Prof.Dr.ulePekyardmc AnkaraniversitesiKimyaBlm A k i it iKi Bl

Protein Tayin YntemleriBir ltid ki toplam protein miktarnn belirlenmesi, bilimsel Bi zeltideki t l t i ikt b li l i bili l aratrmalarda, gda analizlerinde, endstriyel ve biyoteknolojik birok rnn analizinde kullanlr. anal z nde kullan l r. Proteinlerin saflatrma basamaklarnda mutlaka protein tayinleri yaplmaldr. Saflatrlan protein bir enzimse ek olarak aktivite tayinlerinin de yaplmas gerekir. zellikle kromatografik ve elektroforetik ayrmalarda deneylerin optimizasyonu iin miktar tayini yaplmas gerekir. Gnmzde tehis iin nemli olan enzim ve serum proteinlerinin hemen hepsi otomasyonlu spektrofotometrik yntem ve kitler kullanlarak y p yaplmaktadr.

Protein tayinleri tm biyokimya laboratuvarlarnda rutin olarak yaplr, kan ve idrardaki protein miktarlarndan baz hastalk tehisleri yaplr yaplr. Temel biyokimyasal ilemlerde de spesifik aktivite tanm iin biyolojik rnein protein miktarndan yararlanlr (aktivite/mg protein).

Protein Tayin Yntemleri

1.Kjeldal Yntemi2. Spektrometrik Yntemler Grnr Blgedeki l l d k lmler l Ultraviyole Blgedeki lmler

- Bire Yntemi - Bikinkoninik asit Yntemi - Lowry Yntemi y

Florimetrik Yntemler 3. Boya Balama Yntemleri 4. Gravimetrik Yntemler 4 G kY l

Protein tayinleri dolayl (indirekt) ve dorudan (direkt) yntemler olarak iki ksmda incelenebilir. Dorudan Yntemler D d Y l Proteinlerin fiziksel zelliklerinden yararlanlarak yaplan tayinlerdir. 1.Gravimetrik Yntemler (Kuru ktle) Analizleri: Bir frnda kurutulduktan sonra kuru arlk bulunur. 2. Toplam Azot Miktar (Kjeldahl Yntemi): Azot tayini zerinden yaplr. 3. Amino Asit Analizleri: Asit hidrolizinden sonra amino asitlerin lm m no s t nal zler s t h drol z nden am no as tler n yaplr. 4. UV Spektroskopisi: Aromatik yan zincirlerin n absorbsiyonuna dayanr.

Dorudan yntemler, rnekteki proteinin gerek ktlesini lt iin avantajldr. avantajldr Ancak hassas olmadklar iin az kullanlr. Bu B tayinler iin d h f l protein rneine gerek d i l i i daha fazla i i k duyulur ve i l l ilem zaman alcdr. UV spektroskopisi hzl bir yntemdir, ancak giriim etkileri f l d k k i i h l bi di k i i i kil i fazladr.

Dolayl Yntemler

Proteinlerin eitli kimyasal reaktiflerle oluturduu renkli bileiklerin belirli dalga boylarnda verdikleri absorbansa d dayal lmlerdir. b li li d l b l d dikl i b b l l l di Bu yntemin dezavantaj, farkl proteinler, farkl kolorimetrik reaktiflerle farkl reaksiyonlar verir. Reaktifle protein rneinin reaksiyonu sonucu oluan absorbans, rnekteki proteinin bal miktarn hesaplamak iin kullanlr (protein standardna gre bal miktar). Dolayl yntemler, proteinin gerek miktarn len dorudan yntemlerle kyaslandklarnda her zaman bal miktar belirtir. Dolayl yntemler hzl spesifik ve hassas olduklar iin ok kullanlr Bu hzl, kullanlr. yntemlerle ok kk miktardaki proteinler bile hesaplanabilir.

Primer yaps bilinen bir proteinin amino asit analizleri ile miktar tayini yaplmaktadr. l kt d Bu yntemde asidik ortamda triptofan, sistin ve sistein gibi amino asitler hidrolize kar hassas olduklarndan bunlarla ilgili baz hatalar olabilmektedir. Ayrca glutamin ve asparajin amino asitleri de hidrolizden sonra glutamik asit ve aspartik aside dnmektedir. p

Protein StandartlarBirok protein tayin ynteminde bilinen bir proteinin kullanlmasyla izilen standart grafikler yardmyla bilinmeyen rnein miktar bulunur. Proteinin amino asit bileimi ve protein prostetik gruplarn varl ruplar n varl (glikoproteinlerdeki karbohidrat gruplar gibi) spektrometrik bir lmde y renk deiimini etkileyebilir. lm yaplacak tm standartlar ve rnek iki veya seri halinde hazrlanmaldr. Bu daha doru sonularn alnmas iin ok nemlidir.

Mmknse saflatrlmak istenen proteinin saf bir rnei ile lm kalibre etmek, benzer renk verimine ulamak iin iyi bir zmdr. Byle bir zmn mmkn olmad durumlarda yaygn olarak kullanlan protein standard, sr serum albuminidir (BSA). mmnoglobulin G de bu amala kullanlmaktadr. kullanlmaktadr Farkl proteinler ayn yntemde bile bazen farkl sonular verebilir. y y j rnein Lowry ynteminde 10 g jelatin 10 g BSA'n verdii absorbansn %69'unu verir.

KvetlerProtein tayinlerinde farkl koullarda farkl kvetlerden yararlanlmaktadr. Cam kvetlerle Kuartz kvetler 320 nm nin zerindeki lmler UV-VIS blgedeki lmler

Tek kullanmlk polisitiren kvetler 340 nm nin zerinde Akrilik kvetler 275-350 nm arasnda kullanlmaktadr kullanlmaktadr.

zellikle boya-balama esasl protein tayin yntemlerinde boya veya y p mp p y p m y boya-protein kompleksinin kvet eperlerine yapmas sorun yaratt iin tek kullanmlk kvetleri kullanmak daha uygundur. Kvetlerle alrken cam kvetlere cam pipetlerin dedirilmemesine, kvet i i d h k iinde hava k b kabarcklar olumamasna, k kl l kvetin k geiren yzeyinde i k i i d parmak izi olmamasna zen gsterilmelidir. Oluan parmak izleri %70 lik etanolle silinmelidir silinmelidir.

Protein t in nt minin seimi Pr t in tayin ynteminin s imi Belirlenecek proteinin rnekdeki miktarna yapsna ( uygun rnekler sv halde olanlardr) (en yg ) rnein y p Yntemin o proteine spesifikliine Giriim yapan maddelerin varlna (protein ktrmesi yaptktan sonra ykama i l l i l b maddeler ayrlabilir. A i asitler ve t l gibi k ilemleriyle bu dd l l bili Amino itl tuzlar ibi kk molekller ise diyalizle uzaklatrlabilir). y y p proteinin amino asit bileimine baldr. m m Miktar tayini yaplacak p

Kjeldahl Yntemi1883 ylnda Johan Kjeldahl tarafndan gelitirilmi, bileiklerin azot miktarn belirlemek iin kullanlan olduka eski bir yntemdir. Bu B yntemde bil ikl d bulunan azot, deriik H2SO4l ve Cu+2 i d bileiklerde b l d i ik le C 2 iyonlar, l civa iyonlar ve metalik selenyum gibi katalizrlerle reaksiyona sokularak NH3 a dnr. Bylece NH3 asidik ortamda NH4+ iyonlar halinde y y tutulur. zelti H2SO4 ilavesinden sonra kahverengi-siyah bir renk alr, stldkca berraklar berraklar. Souyan karm distilasyon cihazna alnr ve ortamn kuvvetli bazik olmas iin NaOH ilave edilir. Oluan NH3 destillenerek alnr ve borik asit zeltisinde t t l it lti i d tutulur. NH4+ iyonlar, ayarl HCl ile titre edilir. Proteindeki azot oranndan hareket ederek protein miktar belirlenir belirlenir.

Bu yntemle; aminlerde, proteinlerde ve amitlerde bulunan amonyak aminlerde azotlar tayin edilebilir. Ancak bu yntem, ortamda protein d nda baka azot kayna olduu prote n dnda kayna durumlarda kullanlamaz. Byle bir durumda proteinler ktrldkten sonra tayin yaplmaldr. Bu yntemin hassasiyeti iyi deildir.

Proteindeki Toplam Azot Miktarnn Hesaplamas Hesaplama, Hesaplama bir mol azot atomunun, bir mol NH3 oluturmasna ve bunu atomunun ntralize etmek iin bir mol asit kullanlmas gerektii temeline gre yaplr. 1,0 1 0 mol HCl 14 g azota edeerdir. HCl, rnekte bulunan azottan oluan amonya ntralize etmek iin B mol/L konsantrasyonundaki A ml asit zeltisi gerekiyorsa rnekte bulunan azot miktar aadaki formlle bulunur bulunur. Proteinler ortalama olarak % 16 civarnda azot ierdiinden titrasyon sonucu b l bulunan azot yardmyla protein miktar hesaplanr. d l k h l

N (g) = 14/1000 x A x B

1 mg azot (N) 6,25 mg proteine edeerdir. (100 16= (100: 16 6,25 Kjeldahl Faktr)

rnekteki protein miktar (g) = 14/1000 x A x B x 6,25 bulunur. bulunur

eitliinden

Protein Kayna Kan Plazmas l St Buday Et Yumurta

Azot % si 15.3 15.6 17 5 17.5 16.0 14.9

Dnm Faktr 6.54 6.38 5.70 5 70 6.25 6.68

SPEKTROMETRK YNTEMLERProtein konsantrasyonunun belirlenmesinde ok fazla kullanlr. Beer yasasna gre absorbans konsantrasyonla ilgili olduundan rnekteki protein miktar hesaplanr. A=xlxc A = Absorbans = Molar absorbsiyon katsays (ekstiksiyon katsays, M-1 cm-1) l = In getii yol (cm) Her H proteinin k di molar ekstinksiyon k ts s () vardr. Bu il ml d t i i kendi m l ksti ksi katsays ( ) d B ilemlerde molar konsantrasyon kullanlr ve n getii yol ise genel olarak 1 cm olduu iin molar ekstiksiyon katsaysnn birimi (M-1cm-1) dir. Absorbans skalann dna karsa protein rnei tamponla seyreltilir ve lm tekrarlanr. Buna alternatif olarak daha ksa k yolu olan bir kvet de kullanlabilir kullanlabilir.

Absorbans yardmyla konsantrasyonun belirlenmesi iin molar absorbans katsay s n n kes n deer n n b l nmes gerek r. kullan lan katsaysnn kesin deerinin bilinmesi gerekir. lemlerde kullanlan cihazlar da nemli olduu iin literatrde verilen deerleri kullanmak yerine deerinin hesaplanmas daha uygundur. Belirli bir dalga boyunda molar absorbsiyon katsaysnn belirlenmesi iin o madde iin hazrlanan stok zeltiden seyreltmeler yaplr ve bir seri zelti hazrlanr Bunlarn absorbsiyon deerleri konsantrasyonlarna hazrlanr. kar grafie geirilir ve bu dorunun eiminden belirlenir.

Ultraviyole Blgedeki Spektrofotometrik lmler280 nm deki lmler Tirozin ve fenilalaninde bulunan fenolik ve triptofandaki indolik gruplarn 280 nm de maksimum absorbans gstermesinden yararlanlarak protein miktar belirlenmektedir belirlenmektedir. Yntem ok duyarl deildir (0.022.0 mg protein/ml ) Ancak protein gerek olmadan yaplan kolay ve hzl bir y p y rneinde bir n ileme g yntem olmas nedeniyle ok kullanlr.

280 nm deki absorbans deerleri protein miktarn kabaca verir. Ancak prote n saflatrmalarnn ler aamalarnda ekst nks yon katsays protein saflat rmalar n n ileri aamalar nda ve ekstinksiyon katsay s biliniyorsa o zaman daha hassas sonular alnr. Bu teknik genellikle kolon kromatografisinde protein pikinin nerede elue olacan belirlemek iin ve ham protein karmlarndaki protein miktarlarnn belirlenmesi iin kullanlr. Protein lti i i P t i zeltisinin saflk dzeyi ykseldike hatalar d en aza fl k d i k ldik h t l da indirgenir. Bu nedenle bu yntem genellikle yar saf veya saf protein zeltilerine uygulandnda ok daha hassas sonular elde edilir. UV absorbans ynteminde ayn konsantrasyondaki iki farkl proteinin aromatik amino asit ierikleri farklysa farkl UV absorbsiyon deeri verir. Bu durum rnek proteinle ayn olan bir standartla deney yaplrsa ortadan kaldrlr.

Bu yntemin nemli bir sakncas, 260 nm de maksimum absorpsiyon veren nkleik asitlerle giriim vermeleridir. Nkleik asit artklar ile kontamine olmu ilk kaba ekstrelerle alldnda hatal sonular elde edilebilir. 1941 ylnda E.Adams, Warburg ve Christiann verilerini kullanarak bir E Adams Christian n nomograf oluturmutur. Burada nkleik asit ve protein iin belirli y konsantrasyonlardaki A280 ve A260 deerleri verilmektedir. Buradan yararlanarak hata dzeltme faktrleri belirlenmi ve listelenmitir.

DNA ve Protein Absorbsiyonlar

Bu yntemin uygulan1. Protein zeltisinin 260nm ve 280nm de absorbanslar llr.

2. A280/A260 oran belirlenir. 3. Hata dzeltme faktr formlde yerine koyularak protein miktar hesaplanr. h l Protein Deriimi (mg/ml)= faktr x A280 Schleif ve Wensink 280nm ve 260nm de llen absorbans deerleriyle 260nm protein miktarnn hesaplanabilecei forml gelitirmidir. Protein Deriimi(mg/ml)=1 5 x A280 0 75 x A260 Deriimi(mg/ml)=1.5 0.75

Uzak Ultraviyole Blgedeki lmler U k Ult i l Bl d ki l lProteinlerdeki peptit balar 191-194 nm de bir maksimum absorbans gsterirler. gsterirler Bu teknik protein rneinde herhangi bir ileme gerek olmayan pratik ve kolay bir yntem olmasna ramen kullanlan tamponlarla girisim sz konusu olabilir. nk bu dalga boyunda alkoller, kullanlan tamponlardaki iyonlar ve karboksilik asitler de absorbans verir. Bu nedenle protein tayini iin fazla kullanlmaz. f l k ll l Bu yntem proteinlerin amino asit bileimine bal olmad iin 280 nm deki lmlere gre daha baarldr Ancak oksijen bu blgede baarldr. absorbsiyon yapt iin bu amala rutin spektrofotometreler dnda zel cihazlar kullanlmaldr.

Eer protein rnei ok az veya hi tirozin ve triptofan amino asitlerini iermiyorsa prtein miktar 205 nm deki absorbans lerek belirlenebilir. Bu teknik Scopes yntemi olarak bilinmektedir (1974). 205 nm deki absorbansn byk bir ksm peptit balarndan kaynaklanmaktadr. Scopes, tirozin ve triptofan amino asitlerini i S i i i f i i l i i ieren rnekler i i b d l kl iin bu dalga boyunda yaplabilen bir yntem nermitir. Protein rnei triptofan ve tirozin ieriyorsa, 280 nm deki absorbans ieriyorsa lmyle 205 nm deki lmlerin kombinasyonu sonucu elde edilen forml kullanlarak daha uygun sonular elde edilir. Protein deriimi (mg/ml) = 27 x 120 x A280/ A205

Grnr Blgedeki Spektrofotometrik lmler G Bl d ki S kt f t t ik l l Bire YntemiBiure reaksiyonunu iki veya daha fazla peptit ba ieren maddeler verir verir. Bu yntem adn renin kuru stlmas sonucu oluan bire isimli maddeden (H2N-CO-NH-CO-NH2) almaktadr. Bu yntemde alkali ortamdaki Cu+2 iyonlar protein ve peptitlerdeki peptit ba azotuyla mavi-meneke renkli kompleks verirler. Renk iddeti 540 nm de fotometrik olarak tayin edilebilir. B k i d f ik l k i dil bili Bakr iyonlar il k l ile koyu mavi i renkli bakr-tetraamin kompleksi oluur. Ortamda amonyum iyonlar bulunduu zaman (tampon olarak tris kullanlmas ve amonyum slfat ile protein ktrlmesi) bu yntem uygulanamaz. Byle bir durumda bakr iyonlar amonyakla koyu mavi renkli bakr-tetraamin kompleksi oluturur.

Bire ynteminin duyarl dktr (1-10 mg protein/ml). Ancak kullanlan (1 10 reaktiflerin ucuz, hazrlanmasnn kolay olmas ve dier yntemlere gre giriim etkilerinin daha az olmasndan dolay kullanlmaktadr. Bu yntemle miktar tayini yaplabilmesi iin rnekteki protein miktarnn 1-20 mg civarnda olmas gerekmektedir. Cu 2 iyonlar ana zincire b l d i i b yntem proteindeki amino asit C +2 i l i i baland iin bu t t i d ki i it ieriinden etkilenmez

Bire reaksiyonu sonucu bakr tetra amin kompleksi oluumu bakr-tetra

Bire Belirtecinin Hazrlanmas: 0.15 g bakr slfat (CuSO4. 5 H2O) ve 0.6 g Na, K-tartarat 50 ml suda zlr. 30 ml %10 luk NaOH ilave edilir ve hacm 100 ml ye tamamlanr. mlye tamamlanr

Uygulama1 1 er ml 1-12mg BSA proteini ieren standartlar (1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 1 12mg (1 2 4 6 8 10 mg/ml) ve tayini yaplacak protein rnei ve kr rnek (1 ml tampon veya saf su) zerine 4 ml bire reaktifi ilave edilerek vortekslenir. 30 dakika oda scaklnda bekletilir.Kr lti l K zeltiyle 0 ayar yaplr. l1mg/ml 2mg/ml / l 4mg/ml 6mg/ml 8mg/ml 10mg/ml 12mg/ml rnekzelti

Standart zeltilerin 540nm de absorbanslar llr . rnein absorbans da 540 nm d l l de llr.

Absise standart proteinlerin konsantrasyon deerleri, ordinata ise bunlarn absorbans deerleri yerletirilerek dorusal bir grafik (standart eri) hazrlanr. Bu erinin oluturulmasnda en az 5 nokta kullanlmaldr. Deriimi bilinmeyen protein rneinin absorbans deerinin eriyi kestii noktadan absise indirilen bir dikey vastasyla bilinmeyen deriim bulunur. yaplan seyretmeler de dikkate alnmaldr. y Bu ilemlerde lmler srasnda y p

absorbans

rnek

0124681012

deriim mg/ml g

Lowry YntemiLowry tarafndan 1951 ylnda kullanlmaya balanmtr. Protein tayininde en yaygn olarak kullanlan yntemdir. Fosfomolibdik/fosfotungstik asit zeltisinin (Folin-Ciocalteau reaktifi) alkali koullarda proteinlerdeki fenolik amino asitlerle verdii reaksiyona dayanmaktadr. dayanmaktadr Bu yntemde alkali koullarda iki farkl reaksiyon gereklemektedir. y p p y Birinci reaksiyonda peptit balar ile Cu+2 arasnda bire reaksiyonu sonucu indirgenmi bakr oluur. kinci reaksiyonda ise Folin-Ciocalteu ayrac, tirozin ve triptofan amino asitleri ile tepkimeye girerek indirgenir ve mavi renkli heteropolimolibden k kli h li libd kompleksi meydana getirir. l k i d i i Oluan kompleks 600-800 nm aralnda absorbsiyon piki verir.

Lowry yntemine proteinin amino asit bileiminin etkisi orta dzeydedir. Ancak amino trevleri, tamponlar, deterjanlar, lipitler, karbohidratlar ve elatlayc ajanlar bu yntemle giriim yapmaktadr. Protein rnei seyreltilerek bu giriim etkileri azaltlabilir Ayrca bu azaltlabilir. etkilerin nlenebilmesi iin, yntemin her bir giriim etkisi iin farkl y modifikasyonlar bulunmaktadr. Lowry yntemi, tirozin ve triptofan ierii fazla olan proteinlerle daha fazla hassasiyet gsterdii iin bu amino asitler asndan zengin olan proteinlerde olduka iyi sonular alnmaktadr.

Bu yntemin hassasiyeti 30-150 g/ml civarndadr. Reaksiyon pH a ok fazla bal d r (pH 10-10.5). Bu nedenle uy un bir pHn salanabilmesi iin baldr 10 10 5) uygun pH n reaktifin seyreltilmesi gerekebilir. Reaksiyon oda scaklnda 40 dakikada tamamlanr Absorbans okumas tamamlanr. cam veya polistiren kvetler kullanlarak 750 nm yaplr. Ancak 600 ve 650 nm de absorbans lmleri yaplmaktadr.

Lowry yntemi, hassasiyetinin iyi olmas ve kolayl asndan protein biyokimyas ilemlerinde ok fazla kullanlr. En fazla gda proteinlerinin tayininde kullanlr. nk gda karmndan proteinleri izole etmee gerek yoktur. Bire t i Bi yntemine gre 50 100 kez daha hassastr. 280 nm de absorbans 50-100 k d h h t d b b yntemine gre ise 10-20 kez hassastr. Dier yntemlere gre daha spesifiktir spesifiktir. Dezavantajlar: Renk oluumu proteinlere gre farkllk gsterebilir gsterebilir. Renk tamamen protein konsantrasyonuyla orantl olmayabilir. Lipitler, sakaroz, fosfat tamponlar, monosakkaritler ve hegzoaminlar giriim yaparlar.

R ktifl ReaktiflerA Reaktifi: 1 g Na veya K-tartarat N K t t t ve 0.5 g CuS04.5H20 100 ml destile suda zlr. zeltinin ktan korunmas gerekir. B Reaktifi: 20 g Na2C03 ve 4 g NaOH bir litre destile suda zlr. N N Hb l d l d l C Reaktifi: 1 ml A reaktifi + 50 ml B reaktifi

Folin Ciocalteau Reaktifi: 5 g sodyum tungstat dihidrat (Na2WO4H2O) 1.25 1 25 g sodyum molibdat (Na2MoO4.H2O) H 2.5 ml %85 lik H3PO4 5 ml deriik HCl

35 ml su ile kartrrlr. l l l zelti 10 saat oda scaklnda bekletilir.

10 saat geri soutucu 50 ml ye seyreltilir, taze altnda kaynatlp soutulur. soutulur hazrlanr ve h l ktan korunur.

7.5 g lityum slfat 2.5 ml su birka damla Br2 damlatlr.

Folin Ciocalteau belirteci ticari olarak da satlmaktadr.

BSA kullanlarak konsantrasyon 1 mg/ml olacak ekilde stok zelti olarak hazrlanr. hazrlanr. Daha sonra bu stoktan bir seri standart hazrlanr rnek zeltinin konsantrasyonu, standart zeltilerin konsantrasyon aralnda ise seyreltilmesine gerek yoktur. Daha deriik olan rnekler seyreltilir. 0 01 mg/ml den seyreltilir 0,01 mg/ml'den dk protein ieren numuneler ise TCA ile ktrlerek deritirilir.

Uygulama: U l1. alma l m aralna uygun ln n konsantrasyonda 0,5ml lik zeltiler hazrlanr. Btn zeltilere 2,5 2 5 ml C reaktifi katlr.

Kr K ve protein rnei p t in n i 2.Vortekslenir 2 Vortekslenir ve oda scaklnda 10 dakika bekletilir bekletilir. 3. 0.25 ml Folin Ciocalteau Reaktifi hzla ve vorteksle kartrlarak eklenir. Bu ilem 2-3 saniye iinde tamamlanmaldr. 4. 4 30 dakika karanlkta bekletilir bekletilir. 5. 750 nm'de absorbanslar llr. 6. Standart eri grafii hazrlanarak rnekteki protein deriimi bulunur .

Bikinkoninik (BCA) Asit YntemiLowry ynteminin farkl bir uygulamas olan bu teknik, Smith ve arkadalar tarafndan gelitirilmitir. Dier protein tayin yntemlerine gre daha yenidir ve reaktif olarak bikinkoninik asit (BCA) kullanlr. 2 1 Bu yntem alkali zeltideki proteinlerin Bire reaktifi ile Cu+2 den Cu+1 l l l l l indirgenmesi ve daha sonra Cu+1 in BCA ile verdii renkli kompleksin 562 nm deki spektrofotometrik lmne dayanr dayanr. Renk yeilden koyu mora dnr. Yntemin duyarll Lowry metoduna yakndr (20100 g Protein/ml). Mikro lm ilemi ile duyarlln daha da arttrlmas mmkndr.

BCA yntemi proteinin amino asit kompozisyonundan az etkilenir ve giriim etkisi gsteren ok fazla bileik yoktur. Ancak BCA reaktifi pahaldr ve tekrarlanabilirlik dktr. Amino asitler, deterjanlar, lipitler, ekerler ve nkleik asitler Lowry metoduna gre daha iyi tolere edilir ndirgen ekerler ve bakr edilir. elatlayc maddeler bu yntemde giriim etkisi gsterir. Cu+2 iyonlar ile elat oluturan EDTA gibi maddeler de giriime yol aar. g g y

Ditiyotreitol, glutatyon ve 2-merkaptoetanol gibi indirgeyici reaktifler de Cu+2 iyonlarn Cu+1 e indirgeyerek olduka fazla giriim etkisi gsterir. BCA ynteminde giriim etkilerini engellemek i i G t t t i d i i i tkil i i ll k iin Gates tarafndan bi f d bir teknik bulunmutur. Bu teknikte pH 8.5 da pozitif ykl naylon bir m m membrana protein balanr. Giriim yapan maddeler ykanarak p my p m y uzaklatrldktan sonra BCA reaktifi ile reaksiyona sokulur. Taze hazrlanan maddelerle alldnda giriim etkisi daha az olmaktadr.

Reaktif A: 10 g BCA pH 11.25 e 20 g Na2CO3. H2O Kartrlp destile ayarlamak iin su ile 1 litreye 1.6 g Na2C4H406 . H2O gerekirse NaOH tamamlanr. l veya kat NaHCO3 4 g NaOH ilave edilir. 9.5 g NaHCO3 Reaktif B: 2 g CuSO4 . 5 H2O d k f destile suyla 50 ml ye tamamlanr. l l l l Reaktif A ve B oda scaklnda en az 12 ay kararl kalmaktadr. Standart alma Reaktifi: 50 Hacm reaktif A+ 1 Hacm reaktif B kartrlr, bu reaktif bir hafta sreyle kararldr.

Uygulama:Standart zeltilerin, kr ve rnein 0.1 ml sine, standart alma reaktifinden 2 ml il ktifind n ilave edilir. dili Oda scaklnda 2 saat veya 370 C da 30 dakika inkbe edilir. Eer 370 C da tutulmusa soutulur. Spektrofotometrede 562 nm de absorbans okumas yaplr. Hazrlanan standart eriden protein rneinin miktar belirlenir.

Bradford (Coomassie Brillant Blue) YntemiBoya balama esasl yntemlerin en yaygn 1976 ylnda Bradford tarafndan gelitirilen ve Coomassie Brillant Blue G250 boyasnn kullanld yntemdir. Proteinlerin asidik ve bazik g up n n z gruplar uygun koullarda organik u g n boyalarla etkileerek renkli bileikler oluturur. zellikle aromatik boyar maddeler proteinlere ok salam balanrlar. Proteinlerin tayin edilmesi ilemlerinde Orange G, Amido siyah, Bromkrezol yeili ve Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBBG) gibi boyalar kullanlmaktadr kullanlmaktadr.

Coomassie Brillant (CB) boyalarnn proteinlere balanmas ilk kez Fazekas ve St Groth tarafndan 1963 ylnda allmtr. Yntem bu boyann farkl konsantrasyondaki protein zeltilerinde farkl iddette mavi renk oluturmasndan yararlanlarak gelitirilmitir gelitirilmitir. Boya zellikle arginin gibi bazik amino asitlere ve baz aromatik amino asitlere balanmaktadr balanmaktadr. Spector isimli bilim adam protein rnei ile kullanlan boyann hacmini uygun ekilde oranlayarak ok daha hassas protein tayinleri yaplabilecein belirtmitir .

Bu yntemle olduka geni bir aralkta protein tayini yapmak mmkndr. Kolay ve hassas bir yntemdir. Arginin amino asidi bu boyayla dier amino asitlere gre sekiz kat daha g y y g fazla cevap verir. allan arginince zengin bir proteinse standardn da ayn ekilde arginince zengin olmas gerekir. G-250 boyas sulu ortamda krmz(A) ve mavi(B)olmak zere iki ekilde bulunur. Asidik ortamda krmz renkli A ekli fazladr ve 470 nm de maksimum absorbsiyon yapar Bu boya (+) ykl bir proteine yapar. boya, balandnda ise 595 nm de mavi bir renk oluturur. Renk oluumu 5 dakikada tamamlanr,ancak 10-15 dakika kmeler olabilir. ,

Le Chatelier yasasna gre asidik ortamda A ve B ekilleri dengedeyken proteinler ilave edildiinde krmz form konsantrasyonu azalr ve mavi form konsantrasyonu artar. Boyann bu iki halinin geisi artan protein konsantrasyonuyla 450 nm de azalan absorbans lerek veya 595 nm de artan absorbas lerek spektrofotometrik olarak izlenebilir. 1.Adm: Akrmz Bmavi 2. Adm: Bmavi + Protein Bmaviprotein Net Reaksiyon: Akmz+ protein Bmaviprotein Krmz renk azalr ve mavi renk artar (595 nm de).

Sedmak ve Grossberg, boya-protein kompleksinin boyann kaynana bal olarak maksimum absorbans aralnn 595-620 nm arasnda deitiini bildirmitir. Bu aratrmaclar protein miktarnn belirlenmesi iin 620 ve 464 nm deki absorbanslarn orannn kullanlmasnn daha uygun olacan ve asidik bir ortam oluturmak iin fosforik asit yerine perklorik asit veya hidroklorik asit kullanlabileceini belirtmilerdir. Zor ve Selinger ise 590 ve 450 nm dalga boylarnn orannn kullanlmasnn CB tayin sisteminin lineerliini de arttrdn belirtmitir. Bu orann kullanlmas ayni zamanda tayinin hassasiyetini de arttrr arttrr.

y y gp y Bu yntemde duyarlk 150-750 g protein/ml civarndadr. Bu duyarlk mikro tayinlerle daha da arttrlabilir (25200 g protein/ml). Boya-protein komleksinin ekstinksiyon katsays substratn 10 kata kadar olan farkl k ns ntr s nund bil k r rl d r l n f rkl konsantrasyonunda bile kararldr. rnein absorbans lineer blgenin stndeyse toplam hacm 5 ml y p y y y oluncaya kadar Bradford alma tamponuyla seyreltilebilir. Blank de ayni hacime seyreltilmelidir (Spector, 1978). Bu yntem iin alternatif bir standart olarak ovalbmin kullanlabilir. Bradford t i kolonlarda bulunan i B df d yntemi k l l d b l immobilize proteinlerin ve bili t i l i membrana bal proteinlerin konsantrasyonunu belirlemek iin de kullanlr (Fanger,1987).

Boya Reaktifinin Hazrlanmas:100gr Comassiebrillant blue G-250 Saf su ile 600ml ye seyreltilir.

Uygulama:

50ml etanol (%95) ( )

100ml %85 lik fosforik veya perklorik asit zeltisi eklenir.

Wahtman No.1 kad ile szlr ve cam iede oda scaklnda saklanr. No 1 saklanr Reaktif birka hafta iinde ve her seferinde yeniden szlerek kullanlabilir. Reaktif ticari olarak satlmaktadr.

Protein Tayin YntemiUygun ekilde seyreltilen protein rneine standartlara ve kre 1 ml boya reaktifi katlp vortekslenir. 5 dakika sonra kre kar 595 nm deki absorbanslar llr. Standart grafikten protein deriimi belirlenir.

Standartlarn renk gstergesi (en sadaki tp kr tpdr)

0.9 09 0.8 0.7 07

y = 0.2828x + 0.3841 2 R = 0.9932

Absor rbance (A 570 nm) 5

0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6

BSA (g/l)

Gm Balama YntemiGm iyonlarnn proteinlerle balanmasyla oluan renkli bileiin 420 nmdeki absorbansnn okunmasyla yaplr. y y p Olduka yksek bir hassasiyeti vardr (150 ng 20 g protein/ml). Ancak elatlayc ajanlar (EDTA) tarafndan, % 0.01 den fazla SDSden ve DTT ve 2-merkaptoetanol gibi indi 2 m k pt t n l ibi indirgeyici ajanlardan k l i i j nl d n kolayca etkilenerek bozulur.

Florimetrik yntemlerle dier yntemlerde grlen giriim sorunlar ortadan kaldran ve olduka hassas sonular elde edilir. Floresans tekniklerin en byk avantaj, duyarlklar ve sonularn nanogram (10-9) dzeyine kadar belirlenebilmesidir Bu tr floresans temelli belirlenebilmesidir. tayinlerden biri Udenfriend tarafndan 1972 ylnda uygulanmtr. Bu yntemde floresan olmayan bir bileik olan floresamin, proteinlerdeki primer aminlerle (peptitlerin terminal amino gruplar ve lizinin amino asidi gibi) olduka hzl bir ekilde floresan bir bileik oluturarak reaksiyon verir. verir 1993 ylnda Lorenzon bu yntemi modifiye etmitir etmitir. Bio-tek FL600 firmas 2006 ylnda bu iki yntemden yararlanarak ve p y p p mikroplate floresans okuyucu kullanarak toplam protein miktarn olduka hassas bir ekilde belirlemitir.

FLORMETRK TEKNKLER

Yaygn olarak kullanlan yntem ise proteinlerin o-fitalaldehit (OPA)- ile trevlendirilmesine dayanr. OPA proteinlerdeki primer aminlerle (amino asidin NH2 terminali ve lizinin - amino asidi gibi) reaksiyon verir. Yntemin hassasiyeti tayinden nce protein rneinin hidrolizlenmesiyle daha da arttrlabilir Hidroliz arttrlabilir. ilemi proteinde yan grup olarak bulunan -amino gruplarn reaksiyona hazr hale getirir. Bu yntemle yaplan tayinlerde ok az miktardaki protein rnei yeterli olmaktadr. Tris (hidroksimetil) aminometan, amino asit tamponlar gibi primer aminler o fitalaldehit ile reaksiyon verdii iin ortamdan o-fitalaldehit uzaklatrlmaldr. g p p p p . OPA genellikle 2-merkaptoetanol varlnda ve pH 9.5 de peptit ve proteinlerin primer amin gruplaryla olduka floresans bileikler olan izoindolleri meydana getirir.

Uyarlm Durum

y Yaylan floresans

Temel Hal

Spesifik dalga boyu kullanlarak uyarlr ve yaylan floresans miktarndan lm yaplr.

Standart zeltiler: Uygun bir standart rnein hazrland tamponda zlerek hazrlanr standart, hazrlanr. Bu ilem iin en az 5 adet standart hazrlanmaldr (10-200 g/ml konsantrasyon aralnda). rnek k zeltisi: l i i Konsantrasyonu belirlenecek olan protein uygun bir tamponda zlr. Konsantrasyonun standart zeltilerin aralnda olmasna dikkat y edilmelidir. Blank (kr): rn rnek ve standart zeltilerin hazrland tampon kullanlr. Bu lmlerde stan art z t r n haz r an u an r. u m r floresan olmayan bir kr kullanlr.

Reaktifler Borat Tamponu: 61.83 g borik asit suda zlr ve pH potasyum hidroksitle 10.4 e ayarlanr. Suyla 1 litreye seyreltilir. Stok OPA Reaktifi: 120 mg o fitalaldehit 1 5 ml metanolde zlr 100 ml o-fitalaldehit 1.5 zlr, borat tamponu ilave edilir, 0.6 mL polioksietilen loril eter ilave edilir ve kartrlr. Bu zelti oda scaklnda en az 3 hafta kararldr. OPA Reaktifi: 5 ml stok OPA Reaktifine 15 l 2- merkaptoetanol ilave edilir. Bu reaktifin kullanlmadan en az 30 dakika nce hazrlanmas gerekir. 1 gn iin kararldr kararldr.

lem Standartlar ve rnek protein zeltisi pH lar 8-10.5 arasnda olacak ekilde ayarlanr. Standart zeltiler ve 10 L rnek protein zeltisi, 100 L OPA il kartrlr ve oda scaklnda 15 d kik b kl i L ile k t l d kl d dakika beklenir. 3 mL 0.5 N NaOH ilave edilip kartrlr. Bir florimetre kullanlarak stan art z t r n standart zeltilerin ve rn n 340 nm deki uyarma dalga boyu ve 440-455 rnein a ga oyu 55 nm deki emisyon dalga boyunda floresans iddetleri belirlenir. Hesaplama Protein k P konsantrasyonu ve floresans iddeti arasndaki iliki lineerdir. fl dd d k l k l d Lineer regresyon yntemi kullanarak protein konsantrasyonuna kar standart zeltilerin floresans iddetleri grafie geirilerek standart eri izilir. Daha sonra standart eri yardmyla floresans iddeti bilinen rnein protein konsantrasyonu belirlenir.

Floresans Yntemi

mg protein/ml zelti

MMNOLOJK YNTEMLER Protein tayinlerinde antikorlar da spesifik bir ekilde kullanlmaktadr, monoklonol antikorlar olduka geni bi ekilde b amala k ll l Bi kl l tik l ld k i bir kild bu l kullanlr. Birok k antikor hedef proteini ktrr, oluan bulanklk trbidometrik yntemlerle llr. Alternatif immno tayinler de hassasiyeti arttrr.

KOLODAL ALTIN YNTEMBu yntemin temeli, asidik ortamda (+) ykl proteinlerin () ykl kolloidlerle etkilemesi ve oluan rengin 560 nm de okunmasdr. Bu yntem 2-60 g protein/ml aralnda bir duyarla sahiptir. 2008 ylnda yaplan bir almada Western blot tekniinde olduu gibi y y p g nitrosellozdaki proteinleri boyamak iin kolloidal altn zeltisi kullanlmtr. Bylece duyarlk nanogram dzeyine kmtr.

p g Bu ilemde proteinlerin balanmas iin genellikle nitroselloz membranlar kullanlmaktadr. Membrana bal proteinler kolloidal altn zeltisi ile 2-16 saat inkbe edildikten sonra rnekteki protein miktaryla orantl olarak mor renkli protein bantlar zl nir m r r nkli pr t in b ntl r gzlenir. Tm bantlarn grnr hale gelmesi 1-2 saat iinde gerekleir. Sonra kolloidal altn zeltisi birka kez ykanarak uzaklatrlr Tm ykama ve uzaklatrlr. inkbasyonlar oda scaklnda yaplmaktadr. Klorr iyonlar gibi kontaminantlar kolloidal altnn farkl kmesine yol aar.

Bio-Rad satlmaktadr. Altn zeltileri Bio Rad firmas tarafndan hazr olarak satlmaktadr Bu ilemde membrann cm2 si bana yaklak 0.2 ml kolloidal altn zeltisi kiti kullanlmas nerilmektedir. Bantlarn dansitometrik analizinde,ayn nitroselloza yerletirilen protein standartlardan yararlanarak miktar tayini yaplr. Klasik protein tayin yntemlerine gre bu yntemde ok az miktarda protein rneine gerek duyulur (2 l). Bylece nanogram dzeyinde protein tayinleri yapmak mmkn olmaktadr.

Gravimetrik Y G i ik Yntemler lProtein suda zlr ve 95C tm su uuncaya kadar kurutulur Daha 95 C kurutulur. sonra scaklk fiziksel olarak bal bulunan suyun uzaklatrlmas iin 105-110C ye kadar arttrlr. Souduktan sonra bir vakum desikatrnde P2O5 ile kuruttuktan sonra kuru arlk belirlenir. Bu deer %1280 deerini belirlemek iin kullanlr. Kuru arlk 0.073 g olarak belirlenmi olsun. Bu 100 ml suda zld zaman Konsantrasyon = 0.073g/100 ml = 0.033 % olarak bulunur. A280 = 0.815 olarak bulunsun 0 815 A280 = x cx l l = 1 cm olduundan = A280/ c bulunur. %1280 = 0 815/0 073 = 11 16 olur 0.815/0.073 11.16 olur.

Yntem UVyntemi (280nm) UzakUV yntemi (205nm)

Duyarllk y 0.023.0mg/ml 1.0100g/ml

Mekanizma

Avantajlar j

Dezavantajlar jDkduyarllk Aminoasit kompozisyonuna baml zelekipmanaihtiya, Tamponlarilegiriim

Aromatikamino Basitvehzl asitlerin(Tyr,Trpveaz rnektekimyasalbir orandaPhe)280 ilemyok nmdeabsorblar Peptidbanaspesifik Basit,hzl rnektekimyasalbir ilemyok

Bikinkoninik 20100g/ml asityntemi

Bire yntemi Bradford y yntemi

110mg/ml 150750g/ml

Bakrierenreaktif, proteinile indirgenerek Bicinchonicasitile reaksiyonsonras562 nmdelm Bakrierenreaktif, proteinilereaksiyon sonras550nmde lm Coomassiebrilliant blueG250ile p proteininpHbaml p geridnml balanmas 595nmdelm Bakrvefosfo molibdik/fosfotunsgti kasitbileiminin proteinilereaksiyonu sonucuoluanrengin 750nmdelm

Duyarlvegvenli, Dieryntemleregre giriimdahaaz

Reaktifpahal, Tekrarlanabilirlik dk

Reaktiflerucuzve hazrlamaskolay, Dieryntemleregre giriimaz Duyarllkiyi,kolayve hzl

Duyarllkdk

AlkalipH,tamponlarve deterjanlar(SDS)ile g giriim

Lowry y yntemi

3 5 g 30150g/ml

Duyarllkiyi

Zahmetli,deterjanve elatlaycajanlarakar giriimeak

Protein tayinleri hazr olarak satlan kitlerle de yaplmaktadr yaplmaktadr. Bunlar satan firmalar: Amerscham-Bioscience Ph h Bi i Pharmacia i Bio-Rad Molecular probes Pierce Roche