protocolo de utilización para sondas de dna live ... · new cork: raven press; ... la falla u...

Protocolo de utilización para sondas de DNA LIVe

Utilization protocol LIVe DNA probes

Protocolo de utilização Sondas de DNA LIVe

1

PROTOCOLO DE UTILIZACIÓN

DNA específico marcado con fluorocromo

Producto:

1. Sonda de DNA específico marcado con fluorocromo. 2. Buffer de Hibridación 3. Reactivos para preparar Solución de Montaje (DAPI + Antifade)

Estas sondas están diseñadas para utilizar sobre células en interfase o metafase obtenidas mediante procedimientos citogenéticos estándares, ver: The ACT Cytogenetics Laboratory Manual. 2nd ed. New Cork: Raven Press; 1991.

Materiales extras requeridos: Solución de Formamida* 2XSSC* Soluciones de etanol 70, 90 y 100% Pepsina* Detergente no-iónico Solución de contracolorante* diluido en antifade* pH-metro o papel para medir pH Cubreobjetos Soluciones de enjuague (1 y 2)* Cemento de contacto removible Tubos 0,2 o 0,5ml Recipientes para enjuagues (Coplin) Aceite de inmersión Cámara húmeda Termómetro

*ver protocolos de preparación mas abajo. Equipamientos requeridos:

Microscopio de fluorescencia: No siempre un microscopio utilizado en reacciones de inmunohistoquímica u otro tipo de análisis con fluorescencia resulta adecuado. Los requerimientos para observar correctamente una reacción de FISH son los siguientes:

o Fuente de Excitación: Se recomienda una lámpara de mercurio de 100 Watt con una vida útil de 200horas. Es necesario que una vez colocada, la lámpara sea alineada correctamente.

o Objetivos: Para la ubicación del blanco (interfases o metafases) se recomiendan objetivos de 10, 20 y/o 40X. Para el análisis de la reacción es necesario un objetivo de inmersión especial para fluorescencia con una apertura numérica ≥0,75.

o Filtros de excitación-emisión: Cada fluorocromo observado requerirá de diferentes filtros. Los requerimientos para nuestras sondas se muestran en el cuadro a continuación:

Fluorocromo Excitación (nm) Emisión (nm) Verde 501 523 Rojo 550 570 DAPI 350 470

Micropipetas (1-10µl o similar) Microcentrífuga Vórtex Timer Baño de inmersión

2

Incubadora 45ºC) Placa termostática o hibridizador

Preparación de soluciones extras: 2XSSC:

Cloruro de Sodio (NaCl) 300mM Citrato de Sodio (Na3C6H5O7) 30mM

Ajustar a pH:7 con Acido clorhídrico (HCl) 1N Hidróxido de Sodio: Hidróxido de sodio 0.1M (concentración final) disuelto en Etanol 70%.

Formamida: Mezclar 70% Formamida con 30% 2XSSC. Ajustar a pH:7-8.

Esta solución puede ser utilizada durante 1 semana. Guardar a 4ºC en recipiente cerrado

Pepsina:

Diluir 0,5mg de pepsina en 1ml de Acido clorhídrico (HCl) 0,01N

Enjuague 1: En un coplin adecuado para 80ml, agregar 16ml de 2XSSC, 64ml de agua bidestilada y 0,240 ml de detergente no-iónico.

Enjuague 2: En un coplin adecuado para 80ml, agregar 80ml de 2XSSC y 0,080ml de detergente no-iónico.

3

Precauciones y advertencias (Leer atentamente):

Reactivo analítico. Para uso en investigación solamente. Este producto NO está probado para uso diagnóstico o terapéutico.

Las reacciones así como la interpretación de las mismas deben ser realizadas por personal idóneo debidamente entrenado.

Todas las muestras biológicas deberían ser tratadas como posibles transmisores de agentes infecciosos.

Se debe evitar la exposición de la muestra a ácidos o bases en alta concentración así como también al calor extremo. Estos factores dañan el DNA y pueden causar el fallo de la reacción de FISH.

Una vez extraída la alícuota a utilizar, la sonda debe ser guardada nuevamente a -20ºC.

La falla u omisión de cualquiera de los pasos del protocolo detallado más abajo puede generar resultados erróneos o inaceptables.

Las soluciones de enjuague pos-hibridación (ver protocolo) deben ser renovadas periódicamente debido a que son propensas de contaminación.

El buffer de hibridación contiene formamida, un teratógeno, por lo que debe evitarse el contacto con la piel y las mucosas.

Se recomienda el uso de guantes y chaqueta de trabajo durante todo el proceso.

Es necesario controlar siempre la temperatura de las soluciones que se utilizan calientes.

Todos los materiales peligrosos deben ser descartados de acuerdo a las normativas de su institución.

4

Protocolo de utilización Consideraciones previas:

Durante el desarrollo de este protocolo NO ES NECESARIO trabajar en condiciones de semi-obscuridad. Las sondas LIVe están desarrolladas para no perder su fluorescencia durante periodos medios de exposición a luz artificial.

Si bien es altamente recomendado mantenerlas a -20ºC, las sondas LIVe no pierden su actividad después de 24hs a temperatura ambiente.

El buffer de hibridación provisto permite obtener resultados con 30 minutos de hibridación. Tiempos de Hibridación mayores a 30 minutos no afecta la calidad de la reacción.

Se recomienda utilizar 45ºC para hibridaciones de 30 minutos hasta aproximadamente 8 horas. Si la hibridación será revelada al día siguiente la temperatura debe ser de 37ºC

Extendido celular

Es muy importante que durante la realización del extendido celular NO se utilice calor extremo (flameado, secado a la llama, etc.)

Pre-tratamiento En general las sondas LIVe funcionan bien sin ningún tipo de pre-tratamiento, sin embargo, en ocasiones la presencia de restos celulares sobre el extendido o bien la hibridación de muestras como mucosa yugal, amniocitos, etc., requiere realizar una limpieza del extendido afín de exponer mejor el DNA.

Sobre la región a hibridar agregar una gota de Pepsina 0,5mg/ml (diluída en HCl 0,01N). Agregar un cubreobjetos.

Incubar en cámara húmeda a 37ºC (los tiempos varían con la severidad del tratamiento, siendo el mínimo 5 minutos).

Descartar el cubreobjetos y enjuagar el extendido bajo agua corriente. Deshidratar en etanol en series: 70, 90 y 100% 1 minuto en cada uno. Dejar secar totalmente.

5

Reacción de Hibridación in situ Fluorescente Protocolo 1: Desnaturalización con Formamida

Preparación de la sonda: Descongelar la sonda, homogeneizar en Vórtex Centrifugar brevemente Atemperar el buffer de hibridación En un tubo de PCR agregar:

7µl de Buffer de hibridación 1µl de sonda 1 1ul de sonda 2

De utilizarse sólo 1 sonda, no es necesario agregar agua.

Homogeneizar en Vórtex Centrifugar brevemente

Desnaturalización:

En el reverso del portaobjetos marcar la región a hibridar (los 8 o 9µl preparados hibridan una región aproximada de 22x22mm).

Colocar el portaobjetos en una solución de formamida 70% (en 2XSSC) a 70-75ºC durante 1-5 minutos (según la vejez del extendido).

Utilizando pinzas extraer el portaobjetos e inmediatamente colocarlo en etanol 70% agitando afín de eliminar la formamida.

Deshidratar en etanol 70, 90 y 100% 2 minutos en cada uno. Dejar secar totalmente. Desnaturalizar la solución de sonda a 70ºC durante 5 minutos. Esto

puede hacerse en un equipo con temperatura controlada o bien en baño María.

Colocar la solución de sonda en un recipiente con hielo unos segundos. Centrifugar brevemente para colectar la fracción evaporada.

Sobre la región a hibridar agregar la sonda previamente desnaturalizada.

Colocar un cubreobjetos de tamaño adecuado. Sellar los bordes con cemento de contacto removible o colocar una

lámina de Parafilm® que supere el tamaño del cubreobjetos.

Hibridación: El buffer de hibridación LIVe, permite obtener resultados para cualquier tipo de sonda con apenas 30 minutos de hibridación. Colocar el portaobjetos en cámara húmeda. Incubar durante un mínimo

de 30 minutos a 45ºC o toda la noche a 37ºC.

6

Protocolo 2: Desnaturalización con Hidróxido de Sodio (NaOH)

Desnaturalización con Hidróxido de Sodio

Este protocolo preserva de manera óptima la morfología cromosómica, permite realizar la reacción de FISH el mismo día de la preparación del extendido y brinda resultados de excelente calidad. Además, según la calidad de la suspensión celular es posible observar un patrón de bandas similar al bandeo G. Debido a la acción del NaOH en ocasiones puede generarse autofluorescencia en los núcleos y/o cromosomas tratados. Debido a esto se recomienda envejecer levemente (37-45ºC 2 horas) el extendido en estos casos.

Extendido celular Es muy importante que durante la realización del extendido celular NO se utilice calor extremo (flameado, secado a la llama, etc.)



De utilizarse sólo 1 sonda, no es necesario agregar agua. Homogeneizar en Vórtex

Centrifugar brevemente Desnaturalización: En el reverso del portaobjetos marcar la región a hibridar (los 8 o

9µl preparados hibridan una región aproximada de 22x22mm). Colocar el portaobjetos en una solución de Hidróxido de Sodio (NaOH)

0.1M (en Etanol 70%) a temperatura ambiente durante 6 minutos. Utilizando pinzas extraer el portaobjetos e inmediatamente colocarlo

en etanol 70% agitando afín de detener la acción del NaOH. Deshidratar en etanol 70, 90 y 100% 2 minutos en cada uno. Dejar secar totalmente. Desnaturalizar la solución de sonda a 70ºC durante 5 minutos. Esto

puede hacerse en un equipo con temperatura controlada o bien en baño María.

Colocar la solución de sonda en un recipiente con hielo unos segundos. Centrifugar brevemente para colectar la fracción evaporada.

Sobre la región a hibridar agregar la sonda previamente desnaturalizada.

Colocar un cubreobjetos de tamaño adecuado. Sellar los bordes con cemento de contacto removible. Nota: Una vez terminado el proceso anterior, es aconsejable colocar

el portaobjetos sobre una superficie caliente a 71ºC durante 4 minutos. Por lo general con este paso extra se obtienen mejores resultados, aunque puede disminuir levemente la calidad de la morfología cromosómica.

Hibridación: El buffer de hibridación LIVe, permite obtener resultados para cualquier tipo de sonda con apenas 30 minutos de hibridación. Colocar el portaobjetos en cámara húmeda. Incubar durante un mínimo

de 30 minutos a 45ºC o toda la noche a 37ºC.

7

Protocolo 3: Desnaturalización conjunta (Co-desnaturalización)

Con este protocolo se ha logrado homogeneizar el tiempo y la temperatura de desnaturalización conjunta (co-desnaturalización), de forma que se utilizan los mismos parámetros para extendidos frescos o mantenidos a -20ºC.



De utilizarse sólo 1 sonda, no es necesario agregar agua.

Homogeneizar en Vórtex Centrifugar brevemente Co-desnaturalización: Sobre el reverso del portaobjetos marcar la región a hibridar (los 8

o 9µl preparados hibridan una región aproximada de 22x22mm). Agregar la solución de sonda sobre la región marcada Colocar un cubreobjetos de tamaño adecuado Sellar los bordes del cubreobjetos con cemento de contacto removible Colocar el portaobjetos así montado sobre una superficie caliente

(hibridizador, plancha termostática, etc.). En ocasiones es conveniente colocar una gota de agua sobre la placa calefactora y luego colocar sobre ésta el portaobjetos montado, de esta forma se logra una película de agua entre el portaobjetos y la superficie caliente optimizando la transferencia de temperatura.

o Un tratamiento de 15 minutos a 71ºC ha funcionado de forma óptima e independientemente de la vejez del extendido (goteados en el día, envejecidos en estufa, guardados a -20ºC, etc.).

Hibridación: El buffer de hibridación LIVe, permite obtener resultados para cualquier tipo de sonda con apenas 30 minutos de hibridación. Colocar el portaobjetos en cámara húmeda. Incubar durante un mínimo de 30 minutos a 45ºC o toda la noche a 37ºC.

8

Reacción de Hibridación in situ Fluorescente

Revelado (Mismo procedimiento para protocolos 1, 2 y 3) Pasos previos Por lo menos 30 minutos antes, calentar la solución de enjuague 1 a

71ºC (+/-1ºC) corroborando con un termómetro calibrado la temperatura dentro del recipiente.

Atemperar la solución de enjuague 2 a temperatura ambiente. Atemperar el contracolorante a utilizar a temperatura ambiente. Enjuague del exceso de sonda Extraer el portaobjetos de la cámara húmeda. Quitar cuidadosamente el cemento de contacto o la lámina de Parafilm®. Sumergir el portaobjetos en una solución de 2XSSC a temperatura

ambiente hasta que el cubreobjetos se desprenda (2 a 5 minutos). Sumergir el portaobjetos en el enjuague 1 durante 2 minutos

exactamente. Sumergir el portaobjetos en el enjuague 2 un mínimo de 1 minuto. Drenar levemente el exceso de líquido. Colocar sobre la región hibridada una gota (aprox. 20µl) de

contracolorante (conteniendo la solución de Antifade). Agregar un cubreobjetos de tamaño mayor a la región hibridada. Drenar el exceso de contracolorante presionando suave y uniformemente

con papel absorbente. Eliminar posibles burbujas de aire presionando suavemente con la punta

de un tip. La reacción está lista para ser analizada.

9

Extendido celular Hecho en el momento (envejecido 2 horas a 37ºC)

Desnaturalización Formamida 70% Deshidratación en etanol

Preparación sonda Sonda + Buffer de Hibridación

Hibridación 45ºC (30 minutos – aprox. 8 horas) 37ºC (Toda la noche)

Enjuague

Montado DAPI + Antifade

OBSERVACIÓN

Desnaturalización 70ºC o más, 5 minutos

Protocolo de utilización(Protocolo 1)

10

Extendido celular Hecho en el momento Preparación sonda (envejecido 2 horas a 37ºC)

Desnaturalización Hidróxido de Sodio 0.1M

6minutos Tº amb. Deshidratación en etanol

Sonda + Buffer de Hibridación


OBSERVACIÓN

Desnaturalización 70ºC o más, 5 minutos


Opcional 71ºC, 4 minutos


Enjuague

11

Extendido celular Hecho en el momento

o Conservado -20ºC

Co-desnaturalización 71ºC 15 minutos

Preparación sonda Sonda + Buffer de Hibridación


OBSERVACIÓN



Enjuague

12

Specific DNA fluorescently tagged

Product:

1. DNA probe fluorescently labeled. 2. Hybridization Buffer 3. Reagents to prepare Mounting Solution (DAPI + antifade)

These probes are designed to be utilized on interphase or metaphase cells obtained through standard citogenetic procedures, see: The ACT Cytogenetics Laboratory Manual. 2nd ed. New Cork: Raven Press; 1991.

Materials required but not provided

Ultrapure Formamide solution* 2XSSC* Ethanol solutions 70, 90 y 100% Pepsin* Non-ionic detergent Counterstain solution* diluted in antifade* pH-meter or pH indicator papers Coverslips Wash solutions (1 y 2)* Rubber cement 0,2 or 0,5ml PCR tubes Coplin jars Moist chamber Calibrated thermometer

*see prepatation instructions below. Equipment Required:

Fluorescence microscope: Not always a microscope used in immunohistochemistry reactions or other fluorescent analysis is appropriate. The requirements to properly observe FISH reactions are as follows

o Excitation Source: a 100 Watts mercury lamp with a lifespan of 200 hours is recommended. It is necessary that once positioned,

the lamp is correctly aligned. o Objectives: To target location (interphases or metaphases)

objectives of 10, 20 and / or 40X are recommended. The reaction analysis requires a special fluorescence immersion objective with a numerical aperture ≥ 0.75

o Excitation-emission filters: Each fluorochrome require different filters. The requirements for our probes are listed in the table below:

Fluorochrome Excitation(nm) Emission (nm) Green 495 519 Red 550 570 DAPI 350 470

13

Microcentrifuge Microliter pipettor for 1 to 10 μL volumes Vórtex Timer Water bath Incubator

Reagent preparation: 2XSSC:

Sodium chloride (NaCl) 300mM Sodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7) 30mM

Adjust pH to 7.0 with drops of Hydrochloric acid (HCl) 1N

Denaturation Solution: Ultrapure Formamide 70% 2XSSC 30% Adjust pH:7-8.

Store at 4°C. Discard after 7 days. Pepsin solution:

Dilute 0,5mg of pepsin in 1ml Hydrochloric acid (HCl) 0,01N.

Wash solution 1: In a coplin suitable for 80ml, add 16ml of 2XSSC, 64ml distilled water and 0.240 ml of non-ionic detergent.

Wash solution 2: In a coplin suitable for 80ml, add 80ml of 2XSSC and 0.80 ml of non-ionic detergent.

14

Cautions and warnings (Read carefully):

Analytical reagent. For research use only. This product is NOT tested for diagnostic or therapeutic use.

The reactions and the interpretation of them must be performed by qualified personnel properly trained.

All biological samples should be treated as potential carriers of infectious agents.

Avoid exposure of sample to acid or alkali in high concentration as well as extreme heat. These factors can damage DNA and cause failure of the FISH reaction.

The failure or omission of any step of the protocol detailed below can lead to erroneous or unacceptable results.

The hybridization buffer containing formamide, a teratogen and therefore should avoid contact with skin and mucous membranes.

It is recommended the use of gloves and jacket work throughout the process.

All hazardous materials should be discarded according to rules of your institution.

15

Utilization Protocol Preliminary considerations:

• During the aplication of this protocol It is no nesessary to work in reduced-light conditions. LIVE probes were developed to not lose their fluorescence during short periods (hours) of exposure to artificial light.

While it is highly recommended to keep at -20 ºC, the probes Live does not lose its activity after 48hrs at room temperature.

The Hybridization Buffer provided leads to results in 30 minutes of hybridization. A hybridization time over 30 minutes does not affect the quality of the reaction.

It is recommended to use 45°C for 30 minutes to about 8 hours hybridizations. If the reaction will be revealed next day the temperature should be 37ºC

Cellular Smear For the cellular smear it is very important not to use extreme heat(flame, flame-drying, etc.). Pre-treatment In general Live® probes works well without any pre-treatment, however the presence of cellular debris or hybridization on certain samples as buccal mucosa, amniocytes, etc. require to clean the target DNA to improve the hybridization.

Over the smear sample apply a drop of Pepsin solution. Add a coverslip. Incubate in moist chamber at 37 ° C (times vary with the severity of

the treatment, with a minimum 5 minutes). Discard the coverslip and rinse briefly under running water. Dehydrate in ethanol series: 70, 90 and 100% 1 minute each. Allow to dry completely

16

Fluorescent in situ Hybridization reaction

Protocol 1: Denaturation using Formamide Probe preparation: Thaw the probe tube, mix on Vortex Centrifuge briefly Thaw the hybridization buffer In a PCR tube add:

7μl of hybridization buffer 1μl of probe

Mix in vortex Centrifuge briefly Denaturation: NOTE: At least 30 minutes before denaturing, heat the denaturation solution to desired temperature. With a calibrated thermometer corroborate the temperature inside the coplin. On the back of the slide highlight the region to hybridize (the 8μl

prepared cover approximately a region of 22x22mm). Immerse the slide in the denaturation solution at 60-75°C for 1-5 minutes

(depending on the age of the smear) Using tweezers remove the slide and immediately immerse in 70% ethanol

agitating for a few seconds to eliminate remaining formamide. Dehydrate in ethanol 70, 90 and 100% 2 minutes each. Allow to dry completely. Denature the probe solution at a minimum temperature of 70ºC 5 minutes.

This can be done in a temperature-controlled device or simply leaving the tube in boiling water in a polystyrene support.

Place the probe solution on ice a few seconds. Centrifuge briefly to collect the evaporated fraction.

Add the probe solution on the region to hybridize Place a coverslip of appropriate size. Seal the edges with removable contact cement or place a sheet of Parafilm®

that exceeds the size of the coverslip. Hybridization: LIVe hybridization buffer gives excellent results with any probe in just 30 minutes of incubation at 45ºC Place the mounted slide in moist chamber at 45ºC. Incubate for at least 30

minutes at 45ºC or overnight at 37ºC.

17

Protocol 2: Denaturation with Sodium Hydroxide (NaOH)

This protocol optimally preserves chromosome morphology, allows FISH reaction the same day of the cellular smear preparation and provides high quality results. Furthermore, according to the quality of the cell suspension is possible to observe a banding pattern similar to G banding. NaOH can sometimes generate autofluorescence on nuclei and / or chromosomes. In these cases it is recommended to slightly age the smears at 37-45ºC 2 hours.

Probe preparation: Thaw the probe tube, mix on Vortex Centrifuge briefly Thaw the hybridization buffer In a PCR tube add:


Mix in vortex Centrifuge briefly Denaturation: On the back of the slide highlight the region to hybridize (the 8μl

prepared cover approximately a region of 22x22mm). Immerse the slide in a solution of NaOH 0.1M in Ethanol 70% at room

temperature for 6 minutes. Using tweezers remove the slide and immediately immerse in 70% ethanol

agitating for a few seconds to eliminate remaining NaOH. Dehydrate in ethanol 70, 90 and 100% 2 minutes each. Allow to dry completely. Denature the probe solution at a minimum temperature of 70ºC 5 minutes.

This can be done in a temperature-controlled device or simply leaving the tube in boiling water in a polystyrene support.

Place the probe solution on ice a few seconds. Centrifuge briefly to collect the evaporated fraction.

Add the probe solution on the region to hybridize Place a coverslip of appropriate size. Seal the edges with removable contact cement or place a sheet of Parafilm®

that exceeds the size of the coverslip. • Note: Once the above process, a good alternative is to place the slide on a hot surface at 71°C for 4 minutes. Usually this extra step gives better results, although it may slightly decrease the quality of chromosome morphology Hybridization: LIVe hybridization buffer gives excellent results with any probe in just 30 minutes of incubation at 45ºC Place the mounted slide in moist chamber at 45ºC. Incubate for at least 30


18

Protocol 3: Co-denaturation

This protocol has been designed to unify co-denaturation time and temperature. Here, these parameters are the same for cell smears prepared on the day or kept at -20°C.

Probe preparation: Thaw the probe tube, mix on Vortex Centrifuge briefly Thaw the hybridization buffer In a PCR tube add:


Mix in vortex Centrifuge briefly

Co-Denaturation: On the back of the slide highlight the region to hybridize (the 8μl

prepared cover approximately a region of 22x22mm). Add the probe solution on the region to hybridize Place a coverslip of appropriate size. Seal the edges with removable contact cement or place a sheet of Parafilm®

that exceeds the size of the coverslip. Place the mounted slide on a hot surface (hybridizer, thermostatic plate,

etc.). Sometimes it is advisable to place a drop of water on the hot plate to optimize the temperature transfer.

o A treatment of 15 minutes at 71°C has functioned optimally and independently of the age of the smears.

Hybridization: LIVe hybridization buffer gives excellent results with any probe in just 30 minutes of incubation at 45ºC Place the mounted slide in moist chamber at 45ºC. Incubate for at least 30


19

Washing: Note: At least 30 minutes before washing, heat the wash solution 1 to 71°C (+/-1ºC). With a calibrated thermometer corroborate the temperature inside the coplin. Thaw wash solution 2 to room temperature.

Remove the slide from moist chamber. Carefully remove the rubber cement or Parafilm® sheet. Immerse the slide in a 2XSSC solution at room temperature until the

coverslip falls off. Immerse the slide in the wash solution 1 for exactly 2 minutes. Immerse the slide in the wash solution 2 for at least 1 minute. Take off the slide and drain excess liquid slightly. Place on a drop of mounting solution on the hybridized region. Place a coverslip of appropriate size Drain excess mounting solution by pressing gently and evenly with paper

towels. Remove any air bubbles by pressing gently with a tip. The reaction is ready for analysis

20

Cellular smear

Denaturation Formamide 70% Dehydration in ethanol

Probe preparation DNA Probe + Hybridization buffer

Hybridization 45ºC (30 minutes to about 8 hours) 37ºC (Overnight)

Washes

Mounting DAPI + Antifade

Analysis

Denaturation 70ºC or more, 5 minutes

Protocol for use (Protocol #1)

21

Cellular smear Made the same day

(aged 2 hours at 37ºC)

Denaturation Sodium Hydroxide 0.1M 6minutes Room Tº. Dehydration in ethanol

Alternative 71ºC, 4 minutes


Probe preparation DNA Probe + Hybridization buffer

Denaturation 70ºC or more, 5 minutes


Washes

Analysis


22

Cellular Smear Made the same day

or Kept at -20ºC

Co-denaturation 71ºC 15 minutes

Probe preparation DNA Probe + Hibridization buffer

Washes




Analysis

23

DNA especifico com marca fluorescente Produto:

1. DNA marcado com identificação fluorescente. Sonda 2. Buffer(tampão) Hibridizador 3. Reagentes para Preparação de solução de montagem(DAPI + antifade)

Estas sondas estão desenhadas para serem utilizadas nas células interfásicas ou metafísicas, obtidas através de procedimentos padrões citogenéticos, veja:O Manual ACT Cytogenetics Laboratory . 2nd ed. New Cork: Raven Press; 1991.

Materiais necessários que não estão incluídos

Solução ultra pura de Formamida 2XSSC* Etanol em solução 70, 90. 100% Pepsina* Detergente não iônico pH-medidor ou papel para medir pH Coverslip/lamínula Soluções de lavado (1 y 2)* Adesivo de contato Tubos PCR 0,2 ou 0,5ml Frascos coplin Câmera úmida Termômetro calibrado

* Ver abaixo as instruções de preparação. Equipamento necessário:

Microscópio fluorescente: nem sempre o microscópio usado nas reações imunoistoquímica ou em outras analises fluorescentes são apropriado. Os

requisitos para observar corretamente as reações FISH são os seguintes: Fonte de excitação: Recomenda-se uma lâmpara de 1oo watts de mercúrio com uma vida útil de 200hs. É necessário que uma vez posicionada, a

lâmpada esteja corretamente alinhada.

Obj ivos: para localizar o alvo (interfases ou metafases) são recomendadas objetivas de 10, 20 e/ou 40x. A análise da reação requer

et

de uma objetiva fluorescente de imersão com uma abertura numérica ≥ 0.75

Filtros de emissão-excitação: Cada flourocromo requer um filtro diferente. Os requisitos para nossas sondas estão na tabela abaixo:

24

Fluorocromo Excitação(nm) Emissão (nm)Verde 495 519 VERMELHO 550 570 DAPI 350 470

Microcentrifuga a volumes 1 a 10 μL

Preparação de Reagentes:

Micropipetas par Vórtex Timer/ cronômetro Banho- maria Incubadora

2XSSC: Cloreto de sódio(NaCl)

300mM

e sódio desidratado(Na3C6H5O7) 30mM

Citrato dAjustar o pH a 7.0 com gotas de ácido clorídrico (HCl)1N Solução de Desnaturação:

%

7 dias.

ção Pepsina:

Formamida Ultrapura 702XSSC 30%

Ajustar pH:7-8. Armazenar a 4ºC. descartar depois de

Solu

que:

Solução esto 10% [0.1g/ml]

ote-Diluir 0,1 g de pepsina em 1 ml de água ultrapura

(N se a pH deve ser = 2) • A

pós a preparação armazenar a -20 ° C

Solução de trabalho: 0,05% [0.5mg/ml] Pepsina solução stock: 0,4 ml HCl

(Obr a 4 ° C durante 30 dias ou 4

Solução de lavado 1:

12N (puro): 0.66ml H2O destilada: 79ml

er = 2) serve o pH final deve s• Após a utilização, armazenautilizações.

Em um coplin( frasco de vidro) adequado para 80ml, adicione 16ml de 2XSSC, 64ml de agua destilada e 0.240ml de detergente não iônico.

Solução de lavado 2:

vidro) adequado para 80ml, adicione 80ml de 2XSSC e não iônico

Precauções e advertências (leia com atenção):

Em um coplin(frasco de0.80ml de detergente

25

Reagente analítico. Somente para investigação. Este produto Não está

aprovado para diagnóstico ou uso terapêutico

vem ser por

altas temperaturas. Estes fatores podem danificar o DNA e causar falhas

continuação pode levar a resultados errôneos ou inaceitáveis.

as da

As reações e interpretações dos mesmos de realizadas

profissionais qualificados e corretamente treinados.

Toda amostra biológica deve ser tratada como possível portadora de agentes infecciosos.

Evitar expor as amostras a acido ou alcalis em concentrações elevadas e

na reação FISH.

A falha ou omissão de qualquer passo do protocolo detalhado a

O buffer(tampão)hibridizador contém formamida, um teratogênico e

portanto deve-se evitar o contato com a pele ou membranas mucosas.

Recomenda-se o uso de avental de trabalho durante o procedimento.

Todo material perigoso deve ser jogado fora de acordo com as normsua instituição.

26

Protocolo de utilização Considerações preliminares:

Durante a aplicação deste protocolo não é necessário agir em condições de luz tênue. As sondas LIVE foram desenvolvidas para não perderem sua fluorescência durante curtos períodos (horas) de exposição à luz artificial.

Embora seja altamente recomendável mantê-las a -20 ºC, as sondas LIVE não perdem sua ação depois de 48hs a temperatura ambiente.

O buffer (tampão) hibridizador mostrará resultados em 30 minutos de hibridização. Uma hibridização maior a 30 minutos não interfere na qualidade da reação.

Recomenda-se usar 45ºC para 30 minutos até aproximadamente 8hs de

hibridização. Se a reação for mostrada no dia seguinte, a temperatura deverá ser de 37ºC.

Esfregaço/smear celular Para o esfregaço celular é muito importante não usar temperaturas extremas Tratamento prévio Em geral as sondas LIVE funcionam bem sem qualquer tratamento prévio, contudo a presença de fragmentos celulares ou hibridização em algumas amostras como mucosa bucal, amniocitos, etc. requerem que se limpe o DNA especifico para melhorar a hibridização.

Sobre a amostra do esfregaço aplique uma gota de solução de pepisina. Adicione um Coverslip/lamínula.

Incube em uma câmara úmida a 37ºC (o tempo varia com a severidade do tratamento, com 1 minuto como mínimo).

Descarte o Coerslip/lamínula e enxague rapidamente embaixo de agua

corrente.

Desidrate em series de etanol: 70,90 y 100% 1 minuto em cada um.

Espere que se seque completamente.

27

Reação de hibridização flourescente in situ

Protocolo1: Desnaturação usando Formamida

Preparação da sonda: Descongele o tubo da sonda, misture no vortex Centrifugue rapidamente Descongele o buffer(tampão) hibridação Em um tubo PCR adicione:

7μl de buffer(tampão)hibridação 1μl de sonda

Misture no vortex Centrifugue rapidamente Desnaturação: NOTA: Pelo menos 30 minutos antes da desnaturação, aqueça a solução a temperatura desejada. Com um termômetro calibrado certifique a temperatura no interior do COPLIN(frasco de vidro). Na parte de tras da lâmina marque a região para hibridizar(os 8μl

hibridram aproximadamente uma região de 22x22mm). Mergulhe a lâmina na solução desnaturada a 60-75º por 1-5 min (dependendo

da idade do esfregaço/smear) Usando pinças retire a lâmina e imediatamente mergulhe em 70% etanol

agitando por alguns segundos para eliminar a formamida restante. Desidrate em etanol 70, 90 e 100% 2 minutos cada um.

Espere que se seque completamente.

Desnature a solução desonda a uma temperatura mínima de 70ºC por 5

minutos. Isto pode ser feito com um dispositivo controlador de temperatura ou simplesmente deixando o tubo emágua fervendo em um suporte de poliestireno

Coloque a solução de sonda em gelo por alguns segundos. Centrifugue rapidamente para recolher a parte evaporada.

Adicione a solução de sondana região para hibridizar. Coloque um COVERSLIP/LAMINULA do tamanho apropriado.

Sele as bordas com adesivo de contato removível ou coloque uma folha de

Parafilm® que ultrapasse o tamanho do coverslip/lamínula.

Hibridação: O buffer hibridizador LIVE outorga excelente resultados com qualquer sonda em somente 30 minutos de incubação a 45ºC Coloque a lâmina montada em uma câmara úmida a 45ºC. Incubar pelo menos

por 30 minutos a 45ºC ou de um dia para o outro a 37ºC

28

Protocolo 2: Desnaturação com Hidróxido de Sódio Este protocolo preserva de maneira ideal a morfologia dos cromossomas, permite a reação FISH no mesmo dia da preparação do esfregaço-smear celular e dá resultados de alta qualidade. Além disso, de acordo coma qualidade da suspenção celular é possível observar um padrão de bandas similar ao da banda G. NaO Has vezes pode gerar autofluorescência em um núcleo e /ou cromossomas. Neste caso se recomenda envelhecer levemente os esfregaços a 37-45ºC 2 horas.

Preparação da sonda: Descongele o tubo da sonda, misture no vortex Centrifugar rapidamente Descongele o buffer(tampão) hibridação Em um tubo PCR adicionar:

7μl buffer(tampão) hibridação 1μl sonda

Misturar no vortex Centrifugar rapidamente Desnaturação: Na parte de trás da lâmina marcar a região para hibridizar (os 8µl

preparados hibridam uma região aproximada de 22x22mm).

Mergulhe a lâmina em uma solução de NaOH 0.1M em etanol 70% a temperatura ambiente por 6 minutos.

Utilizando pinças retire a lâmina e imediatamente mergulhe em etanol 70% agitando por uns segundos para eliminar o NaOH restante.

Desidratar em etanol 70, 90 e 100% 2 minutos cada um.

Esperar que seque completamente.

Desnaturar a solução de sonda a uma temperatura mínima de 70ºC por 5

minutos. Isto pode ser feito em dispositivo controlador de temperatura ou simplesmente deixando o tubo em agua fervendo em um suporte de poliestireno.

Coloque a solução sonda em gelo por uns segundos. Centrifugue rapidamente

para recolher a parte evaporada. Adicione a solução de sonda na região para hibridizar

Coloque um coverslip/lamínulade tamanho apropriado.

Sele as bordas com adesivo de contato ou coloque uma folha de Parafilm® que

exceda o tamanho do coverslip/lamínula. NOTA: uma vez terminado o processo anterior, é uma boa alternativa colocar a lâmina em uma superfície quente a 71ºC por 4 minutos. Em geral neste passo extra acontece melhores resultados, contudo se pode diminuir levemente a qualidade da morfologia dos cromossomas

29

Hibridização: O Buffer(tampão)hibridizador LIVE oferece excelentes resultados com qualquer sonda em somente 30 minutos de incubação a 45ºC. Coloque a lâmina montada em uma câmara úmida a 45ºC. incubar pelo menos

por 30 minutos a 45ºC ou de um dia para o outro a 37ºC.

30

Protocolo3: Co-desnaturação

Este protocolo foi desenhado para unificar o tempo da co-desnaturaçãocom a temperatura. Aqui, os parâmetros são os mesmo para esfregaços/smear preparadas no dia ou as guardadas a -20ºC

preparação da sonda: Descongele o tubo da sonda, misture no Vortex Centrifugue rapidamente Descongele o buffer(tampão) hibridação Em um tubo PCR adicione:

7μl buffer(tampão) hibridação 1μl sonda

Misture no vortex Centrifugue rapidamente

Co-Desnaturação: Na parte de trás da lâmina marque a regiao para hibridizar (os 8µl

preparados hibridam uma região aproximada de 22x22mm). Adicione a sonda na região para hibridizar Coloque um coverslip/lamínula de tamanho apropriado. Sele as bordas com adesivo de contato removível ou coloque uma folha de

Parafilm® que exceda o tamanho do coverslip/lamínula. Coloque a lâmina montada em uma superfície quente (hibridizador, placa

termostática, etc.). Às vezes é aconselhável colocar uma gota de água na placa quente para poder aperfeiçoar a transferência de temperatura.

Um tratamentode 15 minutos a 71°C tem funcionado bem independente da idade doesfregaço/smears.

Hibridização: O Buffer(tampão)hibridizador LIVE oferece excelentes resultados com qualquer sonda em somente 30 minutos de incubação a 45ºC. Coloque a lâmina montada em uma câmera úmida a 45ºC. Incubar pelo menos 30

minutos a 45ºC ou durante a noite a 37ºC.

31

Lavagem: Nota: Pelo menos 30 minutos antes da lavagem, aqueça a solução de lavado 1 para 71°C (+/-1ºC).Com um termômetro calibrado confira a temperatura dentro do coplin(frasco de vidro). Descongele a solução de lavado 2 a temperatura ambiente.

Retirea lâmina da câmera úmida. Com cuidado retire o adesivo ou a folha de Parafilm® Mergulhe a lâminaem uma solução 2XSSC a temperatura ambiente até o

coverslip/lamínula cair. Mergulhe a lâmina na solução de lavado 1 por exatamente 2 minutos Mergulhe a lâmina na solução de lavado 2 pelo menos 1 minuto. Retire a lâmina e drene o excesso de liquido ligeiramente. Coloque uma gota na solução de montagem na região hibridizada. Coloque o coverslip/lamínula do tamanho apropriado. Drene o excesso da solução de montagem pressionando com cuidado e

secando com toalhas de papel. Remova alguma bolha de ar pressionando com cuidado. A reação está pronta para ser lida

32

Esfregaço/smear Celular

Desnaturação Formamida 70% Desidratar em etanol

Preparação da Sonda DNA sonda + Buffer Hibridização

Hibridação 45ºC (30 minutos - 8 horas) 37ºC (Overnight)

Lavados

Montagem DAPI + Antifade

Análise

Desnaturação 70ºC ou mais

Protocolo para uso (Protocol #1)

33

Desnaturação Hidroxido de sodio 0.1M, 6minutos, Tº ambiente. Desidratar em etanol

Alternativa 71ºC, 4 minutos

Protocolo para uso (Protocolo #2)

Celular Esfregaço/smear Feito no mesmo dia

ou Preparação sonda DNA Sonda +Hibridização buffer

Desnaturação 70ºC ou mais, 5 minutos

Lavagens

Analise

conservada a -20ºC

Montagem

Hibridação 45ºC (30 minutos - 8 horas) 37ºC (Overnight)

DAPI + Antifade

34

Celular Esfregaço/smear Feito no mesmo dia

ou conservada a -20ºC

Co-desnaturaçao 71ºC 15 minutos

Preparação sonda DNA Sonda +Hibridização buffer

Protocolo para uso (Protocolo #3)

Hibridização 45ºC (30 minutos - 8 horas) 37ºC (Overnight)

Montagem DAPI + Antifade

Lavagens

Analise

35

protocolo de utilización para sondas de dna live ... · new cork: raven press; ... la falla u...

Documents