proteínas: métodos para su estudio. propiedades espectroscópicas todos los aminoácidos absorben...
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Proteínas: Proteínas:
Métodos para su Métodos para su
EstudioEstudio
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Propiedades Espectroscópicas
• Todos los aminoácidos absorben luz en la región infraroja
• Sólo Phe, Tyr, & Trp absorben UV
• Absorbancia a 280 nm es un buen diagnóstico para aminoácidos
• Espectros en NMR son característicos de cada residuo en una proteína, y medidas de alta resolución en NMR pueden usarse para elucidar la estructura 3D de las proteínas
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Espectrofotometría
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Separación de Aminoácidos
• Mikhail Tswett, botánico ruso, separó pigmentos coloreados de plantas por ‘cromatografía’
• Existen muchos métodos cromatográficos para separar mezclas de aminoácidos– Cromatografía de intercambio iónico– Cromatografía líquida de alta performance
(HPLC)
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Cromatografía de Intercambio Iónico
Perlitas del polímero
tienen grupos cargados
positiva (int. aniónico) o
negativas (int. catiónico)Mezcla de proteínas es
añadida a columna con
intercambiador (cat)
Proteínas se mueven por la columna a velocidades determinadas por su carga neta al pH que se está
usando. En el intercambiador catiónico, las proteínas con mayor carga negativa se moverán más
rápido y eluirán antes
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Intercambiador aniónico:
p. ej. Dietil aminoetil
celulosa (DEAE)
Intercambiador catiónico:
p. ej. Carboximetil –
celulosa (CM)
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Intercambiador catiónico:La resina tendrá carga negativa e intercambiará cationes (p. ej. Na+) por un aminoácido cargado positivamente
p.ej. Carboximetil celulosa
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Biochemistry 2/e - Garrett & Grisham
Copyright © 1999 by Harcourt Brace & Company
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Biochemistry 2/e - Garrett & Grisham
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Cromatografía de Partición / Tamiz molecular
Mezcla de proteínas es añadida a la Mezcla de proteínas es añadida a la
columna la cual contiene un polímerocolumna la cual contiene un polímero
Moléculas de proteínas se separan en base Moléculas de proteínas se separan en base
a tamaño; las más grandes es añadida a la a tamaño; las más grandes es añadida a la
columna la cual cpasan más libremente y columna la cual cpasan más libremente y
aparecen en las primeras fraccionesaparecen en las primeras fracciones
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Cromatografía de Afinidad
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Electroforesis
Electroforesis en geles de poliacrilamida
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Luego de la tinción : con nitrato de plata o Azul de Coomassie
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Determinación el peso molecular de una proteína “problema”
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Separación de proteínas en dos dimensiones:
1: En base a su punto isoeléctrico
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Segundo: En base a su peso molecular
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Arbol filogenético basado en secuencia de una
proteína/gen conservado
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Insulina consiste de dos cadenas polipeptídicas, A y B, mantenidas unidas por dos puentes disulfuro. La cadena A tiene 21 residuos y la cadena B tiene 30 residuos.
La secuencia mostrada es la de la insulina bovina.
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Determinando la Secuencia Una Estrategia de Ocho Pasos
• 1. Si hay más de una cadena polipeptídica, separarlas.
• 2. Romper (reducir) puentes disulfuro• 3. Determinar composición de c/ cadena• 4. Determinar residuos N- y C-terminal• 5. Cortar c/cadena en fragmentos
pequeños y determinar su secuencia
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Determinar la Secuencia Una Estrategia de Ocho Pasos
• 6. Repetir paso 5, usando procedimiento de corte diferente para generar un
juego diferente de fragmentos • 7. Reconstruir la secuencia de la proteína
a partir de la secuencia de fragmentos que se sobreponen
• 8. Determinar las posiciones de los puentes disulfuro
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Especificidad de Endopeptidasas
Enzima Fuente Especificidad
Tripsina Páncreas bovino Rn-1 = +: Arg, Lys; Rn ‡ Pro Quimiotripsina Pancreas bovino Rn-1 = grandes: Phe, Trp, Tyr
Rn ‡ ProElastasa Páncreas bovino Rn-1 pequeños neutros:
Ala, Gly, Ser, Val, Rn ‡ ProTermolisina B.thermoproteolyticus Rn Ile, Met, Phe, Trp, Tyr, Val
Rn-1 ‡ ProPepsina Mucosa gástrica bovina Rn=Leu, Phe, Trp,Tyr, Rn-1 ‡ProEndopeptidasa V8 Staphylococcus aureus Rn-1 ‡ Glu
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Especificidad de exopeptidasas
Enzima Fuente Especificidad
Carboxipeptidasa A Páncreas bovino Rn ‡ Arg. Lys, Pro; Rn-1 ‡ ProCarboxipeptidasa B Páncreas bovino Rn = Arg, Lys; Rn-1 ‡ ProCarboxipeptidasa C Hojas cítrico Todos los residuos C-terminal
libres; pH óptimo = 3.5Carboxipeptidasa Y Levadura Todos los residuos C-terminal
libre, pero lento con Rn = GlyLeucine aminopeptidasa Riñón porcino R1 ‡ ProAminopeptidasa M Riñón porcino Todo residuo N-terminal libre
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Paso 1:Separación de cadenas
• Interacción entre subunidades depende de fuerzas débiles
• Separación es llevada a cabo con :- pH extremo - 8M urea- 6M guanidina HCl- concentración alta de sales
(generalmente sulfato de amonio)
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Paso 2:
Corte de Puentes Disulfuro
• Oxidación de Acido Perfórmico
• Agentes reductores Sulfhidrílicos
- mercaptoetanol
- ditiotreitol or ditioeritritol
- para prevenir recombinación, seguir con agente alquilante como iodoacetato
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Paso 3:Determinar Composición de Aminoácidos
• Cromatografía de intercambio iónico
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Paso 4:Identificar residuos N- y C-terminal
• Analisis N-terminal :– Reactivo de Edman (PTI)
– Tratamiento con PTI genera derivados de los aminoácidos que son Feniltiohidantoínas
– Libera al a.a. N-terminal y deja cadena intacta
• Otros compuestos:– Cloruro de dansilo (con aminas primarias,
también con e-amino de Lys)
– Ventaja: producto es fluorescente y puede detectarse en concentraciones muy bajas
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Reactivo de Edman
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Paso 4:
Identificar residuos N- y C-terminal
• Análisis C-terminal– Análisis enzimático (carboxipeptidasa)
– Carboxipeptidasa A corta cualquier residuo excepto Pro, Arg, y Lys
– Carboxipeptidasa B (pancreas de cerdo) sólo actúa en Arg y Lys
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Pasos 5 y 6:
Fragmentación de las cadenas
• Fragmentación Enzimática– tripsina, quimiotripsina, clostripaina,
proteasa de staphylococcus
• Fragmentación Química– Bromuro de cianógeno
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Fragmentación Enzimática
• Tripsin - corta en lado C de Lys, Arg
• Quimiotripsina – lado C de Phe, Tyr, Trp
• Clostripaina - como tripsina, pero ataca a las Arg más que a las Lys
• Proteasa de Staphylococcus– Lado C de Glu, Asp en buffer fosfato
– Específico para Glu en buffer acetato o bicarbonato
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Corte por Bromuro de CianógenoCorte por Bromuro de Cianógeno
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Paso 7:Reconstruyendo la Secuencia
• Usar dos o más agentes fragmentadores en experimentos separados
• Secuenciar todos los péptidos producidos (generalmente por degradación de Edman)
• Comparar y alinear péptidos con secuencias que se sobrepongan para determinar la secuencia de la cadena polipeptídica original
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Reconstruyendo la Secuencia
Comparar corte por tripsina y proteasa de staphylococco en un péptido típico :
• Corte por Tripsina :
A-E-F-S-G-I-T-P-K L-V-G-K
• Proteasa de Staphylococcus:
F-S-G-I-T-P-K L-V-G-K-A-E
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Reconstruyendo la Secuencia
• The correct overlap of fragments:
L-V-G-K A-E-F-S-G-I-T-P-KL-V-G-K-A-E F-S-G-I-T-P-K
• Secuencia Correcta:
L-V-G-K-A-E-F-S-G-I-T-P-K
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