présentée à l'université demontpellier ii...
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ACADÉMIE DE MONTPELLIER
UNIVERSITÉ MONTPELLIER II
_.. SCIENCES ET TECHNIQUffi DU lANGUEDOC -
THESE
présentée à l'université de Montpellier II Scienceset Techniques du Languedoc
pour obtenir le diplôme de DOCfORAT
SPÉCIALITÉ: GÉNÉTIQUE DES POPULATIONS
Formation Doctorale: Parasitologie
Éco e Doctorale: BSIAE
COMPARAISON4DES
PROPRIÉTÉS BIOLOGIQUES DE DIFFÉRENTS
CLONFS NATURELS DE TRYPANOSOMA (SCHIZOTRYPANUM) CRUZI,. .
CHAGAS, 1909, AGENT DE LA MALADIE DE CHAGAS
par
Laurent Jean-Pierre
SOL tenue le 6 MA/ 1994 devant le Jury composé de :
M. BOUIX G., Professeur, Université Montpellier Il
M. FRÉZIL J.-L., Directeur de Recherche, A>RSrOM, Montpellier
M. PRÉC/GOUT É., Maître de conférence, Université Montpellier 1
M. TIBAYRE~C M., Directeur de Recherche,ORSrOM, Montpellier
M. DE/-CAS E.. , Ma~tre 'de conférence, Université Lille Il
Comparaison des propriétés biologiques de
différents clones naturels de
Trypanosoma (schizotrypanum) cruzi,
Chagas, 1909,
agent de la maladie de Chagas.
REMERCIEMENTS
Les premiers remerciements iront à mes parents. Sans leur aide
financière, il m'aurait été impossible de parvenir à la fin de ce travail.
Réfléchir à la métacyclogenèse de Trypanosoma cruzi et faire attention à
son fric personnel, c'est comme rassembler Goldenberg et la mère Denis
dans le même pétrin (avec tout le respect que je leur dois) ; peut-être
un peu comique, sûrement même un peu risible, mais quel sport de
passer de l'un à l'autre. Pour m'avoir aidé dans ce sport, je remercie,
aujourd'hui, mes parents avec énàrmément de respect et de sincérité.
Pour pouvoir commencer et finir ce travail, il fallait qu'il y ait un
travail. Mes remerciements vont directement à Michel Tibayrenc, mon
chef de labo, mon directeur de thèse, mon pourvoyeur de post-doc et
bien sûr membre du jury.
Le Grand Zym (c'est lui!) m'a allègrement bousculé sur les rails de la «
zymodémologie » ; je fus bercé à coup de zymodèmes, clones, clonets,
génotypes, clonalité, déséquilibre de liaison, etc. (assez, assez!). Je vous
l'avoue: je suis maintenant totalement obsédé.
Mon' terrain de manœuvre fut la cime de l'ORSTOM, j'entends le 2°
étage. Directement sous la verrière, comme une plante dans une serre
(que c'était bon!), j'ai frotté mes feuilles avec tous les joyeux drilles de
cette partie du monde (Place de l'Amérique) : Alexis, Pascal2 (G. et M.),
Bruno, Christian2 (B. et P.), Stephane, Trimôsse, Issa, Anne-Laure, Kasia,
Brigitte, Susana (jHolà!), Souha, Françoise2 (G. et M.D.), Malika, Johanne,
Frédérique2 (T. et B.), Lorena, Marta, Ari, Jaimie, Jean-Loup, Denis,
Estelle, Christelle, Frédéric (Yaaaa) et, JiCé, Marna, Monique, Sébastien,
Luc, Sylvie, Christine, Saïd, Jean-Pierre, Janis, Dalila et leur bande....
C'est dans ces mêmes hauts plateaux que j'ai rencontré nia cholita
préférée, Marie-Pierre. Je lui donne tout mon amour.
Je remercie les membres du Jury, M. Frézil (ou monsieur le patron,
présentement, de la tribu du 2° étage de l'ORSTOM), M. le Professeur
Bouix (vice-président de l'Université de Montpellier II), M. Précigout
(Hou! le rapporteur), M. Dei-Cas (rapporteur) ainsi que mon directeur de
thèse, d'avoir eu la bienveillance de lire, de critiquer et de m'écouter
présenter ce travail.
[PRÉSENTATION]
SOMMAIRE
texte
RÉSUMÉ français
RÉSUMÉ anglais
HISTORIQUE
Rappels du chapitre
GÉNÉRALITÉS
Données épidémiologiques
Clinique et pathologie
Le parasite
Cycle biologique
Développement chez l'hôte mammifère
Développement chez le vecteur
Variabilité et Épidémiologie
Rappels du chapitre
INTRODUCTION
Modèle génétique
Hypothèse de travail
p.viii
p. i x
p. 1
p. 4
p. 5
p. 6
p. 8
p.ll
p.12
p.13
p.14
p.16
p.l?
p.19
Rappels du chapitre
MATÉRIEL ET MÉTHODES
Bases génétiques
Caractérisation isoenzymatique
Clonage
Croissance des épimastigotes
Différenciation cellulaire
L'infection expérimentale
La résistance au complément
Analyse statistique
Rappels du chapitre
RÉSULTATS
Description des résultats
Génétique
Biologie
Cinétique de culture
Différenciation
Résistance au complément
Infection in vivo
i i
p.21
p.22
p.23
p.24
p.25
p.28
p.31
p.34
p.36
p.38
p.39
p.42
p.44
p.45
p.47
i i i
Analyse statistique
Conformité à la loi normale p.49
Comparaisons des moyennes p.52
Corrélation entre biologie et génétique p.57
Analyse des données
Analyse en composantes principales
Classification automatique
Analyse discriminante
Rappels du chapitre
DISCUSSION
Discussion principale
Virulence et Métacyclogenèse
Temps de doublement
Résistance au complément
Rappels du chapitre
CONCLUSIONS et PERSPECTIVES
BIBLIOGRAPHIE
p.60
p.65
p.66
p.69
p.70
p.74
p.75
p.76
p.78
p.79
p.82
Généralités
Figure nO l :
Figure n02
TABLES ET
FIGURES
Phases et formes cliniques du mal de
Chagas
Formes parasitaires existantes chez
l'hôte vertébré
Formes parasitaires de culture existantes
chez le vecteur
Schéma du cycle naturel domestique de
Trypanosoma cruzi
Photographies de vecteurs et d'hôtes
sylvestres de Trypanosoma cruzi
iv
p. 6
p. 9
p.l0
p.ll
p.12
Matériel et Méthodes
Les origines géographique et biologique
des 16 stocks
Courbe d'une cinétique de multiplication
cellulaire de Trypanosoma cruzi
. p.22
p.2?
v
Résultats
Description des résultats
Table n02 : Présentation des variables avec leurs unités p.39
et les abréviations
Génétique
Table n03 :
Figure n07
Figure n08
Matrice des distances génétiques de Jaccard p.4D
Dendrogramme p.4D
Réseau de Wagner p.41
Biologie
Table n04 : Résultats de toutes les variables
biologiques mesurées
Cinétique de culture
p.42
p.46
Mesures de la reproductibilité de croissance p.43
et de différenciation in vitro
Sensibilité au complément
Table n06: Mesures de la reproductibilité de la
sensibilité au complément
Infection in vivo
Mesures de la reproductibilité des
caractéristiques de l'infection in vivo
p.47
Analyses statistiques
Conformité à la loi normale
vi
Valeur de Dobs pour les 8 variables p.51
Cornparaison des moyennes
Figure n09 :
Table n09 :
Présentation des courbes de distribution
des fréquences
Présentation des calculs statistiques
Répartition des différentes modalités
pour les variables qualitatives
Analyse de la variance à un critère de
classification
p.52
p.53
p.53
p.54
Corrélation entre biologie et génétique
Matrice des corrélations p.59
Analyse des données
Analyse en composantes principales (A.C.P.)
Table n012 . Inertie des axes de l'A.C.P. p.62.
Figure nO ll Schéma expliquant la Figure nO ll p.62
Figure n012 Cercles de corrélations de l'A.C.P. p.63
Figure n013 Graphes de l'A.C.P. en deux dimensions p.64
Figure n014 Graphes de l'A.C.P. en trois dimensions p.65
Classification automatique
vii
Dendrogramme biologique p.66
Analyse discriminante
Graphe de l'analyse discriminante. p.68
(RÉSUMÉS J
viii
RÉSUMÉ
Trypanosoma cruzi, agent de la maladie de Chagas, est un parasite très
variable pour beaucoup de paramètres biologiques (36). De plus, les
populations naturelles du parasite présentent une structure c10nale (82).
L'étude présentée ici a pour hypothèse de travail que les divergences
phylogéniques, existant entre clones naturels de T. cruzi, ont un impact
important sur la biodiversité de ce parasite.
8 paramètres biologiques (notamment le comportement en culture in vitro
et infectiosité chez la souris) ont été mesurés sur 16 stocks appartenant
à 3 clones majeurs (ensemble de génotypes c10naux ubiquistes définis sur
la base de 15 systèmes enzymatiques) (83).
Il existe une forte corrélation entre les distances génétiques (divergences
phylogéniques), entre les clones, et les différentes caractéristiques
biologiques ainsi qu'une discrimination significative à 93% entre d'un côté
le c10net 39 et de l'autre côté le groupe 19-20 bien qu'au sein de chaque
clone, la diversité biologique reste notable.
Ce travail souligne l'intérêt du cadre de génétique des populations dans
l'étude de la variabilité génétique des microorganismes, et confirme
l'utilité du concept de clone majeur en microbiologie.
ix
Summary
Trypanosoma cruzi, the agent of Chagas'disease, exhibits considerable
variability for many biological parameters (36). Moreover, its natural
populations showh a basically clonai structure (82).
The working hypothesis taken in the present study is that the phylogenetic
divergences accumulated among T. cruzi natural clones have a major
impact on the biodiversity of the parasite.
16 stocks belonging to 3 majo"r clones (ubiquitous clonai genotypes
characterized by 15 isozyme loci) (83) were compared for 8 different
biological parameters, mainly culture behaviour and virulence in mice.
There is a strong correlation between the genetic distances (phylogenetic
divergences) among the clones on the one hand, the various biological
parameters on the other hand.
Despite of this correlation, within each clonai genotype, the biological
diversity remains notable, which suggests that clonai evolution is not the
only parameter involved in T. cruzi 's biodiversity.
This work emphasizes the interest of the population genetics framework
for studying microbial biodiversity, and confirms the usefulness of the
concept of major· clone in microbiology.
( HISTOIRE J
Histoire 1
HISTOIRE
« En 1907, nous fûmes chargés, par le directeur Dr. Oswaldo Gonçalves
Cruz, de réaliser une campagne antipaludique pour les services de
construction de Estrada de Ferro Central do Brasil, dans la région
septentrionale de l'état de Minas Gerais ».
Cette phrase, écrite par Carlos Chagas en 1909, est l'introduction à
l'étude exceptionnelle d'un nouveau protozoaire parasite de l'homme (24).
La campagne prophylactique antipaludéenne fut progressivement
délaissée pour l'étude d'un insecte hématophage, le « barbeiro », attaquant
l'homme lors de son sommeil. Celui-ci se trouvait en grande quantité et
représentait une nuisance si considérable qu'il pertubait l'extention des
chantiers. Carlos Chagas eut le mérite de pressentir qu'il était
transmetteur d'un parasite quelconque (55).
Disséquant l'intestin postérieur de cet hémiptère (actuellement connu
comme Panstrongylus megistus), il découvrit «un grand nombre de
flagellés avec des caractères morphologiques de crithidias »
(épimastigotes).
Deux années durant, Carlos Chagas, aidé de son ami et directeur
Oswaldo Cruz, fit une étude exhaustive de ce nouveau parasite :
Trypanosoma cruzi, Chagas, 1909. L'étiologie, l'aspect clinique, le
Histoire 2
comportement pathogène, l'existence d'hôtes intermédiaires, d'hôtes
réservoirs et de vecteurs de ce protozoaire : tout fut passé en revue par ce
spécialiste du paludisme.
Au cours de ses recherches, trois faits l'ont marqué:
1/ un cycle évolutif très particulier ;
2/ l'observation, chez le marmouset Callithrix penicillata, infecté
expérimentalement, de « trypanosomes [ ... ] de morphologie
entièrement différente de n'importe quelles espèces connues du
genre Trypanosoma »;
3/ un mode de reproduction schizogonique.
Toutes ces différences justifiaient, pour lui, la création d'un nouveau
genre. Trypanosoma cruzi devint Schizotrypanum cruzi (24).
En 1911, Vianna (50) montrait que le seul mode de reproduction dans
l'hôte vertébré « est la scission binaire du stade leishmanial »
(amastigote).
En 191 2, Delanoë et Delanoë montraient que les schizontes observés par C.
Chagas, ne faisaient pas partie du cycle évolutif de s. cruzi mais
appartenaient à un nouveau protozoaire parasite, Pneumocystis carinii.
En 1913, Brumpt (50) démontrait que le développement du trypanosome se
finissait dans l'intestin postérieur. /1 montrait donc que la transmission
Histoire 3
se fait par contamination, le parasite transmis se trouvant dans les fèces.
Il contredisait C. Chagas supposant une transmission par inoculation.
L'hypothèse de Brumpt fut confirmé sans ambiguïté par Dias en 1934.
C. Chagas, en 1913, revint au premier nom qu'il avait donné au parasite:
Trypanosoma cruzi (50). Le terme Schizotrypanum fut conservé comme
sous-genre différenciant ce parasite des autres espèces connues de
trypanosomes. Ce n'est que dans les années cinquante que le nom de
Trypanosoma cruzi fut définitivement adopté : la multiplication
intracellulaire du stade amastigote ne fut plus considérée comme un
phénomène extraordinaire dans le genre Trypanosoma.
En 1914, Maggio et Rosembusch (50) observaient qu'un très grand nombre
de Triatoma in fes tans, le Triatominae le plus répandu sur le territoire
argentin, se trouvaient infestés par Trypanosoma cruzi.
Peu à peu, des études épidémiologiques, d'abord au Brésil et en Argentine
puis partout ailleurs en Amérique du sud, montraient l'étendue de la
maladie et la diversité des hôtes et des vecteurs possibles.
Pendant plus de trente années, rien à part des études épidémiologiques, ne
vint compléter les connaissances du parasite et de la maladie, en grande
majorité révélées par le travail de C. Chagas.
Histoire 4
Rappels des éléments importants du chapitre
1909 : Carlos Chagas publie la découverte d'un nouveau parasite
protozoaire de l'homme, au Brésil : Trypanosoma cruzi.
1911 : La seule forme de multiplication chez l'hôte vertébré est le
stade amastigote (Vianna).
1913 : La transmission se fait par contamination, le parasite étant
dans les fèces du vecteur (Brumpt).
1960 : Cette trypanosomiase touche toute l'Amérique latine; 7
millions de personnes sont estimées infectées par T. cruzi (O.M.S.).
[ GÉNÉRALITÉS J
Généralités 5
GÉNÉRALITÉS
Données épidémiologiques
La trypanosomiase sud-américaine ou mal de Chagas est une
anthropozoonose grave, répandue dans 17 pays d'Amérique latine.
En 1991, l'Organisation Mondiale de la Santé estimait que 100 millions de
personnes étaient exposées à l'infection et 16 millions infestées par le
parasite (7).
D'une région d'endémie à l'autre, certains paramètres présentent une
grande hétérogénéité :
• les taux de prévalence (7) : dans certaines collectivités de
Bolivie et du Paraguay, la prévalence peut dépasser 60% ; au Pérou
elle ne dépasse pas 12 %.
• les modes de transmission (7) : ils peuvent de différents
types. Le parasite peut être transmis par contamination par un
vecteur ou par transmission congénitale : apparemment, l'infection
n'aurait pas de conséquence sur le déroulement de la grossesse. La
transmission par transfusion sanguine est de plus en plus importante
: en Bolivie, jusqu'à 63% d~s donneurs. de sang étaient séropositifs en
1990 ; les contaminations par greffes d'organes parasités et par voie
orale (pour les animaux mangeurs de réduves) sont des voies de
Figure n01 : Phases et formes cliniques du Mal de Chagas (réf.32)("Esquema geral e a historia natural da doença de Chagas humana", Dias J.C.P., 1984)
Contamination par Trypanosoma cruz;
Formes cliniqueschroniques bénignes
évolutionbénigne
>---3.1 Mort 1
1évolution maligne !:.
(cardiopathie grave)··:;::H···············································....•........................................................:
~---~ 1 Mort 1
Forme chroniqueindéterminée
permanente (guérison??)
1 1traitement
Guérison ...~---r
Généralités 6
contamination qui restent rares.
• les caractéristiques du parasite (voir page 8).
• les caractères clinico-pathologies (voir rubrique Clinique
et Pathologie page 6 et 7)
• les vecteurs : le parasite est transmis par trois principaux
genres de vecteurs : Panstrongylus, Rodnius et Triatoma ; la
susceptibilité de ces vecteurs est différente d'une espèce à
l'autre.
• les hôtes réservoirs: déjà en 1972, Hoare recense plus de
100 espèces de mammifères (50). On en recense aujourd'hui près de
150 espèces (7).
Considérée traditionnellement comme une endémie rurale, la maladie
de Chagas s'étend peu à peu aux régions urbaines, principalement par les
transfusions sanguines. Plus que toute autre parasitose, cette maladie est
liée au développement socio-économique.
Clinique et pathologie
L'évolution de la maladie est très variable. Chez l'homme, elle se
divise, généralement, en 3 phases (cf. Figure n01) :
• la phase aiguë, de courte durée, se caractérise par un état de
malaise général et par des phénomènes inflammatoires qui
Généralités 7
passent souvent inaperçus. Elle n'est, effectivement,
diagnostiquée que dans 2% des cas : on peut alors observer
une hépatosplénomégalie, une anorexie, des diarrhées et des
vomissements. Une myocardite aiguë, révélée dans un tiers de ces
cas, peut entraîner la mort, le plus souvent chez l'enfant de moins de
2 ans ; plus rarement, les lésions nerveuses se manifestent sous
forme d'une méningo-encéphalite aiguë.
Généralement, ces symptômes disparaissent après 8 semaines.
Pendant la phase aiguë, le parasite reste sensible à certains
médicaments (Nifurtimox et Benznidazole).
Un trait caractéristique de cette phase est une réaction
inflammatoire importante de la face appelée « signe de Romana ».
Cette inflammation indique, potentiellement, un début d'infection.
Elle se présente comme un gonflement cutané tout autour de l'œil.
C'est une réaction à la seule sensibilisation allergique à la piqûre de
triatomes (57), sans trypanosomes.
• la phase intermédiaire (Forme chronique indéterminée dans
la figure nOl) commence 1a semaines après la pénétration du
parasite dans l'organisme, indépendamment du retentissement de la
. phase aiguë; elle peut durer toute la vie du patient. Elle n'est
caractérisée par aucun symptôme clinique. La sérologie est positive.
Généralités 8
La parasitémie est indécelable par les méthodes directes ; seul le
xénodiagnostic la révèle dans 20 à 60% des cas.
• la phase chronique est caractérisée, dans 30% des cas au
maximum, par :
- une atteinte cardiaque. On observe une myocardiopathie
associée à une thrombose intracardiaque pouvant être à l'origine
d'embolies pulmonaires; le parasite n'est découvert dans les lésions
du myocarde que dans un tiers des cas au maximum.
- une atteinte digestive. L'appareil digestif peut être atteint
en n'importe quel point; les organes les plus touchés sont
l'œsophage, le côlon et le plexus nerveux intrinsèque.
- une atteinte neurologique. L'aggravation de la' phase chronique
peut engendrer des lésions du système nerveux central, périphérique
ou végétatif, entraînant des troubles fonctionnels et psychiques.
Le parasite
Trypanosoma (schizotrypanum) cruzi, Chagas 1909 est un
Kinétoplastidé, de la famille des Trypanosomatidae ; il appartient à la
section Stercoraria du genre Trypanosoma.
Une des caractéristiques marquantes de Trypanosoma cruzi est que, tout
au long du cycle biologique, le parasite subit plusieurs métamorphoses:
\ .._J
r-'"1
o
Figure nQ
: Formes pa asitaires présentes chez l'hôte vertébré.et b : Trypomastigotes sanguins (formes trapues) ;
c et d : Arna "'"igotes il tracellulair s t culture de fbroblas es desouris) ;e : Ai ,3stigotes libres après écla ement provoqué du fibroblaste.
Généralités 9
épimastigote, trypomastigote, amastigote et sphaeromastigote.
La nomenclature de toutes les formes cellulaires des trypanosomes a été
réactualisée par Hoare, Wallace (1966) et Brack (1968) (50). L'agencement
du flagelle, son point de naissance cellulaire et son point de détachement
du corps cellulaire, l'existence ou non d'une membrane ondulante sont les
bases de cette nomenclature.
Nous donnons, ci-dessous, une description des différentes formes
cellulaires présentes dans le cycle naturel de Trypanosoma cruzi.
Sur les figures n02 et 3, sont présentées les formes parasitaires
cultivées in vitro et in vivo pendant notre travail.
• Le trypomastigote (cf. figures n02 et n03). C'est une cellule
différenciée (qui ne se divise pas), libre, mobile, qui est
présente dans l'ampoule rectale du vecteur (trypomastigote
métacyclique) et dans le sang de l'hôte mammifère (trypomastigote
sanguicole). L'aspect de la cellule est le même dans les deux cas:
forme en S plus ou moins allongée, kinétoplaste postérieur en
position subterminale ou terminale, flagelle naissant près du
kinétoplaste, attaché le long du corps cellulaire par une membrane
ondulante; le flagelle se détache de la partie antérieure du corps
cellulaire ; la. partie libre est plus ~u moins longue.
La forme trypomastigote métacyclique est toujours très fine le
Figu n0 3: F r lesparasitaires obtenues encultUie et présentesnatureller e t c~ z levecteur.
Ci et b : 1rypomastigotes n étacyclique cul ure en milieu ""'"AU 3AAG ;ç : Épimastigote en cours de différenciation (le kinétoplaste migre versi' extrémité postérieure) ; ct : Culture d'épimastigo es en phase lateau;
e et f : Divis'on d'ép'mastigot
Généralités 10
kinétoplaste se présente sous une forme arrondie régulière, donnant
l'impression de déborder du corps cellulaire. Les formes sanguines
sont soit allongées et fines (forme fine, « slender form ») soit
courtes et épaisses (forme trapue, « stumpy form »). Chez cette
dernière, le flagelle libre est court.
Les formes trypomastigotes ne sont généralement pas sensibles à
l'action lytique du complément .
• L'amastigote (cf. figure n02). C'est le stade intracellulaire,
non mobile et la seule forme de multiplication cellulaire chez
l'hôte mammifère. Bien qu'il soit intracellulaire, il peut être
détecté dans la circulation sanguine de l'hôte vertébré durant la
phase aiguë de l'infection.
La cellule est sans flagelle, de forme ronde ou ovale ; le
kinétoplaste, de forme rectangulaire, est proche du noyau ; le noyau
est central.
La forme amastigote active la cascade du complément, par la voie
alterne', mais n'est pas lysé par le produit final.
• L'épimastigote (cf. figure n03) : C'est la forme de
multiplication chez le vecteur. Le corps cellulaire est en forme
d'amande plus ou moins allongée, le noyau est central, le
1 Les voies d'activation du complément sont de 2 sortes. La voie classiqueest initiée par le complexe antigène-anticorps, .Ia voie alterne est initiéepar des composants microbiens. Les deux aboutissent à la formation ducomplexe d'attaque membranaire.
Multiolication dans l'intestin
=x211
TranSfO~
Épimastigote
Métacyclogénèse
')
Contaminationpar les fa!ces
TrypomastigotevCYcliQue
VERTÉBRÉH01E
Trypomastigotesanguin
Repas sanguin
l~iii~fŒAl liifÜ~ii:l
Amastigote
Transformationet Libérationpar éclatementcellulaire
n=x2
Pénétrationtissulaire et ",transformation
Multiplication intracellulaire
Figure n°4 : Schéma du cyCle naturel domestique de Trypanosoma cruzi.
. -. .....
Généralités 11
kinétoplaste en position antéro-médiane proche du noyau, et de
forme ovoïde ; le corps basal est toujours près du kinétoplaste, le
flagelle émerge de la cellule sans formation de membrane ondulante
à l'extrémité antérieure.
C'est une forme intermédiaire dans la tranformation des
trypomastigotes en amastigotes se différenciant dans les
cellules de l'hôte vertébré (50).
L'épimastigote est sensible à la lyse du complément par la voie
alterne.
• Le sphaeromastigote (n'est pas présenté sur les figures n02
et n03) : Il a une forme ronde avec un flagelle émergeant libre. C'est
une forme de transition dans la différenciation d'épimastigote en
trypomastigote. C'est, aussi, une forme de transition entre
l'amastigote et toute autre forme flagellée (50).
Cycle biologique (Figure n04)
Le parasite est transmis naturellement à l'homme et à d'autres
mammifères par des insectes vecteurs: les réduves (Figures n04 et nOS).
Ce sont des hémiptères hétéroptères de la famille des Reduviidae et de la
sous-famille des Triatominae. On décompte, aujourd'hui, prés de 120
espèces ; LIn peu moins de la moitié est associée aux habitations humaines... ., '.
Les espèces suivantes sont considérées comme très importantes dans la
Panstrongylus megistus
Figure n°5 : Les vecteurs (en haut) déposent les parasites dans leursfèces pendant leur repas de sang sur les hôtes mammifères (en bas,deux hôtes sylvestres).Rcproduits dl''' Colour Atlas of Tropical ~(ediLJnt' &- Parasitologv" avcC' l'aimilble permissiondes iluteurs Pelers W. et Cille" H.\1. et de l'éditeur Mosby-\Volfe.
[ MATÉRIEL ET MÉTHODES J
r
Généralités 12
transmission de la maladie: Rhodnius prolixus (Walker, 1873), Rhodnius
pallescens (Barber, 1932), Triatoma infestans (Klug, 1834), Triatoma
dimidiata (Latreille, 1911), Triatoma sordida (Stal, 1859), Triatoma
braziliensis (Neiva, 1911) et Panstrongylus megistus (Burmeister, 1835).
Ces réduviidés (<< vinchucas » dans les pays andins, « barbeiros » au
Brésil, « kissing bugs» aux États-Unis) déposent, pendant leur repas de
sang, leurs déjections sur la peau de l'hôte. Ces déjections contiennent
les formes infectantes du parasite.
Développement chez l'hôte mammifère
La forme infectante du parasite, le trypomastigote métacyclique, entre
dans l'organisme au niveau du point de piqClre ou de toute autre lésion.
Le trypomastigote ne se divisant pas, il pénètre dans les cellules de
différents tissus (cf. Clinique et pathologie page 6).
Le développement intracellulaire semble suivre deux schémas
1/ le modè fusiforme (50). Le trypomastigote devient épimastigote
par contraction du corps cellulaire; l'épimastigote se transforme
en amastigote, forme de multiplication. Au 3e ou 4e jour, la
cellule-hôte contient une centaine d'amastigotes, parfois plus. Le
cytoplasme de la" cellule-hôte est consommé par les parasites
cela aboutit à la formation du pseudokyste.
L'amastigote se transforme en épimastigote puis en
Généralités .13 .
trypomastigote.
2/ le mode orbiculaire (50, 89). Le trypomastigote se transforme
directement en amastigote ; ce dernier se multiplie activement
pendant 5 générations et, lorsque l'enceinte cellulaire devient
limitante (pseudokyste), il se transforme directement en
trypomastigote. Ces trypomastigotes sont lâchés dans la
circulation sanguine par éclatement de la cellule-hôte.
Dans les deux cas, le trypomastigote libéré, dans le flux sanguin, par
éclatement de la cellule-hôte va infecter de nouveaux tissus.
Le triatome s'infecte lors d'un repas sur un hôte malade par absorption de
formes sanguines trypomastigotes.
Cette alternance entre, d'une part la forme mobile présente dans le flux
sanguin qui ne se divise pas et, d'autre part la forme intracellulaire
immobile qui se divise, est une des caractéristiques les 'plus marquantes
de Trypanosoma cruz;.
Développement chez le vecteur
Tout le cycle vectoriel s'effectue dans la lumière de l'appareil digestif.
Seules les formes sanguines dites trapues (<< stumpy » ou « broad » en
anglais) ont un devenir chez le vecteur (63). 100% des réduves sont
Généralités 14
infectées pour peu qu'il y ait des parasites circulant chez l'hôte vertébré.
Les trypomastigotes ingérés se transforment en épimastigotes. Nous
observons deux types d'épimastigotes : les petits et les longs. Les petits
épimastigotes (10-20 pm) se multiplient dans l'intestin moyen du vecteur
et forment un « réservoir» de parasites : un insecte infecté lors d'un
repas de sang le reste toute sa vie. Les épimastigotes longs (35-40 pm)
passent dans l'intestin postérieur et adhèrent à l'épithélium de la glande
rectale (92 , 93) ; ils se différencient en sphreromastigotes (63), puis en
trypomastigotes métacycliques. Ceux-ci sont trouvés dans l'ampoule
rectale, n'adhèrent pas à l'épithélium et sont rejetés lors de la défécation,
pendant un repas de sang sur un hôte vertébré.
Variabilité de T. cruzi et épidémiologie de la maladie de
Chagas
Les données épidémiologiques, l'aspect clinique et les pathologies
tout montre une grande diversité chez l'agent de la maladie de Chagas.
De plus en plus d'études sont menées sur les caractéristiques parasitaires
dépendantes des stocks: infection in vivo, virulence, sensibilité aux
drogues, constitution antigénique, taux de croissance, quantité d'A.D.N., la
réponse immunitaire, génétique, etc.
Cependant, ces études Considèrent la variabilité de chaque caractéristique
séparément et n'ont pas été faites sur les mêmes stocks parasitaires.
Généralités 15
Nous sommes donc confrontés à une information partielle de la biologie de
certains stocks.
Des tentatives pour corréler une à une, différentes caractéristiques entre
elles ont été faites, mais le nombre de souches est toujours resté faible
(4, 32, 45, 52, 54) et jamais une synthèse des paramètres biologiques
même pour un nombre restreint de stocks n'a été réalisé.
Plusieurs revues générales témoignent de la difficulté (peut-être de
l'irréalisme) de considérer T. cruz; comme une seule entité taxonomique
et médicale (9, 17, 37).
Généralités 16
Rappels des éléments importants du chapitre
En 1991, l'O.M.S. estimait que 16 millions de personnes étaient
infectées par Trypanosoma cruzi.
Le cycle biologique est dixène. Le vecteur est un hémiptère
appartenant à trois genres principaux : Tria toma, Rhodnius et
Panstrongylus. Il transmet le parasite par contamination par ses
fèces à un hôte mammifère. Près de 150 espèces de mammifères
(dont l'homme) ont été recensés infectés par Trypanosoma cruzi.
Le parasite se présente sous plusieurs formes cellulaires:
l'épimastigote se multiplie et se différencie en trypomastigote
métacyclique chez le vecteur ; l'amastigote, intracellulaire, se
multiplie et se différencie en trypomastigote chez l'hôte mammifère.
L'infection humaine se déroule en trois phases. Une phase aiguë de
courte durée diagnostiquée que dans 2% des cas. Une phase chronique
prolongée et caractérisée dans 30% des cas par une atteinte
cardiaque, digestive et neurologique. Ces deux phases sont séparées
par une longue phase de latence clinique dite phase indéterminée.
(INTRODUCTIONJ
Introduction 1;'
INTRODUCTION
Modèle génétique
Certains paramètres biologiques importants ont permis de classer les
populations de T. cruz; en groupes : isoenzymes, analyse de fragments de
restriction d'A.D.N. kinétoplastique ou virulence et pathogénicité du
parasite (4, 73, 74).
Ces classements, pour chaque paramètre biologique, confortent l'idée que
la diversité biologique naturelle peut être expliquer par l'existence de
plusieurs ensembles de populations parasitaires. Cette classification en
trois ou quatre groupes, proposée par plusieurs auteurs (3, 59, 64), traduit
mal l'ampleur de la biodiversité du parasite. L'analyse porte toujours sur
un paramètre (ou biochimique ou biologique) et non sur un ensemble des
propriétés biologiques du parasite.
Tibayrenc et coll. (82) estiment qu' « une description typologique de la
variabilité des stocks semble inappropriée ». Ces auteurs ont postulé, sur
la base d'une approche de génétique des populations, que les populations de
T. cruz; présentent une structure principalement c10nale (79, 80). L'espèce
ne se divise plus en quelques groupes plus ou moins homogènes, mais en
clones naturels, stables da"ns l'espace et dans le temps (81).
Pratiquement, cela se répercute par la sélection de certains clones due à
diverses pressions naturelles et donc, par leur surreprésentation sur de
Introduction 17
vastes aires géographiques. Ces clones ont été nommés clones majeurs
(83). Tibayrenc et coll. (82) analysent les variants isozymiques de 121
stocks provenant de toute l'Amérique du sud et prélevés sur un grand
nombre d'hôtes et répartissent ces stocks en 43 génotypes ou clones
naturels: 53,7% de ces stocks sont représentés par seulement trois
génotypes (33,1% sont des génotypes n019 et n020 et 20,6% sont du
génotype n039).
Dans ce modèle, les génotypes caractérisés par un nombre déterminé de
marqueurs (1 5 loci isozymiques) ne représentent pas des clones au sens
propre du terme mais, plutôt, des familles de clones étroitement
apparentés (82). Le terme de c10net a été proposé (85) et désigne, chez
toute espèce à reproduction c1onale, tous les individus qui apparaissent
1
identiques entre eux sur la base d'une série de données de marqueurs
génétiques. Dans le cas des génotypes de Trypanosoma cruzi cités
ci-dessus, la série de marqueurs est constituée des 15 loci isozymiques
étudiés par Tibayrenc et coll. (82).
Nous admettons que plus augmentera le nombre de marqueurs, plus
augmentera la finesse du système. La numérotation originelle en 43
zymodèmes n'a aucun caractère définitif et ne saurait en avoir:
l'utilisation d'un plus grand nombre de loci enzymatiques, ou de marqueurs
génétiques différents, révèlera une hétérogénéité additionnelle au sein de
chacun des « clones ». Un c10net défini par n loci enzymatiques sera éclaté
Introduction 18
en une quantité de « nouveaux » c1onets, définis eux-mêmes par plus de n
loci enzymatiques (voir figure nO?). 1\ est donc important de préciser sur
quel éventail de marqueurs génétiques s'est faite la description des
c1onets.
Le modèle est « T. cruzi a une propagation clonale ». Ce modèle implique
que les c10nets sont stables dans l'espace et dans le temps, même à
l'échelle évolutive. Mais il n'exclut pas la possibilité de phénomènes de
recombinaison sexuée à bas bruit, qui pourraient moduler le devenir des
c10nets à l'échelle évolutive.
Les clones naturels représentent, selon ce schéma, des phylums évolutifs
indépendants, divergeant toujours davantage les uns des autres par
accumulation de mutations et dérive génique. 1\ est raisonnable de
postuler que ces divergences évolutives auront un impact notable sur les
propriétés biologiques du parasite, en particulier ses propriétés
médicalement importantes.
Hypothèse de travail
Notre hypothèse de trayail est que la variabilité c10nale du parasite a
un. impact majeur sur ses propriétés biologiques: les distances
génétiques mesurées entre c10nets auront un pouvoir prédictif statistique. .
sur les différences biologiques existant entre ces mêmes c1onets.
Introduction 19
Tester cette hypothèse revient à analyser la relation qui existe entre la
distance génétique de 2 populations du parasite et leur divergence
biologique. Si ces deux parmètres sont totalement indépendants,
l'hypothèse de travail n'est pas confirmée. Au contraire, s'il existe une
dépendance statistique significative de l'un par rapport à l'autre, cela
indiquera que le modèle clonai doit être pris en compte dans les études
portant sur la pathogénicité de Trypanosoma cruz; et la diversité clinique
de la maladie de Chagas.
Introduction 20
Rappels des éléments importants du chapitre
La diversité biologique de Trypanosoma cruz; a suggéré à plusieurs
auteurs d'organiser les populations du parasite en différents groupes.
Cette représentation typologiste semble inappropriée. En effet,
Tibayrenc et coll. montrent, par une approche de génétique des
populations, que Trypanosoma cruz; est formé de populations ayant
une structure fortement c1onale.
Certains clones naturels sont surreprésentés sur de vastes aires
géographiques : ils sont nommés clones majeurs.
Définis après l'étude de 15 loci isozymiques, les clones naturels sont,
en fait, des familles de clones étroitement apparentés : ils sont
nommés c1onets.
Les clones naturels représentent des phylums évolutifs indépendants.
Notre hypothèse de travail est que les divergences évolutives
existantes entre clones naturels ont un impact majeur sur les
propriétés biologiques, en particulier les propriétés médicallement
importantes.
Matériel et Méthodes 21
MATÉRIEL ET MÉTHODES
Bases génétiques
Nous avons comparé trois c10nets : le n019, le n020 et le n039 (82).
Ils ont été choisis pour deux raisons :
1/ ils présentent une divergence phylogénique permettant de tester
au mieux notre hypothèse de travail: le c10net 19 et le
c10net 20 sont phylogénétiquement très proches l'un de l'autre et
ils sont, tous deux, très éloignés du c10net 39. Nous pouvons,
ainsi, comparer l'impact sur le comportement biologique de deux
distances génétiques, une très petite et une très grande ;
2/ Ce sont des clones « majeurs» c'est-à-dire surreprésentés et
ubiquistes. Cela augmente l'intérêt médical potentiel de notre
étude.
Le c10net 19 est représenté par 5 stocks, le c10net 20 par 5 stocks, le
c10net 39 par 6 stocks. Ces seize stocks de Trypanosoma cruz; ont été
choisis de manière à ce que leur provenance géographique et l'hôte sur
lequel ils ont été prélevés soient· représentatifs de la diversité naturelle
du parasite.
Ces données sont présentées dans la table n01.
Table n01 : Les origines géographique et biologique des 16 stocks
STOCKS CLONET HOTE LIEU
SPl 04 cil 19 Triatoma spinolai Chile / Region IVCutia cil 19 Dasylprocta aguti Brazil / Espiritu santo
Gamba cil 19 Didelphis azarae Brazil / Sao Paulo133 79 cl7 19 homme; Ph. aigUË:! Bolivia / Santa CruzOPS21 clll 19 homme Venezuela / Cojedes
5034 cl4 20 Triatoma infestans Bolivia / PotosiCuica cil 20 Opposum cuica philander Brazil / Sao PauloP209 cil 20 homme; phase chronique Bolivia / Sucre
Esquilo cil 20 Sciurius aestuans ingrami Brazil / Sao PauloPll cl3 20 homme; phase chronique Bolivia / Cochabamba
SC43 cil 39 Triatoma infestans Bolivia / Santa CruzBug2148 cil 39 Triatoma infestans Brazil / Rio grande do sul
S03 cl5 39 Triatoma infestans Bolivia / PotosiMN cl2 39 homme; Ph. chronique Chile / Region lVa
Bug2149 cil a 39 Triatoma infestans Brazil / Rio grande do sulNR cl3 39 homme ; Ph. chronique Chile / Region ilia
Matériel et Méthodes 22
Nous rappelons que le c10net (82) est défini sur la base de l'étude de 15
loci isoenzymatiques (cf. Introduction page 17).
Caractérisation isoenzymatiqne
Tout au long de ce travail, nous avons vérifié régulièrement le profil
isoenzymatique des 16 stocks. De cette manière, nous voulions être sûrs
de ne pas avoir' de variation isoenzymatique au cours du temps due au
maintien des stocks en culture pendant trois ans, et de ne pas avoir
mélangé de stocks (manipulation simultanée des 16 stocks).
L'analyse isozymique des 16 stocks a été affinée, au début de ce travail,
par augmentation du nombre de loci utilisés (de 15 à 22) et par
amélioration des techniques à tous les loci.
. Les techniques de caractérisation ne sont pas exposées dans cette thèse
puisque le travail technique a été réalisé au laboratoire par C. Barnabé.
Des modifications de comportement biologique, tant en culture (37, 38)
que durant l'infection expérimentale (23), ont permis de constater que
nombreux stocks étudiés en .laboratoires étaient des compositions de
pl~sieurs sous-populations. Par ailleurs, l'utilisation de marqueurs
génétiques a démontré que de rJombreux isolats naturels du parasite
étaient constitués de plusieurs génotypes différents (19, 65).
La recherche des implications médicales de la variabilité clonale du
Matériel et Méthodes 23
parasite nous demandait de travailler pour chaque stock sur une
population génétiquement homogène.
Nous avons, par conséquent, cloné tous les stocks. Chacun représente,
désormais, un clone de laboratoire ; cette qualité est indiquée par « cl »
après le nom du stock : par exemple, SP104 cil indique le résultat du
premier clonage réalisé sur le stock SP104.
Clonage
Nous avons utilisé la méthode de la micromanipulation.
Un seul parasite est prélevé par microcapillarité. Par pompage, le liquide
est vidé sur une lamelle. Cette dernière est renversée sur une lame
comportant une cavité circulaire centrale. Le milieu contenu dans cette
cavité permet d'éviter le séchage de la microgoutte. Nous pouvons, ainsi,
observer au microscope le parasite et valider le clonage. Cette
vérification est confirmée par 2 observateurs différents.
Le parasite est, ensuite, remis en culture dans un milieu biphasique. La.
première phase de ce milieu est une base solide d'agar et de sang: N.N.N.
(Nicolle, Novy et Mac Neal) ; la deuxième phase est le milieu de culture à
base de L.I.T. (Liver Infusion Tryptose) qui sera utilisé par la suite pour
l'entretien et la cinétique de culture. Le tout est gardé à 27°C.
Matériel et Méthodes 24
[Milieu N.N.N.=
l/Phase solide Bacto-Agar 1,3% + NaCl 0,56% +
pH 7 Sang de lapin hépariné 7%
2/Phase liquide L.I.T.+ SVF2 décomplementé 10%
Milieu L.I.T.=
pH 7,2
NaCl 0,5% + Na2HP04 7,5% +
Tryptose 0,5% + KCl 0,04% +
Yeast Extract 0,3% + Hémine 2%
+ Liver Infusion 0,3% + AB3 4%
Dès que la densité de la nouvelle culture le permet, nous passons le
parasite en milieu de culture liquide4 (moins riche que le milieu N.N.N.).
Après 2 ou 3 passages, nous contrôlons le profil isoenzymatique de chaque
clone par la technique d'électrophorèse sur acétate de cellulose (11).
Les stocks ont été maintenus en culture pendant plusieurs mois au
laboratoire avant d'être clonés. Aucun clone n'a présenté un génotype
différent de celui du stock avant clonage.
Croissance des épimastigotes
L'entretien de tous les stocks clonés se fait par passage de 2x 106
parasites pour 3 millilitres (ml) de milieu de culture; tous les 15 jours,
2 SVP : Sérum de Veau Fœtal.3AB.: AntiBiotiques (Gentamycine + Pénicilline)
4 Le seul milieu de culture utilisé pour l'entretien et la cinétique decroissance des épimastigotes est du L.I.T. + SVF 10%.
Matériel et Méthodes 25
en tubes de contenance de 15 ml. Les cultures sont gardées à 27°C.
L'épimastigote est la forme la plus facile à entretenir en culture: elle se
multiplie activement en milieu axénique et l'on peut obtenir le parasite en
grande quantité.
La première caractéristique biologique que nous avons comparée est la
cinétique de croissance des épimastigotes en milieu de culture.
Elle a été réalisée en boîtes de culture Nunclon® de 80 cm2 à col
droit. La concentration initiale est de 5x105 parasites par ml (P.lml) et le
volume final est de 50 ml. La culture est incubée à 27°C.
Tous les deux jours, la culture est homogénéisée et trois échantillons
sont prélevés pour compter les parasites sur cellule de Thoma. La
cinétique de croissance est suivie pendant 24 jours.
Les parasites prélevés sont fixés.
[Solution de Fixation =
P.B.S.S
pH 7,2
Fixateur et
colorant
NaH2P04 8mM + Na2HP04 8mM +
NaCl 190mM
Formaldéhyde 0,75% +
Bleu Trypan 0,2%]
Le Bleu Trypan est un colorant vital qui colore les cellules mourantes ou
mortes. Le nombre de parasites comptés sur toute la chambre est
. multiplié par 104 pour obtenir la concentration parasitaire dans la boîte
5 P.B.S. Phosphate Buffer Saline ou Tampon phosphate isotonique.
Matériel et Méthodes 26
de culture.
Nous obtenons des courbes du type de celle représentée par la figure nOG.
Ces courbes se divisent en 3 parties :
1/ une phase de croissance ou multiplication logarithmique (phase
log.) ;
2/ une phase de plateau ou stationnaire: nous observons l'apparition
de formes trypomastigotes métacycliques en quantité variable
selon les stocks.
3/ une phase de dégénérescence: les cellules se lysent plus ou moins
rapidement selon les stocks.
Les deux premières phases ont été caractérisées par 2 paramètres: le
Temps de Doublement (en anglais Doubling Time) et la Concentration
parasitaire de la fin de la phase logarithmique. Le temps de doublement
est déterminé par la pente de la droite que décrit (sur papier
semi-Iogarithmique) la phase de croissance: c'est une constante pour un
stock donné (36).
Nous symboliserons ces paramètres par, respectivement, TD et Cfl.
TD sera exprimé en heures; Cfl sera exprimé en 10-6 P.lml, soit en nombre
de parasites divisé par 106 , par millilitre~
Concentration parasitaireP.lml
phase decroissance phase plateau
phase dedégénéréscence
Cfl
2xY
y
11
.................................................................1
tl ~ • t2
DT Tempsjours
Figure nOG : Courbe d'une cinétique de multiplication cellulaire de T.cruzi dans du milieu de culture. L'axe des abscisses est en échellelinéaire ; l'axe des ordonnées est en échelle .Iogarithmique.
Matériel et Méthodes 27
Différenciation cellulaire
Le deuxième caractère étudié est la cinétique de transformation des
épimastigotes en trypomastigotes métacycliques, en milieu axénique
défini. C'est une véritable différenciation cellulaire. Elle s'observe
naturellement dans l'intestin postérieur de l'insecte vecteur.
Le milieu utilisé dans notre étude, a été mis au point par Contreras et
coll., en 1985 (27).
Il est très pauvre et acide comme l'urine de triatome. Ce milieu stressant
déclenche la « métacyclogenèse ».. .
Deux étapes sont nécessaires pour obtenir une cinétique de transformation
reproductible.
La première étape aboutira à la synchronisation des parasites.
1/ Les épimastigotes d'une culture ne se trouvent pas tous à la même
phase du cycle cellulaire.
Or les trypomastigotes métacycliques sont des cellules en phase Go (elles
ne se divisent pas). La phase .Go commence après la mitose. Cette dernière
représente entre 15 et 20% de la durée totale du cycle (36).~ "
" a été montre que les épimastigotes adhèrent, chez l'insecte vecteur, à
Matériel et Méthodes 28
l'épithélium de l'intestin postérieur au niveau de la glande rectale avant
de se différencier (92). Cette adhésion sur l'épithélium, prélude à la
métacyclogenèse, se retrouve dans la différenciation axénique in vitro
(12).
La synchronisation consiste à séparer les épimastigotes ayant adhéré à la
surface de la boîte de culture de ceux n'ayant pas adhéré, c'est-à-dire
n'étant pas prêts à se transformer.
Pratiquement, les épimastigotes sont récoltés en fin de phase
logarithmique par centrifugation 1 200g pendant 10 minutes à
température ambiante. Ils sont dilués dans du milieu T.A.U. à la
concentration finale de 5x108 P.lml, et sont incubés à température
ambiante pendant 2 heures dans des boîtes Falcon® de 25 cm2 à col
incliné (27).
[Milieu T.A.U. =
Sels + CaC12 2mM + MgC12 2mM +
pH 6 NaCl 190mM + RCI 17mM]
La deuxième étape est la cinétique.
2/ Les épimastigotes ayant adhéré pendant la phase de. .
synchronisation sont décollés pour être répartis en culture dans du milieu
de différenciation6 (12).' Cette répartition s'effectue comme suit: les
6 Le milieu où s'effectue la différenciation est le milieu T.A.U. 3AAG.
Matériel et Méthodes 29
parasites sont remis en culture dans 10 boîtes de culture Falcon® 25 cm2
à col incliné, à la concentration finale de 5xl06 P.lml dans un volume
final de 10 ml à 28°e sans aucLlne agitation.
[ Milieu T.A.U. 3AAG = Milieu T.A.U. +
L-Glutamate SOmM + Proline lOmM
~spartate 2mM + D-Glucose lOmM]
Nous suivons quotidiennement la cinétique : dans une boîte, les cellules
collées sur la surface de la boîte sont mélangées, par grattage, aux
cellules du surnageant. Après une homogénéisation vigoureuse, trois
prélèvements sont déposés sur lames. Les frottis séchés sont colorés à
l'éosine-bleu de méthylène, après fixation au méthanol pur.
[ Fixation-Coloration : Méthanol Bain S mn.
(sans lavage) Eosine 1 mn.
(sans lavage) Bleu de méthylène 2 mn.
Après un lavage abondant à l'eau et un séchage, un comptage de 100
cellules est réalisé sur toute la surface de la coloration. La forme
trypomastigote se distingue facilement par sa morphologie .
caractéristique (cf. description, Généralités page n09).
Nous traduisons la capacité d'un stock à se différencier par le pourcentage
maximum de trypomastigotes métacycliques obtenus et par le moment
auquel on observe ce maximum.
Matériel et Méthodes 30
Le premier, noté DIF, est exprimé en % ; le second, noté TDIF, est exprimé
en jours.
Infection expérimentale
Le troisième paramètre que nous avons étudié est l'infection
expérimentale de souris syngéniques.
Elle a été réalisée sur des souris BALB/C, femelles, âgées de 4 à 5
semaines. Pour chaque stock de parasites, Llne série minimale de 6 souris
a été utilisée.
Des essais préliminaires d'infections expérimentales ont été effectués
pour déterminer certaines conditions d'expérimentation. Les premières
infestations ont été faites par injection d'un culot parasitaire de culture
d'épimastigotes en fin de phase plateau. Nous n'avions pas séparé les
épimastigotes des trypomastigotes. De cette manière, environ 106
trypomastigotes furent injectés dans les souris âgées de 4 semaines.
Ces essais se sont soldés, dans la majorité des cas, p~r une absence de
parasitémie détectable (ceci étant du au fait que les stocks n'étaient pas
adaptés aux souris). Pour obtenir de fortes parasitémies et pouvoir,
Matériel et Méthodes 31
potentiellement, adapter tous les stocks sur souris, nous avons joué sur
deux paramètres:
1/ la purification des trypomastigotes.
Les trypomastigotes métacycliques sont récoltés d'une culture
d'épimastigotes en fin de phase stationnaire. Ils sont séparés des
épimastigotes après incubation pendant une nuit à 3?OC, dans du sérum
humain non décomplémenté. Les trypomastigotes ne sont pas sensibles au
complément présent dans le sérum utilisé in vitro, contrairement aux
épimastigotes.
Les trypomastigotes sont lavés trois fois en P.B.S. par centrifugation à
1200g pendant 10 minutes à 4oC.
2/ Nous avons immunodéprimé toutes les souris utilisées pour ces
primo-infections.
.Une dose de 8mg (soit 400 mg de cyclophosphamide, Endoxan-Asta®,
Laboratoires Sarget, Merignac, France) par souris a été choisie, après
comparaison d'injections à différentes doses d'endoxan (résultats non
montrés).
Une étude réalisée par Calabrese et coll. (21) montrait qu'une injection
post-infection (5 jours après l'inoculation des parasites) engendrait une
parasitémie forte et durable. Nous avons comparé une injection
d'immunosuppresseur synchrone à l'inocul~tion de parasites et une
Matériel et Méthodes 32
injection 3 jours après l'inoculation de parasites. Ce dernier essai
présentait le meilleur résultat.
La cyclophosphamide est sans doute le plus puissant des
immunosuppresseurs chimiques. C'est un agent alkylant qui, comme
tous les autres, semble exercer son action immunosuppressive (à
fortes doses) par la destruction des cellules prolifératives. Il
atteint les cellules T et les cellules B, bien que son action sur
le système T soit moins importante que la suppression de la
production d'anticorps.
Nous avons, finallement, opéré avec le protocole suivant :
• 3x106 trypomastigotes métacycliques sont injectés dans la
cavité péritonéale de souris. Les souris sont immunodéprimées 60
heures après l'injection. La parasitémie est mesurée selon une
variante de la technique de Pizzi (15, 69). Ce protocole a été préféré
à d'autres parce qu'il est fréquemment utilisé dans la littérature.
- 5 III de sang sont prélevés au bout de la queue de la souris et
sont étalés entre une lame porte-objet et une lamelle de
20x20 mm2 ; les parasites sont comptés sur 50 champs
microscopiques (objectif 40x et oculaire 1Ox).
La quantité de parasites observés est multipliée par le facteur 104 pour
obtenir la concentration parasitaire sanguine.
Matériel et Méthodes 33
Un oculaire 10x ou d'indice 18 associé à un objectif 40x permet
d'observer un champs-objet de 0,45 mm de diamètre.
La surface d'un champs fait 0,159 mm2 i 50 champs couvrent 7,95 mm2 •
Il y a, sous la lamelle de 400 mm2 , 5 ~l de sang. Donc, les
parasites observés sur 50 champs sont contenus dans 0,1 ~l de
sang i il suffit de multiplier par 104 pour avoir la quantité de
parasites par ml de sang de souris.
La parasitémie est suivie tous les deux jours pendant 40 jours. La
mortalité est suivie quotidiennement, pendant 70 jours c'est-à-dire
jusqu'à la fin de la phase aiguë.
Les différents paramètres de l'infection sont
MP = Maximum de parasitémie ; il est exprimé en 10-4 P.lml, soit en
nombre de parasites divisés par 104, par millilitre de sang de souris.
INF = infectivité ; cela correspond au pourcentage de souris qui ont eu une
parasitémie détectable.
MOR = mortalité; c'est le pourcentage cumulé de souris mortes du 15e
jours au 70e jour après inoculation des parasites.
Résistance au complément
Comme nous l'avons expliqué dans le protocole de l'infection in vivo,
nous avions besoin de purifier les trypomastigotes métacycliques en
Matériel et Méthodes 34
éliminant les épimastigotes (forme non infectante). La purification fut
effectuée par passage dans du sérum humain non décomplémenté. C'est une
purification rapide et imparfaite.
Nous avons constaté que cette purification dépendait du stock utilisé et
du temps d'incubation à 37°C.
Nous avons, do"nc, voulu considérer un paramètre supplémentaire : la
sensibilité des épimastigotes des 16 stocks à la lyse par le complément .
Le protocole est le suivant :
Un seul lot de sérum humain AB+ est utilisé pour tous les stocks ; il est
congelé à -20°C en autant d'aliquots qu'il y a de stocks.
Tous les stocks seront expérimentés avec le même lot de milieu L.I.T..
Les expériences sont effectuées en plaque de 24 puits Nunclon®.
La moitié du sérum est décomplémenté par chauffage au bain-marie à
56°C pendant 45 minutes. Le sérum est réparti dans les puits à raison de
0,5 ml par puits; cette plaque préparée et le milieu L.I.T. sont mis à 37°C
pendant 30 minutes.
Les parasites sont récoltés de cultures en milieu de phase logarithmique
(100% d'épimastigotes). Après un lavage en milieu L.I.T. par centrifugation
à 1 200g pendant 10 minutes à température ambiante, les parasites sont
resuspendus dans le milieu L.I.T. (sans sérum), maintenu à 37°C. La
Matériel et Méthodes 35
concentration est fixée à 6,66xl06 P.lml.
Cette suspension est répartie à raison de 1,5 ml par puits pour avoir, lors
de l'expérience, une concentration finale de 5xl06 P.lml par puits.
Les parasites en contact avec le sérum sont mis à l'étuve à 37°C. Au bout
d'une heure d'incubation, les parasites sont comptés sur cellule de Thoma.
Pour chaque stock, nous avons préparé 4 puits où les parasites sont en
contact avec du sérum non décomplémenté (SNO) et 4 puits où les
parasites sont en contact avec du sérum décomplémenté (SO). Nous
effectuons, donc, 4 mesures SNO et 4 mesures SO.
Le pourcentage de parasites lysés est calculé comme suit :
- la moyenne des mesures SNO est divisée par la moyenne des
mesures SO. Cette fraction est soustraite à l'unité pour avoir, non pas
le pourcentage d'épimastigotes résistants sinon le pourcentage
d'épimastigotes lysés.
Nous avons symbolisé cette Sensibilité au Complément par SC. Il est
exprimé en %.
Analyse statistique
Toute l'analyse des données et le calcul des corrélations entre
Matériel et Méthodes 36
biologie et génétique ont été réalisés grâce au logiciel «Analyses
multivariées et expression graphique des données environnementales »,
ADE version 3.6, créé et donné par Chessel D. et Dolédec S., Écologie des
Eaux Douces et des Grands Fleuves, URA CNRS 1451, Université C. Bernard
Lyon 1, 69622 Villeurbanne cedex.
Matériel et Méthodes 37
Rappels des éléments importants du chapitre
16 stocks ont été choisis appartenant à 3 c10nets : les c10nets 19, 20
et 39.
Après avoir été cloné, ils ont été caractérisés par l'étude de 22 loci
isoenzymatiques. Les divergences sont mesurées par les distances
génétiques de Jaccard.
8 paramètres biologiques ont été étudiés : le Temps de Doublement
(TD) et la Concentration en Fin de phase Logarithmique (Cfl) pour la
croissance in vitro des épimastigotes ; le maximum de
trypomastigotes métacycliques obtenus (DIF) et le moment
d'observation de ce maximum (TDIF) pour la différenciation in vitro en
milieu axénique ; la Sensibilité des épimastigotes à la lyse du
Complément (SC) et le Maximum de Parasitémie (MP), l'INFectivité
(INF) et la MORtalité (MOR) de souris expérimentalement infestées par
T. cruzi.
[ RÉSULTATS J
Résultats 38
RÉSULTATS
Nous rappelons dans la table n02 le nom des variables, leurs unités et
leurs abréviations.
Variables Abréviations Unités
Temps de doublement TD heures
Conc. en fin de phase log. efi 10-6 P.lml
Max. de différenciation DIF %
Temps de DIF TDIF jours
Sensibilité au complément se %
Max. de Parasitémie MP 10-4 P/ml
Infectivité INF %
Mortalité MOR %
Table n02 : Variables, unités et abréviations
Description des Résultats
Génétique
Bien que les analyses isoenzymatiques complémentaires (22 loci au
lieu de 15) n'aient pas été faites par nous-mêmes, nous avons participé à
l'analyse de la variabilité génétique additionnelle,' et nous en donnons ici
les résultats utiles à la compréhension de notre sujet.
SPI 04 Cutia Gamba OI'S21 13379 5034 Cuica P209 Esquilo PlI SC43 BU92148 503 "'" BU92149 NR
SP104 0 PlICutia 0,09 0
Gamba 0,2 0,13 0OI'S21 0,31 0,31 0,31 013379 0,31 0,24 0,27 0,37 05034 0,17 0,09 0,13 0,34 0,31 0Cuica 0,17 0,09 0,13 0,34 0,31 0 0P209 0,17 0,09 0,2 0,37 0,17 0,17 0,17 0
Esquilo 0,24 0,17 0,13 0,27 0,24 0,09 0,09 0,24 0PlI 0,09 0 0,13 0,31 0,24 0,09 0,09 0,09 0,17 0
SC43 0,84 0,81 0,81 0,79 0,78 0,82 0,82 0,81 0,78 0,81 0Bug2148 0,84 0,81 0,81 0,83 0,81 0,82 0,82 0,81 0,82 0,81 0,09 0
503 0,84 0,81 0,81 0,83 0,81 0,82 0,82 0,81 0,82 0,81 0,17 0,09 0t,f.l 0,84 0,81 0,81 0,83 0,81 0,82 0,82 0,81 0,82 0,81 0,17 0,09 0 0
Bug2149 0,84 0,81 0,81 0,83 0,81 0,82 0,82 0,81 0,82 0,81 0,09 0 0,09 0,09 0NR 0,84 0,81 0,81 0,83 0,81 0,82 0,82 0,81 0,82 0,81 0,09 0 0,09 0,09 0 0
Table n03 Matrice des distances de Jaccard correspondant aux divergencesgénétiques entre les 16 stocks.
o1
0,11
0,21
0,31
0,41
0,51
0,61
0,71
0,81
0,91
1,01
1,11
1,21[
13379
CUK:a
5034
Cutia
Pl1
EsquiJo
Gamba
P209
SP104
OI'S21
BU92148
Bug2149
NR
503
MN
SC43
~--
}~
~-
-
~
Figure nO? Relation entre les 16 stocks; dendrogramme basé sur lesdivergences présentées table n03, au-dessus.
Résultats 39
Les degrés de dissemblance génétique ont été quantifiés par la distance de
Jaccard (52) qui se calcule grâce à la formule suivante:
Vij = 1-(C/(2N-C))
dans laquelle C est le nombre de bandes communes entre les stocks i et j
et N est le nombre total de bandes différentes entre les deux stocks.
Les distances de Jaccard, calculées sur la base de 22 systèmes
enzymatiques, sont rassemblées sur la table n03. Un dendrogramme
U.P.G.M.A. (Unweighted Pair-group Method with Arithmétic Averages [78])
est réalisé à partir de ces distances. \1 est présenté sur la figure n07.
Les relations phylogénétiques entre stocks ont été également visualisées
par un réseau de Wagner (39, 40), représenté sur la figure n08.
Le réseau de Wagner, qui présente un arbre phylogénétique, est élaboré
grâce au programme MIX communiqué par Felsenstein J. (PHYLIP package).
Avec cette caractérisation génétique améliorée, nous obtenons les
résultats suivants, bien visualisés par le dendrogramme et le réseau de
Wagner:
1/ Comme prévu (82), chacun des anciens donets (y compris le
39) se rév~le hétérogène. Les « cionets » ne sont pas de véritables
clones, mais des faniilles de clones étroitement apparentés.
2/ La distinction qui avait été faite entre les c10nets 19 et 20
Figure n08 : Réseau de Wagner reliant les 16stocks selon leur divergence évolutive. L'étude aporté sur 22 loci isozymiques.
10
En grisé, est représenté leréseau de Wagner originelprésentant les 43 génotypesdifférents de T. cruz; . Lacaractérisation a porté sur15 loci isozymiques.
CutiaSPI04 *~~~*II:~rïr-..i4__~r-~~~~~~Lfuica 1 4 Tehuentepec
3
35
Résultats 40
(82) est difficile à retrouver sur le dendrogramme et sur le réseau de
Wagner. Certains stocks (par exemple 133 79) présentent une
divergence génétique qui les éloignent autant des stocks 19 que des
stocks 20. OPS21 se trouve aussi proche de Tehuentepec
(caractérisée comme clonet 12 sur la base de 15 loci
isoenzymatiques [82]) que des stocks 19 et 20 dans leur ensemble.
Pour plus de prudence et dans le cadre du présent travail, nous parlerons,
désormais, pour les 10 stocks des c10nets 19 et 20, des stocks du «
groupe 19-20 ».
3/ Bien que la caractérisation génétique améliorée ait permis de
raffiner le tableau de divergence phylogénique au sein de notre
échantillonnage, les grandes lignes dressées par le travail antérieur
(82) demeurent vraies. Nous nous retrouvons, donc, avec deux groupes
(19-20 et 39) séparés une forte divergence phylogénique et au sein
desquels les divergences sont comparativement beaucoup plus
limitées. L1ancien c10net 39 reste plus homogène que le groupe 19-20.
Nous voyons donc, que le présent échantillonnage reste donc parfaitement
adapté pour tester Ilhypothèse de travail, à savoir que les distances
phylogéniques entre c10nets ont un pouvoir prédictif sur leùrs différences
biologiques. Cette hypothèse sera testée en prenant en compte les
distances génétiques estimées sur la base de 22 loci isozymiques.
Table n04 : Résultats de tous les paramètres biologiques étudiés.
Stock cloné Clonet Croissance en L.I.T. Différenciation Sens. Compl. Infection de sourisDT Cfl DIF TDIF SC MP INF MOR
SP104 cil 19 34.06 18 63.6 6 34.8 0.25 37.5 0Cutia cil 19 33.28 30.5 3 10 61.2 0 0 50
Gamba cil 19 28.98 42.33 63.68 8.75 100 887.7 100 59.7133 79 cl7 19 46.55 26.5 6.67 10 45 0 0 33.3
OPS21 cll1 19 40.3 9.4 35.31 7 91.8 0.77 12.5 0
5034 cl4 20 29.33 46.5 58.4 7.68 95.8 382.5 100 50Cuica cil 20 31.98 16 28.33 8 98.4 1.4 61.1 4.8P209 cil 20 21.34 27 49.67 8 88.1 378.1 100 62.5
Esquilo cil 20 50 31.5 58 9 91.3 1718.3 100 100Pll c13 20 35.17 39 2 10 90.4 22.2 11.1 0
SC43 cil 39 59.61 18.83 8.17 9.33 33 0 0 27.4Bug2148 cil 39 51 27.5 7.67 5 34.6 0 0 33.3
503 c15 39 78.1 11 45 9 24.9 11.67 75 75MN cl2 39 69.4 9.4 47 9 39.9 0 0 60
Bug2149 cllO 39 56.8 16 14.7 8 49.4 0.19 11 0NR cl3 39 51.02 23 4 5 10.6 0 0 0
DT en heures; Cfl en 1q-.6 P.lml; DIF en % ; TDIF en jours; SC en % ; MPen 10- 4 P.lml; INF en %; MOR en %.
Résultats 41
Biologie
Les résultats sont rassemblés dans la table n04.
Cinéti.que de culture
La phase de dégénérescence n'est pas considérée dans notre étude. La
faute en est à notre manque de perspicacité, et à l'excés d'intérêt pour la
phase de croissance.
L'observation non mesurée permet, cependa~t, de décrire qualitativement
une phase de dégénérescence beaucoup plus brutale et précoce pour les
stocks du groupe 19-20 que pour les stocks du c10net 39. Ces derniers
perdurent en phase plateau et semblent « résister » au phénomène de lyse
de cette phase.
Lors de nos premiers essais pour suivre la cinétique de croissance des
épimastigotes, nous nous sommes aperçus qu'il était nécessaire de
maintenir les parasites en phase logarithmique avant de mesurer les
paramètres de croissance.
Effectivement, bien que le temps de doublement soit considéré comme une
caractéristique du stock parasitaire (34, 37), il peut varier énormément,',
si le parasite est maintenu" en culture sans prendre en compte sa
cinétique.
STOCKS CLONET Mesures
GAMBA cl 1 19 10
Coefficient de variation (%)
TD
28,17
28,9
29,87
NM
2,3
..Cfl
34
31
62
NM
40,39
DIF
58,7
66,3
49,7
80
20,14
TDIF
7
8
10
10
17,14
S034 c14 20 29,62
30,06
28,32
35
34,5
70
49,3
64,7
61,5
7
8
8
Coefficient de variation (%) 3,08 43,76 13,89 7,53
SC43 cil 39 59,54
58,2
61,1
16,5
22,5
1,75
8
6,5
10
9
9
10
Coefficient de variation (%) 2,43 78,61 21,5 6,19
Table nOS: Mesures de la reproductibilité de la cinétique de croissance
des épimastigotes et de leur différenciation en milieu T.A.U.
3AAG (NM = Non Mesurée).
Résultats 42
Un nombre minimal de 3 passages de parasites de fin de phase
logarithmique est effectué pour avoir un temps de doublement
reproductible.
La table nOS montre les mesures de la reproductibilité, faites sur un
représentant de chaque c1onet.
La reproductibilité est considérée comme forte lorsque le coefficient de
variation est inférieur à 20 % ; elle est considérée comme nulle lorsqu'il
dépasse 40 %.
Le TD est une mesure fortement reproductible alors que Cfl ne l'est pas du
tout. Ceci peut expliquer pourquoi le Cfl n'est jamais considéré dans la
littérature.
Nous observons une croissance beaucoup plus rapide des stocks du groupe
19-20 et, sans faire de tests statistiques, il est évident que le temps de
doublement semble lié à la distance génétique qui sépare ces deux
ensembles (groupe 19-20 et clonet 39). Cela veur dire qu'il nous permet a
priori de distinguer des groupes de stocks génétiquement distincts.
Trois stocks du groupe 19-20 sont moins rapides que les autres stocks:
133 79, OPS21 et Esquilo.
Si on regarde l'arbre de Wagner qui traduit la divergence génétique entre
tous les stocks, nous pouvons constater que ces stocks se trouvent à la
périphérie de l'ensemble.
1
Résultats 43
Les valeurs les plus élevées de la concentration à la fin de la phase
logarithmique - Cfl - sont atteintes par des stocks du groupe 19-20.
Le TD apparait véritablement comme une variable permettant une très
bonne distinction de stocks phylogénétiquement différents.
Différenciation
Le processus de la métacyclogenèse est particulièrement important
puisqu'il représente la transformation morphogénétique d'une forme non
pathogène à une forme pathogène.
La table nOS montre clairement que les caractéristiques de la
différenciation sont fortement reproductibles.
Les comparaisons entre un inoculum parasitaire (épimastigotes en milieu
de culture) en milieu de phase de croissance, en fin de phase de croissance
et en phase plateau n'ont pas donné de résultats significativement
différents.
Nous avons ensemencé, avec, les parasites synchronisés en milieu T.A.U.,
dix. boîtes. La cinétique de transformation est suivie pendant 10 jours : la
lyse devient par la suite trop in:1portante. .
Le paramètre DIF est le pourcentage maximum de trypomastigotes
métacycliques obtenus.
Résultats 44
Dans l'ensemble, les stocks du groupe 19-20 ont une capacité plus grande
à se différencier en trypomastigotes métacycliques que les stocks du
c10net 39.
Trois stocks se distinguent des autres dans le groupe 19-20 : Cutia,
133 79 et Pll se transforment très peu. Deux se distinguent dans le
c10net 39 : 503 et MN se transforment beaucoup.
Nous observons que 503 et MN, dans le c10net 39, sont aussi les deux
stocks les plus lents en cinétique de culture. Dans le groupe 19-20 par
contre, nous ne notons pas de rapproc.hement entre les mesures de
différenciation et les mesures de cinétique de croissance des
épimastigotes.
Le jour du maximum de différenciation est une valeur difficile à utiliser ;
en effet, les valeurs mesurées varient sur une petite échelle (de 5 à 10
jours pour les 16 stocks) et ne semblent pas distinguer les c1onets..
Nous notons que, dans le groupe 19-20, les trois stocks Cutia, 133 79 et
Pll ne se différenciant pas, sont les seuls stocks à avoir un TDIF de 10
jours. Cependant, d'autres stocks ont un TDIF de 9 jours (Esquilo, 503 et
MN) et se différencient très bien.
Résistance au complément
Les épimastigotes sont connus pour leur sensibilité au complément.
En étudiant le comportement d'une culture d'épimastigotes maintenus en
STOCKS
CLONET
1° mesure
2° mesure
3° mesure
Coef. de variation
13379c17
19
45,42
34,04
55,54
23,9
Esquilo cil
20
89,06
93,53
NM
3,46
SC43 cil
39
36,16
39,54
23,32
25,93
Table nOG : Mesures de la reproductibilité de la sensibilité desépimastigotes au complément humain (NM = Non Mesurée).
Résultats 45
phase logarithmique, nous ne nous attendions pas à observer une telle
résistance au complément des parasites de certains stocks.
Les mesures de la reproductibilité de la sensibilité au complément sont
présentées dans la table nOG.
Les coefficients de variation montrent une sensibilité moyennement
reproductible. Une reproductibilité plus grande serait obtenue en
conservant les parasites dans les mêmes conditions de culture, ce qui
n'est pas le cas dans notre protocole. En effet, nous les transférons d'un
milieu de culture, L.I.T. en présence de 5VF7, dans un nouveau milieu L.I.T.
en présence d'un nouveau sérum (sérum humain frais au lieu de sérum de
veau fœtal frais), dans un nouveau volume, en contact avec un nouveau
matériau.
Les résultats sont surprenants puisque nous pouvons observer que les
épimastigotes de certains stocks (NR, 503) résistent très bien à la lyse du
complément.
Les épimastigotes des stocks du groupe 19-20 sont dans l'ensemble
sensibles à l'action lytique du complément : les épimastigotes du stock
Gamba sont lysés à 100%.
Dans l'ensemble, les stocks du c10net 39 sont résistants au complément
tandis que les stocks du groupe 19-20 sont sensibles.
Quat~e exceptions à l'ensemble des résultats sont observables: Bug 2149,
7 5VF : Sérum de Veau Fœtal
STOCKS CLONET
Gamba cil 19
Coefficient de variation
Cuica cil 20
Coefficient de variation
SC43 cil 39
Coefficient de variation
MP
10-4 P.lml
1680
1256,2
155
173,1
1301,5
760,6
71,22
0,8
0,95
2,38
63,35
o
o
o
o
INF
%
100
100
100
100
100
100
o
83,3
57,1
42,9
33,54
o
o
o
o
MOR
%
50
NM
NM
NM
66,7
62,5
14,53
o
o
14,3
173,2
o
22,2
60
110,72
TMP
jours
28
29
33
24
40
24
20,52
17
15
15
7,37
NM
NM
NM
NM
Table nO? : Mesures. de la reproductibilité des caractéristiques de
l'infection in vivo. (NM = Non Mesurée)
Résultats 46
MN sont plus sensibles que les autres stocks du c10net 39 ; 133 79 et
SP104 ont une sensibilité très moyenne par rapport aux autres stocks du
groupe 19-20.
Infection in vivo
La table n07 présente les mesures de la reproductibilité des
différents paramètres de l'infection expérimentale de souris.
Les résultats obtenus sont, pour le moins, hétérogènes et les coefficients
de variation sont explicites: selon le protocole que nous avons utilisé, les
mesures ne sont pas reproductibles.
Par contre, nous observons que « l'information qualitative» est
reproductible : certains stocks provoqueront toujours une parasitémie,
même dans les cas où la parasitémie fluctue plus que ce que nous
aimerions et inversement, certains stocks ne provoqueront jamais de
parasitémie mesurable.
C'est pour nous l'observation la plus importante; en effet, les mesures ne
nous fournissent pas d'informations quantitatives fiables sur le
comportement in vivo des stocks, sinon une information qualitative
reproductible.
Il nous était, donc, possible de répartir les 16 stocks en groupes selon la
« qualité » de l'infection provoquée. Nous avons considéré la virulence
Résultats 47
pour cette répartition. La virulence regroupe généralement la mortalité et
la parasitémie (4, 17, 72). Nous l'utilisons avec la même signification.
Nous avons réparti les stocks en trois groupes :
• ceux qui ne sont pas virulents.
Ce sont ceux qui provoquent un pic de parasitémie visible nulle ou
faible (MP ~ 22,2x104 P.lml) et une mortalité nulle ou faible
(MOR < 33,3%). Ils ont généralement une infectivité faible
(INF ~ 37,5%) à l'exception de Cuica dont l'infectivité est de 61,1 %.
• ceux qui sont très virulents.
Ce sont ceux qui provoquent et une forte parasitémie (MP ~ 3,78x1 06
P.lml) et une forte mortalité (MOR ~ 33,3%).
• ceux qui possèdent une virulence intermédiaire ou moyenne.
Ce sont ceux qui provoquent une forte mortalité sans pour autant
avoir engendré une forte parasitémie.
On observe une grande variabilité dans le groupe 19-20 autant pour le
maximum de parasitémie que pour la mortalité et l'infectivité.
Les stocks suivants ont un comportement particulier : Cutia, 133 79, Bug
2148, MN et S03. Les souris infectées par ces stocks, pendant 60 jours,
n'ont pas montré de parasitémie alors que leur état général s'aggravait
tout au long de l'infection et que ·Ie total des souris tuées pendant
Résultats 48
l'infection est égal ou supérieur à 33,3%.
Nous observons que la mortalité peut être forte sans que la parasitémie le
soit mais nous n'observons jamais une forte parasitémie pour une faible
mortalité.
La variabilité des résultats et la non-reproductibilité des mesures ne sont
pas surprenantes. Des infections reproductibles s'obtiennent en adaptant
le parasite à la souris par 4 à 5 passages sur des souris jeunes en vue de
stabiliser la courbe de parasitémie. Certains stocks qui n'ont présenté
aucune parasitémie se sont avérés impossibles à adapter sur souris.
Adapter les stocks n'était pas pour nous primordial, nous recherchions
seulement un éventail de paramètres biologiques pour tester notre
hypothèse de travail. Bien que, spontanément, les paramètres de
l'infection semblent moins « parlants » que les autres paramètres déjà
décrits, l'analyse statistique sera faite de la même manière.
Analyse statistique
Conformité à la loi de Laplace-Gauss, dite loi Normale
Le but est de détermin~r dar)s quelle mesure les variables mesurées
suivent, pour l'échantillon considéré, une distribution normale.
En général, chaque test statistique a des conditions d'application
Résultats 49
particulières. Pour tous ceux que nous avons utilisés, savoir si les
variables suivent une loi normale est nécessaire.
Le test khi carré est le plus utilisé. C'est un test robuste mais qui reste
inadéquat pour l'analyse d'échantillons de moins de 20 individus.
Le test de conformité de Kolmogorov-Smirnov est un test non
paramétrique qiJi s'applique aux distributions de fréquences de variables
quantitatives continues. Il possède l'avantage sur le test khi carré d'être
plus puissant, de ne pas nécessiter les regroupements par classes quand
l'effectif de l'échantillon est faible et de s'appliquer quand ce même
effectif est très petit.
C'est exactement notre cas.
Le test consiste à calculer les différences existant entre les
distributions relatives cumulées observées (Fobs) sur l'échantillon et les
distributions relatives cumulées théoriques (Fth) et de ne prendre en
compte que la différence maximale ainsi calculée « Dobs » :
Dobs = max. cl Fobs(xi) - Fth(xi)l) 'tJ xi
L'hypothèse nulle est:
« La distribution théorique est conforme à la distribution observée. »
L'hypothèse de travail est:
Résultats 50
« La distribution théorique n'est pas conforme à la distribution
observée; il existe au moins une valeur de x où l'écart entre les deux
distributions est trop grand. »
Notre question dans ce test, pour chaque variable, est :
« Les valeurs mesurées sur les 16 stocks se distribuent-elles selon une
loi normale? »
L'hypothèse Ho sera acceptée si chaque valeur de Dobs est inférieure à la
valeur critique Da pour les 16 individus (a étant le risque de première
erreur) ; cette valeur est de 0,392 pour a égal à 1%, et de 0,3273 pour a
égal à 5%.
Deux valeurs dépassent la valeur Do,os : la Dobs de MP et la Dobs de INF.
Variables
1
TD Cfl DIF TDIF SC MP INF MOR
1
Dobs 0,12 0,12 0,275 0,11 0,15 0,67 0,38 0,28
Table n08 : Valeurs de Dobs pour les 8 variables.
La variable MP ne suit pas du tout la loi normale tandis que INF suit la loi
normale de façon approximative (Dobs < Dl %).
• 38,-,.:0:-:,:,,:,:,:,,:'"-":":":'1
9.2 Cfl 47
·38 .26
lillilll0i:!ii·fl:;··'1
1. 9 D1F 64 T D1F
sc 0 MOR 110
Figure nog : Présentation des courbes de distribution desfréquences pour chacune des variables ; celles de MP et INF nesuivent pas un loi normale contrairement aux autres.
Résultats 51
La figure n09 présente, pour chaque variable, les courbes de répartition
des fréquences de distribution sur lesquelles nous avons superposé les
histogrammes donnant les différentes catégories créées dans chaque
variable et le pourcentage de stocks présents dans ces catégories.
Comparaisons des moyennes
Dans notre étude et pour une bonne compréhension de la suite des
analyses statistiques, nous devons préciser que l'information générale que
nous possédons des stocks utilisés est de deux ordres :
une information qualitative qui est donnée par les « paramètres
qualitatifs» (appartenance à un c1onet, provenance géographique, hôte
prélevé) et une information quantitative donnée par les « paramètres
quantitatifs» (toutes les variables mesurées).
En plus de l'appartenance aux c10nets 19, 20 et 39, les données
qualitatives sont épidémiologiques. Bien que l'objet principal du travail
était de tester l'impact de la variabilité génétique du parasite sur sa
diversité biologique, il nous a semblé intéressant d'aborder la question de
l'impact de ces paramètres épidémiologiques sur la diversité biologique.
Cependant, il fal~t souligner que cette partie de notre travail a un
caractère tout à fait préliminaire: l'échantillonnage a été conçu pour
Variables Moyennes Ecarts types V (%) Variances Unités
TD (total) _~__'t.~,8__~____.!.~ê.~ 35,29 250 heures._---.....---_.__.._- __._~ ....~09_._ .._~ ......cl 19 36,6 6,9 18,7 47,1cl 20 33,6 10,5 31,3 110,6cl 39 61,0 10,8 17,7 116,4
Cfl (total) 24,5 11,48 46,86 131,72 10-6 P/mlcl 19 25,3 12,5 49,3 156,1cl 20 32,0 11,6 36,3 135,1cl 39 17,6 7,0 39,5 48,4
DIF (total) 30,95 24,1 77,87 580,92 %
cl 19 34,5 29,4 85,4 866,4cl 20 39,3 24,2 61,5 583,4cl 39 21,1 19,6 93,0 384,6
TDiF (total 8,1 1,64 20,25 2,68 jours
cl 19 8,4 1,8 21,5 3,2cl 20 8,5 1,0 11,2 0,9cl 39 7,6 2,0 26,9 4,1
SC (total) 61,8 31,02 50,19 962,13 %
cl 19 66,6 28,5 42,9 814,4cl 20 92,8 4,2 4,5 17,6cl 39 32,1 13,3 41,4 176,3
MP (total) 212,7 469,51 220,74 220443,6 10-4 P/mlcl 19 177,7 396,9 223,3 157511,8cl 20 500,5 705,3 140,9 497453,6cl 39 2,0 4,7 240,3 22,6
INF (total) 38 43,24 113,79 1869,71 %
cl 19 30 42,0 140,1 1765,6cl 20 74,4 39,2 52,7 1537,5cl 39 14,3 30,0 209,6 902,7
MOR (total) 34,75 32,01 92,12 1024,4 %
cl 19 28,6 27,8 97,1 770,8cl 20 43,5 41,8 96,2 1746,4cl 39 32,6 30,7 94,0 940,3
Table nog : Présentation des calculs statistiques simples detoutes les variables étudiées ; V est le coefficient devariation (écart-type/moyenne)
Résultats 52
tester l'hypothèse de travail principale et n'est absolument pas suffisant
pour apporter des réponses rigoureuses sur les rapports entre les
paramètres épidémiologiques et la diversité biologique.
La table nog présente les calculs statistiques des moyennes, écarts types,
variances et coefficients de Variation.
Nous pouvons observer que toutes les variables sont hétérogènes : les
coefficients de variation sont élevés. TDIF semble échapper à la règle (les
valeurs varient de 5 jours à 10 jours). MP varie énormément de 0 P.lml à
1,7 107 P.lml.
La comparaison des moyennes sera faite par rapport aux modalités (ou
catégories) présentées à la table nOl0.
Modalités N° 1 N°2 N°3
Géographie Chili Bolivie Vénéz.-Brésil
Hôtes Vecteur Hôte sauvage Homme
Clonet 19 20 39
Table nOl0 : Répartition des différentes modalités pour les
variables qualitatives
L'analyse de la variance à un critère de çlassification s'applique
Variables qualitatives
d.d.1. = 15 Clonet Hôte Geographie
V TD F 13.6 1.18 0.365
a P 0.0006 0.337 0.701
rCfl F 2.63 0.59 0.97.
q p 0.11 0.566 0.403
ua DIF F 0.83 0041 0.16n P 0.456 0.672 0.857ti
TDIF F 0.53 0.92 2.5t P 0.6 0.424 0.121a.t F 15.79 2.76 3.05i SC
P 0.0003 0.1 0.082ves MOR F· 0.26 0.96 0041
P 0.773 0.409 0.67
Modalités Clonet Hôte Géogïclphiecomparées = Probabilité de ne pas observer une différence
MP n0 1 / n0 2 = 0,048 0,176 0,131
n0 1 / n0 3 = 0,214 0,469 0,133
n0 2 / n0 3 = 0,004 0,150 0,473
INF n0 1 / n0 2 = 0,090 0,238 0,190
n0 1 / n0 3 = 0,214 0,270 0,192
n0 2 / n03 = 0,009 0,150 0,473
Table nOll : Analyse de la variance à un critère declassification. Table nOll-a : F est le rapport des variancesTable nOll-a et nOll-b : P est la probabilité qu'il n'y aitaucune différence entre les modalités (cf. table n0 10).
Le taux d'acceptation de Ho est P ~ 0,05.
Résultats 53
indifféremment aux grands et aux petits échantillons. Cependant, il est
indispensable que la distribution de fréquence des variables suive une loi
normale.
MP et INF étant en-dehors de ces conditions d'application, nous serons
obligés d'utiliser un test non paramétrique de Wilcoxon-Mann-Whitney.
Le but de l'analyse de la variance à un facteur est de comparer les
différences existantes entre plusieurs catégories ; ces catégories sont
créées selon un caractère qualitatif. C'est, ainsi, l'influence de ce seul
facteur que l'on teste par cette analyse (cf. table n0 10 pour les
différentes catégories ou modalités).
L'hypothèse nulle est, ici, qu'il n'y a pas de différence entre les moyennes
des échantillons que ·l'on compare, c'est-à-dire que le facteur testé (la
provenance d'une même région par exemple) n'a pas d'influence
significative sur les mesures et donc, qu'il n'y a pas de différences
significatives entre groupes de stocks.
La table n011-a présente la valeur F (du nom du mathématicien Fischer) et
la probabilité P ; F étant considéré comme le rapport des variances
(Variance expliquée par le facteur/Variance inexpliquée par ce même
facteur) et P étant la probabilité que les différences observées soient
dues au seul hasard.
Résultats ~4
Plus F est grand, plus la variance expliquée augmente ou plus la variance
inexpliquée diminue et P est fort.
Le degré de liberté est de 13+2=15 ; 3 catégories par variable (3-1 =2) et
3 paramètres qualitatifs pour 16 stocks (16-3=13).
L'analyse de la variance est un test de comparaison des moyennes de plus
de 2 échantillons.
Les hypothèses sont les suivantes:
- l'hypothèse nulle est « toutes les moyennes sont identiques ».
- l'hypothèse alternative est « au moins une moyenne diffère des
autres ».
Nous accepterons ou rejeterons l'hypothèse nulle au risque d'erreur de 5%.
Cependant dans le cas où Ho est rejetée, nous ne pourrons pas dire quelle
moyenne diffère des autres.
Par l'observation de la table n011-a, nous pouvons dire que:
- l'appartenance à un c10net engendre significativement pour
TD et SCJ. et dans une moindre mesure pour Cfl (a = 10%), une
différence de co~port.ement.
- la nature de l'hôte sur lequel on a fait le prélèvement n'est
pas un caractère discriminant significatif pour les 16 stocks ;
Résultats 55
il l'est pour SC au risque d'erreur de 10%.
- la provenance géographique a, pour SC, une influence
statistiquement significative ; cette influence est
moindre pour TDIF (a = 12%).
Il nous faut souligner que les variables DIF et MOR ne présentent pas de
différences significatives entre les groupes pour aucune des variables
qualitatives.
La Sensibilité au Complément apparaît comme une variable très
informative: elle sépare (cf. Table n09) très bien les stocks du c10net 39
des stocks du groupe 19-20 et elle sépare très bien les stocks du Chili
(SCmoyen = 28,43%) des stocks des autres régions géographiques (Bolivie:
SCmoyen = 62,87% et Brésil: SCmoyen = 75,24%). Ce dernier résultat doit
être pris avec prudence puisque nous n'avons, dans notre échantillon, que
trois stocks du Chili.
Le test de Wilcoxon-Mann-Whitney est un test non paramétrique
c'est-à-dire qu'il n'est pas a~sujetti à la loi de distribution des éléments
de .Ia population. Les éléments sont classés par ordre croissant sur une
même échelle ordinale, ils occupent ainsi d~s rangs. Le test cherche à
vérifier si les éléments de deux groupes occupent des rangs équivalents
Résultats S6
révélant ainsi une similitude des deux distributions.
Les résultats, table nO' , -b, nous permettent de dire que les stocks du
c10net 20 se distinguent significativement des stocks des c10nets , 9 et
39 pour ces 2 caractéristiques de l'infection in vivo et que la provenance
géographique aurait tendance (a. = '3%) à séparer les stocks du Chili des
autres pour la variable MP ; que l'hôte n'est pas un facteur déterminant
dans la classification des stocks présentés pour les variables MP et INF.
Corrélation entre biologie et génétique
La comparaison de moyennes entre c10nets ne donne qu'une
information globale de la relation entre chaque variable biologique et la
divergence génétique et ne saurait être utilisée, seule, pour tester notre
hypothèse pour deux raisons :
, / comme le montre la table n04, les valeurs trouvées au sein de
chaque c10net pour les différents paramètres biologiques peuvent
être très hétérogènes;
2/ les nouvelles méthodes d'analyse isoenzymatique ont montré
une hétérogénéité génétique additionnelle au sein de chaque c1onet.
Nous devons, donc, prendre en compte ces deux qbservations et chercher,
pour plus de rigueur, à mesurer le degré de corrélation qui existe entre
Résultats 57
d'une part, les distances génétiques de Jaccard entre paires de stocks et
d'autre part, les valeurs absolues des différences, entre ces mêmes paires
de stocks, des mesures de chaque variable biologique. C'est ici la
démarche la plus appropriée pour tester notre hypothèse de travail8.
Le degré de liberté de l'étude de la corrélation est le nombre de paires de
stocks moins 1, soit 119. Cette solution n'est pas totalement
satisfaisante, car les distances génétiques et les « distances
biologiques » (les différences, entre paires de stocks, des mesures des
variables biologiques) ne sont pas réellement indépendantes les unes des
autres (84) comme l'exigerait l'analyse du coefficient de corrélation de
Pearson. Cependant, dans la pratique, des tests de tirages aléatoires (test
de Mantel), qui ne demandent pas d'estimation sur les degrés de liberté,
ont toujours donné des résultats parallèles aux corrélations classiques
dans de telles comparaisons de matrices de distances (Tibayrenc M., en
préparation). Nous avons, donc, retenu les résultats obtenus par la mesure
du coefficient de corrélation de Pearson (figure nO l0).
En plus de l'estimation du degré de liberté, les variables comparées
doivent être quantitatives et avoir une distribution jointe binormale.
Nous nous trouvons avec ·9 variables· et 120 individus. Ce grand nombre8 L'hypothèse étant que les divergences phylogéniques ont un impact surles propriétés biologiques des stocks.
GÉN TD Cfl DIF TDIF sc MP INF MOR
GÉN
TD
Cfl
DIF
TDIF
sc
MP
INF
MOR
1----:~__1 -. 692 .372 .696 .445 .57 .24
.49
.455
.232
.684
.594
La corrélation est considériJ~
significatiueo 05pour ai ,
10- 4
10- 4 10· 4
10- 4 0,03/' :'\~,3~
/" "' 10- 4 /"V':'"~,57./ ~,63./~,4~
10- 4 10- 4 10- 4 10- 4 0,03
10- 4 va 07' 10· 4 10- 4 1~1"' 10- 4f'....' ./ 1'....'.-/
10- 4 10- 4 10- 4 10- 4 ~ 51"" 10- 4 10. 41'....'../
V ........2.10· 4 10. 4 10· 4 10- 4 10. 40,008 ~,1~ 0,01
MP
MOR
DIF
sc
Cfl
INF
TDIF
TD
GÉN TD Cfl DIF TDIF sc MP INF
.Figure nO' O': Matrice des coefficients de corrélations (en haut) et destaux de signification a (en bas) ; les coefficients de corrélation sontliés aux courbes de régression dessinées sur. la matrice; l'abscisseest la variable de la colonne et l'ordonnée est la variable de la ligne.
Résultats 58
nous a permis de confirmer que les différentes variables avaient une
distribution s'approchant de la normale et, y compris pour MP et INF, nous
avons considéré l'utilisation du coefficient de Pearson comme correct.
La figure nOl0 présente les coefficients de corrélation entre chacune des
variables biologiques d'une part et les distances génétiques d'autre part ;
et entre toutes les variables biologiques comparées deux à deux.
Cette dernière information nous permettra de vérifier dans quelle mesure
les paramètres biologiques ont un pouvoir prédictif les uns sur les autres.
Les coefficients de' corrélation encerclés sur la figure nOl0 sont
considérés comme non significatifs (a > 5%) comme le montrent les taux
de signification au bas de la figure (le test de signification est réalisé
par un test de Student).
La corrélation entre les distances génétiques et les paramètres
biologiques est hautement significative, sauf pour TDIF. Cette corrélation
est très accentuée pour TD et pour SC, moins pour MP, INF et DIF.
DIF est fortement corrélé à tous les paramètres de l'infection in vivo
. alors qu'il est faiblement corrélé aux paramètres de croissance des
épimastigotes.
Le .fait de trouver une telle corrélation entre la facilité à se différencier
en milieu axénique in vitro et la virulence du stock plaide en faveur de la
Résultats S9
qualité du modèle expérimental de différenciation en milieu T.A.U. 3AAG.
Nous voyons que le paramètre TDIF est le seul à ne pas être corrélé avec
les distances génétiques. Ce paramètre est particulier puisqu'il n'est
corrélé qu'au TD, au MOR et au SC.
TD et MOR ne sont pas corrélé entre eux.
Nous pouvons constater que nous n'avons pas de variables complètement
redondantes : par exemple, MOR est fortement corrélé aux autres
paramètres de l'infection, cependant nous voyons que son comportement
par rapport au TDIF est différent. INF est fortement relié aux MP et MOR,.
cependant MP est faiblement relié au TD.
La corrélation nous renseigne sur le comportement de chaque variable
biologique par rapport à toutes les autres. Mais il est plus informatif de
synthétiser, d'un coup, l'information de toutes les variables et de voir la
puissance de cètte information pour décrire et caractériser les stocks.
Nous nous proposons de le faire dans les chapitres suivants.
Analyse des données
Analyse en composantes principales ou A.C.P.
Cette analyse est un pas nécessaire pour introduire l'analyse
Résultats 60
factorielle discriminante. Cela nous permettra de « débroussailler », de
manière descriptive, l'information synthétique sur l'organisation des
stocks en différentes classes.
L'analyse en composantes principales consiste précisément à chercher de
nouvelles variables - les composantes principales - non corrélées entre
elles et combinaisons linéaires des variables de départ (TD, Cfl, DIF, TDIF,
SC, MP, INF, MOR).
Cette analyse détermine des axes principaux d'inertie du nuage.
En termes pratiques, lorsque l'on se trouve face à un tableau de données
tel que celui présenté table n04, nous ne pouvons parler que de
l'information apportée séparément par chaque variable. Synthétiser
l'information obscurcie par la masse de nombres revient à obtenir le
maximum d'information sur le modèle à partir du minimum de données.
Transformer les différents paramètres quantitatifs en variables non
corrélées entre elles permet de mieux gérer l'information intrinsèque à
chacune - il n'y a pas redondance d'information - et de nous limiter à un
petit nombre d'entre elles sachant quelle est leur valeur informative.
Tout ce qui suit consiste don~ à r~duire la dimension de l'espace à 8
dimensions (les 8 variables) des 16 individus (les stocks) en une espace
en deux ou trois dimensions.
Les axes de cet espace possèdent chacun une inertie différente,
Inertie (%) Cumul (%)
1° axe 45,87 45,87
2° axe 20,83 66,70 Axes conservés pourl'interprétation
3° axe 15,12 81,81
4° axe 8,64 90,45
5° axe 4,11 94,56
6° axe 2,15 96,71 Axes mineurs
raxe 1,95 98,67
8° axe 1,33 100
Table n0 12 : Inertie individuelle et cumulée desaxes créés pour l'A.C.P.
2
A est faiblement représenté parl'axe 1, fortement représentépar l'axe 2.
A est fortement représenté parl'axe 1, faiblement représentépar l'axe 2.
Figure n0 11 : Description des cercles des corrélationsentre les variables et les axes.
Résultats 6'
c'est-à-dire une partie différente de l'information du modèle.
La table nO' 2 présente l'inertie de chaque axe. Les 4 premiers axes ont été
retenus pour l'analyse. Ils synthétisent 90,45% de l'information du modèle.
Ils expriment aussi différemment chaque variable de départ étant entendu
qu'ils sont une composition de celles-ci. Les huits axes ont donc deux
propriétés :
, / ils ne possèdent pas la même information du modèle
d'ensemble ;
2/ ils n'expriment pas les variables de la même manière.
En fait, un cercle de corrélation permet, par rapport à 2 axes (1 horizontal
et , vertical) créés et définis lors des calculs préparatoires de l'A.C.P., de
représenter graphiquement les relations qui existent entre les différentes
variables et les différents axes. Nous voyons sur la figure nO" qu'une
variable est d'autant bien prise en compte par un axe que sa projection
orthogonale sur celui-ci est grande.
Sur la figure nO' 2 ( et table nO?), nous notons que
- l'axe' exprime très fortement les variables MP et INF et SC,
et bien toutes les autres variables sauf TDIF ;
- l'axe 2 prend très bien en compte TD et MOR, et mal TDIF, INF,
DIF, MP ;
- l'axe 3 prend très bien en compte TDIF et faiblement DIF et pas
Figure n012 : Représentation graphique des cercles descorrélations entre les variables biologiques et lesprincipaux axes de l'A.C.P.
1,1
-1,1
Résultats 62
c'est-à-dire une partie différente de l'information du modèle.
La table n01 2 présente l'inertie de chaque axe. Les 4 premiers axes ont été
retenus pour l'analyse. Ils synthétisent 90,45% de l'information du modèle.
Ils expriment aussi différemment chaque variable de départ étant entendu
qu'ils sont une composition de celles-ci. Les huits axes ont donc deux
propriétés :
1/ ils ne possèdent pas la même information du modèle
d'ensemble;
2/ ils n'expriment pas les variables de la même manière.
En fait, un cercle de corrélation permet, par rapport à 2 axes (1 horizontal
et 1 vertical) créés et définis lors des calculs préparatoires de l'A.C.P., de
représenter graphiquement les relations qui existent entre les différentes
variables et les différents axes. Nous voyons sur la figure n011 qu'une
variable est d'autant bien prise en compte par un axe que sa projection
orthogonale sur celui-ci est grande.
Sur la figure n012, nous notons que
- l'axe 1 exprime très fortement les variables MP et INF et SC,
et bien toutes les autres variables sauf TDIF ;
- l'axe 2 prend très bien en compte TD et MOR, et mal TDIF, INF,
DIF, MP ;
- l'axe 3 prend très bien en compte TDIF et faiblement DIF et pas
Inertie totale = 66.7%
.Esqui.lo
RMe 2
.5(43
RHe 1
209
•
Pll
R
Inertie totale = 23.76% RMe 4
ffi·1-3.9 tfi 3.1
-2
RHe 3
SP104•
Figure nO' 3 : Représentation graphique en deux dimensions del'A.C.P.. En haut: le graphe a les axes' et2 (graphe' -2) ; en bas: le graphe a les axes 3 et4 (graphe 3-4).
Résultats 62
du tout TD et MP ;
- l'axe 4 prend faiblement en compte Cfl.
Nous confirmons que les axes 1,2 et 3 forment la meilleure combinaison
autant pour la quantité d'inertie que pour qualité d'expression des
variables.
La figure n013 présente deux graphes à deux dimensions distribuant les
stocks selon les nouveaux axes définis par l'A.C.P. : l'un est formé par les
axes 1 et 2, l'autre par les axes 3 et 4.
Sur le graphe 1-2, quatre groupes sont formés.
L'axe 1 sépare les stocks en 2 groupes, dont l'un est formé de Esquilo,
Gamba, P209 et S034. Les cercles des corrélations montrent que les
variables les mieux exprimées par l'axe 1 sont MP et INF et SC et
effectivement, Esquilo, Gamba, P209 et S034 forment le groupe des
stocks les plus virulents9 avec une faible résistance au complément.
L'axe 2 sépare les stocks en deux groupes dont l'un est formé de Esquilo,
MN et S03 : les cercles des corrélations montrent que les variables les
mieux exprimées sur l'axe 2 sont TD et MOR.
Nous voyons qu'en prenant en compte plus des deux tiers de l'inertie totale
les stocks se répartissent « aux quatre coins » du graphe témoignant de
comportements biologiques différent's. Nous pouvons dire que, sur les 169 La virulence étant aptitude à déterminer chez .Ia souris une forteparasitémie et une forte mortalité.
Résultats 0.:5
stocks, Gamba, P209 et S034 s'individualisent par une virulence forte et
une croissance en milieu axénique rapide, que S03 et MN s'individualisent
par une croissance très lente et des mesures de MOR élevées et que les
autres stocks (mis à part Esquilo) n'ont pas de composantes biologiques
déterminantes.
Les axes 3 et 4 ne concernent à deux que à peu près 24% de l'inertie. Ils
sont donc beaucoup moins informatifs pour distinguer les stocks les uns
des autres. Toutefois, il convient de considérer plus en détail une qualité
particulière de l'axe 3 : il exprime 74% de l'information de TDIF.
L'axe 3 isole SP104 et regroupe Pll, Cutia et 133 79. Le rapprochement
des 3 autres stocks est dû leur très fort TDIF.
L'axe 4 nous permet d'individualiser Cuica et OPS21 d'une part, et NR et
Bug 2148 d'autre part, ces stocks ayant respectivement des
caractéristiques biologiques in vitro similaires.
Nous présentons, sur la figure n014, 2 graphes en· trois dimensions. Nous
augmentons ainsi le pourcentage d'inertie (de 66,7% pour le graphe 1-2
nous parvenons à 81,5% de l'inertie totale sur le graphe 1-2-3).
Nous espérons, ainsi, vérifier les séparations observées figure n013 et
faire éclater le groupe compact de 10 stocks observé dans le graphe 1-2.
Le graphe 1-3-4 semble proposer plus clairement des rassemblements de
stocks que le graphe 1-2-3.
RHes 1, 2. 3 :81,5% del'inertie total e
Esquilo
RH 2
503
RH 3
RHes 1, 3,4 :65,8% del'inertie totale
RH 4
Ax 1 min.=-3,9Ax 2 min.=-2Ax 3 min.=-1,9Ax 4 min.=-1,7
max.=2,6max.=3,1max.=2,2max.=1,5
RH 1
Figure n014 Représentation graphique en 3 dimensions del'analyse en composantes principales.Le graphe du haut a les axes 1, 2 et 3 (1-2-3) ; le graphe du basa les axes 1,3 et 4 (1-3-4).
Résultats 64
Nous pouvons discerner 5 groupes dont Esquilo, Gamba, P209 et S034 d'un
côté et Pll, Cutia et 133 79 de l'autre.
Au centre Bug2149, MN et S03 sont séparés de Cuica et Esquilo.
SP104 est isoléainsi que Bug2148 et NR.
Nous constatons, grâce à l'analyse en composantes principales, qu'il est
désormais plus facile d'identifier biologiquement les stocks. Ceux-ci se
regroupent selon les paramètres qui leur sont les plus marquants : par
exemple, Esquilo, Gamba, P209 et S034 se distinguent, entre autre, par
leur forte virulence.
Classification automatique
La classification automatique est une autre méthode d'analyse des
données. Elle porte sur des individus qu'il s'agit de regrouper en catégories
jugées homogènes au regard de tel ou tel critère.
Nous avons représenté, sur la figure n015, la classification automatique
des 16 stocks.
Nous pouvons voir que cette méthode se rapproche de l'analyse en
composantes principales (cf. figure n014, graphe 1-3-4).
Nous voyons, de nouveau, que les stocks Esquilo, Gamba, 5034 et P209 se
distinguent de tous les autres stocks ; que 503 et MN se regroupent (cf.
figure n013, graphe 1-2) d'un côté ainsi que Cutia, 133 79 et Pl1 d'un
autre côté.
o 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,37
SPl04
OPS2l
Cuica
Cutia
13379
PlI
Bug2l49
SC43
Bug2l48
NR
S03
MN
Esquilo
Gamba
S034
P209
1
1
1 ~
1
1
1
1
1
1
1
~
Figure nO' 5 : Dendrograrnme représentant la variabilitébiologique totale entre les stocks.
Résultats 65
Les résultats de l'étude de la corrélation (entre distance génétique
et paramètres biologiques) et les résultats de l'A.C.P. sont autant
d'arguments pour réaliser l'analyse factorielle discriminante.
Analyse factorielle discriminante
On peut assigner aux méthodes de discriminations deux objectifs
complémentaires :
1/ étudier si les variables recueillies permettent de distinguer des
groupes et
2/ fournir des règles de classement pour prédire l'appartenance des
observations à des groupes prédéterminés.
L'analyse factorielle discriminante consiste à chercher de nouvelles
variables, combinaisons linéaires des variables de départ (comme l'A.C.P.),
qui fournissent les meilleures séparations des groupes. Elle apparait alors
comme une analyse en composantes principales particulière.
On peut considérer que l'objet de l'analyse discriminante est l''élaboration
d'une règle de décision perm~ttan~ de classer au mieux les observations
futures.
Toutes les variables n'ont pas le même « pouvoir» discriminant. Certaines
variables peuvent même apporter du « bruit » au problème décisionnel
Résultats 66
posé. II est donc, la plupart du temps, indispensable de passer par une
phase de sélection des meilleures variables afin d'obtenir une
discrimination fiable.
Le calcul des coefficients de corrélation nous a permis de voir quelles
variables étaient entre elles et donc, présentaient un certain degré de
redondance. L'A.C.P., en revanche, nous a permis de préciser qu'elles
apportent, pour' la plupart des cas, une information spécifique. La variable
MP fait exception et n'a pas été utilisée pour l'analyse discriminante.
Nous remarquons que la variable MP - le nombre maximum moyen de
parasites observés dans le sang d'une souris infectée expérimentalement
- est une variable qui a un faible pouvoir analytique. Ceci ne veut pas dire
qui faille rejeter ce paramètre pour des études postérieures : dans les
conditions expérimentales utilisées, MP ne donne pas toute sa puissance
informative. Cela aurait été probablement le cas si avec temps, patience
et obstination, nous avions adapté chaque stock pour l'infection
expérimentale et observé une parasitémie contrôlée, stable et beaucoup
plus significative. Cependant, il est utile de préciser que l'adaptation chez
la souris de stocks ne donnant pas de parasitémie est un travail quelque
fois très long.
Nous avons préféré augmenter le nombre de paramètres descriptifs. .
pouvant être analysés.
La figure n016 présente les résultats graphiques de l'analyse
HK 2
Figure n016 : Représentation graphique de l'analyse factoriellediscriminante ; chaque stock est relié au centre de gravité deson c10net (1 c::::> 19; 2 c::::> 20; 3 c::::> 39); les aires deprobabilité définissent l'espace où la probabilité de trouver unstock appartenant au c10net précisé est de 93%. Les axes 1 et 2définissent complètement le modèle (100% de l'inertie). .
Résultats 67
discriminante des données biologiques par rapport au modèle génétique.
Dans cette analyse, la question est: « dans quelles mesures l'ensemble
des données biologiques ci-dessus traitées permettent-elles de prédire
l'appartenance d'un stock à un donet? »
Nous voyons que la répartition des stocks après l'analyse discriminante
sépare nettement les stocks du c10net 39 de ceux du groupe 19-20. L'aire
de probabilité est de 93% sans chevauchement entre le c10net 39 d'une
part et le groupe 19-20 d'autre part. En d'autres termes, par ces
caractéristiques biologiques, un stock 39 aura 93% de chance de se
trouver dans l'aire de l'ellipse du c10net 39.
Nous pouvons, aussi, observer que le c10net 19 est très hétérogène et que
les c10nets 19 et 20 ont tendance à se séparer sur l'axe vertical (axe n02).
Résultats 68
Rappels des éléments importants du chapitre
Une hétérogénéité additionnelle au sein de chaque clonet est mise
en évidence après augmentation (de 15 à 22) du nombre de loci
isozymiques étudiés.
Les c10nets 19 et le c10net 20 se trouvent ainsi indifféremment
assemblés dans le groupe génétique 19-20. Ce dernier est
phylogénétiquement très divergent du c10net 39.
Les paramètres in vitro, surtout le TD et SC, sont reproductibles
et permettent de bien distinguer les différents groupes génétiques.
Les paramètres in vivo sont moins reproductibles et s'avèrent très
.variables.
Les variables MP et INF ne suivent pas une loi normale
contrairement à toutes les autres. Seules les variables SC et TD ont
des valeurs significativement différentes entre les stocks de c10nets
différents. Toutes les variables sauf TDIF sont fortement corrélés aux
distances génétiques. L' A.C.P. nous permet de constater que les stocks
se regroupent selon des composantes biologiques fortes. L'analyse
discriminante permet de dire que, à 93%, les stocks du c10net 39 et du. . .
groupe 19-20 ont des comportements biologiques statistiquement
différents..
[ DISCUSSION J
Discussion 69
DISCUSSION
Discussion principale
Le présent travail a pour but de répondre à une question simple :
l'évolution c1onale, postulée chez T. cruzi (79, 81, 82), a-t-elle un impact
sur la diversité biologique considérable du parasite? En d'autres termes,
les divergences phylogéniques existant entre clones n~tlJrels de T. cruzi
ont-elles un pouvoir prédictif sur les différences de comportement
biologique du parasite qu'on peut voir d'un stock à l'autre?
L'hypothèse nulle, par rapport à laquelle sont effectués les tests
statistiques, est que la variabilité génétique n'a pas d'impact sur la
variabilité biologique de Trypanosoma cruzi.
Dans cette optique, l'étude des divers paramètres biologiques considérés
dans le présent travail n'était pas un but en soi, mais visait seulement à
constituer la panoplie la plus étendue et la plus variée possible de
caractères différents susceptibles de répondre à notre question.
Deux observations principales peuvent être tirées de nos résultats:
1/ L'hypothèse nulle est peu compatible avec ce que nous observons;
en effet, les distances génétiques sont nettement ou fortement corrélées
à tous les paramètres biologiques sauf un. Le bon accord entre distances
génétiques et diversité biologique est spécialement bien illustré par
Discussion 70
l'analyse factorielle discriminante (figure n016).
2/ L'information génétique apportée par la caractérisation
isoenzymatique n'a pas Lin pouvoir prédictif de 100% sur la diversité
biologique. Nous le voyons sur les tables n04 et n09 : à l'intérieur d'un
groupe génétique donné (par exemple l'ancien c10net 39, qui reste
relativement bien homogène génétiquement malgré l'utilisation de
techniques isoenzymatiques plus résolutives), la variabilité biologique
reste importante.
Ceci suggère donc fortement que la divergence phylogénique entre c10nets
n'est pas le seul paramètre influençant la diversité biologique de T. cruz;,
même si la première semble bien avoir un impact majeur sur la seconde.
Tibayrenc et coll. (81) ont proposé que la diversité biologique de T. cruz;
pouvait s'expliquer, soit par la divergence phylogénique entre clones
naturels, soit par l'adaptation à différents cycles écologiques, soit par
une combinaison de ces deux facteurs. Si l'adaptation à des cycles
écologiques divers était le facteur prépondérant, on devrait attendre que :
1/ des stocks présentant le même profil isoenzymatique (appartenant
au même c1onet), mais venant de cycles radicalement différents (par
exemple, pris chez des patients chagasiques chroniqu,es et chez des
mammifères sylvestres) tendent à être très différents pour leurs
propriétés biologiques ;
2/ des stocks appartenant à des c10nets radicalement différents et
Discussion 71
venant tous d'un même cycle écologique (par exemple, tous isolés de
Triatoma infestans en cycle domestique) montrent peu de diversité
biologique.
Le dernier cas de figure résulterait d'une véritable convergence évolutive :
des stocks issus de phylums radicalement différents deviendraient
biologiquement similaires par. le fait de pressions environnementales
comparables.
Malheureusement, le présent échantillonnage se prête malaisément à
l'estimation de cette hypothèse puisque nous avons bien 5 stocks issus de
Triatoma infes tans, mais le c10net 39 Y est hyper-représenté (4 stocks
sur 5).
La question reste donc ouverte de l'impact spécifique de la différenciation
écologique sur la diversité biologique de T. cruzi.
Les résultats du présent travail pourraient être redoutablement
remis en cause par une hypothèse récemment proposée chez T. cruz! (2) et
chez Entamœba histolytica (61), hypothèse selon laquelle les zymodèmes
de parasites ne représentent pas des génotypes stables, mais de simples
phénotypes susceptibles de subir des changements radicaux sous des
pressions environnementales adéquates (2, 87).
Une telle hypothèse, si elle est vraie, rend nul et non avenu le modèle
clonai de T. cruzi, et par là-même le présent travail. Cependant, une
Discussion 72
somme considérable de connaissances en génétique des populations,
acquises à partir d'organismes extrêmement divers, y compris des
microorganismes, montrent qu'en règle générale, les caractères
isoenzymatiques représentent bien des génotypes fiables. Il faudrait donc
admettre que les protozoaires parasites, pour quelque mystérieuse raison,
constituent un cas spécial.
Par ailleurs, une donnée extrêmement robuste plaide en faveur de
l'hypothèse que les profils isoenzymatiques de T. cruz; représentent bien
des lignées évolutive authentiques : la corrélation entre plusieurs séries
indépendantes de marqueurs génétiques, exemple particulier spécialement
frappant de déséquilibre de liaison (84).
Une telle corrélation a été observée pour des marqueurs très divers chez
T. cruz; (49, 76, 82, 84), et est très difficilement compatible avec
l'hypothèse proposée par Alves et coll. (2) et Mirelman (61).
Notre propre travail apporte des éléments nouveaux à ce débat, puisque la
stabilité des profils isoenzymatiques de nos stocks a été confirmée sur
plusieurs années dans des conditions expérimentales extrêmement
diverses.
Il est probable que les résultats, présentés à l'encontre de la stabilité
des profils isoenzymatiqLies, soient en fait dus simplement aux clonages
imparfaits comme le suggèrent Clark et coll. (26).
Discussion 73
Bien que l'étude des paramètres biologiques n'ait pas été un but en soi
dans notre travail, il nous a été possible de glaner sur ces paramètres un
certain nombre d'observations qui valent la peine d'être rapportées
brièvement.
Virulence et Métacyclogenèse
L'infection in vivo a fourni des mesures très hétérogènes (Table n0 9).
Néammoins, nous avons pu séparer les stocks en 3 groupes selon leur
virulence. Bien que les paramètres de virulence soient statistiquement
corrélés aux distances génétiques, les 3 groupes de virulence ne
correspondent pas aux 3 c10nets étudiés ici.
Chez Cutia et MN, la parasitémie n'est jamais détectable bien que la
mortalité soit élevée. Cela semblerait confirmer plusieurs travaux
antérieurs (68, 69, 70), qui précisent que le nombre de parasites
circulants n'est pas toujours un indicateur du développement de l'infection
chez la souris.
Le maximum de différenciation in vitro est trés fortement corrélé aux
paramètres de l'infection in vivo. Cette corrélation a déjà été soulignée
par Sanchez et coll. (75). Les paramètres de transformation in vitro,
relativement simples à mettre en œuvre, auraient donc un bon pouvoir
prédictif sur la virulence.
Discussion 74
Temps de doublement et tests de sensibilité aux drogues
Le Temps de doublement et la Sensibilité au complément sont les
paramètres in vitro qui séparent le plus nettement les stocks appartenant
aux différents c1onets.
Le Temps de doublement des épimastigotes in vitro a été le premier
paramètre biologique à avoir été relié aux variations isozymiques, avec,
cependant, un sondage non exploitable statistiquement (36).
C'est une donnée biologique facilement obtenue en laboratoire et très
informative :
• le TD est considéré comme une caractéristique intrinsèque du
parasite (36) ; il est corrélé au temps de doublement intracellulaire de
l'amastigote (38).
• le TD a aussi été corrélé (36) aux pourcentages d'épimastigotes
présents dans les différentes phases du cycle cellulaire (Gl, S, G2-M),
montrant une durée de la phase S proportionnelle au temps de doublement.
Ces informations sont importantes, puisque la connaissance indirecte
de la durée des différentes phases du cycle peut permettre de choisir les
drogues les plus susceptibles d'agir sur telles ou telles populations.
Effectivement, une population parasitaire ayant une phase S longue (phase
de synthèse de l'ADN) est très .sensible à des agents interférant avec cette
synthèse (36). Par ailleurs, une infection par un parasite ayant une
croissance intracellulaire de longue durée doit faire l'objet d'un
Discussion 75
traitement par un agent chimique restant suffisamment longtemps dans la
circulation sanguine.
L'épimastigote serait, ainsi, un bon modèle pour le criblage de produits
trypanocides (36).
Résistance au complément
C'est la première fois que l'on montre une résistance partielle des
épimastigotes au complément. Les épimastigotes sont effectivement
connus pour se lyser au contact de sérum non décomplémenté, ce qui
permettait de les séparer des formes trypomastigotes résistantes à cette
lyse (14, 31).
Nous avons comparé la sensibilité au complément de « vrais »
épimastigotes. Les parasites ont été prélevés en milieu de phase
logarithmique. La résistance observée pour certains stocks est
temporaire, puisqu'en augmentant le temps d'incubation, 100% des
épimastigotes de tous les stocks ont été lysés (Cf. le protocole d'infection
expérimentale).
L'acquisition de la résistance des trypomastigotes au complément a été
reliée à l'apparition de diverses protéines de surface. Ces protéines
seraient des inhibiteurs contrôlant la formation du complexe d'attaque
résultat de la cascade du complément (51).
La synthèse de telles molécules semblerait survenir très rapidement
Discussion 76
après le déclenchement de la métacyclogenèse (27).
La resistance temporaire des épimastigotes révélée dans notre travail
semble indiquer que l'activation de la voie alterne du complément est
modulée par un facteur intrinsèque au parasite : on obtient, dans tous les
cas, 100% de lyse. Cependant, les épimastigotes de certains stocks
doivent être incubés au contact du complément beaucoup plus longtemps
que les autres.
Discussion 77
Rappels des éléments importants du chapitre
Les distances génétiques sont bien corrélées aux paramètres
biologiques. L'analyse discriminante nous permet de bien séparer les
stocks du c10net 39 des autres stocks par leur comportement
biologique sur les 8 variables.
La variabilité biologique nlest pas complètement expliquée par le
modèle clonale et l'adaptation du parasite aux différentes niches
écologiques doit intervenir.
Le Temps de Doublement et la Sensibilité au Complément sont les
deux paramètres les plus informatifs vis-à-vis du modèle génétique.
[CONCLUSIONSJ
Conclusions 78
CONCLUSIONS
Des études de valeur ont par le passé considéré la diversité
biologique de protozoaires parasites, en particulier de Trypanosoma cruzi
(36). Cependant, ce travail est le premier, à notre connaissance, qui appuie
une telle étude biologique sur un cadre rigoureux de génétique des
populations. Le modèle clonai fournit une hypothèse réfutable : « la
diversité clonale a un impact notable sur la diversité biologique de T.
cruzi ».
Cette hypothèse n'est pas réfutée par la présente étude, ce qui nous
conduit donc à la retenir comme hypothèse de travail.
La diversité biologique importante mise en évidence chez des stocks,
pourtant très apparentés génétiquement, nous montre clairement par
ailleurs que la diversité c10nale n'est pas le seul facteur responsable de
cette diversité: l'impact des pressions environnementales devra être
évalué par un échantillonnage plus approprié prenant en compte, d'une part
des séries de stocks venant d'environnements diversifiés, mais
relativement homogènes génétiquement, d'autre part, des séries de stocks
provenant de mêmes environnements mais génétiquement très différents.
Bien que .Ies résultats obtenus soient trop préliminaires pour le
certifier (il faut augmenter le nombre de stocks), il semble bien que,
Conclusions 79
malgré leur diversité biologique notable, les stocks du c10net 39 aient,
dans leur ensemble, un comportement spécifique par rapport aux stocks du
groupe 19-20 : en particulier, une croissance lente en culture
d'épimastigotes et une faible virulence chez la souris SALS/C.
Nous soulignons l'importance potentielle d'un tel résultat dans l'étude de
la variabilité clinique de la maladie de Chagas : les stocks du c10net 39
sont fort répandus dans le sud de la zone de répartition de la maladie (
c'est un clone majeur), et il est bien sûr vital de vérifier s'ils pourraient
avoir un comportement clinique moins sévère que les stocks du groupe
19-20.
Cependant, il est essentiel de dépasser ce modèle (peut-être simpliste)
reposant sur l'étude séparée des différents génotypes. Cette étape
réductionniste est indispensable mais ne suffit pas pour comprendre
complètement les observations sur le terrain. En effet, chez T. cruzi, les
mélanges de clones naturels chez un hôte (ou triatome [79] ou patient
chagasique [19]) semblent très fréquents.
Il est possible que ces mélanges aient un rôle dans la pathogénicité de la
maladie de Chagas. Une hypothèse de travail future est que le mélange de
de.ux c10nets chez un hôte donné n'a pas le même effet que la simple
juxtaposition des effets séparés de ces c10nets : des phénomènes. .
d'inhibition, ou au contraire, de potentialisation pourraient se voir.
Des expérimentations futures devront donc explorer cette voie, en
Conclusions 80
étudiant les conséquences, en particulier chez l'animal de laboratoire, des
mélanges de c1onets.
Un des apports majeurs du présent travail aura été d'ouvrir la voie à ces
recherches complémentaires, en dégageant la méthodologie expérimentale
nécessaire.
" est utile d'annoncer ici que les résultats préliminaires obtenus dans le
cadre d'une « thèse-sœur» s'appuyant sur le modèle expérimental que
nous avons mis au point dans ce travail, sont tout à fait parallèles à ceux
que nous avons obtenus (Susana Revollo, communication personnelle) : en
effet, la sensibilité in vitro de deux drogues antichagasiques majeures est
fortement corrélée à la divergence phylogénique entre c1onets, mais on
observe une diversité notable entre stocks génétiquement apparentés.
La démarche que nous avons suivie (utilisation d'un cadre rigoureux de
génétique des populations pour l'étude de la biologie d'un protozoaire
parasite) est potentiellement applicable à tout microorganisme et vise, en
fait, à répondre à une question essentielle de très large portée, sans
réponse à ce jour: quel est l'impact de la variabilité génétique des
microorganismes sur leurs propriétés médicales importantes?
Notre espoir est que. la présente recherche apparaisse dans le futur
comme un trav~il pionnier dans l'étude de cette· question.
[ BIBLIOGRAPHIE J
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