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Proyecto CGPI 20050860 Relación entre los niveles de proteasa y quitinasa con la capacidad
entomocida en Paecilomyces fumosoroseus. Director del proyecto: Dr. Ramón Cruz Camarillo
1 INTRODUCCIÓN
1.1. INSECTICIDAS BIOLÓGICOS. ASPECTOS GENERALES
Entre las diferentes causas de la contaminación de los ecosistemas se encuentra el uso
inadecuado de plaguicidas químicos, que originan severos daños sobre los humanos y el ambiente.
Entre las plagas más difíciles de combatir están los insectos, que son considerados como tal cuando
han rebasado su hábitat natural, se encuentran en una situación en la que prácticamente no tienen
enemigos naturales, y si existen las condiciones ambientales adecuadas, su población se
incrementa rápidamente. Uno de los principales problemas que presenta el control de insectos por
medios químicos, es la adquisición de resistencia, por lo que su uso frecuente resulta ineficaz y con
un fuerte impacto ambiental negativo. Por tal razón, hay una demanda continua de métodos
alternativos para el control de plagas de insectos. Uno de estos métodos es la utilización de
bioreguladores naturales de tales insectos, que regulan poblaciones, ofrecen la posibilidad de ser
utilizados para un control selectivo, y dan tanto seguridad humana como ambiental. Entre los
organismos susceptibles a ser utilizados para el control biológico, se encuentran los hongos
microscópicos (Fernández-Tavizón, 1980; Ferron et al., 1991; Wraight et al., 2000).
1.2. HONGOS MICROSCÓPICOS EMPLEADOS COMO BIOINSECTICIDAS
1.2.1. Grupos taxonómicos con potencial insecticida. A diferencia de otros
agentes entomopatógenos, los hongos pueden infectar no solamente a través del intestino de los
insectos, sino también por penetración directa del integumento. Esta propiedad hace posible la
infección de insectos, independientemente de sus hábitos alimenticios, y su utilización en el control
de insectos de casi todos los órdenes taxonómicos (Deacon, 1994; García-Juárez et al., 1999; Smith
y Grula, 1983).
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Hasta este momento, se calcula que puede haber 1,500,000 especies de hongos, aunque
solamente están registradas cerca de 72,000, de las cuales, 750 han sido determinadas como
patógenos de insectos y otros artrópodos, incluidas en 90 géneros diferentes (Goettel et al., 1989;
Herrera y Ulloa, 1998; Moore-Landecker, 1996; Hawkesworth, 1988).
A pesar de la gran cantidad de especies reconocidas como entomopatógenas, sólo un 10%
de estas se reproduce de manera masiva en condiciones de laboratorio, y sólo el 1% se encuentra
en condiciones de investigación aplicada o de comercialización, debido principalmente a que no
existen estudios suficientes de las interacciones hospedante-patógeno. Dentro del 1% mencionado,
las siguientes especies son susceptibles de ser reproducidas a escala comercial, Aschersonia
aleyrodes, Beauveria bassiana, Hirsutella thompsonii, Metarhizium anisopliae, Paecilomyces
fumosoroseus, Nomuraea rileyi y Verticillium lecanii (Garza-González, 1995).
1.2.2. Mecanismos de acción de los hongos entomopatógenos. Los hongos
entomopatógenos varían considerablemente en sus modos de acción, virulencia y especificidad de
hospedante, aunque puede distinguirse un mecanismo básico de infección, que se inicia con la
adherencia de la unidad infectiva, usualmente un conidio, a la cutícula del insecto. Se piensa que el
éxito de una infección fúngica radica en gran parte en esta primera fase. Posteriormente, el conidio
germina y se inicia la penetración fúngica, la cual requiere una combinación de fuerza mecánica y
de una degradación enzimática de la cutícula. Dependiendo de la especie del hongo, se forma un
tubo de germinación que penetra directamente, o bien se forman estructuras especializadas de
infección tales como los apresorios, que son hinchamientos aplanados que se forman del tubo de
germinación de un conidio, y que se adhieren a la superficie del hospedante antes de penetrarlo con
una hifa infectiva, la cual se origina a partir de dicho hinchamiento. La penetración, aunque de
manera menos frecuente, puede ocurrir también vía heridas, a través de los órganos de los
sentidos, o por el tracto digestivo (Askary et al., 1999; Boucias y Pendland, 1991; Charnley y St.
Leger, 1991; Goettel e Inglis, 1997; Ulloa, 1991).
En el caso de la invasión por la cutícula intacta, la epicutícula es la primera barrera
encontrada y está constituida en su mayoría por proteínas; su penetración se favorece por la acción
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de los ganchos de infección, por debajo de los apresorios o bien por la entrada directa de los tubos
germinativos. Después de pasar la epicutícula, las estructuras penetrantes a menudo se expanden
lateralmente en las capas externas de la procutícula, produciendo placas de penetración; estas
expansiones pueden causar fracturas que favorecen la penetración. El paso del hongo a través de
la procutícula puede ser más o menos vertical, o involucrar una extensión lateral del micelio;
posteriormente, las hifas alcanzan la epidermis (figura 1). Una vez en el hemocele, el micelio se
ramifica a través del hospedante, formando cuerpos hifales y/o blastosporas. En esta fase de la
infección, es importante el estadio del insecto, ya que la penetración y desarrollo del hongo
frecuentemente ocurre en los estados entre muda y muda (Askary et al., 1999; Charnley y St. Leger,
1991; Goettel e Inglis, 1997), tal como lo observaron Zacharuk hacia 1981 y Fargues y Vey entre
1974 y 1977 (citados por Khachatourians, 1992).
Figura 1. Estructura de la cutícula de los insectos y mecanismo de penetración por los hongos entomopatógenos. En la mosquita
blanca (Homoptera: Aleyrodidae) se distinguen cuatro capas bien definidas. El mayor componente de la cutícula es de tipo proteico.
La esclerotización es la unión de la proteína con compuestos aromáticos como la N-acetildopamina, que endurece la cutícula. En los
insectos de cuerpo suave (i.e larvas), la exocutícula es delgada e indistinguible de la epicutícula. La membrana artroidal de las
articulaciones, así como aquella localizada entre los segmentos no tiene exocutícula. Otro componente importante de la cutícula es la
quitina. Tomado de Charnley y St. Leger (1991).
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La muerte del hospedante a menudo se debe a una acción combinada de toxinas fúngicas,
obstrucción física de la circulación sanguínea, disminución en el aporte de nutrimentos e invasión de
órganos. Después de la muerte del hospedante, las hifas usualmente emergen del cadáver y bajo
condiciones apropiadas de temperatura y humedad, producen conidios en el exterior del
hospedante. Estos conidios, dependiendo de la especie, pueden ser hidrofóbicos o hidrofílicos, y ser
dispersados por el viento o la lluvia. Bajo condiciones secas o frías, los insectos a menudo
permanecen intactos como momias rellenas de hongos. El hongo emerge y esporula una vez que el
cadáver está bajo las condiciones ambientales apropiadas (Bidochka y Khachatourians, 1994;
Charnley y St. Leger, 1991; Goettel e Inglis, 1997).
1.3. IMPORTANCIA DE LA MOSQUITA BLANCA COMO INSECTO PLAGA
La mosquita blanca (Homoptera: Aleyrodidae) es una plaga polífaga de una importancia
económica creciente alrededor del mundo, no solo en campos de cultivo, sino también en plantas
ornamentales de invernadero. Está constituida por diferentes géneros y especies, entre las más
importantes, Bemisia argentifolii, B. tabaci, Trialeurodes vaporariorum, Dialeurodes citri, y Parabemisia
myricae. Este insecto es una plaga cosmopolita que ataca cultivos y plantas silvestres, ocasionando
grandes pérdidas económicas. En México, se calcula que anualmente daña 700, 000 hectáreas de
cultivos de hortalizas, frutas y plantas ornamentales. El daño directo lo causan las ninfas y los
adultos al succionar la savia a través de su aparato bucal, por lo que son un vector de
enfermedades, y sus secreciones propician la proliferación de hongos fitopatógenos. Por otro lado,
la constante aplicación de insecticidas químicos para combatirla ha propiciado una mayor
resistencia a los mismos. En México afecta cultivos de algodón, soya, frijol, tomate rojo, chile, papa
y diversas hortalizas. También ataca plantas ornamentales, como la nochebuena (Ayala-Zermeño et
al., 1999; Greer, 2000; Mier et al., 1991; Mier et al., 1999).
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1.4. Paecilomyces fumosoroseusPaecilomyces fumosoroseusPaecilomyces fumosoroseusPaecilomyces fumosoroseus COMO AGENTE PARA EL CONTROL DE LA
MOSQUITA BLANCA
P. fumosoroseus es un hongo que puede ejercer un papel importante en la regulación de la
plaga de la mosquita blanca, a través de la aplicación de programas de control biológico, ofreciendo
así una alternativa a los insecticidas químicos en los programas de manejo de plagas. Las especies
pertenecientes a este género forman conidióforos ramificados, agrupados en paquetes llamados
sinemas o coremios. Además presentan fiálides engrosadas en la base y terminadas en un cuello
en forma de botella, y sus conidios son de color rosado. Los hongos pertenecientes a esta especie
se encuentran en forma natural en un amplio espectro de hospedantes, por ejemplo los áfidos rusos
del trigo (Diuraphis noxia), Homoptera: Aphididae y los trips del melón (Thrips palmi), Thysanoptera:
Thripidae (Ayala-Zermeño et al., 1999; Castaneiras et al., 1996; Mesquita et al., 1996; Samson,
1981).
1.5. PARTICIPACIÓN DE LAS QUITINASAS Y PROTEASAS FÚNGICAS, EN EL
MECANISMO DE ATAQUE A INSECTOS
Los insectos son artrópodos, por lo que poseen un esqueleto externo o cutícula que tiene
una variedad de funciones, aparte de su papel esquelético, de soporte y anclaje muscular. La
función defensiva de la cutícula es evidente, ya que sólo un grupo de entomopatógenos, los hongos,
han desarrollado la capacidad de invadir a los insectos por esta ruta. Debido a la complejidad
estructural de la cutícula, es necesaria su degradación enzimática para que el hongo pueda tener
acceso a los nutrimentos del interior del insecto (Glare y Milner, 1991; Hernández-Velázquez,
1995a).
Existen varias enzimas involucradas en el proceso de degradación de la cutícula, así como
en las demás fases de la infección. En este contexto se conoce la existencia de un grupo enzimático
formado por lipasas, proteasas y quitinasas principalmente. Para los fines del presente trabajo, la
información se centrará en las proteasas y quitinasas fúngicas. La producción de proteasa es una
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de las primeras respuestas bioquímicas de muchos organismos parásitos una vez establecido el
contacto con el hospedante. La quitinasa se produce en menores cantidades, debido a que el mayor
componente de la cutícula es de tipo proteico, el cual estructuralmente enmascara a la quitina
cuticular, por lo que la quitinasa comienza a producirse hasta que la proteína que rodea a la quitina
ha sido degradada. Otra de las funciones de estas enzimas, sobre todo en el caso de la quitinasa,
es la de proveer nutrimentos a partir de la cutícula de los insectos moribundos (Charnley y St. Leger,
1991; St. Leger et al., 1987c).
A finales de la década de los cincuenta, comenzó a desarrollarse un gran interés por
estudiar la degradación enzimática de la cutícula de los insectos, debido a la posibilidad de que la
virulencia de los hongos entomopatógenos pudiera estar correlacionada, al menos en parte, con su
actividad proteolítica, quitinolítica y lipolítica. Sin embargo los resultados obtenidos hasta el
momento han sido contradictorios, ya que algunos autores proponen que existe una correlación
positiva entre enzimas y virulencia, y otros mencionan que dicha correlación es negativa (tabla 1).
Es importante señalar que Paecilomyces fumosoroseus no ha sido muy estudiado en este sentido, por
lo que la evaluación de su producción de enzimas proteo-quitinolíticas podría ayudar a entender el
mecanismo de su acción entomopatógena. En el caso de encontrar una correlación positiva entre
los niveles de producción enzimática en los diferentes aislados, este hecho ayudaría a hacer una
selección de aquellos más promisorios, para ser estudiados después mediante bioensayos contra el
insecto blanco escogido (Charnley y St. Leger, 1991; St. Leger et al., 1986b).
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Tabla 1. Resultados sobre la participación de las quitinasas y proteasas fúngicas en el mecanismo de ataque a insectos Autor y año
Especies de hongos
Resultados reportados Citado por
Huber, 1958 B. bassiana, M..anisopliae, Cordyceps militaris
Señaló la capacidad de los hongos entomopatógenos para producir enzimas extracelulares, sin aclarar de que tipo, como las responsables de la degradación de las capas cuticulares.
St. Leger et al., 1986a
Claus, 1961 B. bassiana Propuso la intervención de una quitinasa en la degradación de la cutícula, tomando como base la composición de la misma.
Khachatourians, 1992
Gabriel, 1968 E. apiculata, E. thaxteriana, E. virulenta, E. coronata
Demostró la producción in vitro de enzimas lipolíticas, quitinolíticas y proteolíticas.
Khachatourians, 1992
Mc. Cauley et al., 1968
M. anisopliae Observaron que la penetración del tubo de germinación va acompañada de la formación de una zona clara alrededor, que indica actividad enzimática.
Khachatourians, 1992
Hedlund y Pass 1968 y Zacharuk-Ry, 1981
B. bassiana, M. anisopliae
Observaron la degradación de tejidos de insectos después de la invasión por hifas.
Khachatourians, 1992
Tomiyama y Aoki 1969
Erynia blunkii Observaron la formación de una zona clara rodeando el lugar de penetración del tubo de germinación, en la polilla “diamante negro”
Khachatourians, 1992
Grula et al., 1970-1980
B. bassiana La infección era dependiente de la actividad enzimática hacia el gusano de maíz. La degradación de la quitina del insecto es llevada a cabo por la quitinasa del hongo
Khachatourians, 1992
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Tabla 1. Continuación.... Autor y año
Especies de hongos
Resultados reportados Citado por
Zacharuk 1970 M. anisopliae Observaron la desaparición de la capa de cera en la cutícula del gusano barrenador, bajo los apresorios del hongo, lo que sugiere la participación de una lipasa en el mecanismo de penetración .
Khachatourians, 1992
Kucera, 1971 y Samsinakova et al, 1977
B. bassiana Demostraron la existencia de una proteasa, cuya producción era influenciada por la fuente de nitrógeno.
Khachatourians, 1992
Mohamed et al, 1978
N. rileyi Propusieron que las proteasas extracelulares fúngicas están involucradas en el proceso de infección y de penetración hifal.
Khachatourians, 1992
Pekrul y Grula, 1979
B. bassiana Reportaron la presencia de perforaciones circulares probablemente causadas por enzimas, sin mencionar de que tipo, en el punto de entrada del tubo de germinación en las larvas de Heliotis zea.
Khachatourians, 1992
Smith y Grula, 1983
B. bassiana Demostraron la producción in vitro de una quitinasa inducible, empleando como substrato el integumento pulverizado del insecto. La actividad se midió utilizando el método de los azucares reductores. El muestreo se prolongó por 27 días.
Khachatourians, 1992
Sosa-Gomez y Alves, 1983
M. anisopliae Encontraron una correlación negativa entre la capacidad de producción de enzimas del hongo, con los procesos de patogénesis y virulencia. Las enzimas que probaron fueron proteasas y una amilasa.
Sosa-Gómez y Alves, 1983
Coudron et al, 1986
B. bassiana, M. anisopliae, N. rileyi
Examinaron la producción de endo y exoquitinasa en aislados virulentos y avirulentos; los primeros tenían de 10 a 17 veces más actividad. No se hace mención de la manera en que se midieron las actividades enzimáticas.
Khachatourians, 1992
St. Leger et al, 1986
M. anisopliae, V. lecanii, B. bassiana
Identificaron una endoproteasa, una quitinasa, y una N-acetil-β-glucosaminidasa en diferentes aislados de hongos.
St. Leger et al., 1986a
St. Leger et al, 1986
M. anisopliae Identificaron una serín-proteasa con dos actividades: Pr1 y Pr2. Ambas intervenían en los procesos de melanización y virulencia hacia Manduca sexta.
St. Leger et al., 1986b
St. Leger et al, a partir de 1986
M. anisopliae La proteasa del hongo participaba en la degradación de la cutícula, y en los procesos de infección hacia diferentes insectos como la langosta del desierto.
St. Leger et al., 1986-1999
Pendland y Kucera, 1982 a 1987
N. rileyi, M. anisopliae
Durante la fase de invasión el hongo producía proteasas, que eran inhibidas por compuestos presentes en la hemolinfa de los insectos.
Khachatourians, 1992
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Tabla 1. Continuación... Autor y año
Especies de hongos
Resultados reportados Citado por
Clarkson y Charnley, 1996
Metarhizium Mencionaron a las enzimas extracelulares, principalmente proteasas, como parte del mecanismo de penetración a la cutícula del los insectos.
Clarkson y Charnley, 1996
Khachatourians, 1987
B. bassiana Se purificó una serín-proteasa, de peso molecular de 35,000 Da. y un pH óptimo de 8.5.
Khachatourians, 1992
Bidochka y Khachatourians, 1988
B. bassiana Observaron la producción de una serín-proteasa supuestamente regulada por represión catabólica, debida a la presencia de la NAG liberada al degradarse la cutícula de los insectos.
Bidochka y Khachatourians, 1988
Samuels et al, 1988
Erynia spp Demostraron la presencia de aminopeptidasas. Khachatourians, 1992
El-Sayedet et al, 1989
N. rileyi Se identificó una exoquitinasa, cuya actividad era 15-18 veces mayor en los patotipos virulentos, que en los avirulentos.
Khachatourians, 1992
Goettel et al, 1989 M. anisopliae Reportaron la producción de la proteasa PR1 en los apresorios, durante el proceso de infección a M. sexta.
Goettel et al., 1989
St. Leger et al, 1991
M.anisopliae, V.lecanii, B bassiana, P.farinosus, Tolypocladium niveum
Demostraron la producción de proteasas semejantes a la PR1 de M. anisopliae en todos los aislados ensayados, lo que sugiere una adaptación para ser patógenos de insectos.
St. Leger et al., 1991
St. Leger et al., 1994
M. anisopliae Reportaron 3 tipos de proteasas diferentes, durante el crecimiento en medios con cutícula de cucaracha. Cada enzima presentó varias isoformas, las cuales se caracterizaron de acuerdo a su especificidad hacia el sustrato y por sus patrones de inhibición. También mencionaron la presencia de una metaloproteasa.
St. Leger et al, 1994
Paterson et al., 1994
M. anisopliae Ocurría la inducción de la síntesis de una proteasa, al agregarse cutícula molida de los insectos al medio de cultivo. Si se usaban otras fuentes de carbono y nitrógeno no ocurría la síntesis de dicha enzima.
Paterson et al., 1994a y 1994b
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Tabla 1 Continuación... Autor y año
Especies de hongos
Resultados reportados Citado por
St. Leger et al. 1997
V. lecanii Propusieron que mediante un proceso de coevolución hospedante-parásito, los hongos han adquirido la capacidad de producir enzimas extracelulares, capaces de degradar sustratos de naturaleza diversa, mostrando preferencia por algunos de éstos, dependiendo del organismo que se encuentren parasitando.
St. Leger et al, 1997
Joshi et. al, 1997 M. anisopliae Identificaron los genes que codifican para la actividad PR1 de una serín-proteasa.
Joshi et al, 1997
Gillespie et al, 1998
Metarhizium No encontraron correlación significativa entre la capacidad de las proteasas para degradar un sustrato cromogénico, y el TL50 en ensayos con langostas.
Gillespie et al., 1998
Chul-Kang et al, 1998
M. anisopliae Llevaron a cabo el aislamiento de un gen que codifica una quitinasa.
Chul-Kang et al., 1998
Chul-Kang et al, 1999
M. anisopliae Reportaron las actividades de una endo y una exoquitinasa. Chul-Kang et al., 1999
Askary et al, 1999 V. lecanii Detectaron en algunos pasos del mecanismo de infección para invadir áfidos (Macrosphum euphorbiae), la participación de proteasas y quitinasas.
Askary et al., 1999
Bidochka et al, 1999
Verticillium Demostraron la presencia de proteasas, pectinasas y quitinasas en diversas especies de este género, lo que puede señalar una adaptación hospedante-parásito, de acuerdo con el organismo que se encuentren parasitando.
Bidochka et al., 1999
St. Leger et al, 1999
M. anisopliae Observaron la modificación del pH del medio al liberarse compuestos alcalinos de carácter proteico. Esto podría crear un ambiente óptimo para la acción de las proteasas.
St. Leger et al., 1999
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1.6. HIPÓTESIS DE TRABAJO
Los aislados de Paecilomyces fumosoroseus (Wize) Brown & Smith con mayor actividad de proteasa y
quitinasa, serán los más virulentos para la mosquita blanca, Trialeurodes vaporariorum (West.).
1.7. OBJETIVO GENERAL
Investigar la relación existente entre la capacidad proteolítica y quitinolítica de aislados del hongo
entomopatógeno P. fumosoroseus, con respecto a su virulencia contra la mosquita blanca
Trialeurodes vaporariorum.
1.8. OBJETIVOS PARTICULARES
1.8.1. Seleccionar dos aislados con alta, mediana y baja actividad de proteasa y quitinasa, dentro
de una colección de 18 aislados de P. fumosoroseus.
1.8.2. Evaluar la virulencia (como concentración letal media, CL50) hacia la mosquita blanca, de dos
aislados de P. fumosoroseus con alta, mediana y baja capacidad proteolítica y quitinolítica.
1.9. JUSTIFICACIÓN
P. fumosoroseus es un hongo potencialmente útil para el control de plagas agrícolas, ya que
permite plantear programas que limiten el uso de plaguicidas químicos, disminuyendo así el daño al
ambiente; sin embargo, su uso comercial todavía es limitado, sobre todo porque se sigue prefiriendo
el uso de insecticidas químicos que propician una disminución rápida de las poblaciones de
insectos, comparada con la velocidad de acción de los hongos entomopatógenos. Esto hace
necesaria la búsqueda de aislados que produzcan gran cantidad de enzimas proteo-quitinolíticas, y
que por lo mismo pudieran ser muy virulentos por atacar masivamente al insecto blanco,
compitiendo así con los plaguicidas químicos con respecto al tiempo de eliminación de la mosquita
blanca.
En el caso particular de este hongo, no se ha estudiado de manera amplia la producción de
estas enzimas, ni la relación que existe entre ellas y la virulencia hacia la mosquita blanca. Además,
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estos datos ayudarían a conocer mejor este microorganismo, y así producirlo a mayor escala
cultivándolo por ejemplo en medios ricos en materiales proteino-quitinosos.
Así mismo, en el caso de que hubiera una correlación positiva entre los niveles de proteasa
y quitinasa con la entomopatogenicidad, se haría más sencilla la selección de aislados promisorios
evaluando dichas enzimas, antes de realizar los bioensayos correspondientes contra los insectos de
interés.
1.10. METAS
1.10.1. Seleccionar el medio de cultivo más adecuado, para la evaluación en placa de proteasa
extracelular. Realizar el ordenamiento de los 18 aislados fúngicos, con base en los niveles de
producción de dicha enzima en el medio sólido seleccionado.
1.10.2. Llevar a cabo estudios cinéticos en cultivo sumergido de los dos aislados que presenten la
mayor, intermedia y menor producción de proteasa, para establecer los tiempos convenientes para
evaluar dicha actividad.
1.10.3. Evaluar la actividad proteolítica a los tiempos establecidos, de los 18 aislados cultivados en
medio líquido. Hacer la selección final de dos aislados que sean altos, medianos y bajos productores
de la enzima, para realizar posteriores bioensayos contra la mosquita blanca.
1.10.4. Seleccionar el medio de cultivo más adecuado, para la evaluación en placa de quitinasa
extracelular. y hacer el ordenamiento inicial de los 18 aislados fúngicos, con base en los niveles de
producción de dicha enzima en el medio sólido seleccionado.
1.10.5. Llevar a cabo estudios cinéticos en cultivo sumergido de los dos aislados que presentaron la
mayor, intermedia y menor producción de quitinasa, para establecer los tiempos convenientes para
evaluar dicha actividad.
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1.10.6. Evaluar la actividad quitinolítica a los tiempos establecidos, de los 18 aislados cultivados en
medio líquido. Hacer la selección final de dos aislados que sean altos, medianos y bajos productores
de la enzima, para realizar posteriores bioensayos contra la mosquita blanca.
1.10.7. Determinar la virulencia de P. fumosoroseus contra ninfas de mosquita blanca en su segundo
estadio, evaluando la concentración letal media (CL50). empleando en estos bioensayos los seis
aislados previamente seleccionados para cada enzima; dos con alta, dos con media y dos con baja
actividad.
1.10.8. Determinar la relación entre la producción de proteasa y quitinasa y la virulencia hacia el
insecto, mediante un tratamiento estadístico de los datos obtenidos en los bioensayos.
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2. METODOLOGÍA
2.1. MICROORGANISMOS Y SU CONSERVACIÓN
En la presente investigación se trabajó con 18 aislados de Paecilomyces fumosoroseus,
procedentes de distintas regiones de México (Tabla 2), todos ellos proporcionados por el Centro
Nacional de Referencia en Control Biológico (CNRCB) SAGAR, de Tecomán, Colima y depositados
en la Colección del Departamento de Microbiología y Parasitología de la Universidad Nacional
Autónoma de México.
Tabla 2. Cultivo y origen de procedencia de los diferentes aislados de P. fumosoroseusP. fumosoroseusP. fumosoroseusP. fumosoroseus, de la mosquita blanca (BemisiaBemisiaBemisiaBemisia sp.) No. asignado (UNAM*) Clave (CNRCB) Cultivo Origen
EH-503 MBP pepino Yucatán EH-504 MBP1 pepino Yucatán EH-505 MBCH chile habanero Yucatán EH-506 PFCAM chile habanero Campeche EH-507 MBPO1N nochebuena Colima EH-508 MBPO2N nochebuena Colima EH-509 MBPO3A nochebuena Colima EH-510 MBNS1 sandía Armería, Colima EH-511 MBAS2 sandía Armería, Colima EH-512 MBAS3 sandía Armería, Colima EH-513 MBAS4 sandía Armería, Colima EH-514 MBAS5 sandía Armería, Colima EH-515 MBASG sandía Armería, Colima EH-516 MBPO4 nochebuena Colima EH-517 MBTH -------------- Sinaloa EH-518 MBMAC -------------- Sinaloa EH-519 MBBRT berenjena Colima EH-520 PSMB tomate Nayarit
* Facultad de Medicina, Colección del Depto. de Microbiología y Parasitología, México, D. F.
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Los aislados fueron sembrados en tubos de ensayo y cajas de Petri con medio H o agar de
glucosa Sabouraud e incubados a 28 °C durante 7 a 15 días, para facilitar el desarrollo de sus
colonias. Los cultivos se guardaron en refrigeración para su mejor conservación. Los aislados fueron
resembrados cada seis meses, para evitar resiembras frecuentes que pudieran propiciar la
disminución de la virulencia. Paralelamente con las resiembras, hubo pruebas de pureza en placa, y
observaciones al microscopio para constatar que no había contaminación.
2.2. MEDIOS DE CULTIVO USADOS PARA LA PRODUCCIÓN DE PROTEASA Y QUITINASA EN
LOS EXPERIMENTOS DE EVALUACIÓN EN PLACA
Puesto que no existen antecedentes sobre un medio particular que resulte adecuado para la
producción de quitinasas o proteasas en P. fumosoroseus, se consideró necesario ensayar diferentes
medios sólidos, para hacer las evaluaciones de ambas enzimas en cajas de Petri.
La estrategia consistió en añadir al medio en estudio los inductores correspondientes, que
para el caso de la proteasa fue caseína de Hammersten al 1% (Merck, Darmstadt, Alemania), y para
la quitinasa, quitina (Sigma de México, MX) coloidal o desechos molidos de camarón coloidales a
13-14% (peso húmedo/volumen). En todos los casos el pH de los medios fue ajustado a 7 (tabla 3).
Todos los medios se esterilizaron en autoclave durante 15 min a 121°C. El medio sintético de
Castañeda (Chávez-Camarillo y Cruz-Camarillo, 1984), fue utilizado completo y también
suprimiendo el citrato y el glicerol.
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Tabla 3. Medios de cultivo utilizados para la evaluación en placa de quitinasa y proteasa, para seleccionar el medio más conveniente para cada caso
Medio Composición Agar agua (Vidal et al., 1996)
agar 23 g agua destilada 1000 ml
Medio sintético de Castañeda (Chávez-Camarillo y Cruz-Camarillo,1984)
citrato diamónico .625 g cloruro de sodio 0.25 g
fosfato monobásico de potasio 0.375 g
carbonato de sodio 0.375 g
sulfato de magnesio 0.275 g glicerol 6.25 ml
agar 23 g
agua destilada 1000 ml
Medio CM (Czapek modificado, Toriello y Mier, com. pers.)
glucosa 10 g fosfato de potasio 0.36 g fosfato de sodio 1.42 g cloruro de potasio 1 g sulfato de magnesio 0.6 g nitrato de amonio 0.7 g extracto de levadura 5 g agar 20 g agua destilada 1000 ml
Agar de glucosa Sabouraud (Goettel e Inglis, 1997)
glucosa 20 g peptona 10 g agar 15 g agua destilada 1000 ml
17
Agar micológico (Bioxón, México)
peptona de soya 10 g glucosa 10 g extracto de levadura 2.5 g agar 15 g agua 1000 ml
Agar de glucosa extracto de levadura (Goettel e Inglis, 1997)
glucosa 35 g extracto de levadura 10 g agar 15 g agua destilada 1000 ml
Medio H (Goettel e Inglis, 1997)
sacarosa 10 g glucosa 5 g peptona 0.5 g extracto de levadura 5 g agar 15 g agua destilada 1000 ml
2.2.1. PREPARACIÓN DE LOS SUBSTRATOS QUITINOSOS COLOIDALES
Para inducir la síntesis de quitinasa, se añadió un substrato quitinoso a todos los medios
utilizados, fueran sólidos o líquidos. Uno fue la quitina coloidal y el otro desperdicio de camarón
también coloidal. A continuación está descrita la preparación correspondiente.
a) Quitina coloidal. Este sustrato fue utilizado para la evaluación de la producción de
quitinasas en placa; utilizando quitina comercial Sigma, molida en un molino Wiley con una luz de
malla de 40. Por cada 10 gramos de quitina se agregaron 100 ml de H3PO4 al 85%, mezclando
manualmente, luego, la mezcla fue mantenida en refrigeración durante 24 h. Pasado este tiempo,
18
fue añadida agua de suministro en exceso para propiciar la formación de la quitina coloidal,
eliminando la acidez colocándola en una gasa y lavándola hasta que el pH de la quitina alcanzó el
del agua de suministro. La pasta gelatinosa obtenida fue colocada en un frasco de boca ancha y
esterilizada en autoclave durante 15 min a 121 °C, después mantenida en refrigeración hasta su
uso (Chávez-Camarillo y Cruz-Camarillo, 1984).
b) Desperdicio molido y coloidizado de camarón. Este sustrato se utilizó para inducir la
síntesis de quitinasa tanto en placa como para los experimentos en cultivo sumergido; en estos
últimos también actuó como inductor de proteasas, ya que su composición proteico-quitinosa es
adecuada para inducir la síntesis de ambas enzimas. El procedimiento para prepararlo es el mismo
que para la quitina coloidal.
c) Quitina coloidal teñida. Al utilizar quitina o desperdicio de camarón coloidizados, los
resultados no fueron claros, debido probablemente a que el hongo producía simultáneamente
proteasa y quitinasa. Por esta razón, para evaluar la quitinasa, una preparación de la quitina
coloidal teñida con azul brillante de remazol fue utilizada. Primero se preparó quitina coloidal como
se describió en el inciso a, tiñéndola después con azul brillante de remazol, colocando para tal fin
en un vaso de precipitados 7 g de quitina coloidal y 0.23 g del colorante previamente disuelto en
agua y calentando la mezcla a ebullición durante 1 h. Posteriormente, la quitina fue lavada con
agua fría y después con agua caliente hasta que ya no hubo desprendimiento de color. Luego de
dejarlo escurrir, el material teñido se colocó nuevamente en un vaso de precipitados para favorecer
la fijación de color, agregando 0.075 g de dicromato de sodio y 0.075 g de tartrato de sodio y potasio
por cada 5 g de quitina coloidal teñida. La mezcla hervió por 10 min, para posteriormente lavarla con
agua fría y caliente. Luego de escurrila, se esterilizó en autoclave durante 15 min a 121°C,
conservando posteriormente en refrigeración hasta su uso (Gómez-Ramírez, 2000).
2.3. SELECCIÓN DE LOS MEDIOS MÁS ADECUADOS PARA EVALUAR LA PRODUCCIÓN DE
PROTEASA Y QUITINASA EN MEDIO SÓLIDO
19
Los diferentes aislados fueron sembrados en placas conteniendo los medios indicados en la
tabla 3, adicionados de agar y los inductores correspondientes. Luego se registró la aparición de los
halos de actividad enzimática durante un máximo de 7 días, midiendo la relación diámetro del halo
entre diámetro de la colonia. Un inóculo circular, colocado dentro de una hoquedad de la misma
forma, sirvió para propiciar la formación de una colonia redonda, que facilitase la evaluación
enzimática. Tanto la hoquedad como el inóculo, proveniente de la parte media de una colonia
fúngica de 7 a 11 días de crecimiento, fueron hechas con una pipeta Pasteur cortada en el centro y
con los bordes afilados. Ya inoculadas, las placas fueron incubadas a 28° C en la obscuridad. De
este modo, la secreción de quitinasa se manifestó en forma de halos transparentes en torno a la
colonia. En cambio los halos de proteasa podían tener distintos aspectos: pequeños y opacos, hasta
halos más grandes y transparentes con un borde opaco muy delgado.
La evaluación se hizo de dos maneras. Por un lado mediante una escala arbitraria
cualitativa, asignando cuatro a cinco cruces a aquel aislado con mayor actividad, en tanto que los
otros aislados recibirían tantas cruces correspondiendo a una comparación visual con el aislado más
activo. Por otro lado, el cociente entre diámentro de halo/diámetro de colonia, fue la otra opción para
evaluar. Los resultados obtenidos permitieron seleccionar el medio de cultivo más adecuado para la
producción de enzimas.
Una vez hecho el ordenamiento de los aislados con base en la producción de proteasa o
quitinasa y habiendo seleccionado el medio de cultivo apropiado, se realizaron estudios cinéticos en
cultivo sumergido para hacer un ordenamiento definitivo de acuerdo con una alta, media y baja
actividad proteolítica o quitinolítica para la realización de bioensayos de virulencia.
2.4. PREPARACIÓN Y CONTEO DEL INÓCULO
La preparación del inóculo tanto para los estudios cinéticos como para los bioensayos, se
realizó mediante cuentas directas de conidios. Para esto, los conidios fueron colectados a partir de
colonias esporuladas que habían sido cultivadas en agar de glucosa Saboraud o medio H,
agregando tween 80 al 0.05% estéril, y agitando vigorosamente la superficie de la colonia con ayuda
20
de un asa de siembra. Posteriormente, la suspensión obtenida fue filtrada a través de un embudo
con una placa de vidrio de porosidad media, o un embudo Büchner con papel filtro Whatman del No.
1, para retener las hifas que pudieran haberse desprendido de la colonia.
El conteo se hizo en una cámara de Neubauer usada comúnmente para cuantificar el
número de conidios por unidad de volumen o de peso. El procedimiento consistió en homogeneizar
primero la suspensión de conidios con un vortex durante un min, y llenando después las celdas del
hemocitómetro con la suspensión obtenida, lo que se dejó en reposo de 15 a 30 min, cuidando que
la preparación no se secara. La cámara de Neubauer se observó al microscopio con el objetivo 40 x.
El número promedio de conidios fue calculado y el conteo fue válido cuando la desviación estándar
fue del 10-15% de la media (Goettel e Inglis, 1997).
Dado que con el método hemocitométrico no es posible distinguir entre conidios viables y no
viables (de modo que el inóculo pudiera ser preparado de acuerdo con los primeros), la viabilidad de
las esporas se determinó por las unidades formadoras de colonias (UFC). Preparando para ello, una
suspensión de conidios de 1 x 106 conidios/ml, y diluyendo a 105, luego 104, 103, y 102 conidios/ml.
De cada dilución se tomaron los µl necesarios para sembrar en cajas de agar dextrosa Saboraud, y
obtener aproximadamente 20 UFC por placa. Las cajas fueron incubadas luego en la obscuridad a
28°C durante 36 a 48 h.
Para calcular los conidios viables por unidad de volumen, y así inocular con la concentración
de conidos exacta, las cuentas totales estimadas con el hemocitómetro fueron multiplicadas por el
número de UFC obtenido en las cajas de Petri (Goettel e Inglis, 1997). Siempre se trabajó con una
viabilidad del 99%.
En el caso de los bioensayos, se utilizaron cultivos monospóricos conservados en medio H,
que provenían del pase uno a partir de un insecto infectado, esto con el fin de mantener la
virulencia. La extracción y el conteo de los conidios fue hecha de la manera antes descrita; sin
embargo, el conteo de conidios viables no fue realizada, ya que en la parte de la investigación que
correspondió a los ensayos enzimáticos la viabilidad de los conidios nunca fue inferior al 99%.
21
Para los bioensayos, la concentración inicial de inóculo fue ajustada a 4.7 x 106 conidios/ml,
que fue el promedio obtenido de un tubo de ensayo con medio H, de todos los aislados. A partir de
dicha concentración se hicieron diluciones decimales para probar diferentes concentraciones del
hongo.
2.5. CINÉTICAS DE PRODUCCIÓN DE PROTEASA Y QUITINASA EN CULTIVO SUMERGIDO
En virtud de que no se conocían las tendencias de producción enzimática de los18 aislados,
se decidió reducir el número a solamente seis, escogiéndose los dos productores altos de una u otra
enzima, dos intermedios y dos productores bajos, basándose en las evaluaciones en placa. Con
estos seis aislados se realizaron estudios cinéticos sobre la producción tanto de proteasa como de
quitinasa, para establecer en qué momento se alcanzaba la mayor actividad, y escoger dos tiempos
a los cuales fuera conveniente hacer evaluaciones con los 18 aislados en estudio. Sin embargo, los
trazos cinéticos obtenidos eran totalmente distintos y no fue posible determinar dos tiempos de
máxima producción enzimática, por lo que fue necesario hacer estudios cinéticos de la producción
de ambas enzimas en los 18 aislados en estudio.
Para ello, la producción de las dos enzimas se realizó en cultivo sumergido, utilizando
matraces de 125 ml con 25 ml del medio sintético de Castañeda, pero sin citrato ni glicerol, y
adicionado con desperdicios molidos de camarón previamente coloidizados al 13-14 % (peso
húmedo/volumen). Cada matraz fue inoculado con una suspensión de 106 esporas por ml, e
incubado a 28°C con una agitación de 150 rpm; tomando cada dia un matraz y centrifugando su
contenido a 10,000 rpm durante 15 min en una centrífuga Sorvall RC-5B; colectando el
sobrenadante con pipetas estériles de 10 ml y distribuyéndolo en alícuotas de 5 ml, congelándolas
para su ensayo enzimático posterior. Este procedimiento fue repetido durante 13 días seguidos. En
el momento de la cosecha de cada matraz, el pH de los cultivos, y el desarrollo microscópico del
hongo fue registrado.
22
2.5.1. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA
Para la determinación de la actividad proteolítica se utilizaron las dos técnicas descritas a
continuación:
a) Uno fue el método de Kunitz (1947), basado en que la hidrólisis de la caseína origina la
liberación de péptidos solubles que absorben a 280 nm por contener tirosina, triptofano y
fenilalanina. El substrato utilizado para esta técnica fue caseína Hammersten (Merck) disuelta al 1%
en regulador de fosfatos 0.2 M a pH 7. Este ensayo consistió en mezclar 1 ml del sobrenadante a
ensayar con 1 ml de caseína, incubando después a 37 °C durante 15 min y deteniendo la reacción
con 3 ml de ácido tricloroacético al 30 %, para después dejar reposar durante 30 min en
refrigeración. Después se centrifugó a 10,000 rpm y los sobrenadantes fueron leidos a 280 nm. Los
testigos se prepararon colocando en el siguiente orden 1 ml de enzima, 3 ml de ácido tricloroacético
(TCA) y 1 ml de caseína, incubando, centrifugando y leyendo a 280 nm al igual que los problemas.
Las diferencias de lecturas entre problemas y testigos se interpolaron en una curva tipo de tirosina
(con límites de 0-300 µg/ml). La actividad fue expresada en unidades, siendo una unidad de
proteasa la cantidad de enzima que libera 1 µg de tirosina/min/ml (Chávez-Camarillo y Cruz-
Camarillo, 1984).
b) En virtud de que a lo largo de esta investigación hubo interferencias a 280 nm, causadas
por productos metabólicos secretados por el hongo (Clarkson y Charnley, 1996), se ensayó la
técnica de la azocaseína, que es un sustrato cromogénico. En este caso, la enzima hidroliza a la
azocaseína y libera péptidos coloreados de bajo peso molecular, los cuales alcanzan su máxima
absorbencia a 440 nm. Para este ensayo, la azocaseína fue disuelta al 2% en regulador de fosfatos
pH 7, eliminando por centrifugación, en caso de haberlos, aquellos grumos insolubles que pudieran
haberse formado. El ensayo consistió en colocar en un tubo de microcentrífuga 250 µl de sustrato y
150 µl de enzima, incubándolos a 25°C por 1 hora. Posteriormente se agregó 1.2 ml de TCA al
10%, para luego dejar reposar durante 15 min, y centrifugar a 10,000 rpm durante 5 min, agregando
después 1.4 ml de hidróxido de sodio 1.0 M a 1.2 ml del sobrenadantre obtenido, para desarrollar
23
color y así leer la absorbencia a 440 nm. Los testigos se prepararon de la misma manera que los
problemas, pero el TCA fue agregado antes que la enzima. En este caso la actividad está
expresada en unidades, siendo una unidad la cantidad de enzima que origina un cambio en la
absorbencia de 0.010 a 440 nm (Sarath et al., 1989).
2.5.2. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD QUITINOLÍTICA
Para la determinación de la actividad quitinolítica se utilizaron las técnicas que se describen
a continuación:
a) Método de los azúcares reductores. Esta técnica se basa en que la quitina, al ser
hidrolizada enzimáticamente da lugar a la formación de N-acetil-D-glucosamina (NAG), la cual
puede ser evaluada mediante su reacción con ácido 3,5, dinitrosalicílico, formando un compuesto
colorido con una máxima absorbencia a 535 nm.
Dado que las condiciones de reacción particulares para evaluar la quitinasa de P.
fumosoroseus, no fueron encontradas en la literatura, en la presente investigación se hicieron
ensayos variando temperaturas y tiempos de incubación, así como el pH de la reacción. La técnica
en general consistió en mezclar 1 ml del sobrenadante colectado con 1 ml del sustrato quitinoso. El
sustrato para este ensayo fue preparado al suspender 10 g de quitina coloidal (peso húmedo) en
100 ml de regulador de fosfatos 0.02M a pH 7, o bien en regulador citrato-fosfato, pH 5, incubando
la mezcla enzima-sustrato durante 1 h a 50°C. También la temperatura de incubación fue variada a
37 °C y los tiempos de incubación fueron de 1, 2, y 3 h. La reacción fue detenida al agregar 1 ml de
NaOH al 1%, para luego centrifugar a 10,000 rpm durante 15 min. Al combinar 1 ml de los diferentes
sobrenadantes (enzima), 1 ml de NaOH al 1% y después 1 ml del sustrato de quitina coloidal, en
ese orden, fueron preparados los testigos, que fueron sometidos a las mismas condiciones
experimentales que los problemas, esto es, el mismo tiempo y a la misma temperatura, así como la
centrifugación a 10,000 rpm durante 15 min. Luego fue tomado 1 ml de los sobrenadantes tanto de
los tubos problemas como de los testigos, para determinar los azúcares reductores (referidos como
NAG), añadiendo 1 ml del reactivo del ácido 3,5 dinitrosalicílico, y colocando los tubos en baño
24
maría a ebullición durante 5 min, diluyendo después con 2 ml de agua destilada, y enfriando al
chorro de agua de la llave, para leer la absorbencia del color desarrollado a 535 nm. Las lecturas se
interpolaron en una curva tipo de NAG (con límites de 0-5 µM/ml), para calcular la actividad como
unidades de enzima. Se consideró una unidad de quitinasa como la cantidad de enzima que libera 1
µM de NAG bajo las condiciones experimentales empleadas (Chávez-Camarillo y Cruz-Camarillo,
1984).
El ácido 3,5 dinotrosalicílico fue preparado disolviendo 5 g en 100 ml de NaOH 2N. A esta
mezcla se agregaron 150 g de tartrato de sodio y potasio disolviendo en caliente, aforando finalmete
a 500 ml con agua destilada y conservandolo en un frasco ámbar a temperatura ambiente.
b) Debido a que la actividad de quitinasa obtenida por el método de los azúcares reductores
fue muy baja en relación con el valor obtenido con la cepa de referencia Serratia marcescens WF,
para el ordenamiento final de los aislados se utilizó el método de evaluación de la producción de
quitinasa en medio liquido, usando quitina coloidal teñida como sustrato Este método tiene como
base la liberación del colorante unido a la quitina, cuando ésta es hidrolizada por la quitinasa
extracelular del hongo. Para la producción y la evaluación de la quitinasa fueron utilizados frascos
para antibióticos, conteniendo 10 ml del medio de Castañeda (sin citrato ni glicerol) con quitina
coloidal teñida al 2% (peso húmedo/volumen). Los frascos con el sustrato estéril (15 min a 121°C)
fueron inoculados con una suspensión de esporas equivalente a 106 UFC/ml, trabajando
simultáneamente con los 18 aislados. El cultivo, fue incubado en agitación a 28°C durante 13 días.
Cada 48 h se colectó un frasco para cada aislado, centrifugándo su contenido y leyendo después la
absorbencia del sobrenadante a 595 nm. Con este método fue posible llevar a cabo finalmente el
ordenamiento de los aislados fúngicos, de acuerdo con su nivel de producción de quitinasa. La
actividad se expresó en unidades, siendo una unidad la cantidad de enzima que origina un cambio
en la absorbencia de 0.010 a 595 nm (Gómez-Ramírez, 2000).
2.6. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA TOTAL EN LOS SOBRENADANTES
25
Para calcular la actividad específica de proteasa en los sobrenadantes, se determinó la
cantidad de proteína soluble en los mismos, utilizando el método de Bradford (1976), el cual está
basado en la unión de un colorante a las proteínas. El complejo colorante-proteina tiene su máxima
absorbencia a 595 nm, y las lecturas son proporcionales a la concentración de proteína. Los datos
obtenidos son interpolados en una curva tipo de albúmina sérica bovina (0-22 µg/µl). Para este
ensayo, fueron mezclados 1 ml de sobrenadante con 1 ml de reactivo de Bradford (el cual es azul
brillante G disuelto en ácido fosfórico y metanol), agitando vigorosamente en un Vórtex, y leyendo la
absorbencia a 595 nm. En el caso de esta investigación, fue necesario hacer diluciones 1:5 de los
sobrenadantes, para obtener lecturas confiables.
2.7. BIOENSAYOS PARA DETERMINAR LA VIRULENCIA DE LOS AISLADOS
SELECCIONADOS
Una vez determinados los niveles de actividad enzimática de los 18 aislados de P.
fumosoroseus, doce de ellos se seleccionaron por haber exhibido actividad alta, media y baja de
proteasa y quitinasa (dos en cada caso). Con éstos, fueron realizados los bioensayos de virulencia
en ninfas de segundo estadio de mosquita blanca (Trialeurodes vaporariorum West), estadio en el
que esta especie de homóptero es mayormente susceptible al ataque de los conidios de P.
fumosoroseus (Vidal et al., 1996).
2.7.1. SELECCIÓN, MARCADO Y DESINFECCIÓN DE LAS NINFAS EN SEGUNDO ESTADIO
Se colectaron foliolos de frijol infestados con ninfas de mosquita blanca en varios estadios
de desarrollo. Los foliolos fueron revisados bajo un microscopio estereoscópico, con objeto de
seleccionar a las ninfas que se encontrasen en el segundo estadio (ver anexo del ciclo de vida de la
mosquita blanca). En este momento del desarrollo, estos insectos se caracterizan por tener forma
de escama aplanada; generalmente son transparentes y turgentes, con patas y antenas no
26
funcionales y miden aproximadamente 0.458 x 0.307 cm en promedio, seleccionado para todos los
experimentos 25 ninfas por foliolo que tuvieran dichas características, indicadoras de que los
insectos estaban sanos. Para poder reconocer y encontrar fácilmente las ninfas seleccionadas sobre
los foliolos, se hizo una pequeña marca (generalmente un punto diminuto) con un marcador
indeleble y punto fino al lado derecho de la ninfa seleccionada, así como una marca distintiva sobre
el foliolo (→) para poder determinar cual era el lado derecho del insecto (Vidal et al., 1996).
El siguiente paso en el desarrollo del bioensayo fue la desinfección de los foliolos, los cuales
fueron cortados previamente con un bisturí estéril en discos de 3.5 cm de diámetro, donde se
encontraban las ninfas seleccionadas. La disnfección consistió en sumergir los discos en alcohol al
70% por 2 seg, posteriormente pasarlos a agua destilada estéril durante 40 seg, y después
sumergirlos en una solución de hipoclorito de sodio al 2.5% por 20 seg. Seguido de esto, fueron
sumergidos tres veces en agua destilada por 40 seg cada vez (estas fueron las condiciones de
desinfección en las que no hubo muerte de las ninfas, ya que se ensayaron diferentes
concentraciones de hipoclorito de sodio y varios tiempos de desinfección). Cuando el proceso fue
completado, se secaron sobre papel filtro estéril e infectaron con los aislados seleccionados (Vidal et
al., 1996).
2.7.2. INFECCIÓN DE LAS NINFAS CON LOS AISLADOS SELECCIONADOS
Para hacer la infección de las ninfas dos con las concentraciones de conidios a probar,
obtenidas como se describió en la sección 2.4, los conidios fueron homogeneizados por agitación en
un Vórtex durante 1 min y colocados inmediatamente en cajas de Petri estériles de 5 cm de
diámetro, y en estas suspensiones de esporas se pusieron a flotar los discos por 1 min, teniendo
cuidado que el envés del foliolo con las ninfas tuviera contacto con los conidios. Posteriormente se
pasaron a cajas de Petri conteniendo medio KNOP (en g/l: KNO3, 0.125; CaNO3, 0.500; MgSO4,
0.125; KHPO4, 0.125; agar, 23) preparado con agua desionizada para evitar el marchitamiento
prematuro de los discos recortados de los foliolos (Vidal et al., 1996).
27
En el medio de cultivo, los discos fueron colocados de manera que las ninfas quedaran
arriba y el envés fuera visible, y el haz del foliolo permaneciera en contacto con el agar. Una vez
etiquetadas y selladas con parafilm, las cajas fueron incubadas a 26°C (+/- 1°C) a una humedad
relativa de 60%, y un fotoperiodo de 16:8 de luz-oscuridad, durante 24 horas, las tapas de las cajas
fueron reemplazadas por tapas con un orificio de 1 cm de diámetro, cubierto con filtros de papel
para cafetera eléctrica, para permitir el intercambio gaseoso y favorecer el crecimiento fúngico. Se
dejaron incubar por 9 días en las condiciones descritas, registrando, al término de los cuales el
número de ninfas que quedaron en segundo estadio, cuántas habían pasado al tercero o al cuarto y
cuántas habían llegado al estado adulto. En el caso de los adultos, fue necesario buscar la pupa
vacía junto a la marca hecha previamente, para determinar que el adulto realmente hubiese
emergido de las ninfas seleccionadas. Con objeto de verificar que P fumosoroseus fuera el agente
infeccioso responsable de la muerte de las ninfas, éstas fueron pasadas a un medio de agar-agua
(23 g/l) e incubadas a las condiciones señaladas durante 5-7 días.La fuente de nutrimentos fue el
propio cadáver de la ninfa.
El registro de los resultados se hizo de tres maneras:
a) Por porcentaje de ninfas que cambiaban de estadio; es decir, registrando las ninfas que
quedaron en segundo estadio, las que pasaron al tercero y las que pasaron a cuarto.
b) Por porcentaje de ninfas muertas, comprendiendo tres categorías: 1.- Mortalidad de
ninfas en estadio dos y tres. 2.- Mortalidad de ninfas sólo en cuarto estadio. 3.- Mortalidad total
(todos los estadios).
c) Por porcentaje de adultos emergidos
Los datos obtenidos se sometieron a análisis de varianza simple (ANOVA) a un nivel de
significancia del 5%; los tratamientos fueron cinco diluciones de conidios y un testigo; cada dilución
fue repetida tres veces. El análisis fue realizado para cada estadio ninfal por separado. Las
diferencias en promedios fueron analizadas posteriormente por medio de la prueba de Tukey
(Dowdy y Wearden, 1983).
28
Por otro lado, para cada aislado ensayado se calculó la CL50 (Finney, 1974), usando los
datos de porcentaje de ninfas 2, ya que éste es el estadio en el que las mosquitas son más
susceptibles al ataque fúngico, y puede tomarse como un indicador de que realmente murieron por
micosis.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados y su discusión serán abordados en dos grandes bloques para facilitar su
análisis. Primero serán referidos los datos de los aislados con base en su producción de proteasa, y
posteriormente los de la producción de quitinasa.
3.1. SELECCIÓN DE LOS MEDIOS MÁS ADECUADOS PARA EVALUAR EN MEDIO SÓLIDO, LA
PRODUCCIÓN DE PROTEASA
En esta primera fase de la investigación, se utilizaron los siete medios de cultivo señalados
en la tabla 3 adicionados con caseína al 1%, y sólo dos aislados de P. fumosoroseus, debido a que
en el momento en que se empezaron a instaurar las técnicas de evaluación enzimática en placa, no
se contaba aún con los 18 aislados que integrarían la colección. Como testigo positivo se utilizó
Serratia marcescens WF. También se incluyeron en los ensayos los hongos entomopatógenos:
Metarhizium anisopliae, M. anisopliae var. acridum y Verticillium lecanii, ya que en la literatura se les
reporta como buenos productores de proteasa (Rosato et al., 1981). La evaluación de esta enzima
se hizo tomando como base una escala en cruces, en la que no sólo se considera el tamaño sino el
aspecto de los halos de actividad enzimática.
La selección de los medios se basó en la observación de la presencia de halos más grandes
y transparentes, producidos exclusivamente por los aislados de P. fumosoroseus. En la tabla 4 puede
observarse que los mejores medios fueron el agar de glucosa Sabouraud, y el medio H adicionados
con caseína. En ambos casos se observaron halos transparentes, con el borde exterior opaco
alrededor de la colonia, lo cual no se observó en los otros medios, donde el halo, en caso de
presentarse, era completamente opaco. Por otra parte, los halos transparentes con bordes opacos
29
también fueron producidos por los dos aislados de M. anisopliae en agar de extracto de levadura,
medio H y medio sintético con citrato y glicerol, los tres adicionados con caseína. A todos estos
halos se les asignó el valor máximo de cinco. El medio de extracto de levadura y el sintético no
fueron considerados; los medios de interés, eran aquellos en los que P. fumosoroseus presentó los
halos que indicaban de mayor actividad.
Tabla 4. Evaluación de la producción en placa de proteasa por diversos aislados fúngicos
Medio + Aislados inductor (Observaciones hechas a las 24 y 48 h) Proteasa Verticillium lecaniiVerticillium lecaniiVerticillium lecaniiVerticillium lecanii Metarhizium anisopliae Metarhizium anisopliae Metarhizium anisopliae Metarhizium anisopliae
var acridum acridum acridum acridum MMMM. anisopliae . anisopliae . anisopliae . anisopliae var anisopliae anisopliae anisopliae anisopliae
Paecilomyces fumosoroseusPaecilomyces fumosoroseusPaecilomyces fumosoroseusPaecilomyces fumosoroseus Serratia marcescens WFSerratia marcescens WFSerratia marcescens WFSerratia marcescens WF
Vl EH-438 EH-495 EH-502 EH-465
EH-172
EH-506 EH-505
Caseína+ agua
++++ ++++ - ++++ - + ++ + +++
Medio sintético incompleto+Caseína
- - - - - - - - +++
Medio sintético completo+Caseína
- - - ++ +++++ +++++ + + +++
Medio CM+ Caseína
++ ++++ ++++ - - - + - +++
Agar de Glucosa Sabouraud+Caseína
- - - +++ - ++++ +++ ++++ +++
Agar micológico+Caseina
- - - - - + - - +++
Agar extracto de levadura+ Caseína
- - ++ ++ +++++ +++++ ++ ++ +++
Medio H+Caseína
- - - ++ +++++ +++++ ++++ ++++ +++
-= no hubo halo de degradación de caseína
Cada aislado fúngico es un caso diferente, ya que ninguno presentó producción de proteasa
en todos los medios. De acuerdo con St. Leger et. al, (1997) el número y tipo de proteasas son,
30
hasta cierto punto, dependientes de la cepa. Lo contrario sucedió con Serratia marcescens WF, ya
que presentó halos de proteólisis en todos los medios, y el aspecto de los mismos fue uniforme; lo
que señala que tiene una alta producción de proteasa, validando así el ensayo y poniendo de
manifiesto la importancia del medio utilizado para la producción de proteasas fúngicas, ya que esta
depende de la composición del medio y evidencía la presencia de sistemas de regulación muy
complicados. Con respecto a esto último, puede mencionarse que se observó la presencia de halos
tanto en medios relativamente pobres, como es el caso del agar-agua con caseína, como en medios
ricos como el H o el agar de glucosa-extracto de levadura. También puede destacarse, que en todos
los medios de cultivo se observó similar crecimiento de todas las especies fúngicas. Otro aspecto
fue que no se observó una posible represión catabólica por la presencia de glucosa o aminoácidos,
como lo señalaron Clarkson y Charnley (1996), ya que en varios medios con alto contenido de
glucosa, también se produjo la proteasa; aunque es posible que la enzima se haya formado una vez
que el carbohidrato fue consumido.
Este experimento permitió la selección del agar de glucosa Sabouraud y del medio H,
ambos adicionados con caseína al 1%, para la evaluación de proteasas en placa de los 18 aislados
de P. fumosoroseus.
3.2. PRODUCCIÓN DE PROTEASA EN MEDIO SÓLIDO POR 18 AISLADOS DE P. P. P. P.
fumosoroseusfumosoroseusfumosoroseusfumosoroseus
Cada uno de los 18 aislados se sembró en los dos medios seleccionados para la producción
de proteasa y se observó y midió el halo de hidrólisis de caseína a las 24 y 48 h (figura 2). Como
testigos se utilizaron a Serratia marcescens WF y M. anisopliae var acridum EH-502 (datos no
mostrados). En esta evaluación se utilizó tanto la escala en cruces como la relación diámetro de
halo/diámetro de colonia. Los resultados obtenidos están en la tabla 5. Estas escalas no son
estrictamente equivalentes, pues en la escala en cruces se considera además del tamaño del halo
el aspecto del mismo.
31
Figura 2. Aspecto de los halos de degradación de caseína en medio H y agar de glucosa Sabouraud adicionado con caseína al 1%. El aislado con el halo transparente con bordes opacos es EH-506, los otros dos son EH-508 y EH-517; este último presentó halos muy pequeños.
Tabla 5. Evaluación en placa de la producción de proteasa, de 18 aislados de P. fumosoroseusP. fumosoroseusP. fumosoroseusP. fumosoroseus Aislado de P. P. P. P. fumosoroseusfumosoroseusfumosoroseusfumosoroseus
Agar de glucosa Sabouraud+Caseína al 1% Medio H+Caseína al 1%
Escala en cruces
Relación colonia/halo 24 h
Relación colonia/halo 48 h
Escala en cruces
Relación colonia/halo 24 h
Relación colonia/halo 48 h
1 EH-503 + 0.46 1.13 + 1.05 0.9 2 EH-504 ++ 2.8 2.8 ++ 1.9 1.5 3 EH-505 ++ 1.94 1.72 ++++ 1.01 1.31 4 EH-506 ++++ 4.34 2.26 ++++ 3.61 2.95 5 EH-507 ++ 1.17 1.3 + 1.1 1.38 6 EH-508 ++++ 1.79 1.62 ++++ 1.63 1.59 7 EH-509 ++++ 2.3 1.04 ++++ 2 1.27 8 EH-510 + 0.47 1.11 + 0.68 1.18 9 EH-511 ++ 1.16 1.21 + 1.31 1.55 10 EH-512 ++++ 1.7 1.34 ++++ 1.9 1.2 11 EH-513 ++++ 1.9 1.5 ++++ 1.3 1.52 12 EH-514 ++++ 1.67 1.67 ++ 1.71 1.08 13 EH-515 ++++ 1.45 1.65 ++++ 1.8 1.37 14 EH-516 ++ 1.2 1.31 ++++ 1.34 1.4 15 EH-517 ++ 1.07 1.52 ++ 1.3 1.23 16 EH-518 ++ 1.84 1.61 ++ 1.84 1.57 17 EH-519 + 0.97 1.07 + 0.43 0.99 18 EH-520 + 0.14 0.43 + 0.32 1.36 Con los datos mostrados en la tabla 5, se hizo un ordenamiento preliminar de los aislados,
combinando los dos criterios de evaluación, ya que en algunos casos se obtenía un valor alto entre
la relación halo/colonia, pero el aspecto del halo era completamente opaco. En el medio H esto se
observó con los siguientes aislados: EH-516, EH-504, EH-517, EH-518, EH-505, EH-507 y EH-503,
los cuales presentaron a las 24 h una buena relación halo/colonia; sin embargo, por el aspecto del
halo se incluyeron entre los de mediana producción de proteasa. Es interesante observar que con
excepción de EH-510, EH-511 y EH-520, los demás aislados presentaron un descenso en el valor
de la relación halo/colonia, debido a que la colonia creció más rápidamente que el halo a las 48 h.
En el medio de agar de glucosa Sabouraud, a las 24 h también se observó que en algunos
casos se obtenían valores altos para la relación halo/colonia, pero el aspecto de los halos era
32
opaco; los aislados fueron, EH-504, EH-518, EH-507 y EH-514. Todos, a excepción del último,
presentaron el mismo aspecto en los dos medios, y EH-504, EH-518 y EH-507 fueron agrupadas
dentro de las medianas productoras. EH-514 se consideró como baja productora. En este caso,
también se observó que en la mayoría de los aislados, agrupados como tales, menos en EH-519,
EH-515, EH-517, EH-510, EH-520, EH-507 y EH-503, la relación halo/colonia disminuyó por el
crecimiento micelial. Estos resultados reflejan la variabilidad que puede existir entre los aislados de
una misma especie.
De manera general, pudo observarse que todos los aislados presentaron un crecimiento
algodonoso, aéreo, con la punta de las hifas fácilmente apreciable a simple vista en ambos medios
de cultivo. Tomando en cuenta el aspecto del halo y el valor de la relación halo/colonia, pudo
establecerse el ordenamiento señalado en la tabla 6. También, de acuerdo con el aspecto de los
halos en los dos medios de cultivo utilizados, se seleccionó el medio H, por ser en el que se observó
una mayor producción de proteasa en menos tiempo, para utilizarse sin agar en la siguiente fase,
referente a los estudios cinéticos de producción de proteasa en cultivo sumergido, de dos aislados
con alta, dos con media y dos con baja producción de proteasa.
Tabla 6. Ordenamiento preliminar de los 18 aislados de P. fumosoroseusP. fumosoroseusP. fumosoroseusP. fumosoroseus con base en la producción de proteasa en placa
Aislado Aspecto del halo Proteolíticos altos EH-506 Transparente, con el borde exterior opaco y muy delgado EH-509 Transparente, con un borde exterior opaco y muy delgado EH-515 Pequeña franja transparente y un grueso borde exterior opaco EH-513 Pequeña franja transparente y un grueso borde exterior opaco EH-512 Pequeña franja transparente y un grueso borde exterior opaco EH-514 Pequeña franja transparente y un grueso borde exterior opaco EH-508 Pequeña franja transparente y un grueso borde exterior opaco Proteolíticos medios EH-518 Opaco, con un valor de la relación halo/colonia alto EH-503 Opaco, con un valor de la relación halo/colonia alto EH-516 Opaco, con un valor de la relación halo/colonia alto EH-504 Opaco, con un valor de la relación halo/colonia alto EH-517 Opaco, con un valor de la relación halo/colonia alto EH-505 Opaco, con un valor de la relación halo/colonia alto EH-511 Opaco, con un valor de la relación halo/colonia alto EH-507 Opaco, con un valor de la relación halo/colonia alto
33
Proteolíticos bajos EH-520 Opaco, muy pequeño EH-510 Opaco, muy pequeño EH-519 Opaco, muy pequeño
3.3. CINÉTICAS DE PRODUCCIÓN DE PROTEASA EN CULTIVO SUMERGIDO
Una vez que se seleccionó el medio H con caseína al 1% para la producción de proteasa,
se pasó a la siguiente fase, que incluyó los estudios cinéticos en cultivo sumergido con dos aislados
altos, dos medios y dos bajos productores de proteasa, previamente seleccionados a partir de los
experimentos en placa (tabla 6).
Utilizando el medio H sin agar y adicionado con caseína al 1%, se hizo un estudio cinético
con EH-506, el aislado con mayor producción de proteasa en placa, para instaurar la técnica de
producción de enzima en cultivo sumergido con los seis aislados de P. fumosoroseus. Los
experimentos consistieron en inocular con 1 x 106 conidios/ml 13 matraces de 125 ml conteniendo
25 ml de medio. Cada 24 h se colectó un matraz y se centrifugó. Después se evaluó la actividad de
proteasa en los sobrenadantes por el método de Kunitz (1947). Se encontró que las absorbencias a
280 nm de los testigos del ensayo eran muy altas (datos no mostrados), lo que se atribuyó a algún
componente del medio de cultivo, ya que éste contiene peptona y extracto de levadura, de los
cuales el primero podría haber sido utilizado por el hongo, liberando algún aminoácido aromático
cuya absorción a 280 nm podría causar interferencia en los testigos. Por esta razón, se decidió
entonces cambiar el medio de cultivo H por medio sintético (tabla 3), sin citrato ni glicerol y
adicionado con desperdicio de camarón coloidal al 13-14%. Sin embargo, a pesar del cambio de
medio de cultivo, los testigos continuaban siendo altos, lo que se atribuyó entonces a productos
metabólicos del hongo, por ejemplo la beuvericina, que en su estructura tiene anillos aromáticos que
absorben fuertemente a 280 nm. La presencia de beuvericina en filtrados de cultivos de hongos
entomopatógenos ha sido reportada por Clarkson y Charnley (1996).
34
Con el medio sintético sin citrato ni glicerol adicionado con desperdicio de camarón coloidal,
se trabajó para la producción tanto de proteasa como de quitinasa, aunque en este punto se
describirán solamente los experimentos para proteasa. Los seis aislados con los que se trabajó
fueron: EH-506 y EH-509, que fueron los dos proteolíticos más altos en los ensayos en placa, los
dos medianos fueron EH-518 y EH-517, que dentro del ordenamiento estaban en el centro y los dos
aislados seleccionados como bajos proteolíticos fueron EH-519 y EH-510.
De manera general, en los aislados se observó que el sustrato quitinoso-proteico
desapareció entre las 96 y las 120 h de incubación. También se observó un aumento en el color de
los sobrenadantes a medida que transcurrió el tiempo (figura 3), este aumento de color se debió a
que el sustrato quitino-proteico utilizado contiene carotenos, los cuales son liberados durante la
hidrólisis del mismo por las enzimas del hongo. Este es un indicador indirecto de que sí se estaba
produciendo actividad de proteasa. Cabe mencionar además que en los cultivos de todos los
aislados se observó un cambio en el pH del medio, ya que se ajustó a 7 al inicio del experimento, y
a partir de las 24 h se observó un incremento hasta 8.
Figura 3. Aspecto de los sobrenadantes de los cultivos de P. fumosoroseus en un medio conteniendo desperdicio de camarón coloidal al 13-14%. El incremento en el color amarillo se debe a la paulatina liberación de sustancias carotenoides presentes en el desperdicio de camarón. De izquierda a derecha: tiempo cero a tiempo diez del ensayo.
La actividad proteolítica de los seis aislados puede ser observada en la figura 4. Es
importante notar que los trazos de las cinéticas son muy distintos, ya que cada aislado se comporta
de una manera diferente, esto hace que los tiempos de máxima producción sean diferentes para
cada aislado. Por ejemplo, EH-506 fue un aislado en el que tanto en las placas como en el cultivo
sumergido se presentó la actividad más alta; ésta se registró a los dos días, posteriormente a los
cinco días la actividad empezó a decaer, coincidiendo con la desaparición del sustrato en el medio;
dicha disminución de actividad podría deberse a un mecanismo de regulación observado con las
proteasas de B. bassiana (Shimizu et al., 1993), que se producen en menor cantidad cuando, al
hidrolizar cutículas de insectos dejan al descubierto la quitina de las mismas. En el caso de EH-509
se obtuvo una baja actividad comparada con los otros aislados, con un máximo de actividad a los
35
siete días. Es interesante mencionar que en la mayoría de los aislados ocurrió un aumento de la
actividad proteolítica a partir de los 10 días, debida probablemente a lisis celular, que libera
sustratos proteicos al medio, los cuales promovieron nueva síntesis de enzima y el consecuente
incremento en el crecimiento.
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Tiempo (d)
UP
/ml
EH-506
EH-509
EH-518
EH-519
EH-510
EH-503
Figura 4. Cinéticas de producción de proteasa en cultivo sumergido por los dos aislados altos, dos medios y dos bajos proteolíticos en medio sintético adicionado con desperdicio de camarón coloidal.
Los otros aislados con los que se trabajó fueron, EH-518, EH-519, EH-510 y EH-503, con
los cuales tampoco se observó alguna coincidencia en los tiempos requeridos para obtener la
máxima actividad, lo que refleja la gran variabilidad interespecífica de los distintos aislados. El caso
de EH-510 sí coincidió con el ordenamiento en placa, ya que estaba considerado de baja actividad,
comparada con la de EH-506, el aislado más proteolítico. Es importante mencionar que EH-510
mantuvo una actividad más o menos constante durante todo el experimento, presentando la máxima
actividad a las 72 h. Para EH-519 y EH-503 el comportamiento fue muy interesante, ya que a pesar
de haber presentado halos pequeños y opacos, indicio de baja producción de enzima, ahora
36
tuvieron actividades medias con respecto al aislado más proteolítico (EH-506). EH-519 presentó la
máxima actividad a las 96 h, mientras que EH-503 presentó dos puntos de máxima actividad; uno a
las 120 h y otro a las 264 h. Esta variación en las cinéticas de producción de enzima, señala
nuevamente la importancia del medio y las condiciones de cultivo utilizadas; además, el incremento
de actividad observado en el cultivo sumergido, con respecto a lo observado en las placas podría
deberse a que al pasar a medio liquido, el hongo tuvo mayor contacto con el sustrato, lo que pudo
comprobarse al microscopio, ya que se apreció cómo el micelio del hongo envolvía las partículas del
desperdicio de camarón, y cómo iba disminuyendo el tamaño y la cantidad de partículas durante el
transcurso del experimento. Esto coincide con lo reportado por St. Leger et al. (1986b), quienes
observaron que la degradación de la cutícula de los insectos estaba limitada a la vecindad de las
estructuras fúngicas de M. anisopliae.
De manera general, las altas y bajas en la actividad de proteasa podrían explicarse con lo
propuesto por St. Leger et al. (1987c) y Chul-Kang et al. (1998) para M. anisopliae donde sugieren
que esto puede estar reflejando la actividad conjunta de diferentes proteasas, algunas de las cuales
pueden estar desapareciendo y/o apareciendo, conforme el hongo va degradando el sustrato.
Varias proteasas semejantes a las de M. anisopliae han sido descritas en otros hongos
entomopatógenos, y es probable que se encuentren también en P. fumosoroseus; esto ha sido
comprobado por Shimizu et al. (1993), que reportan que las proteasas de B. bassiana, P.
fumosoroseus y M. anisopliae comparten antígenos comunes. Otra posible explicación es que
existan fenómenos de regulación complejos en los aislados, así como la producción y acumulación
en los sobrenadantes de compuestos metabólicos que absorben fuertemente a 280 nm como lo
señalan Clarkson y Charnley (1996), lo que provocaría cierta interferencia en las mediciones de la
actividad, distorsionando o alterando la tendencia de los trazos.
Debido a que los trazos de las cinéticas de producción de proteasa mostraron variación en
los tiempos de máxima producción ,no pudieron establecerse los dos tiempos apropiados para
trabajar con la colección completa, y hacer su comparación, por lo que se decidió realizar estudios
cinéticos con toda la colección, considerando siete tiempos, para obtener una mayor información,
que permitiera hacer el ordenamiento definitivo de los 18 aislados. Así mismo se decidió cambiar el
37
procedimiento para evaluar la actividad enzimática, substituyendo el método de Kunitz (1947) por el
de la azocaseína, para evitar la interferencia de los metabolitos fúngicos en los testigos, y tener un
ordenamiento más confiable.
3.4. ORDENAMIENTO DE LOS AISLADOS FÚNGICOS CON BASE EN LA PRODUCCIÓN DE
PROTEASA EN MEDIO LIQUIDO
En esta fase de la investigación se trabajó nuevamente con todos los aislados de P.
fumosoroseus, utilizando azocaseína como sustrato para evaluar la actividad. Para el desarrollo de la
técnica se hicieron ensayos de la reacción de la azocaseína con la enzima. a los 15, 20 y 30 min. Se
observaron resultados adecuados a este último tiempo.Con esta técnica se eliminó totalmente la
interferencia de los metabolitos fúngicos en los testigos.
Se utilizó el medio sintético, sin citrato ni glicerol y adicionado con desperdicio de camarón
al 13-14% (peso húmedo/volumen). Las muestras se colectaron a las 24 h y después cada 48 h
hasta completar siete muestras. En este caso, una unidad de proteasa es la cantidad de enzima que
origina un cambio en la absorbencia de 0.010 a 440 nm (Sarath et al., 1989).
Las máximas actividades se registraron a las 120 o 168 h para la mayoría de los aislados,
aunque otros la presentaron a las 312 h. El aislado EH-506, produjo 39.8 UP/ml a las 120 h, y fue el
más proteolítico. El aislado que presentó la actividad más baja fue el EH-509. EH-515 no presentó
actividad a las 72 h. En general, se observaron dos tendencias en la producción de la enzima; en
algunos aislados se alcanzó un máximo de actividad y luego se registró un descenso de la misma,
por ejemplo en EH-506, EH-514, EH-508, EH-510 o EH-503. Para los aislados EH-518 y EH-519 la
tendencia fue que se alcanzó un máximo de actividad, la cual se mantuvo más o menos estable.Los
resultados reflejan la variabilidad intraespecifica de los aislados (figuras 5, 6 y 7).
38
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
24 72 120 168 216 264 312
Tie m po (h)
UP
/ml
EH-503
EH-504
EH-505
EH-506
EH-507
EH-508
Figura 5. Cinética de producción de proteasa de seis aislados de P. fumosoroseus utilizando azocaseína.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
24 72 120 168 216 264 312
Tiem po (h)
UP
/ml
EH-509
EH-510
EH-11
EH-512
EH-513
EH-514
Figura 6. Cinética de producción de proteasa de seis aislados de P. fumosoroseus utilizando azocaseína.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
24 72 120 168 216 264 312
T ie m p o (h )
UP
/ml
EH-515
EH-516
EH-517
EH-518
EH-519
EH-520
Figura 7. Cinética de producción de proteasa de seis aislados de P. fumosoroseus utilizando azocaseína.
39
En las figuras anteriores, los datos se expresaron con base en la concentración enzimática.
Sin embargo, para fines comparativos se considera más adecuado hacer la comparación con base
en la actividad específica, en donde la actividad se expresa basándose en la concentración de
proteína de las muestras. En las figuras 8, 9 y 10, puede observarse la actividad específica de la
proteasa de todos los aislados, la cual, en algunos casos como el de EH-511 presentó un punto
máximo y luego, cayó, aunque de manera general, la actividad específica observada mostró una
tendencia relativamente estable.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 24 h 72 h 120 h 168 h 216 h 264 h 312 h
Tiempo (h)
Act
ivid
ad e
spec
ífica
UP
/g
EH-503
EH-504
EH-505
EH-506
EH-507
EH-508
Figura 8. Actividad específica de proteasa de seis aislados de P. fumosoroseus.
0
50
100
150
200
250
0 24 h 72 h 120 h 168 h 216 h 264 h 312 h
Tiempo (h)
Act
ivid
ad e
spec
ífica
UP
/g
EH-509
EH-510
EH-511
EH-512
EH-513
EH-514
Figura 9. Actividad específica de proteasa de seis aislados de P. fumosoroseus.
40
0
50
100
150
200
250
0 24 h 72 h 120 h 168 h 216 h 264 h 312 h
Tiempo (h)
Act
ivid
ad e
spec
ífica
UP
/g
EH-515
EH-516
EH-517
EH-518
EH-519
EH-520
Figura 10. Actividad específica de proteasa de seis aislados de P. fumosoroseu.s
De acuerdo con estos resultados, se hizo un nuevo ordenamiento de los aislados, en el
cual EH-506 y EH-518 presentaron la actividad específica más alta, por lo que se seleccionaron
como los aislados de mayor producción de proteasa, en tanto que EH-509 y EH-503 presentaron la
actividad específica más baja, y EH-519 y EH-504 presentaron una actividad específica media.
Estos fueron los aislados que se seleccionaron para la siguiente fase de la investigación, que fue la
realización de bioensayos sobre mosquita blanca para poder establecer una correlación entre
virulencia y actividad enzimática.
3.5. BIOENSAYOS PARA DETERMINAR LA VIRULENCIA HACIA LA MOSQUITA BLANCA, DE
LOS AISLADOS SELECCIONADOS POR SU PRODUCCIÓN DE PROTEASA
Una vez que se seleccionaron los dos aislados con alta, media y baja actividad de proteasa,
se pasó a la siguiente fase de la investigación, que consistió en hacer bioensayos con ninfas de
mosquita blanca, para determinar la virulencia de cada aislado. Es importante señalar que los
experimentos se hicieron con aislados monospóricos para tener una población fúngica
genéticamente homogénea para poder evaluar su acción sobre los insectos.
41
Los bioensayos se realizaron por triplicado y en fechas distintas y los resultados
presentados son el promedio de las tres réplicas de los experimentos. Al cabo de 10 días de
incubación, que es el tiempo aproximado que tardan las ninfas en alcanzar el estado adulto, se
cuantificaron las ninfas que habían quedado en estadio dos, así como aquellas que habían pasado
a los estadios tres y cuatro, o que alcanzaron a llegar al estado adulto. En general, se observó que
las ninfas que habían permanecido en el estadio dos tenían un aspecto deshidratado, eran de color
amarillo obscuro, y muchas veces sólo permanecía su exoesqueleto sobre el foliolo, ya que al
colocar el cadáver sobre el medio de agar-agua, pudo observarse que el interior de la ninfa había
desaparecido, y que en su lugar había crecimiento micelial, permaneciendo así como momias
rellenas de hongos, como lo señalaron Goettel e Inglis (1997).
En el caso de las ninfas en estadio tres y cuatro, su aspecto era el de ninfas sanas, ya que
se veían turgentes y transparentes, y eran relativamente pocos los casos en los que se observaban
deshidratadas o con crecimiento micelial; esto ultimo sucedió sobre todo en las cajas con las
concentraciones de conidios más altas (4.7 x 106 y 4.7 x 105 conidios/ml). Con algunos aislados,
como EH-518 y EH-504 (alto y medio productor de proteasa respectivamente), las ninfas se veían
turgentes, pero con zonas oscuras, señal de melanización. Esta respuesta de los insectos a la
invasión fúngica ya fue reportada por St. Leger et al. (1986a) para Manduca sexta inoculada con M.
anisopliae.
Todas las ninfas, sin importar su aspecto, se pasaron al medio de agar-agua, para
constatar que realmente habían sido infectadas con el hongo, lo que se observó después de 5 a 7
días de incubación. Así, se observó que prácticamente todas las ninfas desarrollaban crecimiento
micelial. Cabe mencionar que el aspecto de ninfas sanas al final del experimento era propio de
aquellas que habían sido infectadas con las concentraciones más bajas de conidios (4.7 x 103 y 4.7
x 102 conidios/ml), esto coincide con lo mencionado por Vidal et al. (1996), quienes señalaron que
las ninfas se infectan en estadio dos, pero la micosis se manifiesta hasta el estadio cuatro,
presentando un aspecto de ninfas sanas hasta antes de llegar a dicho estadio. Un caso
especialmente interesante fue el del aislado que presentó la mayor actividad proteolítica, EH-506,
ya que en los foliolos tratados con las concentraciones de conidios más altas (4.7 x 106 y 4.7 x 105),
42
las ninfas prácticamente desaparecieron, y solo quedó la marca de tinta indeleble que evidenciaba
que ahí había estado la ninfa, lo que podría ser explicado con lo publicado por St. Leger et al.
(1996b), que señala que las proteasas inician la degradación cuticular de los insectos y permiten
que el hongo colonice al hospedante. Sin embargo el crecimiento micelial del aislado en cuestión
sobre el foliolo fue más bien ralo y escaso; mientras que con otros aislados con menos producción
de proteasa, por ejemplo EH-519, las ninfas se cubrieron completamente de micelio.
Algunas ninfas presentaron la tonalidad violeta-liláceo característica del crecimiento de P.
fumosoroseus, ya observada anteriormente en los experimentos en placa utilizando desperdicio de
camarón (figura 11).
Figura 11. Ninfa cuatro infectada con el aislado EH-509, en la cual se puede observar en la parte baja la tonalidad violeta liláceo (V), al término del tiempo del bioensayo.
3.5.1. PORCENTAJE DE CAMBIO DE ESTADO DE LAS NINFAS DE MOSQUITA BLANCA
TRATADAS CON LOS AISLADOS SELECCIONADOS POR SU PRODUCCIÓN DE PROTEASA
Para cuantificar la virulencia de los aislados de P. fumosoroseus, se tomó en cuenta la
concentración letal media (CL50) de cada aislado, que es la cantidad de conidios que se necesita
para matar a la mitad de los insectos a probar. Este valor se determina probando cinco
concentraciones diferentes de conidios y tomando en cuenta la mortalidad total. En este caso se
calculó tomando en cuenta sólo la mortalidad de ninfas en estadio dos, ya que era el estadio en el
que se tenía la certeza de que las ninfas estuviesen muertas, y utilizando las cinco concentraciones
de conidios. También se tomaron en cuenta las ninfas que permanecían en un estadio determinado:
así las ninfas que permanecieron en estadio dos (que no cambiaron al estadio inmediato), fueron
aquellas que murieron rápidamente después de haber sido infectadas (figura 12), esto sucedió con
las concentraciones más altas de conidios (4.7 x 106 y 4.7 x 105 conidios/ml). Sin embargo, las
ninfas que pasaron al estadio tres y cuatro lo hicieron porque no resultaron tan susceptibles al
ataque fúngico, lo cual se observó sobre todo en las concentraciones de conidios más bajas (4.7 x
102 y 4.7 x 103 conidios/ml).
43
Figura 12. Ninfa dos muerta. Obsérvese la tonalidad ámbar (A) que se presentaba, muchas veces era solamente el exoesqueleto lo que se apreciaba sobre el foliolo de frijol, a los diez días de la infección.
Para las ninfas de estadio dos, pudo establecerse de manera general con todos los
aislados, que las concentraciones de conidios más bajas (102 y 103 conidios/ml) resultaron inocuas,
ya que el porcentaje de ninfas encontradas después de 10 días de incubación fue semejante al del
testigo. Al incrementarse la concentración de conidios, a partir de 104 dicho cambio se limitó, por lo
que la diferencia de ninfas dos encontradas entre las concentraciones de conidios fue altamente
significativa (α=0.05) para todos los aislados, y casi en todos los casos las concentraciones de
conidios que limitó el cambio de estadio estuvo en el intervalo de 105 y 106 conidios/ml (figura 13 y
anexo de análisis estadístico).
0
10
2030
4050
6070
8090
100
EH-506 EH-518 EH-519 EH-504 EH-503 EH-509
Aislado
Nin
fas
que
perm
anec
iero
n en
es
tadi
o do
s (%
)
testigo
4.70E+06
4.70E+05
4.70E+04
4.70E+03
4.70E+02
Figura 13. Comparación del porcentaje de ninfas que permanecieron en segundo estadio al ser infectadas con diferentes concentraciones de conidios de aislados de P. fumosoroseus con alta (EH-506 y EH-518), media (EH-519 y EH-504) y baja (EH-503 y EH-509) actividad proteolítica, a los diez días de la infección. El aislado más virulento fue EH-506, (el cual mostró también la actividad proteolítica más
alta), pues un mayor número de ninfas permanecieron en el estadio dos, lo que muestra que como
la ninfa está ya infectada no puede pasar al siguiente estadio. Esto ocurrió aún con una
concentración baja de conidios (102 conidios/ml), donde el 36% en promedio de ninfas dos no
cambiaron de estadio (F5,12;0.05= 6.20, p<0.05; dt 5,12; 0.05=65.6). La alta virulencia de este aislado
(CL50, 1.1 x 103 conidios/ml) está demostrada por la baja concentración de conidios (103) que es
44
necesaria para matar el 50% de las ninfas infectadas. En comparación, cuando se usó la
concentración más baja de EH-504, el aislado menos virulento (102 conidios/ml) quedaron muy
pocas ninfas dos, lo que significa que la infección no fue mortal y permitió a la ninfa su cambio a
estadio tres.
Para poder calcular la CL50 de los aislados, se tuvo que comprobar que existía una
diferencia significativa (α=0.05) en el porcentaje de cambio de estadio de la ninfa dos infectada al
siguiente estadio tres, al estadio cuatro y al adulto (ver anexo de análisis estadístico) del ciclo de
vida de la mosquita blanca. Si la infección es mortal para la ninfa dos, ésta no cambia al estadio
tres, mas si la infección no es mortal, el ciclo de vida del insecto continúa y la ninfa dos cambia a
estadio tres. Como la prueba de CL50 se refiere a la concentración que mata el 50% de los insectos,
se tienen que utilizar diferentes concentraciones de conidios (106, 105, 104, 103, 102). Por lo tanto,
fue necesario preparar, para cada uno de los seis aislados seleccionados, cinco concentraciones
diferentes de conidios, e infectar con ellos ninfas dos. Luego se tuvo que verificar que había
diferencia significativa (α=0.05) en cuanto al cambio de estadio de ninfa dos a tres, para cada
aislado y cada concentración. Al haber significancia (α=0.05) en este cambio de estadio de ninfa
con las diferentes concentraciones, ya se pudo calcular la CL50 (ver anexo análisis estadístico).
Además, se calculó la CL50 en este estadio dos, ya que se tenía la certeza de que al cabo de los
diez días de duración del experimento, si la ninfa dos no había cambiado a ninfa tres era porque
estaba muerta ya que el cambio de estadio de ninfa dos a tres es aproximadamente entre tres y
cuatro días (ver anexo del ciclo de vida de la mosquita blanca). Por esto, no hay resultado para EH-
504 (figura 14), ya que no existió significancia (α=0.05) para cambios de estadio dos a tres en todas
las concentraciones estudiadas, con excepción de la concentración de 104 conidios (ver anexo de
análisis estadístico). Esto significa que este aislado es el menos virulento de todos, ya que en el
mismo tiempo, con las mismas concentraciones de conidios usadas para todos los aislados, el EH-
504 no fue capaz de matar el 50% de los insectos. Es importante mencionar que para este aislado
las ninfas presentaron manchas más obscuras, señal de que tuvieron una fuerte respuesta inmune
al ataque fúngico, fenómeno que ya ha sido reportado tanto para la langosta del desierto
Schistocerca gregaria (Bateman et al., 1996; Gillespie et al., 2000), como en otros insectos (Gillespie
et al., 1997).
45
En general, las CL50 observadas para los aislados proteolíticos estudiados fueron más bajas
que las reportadas por Vidal et al. (1997), utilizando P. fumosoroseus pero en otra especie de
mosquita blanca (Bemisia tabaci), ya que señalan haber obtenido CL50 que van desde 1.79 x 108
conidios/ml hasta 9.9 x 108 conidios/ml, mientras que con los aislados de México estudiados, la CL50
fluctuó entre 1.1 x 103 y 7.4 x 104 conidios/ml, lo que evidencia la gran variabilidad que puede haber
entre aislados de una misma especie fúngica (Brownbride et al., 2001; Vidal et al., 1997) pero
provenientes de diferentes regiones geográficas.
Para los otros aislados proteolíticos ensayados (EH-518, EH-519, EH-503 y EH-509), pudo
observarse (figura 13) una tendencia de concentración-respuesta, esto es, que a mayor
concentración de conidios, hubo una mayor cantidad de ninfas que no pasaron de estadio porque
murieron más rápidamente por la acción fúngica. Al descender la concentración de conidios, bajó
también la cantidad de ninfas que quedaron en estadio dos, permitiendo el cambio al estadio tres
del ciclo de vida de la mosquita blanca, lo que indica que no murieron de la infección. En cuanto a la
CL50, se observó que hay una relación parcial entre cantidad de enzima y virulencia, ya que
solamente el aislado considerado como altamente proteolítico (EH-506) fue también el más virulento
(0.11 x 104 conidios/ml) de todos los estudiados (figura 14). Solamente hubo diferencia significativa
(α=0.05) en la CL50 de este aislado al compararlo con los otros cuatro estudiados. Este fenómeno
coincide con lo señalado por Jackson et al. (1985) para 18 aislados de otro entomopatógeno, V.
lecanii, ya que no observaron una relación directa entre la virulencia hacia áfidos y la actividad de
proteasa del hongo. Esto también ha sido observado para M. anisopliae por Bateman et al. (1996),
ya que señalan que no hay una correlación significativa entre el tiempo letal medio (otra
determinación de la virulencia de aislados) y la actividad enzimática en la infección de este hongo en
la langosta. Estos fenómenos demuestran la complejidad de la relación hospedante/parásito, donde
intervienen factores tanto del hospedante (insecto), del parásito (hongo) y del ambiente.
Probablemente el análisis de los genes relacionados con la virulencia fúngica den la respuesta a por
qué ciertas actividades de proteasa (Pr1 para M. anisopliae, St. Leger et al., 1995) son
determinantes para el ataque a insectos, pero no necesariamente en grandes cantidades.
46
EH-506 EH-518 EH-519 EH-504 EH-503 EH-5090
10
20
30
4050
60
70
80
Núm
ero
de c
onid
ios
x 10
3 /m
l
EH-506 EH-518 EH-519 EH-504 EH-503 EH-509
Aislado
Figura 14. Comparación de la virulencia promedio de la concentración letal media expresada en conidios/ml para ninfas dos al ser infectadas con diferentes concentraciones de conidios de aislados de P. fumosoroseus con alta (EH-506 y EH-518), media (EH-519 y EH-504) y baja (EH-503 y EH-509) actividad proteolítica, a los diez días de la infección.
El siguiente estadio ninfal cuantificado fue el de ninfa tres, ya que si las ninfas dos lograban
pasar de estadio, éste era el siguiente, o bien podían pasar luego al estadio cuatro o hasta adulto.
De manera general, se observó que sólo un porcentaje relativamente pequeño de insectos llegaron
al estadio tres (figura 15), ya que la mayoría o murieron en el estadio dos, o bien alcanzaron el
estadio cuatro, dependiendo de la concentración de conidios que se estuviera trabajando. En el
caso de las ninfas tratadas con los aislados EH-506 y EH-518 (altos productores de enzima) sólo un
porcentaje pequeño de ninfas llegó al estadio tres, y no con todas las concentraciones de conidios
(figura 16). Al estudiar el aislado EH-504, (producción media de proteasa), no se observaron ninfas
tres y para los aislados con menor producción de proteasa (EH-503 y EH-509), se observaron
porcentajes bajos de ninfas tres en todas las concentraciones de conidios ensayadas (5 al 33%).
47
Figura 15. Ninfa tres infectada. Nótese el color ambarino del exoesqueleto (CA); en la mayoría de los casos se observaban momias rellenas de hongos.
0
10
20
30
40
50
EH-506 EH-518 EH-519 EH-504 EH-503 EH-509
Aislado
Nin
fas
que
perm
anec
iero
n en
es
tadi
o tr
es (%
)
testigo
4.70E+06
4.70E+05
4.70E+04
4.70E+03
4.70E+02
Figura 16. Comparación del porcentaje de ninfas que permanecieron en tercer estadio al ser infectadas con diferentes concentraciones de conidios de aislados de P. fumosoroseus, con alta (EH-506 y EH-518), media (EH-519 y EH-504) y baja (EH-503 y EH-509) actividad proteolítica, a los diez días de la infección. Con EH-504 no hubo ninfas de tercer estadio, ya que todas pasaron a ninfas cuatro.
El último estadio de desarrollo antes de llegar a ser adultos, es el de ninfa cuatro. Este caso
también fue cuantificado, ya que las ninfas que lograron cambiar, en su mayoría alcanzaban este
estadio (figura 17). Para los aislados probados, el porcentaje de cambio observado fue inverso al de
las ninfas dos; ésto es, que a mayor concentración de conidios (106 y 105), había una menor
cantidad de ninfas que alcanzaban el cuarto estadio, ya que éstas murieron poco después de tener
contacto con el hongo, y a medida que la concentración de conidios disminuyó, la cantidad de ninfas
que llegaron al último estadio aumentó (figura 17). Como era de esperarse, el aislado más
proteolítico, EH-506, no permitió que una gran cantidad de ninfas llegaran al último estadio, lo que
indica la alta virulencia de este aislado, ya que mata una gran cantidad de ninfas dos, aun con las
concentraciones más bajas de conidios, lo que no sucedió con el resto de los aislados. Por el
contrario, uno de los aislados con actividad proteolítica media (EH-504), no impidió que una gran
cantidad de ninfas (más del 50% para todas las concentraciones de conidios) llegaran al último
estadio; lo que sugiere que los conidios de este aislado son prácticamente inocuos para las ninfas
de mosquita blanca.
48
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
EH-506 EH-518 EH-519 EH-504 EH-503 EH-509
Ais lado
Nin
fas
que
alca
nzar
on e
n cu
arto
est
adio
(%
)
testigo y adultos
4.70E+06
4.70E+05
4.70E+04
4.70E+03
4.70E+02
Figura 17. Porcentaje de ninfas que alcanzaron el cuarto estadio al ser infectadas con diferentes concentraciones de conidios de aislados de P. fumosoroseus, con alta (EH-506 y EH-518), media (EH-519 y EH-504), y baja (EH-503 y EH-509) actividad proteolítica, a los diez días de la infección. Las barras de color verde indican el porcentaje de emergencia de adultos cuantificado como pupas vacías de ninfas cuatro.
Con los otros aislados con que se trabajó, se observó una clara tendencia al aumento de
ninfas cuatro, conforme descendían las concentraciones de conidios utilizadas; en este caso, con
excepción de EH-503, todos los aislados tuvieron diferencias significativas (α=0.05) entre la
cantidad de ninfas cuatro obtenidas para cada concentración de conidios utilizada, es decir, que
mientras menos conidios, más ninfas cuatro.
Es interesante que todos los aislados probados exceptuando a EH-504, mostraron una alta
actividad patogénica cuando fueron utilizados en concentraciones superiores a los 104 conidios/ml.
En el caso de EH-504, sin embargo, prácticamente todas las concentraciones fueron inocuas. Esto
podría ser explicado parcialmente por la susceptibilidad de los insectos hacia cierta cantidad de
esporas en los diferentes estadios ninfales, como lo señalaron Brownbride et al. (2001) para las
ninfas de T. vaporariorum en segundo estadio al ser infectadas con Aschersonia aleyrodis. Otro
aspecto a tomar en cuenta es que los aislados de alta capacidad proteolítica mostraron también alta
virulencia (expresada como CL50). Este comportamiento puede atribuirse parcialmente a dicha
enzima, como lo señalan St. Leger et al. (1986b-1996a) para M. anisopliae. Sin embargo, en el caso
de los otros aislados, no pudo observarse una disminución proporcional de la virulencia (expresada
49
como CL50), al utilizar aislados con producción media o baja capacidad proteolítica, lo que podría
explicarse tomando en cuenta que la interacción hospedante-parásito es una relación sumamente
compleja, que involucra muchos otros factores y no sólo la producción de enzimas. En estos
términos, las variaciones de virulencia para M. anisopliae fueron explicadas por Gillespie et al.
(1998) al observar que puede haber diferencias entre la cantidad, tipo y carga de las enzimas, así
como el grado de endurecimiento de la cutícula del hospedante, dependiendo de la cercanía en
tiempo de la muda, lo que influye en la degradación cuticular del insecto por aislados de una misma
especie, y así las propiedades de las enzimas que degradan la cutícula pueden no ser las óptimas
para todos los hospedantes, lo que es probable que suceda en otros hongos entomopatógenos
tales como P. fumosoroseus.
3.5.2. PORCENTAJE DE MORTALIDAD POR ESTADIOS PARA LAS NINFAS TRATADAS CON
LOS AISLADOS SELECCIONADOS POR SU PRODUCCIÓN DE PROTEASA
Otra manera de analizar los datos obtenidos, consistió en tomar en cuenta las ninfas
muertas al final de los 10 días de incubación y ordenarlas en tres grupos de acuerdo con lo
propuesto por Vidal et al. (1996). La razón de tomar en cuenta los datos de mortalidad total, en
lugar de los datos de mortalidad por micosis fue que al terminar los 5 días de incubación de las
ninfas en agar agua, prácticamente todas las ninfas desarrollaban un crecimiento fúngico, por lo que
los porcentajes de mortalidad por micosis fue de casi el 100% para todos los aislados (datos no
mostrados).
El primer grupo de mortalidad fue el que comprendió a las ninfas de segundo y tercer
estadio; estas últimas se consideraban muertas al presentar crecimiento micelial. Para el caso de
los aislados proteolítcos seleccionados, los porcentajes obtenidos fueron muy semejantes a los
observados con las ninfas dos en la evaluación del porcentaje de cambio de estadio, ya que la
mortalidad para ninfas dos y tres, en las concentraciones altas de conidios, se presentó un mayor
número de muertes, mientras que con las concentraciones más bajas, el porcentaje de muertos fue
muy semejante al obtenido para el testigo (figura 18), lo que señala que es necesaria una cierta
cantidad de conidios para que los insectos sean susceptibles al ataque fúngico y dicha
50
susceptibilidad aumenta conforme aumenta también la cantidad de conidios. Nuevamente, el aislado
con el que se observó una mayor mortalidad fue con EH-506, el proteolítico más alto, ya que con
una de las concentraciones de conidios más bajas (103), se observó un porcentaje de mortalidad de
más del 60%. En el caso de EH-504, se observó una mortalidad baja de ninfas dos en todos las
concentraciones de conidios probadas, lo que indica que dichas concentraciones fueron inocuas
para las ninfas tratadas con este hongo. En el resto de los aislados pudo observarse que conforme
disminuía la cantidad de inóculo, disminuía también la cantidad de muertos.
0
1020
304050
6070
8090
100
EH-506 EH-518 EH-519 EH-504 EH-503 EH-509
Aislado
Mor
talid
ad d
e ni
nfas
dos
y tr
es (%
)
testigo
4.70E+06
4.70E+05
4.70E+04
4.70E+03
4.70E+02
Figura 18. Comparación del porcentaje de ninfas que murieron en segundo y tercer estadio al ser infectadas con diferentes concentraciones de conidios de aislados P. fumosoroseus, con alta (EH-506 y EH-518), media (EH-519 y EH-504), y baja (EH-503 y EH-509) actividad proteolítica a los diez días de la infección.
La mortalidad observada en el testigo de EH-519 es semejante a la observada en algunas
de las concentraciones de conidios, aunque esto probablemente se debió al manejo de los foliolos o
bien al proceso de desinfección, por lo que fue necesario hacer un procedimiento estadístico, que
fue la corrección de Abbott (1925), para que los datos fuesen válidos.
El siguiente grupo de mortalidad que se tomó en cuenta fue la registrada sólo para ninfas
en cuarto estadio, tomando como ninfas muertas a aquellas que presentaran crecimiento micelial o
51
esporulación al cabo de los 10 días de incubación. Para los aislados seleccionados, los porcentajes
más altos de ninfas cuatro muertas se obtuvieron con las concentraciones más bajas de conidos
(102 y 103 /ml), mientras que los porcentajes más bajos fueron los que se observaron en las
concentraciones más altas, esto es, que a mayor concentración de conidios/ml hubo una menor
cantidad de ninfas que llegaba a estadio cuatro. En el caso de los aislados EH-506 y EH-509 (alta y
baja producción de proteasa respectivamente) no hubo ninfas cuatro muertas, ya que la mayoría de
las ninfas que se encontraban tenían un aspecto turgente y transparente como si estuvieran vivas;
mientras que para el resto de los aislados las ninfas cuatro muertas no rebasaron el 60%; tomando
como 100% las 75 ninfas infectadas con cada concentración de conidios a probar Sin embargo, las
diferencias entre las concentraciones de conidios y la cantidad de ninfas cuatro muertas en cada
una de ellas no fueron significativas. En el caso del testigo tratado sólo con agua destilada, no se
observaron ninfas cuatro muertas. Al pasar las ninfas problema al agar agua, pudo observarse
crecimiento micelial en prácticamente todas.
El último grupo de mortalidad tomado en cuenta, fue la total, que incluyó la de todos los
estadios (segundo, tercero y cuarto). En este caso, los aislados EH-519 y EH-503 (media y baja
producción proteolítica respectivamente), no presentaron diferencias significativas (α=0.05) entre las
concentraciones de conidios/ml y la mortalidad total registrada en cada una de ellas. En todos los
aislados, con excepción de EH-504 (con actividad de proteasa media), la mortalidad total no rebasó
aproximadamente el 30% para todas las concentraciones de conidios (figura 19). Contrario a lo que
podría esperarse, EH-506 (actividad proteolítica alta), no fue el aislado que produjo una mayor
mortalidad total, ya que no hubo ninfas cuatro muertas. Otro caso interesante es el de EH-503, que
con una baja producción de proteasa pero alta producción de quitinasa, también mostró una
mortalidad total muy alta. En EH-506, EH-518 y EH-509 se pudo observar una tendencia a la
relación concentración respuesta, ya que a mayor cantidad de conidios, mayor mortalidad total.
52
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
8 0
9 0
1 0 0
EH- 5 0 6 EH - 5 1 8 EH- 5 1 9 EH - 5 0 4 EH- 5 0 3 EH - 5 0 9
A is la d o
Por
cent
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l
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4 .7 0 E+ 0 6
4 .7 0 E+ 0 5
4 .7 0 E+ 0 4
4 .7 0 E+ 0 3
4 .7 0 E+ 0 2
Figura 19. Comparación del porcentaje de mortalidad total de ninfas infectadas con diferentes concentraciones de conidios de aislados de P. fumosoroseus, con alta (EH-506 y EH-518), media (EH-519 y EH-504) y baja (EH-503 y EH-509) actividad proteolítica.
3.5.3. PORCENTAJE DE EMERGENCIA DE ADULTOS DE LAS NINFAS TRATADAS CON LOS
AISLADOS SELECCIONADOS POR SU PRODUCCIÓN DE PROTEASA
Otro dato registrado fue el porcentaje de emergencia de adultos, ya que se consideró al
principio de los bioensayos que a mayor cantidad de adultos presentes, la virulencia sería menor,
pues las ninfas habrían logrado alcanzar su estado adulto. Sin embargo, fueron muy pocos los
adultos encontrados al ensayar todos los aislados, aún en las concentraciones más bajas. Pudo
observarse que las ninfas cuatro ya estaban en la fase de pseudopupa, en la cual ya se podían ver
los ojos y alas del adulto a través de la cutícula de la ninfa, lo que indicaba que en cuestión de horas
el adulto emergería.
Se observó con EH-506 (actividad proteolítica alta), la ausencia de adultos, sin embargo,
algunas ninfas cuatro estaban ya en la fase de pseudopupa, a punto de eclosionar como adulto. En
el testigo se observó la mayor presencia de adultos, lo que confirmó que las ninfas seleccionadas
para los bioensayos habían sido insectos sanos que pudieron completar su desarrollo.
3.6. SELECCIÓN DE LOS MEDIOS MÁS ADECUADOS PARA EVALUAR, EN PLACA, LA
PRODUCCIÓN DE QUITINASA
53
En esta fase de la investigación, se trabajó también con los siete medios de cultivo
señalados en la tabla 3, a los cuales se les agregó desperdicio de camarón coloidal al 13-14% (peso
húmedo/volumen), o quitina coloidal a la misma concentración, resultando un total de 15 medios que
contenían inductores para quitinasa. Al igual que ocurrió en el caso de la proteasa, en el momento
que comenzó a instaurarse la técnica de evaluación en placa, no se contaba con los 18 aislados que
integrarían la colección de trabajo, por lo que se iniciaron las evaluaciones en placa con solo 2
aislados de P. fumosoroseus, esperando hacer una selección del medio más adecuado para las
posteriores evaluaciones con los 18 aislados. Como testigo positivo se utilizó nuevamente a Serratia
marcescens WF, debido a que es un extraordinario quitinolítico, y también se incluyeron a las mismas
especies fúngicas, usadas para la evaluación de proteasa, ya que se les reporta también como
quitinolíticos (Rosato et al., 1981). La evaluación se hizo con una escala en cruces, basándose en el
tamaño relativo de los halos transparentes alrededor de la colonia.
En la tabla 7 puede observarse que los mejores medios para la producción de quitinasa por
P. fumosoroseus fueron, el agar-agua adicionado con desperdicio de camarón, y el medio sintético
con la misma adición. En ambos casos se observó la solubilización de las partículas del sustrato
alrededor de las colonias. Es interesante mencionar que en los otros medios, en los que se
encontraban otras fuentes de carbono o nitrógeno, además de la quitina coloidal o el desperdicio de
camarón coloidal, no se observó actividad. Además el crecimiento micelial en aquellos medios
donde se presentó actividad quitinolítica, fue ralo y escaso; mientras que en los medios que tenían
otras fuentes de carbono y nitrógeno, el crecimiento fue más abundante y con un aspecto más
algodonoso, lo que fue debido probablemente a que el hongo no precisaba usar el sustrato
quitinoso, ya que en términos energéticos es más fácil para el organismo utilizar los otros
nutrimentos presentes en el medio, o bien, se observó algo semejante a los señalado por Askary et
al. (1999) para V. lecanii en el sentido de que las características de crecimiento están relacionadas
con las actividades enzimáticas y la virulencia. Otro aspecto a considerar es que el microorganismo
de referencia, S. marcescens WF creció en todos los medios, y en todos ellos produjo halos grandes y
transparentes de actividad quitinolítica, lo que validó el experimento. Una vez que se seleccionaron
el agar-agua con desperdicio de camarón, y el medio sintético adicionado con desperdicio de
camarón, como los mas propicios, se trabajó con ellos para la evaluación en placa de la quitinasa de
54
los 18 aislados de P. fumosoroseus. Con los resultados obtenidos se hizo un ordenamiento preliminar
de los aislados y se seleccionó un solo medio de cultivo, para utilizarlo, sin agar, para los estudios
cinéticos posteriores en cultivo sumergido.
55
Tabla 7. Evaluación de la producción de quitinasa en placa por diversos aislados fúngicos, utilizando distintos medios de cultivo Medio + Aislados inductor (Observaciones hechas a las 48 y 72 h) Quitinasa Verticillium lecaniiVerticillium lecaniiVerticillium lecaniiVerticillium lecanii Metarhizium anisopliae Metarhizium anisopliae Metarhizium anisopliae Metarhizium anisopliae
var acridumacridumacridumacridum M. anisopliae M. anisopliae M. anisopliae M. anisopliae var anisopliaeanisopliaeanisopliaeanisopliae
Paecilomyces fumosoroseus Paecilomyces fumosoroseus Paecilomyces fumosoroseus Paecilomyces fumosoroseus S. marcescensS. marcescensS. marcescensS. marcescens WF
Vl EH-348 EH-495 EH-502 EH-465 EH-172
EH-506 EH-505
Desp. camarón + agua
+++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++++
Quitina+agua
++ ++ ++++ ++++ - - ++++ - +++++ Medio sintético incompleto+ desp. camarón
+++ ++++ +++ +++ ++++ ++++ +++ +++ +++++
Medio sintético incompleto+ quitina
++ ++++ ++ ++ - - +++ ++ +++++
Medio sintético completo+ desp. camarón
+++ ++++ - - +++ +++ +++ ++ +++++
Medio sintético completo+ quitina
+ + - - - - +++ + +++++
Medio CM+ Desp. camarón
- - - - ++ ++ - - +++++
Medio CM+quitina
- - - - - - -- - +++++
Agar de Glucosa Sabouraud+ desp. camarón
- - - - - - - - +++
Agar de Glucosa Sabouraud+ quitina
- - - - - - - - +++
Agar micológico+ desp. camarón
+ + - - - - - - +++
Agar extracto de levadura+ desp. camarón
- - - - - - - - +++
Agar extracto de levadura +quitina
- - - - - - - - +++
Medio H+desp. camarón
- - - - - - - - +++
Medio H+quitina - - - - - - - - +++ - = no hubo halo de hidrólisis del sustrato quitinoso
56
3.7. PRODUCCIÓN DE QUITINASA EN MEDIO SÓLIDO POR 18 AISLADOS DE P. fumosoroseusP. fumosoroseusP. fumosoroseusP. fumosoroseus
En esta fase de la investigación, ya se había reunido la colección completa de aislados de
P. fumosoroseus, de modo que los 18 aislados se sembraron en agar-agua y en el medio sintético sin
citrato ni glicerol, ambos adicionados con desperdicio de camarón y agar. Los halos de hidrólisis se
evaluaron a las 48 y 72 h. Como testigos se utilizaron a S. marcescens WF y a M. anisopliae EH-465
(datos no mostrados). En este caso, se utilizó para evaluar la actividad una escala en cruces y la
relación diámetro de halo de quitinólisis/diámetro de colonia. Los resultados obtenidos están en la
tabla 8.
Tabla 8. Evaluación en placa de la producción de quitinasa de 18 aislados de P. fumosoroseusP. fumosoroseusP. fumosoroseusP. fumosoroseus Aislado de P. P. P. P. fumosoroseusfumosoroseusfumosoroseusfumosoroseus
Agar agua + desperdicio de camarón al 13-14 %
Medio sintético de Castañeda+ desperdicio de camarón al 13-14 %
Escala en cruces
Relación colonia/halo 48 h
Relación colonia/halo 72 h
Escala en cruces
Relación colonia/halo 48 h
Relación colonia/halo 72 h
EH-503 +++ 1.4 1.2 ++++ 4.7 1.4 EH-504 + 1.7 1.3 ++ 1.4 1.9 EH-505 +++ 2.8 1.5 ++++ 4 5.2 EH-506 +++ 2.8 1.8 ++++ 4.3 1.4 EH-507 + 2.4 1.4 ++ 2.3 1.7 EH-508 + 1.8 2.25 +++ 4.25 2 EH-509 + 2.4 2.4 ++++ 2.5 1.7 EH-510 + 3 1.3 + 1.2 1.6 EH-511 +++ 4 1.5 ++ 2.8 1.6 EH-512 +++ 1.8 2.3 ++ 2.4 1.5 EH-513 - 0 0 ++++ 4.25 1.3 EH-514 + 1.9 1.1 ++++ 4.25 1.8 EH-515 +++ 2.4 1.1 ++ 2.7 1.3 EH-516 + 3 1.3 ++++ 4 2 EH-517 +++ 1.6 1.2 ++ 2.5 1.2 EH-518 + 3 1.4 +++ 2.6 1.25 EH-519 + 1.6 1.4 +++ 2.3 1.5 EH-520 + 2.8 1.5 ++ 1.4 2.7
En general, el crecimiento micelial observado en ambos medios de cultivo fue ralo y
compacto (figura 20), además en la mayoría de los aislados se observó con el paso del tiempo, la
formación de un pigmento violeta-liláceo en el revés de la colonia, debido probablemente a la
acumulación de productos metabólicos, como puede ser el caso de pigmentos. El testigo S.
57
marcescens WF mostró un gran halo de hidrólisis desde las 24 h y M. anisopliae EH-465 presentó
también un gran halo a partir de las 48 h.
Figura 20. Aspecto de los halos de quitinasa de aislados de P. fumosoroseus en medio sintético sin citrato ni glicerol y adicionado con desperdicio de camarón al 13-14% (peso húmedo/volumen).
En el medio agar-agua con desperdicio de camarón, siete de los 18 aislados mostraron una
buena producción de quitinasa; otros diez presentaron una baja actividad en tanto que el aislado
EH-513, no presentó ninguna actividad. En el caso de la escala numérica basada en la relación de
diámetro de halo/diámetro de colonia, no se observaron aislados con producción media; sin
embargo el aspecto del halo sí permitió ordenar los aislados en intermedios, altos y bajos
quitinolíticos. Cabe mencionar que la relación halo/colonia fue más alta a las 48 que a las 72 h,
para 16 de los 18 aislados, lo que puede deberse a que en cierto momento el crecimiento micelial
fue más rápido que el crecimiento del halo de hidrólisis.
Por otro lado, en el medio sintético adicionado con desperdicio de camarón, pudo
observarse una buena producción de quitinasa de casi todos los aislados, sin embargo, la relación
58
halo/colonia disminuyó a las 48 h con excepción de EH-505, en el cual se observó un aumento en el
diámetro del halo con respecto al diámetro de la colonia.
Tabla 9. Ordenamiento de los 18 aislados de P. fumosoroseusP. fumosoroseusP. fumosoroseusP. fumosoroseus con base en su producción de quitinasa en placa
Aislado Aspecto del halo Quitinolíticos altos EH-506 Transparente, relación halo/colinia alta EH-509 Transparente, relación halo/colinia alta EH-510 Transparente, relación halo/colinia alta EH-505 Transparente, relación halo/colinia alta EH-513 Transparente, relación halo/colinia alta EH-519 Transparente, relación halo/colinia alta Quitinolíticos medios EH-516 Ligeramente opaco, relación halo/colinia alta EH-514 Ligeramente opaco, relación halo/colinia alta EH-508 Ligeramente opaco, relación halo/colinia alta EH-518 Ligeramente opaco, relación halo/colinia alta EH-504 Ligeramente opaco, relación halo/colinia alta EH-512 Ligeramente opaco, relación halo/colinia alta EH-515 Ligeramente opaco, relación halo/colinia alta EH-520 Ligeramente opaco, relación halo/colinia alta EH-511 Ligeramente opaco, relación halo/colinia alta Quitinolíticos bajos EH-507 Opaco, difícil de apreciar, relación halo/colonia alta EH-503 Opaco, difícil de apreciar, relación halo/colonia alta EH-517 Opaco, difícil de apreciar, relación halo/colonia alta
A partir de los datos obtenidos en estos experimentos, se escogió el medio sintético
adicionado con desperdicio de camarón al 13-14% (peso húmedo/volumen) como el más propicio
para emplearse en la siguiente fase del trabajo, que incluyó estudios cinéticos de la producción de
quitinasa en cultivo sumergido, por los dos aislados más quitinolíticos, los dos intermedios y los dos
más bajos productores de la enzima.
3.8 CINÉTICAS DE PRODUCCIÓN DE QUITINASA EN CULTIVO SUMERGIDO
Tomando como base los datos mostrados en la tabla 9, se procedió luego a realizar
estudios cinéticos utilizando el medio sintético sin citrato ni glicerol y adicionado de desperdicio de
camarón al 13-14%, escogiendo los seis aislados siguientes: como altos EH-506 y EH-509; como
59
medianos EH-514 y EH-516; y como bajos EH-503 y EH-517. En la figura 21 se muestran las
respectivas cinéticas de producción de quitinasa por los aislados referidos.
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Tiempo (d)
UQ
/ml
EH-516
EH-506
EH-509
EH-503
EH-514
EH-517
Figura 21. Cinéticas de producción de quitinasa en cultivo sumergido determinado por el método del DNS para dos aislados altos, dos medios y dos bajos quitinolíticos, en un medio sintético adicionado con desperdicio de camarón coloidal.
De manera general, pudo observarse que el sustrato quitino-proteico desapareció
aproximadamente a las 120-144 h en todos los casos, también pudo observarse una elevación del
pH del cultivo, el cual había sido ajustado a 7 y aumentó a 8, y así permaneció hasta el final del
experimento.
En los resultados mostrados en la figura 21 puede observarse una actividad quitinolítica
muy baja; en la que ninguno de los aislados alcanza al menos 1 UQ/ml. Una unidad de quitinasa es
la cantidad de enzima necesaria para producir 1µM de NAG/ml al cabo de una hora de incubación.
Esto hace dudar de que los ensayos previos en placa hubieran mostrado realmente una actividad de
quitinasa. Probablemente los halos encontrados mostraban la acción conjunta de proteasa y
quitinasa, y quizá mas de la primera que de la segunda. Cabe aclarar que en estos ensayos se
incluyó a S. marcescens WF y este microorganismo dio altos valores de quitinasa (datos no
mostrados); lo que indicó que no se estaban haciendo mal las determinaciones. Por lo tanto hubo
que considerar que el ensayo con DNS es poco sensible para evaluar muy bajas cantidades de
quitinasa; por esa razón se decidió usar la técnica propuesta por Gómez-Ramírez (2000), para
60
seleccionar cepas quitinolíticas de Bacillus thuringiensis, las cuales poseen también muy baja
actividad. Dicha técnica sirvió para realizar el ordenamiento de los aislados.
3.9 ORDENAMIENTO DE LOS AISLADOS FÚNGICOS CON BASE EN LA PRODUCCIÓN DE
QUITINASA
Debido a que los valores de la actividad de quitinasa obtenidos con el método de los
azucares reductores fue muy baja y esto dificultaba un adecuado ordenamiento de los aislados con
base en su capacidad para producir dicha enzima, se decidió utilizar el método de la quitina coloidal
teñida con azul brillante de remazol, ya que es más sencilla y sensible, y permite detectar de
manera confiable la actividad quitinolítica por muy baja que ésta sea. Otro inconveniente fue que a
partir de los resultados obtenidos en los estudios cinéticos evaluando con el método del DNS, no
pudieron establecerse dos tiempos de máxima actividad, debido a la gran variabilidad de resultados
entre aislados de una misma especie, por lo que se hizo un estudio cinético de la producción de
enzima, colectando los sobrenadantes de los cultivos a las 24 y luego cada 48 h hasta completar 13
días, para obtener mayor información y hacer un ordenamiento más confiable.
La absorbencia de los sobrenadantes colectados se leyó directamente a 595 nm y
posteriormente se hizo la conversión a UQ/ml, en este caso 1UQ/ml es la cantidad de enzima
necesaria para provocar un cambio de 0.010 en la absorbencia. Los resultados obtenidos están en
las figuras 22, 23 y 24, donde puede apreciarse que los tiempos de máxima producción de quitinasa
fueron a las 264 y 312 h en la mayoría de los aislados, lo que coincide con lo señalado por Chul-
Kang et al. (1998), quienes reportan que M. anisopliae produce las actividades mas altas de
quitinasa al final de crecimiento, al cultivar el hongo en quitina coloidal como única fuente de
carbono y de nitrógeno. Así mismo, puede observarse que los dos aislados con mayor actividad
fueron EH-503 y EH-509. Debido a que el sobrenadante obtenido es de color azul, no se pudo
determinar la cantidad de proteína para luego calcular la actividad específica, ya que el reactivo de
Bradford (1947) tiene también su máxima absorbencia a 595 nm.
61
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
24 72 120 168 216 264 312
Tie m po (h)
UQ
/ml
EH-503
EH-504
EH-505
EH-506
EH-507
EH-508
Figura 22. Cinética de producción de quitinasa de seis aislados de P. fumosoroseus utilizando quitina coloidal teñida.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
24 72 120 168 216 264 312
Tie m po (h)
UQ
/ml
EH-509
EH-510
EH-511
EH-512
EH-513
EH-514
Figura 23. Cinética de producción de quitinasa de seis aislados de P. fumosoroseus utilizando quitina coloidal teñida.
01020
3040506070
8090
100
24 72 120 168 216 264 312
Tie m po (h)
UQ
/ml
EH-515
EH-516
EH-517
EH-518
EH-519
EH-520
Figura 24. Cinética de producción de quitinasa de seis aislados de P. fumosoroseus utilizando quitina coloidal teñida.
62
De acuerdo con estos resultados, los dos aislados con actividad quitinolítica más alta fueron
EH-503 y EH-509, los medios EH-510 y EH-511, y los más bajos EH-520 y EH-516. Estos seis
aislados se seleccionaron para la siguiente fase de la investigación, que fue el establecer una
correlación entre la producción de enzimas y la virulencia, mediante la realización de bioensayos.
3.10. BIOENSAYOS PARA DETERMINAR LA VIRULENCIA HACIA LA MOSQUITA BLANCA DE
LOS AISLADOS SELECCIONADOS POR SU PRODUCCIÓN DE QUITINASA
De la misma manera que con los aislados seleccionados por su actividad proteolítica,
aquellos dos con alta, media y baja actividad de quitinasa, se pasó a la siguiente fase de la
investigación, que fue la realización de los bioensayos con mosquita blanca. En este caso, no pudo
contarse con el cultivo monospórico de EH-510 (producción media de quitinasa), por lo que dicho
aislado no se incluyó en las pruebas de virulencia. Para los aislados ensayados, de manera general,
se observaron las momias rellenas de hongos para las ninfas que quedaron en estadio dos al final
del tiempo de incubación del experimento, y para los estadios tres y cuatro, la mayoría de las ninfas
tenían un aspecto sano. Sin embargo, al pasarlas al agar-agua presentaban signos evidentes de
micosis. En el caso del aislado EH-511 (producción media de quitinasa), pudo observarse la
presencia de adultos muertos colonizados por el hongo.
3.10.1. PORCENTAJE DE CAMBIO DE ESTADIO DE LAS NINFAS DE MOSQUITA BLANCA
TRATADAS CON LOS AISLADOS SELECCIONADOS POR SU PRODUCCIÓN DE QUITINASA
En el caso de estos aislados también se tomó en cuenta la CL50 para cuantificar la virulencia
de P. fumosoroseus sobre las ninfas en estadio dos. Al igual que con los aislados seleccionados por
su producción de proteasa, las ninfas estadio dos infectadas con las concentraciones de conidios
más altas (4.7 x 106 y 4.7 x 105), murieron rápidamente después de tener contacto con el hongo;
mientras que las que fueron tratadas con las concentraciones más bajas de conidios lograron
alcanzar los estadios tres o cuatro, lo que señaló que las ninfas no resultaron tan susceptibles al
ataque fúngico producido por dichas concentraciones de conidios.
Para las ninfas en estadio dos, los aislados que mostraron resultados congruentes con la
hipótesis de trabajo fueron EH-503 y EH-509, ya que eran los aislados con la mayor actividad
63
quitinolítica, y fueron los que limitaron el cambio de estadio de las ninfas cuando se usaron las
concentraciones de conidios de 105 y 106 (ya que las ninfas dos infectadas morían inmediatamente
después de tener contacto con el hongo (figura 25). En cuanto a los testigos tratados sólo con agua
destilada, prácticamente todas las ninfas lograron cambiar a estadio tres, cuatro o llegar a adulto.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
EH-503 EH-509 EH-511 EH-516 EH-520
Aislado
Nin
fas
que
perm
anec
iero
n en
est
adio
do
s (%
)
testigo
4.70E+06
4.70E+05
4.70E+04
4.70E+03
4.70E+02
Figura 25. Comparación del porcentaje de ninfas que permanecieron en segundo estadio al ser infectadas con diferentes concentraciones de conidios de aislados de P. fumosoroseus, con alta (EH-503 y EH-509) media (EH-511) y baja (EH-516 y EH-520) actividad quitinolítica, a los diez días de la infección. En todos los aislados seleccionados por su actividad quitinolítica pudo observarse también
la tendencia lineal de concentración-respuesta; esto es, que a mayor cantidad de inóculo, mayor
cantidad de ninfas que morían y quedaban en el estadio dos.
Las concentraciones letales medias observadas (figura 26), fueron también las esperadas
de acuerdo con los niveles enzimáticos para casi todos los aislados seleccionados, lo que coincide
con lo reportado por Jackson et al. (1985), en cuanto a que existe una correlación entre la
producción de quitinasas extracelulares y la virulencia de V. lecanii hacia el áfido Macrosiphoniella
sanborni. La excepción fue EH-511 que presentó la CL50 más baja (0.069 x 105) de todos los
aislados ensayados, esto es, que mata la mitad de los insectos con una cantidad menor de conidios;
y por consiguiente fue la más virulenta. Estos datos muestran la relevancia de la determinación de la
virulencia por la variabilidad que puede haber entre aislados de una misma especie.
64
EH-503 EH-509 EH-511 EH-516 EH-5200
20
40
60
80
100
120
Núm
ero
de c
onid
ios
x 10
3 /m
l
EH-503 EH-509 EH-511 EH-516 EH-520
Aislado
Figura 26. Comparación de la virulencia promedio de la concentración letal media expresada en conidos/ml para aislados de P. fumosoroseus con alta (EH-503 y EH-509), media (EH-511), y baja (EH-516 y EH-520) actividad quitinolítica.
Al igual que con los aislados seleccionados por su producción de proteasa, las CL50
obtenidas para los aislados seleccionados por su capacidad quitinolítica fueron más bajas que las
reportadas por Vidal et al. (1996) para aislados de P. fumosoroseus, lo que muestra la mayor
virulencia de los aislados estudiados.
En el caso de las ninfas tres, los porcentajes de insectos que quedaron en ese estadio
fueron semejantes, ya que con ninguna concentración de conidios las ninfas tres alcanzaron el 35%
de cambio (figura 27). De hecho, con el aislado EH-520 no se presentaron ninfas tres, con las
concentraciones de conidios probadas, siendo éste el aislados menos virulento. En el único aislado
en el que pudo observarse una relación concentración-respuesta fue en EH-509, ya que a mayor
concentración de conidios, menos ninfas tres; sin embargo, en ninguno de los casos se observaron
diferencias significativas (α=0.05) entre el número de insectos obtenidos al tratar las ninfas con
diferentes concentraciones de conidios (ver anexo de análisis estadístico). Es importante mencionar
que en los testigos se pudo observar un porcentaje bajo de ninfas tres, ya que la mayoría
65
alcanzaron el final del ciclo de vida de la mosquita blanca, esto es, ninfa cuatro a punto de cambiar
a adulto.
0
10
20
30
40
50
EH-503 EH-509 EH-511 EH-516 EH-520
Aislado
Nin
fas
que
perm
anec
iero
n en
es
tadi
o tr
es (%
)
testigo
4.70E+06
4.70E+05
4.70E+04
4.70E+03
4.70E+02
Figura 27. Comparación del porcentaje de ninfas que permanecieron en tercer estadio al ser infectadas con diferentes concentraciones de conidios de aislados de P. fumosoroseus, con alta (EH-503 y EH-509) media (EH-511) y baja (EH-516 y EH-520) actividad quitinolítica, a los diez días de la infección. Por otro lado, en las ninfas que alcanzaron el cuarto estadio, que es el último antes de que
los insectos lleguen a adultos, pudo observarse la tendencia descrita para los aislados
seleccionados por su actividad de proteasa, es decir, que a mayor cantidad de inóculo, menor
cantidad de ninfas llegaban a cuarto estadio, y conforme disminuía la concentración de conidios
aumentaba la cantidad de ninfas que podían llegar hasta el estadio cuatro (figura 28). A este
respecto, todos los aislados con excepción de EH-503, tuvieron diferencias significativas (α=0.05)
entre la cantidad de ninfas cuatro para cada concentración utilizada (ver anexo análisis estadístico).
66
010
2030
40
50
6070
80
90
100
EH-503 EH-509 EH-511 EH-516 EH-520
Aislado
Nin
fas
que
alca
nzar
on e
l cua
rto
esta
dio
(%)
testigo y adultos
4.70E+06
4.70E+05
4.70E+04
4.70E+03
4.70E+02
Figura 28. Comparación del porcentaje de ninfas que alcanzaron el cuarto estadio al ser infectadas con diferentes concentraciones de conidios de aislados de P. fumosoroseus, con alta (EH-503 y EH-509) media (EH-511) y baja (EH-516 y EH-520) actividad quitinolítica, a los diez días de la infección. La barra de color verde indica la cantidad de adultos emergidos cuantificados como las pupas vacías en estadio cuatro de las ninfas seleccionadas.
De manera general, pudo observarse claramente una relación entre la virulencia y la
capacidad de producción de la enzima si únicamente se toman en cuenta los aislados con alta y
baja producción de quitinasa, ya que los primeros tienen una CL50 menor que los segundos, lo que
coincide con lo que señalan El-Sayedet et al. (citado por Khachatourians, 1992), para Nomuraea
rileyi. Sin embargo, esto no se cumple con el aislado que tenía una producción media de quitinasa,
ya que éste presentó la mayor virulencia (expresada como CL50) de todos los aislados estudiados
por su producción de quitinasa (figura 26), lo que señala nuevamente la variabilidad que puede
existir entre aislados de una misma especie fúngica.
3.10.2. PORCENTAJE DE MORTALIDAD POR ESTADIOS DE LAS NINFAS TRATADAS CON
LOS AISLADOS SELECCIONADOS POR SU PRODUCCIÓN DE QUITINASA
Los porcentajes de ninfas de mosquita blanca que murieron durante los experimentos se
registraron de la siguiente manera: la mortalidad de ninfas en estadio dos y tres, la mortalidad de
ninfas en estadio cuatro y la mortalidad total de los tres estadios.
67
En el caso de la mortalidad de ninfas en estadio dos y tres, los resultados obtenidos fueron
muy semejantes a los del porcentaje de cambio de las ninfas dos, ya que casi en todos los aislados
se observó una relación directa concentración-respuesta, pues a mayor cantidad de conidios, mayor
mortalidad; solamente en la concentración de 104 de EH-516 ( producción baja de quitinasa), se
observó un valor de mortalidad semejante al del testigo (figura 29). En todos los aislados, hubo una
diferencia significativa entre la mortalidad de las ninfas tratadas con cada concentración de conidios.
En todos los casos la concentración que provocó un mayor número de ninfas muertas en estadio
dos y tres fueron 106 y 105 conidios/ml.
0
10
20
30
40
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60
70
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EH-503 EH-509 EH-511 EH-516 EH-520
Aislado
Mor
talid
ad d
e ni
nfas
dos
y tr
es (%
)
testigo
4.70E+06
4.70E+05
4.70E+04
4.70E+03
4.70E+02
Figura 29. Comparación del porcentaje de mortalidad de ninfas dos y tres al ser infectadas con diferentes concentraciones de conidios de aislados de P. fumosoroseus, con alta (EH-503 y EH-509) media (EH-511) y baja (EH-516 y EH-520) actividad quitinolítica a los diez días de la infección.
El siguiente grupo de mortalidad fue la registrada para ninfas en estadio cuatro, tomando
como ninfas muertas las que presentaban crecimiento micelial (figura 30) o esporulación al término
de los 10 días de incubación del bioensayo. Para las ninfas tratadas con los aislados seleccionados
los resultados fueron muy interesantes, ya que con excepción de EH-503 (producción alta de
quitinasa), no hubo una gran cantidad de ninfas cuatro muertas, ya que la mayoría de las ninfas
habían muerto muy poco tiempo después de haber sido infectadas, y habían quedado en estadio
68
dos. Al pasar las ninfas que alcanzaron el estadio cuatro y que aparentemente estaban sanas a
agar-agua, se observó crecimiento micelial prácticamente en todos los casos (figura 31). Gillespie et
al. (1997), trabajando con otro hongo, M. anisopliae, observaron que al infectar ninfas dos de
langosta (Orthoptera: Acrididae), la infección se desarrolla hasta el cuarto estadio del insecto. Este
mismo fenómeno se pudo observar infectando T. vaporariorum con los aislados de P. fumosoroseus
estudiados.
Figura 30. Ninfa cuatro con hifas (H) emergiendo del cadáver.
Figura 31. Adulto infectado (AI) emergiendo de una ninfa cuatro aparentemente sana, pero que fue pasada a agar-agua al término del bioensayo para constatar que había sido susceptible al ataque fúngico. La mortalidad total fue la última evaluada, y para los aislados seleccionados, con excepción
de EH-503 (mayor actividad quitinolítica), se presentó una tendencia directa entre la cantidad de
inóculo y la mortalidad total, ya que a mayor cantidad de conidios era mayor la mortalidad total
encontrada (figura 32). Para todos los aislados, las concentraciones de 105 y 106 conidios/ml fueron
las que provocaron la mayor cantidad de muertos y sí hubo diferencia significativa (α=0.05) entre las
concentraciones de conidios y el número de ninfas muertas (ver anexo de análisis estadístico).
0
10
20
3040
50
6070
80
90
100
EH-503 EH-509 EH-511 EH-516 EH-520
Aislado
Mor
talid
ad to
tal (
%) testigo
4.70E+06
4.70E+05
4.70E+04
4.70E+03
4.70E+02
Figura 32. Comparación del porcentaje de mortalidad total de las ninfas de mosquita blanca al ser infectadas con diferentes concentraciones de conidios de aislados de P. fumosoroseus, con alta (EH-503 y EH-509), media (EH-511), y baja (EH-516 y EH-520) actividad quitinolítica, a los diez días de la infección.
69
3.10.3. PORCENTAJE DE EMERGENCIA DE ADULTOS DE LAS NINFAS INFECTADAS CON
LOS AISLADOS SELECCIONADOS POR SU PRODUCCIÓN DE QUITINASA
El porcentaje de emergencia de adultos fue otro dato registrado, pero al igual que con los
aislados seleccionados por su capacidad proteolítica, el porcentaje de adultos observado también
fue muy bajo, y en algunos casos emergían, pero infectados por el hongo (figura 33). Sin embargo,
pudo observarse que las ninfas cuatro estaban en la fase de pseudopupa, último subestadio antes
de llegar a adulto; en este momento se observaban ya a través de la cutícula de la ninfa las
características del adulto, como los ojos y las alas. Debido a que este estadio (ninfa cuatro) es muy
corto, es probable que con unas horas más de incubación del bioensayo se observara una mayor
cantidad de insectos en ese estadio. En el grupo donde se observaron más fue en los testigos, lo
que nuevamente confirmó que las ninfas que se seleccionaron para los experimentos estaban sanas
y llegaron hasta el fin de su desarrollo.
Figura 33. Adulto con la micosis desarrollada emergiendo al final del tiempo de incubación del bioensayo. 3.11. RELACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE PROTEASA Y QUITINASA CON LA
VIRULENCIA DE P. fumosoroseusP. fumosoroseusP. fumosoroseusP. fumosoroseus
Los aislados que presentaron la mayor virulencia (EH-506 y EH-511, figuras 34 A y 35 A) en
el modelo estudiado, presentaron un máximo de actividad de proteasa a las 120 h de la cinética
enzimática (con 40 UP/ml para EH-506 y 15 para EH-511). El máximo de la actividad de la quitinasa
llegó a 40 UQ/ml en ambos casos, sin embargo, en el primer caso, el aumento se dió a las 312 h de
la cinética y en EH-511 a las 168 h (figuras 34 B y 35 B).
70
EH-506 EH-503 EH-5160
20
40
60
80
100
120
Núm
ero
de c
onid
ios
x 10
3 /m
l
EH-506 EH-503 EH-516
Aislado
0102030405060708090
100
24 72 120 168 216 264 312
Tiem po (h)
UP
/ml
0102030405060708090100
UQ
/ml
Prot. EH-506
Quit.EH-506
Prot-EH-503
QuitEH-503
ProtEH-516
QuitEH-516
Figura 34. Relación entre la actividad de proteasa y quitinasa con la virulencia de P. fumosoroseus. A) El aislado con una alta virulencia es EH-506 (CL50 de 1.1 x 103 conidios/ml), el de la virulencia media es EH-503 (CL50 de 20 x 103 conidios/ml) y el de baja EH-516 (CL50 de 110 x 103 conidios/ml). B) La actividad de proteasa de EH-506 se presentó a las 120 h. En el caso de los aislados que mostraron una virulencia media (EH-503, figura 35 A con
una CL50 de 25 x 103 conidios/ml y EH-509, figura 36 Acon una CL50 de 27 x 103 conidios/ml), la
actividad de proteasa estuvo siempre por debajo de 10 UP/ml y no se observó ningún aumento de
actividad, en cambio, la producción de quitinasa en EH-503 fue mayor, pero hasta las 264 h, con 90
UQ/ml (figura 34 B). Esta tendencia se puede apreciar también con EH-509, ya que presentó una
gran cantidad de quitinasa (71 UQ/ml), a las 216 h del experimento (figura 35 B). El otro aislado con
virulencia media fue EH-518, figura 36 A (CL50 de 14 x 103 conidios/ml), presentó un máximo de
actividad de proteasa a las 120 h, con 20 UP/ml, y una actividad de quitinasa muy alta (62.3 UP/ml),
figura 36 B, pero también hasta las 312 h del cultivo al igual que los otros aislados con virulencia
A
B
71
media (EH-503 y EH-509). Es interesante mencionar que EH-518 comenzó con una actividad de
quitinasa relativamente alta a las 24 h con respecto a los otros aislados (20 UQ/ml), la cual
descendió a las 72 h y luego comenzó a incrementarse nuevamente hasta el final del experimento
(figura 36B).
72
EH-511 EH-509 EH-5190
1020304050
607080
Núm
ero
de c
onid
ios
x 10
3 /m
l
EH-511 EH-509 EH-519
Aislado
0
10
20
30
40
50
60
70
80
24 72 120 168 216 264 312
Tie m po (h)
UP
/ml
0
10
20
30
40
50
60
70
80
UQ
/ml
Prot. EH-511
Quit.EH-511
Prot-EH-509
QuitEH-509
ProtEH-519
QuitEH-519
Figura 35. Relación entre la actividad de proteasa y quitinasa con la virulencia de P. fumosoroseus. A) El aislado con una alta virulencia es EH-511 (CL50 de 6.9 x 103 conidios/ml), el de la virulencia media es EH-509 (CL50 de 27 x 103 conidios/ml) y el de baja EH-519 (CL50 de 74x103 conidios/ml). B) La máxima actividad de quitinasa de EH-511 se presentó a las 168 h. El aislado que mostró la menor virulencia (EH-516), con una CL50 de 110 x 103 conidios/ml
(figura 34 A), no presentó ningún aumento de actividad de proteasa temprano, sino tardío, hasta las
312 h de la cinética, con una baja actividad, de 17 UP/ml, sin embargo, sí mostró un pico de
actividad de quitinasa a las 120 h, pero llegando a un máximo de 25 UQ/ml hasta el final de la
cinética a las 312 h (figura 34 B). El otro aislado que presentó una virulencia baja fue EH-520 (CL50
de 76 x 103 conidios/ml, figura 36 A), el cual tuvo un máximo de actividad de proteasa baja (15
UP/ml) hasta las 216 h de la cinética y en el caso de la quitinasa, la mayor actividad se observó
hasta las 312 h del experimento, con apenas 27 UQ/ml (figura 36 B).
A
B
73
EH-518 EH-520 EH-5040
10203040506070
80
Núm
ero
de c
onid
ios
x
103 /
ml
EH-518 EH-520 EH-504
A is lad o
0
10
20
30
40
50
60
70
24 72 120 168 216 264 312
Tiempo (h)
UP
/ml
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
UQ
/ml
Prot. EH-518
Quit.EH-518
Prot-EH-520
QuitEH-520
ProtEH-504
QuitEH-504
Figura 36. Relación entre la actividad de proteasa y quitinasa con la virulencia de P. fumosoroseus. A) El aislado con una alta virulencia es EH-518 (CL50 de 14 x 103 conidios/ml), el de la virulencia media es EH-520 (CL50 de 76 x 103 conidios/ml) y el de baja EH-504 (la CL50 no pudo ser calculada). B) La máxima actividad de quitinasa de EH-518 fue alas 120 h
Un caso interesante fue el de EH-504 (figura 36 A), ya que no fue lo suficientemente
virulento como para matar a la mitad de las ninfas en el tiempo que duró el experimento, por lo que
la CL50 no pudo ser calculada. La actividad de proteasa fue relativamente baja (11 UP/ml) y se
mantuvo sin aumentos durante toda la cinética, mientras que la actividad de quitinasa casi alcanzó
las 50 UQ/ml, pero tardíamente a las 312 h del experimento (figura 36 B).
A
B
74
Estas figuras (34, 35 y 36) muestran la aparición de las dos enzimas relevantes en el inicio
del mecanismo de patogenicidad de hongos entomopatógenos, actuando a diferentes tiempos, lo
que ya ha sido demostrado para este tipo de organismos, pero en otras especies como Metarhizium
y Beauveria (Bidochka y Khachatourians, 1988; Charnley y St. Leger, 1991; Smith y Grula, 1983).
Estos resultados sugieren la importanica de la aparición temprana de un máximo de actividad de
proteasa o quitinasa, y una alta actividad de quitinasa más tardíamente en la virulencia de P.
fumosoroseus en el insecto, T. vaporariorum.
4. CONCLUSIONES
Se llegó a las siguientes conclusiones:
Los resultados obtenidos con diferentes aislados de P. fumosoroseus en la infección de la
mosquita blanca T. vaporariorum, sugieren que los aislados más virulentos son los que presentan un
máximo de actividad inicial de enzima, ya sea proteasa o quitinasa en los primeros tiempos de la
cinética (entre 120 y 168 h), por lo que en el modelo estudiado, se observó una relación entre
virulencia y actividad enzimática.
Existe una gran variabilidad en la virulencia de los aislados de una misma especie, lo que
sugiere la participación de otros factores de virulencia, pero también señala la importancia de la
proteasa y la quitinasa para la penetración fúngica, o sea el inicio del mecanismo de patogenicidad.
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