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INFORME FINAL
FECHA: Septiembre de 2008
PROYECTO “Determinación de la eficacia de dos compuestos antimicrobianos como opción al uso continuo de Fumagilina en el control de parasitosis causada por Nosema sp. (Microsporidia) en colonias de Apis mellifera destinadas a la producción de material vivo. Primera caracterización molecular del patógeno en Argentina”.
FUNDAMENTO
La patología apícola conocida como Nosemosis es causada en la actualidad por
dos representantes del género Nosema sp. (Microsporidia, Nosematidae).
Esta parasitosis se caracteriza por acortar drásticamente la vida de las abejas
tanto de la especie Apis cerana como de Apis mellifera, generando graves
pérdidas en la producción de material vivo. (Cornejo y Rossi, 1974; Morse y
Nowogodzki, 1990; Malone y Gatehouse, 1998).
En particular, la crianza de reinas es una de las actividades apícolas que más se
encuentra expuesta a estas pérdidas (Liu, 1992), dependiendo de asistencia
farmacológica constante.
Hasta la fecha el único medicamento de reconocida eficacia en el control de la
Nosemosis causada tanto por Nosema apis como Nosema ceranae es la
Fumagilina (sal de biciclohexilamonio), masificándose su uso (Woyke, 1984;
Ratanabhumma y col., 1989; Webster, 1994, Sarlo y col., 2006a.)
Sin bien la eficacia de este antibiótico no es puesta en discusión, su uso
prolongado es de esperar que conduzca a la resistencia por parte del parásito, lo
cual, de suceder, pondría en serio peligro la viabilidad de la empresa.
Las opciones farmacológicas de reemplazo reconocidas a nivel mundial son
escasas y con resultados variables. Dos de las moléculas con antecedentes
microsporicidas son el Timerosal y el Timol.
El Timerosal (sal sódica de o-carboxifenil-tio-etilmercurio) resultó ser la primera
molécula utilizada en apicultura en el control de N. apis (Gontarski y Wagner,
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1954; Blatz, 1955, Schlüter, 1957). Su rápido reemplazo tras la aparición de la
Fumagilina se basó en la mortalidad que éste compuesto genera principalmente
en la abeja de mayor edad cuando se suministra a la concentración necesaria
para controlar el parásito (Kaeser, 1956; Furgala y Boch, 1970). Si bien esta
cualidad hace que resulte altamente riesgosa su administración, una dosificación
exacta en unidades de multiplicación (caracterizadas por su predominio de abeja
joven) puede resultar beneficiosa en cuanto al manejo de resistencia a
Fumagilina.
Por otro lado, el timol (3-metil-6-isopropilfenol), producto natural extraído de la
planta aromática Thymus vulgaris, es actualmente utilizado en apicultura de forma
tópica para el control de la Varroosis (Marinelli y col., 2001; Eguaras y col, 2002).
Esta molécula es tolerada por la abeja en altas concentraciones (Pohorecka y
Skubida, 2004) y suministrada en solución de jarabes de azúcar de caña a
concentraciones de 0,44 mM. también ha resultado efectiva en el control de la
Nosemosis causada por N. apis (Rice, 2001; Fulton, 2004; Yücel y Dogaroglu,
2005). Su eficacia bajo consumo continuo administrado en forma de pattie no ha
sido estudiada.
Hasta hace dos años se conocía a N. apis como el único agente causal de esta
parasitosis en A. mellifera. En 1996, Fries describe Nosema ceranae en la abeja
asiática Apis ceranae, y a partir del año 2005 es detectada en Apis mellifera en
Taiwan, España Alemania y E.E.U.U. (Fries y col, 2006; Huang y col, 2006) con
una prevalencia de hasta un 88% (Higes y col., 2006a.; Klee y col, 2007; Chen y
col., 2008) Estos países reportan diferencias en el comportamiento de la parasitosis como es
el caso de sintomatología seca (Faucon 2005), mayor patogenicidad (Higes y col.,
2007), desabejados masivos (Higes y col., 2006b), picos tanto primaverales como
invernales (Sarlo y col., 2006b) con rápidas perdidas invernales (Faucon, 2002), y
una mayor cantidad de Fumagilina requerida en el tratamiento (Higes y col.,
2006b, Williams y col., 2008a).
En nuestro país se desconoce tal situación por lo que resulta imperioso
caracterizar previamente el parásito sobre el cual van a ser ensayados los
fármacos alternativos, básicamente debido a las notorias diferencias de respuesta
que presenta N. ceranae en los aspectos previamente descriptos. Dicha
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caracterización también aportará valiosa información a nivel nacional y mundial
sobre la distribución de estos parásitos generada por investigadores del país.
Objetivo general del Proyecto. Aumentar la seguridad de producción de material vivo permitiendo mayor competitividad en el mercado local e internacional.
Objetivos particulares. • Caracterizar molecularmente el Microsporidio presente en los apiarios
destinados a la producción de material vivo de la empresa Malka S.R.L.
• Obtener el primer relevamiento de la/s especie/s presentes en la Provincia
de Buenos Aires, República Argentina, generada por investigadores del
país.
• Evaluar dos nuevos medicamentos destinados al control de la parasitosis
que permitan la rotación farmacológica, de modo de evitar generar
resistencia a la Fumagilina.
Resultados Esperados. • Caracterizar molecularmente la especie de Microsporidio presente en el
área de estudio y su distribución en la Prov. de Buenos Aires.
• Determinar la LD50 de las drogas investigadas en parásitos y abejas.
• Obtener las concentraciones óptimas para su administración en el
campo.
• Obtener la efectividad de las formulaciones obtenidas en colmenas
infectadas.
• Transferir los resultados de las investigaciones por medio de un informe
final a la empresa adoptante.
Resultados logrados. Objetivo: Caracterización molecular del Microsporidio presente en los
apiarios destinados a la producción de material vivo de la empresa
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Malka SRL. Primer relevamiento de la/s especie/s presentes en la Provincia de Buenos Aires, República Argentina.
Para la caracterización molecular de la especie de Nosema sp. presente en el
material vivo de la empresa Malka S.R.L. primeramente se analizaron
individualmente 5 colonias y luego se realizaron 10 muestras conformadas por
pooles de abejas provenientes de 80 núcleos (1/ 8).
Los protocolos de extracción del ADNr, purificación, amplificación y electroforesis
(Apéndice I) fueron adaptados de los propuestos por Fries (1996), Gatehouse y
Malone (1998); Higes y col. (2007) y Martín-Hernández y col. (2007).
La totalidad de las bandas obtenidas tras la amplificación y corrida electroforética
de las muestras realizadas en el Laboratorio de Biología Molecular perteneciente
a Fares Taie Instituto de Análisis, evidenciaron la presencia exclusiva de Nosema
ceranae (relevamiento La Plata).
Parte del material amplificado obtenido fue enviado al Laboratorio de
Secuenciación Pro-Papa EEA INTA Balcarce para la confirmación de los
resultados y detección de variaciones en la secuencia nucleotídica. Cabe destacar
la tarea de la Dra. Gabriela Massa y Tec. Silvina Divito por su compromiso y
dedicación en esta tarea.
Los resultados aportados por este estudio (Apéndice II) son concordantes en un
98% con las secuencias reportadas en Alemania, Austria, Canadá, Francia y
Argentina (Gene Bank NCBI).
Paralelamente, se analizaron un total de 76 muestras conformadas por pooles de
abejas de 5 colonias/ apiario procedentes de los siguientes 38 partidos: La Plata,
Bahía Blanca, San Cayetano, Tres Arroyos, Necochea, Gral. Alvarado, Tandil,
Lobería, Gral. Pueyrredón, Mar Chiquita, Maipú, Balcarce, Gral. Madariaga, Villa
Gesell, Olavarría, Ayacucho, Guaminí, Alem, Saavedra, Laprida, Adolfo Alsina,
Yrigoyen, Gonzalez Chavez, Tapalqué, Gral. Belgrano, Gral. Guido, Lincoln,
Tigre, Campana, Escobar, Zárate, Delta, Gral Villegas, Pellegrini, Villarino, 9 de
Julio, Pergamino y 25 de Mayo (Apéndice III).
Se ha constatado la presencia de coinfecciones con N. apis únicamente en los
partidos de Maipú y Balcarce. En base a este resultado, se intensificó el muestreo
de colmenares en el partido de Balcarce con el objeto de recabar mayor
información sobre el suceso.
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Del total de 6 colmenares relevados, cuatro resultaron positivos para N. ceranae y
dos presentaron coinfección.
Se intensificó también la búsqueda de coinfecciones en partidos que resultaron
negativos a N. apis tales como Tres Arroyos (12 colmenares) y Gral. Pueyrredón
(10 colmenares) volviendo a confirmar su ausencia.
Finalizada la determinación de las muestras remitidas, se procedió a la confección
de un informe de resultados (Apéndice IV) y envío del mismo a cada productor.
Objetivo: Evaluación dos nuevos medicamentos destinados al control de la parasitosis que permitan la rotación farmacológica, de modo de evitar generar resistencia a la Fumagilina.
Evaluación del Timerosal
Investigaciones bajo condiciones de laboratorio La LD50 realizada bajo el protocolo OECD Guidelines (Dimetoato como tóxico
Standard) arrojó un valor de 1.224 mg/l a las 72 hs. (Apéndice V).
Este resultado trasladado a la administración en campo presenta el inconveniente
de que la abeja debe ingerir únicamente 10ul de la solución en una toma. Por este
motivo, se evaluó el consumo reiterado con el objeto de determinar el volumen de
aplicación tolerable por las colonias.
La mortalidad de consumo ad libitum durante 24 hs registrada bajo condiciones de
laboratorio correspondiente a dosis crecientes del fármaco (100–500 mM)
evidenció que a las 72 hs post tratamiento una concentración de 260 mg/ l mata el
50% de las abejas (Apéndice VI), valores concordantes con lo reportado por
Furgala y Boch (1970).
Basados en los resultados de Kaeser (1956), y con el objeto de adecuar aún más
los datos obtenidos en laboratorio a una situación de campo que minimice las
pérdidas por mortalidad, se procedió a realizar un experimento destinado a
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evaluar el efecto del medicamento si resultara consumido por las abejas de 2 días
(jóvenes) y de más de 21 días de vida durante 48 hs ad libitum. La diferencia de
edades planteada, tiene como objeto confirmar la susceptibilidad de los individuos
de mayor edad expuesto por este autor.
La concentración máxima se corrigió a 200 mg/l y se experimentó una intermedia
de 150 mg/ l.
Para esto, se conformaron los siguientes grupos de 20 abejas por duplicado:
Grupo Edad abeja [ Timerosal (mg/ l) ]
A 48 hs. 150
B 48 hs. 200
C 48 hs. Control A-B
D + 21 días 150
E + 21 días 200
F + 21 días Control D-E
Los resultados obtenidos (Apéndice VII) indican que el Grupo E registró la
mortalidad más alta (72,5%) seguido por el Grupo B (62,5%). Estas diferencias
también se presentaron entre los Grupos A y D (20 y 47,5% respectivamente),
confirmando la susceptibilidad observada por Kaeser en abeja de mas de 21 días
de emergida. La mortalidad registrada en el Grupo F (5%), si bien resultó superior
al C (0%) es notoriamente inferior a los Grupos tratados.
La mortalidad registrada en el Grupo D nos indica que para una aplicación
invernal en la cual más del 90% de los individuos posee esta edad, la
administración de 150 mg/l no resulta conveniente.
Considerando los resultados anteriores, de igual forma se evaluó el efecto de las
dosis sobre el desarrollo de la parasitosis si el medicamento resultara consumido
por las abejas durante 48 hs.
Para tal fin se procedió a la infección individual de 120 abejas con un inóculo de
40.500 esporos de Nosema ceranae / 10 ul/ abeja conformando los siguientes
grupos de tratamiento por duplicado:
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Grupo Timerosal mg./l
A 150
B 200
C 0
La administración del Timerosal ad libitum se realizó en solución de jarabe de
azúcar como única fuente de alimento durante 48 hs.
El registro del número de esporos por abeja se realizó a los 6 días de iniciado el
tratamiento, forzado por la mortalidad del 27,5 y 67,5 % registrada en los grupos A
y B respectivamente.
Los individuos sobrevivientes fueron sacrificados con el objeto de contabilizar de
forma individual el número de esporos/ abeja
Se obtuvo una diferencia significativa (P= 0,0002) en el número de esporos
contabilizados entre los tres Grupos (Apéndice VIII). Los resultados obtenidos
evidencian que la dosis de 200 mg/l registró un efecto restrictivo en la
multiplicación del parásito (3.715.385 esporos/ abeja, n= 13), pero nuevamente la
mortalidad registrada invalida su uso. De igual manera, se observa una mortalidad
elevada en el Grupo B (27,5%) con un efecto restrictivo menor.
Investigaciones bajo condiciones de campo En base a los resultados de la etapa de laboratorio, se evaluó la mortalidad en
campo primeramente por medio de un experimento piloto donde se administró a 5
colonias por tratamiento 0, 100, y 150 mg/l de Timerosal en un volumen de 100 ml
de jarabe/ colonia. A cada colmena se le adicionó una trampa destinada a la
recolección de abeja muerta. El conteo del número de abejas recolectadas con
este sistema resultó notoriamente superior en las colonias tratadas con 150 mg/l
con respecto a 0 y 100 mg/l (Apéndice IX).
Considerando estos resultados, se desprende que el número de ingestas y/ o el
volumen de las mismas incide en la cantidad de Timerosal tolerado por la abeja.
Priorizando la supervivencia de las mismas, se concluyó que la administración en
campo de cuatro dosis de 100 ml (100 mg/ l) cada 7 días (40 mg totales de
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Timerosal por colonia) sería la mas adecuada para determinar el efecto que
ejerce sobre la parasitosis.
Evaluación del Timol Investigaciones bajo condiciones de laboratorio
Con el objeto de determinar la toxicidad del Timol administrado en patties de
azúcar y glucosa, el diseño experimental se basó en el protocolo OECD
Guidelines (OECD, 1998) para la determinación de LD50.
Primeramente se experimentaron las concentraciones extremas de Timol (0,5-
3.000 mM.) dentro de las cuales se encontrara la mortalidad del 50% de los
individuos si estos consumían el tratamiento durante 24, 48 y 72 hs ad libitum.
Dosis (mM.) N° de réplicas
Nº Abejas por Replica
100 5 10 500 5 10 1000 5 10 1500 5 10 2000 5 10 3000 5 10
Control azúcar + glucosa 5 10 Control azúcar + glucosa + alcohol 5 10 Dimetoato 5 10
El timol fue primero diluido en etanol absoluto y luego se calculó la molalidad
correspondiente a cada concentración. El Dimetoato fue utilizado como tóxico
estándar. Se realizaron cinco réplicas para todas las concentraciones y controles
(Donovan y Elliot, 2001).
A todos los tratamientos se les suplió las necesidades hídricas.
El número de abejas muertas por réplica fue evaluado a las 24, 48 y 72 hs post-
tratamiento.
Se utilizó el test de Probit para la estimación de la concentración a la cual el
consumo durante 72 hs arrojara el 50% de la mortalidad de los individuos. La
mortalidad debida a cada tratamiento fue ajustada a la registrada en los controles
usando la corrección de Abbott (1925).
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Establecida el rango entre 100 y 1.000 mM. (Apéndice X), se procedió a realizar
un nuevo experimento con el objeto de evaluar como se comporta la mortalidad a
dosis crecientes dentro del rango establecido.
Para esto se conformaron los siguientes tratamientos
Los resultados obtenidos (Apéndice XI) muestran que a las 72 hs el 50% de las
abejas perece si consume el preparado de 400 mM. (con límites fiduciarios entre
332 y 458 mM., respectivamente (p<0.0001). Las concentraciones de Timol
administrado bajo este diseño, resulta peligrosamente tóxico en concentraciones
muy por encima de lo evaluado por Rice (2001) y Albo (2002) como posibles
supresores de enfermedades sistémicas de abejas, indicando que la limitante de
uso no sería la toxicidad sino la repulsión que genera en la abeja el fuerte aroma
que desprende la molécula al sublimar.
Evaluación microsporicida de los compuestos estudiados en el campo.
Obtenidas finalmente las formas de administración más seguras, se procedió a
analizar como última etapa de este proyecto el efecto microsporicida de las
sustancias en el campo.
Para realizar este experimento, en principio se relevó la abundancia de esporos
según Fries y col. (1984) de 86 núcleos de fin de temporada de entre 2 y 3
cuadros de abeja aportados por Cabaña Apícola Malka S.R.L. para tal fin.
Obtenidos los valores de abundancia de cada unidad se procedió a distribuirlas en
rangos de un millón de esporos/ abeja para luego redistribuirlas al azar,
conformando así grupos uniformes.
Dosis (mM.) N° de réplicas Nº Abejas por Replica
100 5 10 200 5 10 300 5 10 400 5 10 500 5 10 600 5 10 700 5 10 800 5 10 900 5 10 950 5 10
Control azúcar + glucosa 5 10 Control azúcar + glucosa + alcohol 5 10
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Las unidades que presentaban valores de abundancia por debajo de los
quinientos mil esporos/ abeja o presentaban poblaciones de dudosa supervivencia
fueron excluidas de los grupos.
Los grupos de tratamiento finalmente resultaron:
Grupo N° de
colonias Compuesto Concentración
Administración/
colonia
N° de
aplicaciones
A 15 Timol 66 mg/l en solución de en
jarabe de azúcar de caña. 500 ml 4
B 15 Timol 10gr/kg en pattie de azúcar
de caña y glucosa. 100 gr. constante
C 15 Timerosal 100 mg/l en solución de
jarabe de azúcar de caña. 100 ml 4
D 15 Fumagilina
(Fumidil B®)
En jarabe de azúcar de
caña según marbete. 500 ml 4
La administración de las drogas salvo para el Grupo B fueron realizadas cada 7
días. El Grupo D ofició de control.
Antes de la administración (Tiempo 0) y a los 15, 30 y 52 días (Tiempos 1, 2 y 3),
se procedió a registrar el estado poblacional de las colonias y a tomar una
muestra de abejas del interior de las unidades con el objeto de registrar la
evolución de la abundancia en el tiempo (Apéndice XII).
El análisis estadístico de los resultados aplicando los Test de Krustal Wallis en
rangos y Dunn (Apéndice XIII) indican que los valores de abundancia de los
Grupos A, B y C resultaron significativamente superiores al control (Grupo D) en
los valores medios de abundancia para los Tiempos 1, 2 y 3. El Tiempo 0 no
presento diferencia significativa entre los grupos.
El Grupo A resultó significativamente superior en abundancia a los Grupos B y C,
indicando que la administración del Timol en jarabe presentó el mayor desarrollo
de la parasitosis (Apéndice XIV).
El Grupo C presento la mayor mortalidad en todos los tiempos alcanzando un
máximo del 66,6% en el Tiempo 3, el Grupo D no presentó mortalidad para la
totalidad de los tiempos (Apéndice XV).
Los promedios de cuadros con abejas registrados evidenciaron un incremento del
26,21 y 18,27 % en los Grupos A y D respectivamente, mientras que en el Grupo
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B se redujo en un 11,97% (Apéndice XVI). El Grupo C no fue incluido en base a la
alta mortalidad registrada.
CONCLUSIONES El análisis de las 85 colonias pertenecientes a Malka S.R.L. realizadas en este
proyecto sostiene que el agente causal de Nosemosis en el material vivo de la
empresa es exclusivamente N. ceranae. Dicha determinación también nos informa
la necesidad de realizar ajustes en la rutina de control de esta parasitosis.
Este resultado no difiere en absoluto con la casi totalidad de las colonias
estudiadas dentro de los 38 partidos de la provincia de Buenos Aires.
La coinfección con N. apis detectada únicamente en los partidos de Maipú y
Balcarce, resulta coincidente con otros reportes mundiales de desplazamiento de
N. apis (Klee, 2007).
La secuenciación de los productos obtenidos arrojan información con respecto a
variaciones en la secuencia nucleotídica como lo reportado por Williams (2008b)
en Canadá. El haplotipo de N. ceranae detectado en el material vivo de la
empresa coincide con el detectado en General Madariaga pero no con los
obtenidos de Mar del Plata y Ayacucho. La implicancia de estas variaciones en
una región del ADN muy conservada puede ser asociada de forma tal que se
conviertan en marcadores de un comportamiento característico de la parasitosis.
Estos análisis nos informan también que N. ceranae ha ingresado en nuestro país
por varias fuentes, contrariamente a lo que parece haber sucedido en EE UU
según Williams (2008).
Como nuevo aporte científico-técnico, podemos contar en Argentina con la técnica
de identificación molecular requerida a nivel mundial para estas dos especies.
Se ha creado el primer banco de esporos de la Provincia de Bs. As. caracterizado
por técnicas moleculares en Argentina.
Timerosal
El suministro de Timerosal en solución de jarabe de caña a las unidades
experimentales no presentó diferencias significativas en el desarrollo de la
abundancia de esporos con las tratadas con Timol, y sí resultó significativamente
superior al Grupo D (control con Fumagilina). La mortalidad registrada se presentó
significativamente superior a todos los tratamientos. Cabe destacar que la dosis
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calculada en laboratorio se obtuvo a partir de abeja joven con mayor tolerancia
(situación primaveral) y las unidades de campo no se ajustaban a esta condición
debido a la época del año (situación otoñal) donde la totalidad de los individuos
poseen mayor edad y por tanto resultan mas susceptibles.
De esto se desprende que la dosis administrada no controla la enfermedad y
resulta altamente tóxica para la abeja otoñal a la concentración experimentada, en
coincidencia con lo expuesto por variados autores (Kaeser, 1956; Binze, 1958;
Furgala y Bosch, 1970). Los resultados obtenidos invalidan el uso de esta
molécula en el control de Nosema ceranae.
Timol
El suministro de Timol en sus dos concentraciones y sustratos resultaron
significativamente superiores en los valores de abundancia de esporos obtenidos
al final del tratamiento con respecto al Control. La administración en jarabe (0,44
mM) propuestas como efectivas por Rice (2001), Fulton (2004) y Yücel y
Dogaroglu (2005), no controlaron la parasitosis de las unidades experimentales
cuando se lo evaluó como medicamento de efecto inmediato. Estos autores
reportan efectividad tras el uso prolongado de la molécula, actuando
principalmente de forma preventiva. Por otro lado, la similitud en el crecimiento
promedio de cuadros con abejas con las unidades que recibieron Fumagilina
(molécula control) y los valores de abundancia registrados hacen sospechar una
prolongación en el tiempo de vida de la abeja, indicando que su consumo tendría
efectos beneficiosos para el individuo tal como resulta en las unidades que
recibieron Fumagilina, medicación cuya efectividad sobre N. ceranae quedó
nuevamente demostrada.
La administración sólida del Timol resultó consumida en su totalidad a una
velocidad más lenta de lo esperado. Esto sucedió principalmente debido a la
población existente en las unidades experimentales y la falta de cría. El consumo
total por parte de las colonias y la baja mortalidad registrada, evidencian que el
vehículo facilita la posibilidad de incrementar la dosis en busca de un control a
corto plazo. Los resultados obtenidos promueven la factibilidad de esta molécula y
ponen en claro la necesidad de futuras investigaciones que permitan su uso en el
control de Nosema ceranae.
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16
Apéndice I.
Protocolo aplicado en la caracterización molecular de Nosema spp. presente en
Apis melífera.
• Macerar abdómenes de abejas adultas y purificarlos por centrifugación.
• Incubar el sobrenadante obtenido en buffer de germinación.
• Extraer el ADN con columnas High Pure PCR Extraction Kit®.
• Realizar la reacción de PCR Multiplex* usando primers específicos tanto para N.
apis como para N. ceranae.
• Usar el ADN obtenido en la extracción como templado.
• Incluir controles negativos
• Correr el producto de la PCR en geles de Agarosa al 2% usando marcadores de
peso molecular.
• Realizar las secuenciaciones** de los productos obtenidos para verificar
resultados y búsqueda de haplotipos.
* PCR Multiplex es una nueva técnica donde se usan dos primers en la misma reacción. Según sea la especie que
esté presente en la muestra, el ADN se va a pegar específicamente al par de primers que le corresponda y va a dar
una banda característica en el gel de agarosa. En caso de encontrarnos con las dos especies en la misma muestra se
verán dos bandas de diferente peso molecular en el gel.
**Secuenciación es el método por el cual es posible determinar la secuencia de bases nucleotídicas presentes en la
muestra de ADN analizada. En este estudio, la secuencia analizada corresponde al fragmento amplificado que resulta
característico a nivel de especie.
17
Apéndice II.
Alineamiento de secuencias obtenidas con las secuencias de Nosema ceranae del Gene Bank (NCBI).
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 605 615 625 635 645 655 N.cer Alemania CGACGATGTG A-TATG-AAA ATATTAATTT GTATTACAT- AATAGAAATT TGAGTTTTTT N.cer Francia CGACGATGTG A-TATG-AAA ATATTAATTT GTATTACAT- AATAGAAATT TGAGTTTTTT N.cer Austria CGACGATGTG AATATG-AAA ATATTAATTT GTATTACAT- AATAGAAATT TGAGTTTTTT N.cer Argentina CGACGATGTG A-TATGGAAA ATATTAATTT GTATTACAT- AATAGAAATT TGAGTTTTTT N.cer Canada CGACGATGTG A-TATG-AGA ATATTAATTT GTATTACAT- AATAGAAATT TGAGTTTTTT La Plata ---------- ---------- -------CTT GTATACTA-- -ATAGAAATT -GAGTTTTTT Madariaga ---------- ---------- -------CTT GTATACTA-- -ATAGAAATT -GAGTTTTTT Ayacucho ---------- ---------- -------CCC TTGATACAT- AATAGAAATT -GAGTTTTTT Mar del Plata ---------- ---------- -------CTT GTATAACATG AATAGAAATT TGAGTTTTTT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 665 675 685 695 705 715 N.cer Alemania GGCTCTGGGG ATAGTATGAT CGCAAGATTG AAAATTAAAG AAATTGACGG AAGAATACCA N.cer Francia GGCTCTGGGG ATAGTATGAT CGCAAGATTG AAAATTAAAG AAATTGACGG AAGAATACCA N.cer Austria GGCTCTGGGG ATAGTATGAT CGCAAGATTG AAAATTAAAG AAATTGACGG AAGAATACCA N.cer Argentina GGCTCTGGGG ATAGTATGAT CGCAAGATTG AAAATTAAAG AAATTGACGG AAGAATACCA N.cer Canada GGCTCTGGGG ATAGTATGAT CGCAAGATTG AAAATTAAAG AAATTGACGG AAGAATACCA La Plata GGCTCTGGGG ATAGTATGAT CGCAAGATTG AAAATTAAAG AAATTGACGG AAGAATACCA Madariaga GGCTCTGGGG ATAGTATGAT CGCAAGATTG AAAATTAAAG AAATTGACGG AAGAATACCA Ayacucho GGCTCTGGGG ATAGTATGAT CGCAAGATTG AAAATTAAAG AAATTGACGG AAGAATACCA Mar del Plata GGCTCTGGGG ATAGTATGAT CGCAAGATTG AAAATTAAAG AAATTGACGG AAGAATACCA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 725 735 745 755 765 775 N.cer Alemania CAAGGAGTGG ATTGTGCGGC TTAATTTGAC TCAACGCGAG GTAACTTACC AATATTTTAT N.cer Francia CAAGGAGTGG ATTGTGCGGC TTAATTTGAC TCAACGCGAG GTAACTTACC AATATTTTAT N.cer Austria CAAGGAGTGG ATTGTGCGGC TTAATTTGAC TCAACGCGAG GTAACTTACC AATATTTTAT N.cer Argentina CAAGGAGTGG ATTGTGCGGC TTAATTTGAC TCAACGCGAG GTAACTTACC AATATTTTAT N.cer Canada CAAGGAGTGG ATTGTGCGGC TTAATTTGAC TCAACGCGAG GTAACTTACC AATATTTTAT La Plata CA-GGAGTGG ATTGTGCGGC TTAATTTGAC TCAACGCGAG GTAACTTACC AATATTTTAT Madariaga CA-GGAGTGG ATTGTGCGGC TTAATTTGAC TCAACGCGAG GTAACTTACC AATATTTTAT Ayacucho CA-GGAGTGG ATTGTGCGGC TTAATTTGAC TCAACGCGAG GTAACTTACC AATATTTTAT Mar del Plata CA-GGAGTGG ATTGTGCGGC TTAATTTGAC TCAACGCGAG GTAACTTACC CATATTTTAT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 785 795 805 815 825 835 N.cer Alemania TATTTTGAGA GAACGGTTTT TTGTTTGAGA ATGATAATAG TGGTGCATGG CCGTTTTCAA N.cer Francia TATTTTGAGA GAACGGTTTT TTGTTTGAGA ATGATAATAG TGGTGCATGG CCGTTTTCAA N.cer Austria TATTTTGAGA GAACGGTTTT TTGTTTGAGA ATGATAATAG TGGTGCATGG CCGTTTTCAA N.cer Argentina TATTTTGAGA GAACGGTTTT TTGTTTGAGA ATGATAATAG TGGTGCATGG CCGTTTTCAA N.cer Canada TATTTTGAGA GAACGGTTTT TTGTTTGAGA ATGATAATAG TGGTGCATGG CCGTTTTCAA La Plata TATTTTGAGA GAACGGTTTT TTGTTTGAGA ATGACCGGG- ---------- ---------- Madariaga TATTTTGAGA GAACGGTTTT TTGTTTGAGA ATGACCGGG- ---------- ---------- Ayacucho TATTTTGAGA GAACGGTTT- ---------- ---------- ---------- ---------- Mar del Plata TATTTTGAGA GAACGGTTTT TTGTTTGAGA ATGACCGGGA ---------- ---------- Las letras y espacios resaltados corresponden a variaciones en la secuencia nucleotídica.
18
Apéndice III.
Distribución de Nosema ceranae y Nosema apis detectada en la Provincia de Buenos Aires.
19
Apéndice IV.
Informe de identificación molecular de especie remitido a los productores. LABORATORIO DE ARTROPODOS-FCEyN-UNMdP
INFORME DE ESPECIE DE NOSEMA PRESENTE EN LA MUESTRA DE ABEJA REMITIDA. Fecha: 26 / 07 / 08 N° DE REGISTRO: 001. Partido analizado: La Plata
Remitidas por Sr: Braunstein, Martín
Rotulada como: La Plata 0-15 /0408 Muestra de: Abejas adultas en alcohol etílico. METODO: CARACTERIZACION MOLECULAR. Según Martín-Hernández y col., 2007, modificado por Laboratorio de Artrópodos UNMdP, 2008. RESULTADOS OBTENIDOS
DETERMINACIONES RESULTADOS
PCR Multiplex
Presencia de banda de 218 kb
coincidente con la descrita para N. ceranae
Secuenciación
La secuencia obtenida coincide en un
98% con las correspondientes a N. ceranae (Gene Bank NCBI)
CONCLUSION
El microsporidio presente en la muestra remitida fue caracterizado molecularmente como perteneciente a la especie Nosema ceranae. No se detectó Nosema apis.
OBSERVACIONES: • Las presentes muestras han sido extraídas por personal del Laboratorio. Lic. Edgardo Gabriel Sarlo LABORATORIO DE ARTROPODOS FCEyN-UNMdP
20
Apéndice V.
LD 50 para 10 ul vía oral de Timerosal a las 72 hs (programa Statsdirect©2008). Probit analysis - probit sigmoid curve constant = -12,473471 slope = 4,03932 Median * Dose = 1224,651256 Confidence interval (No Heterogeneity) = 1058,809631 to 1401,922618 * Dose for centile 90 = 2542,620606 Confidence interval (No Heterogeneity) = 2129,460733 to 3297,703568 Chi² (heterogeneity of deviations from model) = 30,131009 (22 df) P = 0,1153 t for slope = 8,010951 (22 df) P < 0,0001
Proportional Response with 95% CI
0 1000 2000 3000 4000 50000,00
0,25
0,50
0,75
1,00testeada
Log dosis
21
Apéndice VI.
Mortalidad por consumo ad libitum durante 24 hs bajo condiciones de laboratorio.
0102030405060708090
100
100 200 300 400 500
Concentración (mM)
% a
beja
s m
uert
as
Porcentaje de Mortalidad 24 hsPorcentaje de Mortalidad 48 hsPorcentaje de Mortalidad 72 hs
Concentración (mM.) Nº Replicas Nº Abejas
por Replica
Porcentaje de
Mortalidad 24 hs
Porcentaje de
Mortalidad 48 hs
Porcentaje de
Mortalidad 72 hs
100 3 10 0 3,3 3,3
200 3 10 0 6,7 23
300 3 10 20 37 53,3
400 3 10 23,3 53,3 83,3
500 3 10 56,7 86,7 96,7
Probit analysis - probit sigmoid curve constant = -12,860928 slope = 5,323848 Median * Dose = 260,447526 Confidence interval (No Heterogeneity) = 228,842614 to 290,851221 * Dose for centile 90 = 453,355889 Confidence interval (No Heterogeneity) = 394,290598 to 562,436323 Chi² (heterogeneity of deviations from model) = 14,125872 (13 df) P = 0,365 t for slope = 6,97729 (13 df) P < 0,0001
22
Apéndice VII.
Mortalidad por consumo ad libitum durante 48 hs en abejas de 2 y más de 21 días de vida.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
A B C D E F
Grupos
% a
beja
s m
uert
as
%1 día p.t.%3 día p.t.
Mortalidad
Grupo Edad abeja Concentración mg/ l 1 día p.t. % 3 dias p.t. %
A 48 hs. 150 2 5 8 20
B 48 hs. 200 9 22,5 25 62,5
C 48 hs. Control 1 2,5 0 0
D 21 días 150 2 5 19 47,5
E 21 días 200 5 12,5 29 72,5
F 21 días Control 1 2,5 2 5
23
Apéndice VIII.
Eficacia del Timerosal ad libitum en solución de jarabe de azúcar como única fuente de alimento durante 48 hs. a los 6 días post infección.
Mortalidad
Grupo Concentración mg/ l
1 día post tratamiento % 3 días post
tratamiento % 6 días post tratamiento %
A 150 2 5 9 22,5 11 27,5 B 200 9 22,5 23 57,5 27 67,5 C Control 2 5 2 5 2 5
Recuento de esporos
One way analysis of variance (Statsdirect©2008) Variables: 150 mg/l, control, 200 mg/l Source of Variation Sum Squares DF Mean Square Between Groups 127775897435897 2 63887948717948,7 Within Groups 204915000000000 36 5692083333333,33 Corrected Total 332690897435897 38 F (variance ratio) = 11,224001 P = 0,0002 Tukey multiple comparisons Critical value (Studentized range) = 3,456758, |q*| = 2,444367 Pooled standard deviation = 2385808,737794 Comparison Mean difference L (95% CI) |L/SE(L)| Control vs. 200 mg/l 4238461,538462 (1951109,876769 to 6525813,200154) 6,405371 P = 0,0002 150 mg/l vs. 200 mg/l 3246153,846154 (958802,184461 to 5533505,507847) 4,905747 P = 0,0038 150 mg/l vs. Control -992307,692308 (-3279659,354001 to 1295043,969385) 1,499624 P = 0,5444 stop
24
Apéndice IX.
Número de abejas muertas recolectadas por trampa.
5,4
150
6,411,8
200,8
6,60
50
100
150
200
250
100 150 0 (Control)
Mg/ l
Prom
edio
del
N° a
beja
s re
cole
ctad
as
(5 C
olon
ias)
7 dìas14 dìas
Número de abejas muertas en trampas Timerosal 100 mg/l Timerosal 150 mg/l Control
Colmena Nº
7 días 14 días 7 días 14 días 7 días 14 días 1 3 13 126 149 6 6 2 5 8 215 226 9 7 3 8 11 98 231 8 4 4 6 6 136 209 6 9 5 5 21 175 189 3 7
25
Apéndice X.
Mortalidad causada por el consumo ad libitum de pattie con Timol en concentraciones crecientes.
Dosis (mM)
Nº de Replicas
Nº Abejas por Replica
Mortalidad 24 hs
% Mortalidad
24 hs Mortalidad
48 hs %
Mortalidad 48hs
Mortalidad 72 hs
% Mortalidad
72hs
100 5 10 2 4 2 4 2 4 500 5 10 9 18 15 30 24 48 1000 5 10 2 4 14 28 40 80 1500 5 10 4 8 32 64 48 96 2000 5 10 5 10 45 90 50 100 3000 5 10 8 16 47 94 50 100
Control 5 10 0 0 0 0 1 2
Probit analysis - probit sigmoid curve constant = -10,72768 slope = 3,915265 Median * Dose = 549,493888 Confidence interval (No Heterogeneity) = 434,737974 to 645,769903 * Dose for centile 90 = 1167,574678 Confidence interval (No Heterogeneity) = 1002,573886 to 1439,714242 Chi² (heterogeneity of deviations from model) = 2,069336 (4 df) P = 0,723 t for slope = 6,956676 (4 df) P = 0,0022
Proportional Response with 95% CI
0 1000 2000 30000,00
0,25
0,50
0,75
1,00Nº Abejas por Replica
Log Dosis (mM)
26
Apéndice XI.
Mortalidad causada por el consumo ad libitum de pattie con Timol en
concentraciones crecientes.
Concentración (mM) Nº Abejas
por tratamiento
Nº abejas muertas 24 hs
Nº abejas muertas 48 hs
Nº abejas muertas 72 hs
100 50 2 2 2 200 50 1 3 5 300 50 1 9 18 400 50 7 19 30 500 50 9 21 35 600 50 10 23 33 700 50 11 28 36 800 50 11 28 39 900 50 10 34 41 950 50 18 44 48
Control azúcar + glucosa 50 1 1 1 Control zúcar+glucosa+alcohol 50 0 1 1
Valores de LD50 obtenidos para cada observación con sus respectivos límites fiduciarios (95% confianza
24 horas 48 horas 72 horas
Probabilidad Concentración (mM)
Límite inferior
95 %
Límite superior
95 % Concentración
(mM) Límite inferior
95 %
Límite superior
95 % Concentración
(mM) Límite inferior
95 %
Límite superior
95 %
0,5 1632 1199 3892 594 523 661 401 332 458
Resultados estadísticos resultantes de los ajustes de los datos realizados por el programa XLSTAT-DOSE para el análisis de los resultados obtenidos
TEST Observaciones Log veros.
Log veros. (indep)
Chi-cuadrado
de Pearson
GDL (Chi-cuadrado)
Pr. > Chi-cuadrado
L.R. Chi-cuadrado
GDL (L.R. Chi-
cuadrado)
Pr. > L.R. Chi-
cuadrado R²
24 horas 500
-201,472 -219,835 7,440 7 0,385 36,726 2 < 0,0001 0,947
48 horas 500
-268,798 -340,465 10,298 7 0,172 143,333 2 < 0,0001 0,983
72 horas 500
-247,851 -341,077 11,648 7 0,113 186,453 2 < 0,0001 0,990
27
Apéndice XII.
Resultado de relevamiento y distribución de los Grupos de tratamientos. (Tiempos 0, 1, 2 y 3).
T 0 T1 T2 T3
Col Timol líquido
Timol sólido Timerosal Fumagilina Timol
líquido Timol sólido Timerosal Fumagilina Timol
líquido Timol sólido Timerosal Fumagilina Timol
líquido Timol solido Timerosal Fumagilina
1 4.400.000 130.000 145.000 375.000
2 2.950.000 6.600.000 32.000.000 †
3 6.225.000 3.800.000 26.000.000 †
4 14.425.000 1.580.000 19.400.000 23.125.000
5 6.700.000 7.575.000 26.725.000 28.250.000
6 8.600.000 8.950.000 29.425.000 †
8 6.750.000 † † †
9 2.250.000 3.240.000 11.200.000 9.100.000
11 8.650.000 670.000 5.000 25.000
12 2.050.000 4.275.000 † †
15 1.050.000 3.250.000 17.600.000 10.725.000
16 9.200.000 3.300.000 3.125.000 50.000
17 3.225.000 3.850.000 25.025.000 17.550.000
18 6.000.000 3255000 1.720.000 725.000
19 9.525.000 2.000.000 † †
21 5.225.000 1.200.000 0 100.000
22 575.000 760.000 6.100.000 14.925.000
23 4.725.000 1.265.000 4.125.000 9.725.000
24 8.200.000 3.100.000 † †
25 1.775.000 1.380.000 20.925.000 13.150.000
26 3.295.000 3.050.000 8.825.000 1.500.000
27 575.000 240.000 4.425.000 2.950.000
30 3.475.000 290.000 0 0
31 1.225.000 890.000 2.095.000 5.550.000
33 1.125.000 1.680.000 1.210.000 1.200.000
35 3.325.000 775.000 21.575.000 4.600.000
36 4.650.000 2.625.000 4.275.000 3.975.000
37 2.400.000 75.000 0 85.000
38 9.400.000 4.050.000 3.600.000 12.675.000
39 4.400.000 1.070.000 † †
40 1.600.000 1.730.000 3.975.000 10.625.000
41 9.875.000 2.450.000 7.650.000 15.100.000
42 2.625.000 885.000 2.000.000 2.550.000
44 1.350.000 960.000 6.225.000 4.100.000
46 6.050.000 1.620.000 7.250.000 20.375.000
47 6.900.000 3.775.000 3.550.000 †
49 3.175.000 400.000 2.690.000 3.125.000
50 2.925.000 300.000 2.750.000 700.000
51 15.050.000 3.350.000 850.000 7.350.000
52 1.600.000 445.000 † †
53 6.850.000 220.000 0 25.000
54 3.200.000 0 † †
55 9.450.000 1.040.000 12.675.000 16.900.000
57 3.550.000 95.000 0 150.000
58 3.850.000 845.000 16.575.000 28.025.000
59 1.450.000 † † †
60 8.675.000 1.970.000 25.050.000 26.075.000
61 5.475.000 3.970.000 6.600.000 18.050.000
65 2.750.000 30.000 10.000 25.000
66 1.675.000 25.000 780.000 75.000
67 1.450.000 15.000 0 475.000
68 4.500.000 90.000 210.000 1.450.000
70 1.250.000 260.000
73 2.475.000 5.825.000 34.200.000 12.875.000
78 2.775.000 3465000 10.000.000 14.625.000
80 1.325.000 840.000 † †
81 750.000 705.000 185.000 20.175.000
82 3.375.000 960.000 350.000 825.000
85 625.000 30.000 15.000 425.000
86 3.425.000 10.000 0 800.000
Prom 4.465.000 4.655.000 4.678.000 3.961.667 3.430.000 2.083.000 1.700.000 429.333 15.561.000 9.356.667 5.843.333 286.000 12.707.692 10.691.071 9.265.000 290.000
† Colonia muerta.
28
Apéndice XIII.
Resultados de los Análisis estadísticos de la evolución de la abundancia de los distintos tratamientos en el tiempo.
Kruskal-Wallis One Way Analysis of Variance on Ranks Data source: Data 1 in Notebook 1 Normality Test: Failed (P < 0,050) Group N Missing Median 25% 75% Col 1 16 1 3325000,000 1950000,000 6525000,000 Col 2 16 1 3225000,000 1762500,000 6181250,000 Col 3 16 1 3295000,000 1712500,000 6862500,000 Col 4 16 1 3475000,000 1856250,000 5043750,000 Col 5 16 1 3250000,000 1096250,000 5361250,000 Col 6 16 1 1730000,000 903750,000 3322500,000 Col 7 14 1 1070000,000 640000,000 3062500,000 Col 8 16 1 95000,000 30000,000 282500,000 Col 9 16 1 12675000,000 6225000,000 25437500,000 Col 10 16 1 4425000,000 2917500,000 15231250,000 Col 11 7 1 3150000,000 350000,000 8825000,000 Col 12 16 1 0,000 0,000 112500,000 Col 13 14 1 13150000,000 8681250,000 15550000,000 Col 14 15 1 8225000,000 3125000,000 17550000,000 Col 15 6 1 1500000,000 793750,000 20912500,000 Col 16 15 1 92500,000 25000,000 425000,000 H = 125,877 with 15 degrees of freedom. (P = <0,001) The differences in the median values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P = <0,001) To isolate the group or groups that differ from the others use a multiple comparison procedure. All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Dunn's Method) : Comparison Diff of Ranks Q P<0,05 Col 9 vs Col 12 154,633 6,807 Yes Col 9 vs Col 16 143,431 6,204 Yes Col 9 vs Col 8 139,700 6,150 Yes Col 9 vs Col 7 99,082 4,203 Yes Col 9 vs Col 6 85,033 3,743 Yes Col 9 vs Col 5 66,500 2,927 No Col 9 vs Col 11 62,633 2,084 Do Not Test Col 9 vs Col 15 56,867 1,770 Do Not Test Col 9 vs Col 4 54,367 2,393 Do Not Test Col 9 vs Col 2 53,033 2,335 Do Not Test Col 9 vs Col 1 51,933 2,286 Do Not Test Col 9 vs Col 3 51,667 2,274 Do Not Test Col 9 vs Col 10 28,600 1,259 Do Not Test Col 9 vs Col 14 18,645 0,807 Do Not Test Col 9 vs Col 13 0,467 0,0198 Do Not Test Col 13 vs Col 12 154,167 6,540 Yes Col 13 vs Col 16 142,964 5,967 Yes Col 13 vs Col 8 139,233 5,906 Yes Col 13 vs Col 7 98,615 4,042 Yes Col 13 vs Col 6 84,567 3,587 Yes Col 13 vs Col 5 66,033 2,801 Do Not Test Col 13 vs Col 11 62,167 2,025 Do Not Test Col 13 vs Col 15 56,400 1,723 Do Not Test Col 13 vs Col 4 53,900 2,287 Do Not Test Col 13 vs Col 2 52,567 2,230 Do Not Test Col 13 vs Col 1 51,467 2,183 Do Not Test Col 13 vs Col 3 51,200 2,172 Do Not Test Col 13 vs Col 10 28,133 1,193 Do Not Test Col 13 vs Col 14 18,179 0,759 Do Not Test Col 14 vs Col 12 135,988 5,882 Yes Col 14 vs Col 16 124,786 5,307 Yes Col 14 vs Col 8 121,055 5,236 Yes Col 14 vs Col 7 80,437 3,357 No Col 14 vs Col 6 66,388 2,872 Do Not Test Col 14 vs Col 5 47,855 2,070 Do Not Test Col 14 vs Col 11 43,988 1,449 Do Not Test Col 14 vs Col 15 38,221 1,179 Do Not Test Col 14 vs Col 4 35,721 1,545 Do Not Test Col 14 vs Col 2 34,388 1,488 Do Not Test Col 14 vs Col 1 33,288 1,440 Do Not Test Col 14 vs Col 3 33,021 1,428 Do Not Test Col 14 vs Col 10 9,955 0,431 Do Not Test Col 10 vs Col 12 126,033 5,548 Yes Col 10 vs Col 16 114,831 4,967 Yes Col 10 vs Col 8 111,100 4,891 Yes Col 10 vs Col 7 70,482 2,990 Do Not Test
29
Col 10 vs Col 6 56,433 2,484 Do Not Test Col 10 vs Col 5 37,900 1,668 Do Not Test Col 10 vs Col 11 34,033 1,133 Do Not Test Col 10 vs Col 15 28,267 0,880 Do Not Test Col 10 vs Col 4 25,767 1,134 Do Not Test Col 10 vs Col 2 24,433 1,076 Do Not Test Col 10 vs Col 1 23,333 1,027 Do Not Test Col 10 vs Col 3 23,067 1,015 Do Not Test Col 3 vs Col 12 102,967 4,533 Yes Col 3 vs Col 16 91,764 3,969 Yes Col 3 vs Col 8 88,033 3,875 Yes Col 3 vs Col 7 47,415 2,011 Do Not Test Col 3 vs Col 6 33,367 1,469 Do Not Test Col 3 vs Col 5 14,833 0,653 Do Not Test Col 3 vs Col 11 10,967 0,365 Do Not Test Col 3 vs Col 15 5,200 0,162 Do Not Test Col 3 vs Col 4 2,700 0,119 Do Not Test Col 3 vs Col 2 1,367 0,0602 Do Not Test Col 3 vs Col 1 0,267 0,0117 Do Not Test Col 1 vs Col 12 102,700 4,521 Yes Col 1 vs Col 16 91,498 3,958 Yes Col 1 vs Col 8 87,767 3,864 Yes Col 1 vs Col 7 47,149 2,000 Do Not Test Col 1 vs Col 6 33,100 1,457 Do Not Test Col 1 vs Col 5 14,567 0,641 Do Not Test Col 1 vs Col 11 10,700 0,356 Do Not Test Col 1 vs Col 15 4,933 0,154 Do Not Test Col 1 vs Col 4 2,433 0,107 Do Not Test Col 1 vs Col 2 1,100 0,0484 Do Not Test Col 2 vs Col 12 101,600 4,473 Yes Col 2 vs Col 16 90,398 3,910 Yes Col 2 vs Col 8 86,667 3,815 Yes Col 2 vs Col 7 46,049 1,953 Do Not Test Col 2 vs Col 6 32,000 1,409 Do Not Test Col 2 vs Col 5 13,467 0,593 Do Not Test Col 2 vs Col 11 9,600 0,319 Do Not Test Col 2 vs Col 15 3,833 0,119 Do Not Test Col 2 vs Col 4 1,333 0,0587 Do Not Test Col 4 vs Col 12 100,267 4,414 Yes Col 4 vs Col 16 89,064 3,853 Yes Col 4 vs Col 8 85,333 3,757 Yes Col 4 vs Col 7 44,715 1,897 Do Not Test Col 4 vs Col 6 30,667 1,350 Do Not Test Col 4 vs Col 5 12,133 0,534 Do Not Test Col 4 vs Col 11 8,267 0,275 Do Not Test Col 4 vs Col 15 2,500 0,0778 Do Not Test Col 15 vs Col 12 97,767 3,043 No Col 15 vs Col 16 86,564 2,671 Do Not Test Col 15 vs Col 8 82,833 2,578 Do Not Test Col 15 vs Col 7 42,215 1,290 Do Not Test Col 15 vs Col 6 28,167 0,877 Do Not Test Col 15 vs Col 5 9,633 0,300 Do Not Test Col 15 vs Col 11 5,767 0,153 Do Not Test Col 11 vs Col 12 92,000 3,062 Do Not Test Col 11 vs Col 16 80,798 2,662 Do Not Test Col 11 vs Col 8 77,067 2,565 Do Not Test Col 11 vs Col 7 36,449 1,187 Do Not Test Col 11 vs Col 6 22,400 0,745 Do Not Test Col 11 vs Col 5 3,867 0,129 Do Not Test Col 5 vs Col 12 88,133 3,880 Do Not Test Col 5 vs Col 16 76,931 3,328 Do Not Test Col 5 vs Col 8 73,200 3,222 Do Not Test Col 5 vs Col 7 32,582 1,382 Do Not Test Col 5 vs Col 6 18,533 0,816 Do Not Test Col 6 vs Col 12 69,600 3,064 Do Not Test Col 6 vs Col 16 58,398 2,526 Do Not Test Col 6 vs Col 8 54,667 2,407 Do Not Test Col 6 vs Col 7 14,049 0,596 Do Not Test Col 7 vs Col 12 55,551 2,357 Do Not Test Col 7 vs Col 16 44,349 1,851 Do Not Test Col 7 vs Col 8 40,618 1,723 Do Not Test Col 8 vs Col 12 14,933 0,657 Do Not Test Col 8 vs Col 16 3,731 0,161 Do Not Test Col 16 vs Col 12 11,202 0,485 Do Not Test Note: The multiple comparisons on ranks do not include an adjustment for ties.
30
Apéndice XIV.
Valores promedio de abundancias obtenidas.
100.000
1.000.000
10.000.000
100.000.000
T0 T1 T2 T3
Log
pro
med
io N
° de
espo
ros/
abe
ja
Grupo AGrupo BGrupo CGrupoD
Grupo A
(esporos/ abeja) Grupo B
(esporos/ abeja)Grupo C
(esporos/ abeja) Grupo D
(esporos/ abeja) Tiempo 0 4.465.000 4.655.000 4.678.000 3.961.667 Tiempo 1 3.430.000 2.083.000 1.700.000 429.333 Tiempo 2 15.561.000 9.356.667 5.843.333 286.000 Tiempo 3 12707692,3 10691071,4 9265000 290000
31
Apéndice XV.
Mortalidad registrada.
0
10
20
30
40
50
60
70
%
Tiempo 1 Tiempo 2 Tiempo 3
Grupo A Grupo B Grupo C Grupo D
(% MORTALIDAD) Grupo A Grupo B Grupo C Grupo D Tiempo 1 0 0 13,3 0 Tiempo 2 0 0 60 0 Tiempo 3 13,3 6,6 66,6 0
32
Apéndice XVI.
Promedios de cuadros con abejas registrados.
T 0
T 0
T1 T1
T1T2
T2
T2T3
T3
T3
T 0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Grupo A Grupo B Grupo D
Prom
edio
de
cuad
ros
con
abej
a
T 0 T1 T2 T3 Grupo A 1,64285714 1,64285714 1,78571429 2,07142857 Grupo B 1,92307692 1,61538462 1,69230769 1,69230769 Grupo D 1,86666667 1,93333333 2,06666667 2,2