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Proteasas ParasitariasProteasas Parasitarias
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ProteasasDefinición
• Se trata de enzimas capaces de hidrolizar los enlaces peptídicos (subclase E.C 3.4)
• Proteólisis limitada: limitado número de enlaces hidrolizables
• Proteólisis ilimitada: proteasoma, lisosomas
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Enlace PeptídicoEnlace PeptídicoCaracterísticasCaracterísticas
Plano
Rígido
Polar
Restringe conformación de la cadena polipeptídica
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El Problema Químico
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ProteasasNomenclatura
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ProteasasNomenclatura de Schercher y Berger
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ProteasasProteasasClasificación según mecanismo Clasificación según mecanismo
de acciónde acción
• Serina proteasas
• Cisteína proteasas
• Metaloproteasas
• Aspártico proteasas
• Treonina proteasas
• Glutámico proteasas
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ProteasasProteasasClasificaciónClasificación
• Familia: homología significativa a nivel de secuencia de amino ácidos en la porción catalítica.
• Clan: Grupos de familias que han evolucionado a partir de una proteína ancestral. Similitud a nivel de estructura tridimensional
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Proteasas en los Genomas Eucariotas
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Serina proteasasGeneralidades
• Familia de Qumiotripsina: Tripsina, elastasa, factores de la coagulación XIIa, XIa, IXa, plasmina
• Familia Subtilisina, enzimas bacterianas
• Tríada catalítica
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Serina ProteasasMecanismo de Acción Catalítica
Tríada Catalítica: His57, Asp102 y Ser195
-Formación de acil intermediario entre el substrato y la Ser
Formación de este intermediario covalente se produce a través de un intermediario tetrahédrico de transición cargado negativamente
Se cliva el enlace peptítico
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Serina ProteasasMecanismo de Acción Catalítica (cont.)
Fase de deacilación
El intermediario acil-enzima se hidroliza por una molécula de agua liberado el péptido y restaurando el hidroxilo en Ser
La His provee una base y acepta el OH de la Ser reactiva
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Cisteína ProteasasGeneralidades
Papaína, catepsinas lisosomales B, H y L
Calpaínas citosólicas• Díada catalítica:
Cis25, His159 juegan los mismos roles que Ser e His en serina proteasas
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Cisteína ProteasasMecanismo de Acción Catalítica
La catálisis también se produce a través de la formación de un intermediario covalente e involucra a Cys e His
El nucleófilo es en este caso un ion tiolato en lugar de un grupo hidroxilo
El tiolatio se estabiliza por la formación de un par iónico con el imidazol vecino en la His
El ataque nuclefílico es en este caso el par iónico tiolato-imidazol en ambos pasos, por tanto no se requiere una molécula de H2O2
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MetaloproteasasGeneralidades
• Amplias differencias en secuencias y estructura
• La gran mayoría contienen Zn en sitio activo
• Ej: Termolisina, metaloproteasas de la matriz extracelular (MMPs), algunas aminopeptidasas Sito activo de la termolisina
mostrando Zn, HIS142, HIS146 and GLU166.
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MetaloproteasasMecanismo de Acción
El mecanismo catalítico lleva a la formación de un intermediario tetrahédrico no covalente luego del ataque de la molécula de H2O unida al Zn sobre el grupo carbonilo del enlace peptídico.
El intermediario se descompone por la transferencia del protón del ácido glutámico al grupo NH
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Aspártico ProteasasGeneralidades
• Ejemplos: Familia de la Pepsina:catepsina D, renina• Familia de proteasas del HIV (retropepsina). Son
monoméricas, por lo que la dimerización se requiere para formar la enzima activa
• Se trata de enzimas bilobuladas donde el sitio activo está entre dos lóbulos homólogos. Cada lóbulo contribuye con un aspartato
• El pH óptimo es ácido para la mayoría de las aspártico proteasas, donde un protón está compartido por los dos aspartatos del sitio activo
• El agua es activada por los aspartatos para realizar el ataque nucleofílico
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Aspártico ProteasasMecanismo de Acción
Los 2 residuos aspartil tienen una gran proximidad geométrica en la molécula
Un aspartato se ioniza mientras que el segundo no lo está al rango de pH óptimo de 2-3
La catálisis de las aspártico proteasas no involucra la gneración de un intermediario covalente si bien existe un intermediario tetrahédrico.
El ataque nucleofílico se consigue por 2 transferencias simultáneas de protones: una desde el H2O2 a la díada de dos carboxilos y otra desde la diáda al oxígeno carbonilo del substrato con el consiguiente clivaje CO-NH
En términos generales es una catálisis ácido-base.
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Inhibidores de ProteasasBajo Peso Molecular
• Cisteína: E-64, Leupeptin
• Serina: Di isopropilfluorofosfato (DFP), PMSF, Benzamidina, Dicloroisocumarina
• Metalo: EDTA, EGTA, Fenantrolina, Bestatina
• Aspártico: Pepstatina
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Inhibidores de ProteasasInhibidores Naturales
• Mas de 100 compuestos naturales identificados
• Desde bacterias a animales y plantas• Reversibles o seudo-irreversibles• Impiden acceso al sitio activo• Proteicos, de 50 a 400 aa• Clase específicos excepto familia de α-
Macroglobulina• Inhibidores de Serina y Cisteína proteasas
son los mejor caracterizados. Ej. α-1 antitripsina y cistatinas
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Metodología de EstudioSubstratos Cromogénicos
Estos substratos, al clivarse generan un compuesto cromogénico. La tasa de hidrólisis se mide en Los más utilizados son péptidos 4-nitroanilides pNA) y péptidos thioesteres
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Metodología de EstudioMetodología de EstudioSustratos FluorgénicosSustratos Fluorgénicos
Generan un compuesto fluorogénico al producirse el clivaje.
La tasa de hidrólisis se cuantifica por medio de un espectrofluorómetro o fluorómetro en forma continua o ensayos puntuales.
Los sustratos más usados son los que tienen acoplado AMC (peptidyl 4-metil-7 cumarilamidas).
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Metodología de EstudioSustratos con Quenching intramolecular
En estos substratos, la secuencia peptídica separa un grupo fluorescente dador de un grupo aceptor que actúa como mitigador (quencher) de fluorescencia. El fenómeno se llama transferencia de energía resonante. El clivaje del enlace peptídico lleva a separación del par dador-aceptor produciendo un incremento de la fluorescencia. Existen varios pares de dador-aceptor reportadoss, por ej. o-aminobenzoic acid (Abz) como dador y 2, 4 dinitrophenyl (Dnp) como aceptor.
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Substratos sintéticosEjemplos
• Cathepsin B Bz-Arg-pNAPyr-Phe-Leu-pNAZ-Arg-Arg-pNAZ-Phe-Arg-pNA Z-Arg-Arg-MCAZ-Phe-Arg-MCA
• Cathepsin G MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Met-pNASuc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNASuc-Ala-Val-Pro-Phe-pNASuc-Phe-Leu-Phe-pNA –
• Cathepsin H H-Arg-pNABz-Arg-pNA H-Arg-MCA
• Cathepsin L Z-Phe-Arg-pNA» Z-Phe-Arg-AMC
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Geles de gelatina-SDS-PAGEGeles de gelatina-SDS-PAGE
CL1
27,5 kDa
CL1 gelatinolytic activity
CL229 kDa
CL2 gelatinolytic activity
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SDS-PAGE acoplado a Substratos Fluorogénicos
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Acciones de las Proteasas Acciones de las Proteasas Parasitarias en el Contexto Parasitarias en el Contexto
del Parasitismodel Parasitismo
• Invasión
• Migración
• Nutrición
• Evasión de la respuesta inmune
• Inmunomodulación
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Invasión y MigraciónMembranas Basales y Matríz
Extracelular
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Nutrición
• Hemoblobina
• Proteínas del suero
• Proteínas intracelulares
• Proteínas extracelulares (MEC)
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Evasión de la Respuesta Inmune
• Degradación de Igs (IgG, IgM, IgE, IgA)
• Degradación de componentes del Complemento
• Clivaje de moléculas de superificie de células del sistema inmune (Ej. CD4)
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Inmunomodulación
La cisteína proteasa CPB2.8 de Leishmania mexicana induce una fuerte respuesta de tipo Th2 asociada a la progresión de la enfermedad
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Enfermedad de Chagas
• Causada por el flagelado Trypanosoma cruzi
• Parásito heteroxeno• 3 formas: Forma
replicativa intracelular obligatoria amastigote, forma tripomastigote circulante y forma epimastigota replicativa en el insecto vector
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Proteasas de Trypanosoma cruzi
Cisteína proteasas
– Cruzipaína (cruzaína, GP57/51)
– Catepsina B-like proteinasas
– CAAX Prenyl proteasa
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Proteasas de Trypanosoma cruzi
Serina proteasas
– Oligopeptidasa B
– Prolil Endopeptidasa Tc80 (colagenasa)
– Serina carboxipeptidasa
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Proteasas de Trypanosoma cruzi
Metaloproteasas
– Genes pertenecientes a la familia gp63 de Leishmania, una metaloproteasa asociada a membrana celular han sido descritos en T. cruzi.
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CruzipaínaCruzipaínaResponsable de la actividad cisteína proteasa más promienente de T. Cruzi
Se expresa en todos los estadíos parasitarios
La mayoría tiene localización lisosomal, pero hay isoformas asociadas a membrana plasmática y habría alguna secretada
Endoproteasa, digiere proteínas como caseína, SAP, hemoglobina y sustratos sintéticos a pH 7-9.
Prefiere Arg o Lys en P1 y un hidrofóbico o con carga + en P2 (Leu>Tyr>Phe>Val)
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Cruzipaína
Especificidad intermediaria entre Catepsinas L y B en función de AA en P2
Inhibida por organomercuriales, E-64, leupeptin, TLCK, cistatina, stefina, chagasina y derivados peptidil fluorometanos
Peptidos con secuencia YHNGAA del pro-dominio también la inhiben
E-64
Z-Phe-Ala-fluorometilketona
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CruzipaínaCorte de subclases de IgG
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CruzipaínaCruzipaínaCorte de subclases de IgGCorte de subclases de IgG
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CruzipaínaCorte de subclases de IgG
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Malaria
• Causada por protozoarios apicomplexa del género Plasmodium
• 300 millones de infectados, más de un millón de muertes anuales
• Ciclo complejo, transmitidos por vector invertebrado (mosquito Anopheles)
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Proteasas de Plasmodiumen la Digestión de la
HemoglobinaSe desarrolla en la vacuola alimenticia
Consume el 75% de la Hb
Se producen pequeños péptidos pero no AA por lo que existirían transportadores
Las Plasmepsinas I - IV son aspártico proteasas implicadas en la primera fase de la digestión
Las Falcipaínas I y II son cisteína proteasas que degradan los polipéptidos grandes generados
La Falcilysina, una metaloproteasa de la familia M16, degrada los pequeños péptidos
Una aminopeptidasa citosólica completaría el proceso produciendo AA libres
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PlasmepsinasPlasmepsinasNutriciónNutrición
• Degradación inicial de Hb nativa (plasmepsina I)
• Clivan enlace Leu203-His204 en región bisagra de cadena α
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PlasmepsinasInvasión
•Clivaje de espectrinas (CH3) del esqueleto de la membrana plasmática del GR
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Amebiasis
• Infección intestinal o extraintestinal causada por Entamoeba histolytica
• 50 millones de infectados y 110 mil muertes anuales
• 2 especies reconocidas• Entamoeba histolytica –
patógena• Entamoeba dispar –
comensal (10% población mundial)
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Cisteina Proteasas de Entamoeba histolytica y E. dispar
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Proteasas en la Patogenia de la Amebiasis
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Proteasas como Blancos Terapéuticos –Inhibidores de
CP• Peptidil diazometanos
basados en la secuencias LVG de las cistatinas
, , epoxi ketonas - > potencia que E-64c
• Bis-arylacylhydrazidas y aril ureas-reversibles
• Mercaptoetilketonas, algunas con Ki de 1nM
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Proteasas como Blancos Terapéuticos –Inhibidores de
CP• La actividad de los inhibidores de CP contra T. Cruzi en cultivos
o modelos animales correlaciona con la inhibición directa de la CP.
• No se pueden descartar otras acciones.
• En su mayoría los inhibidores también actúan sobre las catepsinas de mamíferos.
• Las células no se ven afectadas por las concentraciones que matan los parásitos. Redundancia?.
• Los parásitos resistentes a los inhibidores de CP no se mostraron resistente a drogas establecidas como nifurtimox indicando mecanismos diferentes