protoplast culture.pdf
DESCRIPTION
Protoplast CultureTRANSCRIPT
��� � � � � � �
����������������� ��������
������������
������������ ������� ���
������������ ����������������� ����� ������������������ ��!��"�#�� �$�� $ �% &��'��� ���� ����������� $ �% &����&� ��(�����
')* ��+��,��* �- "��!�!��
������������� �����
����� ����������� � ������ �������������������������� ��� �� �� �������������������� ����� �� ������������������������ ��� ������ ����������� �� ����� ������� ����������� �������������� ������ � �������� �� �� �� ����� ���������������� ��� ������������ ������������� ����������� ����������� ����������� ���������������������������� ���� !"#����$��������%����������������������������� ���������� ������������������� ���� ���������������� ��� ���� %�����������& !' (�������� ��������������� ����������� �������� �������� � �������� ������������� ����������� ����������������)����
*�������� ��� ���������� �������� ����� �������������� � ��� ��������� � �� ������������� ��������������� �����+� ���������� ����� �� ����� %������������,*-��������������� %���� �� ������ ��������������������� �� ������� ����� ��������+������ ���� ��������� ����������� ������������� ����� �������������� �� ��������� ��������� ��������������� ������������������������������������ ���������������� ����� �������
+������� �� ����� �������� ���� ������� ��� ������� ��� ��� ����� ����� ����� ������������)���� �� ����������� ��������������)���� ����� ���������������������������
�� �����������������
���� ������������ ��� ������� ��� ���� ������ ���� ��������������������� ��� ����� ������������ �� ������ ���� ��� � %�� ����� ������� ����� � ���� .������ ����� ���� ���� �� ��� ����
2nd Proof 31/5/8
����������������� �������������������� ���
2nd Proof 31/5/8
������� ������������ �� �� ����� ������ ��� ��� ��������� �� ��)��%��� ����������� ���� ����/����������� ��������� ����������� ���� ��� �������������� ���� ��0����� �� �� ������ ���������
������������������
1����%���& 2!3(�� ����������������� ���������� ����������� �������������������������������������������������� ���������������������� ������� �������������������������������4� ����������������� �#�5������������������������� ��������%� � ���������������������� �� ������������� ��������������� ���������� ��� ���%���� ������� ����%������� ���������������� ���� �������������� � ��������������� ���� �������������������� ������������� ������������ ������������� ������ ��������� ���� ������ ����� ��� �� ������������ ���� ���������������&6��� (�
��� ������������������
��������������������������������������������������������� ����������� ����������� ������� �������������� ������������������ ������� ��������� ���������������������������� �������� �����/�������� �������������� ������� ����������7��������������������������������������� ������ ���������)���������������� ���������� ���������������%���& !"#(��7��������� ������������ ������� � ��������������������������������������������������������� ��� �� ���� ��� ���� ������� ���� ����� ��� ��� ������� 8 ���� ���� ������ ���� ��� ������� ����� �� ����� ������ �������� � �� ����� ����������� ���� ��� ������ ������ �����%�������������� ��������������������� �� ����������������&����������(����� �� ���9�����������&��)���� �������(�
��� ��������������������������� ���� ��� ��� ���������� ��������� �������������� ������������������ ��� ������� ��������� ������������������������9������������������ ���������� ��������� ��������������������������� ��� ������������������������������ ����� ������������������� ��� ������ ���������� ����
-������� �������������������������� ������ �������� ��������������� �� ���� �� � ���������������������������� �� ������ ������������������4����� ���� ����������� �� �������� ������������:���� ����;#��5�� ��3��� ��������� ��������� ������������ ��
Fig. 1. When tissue is cut at the dotted lines (A) with a sharp razor blade, some cells release uncut completeprotoplast and rest of the cells produced broken dead protoplasts as shown in Figure 1B marked with stars (*).
Cut
A B
��� �������� ���������������� �������
2nd Proof 31/5/8
������� ���� &<����� !2#(�� ���� ������� �������� �� ������ �������� �������� � #�=;>� ���������� ��� ���������� ������ ���� ���� �� ��������� �� ��� ����� ���� ���� ����� ������� ����������� �������������������
���������������������
���� ����������� �������� ��� ������� ���� ��)����� � ����� ����� ���� ��� �� ��� �� � ���������� ���� �� � ���� ����� 4�� ���� ������� ���� ��)���� ��� ��� ������ ��� �������� ������������ ��� ��&����(��������������� ���� ����������
���� ���!"�#$����%�������
,������ ���������������������������� �������������������������������� � ������������ ������������������������ ##>�����������$������ �� ��������������������� ����������� ������������ ��"##���������;�������������������� ��������������������������������������������������� ���������� � ��� ������������� ������������ �������������������� ���� ��� �������9���������� �� �������������� ���� ����������������������������������������������� ��� ��� � ����� �������� ���� ���������� �� ���������� � �� ��� ������� ���������� ���� ������� �������������� ������� �������������� �������������� ��������������� �������������������������������
���� ���!&$�'���$���(�����
��� ��� ������� ���� ��� ��� � ��� ����� ���� ���%��� ������ ��� ��������� ���� ������� ������ � ������3#9=#?����������������� ���������� ���� ��@;#�������������������������� ��������� ������������ ��������������������������������� �� ���� ������������������� �������&:������� �����%���� !";A�+����� �����%���� !'#A�$� ����������� !'3(�
4����%� ��7����� ��� & !' (����� ������ �������������8 �%�� & !'"(����������������� ���� ����� ���� ��� ������� ���� ��� ���������� #�;9@�#� �������� ��� ����� ������� ������ � ���� ����� ����� ���� ��������������������������� �� � �������� ����������� �� ������������������ ������� ��;#93##������� ����� #�������������������� ������������ �� ������������������������������� ������������� ����������������������������&6���3-(������������ ���� ������������������������� ������� �� �������������&6���3.(�
�$���(����)��#�������%����*�����$�����������
��� ��� ������������������������ ������������� ��)� ������������#� ?�� ��������������������� ��� ����;�������� �� ������������������ ��������������������������������� ���������������� ��������� ������� �� �%�
�$���(����)��#�����
6���������� ��� ���&6,-(����������� �������&;���B�(��� ������������ �������������������� ��� ���������� �������#�# ?��-�����;�������� ������������� ���������������� ���� ���� ��������������������������������C����� ����������� ����� ����������
����������������� �������������������� ���
2nd Proof 31/5/8
��������������+�,��������������������"��)��&����-
��� ������ ������������� ����������� ����� �� �������� ��� ��� �� � ���� ���� ����� ��������� ���� ��� ��������� &������ ���������� ������� ��������� �������� �� ������ ��� ��(�5 ����������������������������������������������������������������� � ������� �������������&������ ��������� ������������� ���������� �������������������� ��(������������� ��������������������������� ���������)���� ���������������������-�� ������������������������������� ���� ������������ ����� �������7�&;92(��������������� �������������� ������������� �� �� ������� ���� ��������������������������������� �������������� ����� �������7�� �������������������� ����������������������������� ��������������������� ��������� ��������������� �����+������ ������� ������������������ DD���5�DD� ���������� ���� ����� � ���� ���������� ��� ������� ���� ������ ��� ���������� ������ ��������� ��������������������&<����� !2#(�
����������������
-������ ��������������������� ���� ����������� �� �%������������,���������������� ������������������������������� ���������� ����
.�(�������.��.$�
�������������������� ���� ������������� ��)����������� ���� ������������ ����������������+������ ���� �� ���������� #;B���������� ������ ������3;9;#�������������� �$������������ �%��������������� ����� %���������������������������� �� ���������������4���������� %���� ��� ���������������������� ����������������� %�����)�������� ����������������������� � �����$� ��� �����%���& !';(������������ ��3����������������������� ����������������������3;������ �%������ ��� ��� �� �����E ���& !'"(������������� ������� ������ ��� ������������%����������� ���� ��� ���� �� �������� ��������������������
Fig. 2B. Purified protoplast population
BFig. 2A. Purified Protoplast ring formation and debris
get settled at the bottom
Enzyme solution
Purified proplasts
Lymphprep
Debris
A
��� �������� ���������������� �������
2nd Proof 31/5/8
,��/��/"$�( ����%
1 �� ������������������������ ����������������� !'#������� �������)��������������������&. � � ���������� !' (���������������� ��������������������� ���� �� ��������� #=B��� ��� #;B��� ���� ��� ��;#�>������� ���� ����+������ ����� �� �������� � ���� ����� ����� ���������������� ��3;9@#F�����������������������& ##9;##����(���������� �%��-����������� ���������� ���� �������� ������������������������������� ����� %������������������������ ������������������������������������ �� �������������� ���&E ���� !'"(�
�/�$������/ ����%
������������ ��������� ������������������������.���� ���& !"#(���������� ���������������� ���� ���� ��� ��� ������������������������������ ��������������* � � � ��� % ��& !' (������� /��� � �� ������� ���� �����)��� ��0� &(� � � ������������������������� ����� ��������� ��������� ��&(��� �������������� �������������� �����-������� ����������� /���� �� �%�������������)������� �� ������������ ������������� ��� ����������������������������������� ����� ���������� ��������� ��������� ������� ����������� �%������������ ������������������ ������������9�����7��������������������� ��������������� �������������%����� � ��&�������������� ���� ������������� ���(� ��� ������������������������������ ������������������� ��������������� �����������������)���� ���������������������� �������� �������������)������������������������������ ��� �����������&< ������� ���� !'@(�� ��������������&.������� !'2(�� �� �������������� �� ��&+����%������ ���� !'!(�
��$��.��.$�������0.�
���������)��������������G�������� ���& !"#(����������������� ���������� ���������E �� ��7����� ���& !";(����� ������ ������ ������������ ����������5�����������������)���� ������������������������������������������� ���������� ���� ����������&,�� ����� ���� !'@(��-������������������������ ����������������������� ������������� ����������������C�������������������������������� ���%��������������������-����������������������������������������������������������� ���������������
.���%$�(�$$��1 "�2������0.�
������ ������������������������ ��������������� �� ������������������� ������������� ������ �� �� ������� �� � ������ &��� ��� =!##(� ����� �� ��� ������ ��� �� ��� � ��� �&+����%������ ���� !'!(
��������������+����������������
4����������������� ��������� �������������� ����������������� ������������ ������� ��������������� ������������������ ��������������������������
����������������� �������������������� ���
2nd Proof 31/5/8
�����(�������%)�$������
����� ���������������� ����� �������������� ��������������������� ������ ������������ �������������������������������
������/���%�$/��
-� ������ ����� ��� � ����� ���� ���� ����������� �������� �� ���� ��� ��� ���� ����� �� ��� ����������� ���� ���������������� �������������� ������������������ ����������� ��������������� ��� ����� ���������� ��� ����� ���� ��������� �������� ��� ������� ��� �������%��� ���������� �����/������������������� ������� ��� ��� �������������������� ��������� ��������� ����� ���� ������� ���� ��� ��� ����� ������ � ���� ��� ��� ���������� �� ����������������+� ���������� ����� ������������������������������ ��������� ����������� ������������
�$��.��.$����%������
.����� ���� � ������ �������� ����� ���� ��� ����� ��� ������� ���� �� �������� �� ����������������� ��� ��� � ������ ������ �������� ���������,�������� �������� ����������������������������� ����� �����������������������������������
�$��$����������������.�3&�!�$�����������!�$���(�����
+����� ������� ����� �� ���� ��� ������� �� ��������� �� �������� ��� ������ ��� ���� ��������� ���������� ��������������������� ����������� ���� ��������� �������������
�.�$���������0.�$�����!�$�$���(�����
*������ ����)��������������������������������� ������������������������� ����)������������������ ����������������+������ ������ %������������ ������� ���������������� ����� ����������������� ��� ���� �������� ��� �� ���������������������� ��������� ��������������4������������� ������������������ ���������������� ������������� ���� ��������������� ������������������ ������������������������������� ��������������������� ����������������������������� ��������&1 �� ��5���� ��%� !';(�
�$���(�����"������
+������ ��������������������� �� �������������������� ������������� �������������������������� ������������ ��� ��������������������� �������������������� ������������ �������������������������� ������������������� ����������������� ������� �������������� ���� %������ ������������������� ���������)������� ����������� %��������������-����� ������������ ������������� ��������������� ���������)������������������ ����� ���������������������� ������������ �� ������������)������������&5���������� ���� !'2(�
����������������� ����,-&��"�4�����
-�� �� ��� ������ � ��� �� ������� ����� � ��� �� �� ����� ������� ��� ����� ������ .��� ��� ��������� ������������������������������ ����������� ������������������ ����������������
��� �������� ���������������� �������
2nd Proof 31/5/8
������ ������������������������ �� ������ ����-��������������������������������)�������������� ������������ �������� ���������������������������� ��������� ������������+������ �������������������������������� ��� �������� �� �� �� ������� �������� ��� ������ ���� �������������������� ��� �������� ���� �������0� &(�������� ��� ��� ����&(�������� ����������&(���������������� ���������� ��&�(��������������� ������������������ �������������� �����,������������������������� ��������� �������������.������� ��,����& !2"(������������� ���������� �������� ������������������� ��������0�& (����� DD� �������7�� &�(��������������������� &+$:(�� �� &�(� �������� �����8��� ����� �������� ������ ������������ ������������� ����������������������������������������������������������� ����������������4��� ������� ����������������� ��������������� ���� ������������������������������������� ������������������������ ��� ����� ������������������������ ������������������������������������� �����������%������ ����% �����-�������������������������������� ����� � ������ ���� �������% �����
,�/���55��%,�/�(,��%.��%�$���(�����.����
+���� ������ ����������������� ������������ ������������������7��������������� ��������������� ��������������� ���� ����0�&(������� ��� �������� ������ ����������������� ������ ���� �����������������������%����������������� ����� ��&(� �� ��������� ���������� ���������������������� �������������� ��������� ������� ��� ���������������������������������� ��������� ������������ ������������� ������������������������� ������ ������������ ���� ������� ���� ��������� ������ ������ ����� 1������ ��5������� & !'@(� ����� ����������������� ���������������������� ������������������������������ ������������������ DD������� ������7����������8 ��������������� ������������5������� �8 ��� & !'=(�� ���� �����)��� �������� ���� ��������� �����0� 6������� ��� ���������� ���� ����������� ������ ��������� �� ������ 0 ����� ��� �����������3�;� #;�������� ���������������������� ���� ������������ �� ���������������������� ��;#�������@����;������������������� � ����������� ��3������������������������ ����;#��5�� ��3�373C��;#��5�:�����9* C7������� ��=##��5�5 �������� ����7����������������� /�������� #�;��+������ ���� �����9������������������������������ %���������������������������������� ���� ������������������������� ��;#�������@����;���������������������������������������� ���� ������� ����� � ����� ��� ��@'F������ #����@#�������������������������������� ������� ���������&"##��5�5 ������ �� ;#��5�� ��3�373C(� �� ������� ���� ��� ����� ���� @#������������������ ���� ���� ������������������ ��������������������� ���� �����9����������������� ������ +������ ��� ������ �������� � �� ��� �������� ����� ����������� ������������ ����� ������������������������������������ �������������� �����������������
��+��%.��%�.����
+�������������������&+$:(������������� ���������� �������������1 �� ��5�� ���%& !'=(�����������)�������� ��������������������� �������������������+����������������������������� ������ ���� �%������� ������������������������� ������ �� ������������ ��������������������� �� ����+$:�������������������� ��������������������������� %������������ ���� ���������� ���������� ������������ ���������������������)������/���������� �� ���� ������������ / ������������ ������������������������ �������������������� ��������������������������������������5����������������� ���������� ����&����
����������������� �������������������� ���
2nd Proof 31/5/8
���������������������(������������� �������� �� ������ 0 ��+ ������������������������� �"3>����������������� ������������������ ����� �����������������4� ���������������������������������� ��������������������� ��� ��;#�������"#����������������������������� �����<��������������� � �������� ��������������� �������������� �������� #�����������������&���������0�;##�5�:��������#�'��5�173+C=�73C� ��@�;��5�� ��3�373C� ���7�;�;(��<������ ��� ������������� ���������������� ��� %�� ���������������=9;?��B��������� ������������+��� �39@�����������������3##�����& ##���(��� �"#��� ;�����������+���������+� ��� �33�33�������������������������+������ ;#�>������������ ������������������������������������ �� �������������-����� �����;����������������������� ������������������������������������������� ����-����9��9����=;#�>�����+$:��������� &;#?�+$:9 ;=#�� #�;��5�� ��3�373C��#�'��5173+C=�73C(� ��� ���� ������� ��� ���������� �� �������� ���� ������� ��� ������ ���������������������������� �������������� �����+$:��������� ��%���� ������������� ����&3=F�(����� #����3#���������:������ �#�;���� �)�������������������&;#��5�:�������;#��5� ��3�373C��@##��5�:���������7�!9 #�;(� �� #������������� ����-����� ������� #�������� �������������� ������������������� �������������� ������������� ������������������ ������ #������������������������ ������������������-������������� ���� ����������������������������������������������������� �������� ������ ������������������� ����������������������� ������������ ���� ���������� ������� �������� ���������������� ������������)���������������% ��������� ���� �������� ���������������������������� ���������������������������������� ������������ ��������������� ������ �������;##�>�������������������+�� ��� ��;##9 ###�>������� �� ���� ����������������� ����� ���������� ���� ���� �� ���������������+������ ����
�����$������%��%.��%�.����
�������������������������H��I����� ���������� ���� ����� ����� �������������� �� ��������� ������� ���������������������� ���� � �������� ���� &� ��� �������������(������������������������������������������� ��������� ������������������ ����8�� ��������� ��� ������� %�������������������� �� ������ ������������������������ / ������������ ������������ �������������������� ��� ����������������������������������������������������������� ���������� ������� �������������&I����� �� ��4��������� !2 AI����� ��� ��E��%���� !23(��-�� �������������������H��I����� �� ������ ���������� ��� ������ �� ����������� �� ������ ���� ������������������ ������������������������������������������� ���������� ��������� ���������������������������0
,��������������
5��� ������������� ��
5���� ������� ��
$���������� %������������� ����� �
+������ ���6����
�����������������0������������ ������� ����������������� ����������������������)��������������� ��������������������� �������������������������,������������������������������������������� ��� ������� �� �������������������� �����*���� ��� ���������������� ����������������������������������������� ���������� ��� ���� ����������� ����������� ���� �������������������������������� ���� ����������������������������������������������)� �������������������-��������� �������������������� ��� ����������
��� �������� ���������������� �������
2nd Proof 31/5/8
����������������������������)� ����������������������������&6���@-(��7���������������������������&�������������������������������� ������������)� �(� ����������� �������������� ������������������� ����������� �����������������������������������&6���@.(������������� �����������������
�������������������������0�C���������� ��� ���� ����� ���������� ����������� ������� ���� ��������� ��� ��� ���� ������ ��� ������� ���� ��������� ���� ���������� ���� �������������� ��������������� ��������������������� ����� ��������� ���������������������������������� ���� ��������-�� ��������������� ���������������������������� ��%�� ����� ����&���� ������ ����� �(����������������������� ������� ���&6���@�(�������������������� ������ �����������������
���� ��� ������������ �������������������� ���������������� ������������������������������ �������������������������������� ������� ������������������������ ������ ���������� ������ ����� �������������� ������������<����������� ������������ ����������� ������)������������%���)��������������� ���������������������� ��� ������������� ��� ���� ��� ���� �������� ,��������������� �� �� ��� �� �� ���� ���� ��� ���� � ��� ��� ����������������� �������������������������&����������������� �� #J=���J (�
������������������������0�<�������������������� %����������������������� ������� ����������� �������������������������������� �������������&6���=(��+���������� ��� �� ����� ��� �����9� �������������������� ���������� ���������� ��� ������������� ������������� ���%��� ����������� ��� �������������������������������������������������������� �� ������������ ������� ��� ����������� ������-����9����������������� ���� ���������������������������������������
��� ���)�� ������������ ����������������� ����� ������������������� ��� ���� � ��������������� � �� ���� &��(� ������� ���� &<�(���������� ��� � ����� &6���=-(������ )����������� ���������� ����� ���� ������)������������������� ������� � ���������������� ��������������� ���������������� ����������������� ������3����@����������� ������� )����������� ����������<$������������������������ �������������������� ����������������� ������������������ #3���� #=�W��J3��������� ����������������� ����� ����������������������������� ������������������������� � �� �������� ���� �� �������� ������� ����������������� �� ������� � �������� ����� ��������#�@����#�'�m6��J3� �� �m6��J3��������������
Fig. 3. Movement of protoplast in non uniform electric field towards higher strength electric field and formsprotoplast chain.
���� ��� ������������������ ��������������� ������������������������������������ ���������������� ����
�� ���������� ��������������!����� ����������� �������� ��������������� �����������
����������������� �������������������� ��
2nd Proof 31/5/8
�����%������� ��� � ������� ������������ ������� ����� ��� ��������� ����-������������ ���������&��������������������� � ��������� ������������ �� ����������� ���� ���������� ��� ������� ���(�������� �� &�������(���� %���� ���������� �� ����� � �����$������ ����� %������ ���� ������� �������������� ���������������� ������������������� � ���������������� ������������������������ � ���������������������������9������� ���� � �������������������� ���������� ������� ���� ��� � �� ����������������������� ���������� �� ��������� .����� �� ����� ���� �� ���� �� ��� �� ���� ��� ��� �� � � �������� �������������������� %���������������9������� ����� � ������������� ��������� ���������� ������� �� ��� %���� ��� ������� ��� ����� ���� �� �� ��� ������� ���� ������� �������������������������� ������ �������� ��� ���������������������� ��� ��������������������������=.������������� ������������������������������������� ��� ��������� �������������������� ������������������������������������ ����������� ����� %���������� ������������������������� �������������� ���������������������� ����
�$����!�����$��������%.��%�$���(�����.����
� ���� ������ �������� �������� ��� ���� ������� ���� ��� �������� ������� �� ��������� ����� ����� ���������������������������������������� ����� �� �������������������������� �������
3� 6��������������������������� �������������� ��������� �����4��������������������������� �����
@� E ������ �� ������� ���������������������������������� �������� ����������� ��������� ������� ������� ����� ��������������� �����������������������������������������������������������
=� K��������� ��������������������
;� ,���������������������������������� ������� ������������ �������������
6� ����������� ����,-&��"
4������������� �������� ������)�������������������������� ��������������������������� �������������% ��������� ����� ������������������� ������������ �������������
Fig. 4. (A) Diagrammatic representation of Charge pulse technique, (B) Electric break down occurs at the poles ofthe cells and the zone of contact between two protoplasts.
�� �������� ���������������� �������
2nd Proof 31/5/8
������� �����)������������� �������������� ������������������������ ��������� ����
,��������������� � ��� ����� �������� ���� ���� ��������� ��� ��� ��� ������� ������������� ����� ��������� ���������0
:����� 4�������������� ���������������������������������� ��������������������� ��������������� ���� �������&+�������� ���� !''(�
:�����3 ���������� ������������������ ��������������������������������
:�����@ 5��� �� ����� ���������� ���� ��� ��%���������������� ���������� ��������
:�����= 5������������������� ��� ������������ ����
����!�"����������������0 4������� ���& !'"(����� �������������������������%���������������� �������������#���������������� ��� ������������� ��������������� ��� ��� �������������� ���� ��������������� ����� ���& !'2(������������������������� ��������������������� ��� ���� �����)��� ���� ��������� ��� ��� ������� 6����� ��� ������� ���� �����#���������$��%��� ��#��$��������������������+$:��+ � ���� ������������������������������������ �������������������������������� �����&6���;(�
4�� ����������� ����������� ��������� ���������������������� �������&������ ������� �������� ��� ��������� �� ���� ��� ������� ����� ���� ���� -��������� ,�� ������ �������� �������� ������� ������� ������������������ �������������� ������ ������� ������������� �����+�������� ��� & !''(� ����������������� ��������� ���� ��������� ��� ��������
���� '� "�(������������ �������0 ���������������������5������� ��8 ��� & !'=(�������������� ��� �%��������� �� ����� ������������������������ ����&����"(��4�� �������� � �� ��� �������� ��� ���� � ��� ��� ���������� ���� ��� �� � ������ ��������� ��� ��������������� ����������������� ����������� �������4�������������������������������� ������� � ���������� ������������ ����������������� ��������
5������� �� 8 ��� & !'=(� ���%� ������� ���� ���#�������� ��&������ ���� ��������� �������� ����� ������������������� ������������&39@������(��������������������&2##����(����� ����������������������& #�###����(�� �� ��������������������������� ��������������
Fig. 5. Flow chart showing selection of hybrids using selection medium on which only hybrid can grow.
����������������� �������������������� ���
2nd Proof 31/5/8
��� ���� ����������������������� ����������������������� ������������������������� ������������������� ������������������������������������������������������ ��� ������������� �������������� �����������������������&2##����(�
:��� ���� ���& !';(��������� ���� ������������ ������������������������ ������������������� �������������� ������ ������������������������ ��� ����������������������������� �� ����������� �%�������%������ ���& !''(����� ������������ ������������&����� ��������� ������������������� �����������������&6���"(����������� �������������������� ��������
����)�"������������*�����0 �������������������% ������ ����������� ����� ������ �������������������������������� ����� ����������������������������������������������������������������� ������������������� ������� �������������� ���������������������������������� ���� ����� �� ������� �� � ����� ��� ������� ���� ��� ��� ������������ ���������������� ������� ��������� �� ��� ��������������� ��������������������� ��������������������� ����������������� ����������� ������������� ��� ��������� �� �������� ������������������������������� ���� ��������� ������������������ ���������� ������ ����� ����������� ������ ������������
-���� ������ � ���������� ����������������������� �������������� ���� ������������������ � �� ����� ������� ���� ��� ���������� � ����� ������� ���� ��� �� ������� ���������������������� ����� ���������������������������� ���������
����+� " �����$��%� �����������%���� ��$��������0 ��� ����������� ������� ��������� ��������� ��� ���� ������ �� ����� ���� ���������� �� �� � ������ ��� ���� ����� �� ���� ������ ������������������������� ���� ������������� ������������ ������������������������������ ������������������������� ��������� ���� ������������������ ������
���������
+������ ��������������� ��� ����� ���� ������������� ��������� ������������������ ���� ������������� ������ ��� ���� ���� ����� ����� �������� ��� � ���� �� � ������������� ��
Fig. 6. Flow Chart showing complementary selection of somatic hybrids on specific culture medium.
��� �������� ���������������� �������
2nd Proof 31/5/8
������������� ���������������� �� ����� ������������ ���� !"#�������������������� ����������������� ��������� ��� ������� ���� ������� ����� �� ��� �������� ���� �����������*������������� ������ �����)���� � ��� ����� ��������� �� �� ����� ���� � ��� ������������ ���������������������� �������� ������������ ��������������������� ����������� �������� ��� ������� �����H��� ���������� ��������� �� ���������������� ��� �����������������)���� ���������������������� ��������������� ����� ������������+������ ���� ��� %����� �������������&������� ��� ���������(���������������������������%�������������� ��������� ��������� ���������
���������
. � ��4�.�� ���������� G�:�� & !' (�L.���M� ��*���� ��,����� ����������+������ ������������������������� ��C�����,������� �-�� @30�3=#93=;�
.������� ����� ��,����G�7��& !2"(��+� ���+������ ���0�-������������� ����������������������������
.���� ����8�� & !"#(�:������ ���������� ������ ����������������� ���� ��������.������ %� �����������$��=@0�2= J2; �
.�������G��& !'2(���������������������������� ������������� ����� �� ����������������� ��� ������/��%���-���������220�" 9"2�
� �������+��4���4�����7��7�� ��,� �����<��,��& !'3(�+ � ���� ��������������� �������� ���������#����0����������H4�"!0�33!3933!=�
����� ���K�A�5����������A�7�������59�A�:��/ ���G�� & !'2(0�4�� �������������� ���������������������� ������������������ ������� ������� #;�&@(0�3@!9=;�
���%���$����& !"#(�-������������������ ��������� ���������� ���� ��� ��������#������ 2'0�!"39!"@�
���%����$����A�:�������,�A�+���9G������G��G�A�+������G��.��& !''(�4�����������������������������������������9���������� ����������������������&����� ����������������-��������������� ���������������������������1������ #0'9 3�
,�� ���G��+����% ������� ��,����:��& !'@(�+� ������������������ �������+���� ��/���%���-���������"!03"9@=�
$� ���+��1�� �����%���$�����& !';(����������)��������� ���������������� ����� ������������� �������0�#���,�����2������������������(�������$��&<��7��+ �� ��.��G��4�����$��(����� 3'9 ;2��G�������� ��4����8��
$� ����+��1���1� �����-��:�� �����%����$�����& !'3(����� �������������� ������������� ���� ������������ #=0 '29 ! �
:��� ��K��K��& !'!(�*����������� �������� ������7�����+� ���� ��4�������4�� ���7���� ������0���������$�3�����0������(���$��%����$�������������(��2����4�5������(��������,����(������"��������������0���������6��+��'';9'22��C���4� ���H����+���������������
:��������,������ �����%����$�����& !";(������ ���9�� ������ �������������� ����������� �������� ���������.��(���������3=0 =@9 ="�
G������8��7���� ����-��<%����-������G��& !"#(�:������������ ������ �������������������������0���.�����='0�="29=';�
1 ���1��*��& !'"(�-���������������������� ���������� �������������������������������0�(���� �����������$����������&,��,������� ���$��(�����3@@93@'�-% ��1 ���.� �����
1 ���1�*��1���������-�� ��5������<�-��& !'#(��������������������������������������������� ����������� ���� ���(����7���"30�@@29@=#�
1 ���1��*�� ��5�� ���%��5��<�� � !'=(�-������� �������9���)������ ����������� ����������� ��������� ������������ ;0@;;9"'�
����������������� �������������������� ���
2nd Proof 31/5/8
1 ���1�*�������� �����6���5�� ���%��5�1�� ��: �������C�8��& !'=(�+� ���������� ��������� ����������������������������������������� 3#03 ;93'�� !'=�
1���������-�� ��5���������:��& !'@(��������������������7� ��� ����������� ������ ��������� ���������/��#����%�����32��'@'9'= �
1����%����G������& 2!3(�$���5������������������������������� ������8%����9������0����3�������=!0="@9='=�
8 �%���+�G��& !'"(��+���� ���� ��� ����������� ���������� ���������� ������������ 32��3 @J3 "�
5�������� 8��� 8 � ��� :�� �� 5 �� �� +�� & !'2(� ���� ���� ��� ��� ��� ������ ��� ������� #�������������% ������������������������������� =@0�3!9@3�
+������G��.�� �����%����$�����& !' (�6���������� ���������� ���������������$����8 %����:;<� 2 9!2�
+������G��.���.������4��6���6�� ������$��5�� �����%����$�����& !''(�4������������������������������������� ����9������� ��� ��� ������ ����������� ��&����� ����� �������� �� *��������� � �� ��������������������� ����������������������������1������ #0� 9"�
< �����,���7����� ���$�� ��: �����$�� & !'@(� *�� ���������������� ��� ����������� �����H������ ����������)������������������������������� ��� ��������������*��9����!0�3 "933�
5���������:�� ��8 � ��:��& !';(�4�� �������� ��������� ����������������������� �����4��������������� ����� ������������L� ���M� ����� ��������� ��������� ��� �����5������:����:������ @;03''93!=�
* � � ����� ��� %��������& !' (�+� ���������� ���� � ��������������������� ������� � ���+� �� �E����!!0 393#�
+����%�������7 ���������� ��8�����7��& !'!(�5������9���9 �� ��&5,-(������)������������ ������ ������������ ���������� �� � ����� ��� ������������������������� ������ ����� ��������� �����������)����+� ���4���8�����E���� =��3@ 93@;�
< �����,��7����� ���$�� ��: �����$�� & !'@(� *�� ����� ����������� ��� ����������� �����H������ ����������)������������������������������� ��� �����������������E����!0�3 "933�
<�����<��G��& !2#(��6 �������� ���������������������� ��������������� �������� ���������� ����������� ������������������� �����0����.���������������'0�' 9'3;�
4����%��<��H��� ��7���� ����-�����& !"!(�+������������������ ����������� ������������)��������������������������� �������� �����(���������!0"3!9"@ �
4�����7�7��1 ���1�*�� ������ ����*���� & !'"(� ������������7���� �������������� ���6����� �#�������������G���7������"'0� 3@9 32�� !'"�
� %����� ����8 ����:�� ��5���������:�� & !' (�<������ ��������������� ���� ����� ��� ������������������� ���������� �����#�����������%����;20�@ 2J@3#�
E �������1��& !'"(������������������������ ����������������� ���������� ������� �����0����0$�����320� !9 "#�
E ����E�� ��7���� ����-�����& !";(�,������� ���������� ����+� ���������4���������� ����������5�������������4������E���� ;#0�22!92!3�
I����� ���H�� & !23(�$������� ���9�� ��� ������ ����� ���������� ���������� ������������ �����������0����"!=0�33'J3''�
I����� ���H�� ��4���������+��& !2 (�7������)����������������� ���������� �������������������������� ; 0�3"9@3�
I����� ����H�� ��E��%����G��& !23(�$����������9���������9��9������������.����&������"'0� ";9 23�
.//����%���%��/�
� .������� ����� ��,���� G�7�� & !2"(��+� ���+������ ���0�-������������� ������� ����������������������� �� ��N�7 ���
��� �������� ���������������� �������
2nd Proof 31/5/8
3� ,����,�G�� ��.������� ����� & !2'(�+� ���+������ ���0�-�.����������� ������� ����+� ����������������� �� ��N�7 ���
@� , �����5�<�� ��1�� ���-��& !2@(�7������� ���������� ���0������������ ��������������0���������������*������������7������%�(���$���&:�����1�8��$�(�4����� "��3 !93"@��-� ����+�����*���K��%�
��)��*7������
���/7.�������
� ����� ������������������ ��� ���� ��������������� ��������)����
3� �������������������������� ������ ���������)���� �������������������������O
@� ����� ��������������� ��� ��������� ���� ����������
=� �� �� ������������������������ ��������O�,������� ����������������� ��
;� ,�������������������������� �����������������
.���(��������7.�������
� ����������������� ������������������� ������ ���O
& ( 1����%�� &�( $�������%��
&�( ���1��E �� &( H��I����� ��
3� ��������������������������������� ���� ����� ��������O
& ( ������ �� &�( + ��� ��
&�( .������� ���� &( *������ ����
@� ����������� ����������� ����� ���������������� ���O
( . ���� &�( 4� �
&�( 6����� &( -�� �
= ���������� ���������������� �������O
& ( 4 ��� �� &�( � ��������
&�( 6������������ ��� �� &( *���������� ����
; ���������� ����������������� ���� ���������O
& ( -� �������� &�( � ��������
&�( 6������������ ��� �� &( 4 ��� ��
" 7���� D����� �������7������������������ �����������
& ( ����� ������������ ��� &�( ����� �������� ��������
&�( 5 %��������� �������� � &( -������ ����
'� �� ������������������� ���� ������������������ �������������
& ( .������ &�( 4���%��
&�( ,��������� ��� &( *���������� ����
2� <������ ������������������ ������������������� ����� ����������������
& ( , ��� &�( +����
&�( #����������&��� &( ������������
����������������� �������������������� ���
2nd Proof 31/5/8
!� 6���� ����������� ������� ���� ��� ��������� �� ���� ����� ��� ��� ����� � ��� ��������������
& ( � %����������� � &�( $�������%���
&�( ��1��E �� &( G�.��+����
#� �������������������������������� ��������������)��O
& ( +��4��� ����� &�( $�������%��
&�( ���1��E �� &( H��I����� ��
���8�$�
� &�( 3� &�( @� &�( =� &�( ;� &�( "� &(
'� &�( 2� &�( !� & ( #� &(