protoplast culture.pdf

16
" CHAPTER Protoplast Culture and Somatic Hybridization U.K. Tomar 1* and P.K. Dantu 2 1 Arid Forest Research Institute, New Pali Road, Jodhpur342005 2 Depts. of Botany, Dayalbagh Educational Institute, Dayalbagh, Agra282 005 E-mail: [email protected] * Corresponding author In plants, where fairly distant species could be crossed, it has always not been possible to obtain full hybrids between desired individuals because of sexual incompatibility barriers. This has often proved to be a serious handicap in crop improvement programs through hybridization. With the ability of isolating protoplasts from plant cells using enzymes in the early 1960 by E. C. Cocking, the interest in genetic modification of somatic cells in higher plants has developed. Within a decade, Takebe et al. (1971) regenerated completes plants from leaf protoplasts of tabacco increased the potential of prtoplast culture techniques. Not only isolated protoplasts but their fusion product, a somatic hybrid, can also be regenerated into whole plants. Plant protoplasts can also take up foreign DNA, through their naked plasma membrane, under specific chemical and physical treatments. Protoplasts also provide an experimental system for a wide range of biochemical and molecular studies ranging from investigations into the growth properties of individual cells to membrane transport. Present chapter describes the methods of protoplast isolation, purification, culture techniques as also protoplast fusion techniques and somatic hybrid selection procedures. 1. PROTOPLAST ISOLATION The term protoplast refers to the spherical plasmolysed content of plant cell enclosed by plasma membranes or naked cell without cell wall. Before going into the details about 2nd Proof 31/5/8

Upload: yasuf-ali

Post on 21-Jan-2016

55 views

Category:

Documents


1 download

DESCRIPTION

Protoplast Culture

TRANSCRIPT

��� � � � � � �

����������������� ��������

������������

������������ ������� ���

������������ ����������������� ����� ������������������ ��!��"�#�� �$�� $ �% &��'��� ���� ����������� $ �% &����&� ��(�����

')* ��+��,��* �- "��!�!��

������������� �����

����� ����������� � ������ �������������������������� ��� �� �� �������������������� ����� �� ������������������������ ��� ������ ����������� �� ����� ������� ����������� �������������� ������ � �������� �� �� �� ����� ���������������� ��� ������������ ������������� ����������� ����������� ����������� ���������������������������� ���� !"#����$��������%����������������������������� ���������� ������������������� ���� ���������������� ��� ���� %�����������& !' (�������� ��������������� ����������� �������� �������� � �������� ������������� ����������� ����������������)����

*�������� ��� ���������� �������� ����� �������������� � ��� ��������� � �� ������������� ��������������� �����+� ���������� ����� �� ����� %������������,*-��������������� %���� �� ������ ��������������������� �� ������� ����� ��������+������ ���� ��������� ����������� ������������� ����� �������������� �� ��������� ��������� ��������������� ������������������������������������ ���������������� ����� �������

+������� �� ����� �������� ���� ������� ��� ������� ��� ��� ����� ����� ����� ������������)���� �� ����������� ��������������)���� ����� ���������������������������

�� �����������������

���� ������������ ��� ������� ��� ���� ������ ���� ��������������������� ��� ����� ������������ �� ������ ���� ��� � %�� ����� ������� ����� � ���� .������ ����� ���� ���� �� ��� ����

2nd Proof 31/5/8

����������������� �������������������� ���

2nd Proof 31/5/8

������� ������������ �� �� ����� ������ ��� ��� ��������� �� ��)��%��� ����������� ���� ����/����������� ��������� ����������� ���� ��� �������������� ���� ��0����� �� �� ������ ���������

������������������

1����%���& 2!3(�� ����������������� ���������� ����������� �������������������������������������������������� ���������������������� ������� �������������������������������4� ����������������� �#�5������������������������� ��������%� � ���������������������� �� ������������� ��������������� ���������� ��� ���%���� ������� ����%������� ���������������� ���� �������������� � ��������������� ���� �������������������� ������������� ������������ ������������� ������ ��������� ���� ������ ����� ��� �� ������������ ���� ���������������&6��� (�

��� ������������������

��������������������������������������������������������� ����������� ����������� ������� �������������� ������������������ ������� ��������� ���������������������������� �������� �����/�������� �������������� ������� ����������7��������������������������������������� ������ ���������)���������������� ���������� ���������������%���& !"#(��7��������� ������������ ������� � ��������������������������������������������������������� ��� �� ���� ��� ���� ������� ���� ����� ��� ��� ������� 8 ���� ���� ������ ���� ��� ������� ����� �� ����� ������ �������� � �� ����� ����������� ���� ��� ������ ������ �����%�������������� ��������������������� �� ����������������&����������(����� �� ���9�����������&��)���� �������(�

��� ��������������������������� ���� ��� ��� ���������� ��������� �������������� ������������������ ��� ������� ��������� ������������������������9������������������ ���������� ��������� ��������������������������� ��� ������������������������������ ����� ������������������� ��� ������ ���������� ����

-������� �������������������������� ������ �������� ��������������� �� ���� �� � ���������������������������� �� ������ ������������������4����� ���� ����������� �� �������� ������������:���� ����;#��5�� ��3��� ��������� ��������� ������������ ��

Fig. 1. When tissue is cut at the dotted lines (A) with a sharp razor blade, some cells release uncut completeprotoplast and rest of the cells produced broken dead protoplasts as shown in Figure 1B marked with stars (*).

Cut

A B

��� �������� ���������������� �������

2nd Proof 31/5/8

������� ���� &<����� !2#(�� ���� ������� �������� �� ������ �������� �������� � #�=;>� ���������� ��� ���������� ������ ���� ���� �� ��������� �� ��� ����� ���� ���� ����� ������� ����������� �������������������

���������������������

���� ����������� �������� ��� ������� ���� ��)����� � ����� ����� ���� ��� �� ��� �� � ���������� ���� �� � ���� ����� 4�� ���� ������� ���� ��)���� ��� ��� ������ ��� �������� ������������ ��� ��&����(��������������� ���� ����������

���� ���!"�#$����%�������

,������ ���������������������������� �������������������������������� � ������������ ������������������������ ##>�����������$������ �� ��������������������� ����������� ������������ ��"##���������;�������������������� ��������������������������������������������������� ���������� � ��� ������������� ������������ �������������������� ���� ��� �������9���������� �� �������������� ���� ����������������������������������������������� ��� ��� � ����� �������� ���� ���������� �� ���������� � �� ��� ������� ���������� ���� ������� �������������� ������� �������������� �������������� ��������������� �������������������������������

���� ���!&$�'���$���(�����

��� ��� ������� ���� ��� ��� � ��� ����� ���� ���%��� ������ ��� ��������� ���� ������� ������ � ������3#9=#?����������������� ���������� ���� ��@;#�������������������������� ��������� ������������ ��������������������������������� �� ���� ������������������� �������&:������� �����%���� !";A�+����� �����%���� !'#A�$� ����������� !'3(�

4����%� ��7����� ��� & !' (����� ������ �������������8 �%�� & !'"(����������������� ���� ����� ���� ��� ������� ���� ��� ���������� #�;9@�#� �������� ��� ����� ������� ������ � ���� ����� ����� ���� ��������������������������� �� � �������� ����������� �� ������������������ ������� ��;#93##������� ����� #�������������������� ������������ �� ������������������������������� ������������� ����������������������������&6���3-(������������ ���� ������������������������� ������� �� �������������&6���3.(�

�$���(����)��#�������%����*�����$�����������

��� ��� ������������������������ ������������� ��)� ������������#� ?�� ��������������������� ��� ����;�������� �� ������������������ ��������������������������������� ���������������� ��������� ������� �� �%�

�$���(����)��#�����

6���������� ��� ���&6,-(����������� �������&;���B�(��� ������������ �������������������� ��� ���������� �������#�# ?��-�����;�������� ������������� ���������������� ���� ���� ��������������������������������C����� ����������� ����� ����������

����������������� �������������������� ���

2nd Proof 31/5/8

��������������+�,��������������������"��)��&����-

��� ������ ������������� ����������� ����� �� �������� ��� ��� �� � ���� ���� ����� ��������� ���� ��� ��������� &������ ���������� ������� ��������� �������� �� ������ ��� ��(�5 ����������������������������������������������������������������� � ������� �������������&������ ��������� ������������� ���������� �������������������� ��(������������� ��������������������������� ���������)���� ���������������������-�� ������������������������������� ���� ������������ ����� �������7�&;92(��������������� �������������� ������������� �� �� ������� ���� ��������������������������������� �������������� ����� �������7�� �������������������� ����������������������������� ��������������������� ��������� ��������������� �����+������ ������� ������������������ DD���5�DD� ���������� ���� ����� � ���� ���������� ��� ������� ���� ������ ��� ���������� ������ ��������� ��������������������&<����� !2#(�

����������������

-������ ��������������������� ���� ����������� �� �%������������,���������������� ������������������������������� ���������� ����

.�(�������.��.$�

�������������������� ���� ������������� ��)����������� ���� ������������ ����������������+������ ���� �� ���������� #;B���������� ������ ������3;9;#�������������� �$������������ �%��������������� ����� %���������������������������� �� ���������������4���������� %���� ��� ���������������������� ����������������� %�����)�������� ����������������������� � �����$� ��� �����%���& !';(������������ ��3����������������������� ����������������������3;������ �%������ ��� ��� �� �����E ���& !'"(������������� ������� ������ ��� ������������%����������� ���� ��� ���� �� �������� ��������������������

Fig. 2B. Purified protoplast population

BFig. 2A. Purified Protoplast ring formation and debris

get settled at the bottom

Enzyme solution

Purified proplasts

Lymphprep

Debris

A

��� �������� ���������������� �������

2nd Proof 31/5/8

,��/��/"$�( ����%

1 �� ������������������������ ����������������� !'#������� �������)��������������������&. � � ���������� !' (���������������� ��������������������� ���� �� ��������� #=B��� ��� #;B��� ���� ��� ��;#�>������� ���� ����+������ ����� �� �������� � ���� ����� ����� ���������������� ��3;9@#F�����������������������& ##9;##����(���������� �%��-����������� ���������� ���� �������� ������������������������������� ����� %������������������������ ������������������������������������ �� �������������� ���&E ���� !'"(�

�/�$������/ ����%

������������ ��������� ������������������������.���� ���& !"#(���������� ���������������� ���� ���� ��� ��� ������������������������������ ��������������* � � � ��� % ��& !' (������� /��� � �� ������� ���� �����)��� ��0� &(� � � ������������������������� ����� ��������� ��������� ��&(��� �������������� �������������� �����-������� ����������� /���� �� �%�������������)������� �� ������������ ������������� ��� ����������������������������������� ����� ���������� ��������� ��������� ������� ����������� �%������������ ������������������ ������������9�����7��������������������� ��������������� �������������%����� � ��&�������������� ���� ������������� ���(� ��� ������������������������������ ������������������� ��������������� �����������������)���� ���������������������� �������� �������������)������������������������������ ��� �����������&< ������� ���� !'@(�� ��������������&.������� !'2(�� �� �������������� �� ��&+����%������ ���� !'!(�

��$��.��.$�������0.�

���������)��������������G�������� ���& !"#(����������������� ���������� ���������E �� ��7����� ���& !";(����� ������ ������ ������������ ����������5�����������������)���� ������������������������������������������� ���������� ���� ����������&,�� ����� ���� !'@(��-������������������������ ����������������������� ������������� ����������������C�������������������������������� ���%��������������������-����������������������������������������������������������� ���������������

.���%$�(�$$��1 "�2������0.�

������ ������������������������ ��������������� �� ������������������� ������������� ������ �� �� ������� �� � ������ &��� ��� =!##(� ����� �� ��� ������ ��� �� ��� � ��� �&+����%������ ���� !'!(

��������������+����������������

4����������������� ��������� �������������� ����������������� ������������ ������� ��������������� ������������������ ��������������������������

����������������� �������������������� ���

2nd Proof 31/5/8

�����(�������%)�$������

����� ���������������� ����� �������������� ��������������������� ������ ������������ �������������������������������

������/���%�$/��

-� ������ ����� ��� � ����� ���� ���� ����������� �������� �� ���� ��� ��� ���� ����� �� ��� ����������� ���� ���������������� �������������� ������������������ ����������� ��������������� ��� ����� ���������� ��� ����� ���� ��������� �������� ��� ������� ��� �������%��� ���������� �����/������������������� ������� ��� ��� �������������������� ��������� ��������� ����� ���� ������� ���� ��� ��� ����� ������ � ���� ��� ��� ���������� �� ����������������+� ���������� ����� ������������������������������ ��������� ����������� ������������

�$��.��.$����%������

.����� ���� � ������ �������� ����� ���� ��� ����� ��� ������� ���� �� �������� �� ����������������� ��� ��� � ������ ������ �������� ���������,�������� �������� ����������������������������� ����� �����������������������������������

�$��$����������������.�3&�!�$�����������!�$���(�����

+����� ������� ����� �� ���� ��� ������� �� ��������� �� �������� ��� ������ ��� ���� ��������� ���������� ��������������������� ����������� ���� ��������� �������������

�.�$���������0.�$�����!�$�$���(�����

*������ ����)��������������������������������� ������������������������� ����)������������������ ����������������+������ ������ %������������ ������� ���������������� ����� ����������������� ��� ���� �������� ��� �� ���������������������� ��������� ��������������4������������� ������������������ ���������������� ������������� ���� ��������������� ������������������ ������������������������������� ��������������������� ����������������������������� ��������&1 �� ��5���� ��%� !';(�

�$���(�����"������

+������ ��������������������� �� �������������������� ������������� �������������������������� ������������ ��� ��������������������� �������������������� ������������ �������������������������� ������������������� ����������������� ������� �������������� ���� %������ ������������������� ���������)������� ����������� %��������������-����� ������������ ������������� ��������������� ���������)������������������ ����� ���������������������� ������������ �� ������������)������������&5���������� ���� !'2(�

����������������� ����,-&��"�4�����

-�� �� ��� ������ � ��� �� ������� ����� � ��� �� �� ����� ������� ��� ����� ������ .��� ��� ��������� ������������������������������ ����������� ������������������ ����������������

��� �������� ���������������� �������

2nd Proof 31/5/8

������ ������������������������ �� ������ ����-��������������������������������)�������������� ������������ �������� ���������������������������� ��������� ������������+������ �������������������������������� ��� �������� �� �� �� ������� �������� ��� ������ ���� �������������������� ��� �������� ���� �������0� &(�������� ��� ��� ����&(�������� ����������&(���������������� ���������� ��&�(��������������� ������������������ �������������� �����,������������������������� ��������� �������������.������� ��,����& !2"(������������� ���������� �������� ������������������� ��������0�& (����� DD� �������7�� &�(��������������������� &+$:(�� �� &�(� �������� �����8��� ����� �������� ������ ������������ ������������� ����������������������������������������������������������� ����������������4��� ������� ����������������� ��������������� ���� ������������������������������������� ������������������������ ��� ����� ������������������������ ������������������������������������� �����������%������ ����% �����-�������������������������������� ����� � ������ ���� �������% �����

,�/���55��%,�/�(,��%.��%�$���(�����.����

+���� ������ ����������������� ������������ ������������������7��������������� ��������������� ��������������� ���� ����0�&(������� ��� �������� ������ ����������������� ������ ���� �����������������������%����������������� ����� ��&(� �� ��������� ���������� ���������������������� �������������� ��������� ������� ��� ���������������������������������� ��������� ������������ ������������� ������������������������� ������ ������������ ���� ������� ���� ��������� ������ ������ ����� 1������ ��5������� & !'@(� ����� ����������������� ���������������������� ������������������������������ ������������������ DD������� ������7����������8 ��������������� ������������5������� �8 ��� & !'=(�� ���� �����)��� �������� ���� ��������� �����0� 6������� ��� ���������� ���� ����������� ������ ��������� �� ������ 0 ����� ��� �����������3�;� #;�������� ���������������������� ���� ������������ �� ���������������������� ��;#�������@����;������������������� � ����������� ��3������������������������ ����;#��5�� ��3�373C��;#��5�:�����9* C7������� ��=##��5�5 �������� ����7����������������� /�������� #�;��+������ ���� �����9������������������������������ %���������������������������������� ���� ������������������������� ��;#�������@����;���������������������������������������� ���� ������� ����� � ����� ��� ��@'F������ #����@#�������������������������������� ������� ���������&"##��5�5 ������ �� ;#��5�� ��3�373C(� �� ������� ���� ��� ����� ���� @#������������������ ���� ���� ������������������ ��������������������� ���� �����9����������������� ������ +������ ��� ������ �������� � �� ��� �������� ����� ����������� ������������ ����� ������������������������������������ �������������� �����������������

��+��%.��%�.����

+�������������������&+$:(������������� ���������� �������������1 �� ��5�� ���%& !'=(�����������)�������� ��������������������� �������������������+����������������������������� ������ ���� �%������� ������������������������� ������ �� ������������ ��������������������� �� ����+$:�������������������� ��������������������������� %������������ ���� ���������� ���������� ������������ ���������������������)������/���������� �� ���� ������������ / ������������ ������������������������ �������������������� ��������������������������������������5����������������� ���������� ����&����

����������������� �������������������� ���

2nd Proof 31/5/8

���������������������(������������� �������� �� ������ 0 ��+ ������������������������� �"3>����������������� ������������������ ����� �����������������4� ���������������������������������� ��������������������� ��� ��;#�������"#����������������������������� �����<��������������� � �������� ��������������� �������������� �������� #�����������������&���������0�;##�5�:��������#�'��5�173+C=�73C� ��@�;��5�� ��3�373C� ���7�;�;(��<������ ��� ������������� ���������������� ��� %�� ���������������=9;?��B��������� ������������+��� �39@�����������������3##�����& ##���(��� �"#��� ;�����������+���������+� ��� �33�33�������������������������+������ ;#�>������������ ������������������������������������ �� �������������-����� �����;����������������������� ������������������������������������������� ����-����9��9����=;#�>�����+$:��������� &;#?�+$:9 ;=#�� #�;��5�� ��3�373C��#�'��5173+C=�73C(� ��� ���� ������� ��� ���������� �� �������� ���� ������� ��� ������ ���������������������������� �������������� �����+$:��������� ��%���� ������������� ����&3=F�(����� #����3#���������:������ �#�;���� �)�������������������&;#��5�:�������;#��5� ��3�373C��@##��5�:���������7�!9 #�;(� �� #������������� ����-����� ������� #�������� �������������� ������������������� �������������� ������������� ������������������ ������ #������������������������ ������������������-������������� ���� ����������������������������������������������������� �������� ������ ������������������� ����������������������� ������������ ���� ���������� ������� �������� ���������������� ������������)���������������% ��������� ���� �������� ���������������������������� ���������������������������������� ������������ ��������������� ������ �������;##�>�������������������+�� ��� ��;##9 ###�>������� �� ���� ����������������� ����� ���������� ���� ���� �� ���������������+������ ����

�����$������%��%.��%�.����

�������������������������H��I����� ���������� ���� ����� ����� �������������� �� ��������� ������� ���������������������� ���� � �������� ���� &� ��� �������������(������������������������������������������� ��������� ������������������ ����8�� ��������� ��� ������� %�������������������� �� ������ ������������������������ / ������������ ������������ �������������������� ��� ����������������������������������������������������������� ���������� ������� �������������&I����� �� ��4��������� !2 AI����� ��� ��E��%���� !23(��-�� �������������������H��I����� �� ������ ���������� ��� ������ �� ����������� �� ������ ���� ������������������ ������������������������������������������� ���������� ��������� ���������������������������0

,��������������

5��� ������������� ��

5���� ������� ��

$���������� %������������� ����� �

+������ ���6����

�����������������0������������ ������� ����������������� ����������������������)��������������� ��������������������� �������������������������,������������������������������������������� ��� ������� �� �������������������� �����*���� ��� ���������������� ����������������������������������������� ���������� ��� ���� ����������� ����������� ���� �������������������������������� ���� ����������������������������������������������)� �������������������-��������� �������������������� ��� ����������

��� �������� ���������������� �������

2nd Proof 31/5/8

����������������������������)� ����������������������������&6���@-(��7���������������������������&�������������������������������� ������������)� �(� ����������� �������������� ������������������� ����������� �����������������������������������&6���@.(������������� �����������������

�������������������������0�C���������� ��� ���� ����� ���������� ����������� ������� ���� ��������� ��� ��� ���� ������ ��� ������� ���� ��������� ���� ���������� ���� �������������� ��������������� ��������������������� ����� ��������� ���������������������������������� ���� ��������-�� ��������������� ���������������������������� ��%�� ����� ����&���� ������ ����� �(����������������������� ������� ���&6���@�(�������������������� ������ �����������������

���� ��� ������������ �������������������� ���������������� ������������������������������ �������������������������������� ������� ������������������������ ������ ���������� ������ ����� �������������� ������������<����������� ������������ ����������� ������)������������%���)��������������� ���������������������� ��� ������������� ��� ���� ��� ���� �������� ,��������������� �� �� ��� �� �� ���� ���� ��� ���� � ��� ��� ����������������� �������������������������&����������������� �� #J=���J (�

������������������������0�<�������������������� %����������������������� ������� ����������� �������������������������������� �������������&6���=(��+���������� ��� �� ����� ��� �����9� �������������������� ���������� ���������� ��� ������������� ������������� ���%��� ����������� ��� �������������������������������������������������������� �� ������������ ������� ��� ����������� ������-����9����������������� ���� ���������������������������������������

��� ���)�� ������������ ����������������� ����� ������������������� ��� ���� � ��������������� � �� ���� &��(� ������� ���� &<�(���������� ��� � ����� &6���=-(������ )����������� ���������� ����� ���� ������)������������������� ������� � ���������������� ��������������� ���������������� ����������������� ������3����@����������� ������� )����������� ����������<$������������������������ �������������������� ����������������� ������������������ #3���� #=�W��J3��������� ����������������� ����� ����������������������������� ������������������������� � �� �������� ���� �� �������� ������� ����������������� �� ������� � �������� ����� ��������#�@����#�'�m6��J3� �� �m6��J3��������������

Fig. 3. Movement of protoplast in non uniform electric field towards higher strength electric field and formsprotoplast chain.

���� ��� ������������������ ��������������� ������������������������������������ ���������������� ����

�� ���������� ��������������!����� ����������� �������� ��������������� �����������

����������������� �������������������� ��

2nd Proof 31/5/8

�����%������� ��� � ������� ������������ ������� ����� ��� ��������� ����-������������ ���������&��������������������� � ��������� ������������ �� ����������� ���� ���������� ��� ������� ���(�������� �� &�������(���� %���� ���������� �� ����� � �����$������ ����� %������ ���� ������� �������������� ���������������� ������������������� � ���������������� ������������������������ � ���������������������������9������� ���� � �������������������� ���������� ������� ���� ��� � �� ����������������������� ���������� �� ��������� .����� �� ����� ���� �� ���� �� ��� �� ���� ��� ��� �� � � �������� �������������������� %���������������9������� ����� � ������������� ��������� ���������� ������� �� ��� %���� ��� ������� ��� ����� ���� �� �� ��� ������� ���� ������� �������������������������� ������ �������� ��� ���������������������� ��� ��������������������������=.������������� ������������������������������������� ��� ��������� �������������������� ������������������������������������ ����������� ����� %���������� ������������������������� �������������� ���������������������� ����

�$����!�����$��������%.��%�$���(�����.����

� ���� ������ �������� �������� ��� ���� ������� ���� ��� �������� ������� �� ��������� ����� ����� ���������������������������������������� ����� �� �������������������������� �������

3� 6��������������������������� �������������� ��������� �����4��������������������������� �����

@� E ������ �� ������� ���������������������������������� �������� ����������� ��������� ������� ������� ����� ��������������� �����������������������������������������������������������

=� K��������� ��������������������

;� ,���������������������������������� ������� ������������ �������������

6� ����������� ����,-&��"

4������������� �������� ������)�������������������������� ��������������������������� �������������% ��������� ����� ������������������� ������������ �������������

Fig. 4. (A) Diagrammatic representation of Charge pulse technique, (B) Electric break down occurs at the poles ofthe cells and the zone of contact between two protoplasts.

�� �������� ���������������� �������

2nd Proof 31/5/8

������� �����)������������� �������������� ������������������������ ��������� ����

,��������������� � ��� ����� �������� ���� ���� ��������� ��� ��� ��� ������� ������������� ����� ��������� ���������0

:����� 4�������������� ���������������������������������� ��������������������� ��������������� ���� �������&+�������� ���� !''(�

:�����3 ���������� ������������������ ��������������������������������

:�����@ 5��� �� ����� ���������� ���� ��� ��%���������������� ���������� ��������

:�����= 5������������������� ��� ������������ ����

����!�"����������������0 4������� ���& !'"(����� �������������������������%���������������� �������������#���������������� ��� ������������� ��������������� ��� ��� �������������� ���� ��������������� ����� ���& !'2(������������������������� ��������������������� ��� ���� �����)��� ���� ��������� ��� ��� ������� 6����� ��� ������� ���� �����#���������$��%��� ��#��$��������������������+$:��+ � ���� ������������������������������������ �������������������������������� �����&6���;(�

4�� ����������� ����������� ��������� ���������������������� �������&������ ������� �������� ��� ��������� �� ���� ��� ������� ����� ���� ���� -��������� ,�� ������ �������� �������� ������� ������� ������������������ �������������� ������ ������� ������������� �����+�������� ��� & !''(� ����������������� ��������� ���� ��������� ��� ��������

���� '� "�(������������ �������0 ���������������������5������� ��8 ��� & !'=(�������������� ��� �%��������� �� ����� ������������������������ ����&����"(��4�� �������� � �� ��� �������� ��� ���� � ��� ��� ���������� ���� ��� �� � ������ ��������� ��� ��������������� ����������������� ����������� �������4�������������������������������� ������� � ���������� ������������ ����������������� ��������

5������� �� 8 ��� & !'=(� ���%� ������� ���� ���#�������� ��&������ ���� ��������� �������� ����� ������������������� ������������&39@������(��������������������&2##����(����� ����������������������& #�###����(�� �� ��������������������������� ��������������

Fig. 5. Flow chart showing selection of hybrids using selection medium on which only hybrid can grow.

����������������� �������������������� ���

2nd Proof 31/5/8

��� ���� ����������������������� ����������������������� ������������������������� ������������������� ������������������������������������������������������ ��� ������������� �������������� �����������������������&2##����(�

:��� ���� ���& !';(��������� ���� ������������ ������������������������ ������������������� �������������� ������ ������������������������ ��� ����������������������������� �� ����������� �%�������%������ ���& !''(����� ������������ ������������&����� ��������� ������������������� �����������������&6���"(����������� �������������������� ��������

����)�"������������*�����0 �������������������% ������ ����������� ����� ������ �������������������������������� ����� ����������������������������������������������������������������� ������������������� ������� �������������� ���������������������������������� ���� ����� �� ������� �� � ����� ��� ������� ���� ��� ��� ������������ ���������������� ������� ��������� �� ��� ��������������� ��������������������� ��������������������� ����������������� ����������� ������������� ��� ��������� �� �������� ������������������������������� ���� ��������� ������������������ ���������� ������ ����� ����������� ������ ������������

-���� ������ � ���������� ����������������������� �������������� ���� ������������������ � �� ����� ������� ���� ��� ���������� � ����� ������� ���� ��� �� ������� ���������������������� ����� ���������������������������� ���������

����+� " �����$��%� �����������%���� ��$��������0 ��� ����������� ������� ��������� ��������� ��� ���� ������ �� ����� ���� ���������� �� �� � ������ ��� ���� ����� �� ���� ������ ������������������������� ���� ������������� ������������ ������������������������������ ������������������������� ��������� ���� ������������������ ������

���������

+������ ��������������� ��� ����� ���� ������������� ��������� ������������������ ���� ������������� ������ ��� ���� ���� ����� ����� �������� ��� � ���� �� � ������������� ��

Fig. 6. Flow Chart showing complementary selection of somatic hybrids on specific culture medium.

��� �������� ���������������� �������

2nd Proof 31/5/8

������������� ���������������� �� ����� ������������ ���� !"#�������������������� ����������������� ��������� ��� ������� ���� ������� ����� �� ��� �������� ���� �����������*������������� ������ �����)���� � ��� ����� ��������� �� �� ����� ���� � ��� ������������ ���������������������� �������� ������������ ��������������������� ����������� �������� ��� ������� �����H��� ���������� ��������� �� ���������������� ��� �����������������)���� ���������������������� ��������������� ����� ������������+������ ���� ��� %����� �������������&������� ��� ���������(���������������������������%�������������� ��������� ��������� ���������

���������

. � ��4�.�� ���������� G�:�� & !' (�L.���M� ��*���� ��,����� ����������+������ ������������������������� ��C�����,������� �-�� @30�3=#93=;�

.������� ����� ��,����G�7��& !2"(��+� ���+������ ���0�-������������� ����������������������������

.���� ����8�� & !"#(�:������ ���������� ������ ����������������� ���� ��������.������ %� �����������$��=@0�2= J2; �

.�������G��& !'2(���������������������������� ������������� ����� �� ����������������� ��� ������/��%���-���������220�" 9"2�

� �������+��4���4�����7��7�� ��,� �����<��,��& !'3(�+ � ���� ��������������� �������� ���������#����0����������H4�"!0�33!3933!=�

����� ���K�A�5����������A�7�������59�A�:��/ ���G�� & !'2(0�4�� �������������� ���������������������� ������������������ ������� ������� #;�&@(0�3@!9=;�

���%���$����& !"#(�-������������������ ��������� ���������� ���� ��� ��������#������ 2'0�!"39!"@�

���%����$����A�:�������,�A�+���9G������G��G�A�+������G��.��& !''(�4�����������������������������������������9���������� ����������������������&����� ����������������-��������������� ���������������������������1������ #0'9 3�

,�� ���G��+����% ������� ��,����:��& !'@(�+� ������������������ �������+���� ��/���%���-���������"!03"9@=�

$� ���+��1�� �����%���$�����& !';(����������)��������� ���������������� ����� ������������� �������0�#���,�����2������������������(�������$��&<��7��+ �� ��.��G��4�����$��(����� 3'9 ;2��G�������� ��4����8��

$� ����+��1���1� �����-��:�� �����%����$�����& !'3(����� �������������� ������������� ���� ������������ #=0 '29 ! �

:��� ��K��K��& !'!(�*����������� �������� ������7�����+� ���� ��4�������4�� ���7���� ������0���������$�3�����0������(���$��%����$�������������(��2����4�5������(��������,����(������"��������������0���������6��+��'';9'22��C���4� ���H����+���������������

:��������,������ �����%����$�����& !";(������ ���9�� ������ �������������� ����������� �������� ���������.��(���������3=0 =@9 ="�

G������8��7���� ����-��<%����-������G��& !"#(�:������������ ������ �������������������������0���.�����='0�="29=';�

1 ���1��*��& !'"(�-���������������������� ���������� �������������������������������0�(���� �����������$����������&,��,������� ���$��(�����3@@93@'�-% ��1 ���.� �����

1 ���1�*��1���������-�� ��5������<�-��& !'#(��������������������������������������������� ����������� ���� ���(����7���"30�@@29@=#�

1 ���1��*�� ��5�� ���%��5��<�� � !'=(�-������� �������9���)������ ����������� ����������� ��������� ������������ ;0@;;9"'�

����������������� �������������������� ���

2nd Proof 31/5/8

1 ���1�*�������� �����6���5�� ���%��5�1�� ��: �������C�8��& !'=(�+� ���������� ��������� ����������������������������������������� 3#03 ;93'�� !'=�

1���������-�� ��5���������:��& !'@(��������������������7� ��� ����������� ������ ��������� ���������/��#����%�����32��'@'9'= �

1����%����G������& 2!3(�$���5������������������������������� ������8%����9������0����3�������=!0="@9='=�

8 �%���+�G��& !'"(��+���� ���� ��� ����������� ���������� ���������� ������������ 32��3 @J3 "�

5�������� 8��� 8 � ��� :�� �� 5 �� �� +�� & !'2(� ���� ���� ��� ��� ��� ������ ��� ������� #�������������% ������������������������������� =@0�3!9@3�

+������G��.�� �����%����$�����& !' (�6���������� ���������� ���������������$����8 %����:;<� 2 9!2�

+������G��.���.������4��6���6�� ������$��5�� �����%����$�����& !''(�4������������������������������������� ����9������� ��� ��� ������ ����������� ��&����� ����� �������� �� *��������� � �� ��������������������� ����������������������������1������ #0� 9"�

< �����,���7����� ���$�� ��: �����$�� & !'@(� *�� ���������������� ��� ����������� �����H������ ����������)������������������������������� ��� ��������������*��9����!0�3 "933�

5���������:�� ��8 � ��:��& !';(�4�� �������� ��������� ����������������������� �����4��������������� ����� ������������L� ���M� ����� ��������� ��������� ��� �����5������:����:������ @;03''93!=�

* � � ����� ��� %��������& !' (�+� ���������� ���� � ��������������������� ������� � ���+� �� �E����!!0 393#�

+����%�������7 ���������� ��8�����7��& !'!(�5������9���9 �� ��&5,-(������)������������ ������ ������������ ���������� �� � ����� ��� ������������������������� ������ ����� ��������� �����������)����+� ���4���8�����E���� =��3@ 93@;�

< �����,��7����� ���$�� ��: �����$�� & !'@(� *�� ����� ����������� ��� ����������� �����H������ ����������)������������������������������� ��� �����������������E����!0�3 "933�

<�����<��G��& !2#(��6 �������� ���������������������� ��������������� �������� ���������� ����������� ������������������� �����0����.���������������'0�' 9'3;�

4����%��<��H��� ��7���� ����-�����& !"!(�+������������������ ����������� ������������)��������������������������� �������� �����(���������!0"3!9"@ �

4�����7�7��1 ���1�*�� ������ ����*���� & !'"(� ������������7���� �������������� ���6����� �#�������������G���7������"'0� 3@9 32�� !'"�

� %����� ����8 ����:�� ��5���������:�� & !' (�<������ ��������������� ���� ����� ��� ������������������� ���������� �����#�����������%����;20�@ 2J@3#�

E �������1��& !'"(������������������������ ����������������� ���������� ������� �����0����0$�����320� !9 "#�

E ����E�� ��7���� ����-�����& !";(�,������� ���������� ����+� ���������4���������� ����������5�������������4������E���� ;#0�22!92!3�

I����� ���H�� & !23(�$������� ���9�� ��� ������ ����� ���������� ���������� ������������ �����������0����"!=0�33'J3''�

I����� ���H�� ��4���������+��& !2 (�7������)����������������� ���������� �������������������������� ; 0�3"9@3�

I����� ����H�� ��E��%����G��& !23(�$����������9���������9��9������������.����&������"'0� ";9 23�

.//����%���%��/�

� .������� ����� ��,���� G�7�� & !2"(��+� ���+������ ���0�-������������� ������� ����������������������� �� ��N�7 ���

��� �������� ���������������� �������

2nd Proof 31/5/8

3� ,����,�G�� ��.������� ����� & !2'(�+� ���+������ ���0�-�.����������� ������� ����+� ����������������� �� ��N�7 ���

@� , �����5�<�� ��1�� ���-��& !2@(�7������� ���������� ���0������������ ��������������0���������������*������������7������%�(���$���&:�����1�8��$�(�4����� "��3 !93"@��-� ����+�����*���K��%�

��)��*7������

���/7.�������

� ����� ������������������ ��� ���� ��������������� ��������)����

3� �������������������������� ������ ���������)���� �������������������������O

@� ����� ��������������� ��� ��������� ���� ����������

=� �� �� ������������������������ ��������O�,������� ����������������� ��

;� ,�������������������������� �����������������

.���(��������7.�������

� ����������������� ������������������� ������ ���O

& ( 1����%�� &�( $�������%��

&�( ���1��E �� &( H��I����� ��

3� ��������������������������������� ���� ����� ��������O

& ( ������ �� &�( + ��� ��

&�( .������� ���� &( *������ ����

@� ����������� ����������� ����� ���������������� ���O

( . ���� &�( 4� �

&�( 6����� &( -�� �

= ���������� ���������������� �������O

& ( 4 ��� �� &�( � ��������

&�( 6������������ ��� �� &( *���������� ����

; ���������� ����������������� ���� ���������O

& ( -� �������� &�( � ��������

&�( 6������������ ��� �� &( 4 ��� ��

" 7���� D����� �������7������������������ �����������

& ( ����� ������������ ��� &�( ����� �������� ��������

&�( 5 %��������� �������� � &( -������ ����

'� �� ������������������� ���� ������������������ �������������

& ( .������ &�( 4���%��

&�( ,��������� ��� &( *���������� ����

2� <������ ������������������ ������������������� ����� ����������������

& ( , ��� &�( +����

&�( #����������&��� &( ������������

����������������� �������������������� ���

2nd Proof 31/5/8

!� 6���� ����������� ������� ���� ��� ��������� �� ���� ����� ��� ��� ����� � ��� ��������������

& ( � %����������� � &�( $�������%���

&�( ��1��E �� &( G�.��+����

#� �������������������������������� ��������������)��O

& ( +��4��� ����� &�( $�������%��

&�( ���1��E �� &( H��I����� ��

���8�$�

� &�( 3� &�( @� &�( =� &�( ;� &�( "� &(

'� &�( 2� &�( !� & ( #� &(