prote í na purificada cristales difracci ó n de rayos x obtenci ó n de fases mapa de densidad...
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Proteína purificada
Cristales
Difracción de rayos X
Obtención de fases
Mapa de densidad electrónica
Construcción de modelo
Refinamiento
Validación
Por qué necesitamos cristales para ver Por qué necesitamos cristales para ver difracción?difracción?
•Amplificación de la señal
….(efecto de interferencia a tener en cuenta!)
molécula celda unidad
cristal
Difracción:Difracción:
Cada electrón dispersa
Las ondas emitidas se suman … y se restan!!
El resultado final depende de las fases relativas de las ondas adicionadas en cada dirección
Usar el sitio interactivo
http://www.journey.sunysb.edu/ProjectJava/Bragg/home.html
Ley de Bragg :
n= 2d sin
Difracción: ondas en faseDifracción: ondas en fase
1. Cuándo dispersan en fase dos ó más ondas?
Cuando recorren la misma trayectoria
… como en el fenómeno de la reflexión de luz
Difracción: ondas en faseDifracción: ondas en fase
2 Cuándo dispersan en fase dos ó más ondas?
Cuando sus trayectorias difieren por un múltiplo de la longitud de onda
… como en el fenómeno de la difracción de luz
= 2d sin
Difracción: ondas en faseDifracción: ondas en fase
Cuanto mayor es el ángulo de difracción, más pequeño es el espaciamiento para el que la difracción es sensible
= 2d sin sin / = 1 / d
Cambiando la dirección del haz entrante Mirando diferentes planos en el cristal
Qué clase de información obtenemos de esto? ~posición relativa de los centros dispersores
(scatterers), esto es, los átomos, en la dirección perpendicular a los planos considerados
En la dirección del ángulo negro va a registrarse baja intensidad difractada
según el rojo, mayor
Por qué?
Difracción: ondas en faseDifracción: ondas en fase
Cuándo vemos difracción de un cristal?•Un cristal amplifica la difracción en ciertas direcciones, aquéllas para las que la totalidad de las celdas unidad dispersan en fase…• y las elimina en las otras direcciones
•Antes que nada: sólo planos repetitivos pueden dispersar en fase
debido a la simetría del cristal (repetición de la celda), esos planos tienen relaciones enteras con los ejes de la celda!!
a b c : los tres ejes de la celda unidad
Los planos de Bragg conectan divisiones enteras de cada eje
plano 1 0 0
plano 3 0 0
Cuándo vemos difracción de un cristal?
Ahora mirando diferentes orientaciones en 2 dimensiones
plano 1 1 0
plano 2 1 0
plano 1 -1 0
Indices de Miller
h k l
Cuándo vemos difracción de un cristal?
ResoluciónResolución Grado de detalle
detalle distancia entre planos ordenados del cristal
•Si los átomos estuvieran quietos y el orden cristalino fuera perfecto, la resolución estaría limitada sólo por la
•Eía este no es el caso : desorden, alto contenido de solvente (~50%), flexibilidad….
• 4 Å mala
• 3 Å más o menos
• 2-2.5 Å razonable
• 1.5 Å muy buena
• <1 Å excepcional
El límite de resolución en proteínasEl límite de resolución en proteínas
La difracción ocurre en el espacio recíprocoLa difracción ocurre en el espacio recíproco
Si cualquier punto en el cristal puede ser definido como un vector tridimensionalr = xa + yb + zc
entonces, la difracción ocurre en un espacio recíproco de manera que
s = ha* + kb* + lc*
Cada eje de esta celda recíproca queda definido teniendo una dirección perpendicular a los otros dos ejes del espacio real y una longitud igual a la recíproca del espaciamiento entre los planos definidos por dichos ejes
Espacio recíprocoEspacio recíprocoConstrucción de la esfera de Ewald
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Espacio recíprocoEspacio recíprocode un verdadero cristal de proteína…
Teoría de FourierTeoría de Fourier
El patrón de difracción está relacionado al objeto que difractó las ondas, a través de una operación matemática denominada transformada de Fourier
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Teoría de FourierTeoría de Fourier
El patrón de difracción está relacionado al objeto que difractó las ondas, a través de una operación matemática denominada transformada de Fourier
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Teoría de FourierTeoría de Fourier
El patrón de difracción está relacionado al objeto que difractó las ondas, a través de una operación matemática denominada transformada de Fourier
€
ρxyz=1V
r F hkl
hkl∫
−2πi hx+ky+lz( )[ ]
e
Importante!
Esta integral puede invertirse….
Atención a F, es un vector!
El problema de las fasesEl problema de las fases
Dado que Fhkl es un vector, tiene una magnitud Y una fase (se comporta como una onda!)
€
r F hkl=Fhkl
iαe
Fhkl 2 es directamente proporcional a la intensidad
medida Ihkl
…pero la información sobre se perdió!
Soluciones al problema de las fases :Soluciones al problema de las fases :
•Hipótesis (re)emplazo molecularestructura ≈ conocida
•Perturbar la estructura (y con ella la difracción)
Reemplazo Difracción
isomorfo anómala
FittingFitting y refinamiento y refinamiento
Con la densidad electrónica proyectada en una estación gráfica, uno tiene que construir un modelo atómico que
•encaje bien en la densidad
•tenga sentido químico y físico
Este modelo predice un patrón de difracción (a través de una transformada de Fourier inversa), y uno usa luego programas para minimizar la diferencia entre las amplitudes Fhkl calculadas y observadas
Construyendo el primer modeloConstruyendo el primer modelo
Los mapas de densidad electrónica son el resultado final del experimento de difracción. Su interpretación en términos de un modelo molecular es la primer tarea del cristalográfo
Con lo que el problema de fitear un modelo se asemeja al de 'no perder de vista los árboles en el bosque' esqueletonización
Construyendo el primer modeloConstruyendo el primer modelo
Construyendo el primer modeloConstruyendo el primer modelo
1. Con estos mapas esqueletonizados, lo primero es trazar la cadena principal (ayuda: los C están a ~3.8 Å unos de otros!)
2. Luego, se ajustan las cadenas laterales
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Construyendo el primer modeloConstruyendo el primer modelo
Validación de modelosValidación de modelos
Chequear la geometría del modelo construido: parámetros estereoquímicos, distancias y ángulos de enlace, ángulos dihedros permitidos, etc, etc, etc.
Gráfico de Ramachandran de ángulos dihedros y
Lisozima «made in Uruguay» :
1.4Å resolución
Rwork=15.1%
Rfree=18.2%
Fases experimentales!!
(solvent flattened SAD)
Dispersión anómala de los S and Cl-, a la Cu K (1.542Å)
Estructura de un represor transcripcional (FapR) : MAD (1 Se/21kDa)
+ DM
50 mM Tris pH 8.5, 10 mM MgCl2,15% PEG4000P41212, a=b=59.1 Å, c=157.8 Å, resol: 3.5 Å
Protein cleaved during purification/storage!!
Estructura 3D de FapR
Soaking de Mal-CoA
0 min
1 min
5 min50 mM Tris pH 8.5, 10 mM MgCl2,15% PEG4000P41212, a=b=59.1 Å, c=157.8 Å, resol: 3.5 Å
Complejo FapR - malonil-CoA
Schujman et al., EMBO J, 2006
Buenos sitios www para ver :
http://www-structmed.cimr.cam.ac.uk/course.html
http://www-structure.llnl.gov/Xray/101index.html
http://www.yorvic.york.ac.uk/~cowtan/index.htmlBuenos libros para leer :T.L. Blundell & L.N. Johnson (1976), "Protein Crystallography", Academic Press: London.
Jan Drenth (2007), "Principles of Protein X-ray Crystallography", 3rd edition. Springer-Verlag: New York.
D. Sherwood (1976), "Crystals, X-rays and Proteins", Longman: London.
Muchas gracias!
Conceptos básicos de difracción: ondas, Conceptos básicos de difracción: ondas, interferencia y espacio recíprocointerferencia y espacio recíproco
Qué son los Rx?
E
Fotones = propagados como una onda
amplitud
longitud de onda
E(t) = A cos(t + )
t
=2
(fase)
Qué son los Rx?
E
Fotones = propagados como una onda
amplitud
longitud de onda
E(x) = A cos(x + )
x
=2
(fase)
OndasOndas
OndasOndas
Si combinamos la variación en el espacio y en el tiempo
A cos[2(t-x/)]
efectos “opuestos” del tiempo y la distancia
Adición de ondas
+
=
Sumando el valor del campo eléctrico para cada punto t…
…da el campo total en t
“interferencia constructiva”: la amplitud aumenta.
La suma de dos ondas con longitud de onda siempre produce una onda resultante de long de onda .
Interferencia destructiva
+
=
Diferencia de fase = 180°
La amplitud disminuye
Sumando ondas como vectoresSumando ondas como vectores
Si queremos sumar todas las ondas dispersadas por el elctron e- de una proteína, usando expresiones de la función de onda obtenemos operaciones trigonométricas MUY feas…
A cos(+1) + B cos(+2) + …
Dado que tenemos dos tipos de información (variables) en cada onda, mplitud y fase, podemos usar la notación de vectores para facilitar las operaciones
Imaginar una rotación const. del vector 1; y graficar el cos o el sin de iempo
Ahora la adición y sustracción se vuelven una operación geométrica simple
Sumando ondas como vectoresSumando ondas como vectores
Algunas disgresiones matemáticas…Algunas disgresiones matemáticas…
Este formalismo usando números complejos en lugar de vectores "simples", es de enorme utilidad!
Las ondas pueden siempre separarse en sus componentes de ondas simples coseno y seno
E(t) = A cos(t + )
A cos(t + ) = A cos cost - A sin sint
amplitud del componente coseno
amplitud del componente seno
Usando la regla de la suma de ángulos:
E(t) = A cos(t + )
A cos(t + ) = A cos cost - A sin sint
amplitud del componente coseno
amplitud del componente seno
Ahora las ondas pueden ser sumadas sumando los dos componentes: real e imaginario.
r
i
A
Usando la regla de la suma de ángulos:
Algunas disgresiones matemáticas…Algunas disgresiones matemáticas…
Los números complejos son del tipo
z = a + ib
donde i = √-1
La rotación en el plano complejo es posible por multiplicación de vectores √i = 45°
Diagram de Argand (plano complejo)
Algunas disgresiones matemáticas…Algunas disgresiones matemáticas…
Con lo que,
A cos(t + ) = A cos cost - A sin sint,
para t constante
puede escribirse A cos+ i A sin
ó aun,
A e i
= fase
z1z2 = |z1| exp(i1) |z2| exp(i2) = |z1||z2| exp[i(1 + 2)]
Teorema de Euler
La suma del coseno de más i veces el seno de es el número e elevado a i veces .eiα =cosα +isinα
Algunas disgresiones matemáticas…Algunas disgresiones matemáticas…