 1997).
2.3 High hydrostatic pressure treatment
Freeze-dried FPI was suspended in deionized water at a concentration of 1% w/v,
stirred overnight at 4°C and transferred into polyethylene terephtalate bottles (Groupe
Ampak, Laval, QC, Canada). High hydrostatic pressure treatments of FPI solutions were
performed at industrial scale using a discontinuous hydrostatic pressurization unit
(Hiperbaric 135, Hiperbaric, Burgos, Spain) equipped with a 135 L volume vessel using
water as the pressure transmitting fluid. The pressure level was set at 600 MPa, during 5
or 20 min at 20 °C. This pressure level was selected according to Puppo et al., (2004)
who demonstrated that pressure ranging between 400 and 600 MPa induced denaturation
of soybean proteins. For the treatment duration, it was selected according to studies who
performed high pressure treatments from 5 to 20 minutes on different proteins such as
soy (Wang, Tang, Li, Yang, Li & Ma, 2008), β-lactoglobulin (Chicon et al., 2006a,b) or
lentil (Garcia-Mora et al., 2015). Then, a shorter and a longer treatment time of 5 and 20
min were selected. Treatment pressure was reached in approximately 3 min and
decompression was instantaneous. Control consisted of non-pressurized FPI solution (0.1
MPa). All experiments were repeated three times for each treatment. Finally, pressurized
samples were kept at 4°C for further experiments.
53
2.4 Flaxseed protein hydrolysis
Flaxseed protein hydrolysis was carried out using trypsin and trypsin-pronase at
atmospheric pressure as previously described by Udenigwe et al., (2012) and Doyen et
al., (2014) but with some modifications on each pressurized sample. Thus, 100 mL of
control and pressurized flaxseed protein isolate solution were adjusted to pH 7.0 with
0.5N NaOH at 37°C. Trypsin was added at an E/S ratio of 2:100 to initiate protein
hydrolysis and pH and temperature conditions described previously were maintained
during 2h. The reaction was stopped by decreasing the pH to 4.0 with 0.5N HCl and the
hydrolysate was cooled to room temperature. Solutions were centrifuged at 7000 rpm for
1h and supernatants were collected. The pH was adjusted to 6.5 with 0.5N NaOH and
supernatants were freeze-dried for analyses. These samples were used as the tryptic
flaxseed protein hydrolysate (FPH) for further analyses.
Concerning trypsin-pronase hydrolysis on each pressurized samples, freeze-dried
tryptic FPH (1% w/v) was solubilized in deionized water and pH was adjusted to 7.4 with
0.1N NaOH at 40°C. Pronase was added to the tryptic FPH at an E/S ratio of 1:100. The
pH was maintained at 7.4 during 2h using 0.1N NaOH. The reaction was stopped by the
addition of 0.5N HCl until pH 4.0. The resulting solutions were cooled to room
temperature and centrifuged at 7000 rpm for 1h. Finally, the supernatants were collected
and the pH was adjusted to 6.5 with 0.1N NaOH and freeze-dried for analyses. These
samples were used as the trypsin-pronase FPH.
2.5 Analyses
2.5.1 Electrophoresis
Control and pressurized flaxseed proteins were analyzed by SDS-PAGE in 12%
polyacrylamide gels (Mini-Protean, Precast Protein Gels, Bio Rad) with denaturing agent
(sodium dodecylsulfate) but in non-reducing conditions. Afterwards, 1 mL of the 1% FPI
suspension was added to 0.375 mL of sample buffer (1X) and 0.125 mL of deionized
54
water to achieve a final volume of 1.5 mL. The samples were centrifuged at 13 000 rpm
for 10 min and the supernatant was collected. Two microliters of the supernatant were
loaded in the well, for control and HHP conditions (5 and 20 min). Five microliters of
molecular weight markers (Precision plus # 161-0374, BioRad, Mississauga, ON,
Canada) were loaded in the first well. Tris-glycine-SDS running buffer (10X) was added
in the chamber and migration was performed at constant 200 Volts during around 30 min.
SDS-PAGE gel was stained with Coomassie Brilliant Blue R-250 and destained with a
30% methanol and 10% acetic acid solution. The gel was analysed using the ImageJ
software (ImageJ, 1.48v, National Institutes of Health, USA, http://imagej.nih.gov/ij).
2.5.2 Spectrofluorimetry
Fluorescence analyses were performed using a Cary Eclipse Fluorescence
Spectrophotometer, (Agilent Technologies, California, USA). Firstly, control and
pressurized flaxseed proteins samples were centrifuged at 5000 rpm for 5 min to recover
soluble protein. Supernatants were then collected and the intrinsic fluorescence was
measured using tyrosine and tryptophan excitation wavelength of 274 and 280 nm,
respectively. These two hydrophobic residues were analyzed since the modifications of
their fluorescence spectra represent an indicator of changes in protein structure and
conformation (Liang & Subirade, 2012) Shpigelman, Israeli, & Livney, 2010). The
fluorescence emission spectra was analysed between 410 and 430 nm for tyrosine and
between 375 and 390 nm for tryptophan. Average intensity values were recorded for each
treatment (control, 600 MPa 5 and 20 min).
2.5.3 Particle size distribution
Control and pressurized flaxseed proteins were firstly centrifuged at 5000 rpm for
5 min and the supernatants were collected. Particle size distributions were measured in
triplicate using a Mastersizer 3000 (Malvern Instruments Ltd, Malvern, UK). Optical
parameters used were refractive indices of water and particles of 1.33 and 1.47,
55
respectively. Results were expressed in volume density as a function of particle size
population.
2.5.4 Peptide profiles and molecular weights
Peptide composition and molecular weight of FPH generated after trypsin and
trypsin-pronase hydrolysis were analyzed by RP-HPLC and HPLC-MS according to
Firdaous et al., (2009) but with minor modifications. Firstly, freeze-dried trypsin and
trypsin-pronase FPH samples were solubilized in deionized water at a concentration of 5
mg/mL and 2mg/mL respectively and filtered through 0.45 µm PTFE membranes. The
injected volumes were 20 µL for trypsin FPH and 15 µL for trypsin-pronase FPH onto an
Agilent 1100 series system (Santa Clara, CA, USA). Peptides were analyzed with a Luna
5 µm C18 column (2 mm i.d. x 250 mm, Phenomenex, Torrance, CA, USA). Solvent A,
TFA 0.11% (v/v) in water and solvent B, acetonitrile/water/TFA (90%/10%/0.1% v/v)
were used for elution at flow rate of 0.2 mL/min. A linear gradient of solvent B, from 2%
to 100% in 110 min was used. Detection of peptides was performed at a wavelength of
214 nm (Doyen et al., 2014). To reduce the TFA effect, mass spectrometry analysis was
performed after infusing a mixture of 50% propionic acid and 50% isopropanol to the
existing flow. Signals were recorded in positive mode using a scan range of 300-3000
m/z. Nitrogen was the drying gas at 8 L/min and 350°C and the nebulizer gas at 30.0 psi.
Data acquisition and analysis of peptides were realized with the LC/MSD ChemStation
software.
2.5.5 Antioxidant activity
Oxygen radical absorbance capacity assays were performed in triplicate on freeze-
dried FPI tryptic and trypsin-pronase hydrolysates, using a Fluostar Galaxy fluorometer
(BGM LabTech, Durham, NC). The protocol used was similar to the one published by
Bazinet, Cossec, Gaudreau & Desjardins (2009) but with few modifications. Firstly, 10
mL of a solution of AWA (70% acetone/10% water/0.5% acetic acid) was added to 0.1 g
56
of flaxseed hydrolysates and stirred for 30 s. Then the samples were sonicated for 5 min
with vigorous stirring. Samples were cooled to room temperature for 10 min, stirred
vigorously two times during that period and centrifuged at 4000 rpm for 15 min.
Supernatant was collected and extraction was performed once again. AWA solution was
added to achieve a final volume of 25 mL. Samples were diluted 1/100 and 1/150 for
tryptic and trypsin-pronase flaxseed hydrolysates respectively. Trolox was used as a
control standard and results were reported as micromoles of Trolox equivalent (TE) per
gram of freeze-dried samples (µmol TE/g).
2.5.6 Statistical analyses
Data obtained (three repetitions per treatment) were reported as mean ± standard
deviation and were subjected to a one-way ANOVA. A two-way ANOVA was performed
for antioxidant assays. Statistical differences were analysed by Duncan’s multiple range
test (P<0.05) using Sigma Plot software (Systat Software, San Jose, CA).
3. Results and discussion
3.1 Electrophoretic analyses
The SDS-PAGE patterns presented in Fig. 8 represent the molecular weight
distribution of control flaxseed protein isolate or samples recovered after high pressure
treatments. It appeared that similar protein patterns were observed whatever the treatment
condition applied. Indeed, protein bands with molecular weight around 10-11 kDa,
between 25 and 50 kDa and at 100 kDa were detected (Fig. 8). As published before
(Rabetafika et al., 2011), SDS-PAGE of linin 12S, also called globulin, from flaxseed
proteins consisted of 5-11 subunits. It was also reported that flaxseed proteins contained
subunits corresponding to the 12S protein from flaxseed with molecular weights of 11,
18, 29, 42 and 61 kDa (Madhusudhan & Singh, 1985). This would suggest that bands
57
around 10 kDa and between 25 and 50 kDa correspond to flaxseed globulins. Bands
around 10 and 50 kDa appeared to be the most intense, and corresponded to the ones
reported by Chung et al. (2005), of 10, 11 kDa and 48 kDa, respectively for globulins.
Figure 8. Non-reducing SDS-PAGE patterns of (a) control and pressure treated flaxseed protein isolate at 600 MPa for (b) 5 min and (c) 20 min. Protein standard marker was run
on pattern (d).
As seen in Fig. 8, control and pressure-treated samples demonstrated some
differences in terms of bands intensities, specifically in the three zones named A, B and C
corresponding to, respectively, 30-50 kDa, 15-20 kDa and 10-15 kDa molecular weight
fractions already reported by Chung et al., (2005) for flaxseed proteins. Indeed, relative
intensity of the band associated to zone "A" increased with HHP treatments, from control
to 20 min of pressurization, indicating that pressurization increased the formation of
protein with molecular weights ranging from 30 to 50 kDa. At the opposite, low
molecular weight protein concentration decreased in zone "C", after HHP treatment at
600 MPa during 20 min compared to non-pressurized and HHP-treated flaxseed samples
58
at 600 MPa for 5 min. Finally, concentration of protein molecular weight ranging from 15
to 20 kDa decreased after HHP treatment presuming that these subunits would aggregate
to form larger subunits. Therefore, it appeared that similar protein bands were observed
for all HHP treatments indicating that pressurization did not generate new protein band
and/or subunits. It indicated that HHP treatment generated more subunits with higher
molecular weight subunits and less low molecular weight subunits by the association of
small subunits with larger ones to generate aggregates. As previously observed for soy
proteins (Yang, Yang, Gao, & Chen, 2014; Zhang et al., 2012), no changes in the
molecular weight distribution of flaxseed proteins were observed after HHP treatment;
this confirmed that no flaxseed proteins dissociation occurred after HHP treatments, but
would lead to rearrangements of subunits.
3.2 Spectrofluorimetry
Modification of flaxseed structural conformation subjected to HHP treatment was
studied by change of tyrosine and tryptophan fluorescence signals (Fig. 9). For tyrosine
(Fig. 9a), the fluorescence intensities were 293.8 ± 10.3; 315.6 ± 17.0 and 245.3 ± 1.3 for
control, 600 MPa/5 min and 600 MPa/20 min, respectively. Significant differences were
observed between control and 600 MPa, 20 min (P<0.001) as well as both HHP
treatments (P<0.001). For tryptophan (Fig. 9b), no significant difference (P>0.05) were
observed whatever the conditions studied (control and pressurized samples).
For tyrosine, the fact that HHP treatments decreased the fluorescence intensities
was explained by the more stable structure formed due to protein-protein interactions
which led to aggregations, even if the residue after centrifugation was put aside and not
considered. The more stable structure might also be interpreted by the aggregation or the
re-association of exposed hydrophobic groups (Chao et al., 2013; Wang et al., 2008).
Polarity of the environment of tyrosine residues essentially determined the intrinsic
fluorescence spectrum by their specific interactions and conformations. Interactions of
the chromophores with proteins solvent provided a decrease in the quantum yield of
59
fluorescence (Pallares, Vendrell, Aviles, & Ventura, 2004). While pressure was applied
on FPI, it ruptured hydrophobic interactions, exposing hydrophobic groups to the protein
surface, previously buried in the center of the protein, causing a partial denaturation.
After pressure released, interactions could have occurred between exposed hydrophobic
groups, leading to aggregation (Garcia-Mora et al., 2015; (Yin, Tang, Wen, Yang, & Li,
2008). For tryptophan, the absence of signal modification could be explained by the
protein structure. Indeed, residues like tryptophan and tyrosine act as fluorophores and
are generally partially or completely buried in the protein structure and hindered from the
solvent (Matyus, Szollosi, & Jenei, 2006). It was possible that tryptophan residues were
more buried in the protein hydrophobic core and consequently less accessible to the
solvent than tyrosine residues. It might explain why tryptophan fluorescence intensity
was less important than tyrosine.
Figure 9. Tyrosine (a) and tryprophan (b) fluorescence intensities of control and pressure-treated flaxseed isolate at 600 MPa during 5 or 20 min.
60
3.3 Particle size analyses
Particle size distributions of control and pressurized samples in supernatant after
centrifugation, presented in Fig. 10 differed as a function of treatment. Indeed, for
control, about 75% of particles had an averaged size of 5 µm while a small percentage
(less than 10%) of large particles (~100 µm) was observed for soluble particles after
centrifugation. Concerning pressure-treated flaxseed protein, a decrease in 5 µm particle
sizes was observed whatever the treatment duration while molecule population of about 1
µm appeared. Moreover, pressurization at 600 MPa during 20 min increased the large
particles (~100 µm) population compared to the control and the 5 min HHP treatment.
These two results were in accordance with previous works which demonstrated that HHP
treatment on ovalbumin (Quiros et al., 2007) and β-lactoglobulin ((Dumay, Kalichevsky,
& Cheftel, 1994) induced disorganization of protein weak bonds leading to their
denaturation and aggregation. Indeed, HHP had an effect on tertiary and quaternary
structure of proteins and only a small influence on primary and secondary structure
(Zhang, Li, Tatsumi & Kotwal, 2003; Zhang et al., 2012). Furthermore, non-covalent
interactions within protein molecules are affected by high-pressure treatments ensuring
reformation of intra and intermolecular bonds between or within the molecules (Messens,
VanCamp, & Huyghebaert, 1997; Rastogi, Raghavarao, Balasubramaniam, Niranjan, &
Knorr, 2007). Consequently, HHP treatment of flaxseed proteins induced the generation
of small particle size, suggesting the creation of monomers, as reported by Pin, Royer,
Gratton, Alpert, & Weber (1990) and Balny & Masson (1993) who observed that
pressure treatment dissociated proteins dimers into monomers. According to these results,
it appeared that FPI were dissociated into smaller units during pressurization and protein
aggregation occurred after pressure release or during storage.
61
Figure 1. Particle size distributions of non-pressurized and pressure-treated flaxseed protein isolate at 600 MPa during 5 or 20 min.
3.4 Peptides analyses
Fig 4 represents the peptide profile of control and pressurized FPI (600 MPa, 5
min or 20 min) after tryptic hydrolysis and centrifugation. The entire chromatogram of
non-pressurized (control) conditions (Fig. 11a) was presented and was separated in three
parts (Fig. 11b, c and d) to overlay the pressurized treatments (600 MPa/5 min and 600
MPa/20 min). According to Fig. 4, no change in the peptide profile was observed
whatever the conditions of pressurization. However, specific peaks numbered from 1 to 6
showed significant differences between all treatments (Fig. 11). Indeed, as presented in
Table 6, peaks 1 and 3 for control and HHP/20 min conditions were similar but they
increased (P<0.05) significantly for HHP/5 min condition. Concerning peaks 2 and 6,
similar area were obtained for control and 600 MPa/5 min conditions. However, a
treatment of 600 MPa/20 min (P<0.05) decreased the area of peak 2 but increased
drastically peak 6 area compared to control and 600 MPa/5 min conditions. Area of peak
62
4 showed a decrease (P<0.05) as a function of pressurization duration while HHP
treatments had no impact on peak 5 area, which was lower than the control condition
(P<0.05).
According to MS analysis (Table 6), the same peptide molecular weights were
detected in peaks 1 to 6 whatever HHP treatments. These results suggested that HHP did
no extend hydrolysis since peptide profiles of flaxseed protein hydrolysates were similar.
However, pre-hydrolytic pressurization of flaxseed protein modified the areas under the
peak and consequently the peptide concentration. This result was in accordance with
Maynard et al., (1998) that studied the effect of high pressure treatment of β-
lactoglobulin and demonstrated that hydrolysis performed after protein pressurization
improved proteolytic attack but had a minor impact on peptide composition.
Trypsin-pronase hydrolysis was also performed after hydrolysis with trypsin.
However, no significant differences were observed in terms of peptide profiles (see
supplementary material), peptide peak area and molecular weight whatever HHP
treatment applied (results not presented). Indeed, pronase is a non-selective enzyme,
cleaving any bonds, so whatever the treatment applied, non-significant differences
appeared at the end of the hydrolysis although some differences were present after the
tryptic hydrolysis. Otherwise, contrary to the expectations, even if pronase is a non-
selective enzyme, no more peptides were produced after tryptic hydrolysis.
63
Figure 2. RP-HPLC profiles of tryptic hydrolysates of flaxseed protein isolate of (a) control and the three treatments overlaid between retention times of (b) 5 and 30 min, (c)
30 and 50 min and (d) 50 and 62 min.
64
Table 6. RP-HP LC and MS results for peaks presenting significant differences after tryptic hydrolysis of controls and HHP samples.
Liquid chromatography Mass spectrometry
Peak Treatment Retention time (min) Peak area (a.u.) Molecular weight (Da)
1
Control, 0,1 MPa 12.1
516.3 ± 128.3a
716, 804, 963 600 MPa, 5 min 750.5 ± 26.7b
600 MPa, 20 min 572.5 ± 39.1a
2
Control, 0,1 MPa 22.8
532.6 ± 18.7a
770 600 MPa, 5 min 584.3 ± 39.8a
600 MPa, 20 min 463.4 ± 18.2b
3
Control, 0,1 MPa 29.9
1008.5 ± 11.6a
808 600 MPa, 5 min 1092.5 ± 29.2b
600 MPa, 20 min 1030.8 ± 32.0a
4
Control, 0,1 MPa 44.3
1910.7 ± 355.1a,b
925 600 MPa, 5 min 2245.7 ± 118.0a
600 Ma, 20 min 1654.4 ± 74.2b
5
Control, 0,1 MPa 56.0
1586.2 ± 410.1a
701, 724, 873, 918, 1263, 2713, 2735, 2750
600 MPa, 5 min 781.8 ± 385.8b
600 Ma, 20 min 638.6 ± 68.1b
6
Control, 0,1 MPa
58.9
3836.5 ± 427.9a
724, 1262, 2951 600 MPa, 5 min 4387.6 ± 486.6a
600 Ma, 20 min 5907.9 ± 885.1b
65
3.5 Antioxidant capacity
ORAC assays were performed on tryptic and tryptic-pronase hydrolysates
obtained after enzymatic digestion of control (0.1 MPa) and pressure-treated (600 MPa, 5
min or 20 min) flaxseed proteins. Differences of antioxidant capacity were observed as a
function of HHP conditions for both enzymes. Concerning tryptic hydrolysate, ORAC
values of 264.09 ± 16.70, 339.36 ± 29.81 and 313.29 ± 23.93 µmol TE/g were obtained
for control, HHP/600 MPa for 5 min and 20 min, respectively. While no significant
difference was observed between treatments (P=0.058), a tendency (Fig. 12a) indicated
that high pressure may increase hydrolysate antioxidant activity in comparison with the
control condition. Concerning trypsin-pronase hydrolysates, antioxidant activities were
410.93 ± 7.18, 501.88 ± 64.12 and 596.88 ± 73.73 µmol TE/g for control, HHP for 5 min
and 20 min, respectively. Consequently and contrary to tryptic flaxseed samples, ORAC
activity of trypsin-pronase hydrolysate for the HHP 600 MPa/20 min condition was
higher (P=0.039) than control trypsin-pronase hydrolysate (Fig. 12b). For a same
treatment condition, antioxidant capacity of trypsin-pronase were 1.55 times higher than
trypsin control, 1.47 times for 600 MPa/5 min and 1.90 times higher for 600 MPa/20 min.
Moreover, it can be noticed that HHP duration had an effect on antioxidant activity since
HHP/600 MPa for 20 min induced the highest antioxidant activity whatever the
conditions applied. Finally, no interactions occurred between the three treatments and the
two enzymes used (P=0.978). Thus, flaxseed protein dissociation and particle size
decreased due to HHP treatments (see section 3.3) could favored enzymatic hydrolysis
and generated higher concentration of low molecular weight antioxidant peptides. These
results can be compared to lentil (Garcia-Mora et al., 2015) and pea hydrolysates (Girgih,
Chao, Lin, He, Jung, & Aluko, 2015). For untreated lentil hydrolysates, ORAC values
were ranged between 224-251 µM TE/g according to the protease used and exhibited
higher or lower ORAC values depending of the pressure treatment intensity and the
protease used, which is quite different than the results obtained for flaxseed hydrolysates
submitted to HHP pre-treatments. However, ORAC values of 502 µM TE/g were
obtained for untreated pea hydrolysates, which increased to 978 µM TE/g after HHP
treatment at 600 MPa for 5 min (Girgih et al., 2015). Consequently, a similar increase of
66
antioxidant activity was obtained between control and pressure-treated pea and flaxseed
protein (1.95 for pea and 1.90 for flaxseed) which demonstrated that HHP treatment
improved the antioxidant capacity of enzymatic flaxseed protein.
Moreover, according to statistical analysis, enzymatic hydrolysis conditions and
high pressure treatment had a significant impact (P<0.001) on flaxseed samples
antioxidant activity. Indeed, ORAC value for trypsin hydrolysate was 309.11 ± 40.57
µmol TE/g whereas trypsin-pronase hydrolysate demonstrated higher antioxidant
capacity with value of 514.77 ± 93.68 µmol TE/g. It represented an ORAC enhancement
of 1.7 times greater for trypsin-pronase compared to trypsin hydrolysate. This result was
explained by the hydrolysis extend induced by pronase and consequently, the generation
of lower molecular weight peptides which generally demonstrated highest bioactivities
(Korhonen & Pihlanto, 2003). However, concerning antioxidant capacity, results
published by Marambe et al., (2008), Udenigwe & Aluko (2010) and Udenigwe et al.
(2009) were contrary to these results. These differences can be explained by the
experimental conditions such as the enzymes used or the hydrolysis duration.
Figure 3. Antioxidant capacity of non-pressurized and
pressure-treated trypsin (a) and trypsin-pronase (b) flaxseed protein hydrolysates.
67
4. Conclusions
The use of HHP treatment at 600 MPa during 5 and 20 min induced flaxseed
proteins dissociation and aggregation. These structural modifications had an impact on
further protein hydrolysis and final hydrolysate antioxidant activity. Indeed, tryptic
hydrolysis performed on pressurized flaxseed protein modified the concentration of
specific peptides without new peptide generation. However, no difference was observed
after trypsin-pronase hydrolysis of tryptic fractions in terms of peptide profile and
concentration. Nevertheless, this study demonstrated that flaxseed protein pre-treatments
by HHP improved the antioxidant capacity of enzymatic flaxseed protein. Indeed,
hydrolysis with trypsin-pronase showed a higher antioxidant activity than trypsin alone.
Also, treatment at 600 MPa for 20 min increased antioxidant activity of flaxseed protein
hydrolysates when hydrolyzed with trypsin-pronase. Consequently, HHP represents an
innovative technology to produce bioactive hydrolysate. To our knowledge, it was the
first time that high hydrostatic pressure was carried-out on flaxseed proteins in regards of
protein structure and peptide profiles analyses. Consequently, it would be interesting to
perform flaxseed protein hydrolysis under HHP treatments at the same pressure and to
perform with bioactivity analysis such ACE inhibition assays on resulting flaxseed
peptides fractions because food-derived peptides can be used in human diets against
hypertension.
68
Supplementary material
Figure 13. RP-HPLC profiles of flaxseed protein hydrolysates obtained by hydrolysis with trypsin-pronase of untreated flaxseed protein isolate after 2h of hydrolysis at 40°C
and at atmospheric pressure.
69
Table 7. RP-HPLC results for peptides obtained by tryptic hydrolysis of untreated flaxseed protein isolate and flaxseed protein isolate exposed to HHP treatment at 600 MPa during 5 and 20 min, respectively.
Peak Average control 0.1 MPa Average 600 MPa
5 min Average 600 MPa
20 min
Retention time (min)
Area (u.a.) Retention time (min)
Area (u.a.) Retention time (min)
Area (u.a.)
1 7.83 ± 0.05 1364.8 ± 144.7 7.71 ± 0.02 1256.4 ± 77.9 7.7 ± 0.4 1087.3 ± 125.5 2 8.61 ± 0.02 2314.8 ± 139.2 8.45 ± 0.05 2163.0 ± 139.2 8.3 ± 0.4 1480.5 ± 676.4 3 9.043 ± 0.008 1338.1 ± 287.4 8.99 ± 0.02 1086.3 ± 110.4 9.0 ± 0.7 640.0 ± 288.3 4 10.02 ± 0.09 680.3 ± 410.8 9.90 ± 0.02 243.7 ± 92.8 9.8 ± 0.7 331.9 ± 251.7 5 10.68 ± 0.03 886.0 ± 190.1 10.59 ± 0.04 676.8 ± 67.1 10 ± 1 966.3 ± 374.7 6 12.13 ± 0.02 516.3 ± 128.3 12.00 ± 0.02 750.5 ± 26.7 11 ± 1 572.5 ± 39.1 7 12.87 ± 0.01 943.4 ± 370.0 12.72 ± 0.05 1115.4 ± 26.9 12.3 ± 0.8 812.6 ± 59.1 8 13.8 ± 0.1 141.2 ± 24.5 13.59 ± 0.04 131.6 ± 41.4 13 ± 1 105.2 ± 69.3 9 14.84 ± 0.04 834.3 ± 155.6 14.58 ± 0.07 990.7 ± 95.0 14.6 ± 0.8 1012.4 ± 43.8
10 16.28 ± 0.06 2428.0 ± 253.9 16.0 ± 0.1 2548.7 ± 78.2 15.9 ± 0.5 2820.3 ± 970.1 11 17.0 ± 0.1 3943.7 ± 30.1 16.8 ± 0.1 4027.8 ±222.4 16.8 ± 0.8 2135.1 ± 1282.7 12 18.53 ± 0.04 1407.6 ± 66.2 18.30 ± 0.08 1430.6 ± 198.4 18.2 ± 0.8 1370.6 ± 188.5 13 19.6 ± 0.1 1542.1 ± 331.0 19.41 ± 0.08 1110.5 ± 349.6 19 ± 1 1038.5 ± 356.5 14 21.53 ± 0.06 595.1 ± 33.2 21.27 ± 0.07 628.3 ± 64.0 21.2 ± 0.5 600.3 ± 49.1 15 22.15 ± 0.02 237.0 ± 11.9 21.89 ± 0.07 249.3 ± 57.2 21.8 ± 0.4 304.5 ± 69.6 16 22.566 ± 0.004 87.1 ± 38.6 22.36 ± 0.06 78.0 ± 19.8 22.3 ± 0.3 90.5 ± 15.9 17 22.97 ± 0.03 532.8 ± 18.7 22.77 ± 0.04 584.3 ± 39.8 22.7 ± 0.5 463.4 ± 18.2 18 23.62 ± 0.06 414.9 ± 9.3 23.42 ± 0.03 487.9 ± 130.7 22.4 ± 0.7 360.6 ± 68.9 19 24.56 ± 0.05 879.0 ± 110.0 24.40 ± 0.03 899.1 ± 80.1 24.4 ± 0.2 869.5 ± 85.7 20 24.803 ± 0.008 264.7 ± 88.3 24.64 ± 0.05 219.7 ± 51.4 24.6 ± 0.3 198.2 ± 66.1 21 25.25 ± 0.04 394.6 ± 68.2 25.11 ± 0.02 484.6 ± 86.9 25.1 ± 0.3 403.1 ± 128.7 22 25.76 ± 0.04 630.7 ± 36.8 25.64 ± 0.02 681.4 ± 58.2 25.6 ± 0.8 694.9 ± 28.8 23 27.04 ± 0.08 1826.9 ± 16.6 26.90 ± 0.01 2043.0 ± 238.5 26.9 ± 0.4 1932.8 ± 87.3 24 27.61 ± 0.07 578.9 ± 445.3 27.49 ± 0.01 690.2 ± 152.3 27.5 ± 0.4 649.4 ± 221.5 25 28.30 ± 0.06 1018.9 ± 100.0 28.18 ± 0.02 1006.0 ± 67.5 28.2 ± 0.2 936.8 ± 157.4 26 28.51 ± 0.04 689.4 ± 87.8 28.42 ± 0.02 726.5 ± 127.3 28.4 ± 0.4 752.6 ± 26.6 27 29.12 ± 0.06 569.7 ± 65.6 29.01 ± 0.02 647.8 ± 114.1 29.0 ± 0.3 621.9 ± 52.2 28 29.68 ± 0.04 701.5 ± 175.2 29.58 ± 0.05 774.6 ± 38.0 29.5 ± 0.2 714.9 ± 123.9 29 29.95 ± 0.06 1008.5 ± 12.0 29.86 ± 0.01 1092.5 ± 29.2 29.9 ± 0.3 1030.8 ± 32.0 30 30.49 ± 0.06 1091.1 ± 34.4 30.38 ± 0.01 1076.4 ± 94.5 30.4 ± 0.2 1022.0 ± 86.1 31 30.84 ± 0.06 2304.1 ± 132.2 30.730 ± 0.007 2365.2 ± 21.8 30.7 ± 0.3 2058.7 ± 192.7 32 31.346 ± 0.004 284.6 ± 331.6 31.25 ± 0.03 128.9 ± 48.0 31.2 ± 0.2 160.3 ± 63.3 33 31.56 ± 0.04 353.0 ± 261.2 31.47 ± 0.02 228.3 ± 24.6 31.5 ± 0.2 210.8 ± 14.8 34 31.93 ± 0.05 619.1 ± 42.8 31.820 ± 0.003 559.4 ± 82.2 31.8 ± 0.2 530.6 ± 75.9 35 32.28 ± 0.06 1446.5 ± 26.3 32.171 ± 0.007 1640.9 ± 172.8 32.2 ± 0.7 1671.6 ± 83.3 36 32.62 ± 0.06 2033.2 ± 19.9 32.506 ± 0.008 2031.5 ± 214.5 32.5 ± 0.1 2025.6 ± 213.9
70
37 32.94 ± 0.08 439.1 ± 6.6 32.81 ± 0.02 421.6 ± 37.6 32.7 ± 0.3 453.7 ± 124.8 38 33.38 ± 0.07 108.6 ± 5.4 33.257 ± 0.007 136.2 ± 42.8 33.2 ± 0.1 132.0 ± 13.2 39 33.5 ± 0.1 95.4 ± 31.2 33.42 ± 0.02 67.8 ± 16.8 33.4 ± 0.3 100.3 ± 2.9 40 33.99 ± 0.09 430.7 ± 107.8 33.87 ± 0.01 338.4 ± 57.1 33.8 ± 0.5 399.7 ± 29.2 41 34.8 ± 0.1 2022.7 ± 19.9 34.66 ± 0.01 2032.2 ± 261.7 34.6 ± 0.2 1662.4 ± 184.3 42 35.1 ± 0.1 2485.6 ± 272.8 34.96 ± 0.01 2475.3 ± 211.8 34.9 ± 0.2 2216.9 ± 714.1 43 35.4 ± 0.1 2164.1 ± 167.7 35.26 ± 0.01 2351.3 ± 233.8 35.2 ± 0.2 2155.8 ± 659.5 44 35.8 ± 0.1 965.8 ± 52.0 36.0 ± 0.6 1058.0 ± 97.9 35.6 ± 0.2 1071.7 ± 59.4 45 36.1 ± 0.2 1071.7 ± 314.0 35.93 ± 0.01 938.1 ± 85.6 35.9 ± 0.2 845.1 ± 60.5 46 36.27 ± 0.09 407.6 ± 51.5 36.14 ± 0.02 399.8 ± 69.8 36.1 ± 0.3 454.6 ± 35.1 47 36.7 ± 0.2 7623.3 ± 165.9 36.57 ± 0.02 8142.5 ± 681.9 36.5 ± 0.3 7696.9 ± 429.5 48 37.3 ± 0.2 480.0 ± 143.3 37.09 ± 0.02 478.3 ± 101.4 37.1 ± 0.2 444.0 ± 98.0 49 37.6 ± 0.2 6564.3 ± 353.6 37.38 ± 0.03 6793.3 ± 654.1 37.3 ± 0.5 6964.3 ± 530.7 50 38.4 ± 0.2 6132.9 ± 1568.3 38.20 ± 0.04 5471.5 ± 599.2 38.1 ± 0.5 6083.3 ± 254.8 51 39.1 ± 0.2 2918.0 ± 125.2 38.92 ± 0.03 3294.9 ± 492.1 38.9 ± 0.4 3056.3 ± 163.2 52 39.8 ± 0.2 1979.7 ± 34.4 39.56 ± 0.04 2010.1 ± 236.9 39.5 ± 0.3 2112.5 ± 136.6 53 40.2 ± 0.2 2555.6 ± 98.2 39.95 ± 0.04 2815.7 ± 190.5 39.9 ± 0.3 3102.2 ± 384.1 54 40.6 ± 0.2 956.4 ± 20.7 40.42 ± 0.04 948.0 ± 154.7 40.3 ± 0.6 765.6 ± 47.2 55 41.5 ± 0.2 6789.0 ± 1841.6 41.30 ± 0.05 7369.1 ± 1570.2 41.2 ± 0.2 6962.4 ± 2038.7 56 41.8 ± 0.3 299.2 ± 164.8 41.62 ± 0.4 303.7 ± 125.3 41.5 ± 0.2 259.6 ± 71.4 57 42.2 ± 0.3 1817.7 ± 72.4 41.92 ± 0.03 1899.8 ± 189.9 41.8 ± 0.3 1706.6 ± 320.7 58 42.6 ± 0.3 358.7 ± 125.1 42.30 ± 0.04 372.5 ± 183.3 42.2 ± 0.3 501.7 ± 191.8 59 42.9 ± 0.3 6017.2 ± 769.1 42.64 ± 0.03 6165.5 ± 783.9 42.6 ± 0.2 6015.9 ± 574.0 60 43.2 ± 0.3 1018.4 ± 38.5 42.92 ± 0.03 1084.7 ± 20.3 42.9 ± 0.4 1152.9 ± 86.2 61 43.9 ± 0.3 934.5 ± 22.1 43.58 ± 0.03 984.4 ± 115.9 43.5 ± 0.3 1014.5 ± 61.3 62 44.3 ± 0.4 5659.9 ± 1523.8 44.02 ± 0.03 4936.5 ± 599.9 43.9 ± 0.2 5632.5 ± 288.4 63 44.5 ± 0.3 1910.7 ± 355.0 44.23 ± 0.04 2245.7 ± 118.0 44.1 ± 0.3 1654.4 ± 74.3 64 44.9 ± 0.3 828.8 ± 729.9 44.59 ± 0.04 1042.6 ± 285.7 44.5 ± 0.2 856.1 ± 352.3 65 45.1 ± 0.2 1204.8 ± 307.6 44.90 ± 0.04 1323.3 ± 249.3 44.8 ± 0.3 1437.9 ± 182.0 66 45.4 ± 0.1 2739.5 ± 371.2 45.22 ± 0.03 3042.9 ± 284.0 45.2 ± 0.3 2672.2 ± 702.8 67 45.85 ± 0.06 3396.2 ± 744.8 45.73 ± 0.03 3206.7 ± 144.9 45.7 ± 0.2 3857.5 ± 1676.9 68 46.1 ± 0.1 1345.0 ± 102.1 46.09 ± 0.02 1416.9 ± 122.8 46.1 ± 0.3 1274.0 ± 291.0 69 46.2 ± 0.8 3706.6 ± 427.7 46.64 ± 0.02 4040.2 ± 262.6 46.6 ± 0.4 4477.3 ± 329.8 70 47.2 ± 0.2 4620.2 ± 26.4 47.236 ± 0.007 5080.4 ± 181.6 47.2 ± 0.4 5651.5 ± 695.5 71 47.84 ± 0.09 361.4 ± 34.7 47.81 ± 0.01 244.4 ± 172.9 47.8 ± 0.3 158.5 ± 38.9 72 48.2 ± 0.1 113.1 ± 29.3 48.22 ± 0.02 132.4 ± 26.8 48.2 ± 0.5 110.8 ± 40.0 73 48.9 ± 0.2 375.9 ± 5.2 48.99 ± 0.03 277.4 ± 67.5 49.0 ±0.3 245.9 ± 47.4 74 49.5 ± 0.0 123.9 ± 0.0 49.49 ± 0.04 152.8 ± 53.5 49.4 ± 0.4 98.9 ± 35.7 75 50.0 ± 0.3 383.3 ± 165.8 50.10 ± 0.04 555.0 ± 84.5 50 ± 6 483.9 ± 178.4 76 50.3 ± 0.4 309.6 ± 9.5 50.48 ± 0.04 263.5 ± 33.2 50.4 ± 0.4 203.6 ± 4.5 77 50.8 ± 0.3 1994.4 ± 545.0 50.93 ± 0.02 1687.2 ± 162.5 50.8 ± 0.3 2607.6 ± 747.0 78 51.3 ± 0.4 1268.0 ± 341.7 51.43 ± 0.04 837.7 ± 221.8 51.3 ± 0.3 1519.5 ± 555.0 79 51.7 ± 0.4 522.1 ± 61.4 51.84 ± 0.04 529.2 ± 63.5 51.7 ± 0.5 859.5 ± 428.7
71
80 52.4 ± 0.3 129.0 ± 20.1 52.5 ± 0.1 119.8 ± 11.7 52.4 ± 0.6 111.8 ± 20.4 81 53.2 ± 0.4 1632.1 ± 360.6 53.41 ± 0.04 1630.3 ± 323.8 53.3 ± 0.4 1722.3 ± 57.7 82 53.8 ± 0.5 1745.6 ± 58.0 54.06 ± 0.05 1769.5 ± 120.6 53.9 ± 0.4 2206.9 ± 417.7 83 54.5 ± 0.4 118.6 ± 3.7 54.71 ± 0.04 153.9 ± 47.1 54.5 ± 0.3 160.4 ± 65.8 84 54.9 ± 0.4 778.5 ± 95.5 55.08 ± 0.04 848.2 ± 49.2 54.9 ± 0.4 986.4 ± 114.6 85 55.4 ± 0.4 127.2 ± 0.1 55.62 ± 0.05 144.4 ± 31.7 55.5 ± 0.3 239.1 ± 24.9 86 55.9 ± 0.4 466.2 ± 107.8 56.03 ± 0.07 269.7 ± 137.4 55.9 ± 0.2 201.5 ± 6.6 87 56.2 ± 0.3 1586.2 ± 410.1 56.31 ± 0.06 781.8 ± 385.8 56 ± 1 638.6 ± 68.2 88 58.14 ± 0.04 1536.0 ± 88.4 58.09 ± 0.08 1362.9 ± 250.9 57.9 ± 0.6 1901.8 ± 389.4 89 59.069 ± 0.002 3836.5 ± 427.9 58.93 ± 0.08 4387.6 ± 486.6 58.8 ± 0.7 5907.9 ± 885.1 90 60.2275 ± 0.0007 1177.9 ± 158.5 60.09 ± 0.08 1434.3 ± 184.3 59.9 ± 0.3 1810.4 ± 358.3 91 60.67 ± 0.06 296.8 ± 5.2 60.5 ± 0.1 392.8 ± 118.6 60.31 ± 0.02 458.6 ± 57.3
72
Table 8. RP-HPLC results for peptides obtained by trypsin-pronase hydrolysis of untreated flaxseed proteins isolate and flaxseed protein isolate exposed to HHP treatment at 600 MPa during 5 and 20 min respectively.
Peak
Average control
0.1 MPa
Average 600 MPa
5 min
Average 600 MPa
20 min
Retention
time (min) Area (a.u.)
Retention
time (min) Area (a.u.)
Retention
time (min) Area (a.u.)
1 5.81 ± 0.04 5733.6 ± 532.0 5.745 ± 0.005 6469.3 ± 426.6 5.735 ± 0.007 5569.7 ± 1241.8 2 13.5 ± 0.2 9128.0 ± 365.0 13.40 ± 0.04 9839.9 ± 759.3 13.46 ± 0.02 8795.9 ± 1713.6 3 15.3 ± 0.1 728.6 ± 118.3 15.23 ± 0.09 709.8 ± 58.3 15.33 ± 0.04 581.1 ± 186.3 4 17.8 ± 0.2 541.8 ± 178.0 17.9 ± 0.3 437.6 ± 49.5 17.6 ± 0.5 336.7 ± 21.1 5 22.0 ± 0.1 474.1 ± 20.7 21.86 ± 0.06 476.2 ± 18.6 21.95 ± 0.03 471.5 ± 122.2 6 22.6 ± 0.1 347.3 ± 6.9 22.57 ± 0.03 316.1 ± 61.3 22.66 ± 0.02 319.9 ± 40.3 7 22.9 ± 0.1 665.4 ± 12.6 22.89 ± 0.05 683.1 ± 88.0 22.968 ± 0.009 580.0 ± 124.6 8 24.60 ± 0.08 9287.6 ± 911.2 24.54 ± 0.03 11585.4 ± 1967.6 24.604 ± 0.008 10485.3 ± 2090.7 9 27.59 ± 0.06 443.5 ± 9.8 27.57 ± 0.03 407.8 ± 30.7 27.60 ± 0.01 361.0 ± 87.1
10 28.80 ±0.05 629.1 ± 38.3 28.774 ± 0.007 663.5 ± 82.9 28.817 ± 0.008 647.9 ± 68.2 11 29.73 ±0.05 397.6 ± 14.9 29.72 ± 0.02 427.8 ± 92.8 29.77 ± 0.03 356.2 ± 120.4 12 30.55 ±0.04 206.4 ± 21.4 30.571 ± 0.004 186.2 ± 36.0 30.61 ± 0.01 132.7 ± 3.5 13 30.96 ± 0.03 238.5 ± 9.1 30.99 ± 0.05 239.2 ± 25.4 31.04 ± 0.04 180.7 ± 84.1 14 31.74 ± 0.05 463.8 ± 15.3 31.75 ± 0.02 486.0 ± 58.1 31.77 ± 0.01 429.6 ± 119.5 15 34.21 ± 0.03 746.2 ± 17.5 34.22 ± 0.02 661.8 ± 16.8 34.26 ± 0.01 584.4 ± 124.6 16 34.915 ± 0.008 239.4 ± 28.9 34.97 ± 0.04 134.3 ± 38.8 34.97 ± 0.03 163.2 ± 38.3 17 37.90 ± 0.04 210.8 ± 44.1 37.89 ± 0.02 257.2 ± 13.3 37.95 ± 0.02 276.5 ± 68.7 18 38.33 ± 0.02 554.0 ± 29.6 38.37 ± 0.02 394.0 ± 55.0 38.42 ± 0.02 365.9 ± 83.6 19 38.85 ± 0.03 245.3 ± 18.7 38.86 ± 0.03 252.5 ± 50.9 38.92 ± 0.03 220.4 ± 59.6 20 41.38 ± 0.04 227.0 ± 94.3 41.38 ± 0.03 184.2 ± 47.9 41.41 ± 0.02 161.0 ± 74.4
73
Chapitre 4
Discussion générale, conclusion et perspectives
75
1. Retour sur l’hypothèse
Dans le cadre de ce projet de maîtrise, trois objectifs spécifiques ont été définis
dans le but de répondre à l’hypothèse de recherche, soit que l’application des HPH sur les
protéines de la graine de lin modifie leur structure protéique, augmente leur hydrolyse
enzymatique par la génération de profils d’hydrolysats différents et améliore l’activité
antioxydante des hydrolysats finaux.
D’abord, au premier objectif, il a été question de l’étude des modifications de
structure des protéines natives et pressurisées. Grâce au SDS-PAGE en conditions non-
dénaturantes, à la spectrofluorimétrie, par l’analyse des acides aminés tryptophane et
tyrosine et à l’analyse de la taille des particules, il a été possible de répondre à une partie
de l’hypothèse concernant l’impact sur la structure. En effet, selon les résultats obtenus,
le traitement de pressurisation à induit deux phénomènes distincts chez les protéines, soit
leur dissociation en sous-unités, de même que leur agrégation subséquente.
Le second objectif visait à caractériser les profils peptidiques et les propriétés
antioxydantes des hydrolysats obtenus suite à l’hydrolyse enzymatique des protéines
natives et pressurisées. L’analyse par HPLC-MS des hydrolysats obtenus a mis en
évidence certains éléments. D’abord, les profils peptidiques des hydrolysats obtenus à
partir de l’hydrolyse trypsique pour les trois traitements ont permis de constater que le
traitement de haute pression hydrostatique induisait des différences significatives pour six
pics. Par ailleurs, les analyses de spectrométrie de masse sur les différents hydrolysats ont
permis de démontrer que les poids moléculaires des peptides générés sont similaires quel
que soit le traitement appliqué. Cela implique donc que le traitement de HPH n’a fait que
modifier les proportions relatives des peptides, sans en générer de nouveaux. Cependant,
puisque les protéines des graines de lin ne sont pas séquencées, il n’est pas possible de
caractériser plus précisément les peptides générés. Ainsi, seules leurs masses
moléculaires sont connues. Par ailleurs, pour l’hydrolyse utilisant la trypsine-pronase,
aucune différence significative n’a été observée.
76
Concernant l’analyse de la capacité antioxydante des peptides tel qu’établi à
l’objectif 3, il ressort des résultats que l’hydrolyse utilisant la trypsine-pronase génère des
hydrolysats qui ont une activité antioxydante supérieure aux hydrolysats issus de
l’hydrolyse trypsique. De même, en comparant les hydrolysats en fonction du traitement
de pressurisation employé pour une même d’hydrolyse, il est possible de constater qu’il y
a eu une augmentation significative de l’activité antioxydante entre les échantillons non-
pressurisés et ceux pressurisés pendant 20 min. Ces résultats laissent entrevoir
l’importance de l’utilisation de la pronase à la suite d’une hydrolyse trypsique dans les
procédés d’hydrolyse enzymatique, tout cela dans une optique de développement
d’aliments fonctionnels et nutraceutiques.
L’hypothèse de cette étude a donc été confirmée. En effet, les HPH ont modifié la
structure protéique des graines de lin, par la dissociation en sous-unités et l’agrégation
subséquente. Quant au profil peptidique, aucun nouveau peptide n’a été généré suite au
traitement de pressurisation; seuls quelques peptides ont une concentration différente par
rapport à un contrôle non-pressurisé. Enfin, l’activité antioxydante a été amplifiée lorsque
l’hydrolyse enzymatique a été effectuée avec la trypsine-pronase.
2. Conclusion
L’utilisation des hautes pressions hydrostatiques à 600 MPa pendant 5 et 20 min
ont induit la dissociation des protéines de lin, de même que leur agrégation. Ces
modifications ont eu un impact sur l’hydrolyse enzymatique, de même que l’activité
antioxydante des hydrolysats. La concentration de certains peptides a été modifiée suite
au traitement de pressurisation lorsque l’hydrolyse a été effectuée avec la trypsine seule.
Cependant, aucun nouveau peptide n’a été généré. Concernant l’hydrolyse avec la
trypsine-pronase, aucune différence n’a été observée en termes de profil peptidique.
Selon nos connaissances, aucune recherche antérieure n’a utilisé les sur un isolat
protéique de lin afin d’évaluer les modifications de structure protéique et de caractériser
les profils peptidiques générés. Par ailleurs, cette étude a également démontré que le
77
prétraitement d’un isolat de protéines de lin pouvait augmenter l’activité antioxydante
lorsqu’hydrolysé avec la trypsine-pronase, pendant 20 min à 600 MPa, comparativement
au contrôle non-pressurisé et au traitement pendant 5 min. Ainsi, les HPH peuvent être
une technologie innovatrice pour la production d’hydrolysats bioactifs.
3. Perspectives
À partir de ces conclusions, quelques perspectives peuvent être suggérées afin
d’approfondir les connaissances sur la technologie et ses applications et compléter les
résultats obtenus.
o Effectuer l’hydrolyse enzymatique pendant la pressurisation des protéines,
contrairement à la pressurisation préalablement à l’hydrolyse. Ainsi, sous
l’effet de la pression, la protéine serait dépliée et les enzymes auraient plus
facilement accès aux sites de clivage (Lopez-Fandino, 2006), car l’agrégation
des protéines n’aurait pas le temps de se produire. Cependant, différentes
analyses supplémentaires seraient requises afin de vérifier l’effet des HPH sur
la structure et l’activité de l’enzyme seule, car leur réponse face à ce traitement
peut être différente, dépendamment de l’origine de l’enzyme, de la pression, de
la durée, de la température et même de la nature du substrat (San Martin et al.,
2002).
o L’utilisation d’une pression inférieure à 600 MPa pourrait avoir un tout
autre impact sur la structure protéique et il pourrait en résulter au final
l’augmentation de la capacité antioxydante.
o Dans le cadre de ce projet, seule l’activité antioxydante a été détaillée et
analysée, mais d’autres bioactivités pourraient faire l’objet d’une étude, par
exemple l’activité anti-hypertensive ou anti-diabétique.
78
o Enfin, le fractionnement des hydrolysats par électrodialyse avec membrane
d’ultrafiltration pourrait permettre de concentrer et de séparer les fractions
peptidiques, afin d’augmenter la capacité antioxydante et d’autres bioactivités.
79
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