propolisul si extractele propolisului

67

Propolisul i extractele de propolis

CRISTINA MATEESCU*, I.F. DUMITRU**

* Institutul de Cercetare Dezvoltare pentru Apicultur, 42 Blvd. Ficusului,71544 Bucureti 1, fax 01-2320287** Centrul de Cercetri n Enzimologie, Genetic i Chimie Analitic,Universitatea Bucureti, fax 01-4113171

Introducere

Dezvoltarea societii umane a permis cunoaterea unor resurse naturaledeosebit de valoroase produsele albinelor. Muli vindectori din antichitate aufolosit mierea, polenul cules de albine, propolisul i lptiorul de matc, ceara dealbine i veninul pentru tratarea unor boli.

n epoca modern, studiile i cercetrile efectuate asupra resurselornaturale capabile s asigure organismului uman echilibrul nutriional i bunafuncionare, au evideniat valoarea biostimulent, nutritiv i terapeutic a acestorvaloroase produse. ntre acestea, propolisul reprezint la ora actual una din celemai puternice provocri pentru lumea nutriionitilor i cea medical.

Calitile curative ale propolisului au fost cunoscute nc din vremeaantichitii. Produsul era foarte bine cunoscut n Egiptul antic. Cu cteva mileniinainte de Cristos, propolisul era cunoscut de marii preoi, singurii ce posedaucunotine de medicin i de chimie i chiar arta de mblsmare a cadavrelor.

Faptul c propolisul era cunoscut i de grecii antici este dovedit de nsidenumirea greac a produsului : pro naintea , polis cetate. Exist o dovadfoarte veche ce face aluzie direct la propolis. Faimosul filosof grec Aristotel caredorea s cunoasc ndeaproape activitatea albinelor a construit un stup transparent.Albinele nu au vrut ns s-i dezvluiasc secretul i au acoperit parteainterioar a peretelui transparent cu o substan de culoare nchis probabilpropolis.

Originea propolisului a fost obiectul unei polemici ntre doi scriitoriromani Plinius i Dioscoride. Primul credea c albinele recolteaz propolisul dinrinile secretate de mugurii de salcie, de plop, de castan i de la alte plante, ntimp ce cel de-al doilea afirma c acesta este recoltat din styrax. Mult mai trziudate despre propolis se regsesc n lucrrile lui Galenus i ale lui Varron.

n bine cunoscuta lucrare Canonul tiinei medicale Abu Ali Ibn Sina(Avicenna) vorbete de dou tipuri de cear: ceara pur i ceara neagr. n opiniasa, ceara pur este cea folosit la construcia pereilor fagurilor n care albinelecresc puietul i depoziteaz mierea; ceara neagr este partea de debriuri din stup.Este foarte clar c ceara neagr nu este altceva dect propolisul.

Cristina Mateescu, I.F. Dumitru

68

Aadar, propolisul sau cleiul de albine, n stare natural sau sub formde extracte obinute prin aplicarea unor procedee blnde, reprezint o sursnatural deosebit de interesant de produi cu aciune biologic complex i care,aa cum s-a demonstrat, prezint o palet deosebit de larg de aciuni terapeutice,chiar n afeciuni cu care se confrunt civilizaia secolului nostru.

Pe plan internaional, studiile efectuate la nivelul unor cunoscutelaboratoare de farmacologie i medicin au confirmat rolul deosebit pe care acestprodus al stupului l poate juca pentru organismul uman n profilaxia i tratamentulunor afeciuni.

n acest sens, cunoaterea i folosirea empiric i conform tradiieimedicinei populare a cleiului de albine a fost treptat nlocuit de studii tiinificeaprofundate care au confirmat nu numai complexitatea compoziiei sale biochimiceci i efectele deosebite pe care le ofer acest produs natural n prevenirea itratamentul unor afeciuni degenerative, boli infecioase, virale etc.

Descoperirea rolului esenial pe care l deine echilibrul dintre factorii pro-oxidani i sistemele antioxidante n viaa organismelor aerobe n general i aomului n mod special care triete ntr-un mediu deosebit de complex i expusunei palete largi de factori de agresiune a condus la cutarea acelor resursenaturale capabile s asigure un aport cantitativ, dar mai ales calitativ, de compuicu aciune antioxidant care s permit protejarea structurii vitale celulare aciduldeoxiribonucleic i ntregul sistem de transmitere a informaiei genetice imembranele celulare. Prin marea afinitate a antioxidanilor fa de radicalii liberi,aceti compui constituie inta preferat a aciunii oxidative, protejnd astfelmicrostructurile celulare sau ali compui eseniali.

n acest sens, propolisul, care s-a dovedit a fi o surs extrem de interesantdin punct de vedere al compoziiei sale n compui cu aciune antioxidant - cudeosebirecompui flavonoizi poate contribui sub form de supliment nalimentaie, la prevenirea la om a mortalitii premature, prin corectarea deficituluidin interaciunile dintre antioxidanii endogeni.

n stare natural sau sub form de extracte, tincturi i diferite formefarmaceutice, propolisul reprezint la ora actual pe plan mondial unul dintre celemai importante mijloace de studiu i de lucru pentru apiterapie.

Aplicarea apiterapiei este cunoscut, aa cum s-a amintit, din vremuristrvechi i astzi, interesul pentru aceast variant a medicinei naturale este din cen ce mai larg n ntreaga lume.

Prezenta lucrare se constituie ntr-o prezentare general a compoziieibiochimice complexe a propolisului i a extractelor sale precum i a ctorva dintremecanismele de aciune ale principalelor componente ale acestui produs natural lanivelul organismului uman.


69

I. Noiuni generale despre propolis

1.1. Propolisul i rolul su n cadrul coloniei de albine

Cei ce nu cunosc prea multe despre albine, le asociaz pe acestea adeseorinumai produciei de miere. Dar apicultorii tiu foarte bine c albinele, pe lngmiere recolteaz i polen, ap i propolis.

Este foarte probabil ca acesta s fie ultimul dintre aceste patru produse alestupului cu care apicultorii au fcut cunotin. Destul de des apicultorii i dauseama de existena propolisului cnd lucreaz la stupi i observ c pe minile lorsau pe dalt se acumuleaz o substan foarte lipicioas. Aceast substan este ngeneral de culoare brun-rocat i ader puternic la piele. Pentru a ndeprtaaceast substan se folosete un solvent de obicei alcool dar benzina sauterebentina sunt la fel de eficiente.

Propolisul se gsete lipit (depus) n fisurile stupului, la capetele ramelor,n gurile din stup i chiar pe prile cu suprafaa neted. n general, albinele nufolosesc propolisul pentru a umple spaiile superioare dar l folosesc ntotdeaunapentru a micora dimensiunile urdiniului.

1.2. De ce recolteaz albinele propolis ?

Propolisul poate fi folosit n stup n 5 scopuri. n primul rnd el esteutilizat la astuparea fantelor sau fisurilor din adpostul ocupat de colonia de albine.n al doilea rnd, n regiunile cu climat rece, propolisul este utilizat de ctre albinepentru reducerea urdiniului. Al treilea scop este acela de a face provizii pentrusituaiile critice cum ar fi nevoia de a-l combina cu cear pentru a mblsma unoaspete nedorit care a murit n interiorul stupului i care a fost izolat ca ntr-unsarcofag pentru c acesta a fost prea mare sau prea greu pentru a fi evacuat. Demulte ori apicultorii gsesc astfel de mumii care pot fi oareci sau oprle ucise itratate astfel.

n al patrulea rnd propolisul este utilizat de ctre albine pentru fixarearamelor verticale la baza podiorului. n fine, n al cincilea rnd i poate cel maiimportant din punct de vedere al proprietilor sale este acela de a acoperi faguriinoi i mai ales interiorul celulelor acestora cu o pelicul fin din aceast substan.Cercetrile au artat c propolisul utilizat pentru aplicarea acestei pelicule poate ficonstituit din substane asemntoare diferitelor materii rinoase obinuiterecoltate de pe mugurii plantelor i numai puin modificate prin adugarea deenzime secretate de glandele faringiene i mandibulare ale albinelor lucrtoare.


70

Pelicula de substan aplicat de albine pe fagurii noi, pe pereii interiori aicelulelor precum i pe o mare parte din suprafaa interioar a stupului, careadpostete cuibul de puiet a fost denumit de P.W.PHILLIP (1928)[1] balsam.Unii cercettori consider c pentru fabricarea balsamului albinele folosescpolenul ca surs principal de materie prim.

1.3. Recoltarea propolisului de ctre albine

Recoltarea propolisului pare a fi rezervat unui numr restrns de albinelucrtoare care prezint o predispoziie genetic exclusiv. Din numrul total dealbine al unei colonii numai cteva sunt angajate n aceast activitate iar acestea nuefectueaz dect foarte rar alte activiti cum ar fi colectarea de nectar i acest lucrunu se ntmpl de obicei chiar dac el este foarte necesar coloniei.

Culegtoarele de propolis pot fi deturnate de la eforturile lor i angajate nrecoltarea de nectar dac n apropierea sursei de propolis exist o surs de nectaratractiv care conine o cantitate ridicat de zaharuri; n general ns, ele i reiaurapid activitatea de colectare de propolis. Culegtoarele de propolis sunt foarte rarmai n vrst de 15 zile. Din acest punct de vedere ele se aseamn celorlaltelucrtoare din stup.

1.4. Tendina de propolizare la cteva rase de albine

Cercettorii care au studiat albina Apis indica, Apis florea i Apis dorsata,afirm c acestea nu propolizeaz. Acelai lucru se afirm i despre albina african.n lucrarea sa intitulat n cutarea celor mai bune sue de albine: cltoriiconcludente,[2] clugrul ADAM de la Mnstirea St. Mary, Buckfast, SouthDevon, Anglia, arat c anumite rase de albine i n particular cele din zona AsieiMici manifest o tendin foarte puternic de propolizare.

De fapt, acesta vorbete de o albin galben frecvent ntlnit n regiuneamunilor Atlas i Sahara, cunoscut sub denumirea de Apis sahariensis. Elpresupune c aceast albin a fost adus n Orientul Mijlociu de ctre evreiiemigrani. Vorbind despre albina autohton din Anatolia Central n Asia Mic,unde iernile sunt foarte aspre, clugrul Adam spune c aceast albin, cunoscutsub denumirea de Apis mellifera var. anatolica utilizeaz propolisul pentruprotecie la fel ca toate celelalte specii care fac acest lucru n zonele cu climatfoarte aspru. Tot el este cel care spune c :nu se poate spune c n Egipt albinelenu propolizeaz. La Fayum unde se cresc albine italiene, am vzut interiorul


71

stupilor cptuii cu propolis din cel mai rinos. Se cunoate de asemenea calbina gri caucazian de munte are o tendin de propolizare mult mai pronunatdect cea italian.

1.5. Teorii asupra formrii propolisului

La nceputurile activitii de cretere a albinelor, propolisul a fost ngeneral identificat cu ceara. Mai trziu, cercetrile asupra vieii albinelor au artatc propolisul este un material de construcie i de protecie cu care albinele astuporificiile din stup dar care are i alte caliti. Aceasta este perioada n care au aprutntrebri asupra formrii propolisului.

Primele teorii asupra formrii i originii propolisului au fost foarte simpledar pe msura obinerii de noi cunotine asupra vieii albinelor, acestea au fostrespinse astzi ele fiind doar etape parcurse pn la stabilirea teoriilor actuale.

n prezent, exist dou teorii privitoare la originea propolisului.O teorie afirm c albinele recolteaz propolisul din rinile i secreiile de

pe mugurii i scoara anumitor arbori din familia rinoaselor i foioaselor din zonade amplasare a stupilor. Adepii acestei teorii afirm c albinele colecteazpropolisul astfel: ntr-o prim etap albinele desprind cu mandibulele o mic bucatde rin sau de secreie pe care o trateaz ulterior prin masticare la nivelulmandibulelor. Materialul astfel recoltat i prelucrat este transportat de picioareleanterioare i medii n corbiculele de polen aflate pe picioarele posterioare. Albineleformeaz deci nite pelote, n acelai mod ca i la polen. Apoi zboar spre stupunde alte albine le ajut s se debaraseze de aceste ncrcturi pe care le transportn locurile n care ele sunt necesare. Principalii adepi ai acestei teorii sunt ROSCH,EVENIUS, BERLEPSCH, CIESELSKI i alii. i ntruct ROSCH a fost cel ce apus bazele acestei teorii, teoria este cunoscut sub denumirea de teoria lui Rosch.[3]

n 1907, o nou teorie [4] a fost avansat de Dr.KUSTENMACHER careexplic formarea i originea propolisului ntr-o alt manier. Conform acesteiteorii, propolisul provine din polen; albinele lucrtoare nghit polen i lacumuleaz ntr-o poriune din intestin denumit chylus magen, adic stomac depolen. Procesul propriu-zis de formare a propolisului ncepe prin absorbia uneimari cantiti de ap. Gruncioarele de polen sufer un proces de umflare datoritcantitii de 5 ori mai mare de ap dect propria lor greutate i de dezintegreaz.Din peretele gruncioarelor de polen rezult un balsam pe care albinele l elimin


72

sub form de picturi cu diametrul de 2 pn la 3 mm. Conform preriiDr. Kustenmacher acest balsam constituie materia prim i esena propolisului.

Trebuie totui remarcat faptul c nu toate gruncioarele de polen sunt deaceeai calitate i o parte dintre acestea nu se dezintegreaz ca urmare a umflrii idin acest motiv ele reprezint un balast n hrana albinelor, de care acestea ncearcs se debaraseze. Din cauza densitii specifice mai reduse, acest balast de polenajunge n partea posterioar a intestinului unde se combin cu balsamul. Prinmicri de unduire ale stomacului de polen, albinele lucrtoare elimin aceastmas de balsam i gruncioare de polen nedigerate pe care o depun pe pereii sau ncrpturile stupului. Acolo, materialul capt consisten formnd o mas deculoare galben sau galben-roiatic. Acestui material albinele i adaug naintede a se modifica praf i impuriti mecanice dnd propolisului o consisten carepermite transportul lui dintr-un loc n altul.

Deci, conform dr. KUSTENMACHER propolisul este format din balsamulprovenit din prile exterioare ale gruncioarelor de polen pe care albinele lamestec cu cear i alte materiale, impuriti n cantiti variabile.

Cunotinele obinute n domeniul apiculturii de la apariia acestor teorii ipn n prezent susin dar i neag anumite pri sau detalii ale acestora; de aceeaeste necesar s se fac o analiz critic asupra lor.

Dac polenul este conform teoriei dr. Kustenmacher la baza formriipropolisului ar trebui ca n acesta s se regseasc mai multe substane sub formde compui azotai, zaharuri i lipide pe care polenul le conine n cantiti relativmari. Rezultatele analizelor chimice nu confirm ctui de puin aceasta tez. nplus, nici una din aceste substane coninute n polen nu a fost identificat npropolis. Multe aspecte fiziologice, morfologice, biologice i anatomice legate depropolis expuse de HAYDAK, EVENIUS i ROSCH contrazic teoria luiKUSTENMACHER. [5]; [6]

n ultima vreme, cercetrile efectuate asupra propolisului au furnizatnumeroase date obiective n favoarea teoriei dr. ROSCH. Studiul compoziieichimice a propolisului au demonstrat clar c baza acestei teorii este mai realist imai bine fondat.

Conform acestei teorii se susine c mai ales substanele identificate de omanier indiscutabil n propolis se regsesc ntr-una sau mai multe specii de plantevizitate de albine i c secreiile acestor plante pot fi sursa de producere a propolisului.

Un lucru deosebit de important pus n eviden este participarea activ aalbinei la formarea propolisului. Prin secreiile sale glandulare pe care le adaugmateriilor vegetale se obine propolisul recoltat de apicultor din stup.


73

Se demonstreaz c majoritatea substanelor de natur flavonoididentificate i separate din propolis (GHISALBERTI, 1979) [7] se gsesc n stareliber ca agliconi i nu ca glicoside, form sub care acestea se gsesc n surselevegetale. Se pare deci c albina dispune n secreiile sale salivare de o substan ceare capacitatea de a descompune glicosidele sau componentele lor principale pecare le transform apoi n propolis i n hran.

1.6. Surse naturale de propolis

Aa cum s-a menionat, componentele propolisului pot fi identificate nsursele vegetale vizitate de albine. Adeseori albinele viziteaz plante din familiaconiferelor, plopi (Populus sp.) precum i alte specii: fagul (Fagus sylvatica),castan (Aesculus hippocastanum) pentru a colecta rini de pe scoara i muguriiacestor arbori.

n Europa, principalele surse de propolis cuprind: alunul (Alnus spp.),mesteacnul (Betula spp.), alunul de pdure (Corylus spp.), stejarul (Quercus spp.),plopul (Populus spp.) i salcia (Salix spp.).

n Statele Unite ale Americii, principalele specii sunt plopul i pinul(conifere).

Conform lucrrilor lui KONIG (1985) [8], mugurii de plop reprezintprincipala surs de propolis n Europa, America de Sud, Asia de Vest i Africa deNord.

ntre sursele secundare, acelai autor menioneaz: mesteacnul, stejarul,salcia i alunul, iar pentru alte zone geobotanice situaia este urmtoarea:- arborele Acacia Karroo n Africa de Sud- Xanthorrhoea pressii i Xanthorrhoea australis n Australia i zonele de climat

tropical- Mugurii i scoara arbutilor Plumeria accuminata, Plumeria acutifolia,

Schinus terebinthifolius i Psidium guajava n insulele Pacificului, ndeosebi nHawaii

Studiile recente asupra originii botanice a propolisului din continentul sudamerican, mai ales din Brazilia au demonstrat prezena de compui specifici unorplante ca: Araucaria angustifolia, Eucalyptus globulus i Rosmarinus officinalis.

1.7. Proprieti fizice ale propolisului


74

Din punct de vedere al aspectului, propolisul se prezint ca o masheterogen rinoas de consisten solid, uneori compact ceroas provenind dinparticule maleabile i aderente, alteori granuloas ori friabil, lund aspectul unorsfrmturi pulverulente. Aceast mas ce prezint o oarecare duritate latemperatura ambiant devine friabil la temperaturi sczute, sub 15C, chiar ipentru sorturile ceroase. La temperaturi ridicate se nmoaie i devine rinos ilipicios, iar n intervalul de temperatur cuprins ntre 60 69C sau dupVELESCU i MARIN (1975), [9] 81 83C. Aa cum s-a mai menionat,propolisul mai este cunoscut i sub denumirea de clei de albine.

Culoarea propolisului este ns deosebit de variabil n funcie de sursvegetal vizitat de albine. Conform studiilor efectuate de RICCIARDELLIDALBORE (1979)[10] pe eantioane de propolis provenind din 5 continente, dindiferite regiuni ale acestora a demonstrat c:

- propolisul din zonele cu clim temperat prezint o gam de culoare cevariaz de la brun deschis la brun nchis, uneori cu reflexe galben verzui;

- n Australia i n zonele cu climat tropical culoarea propolisului poate ajungepn la negru;

- propolisul din zonele apropiate de cercul polar (Finlanda) are o culoareportocalie

- propolisul cubanez prezint mai multe varieti: rou, brun, verde i violetnchis.

- propolisul brazilian are o culoare predominant verzuie cu nuane galben-brune.

Mirosul propolisului este foarte specific n general, complex, balsamicamintind ceara, mierea i vanilia. i acest parametru este ns variabil n funcie desursa de cules. Fumul pe care l scoate la ardere poart o arom de balsamuri irini de cea mai fin calitate (HEGAZI, 1998) [11].

Greutatea specific a propolisului variaz mult: se citeaz valori cuprinsentre 1,033 i 1,145.

Gustul este deasemenea un parametru specific dependent tot de sursavegetal dar este n general iute, arztor.

Solubilitate - Propolisul este insolubil n ap i parial solubil n alcool,aceton, eter, cloroform, propilenglicol, benzen, dimetilsulfoxid, etilendiamin. nfuncie de temperatur, variaz nu numai viteza de dizolvare ci i trecerea n soluiesau nu a unor fraciuni cum ar fi de exemplu ceara care se dizolv n alcoolfierbinte, dar este greu solubil n alcool la rece.


75

Reziduurile de la dizolvare cuprind n majoritate impuriti i corpuristrine, alturi de una sau sau mai multe dintre fraciunile care rmn parialsolubile sau insolubile, n funcie de selectivitatea dizolvantului.

Trecerea parial ntr-un anumit solvent este luat n considerare att laobinerea extractelor de propolis, ct i la stabilirea calitii propolisului prinaprecierea substanelor solubile, proporia acestora putnd fi dat ca indice decontrol calitativ n farmaceutic. Conform prerii lui POPRAVKO (1975)[12],caracteristic este solubilitatea ntr-un amestec de cloroform + aceton (2+1).


76

2. Compoziia chimic a propolisului

2.1. Compoziia general a propolisului

n compoziia chimic a propolisului brut au fost semnalate n principalrini, ceruri, uleiuri volatile, polen, glucide, aminoacizi, vitamine, enzime, sruriminerale i impuriti.[7, 11]

Un tablou general de compoziie cantitativ prezint urmtoareleconcentraii ale grupelor majore de substane:- 55% rini i balsamuri (balsamurile sunt definite ca substane naturale lichide

sau semi-lichide obinute de obicei prin metode speciale din scoara unor arbori OPRIS, 1990) [13]

- 7,5 35% ceruri de natur vegetal cu solubiliti diferite i cear de albine(cerurile sunt ntotdeauna prezente n compoziia propolisului)

- 10% uleiuri volatile (eseniale) sunt compui caracterizai de obicei prinprezena unor arome specifice

- 5% polen- 5% acizi grai- 4,40 19% impuriti- terpene- vitamine: A, B, E, PP- oligoelemente: aluminiu, argint, crom, cobalt, fier, magneziu, etc.- aminoacizi liberi: prolin i arginin- substane taninice, secreii ale glandelor salivare de la albine i componente

prezente n mod accidental n propolis (achii de lemn, fragmente de corp dealbin etc.

n propolis se poate gsi un numr foarte mare de compui. n 1990GREENAWAY et al., [14] a constatat c n timp ce exudatele de pe muguriidiferitelor specii de plop sunt frecvent asemntoare din punct de vedere alcompoziiei calitative, acestea pot fi foarte diferite din punct de vedere cantitativ,diferene ce se regsesc la nivelul compoziiei propolisului n care este incorporatexudatul respectiv. Aceste variaii cantitative pot fi uneori considerabile.

2.2. Compoziia calitativ a propolisului

Se poate afirma c n general, orice compus identificat n exudatelevegetale pe care le colecteaz albinele, poate fi regsit n propolis.

Cea mai mare parte a componentelor prezente n exudatele vegetale suntincorporate n propolis fr a fi alterate, dei este posibil ca unele glicozide s fiesupuse unei hidrolize enzimatice efectuat de albine prin secreiile lor salivare ntimpul colectrii exudatelor sau n cursul adugrii de cear pentru obinereapropolisului.


77

Conform autoarelor WALKER i CRANE (1987) [15], compuiiindividuali sunt prezeni n unul sau mai multe eantioane de propolis care provinde la una sau mai multe specii vegetale; unii compui sunt probabil prezeni ntoate eantioanele de propolis i contribuie la proprietile sale caracteristice; uniicompui pot fi prezeni n multe eantioane de propolis de origini diferite, dar aliiaproape sigur sunt prezeni numai n propolisul recoltat dintr-o anumit specievegetal.

Studiile de spectroscopie n infra-rou au relevat prezena n diferitelesorturi de propolis a urmtoarelor grupuri de radicali organici (MAKASHVILI,1978) [16]:

- legturi duble C-C- gruparea CH a nucleului furanic- gruparea carbonil- gruparea CH2-O-CH2- grupul furan- gruparea ariloxi n compui ce conin gruparea metoxi- grupurile (CH3)2C i (CH3)3C- gruparea =C-OH- sisteme ciclice aromatice- sisteme aromatice- gruparea delta-lacton a butandienolilor- grupri CH3 i CH2- gruparea CH aromatic- grupri OH asociate hidrogenului molecular- monooxiflavone care nu conin grupri OH n poziiile C3 i C5- inele piranice cu C, H beta (antrachinone cu 3 grupri alfa)

2.3. Principalele grupe de substane izolate din propolis

Constituenii farmacologic activi din propolis se gsesc n fraciunilesolubile n diferii solveni organici, cum este cazul alcoolului etilic principalulsolvent utilizat la obinerea de extracte de uz farmaceutic.

Cei mai importani sunt flavonoizii n grupa crora intra flavonele,flavonolii i flavanonele precum i diferii compui fenolici i aromatici.

Din punct de vedere biochimic flavonoizii sunt derivai ai benzo-gamma-piranului prezeni n toate celulele vegetale apte de fotosintez. Localizai nmembrana tilacoid a cloroplastelor, aceast grup de compui particip n calitatede catalizatori n lanul transportor de electroni n faza luminoas a fotosintezeii/sau ca reglatori ai canalelor ionice implicate n procesele de fosforilare. Acestlucru are o semnificaie deosebit din punct de vedere al activitii lor chimice.Larg reprezentai n regnul vegetal, pn n prezent au fost recenzai peste 100 dereprezentani.


78

Cnd celulele vegetale mor, flavonoizii sunt deversai n sucurile, sevele,rinile i chiar n nectarul recoltat de insecte (un astfel de exemplu estepinocembrina incorporat n miere care contribuie la activitatea antibacterian aacesteia).

Produsele lor de degradare sunt n mare msur responsabile de colorareafrunzelor copacilor toamna.

Tabel nr.1Flavonoizi din propolis

Denumirea comun Denumirea biochimic

Flavone

Crizin 5,7-dihidroxiflavonTectocrizin 5-hidroxi-7-metoxiflavonGalangin 3,5,7-trihidroxiflavonGalangin-3-metil eter 5,7-dihidroxi-3-metoxiflavonAcacetin 5,7-dihidroxi-4-metoxiflavonIsalpinin 3,5-dihidroxi-7-metoxiflavonKaempferol 3,5,7,4-tetrahidroxiflavonLuteolin 5,7,3,4-tetrahidroxiflavonKaempferid (kaempferol-kaempferol-7,4-dimetil eter)Rhamnocitrin 3,4,5-trihidroxi-7-metoxiflavonErmanin 5,7-dihidroxi-3,4-dimetoxiflavonPectolinarigenin 5,7-dihidroxi-4,6-dimetoxiflavonQuercetin 3,5,7,3,4-pentahidroxiflavonQuercetin-3,3-dimetil eterQuercetin-3,7-dimetil eterBetuletolApigenin 5,7,4-trihidroxiflavonApigenin-7-metil eterRhamnazinRhamnetinIsorhamnetinAlnusinFisetinFlavanoneAlpinetinAlnustinolPinocembrinPinostrobinPinobanksin3-acetil-pinobanksinpinobanksin-3-butiratpinobanksin-3-hexanoatepinobanksin-3-metil etersakuranetinisosakuranetin 5,7-dihidroxi-4-metoxiflavanonnaringenin 5,7,4-trihidroxiflavanon


79

Conform studiilor lui PAPAY i col., (1985)[17] i DONADIEU (1994)[18] flavonoizii din propolis pot fi clasai n:

Flavone: acacetin crizin tectocrizin apigenin pectolinarigenin etc.Flavonoli: galangin galangin-3-metil eter isalpinin kaempferid kaempferol quercetin quercetin-3,3-dimetileter rhamnocitrin rhamnetin isorhamnetinFlavonone: pinostrobin sakuranetinFlavononoli: pinobanksin etc.

Datele din care rezult c flavonoidele din propolis sunt bine reprezentatecantitativ, iar sub acest aspect ele capt importana unor componente principale,cu proporii de 15-20%, au fost publicate abia recent (POLINICENCU i col.,1981)[19]. Astfel de concentraii flavonoidice au fost determinate de autori i nmostre reprezentative de propolis din Ungaria i Uruguay.

Crizina sau 5,7-dihidroxiflavona sau 5,7-dihidroxi-2-fenilcromona a fostfost descoperit n 1927 de G.T.JAUBERT[20] att n propolis ct i n mugurii deplop, ea fiind prezent, de asemenea, n miere i n cear. Cu toate c nu estesingurul flavonoid de culoare galben din amestecul prezent n propolis, cear,miere fiind din punct de vedere cantitativ componenta majoritar a fost lanceputuri singura semnalat i astfel culoarea galben a cerii de albine i a mieriise atribuia numai crizinei.

Tectocrizina sau tectogenina, a crei prezen n propolis a fost semnalatde G.T.JAUBERT [20] este 7-metil-eterul crizinei. n studiile ulterioare efectuate


80

asupra acestui compus au demonstrat proprietile sale diuretice, pentru care s-aeliberat un brevet de invenie SUA din 1964, al firmei Laroche Navarron, autorPERRAULT (1976) [21].

Galangina este flavonolul crizinei, adic 3-hidroxicrizina. Concentraia san propolis o plaseaz alturi de crizin, ntre bioflavonoizii bine reprezentaicantitativ. Ea a fost evideniat de VILLANUEVA i col., (1964) [22] iar nmugurii de plop diferite specii de EGGER i col., (1969) [23].

Izalpinina a fost prima dat evideniat n propolis de VILLANUEVA icol., n 1964 [22].

Pinocembrina i datoreaz numele descoperirii sale n mugurii specieiPinus cembra (Pinaceae) de ctre ERDTMAN (1946)[24]. Ca i crizina,pinocembrina este prezent ntre componentele rinii de pe mugurii de plop. Castructur este flavanona corespunztoare crizinei.

Pinostrobina, descoperit n 1946 n mugurii speciei Pinus strobus apoiseparat i din specia Prunus avium (Rosaceae).

Pinobanksina este 3-hidroxi-pinocembrina, adic un flavanonol din seriaflavonoidelor specifice din propolis, caracterizate prin lipsa oricrei funciunifenolice pe inelul B. A fost descoperit n compoziia unor specii de Pinus ntrecare Pinus banksiana. Abia n 1979, SCHNEIDEWIND i col.,[25] o citeaz npropolis.

3-acetatul de pinobanksin este la rndul su identificat n totalulflavonoidic al propolisului i pare s nu fi fost identificat n vreo plant.

Exist opinia conform creia principiile active cel mai bine reprezentatecantitativ i ntotdeauna prezente n propolis, implicit susceptibile de a da cele maiconstante i mai caracteristice efecte farmacologice ale acestui produs, suntbioflavonoidele care au ca particulariti de structur starea liber, de compui deneglicozidai, precum i lipsa vreunei funcii fenolice n inelul B.

Este poate important de menionat faptul c toate aceste componentemenionate, fr excepie, se regsesc n compoziia chimic a multor specii dePinus, rspndite n cele mai ndeprtate i variate regiuni de pe glob i mai ales nmugurii de pin, la rndul lor utilizai pretutindeni pentru proprieti terapeutice binecunoscute. Pe de alt parte, este cunoscut i utilizarea rinii unor muguri, ca ceiai speciilor Populus, Prunus, ca materie prim pe care albinele o asociaz unorceruri i altor componente, la elaborarea propolisului. Este de asemenea e adugatc i mugurii de plop sunt medicinali i mpreun cu mugurii de prun i deZingiberaceae sunt depozite de astfel de bioflavonoizi.

Ali compui flavonoidici prezeni n propolis n cantiti mai mici sunt:- acacetina sau linarigenina izolat de POPRAVKO (1975) [12];- 7-metil-eterul-acacetinei, separat din mugurii de Betula verrucosa;


81

- campferida izomer de poziie al rhamnocitrinei identificat dePOPRAVKO (1969) [26];

- pectolinarigenina sau 6-metoxi-acacetina sau 6-metoxi-linarigenina,- 4-metil-eterul-sakuranetinei o flavanon a crei origine i structur

se afl n pinostrobin de la care deriv prin metoxilare a fostsemnalat n propolis de ctre METZNER i col., (1975) [27].

Toate aceste flavonoide semnalate frecvent n propolis sunt prezente subform de agliconi i care au ca specificitate prezena de funciuni fenolice libere,reactive, grefate pe inelul B.

Cvercetina (quercetina) agliconul rutozidei i al mai multor alteglicozide flavonoidice este foarte rspndit n regnul vegetal. A fost descoperit nstare pur de PERKIN i HUMMEL n 1896 [28] n hamei Humulus lupulus i ncojile de ceap (Allium cepa). Este utilizat n terapie, alturi de alte bioflavonoide,ca substan activ pentru meninerea strii normale a vaselor sanguine prindescreterea permeabilitii i fragilitii capilarelor BUDAVARI (1989) [29]

Alte grupe de compui prezente n propolis sunt chalconele idehidrochalconele, acizi alifatici i esterii lor, uleiuri volatile cu caten scurti esteri ai acestora, acizi aromatici i esteri ai acestora, acid benzoic i derivaiai acestuia, aldehide, alcooli, acid cinnamic i derivaii acestora, ali acizi iderivai, cetone, fenoli i ompui heteroaromatici, terpene, alcoolisesquiterpenici i derivai ai acestora, terpenoizi i ali compui, hidrocarburisesquiterpenice i triterpenice, compui volatili, hidrocarburi (C21-C33),hidrocarburi alifatice, steroli i hidrocarburi steroidice, zaharuri, lactone,aminoacizi, derivai de acizi nucleici, vitamine, minerale, transhidrogenazeanaerobe, substane donoare de H.

ntre chalcone i dehidrochalcone GREENAWAY i col.,(1990) [14] sepot meniona:

- chalcona alpinetinei- chalcona pinostrobinei- chalcona pinocembrinei- chalcona pinobanksin-3-acetatului- chalcona sakuranetinei- 2,6 dihidroxi-4-metoxi dihidrochalcona

Acizi alifatici i esteri ai acestora (GREENAWAY i col., 1990) [14]:- acid butiric, 2-metoxi-butiric, succinic, crotonic, angelic,, fumaric,

behenic, acetic, benzil-acetat, izobutil-acetat, izopentil-acetat, izopentenil-acetat,

- acid palmitic, cerotic, montanic, stearic, oleic, linoleic, miristic, lignoceric,


82

Uleiuri volatile cu caten scurt:- acid butiric, acid 2-metil-butiric- acid crotonic- acid angelic- acid acetic- acid izobutiric

Esteri ai uleiurilor volatile cu caten scurt:- izobutil-acetat- izopentil- acetat- izopentenil-acetat

Acizi aromatici i esteri ai acestora:- acid benzoic- benzil-benzoat- acid protocatechic- acid veratric- etil-benzoat- metil-salicilat- benzil-salicilat- acid hidroxibenzoic- acid vanilic- acid p-anisic- metil-benzoat- cinnamil-benzoat- acid hidroxicinnamic- acid cinnamic- acid metoxicinnamic- acid p-metoxicinnamic- acid 3,4-dimetoxicinnamic- benzil-3,4-dimetoxi-cinnamat- acid caffeic i esteri- acid cumaric, acid p-cumaric i esteri ai acestora- acid ferulic, acid izoferulic i esteri ai acestora- derivai ai acidului benzoic: acid salicilic, acid gentisic, protocatechic, acid

galic


83

Aldehide:- benzaldehid- aldehid protocatechic- p-hidroxibenzaldehid- vanilin- izovanilin- aldehid caproic

Alcooli:- alcool cinnamic- alcool benzilic- hidroquinon- alcool prenilic- izobutenol- alcool fenetilic- alfa-glicerofosfat- beta-glicerofosfat- glicerol

Ali acizi i derivai ai acestora:- esterul metilic al acidului 2,8-dimetilundecanoic- esterul fenilmetilic al acidului 14-metilpentadecanoic- esterul etilic al acidului palmitic- acid sorbic- esterul butil-2-metilpropilic al acidului ftalic- metil esterul acidului alnustic

Cetone, fenoli i compui heteroaromatici:- acetofenon i derivai- p-acetofenol i derivai- eugenol- pterostilben- xanthorrhoeol- cumarin- esculetol- scopoletol- pinosilvin- trigliceride fenolice


84

Alcooli terpenici, sesquiterpenici i derivai:- geraniol- nerolidol- guaiol- farnesol- dihidroeudesmol- beta-bisabolol- alfa-acetoxibetulenol

Terpenoide i ali compui:- cimen- limonen- alfa-copaen- stiren- 1,8-cineol

Hidrocarburi sesquiterpenice i triterpenice:- beta-burbonen- cariofilen- patchoulen- selen etc.

Hidrocarburi alifatice:- eicosan, eicosin, heneicosan- 1-octadecen- tricosan- pentacosan

Steroli i hidrocarburi steroidice:- cholestrilen- cholinasterol- stigmasterol- beta-dihidrofucosterol- lanosterol- colesterol

Zaharuri:- d-ribofuranoz- d-fructoz- d-glucitol


85

- d-guloz- taloz- zaharoz- d-glucoz- polizaharide

Aminoacizii determinai cantitativ 16 (KARDAKOV, 1980) [30] sau 24(GABRYS, 1986) [31] au ca reprezentani semnificativi acidul piroglutamic,arginina i prolina. Proveniena acestora n propolis este pus att pe seamapolenului dar i a secreiilor salivare ale albinelor.

Acelai lucru se poate afirma i despre prezena vitaminelor cureprezentani: B1, B2, B6, C, E, acid nicotinic, acid pantotenic, vitamina A.

Elementele minerale sunt determinate din reziduul obinut dupcalcinarea propolisului. n diferite eantioane de propolis provenind din diferiteregiuni ale globului, VANHAELEN i VANHAELEN-FRASTRE (1979) [32] audeterminat urmtoarele proporii: 0,51-0,86% n mostre din Frana, 0,55% - China,0,67% - SUA, 0,68%- Australia.

Principalii reprezentani ai acestora sunt: sodiul (Na), potasiul (K),magneziu (Mg), calciul (Ca), bariu (Ba), bor (B) urme, stroniu (Sr), zinc (Zn),cadmiu (Cd), aluminiu (Al), siliciu (Si), plumb (Pb), - urme (datorate mai alespolurii din traficul rutier sau prin amplasarea stupinelor n aceste zone sau zoneindustriale), seleniu (Se) urme, fer (Fe), nichel (Ni), crom (Cr), mangan (Mn),titan (Ti), argint (Ag), cupru (Cu), cobalt (Co), molibden (Mo), vanadiu (V).

Substanele rinoase. Dei n datele curente de specialitate nu suntinformaii foarte clare despre izolarea fraciunii rinoase din propolis icaracterizarea ei, prezena rinilor nu este pus la ndoial de nimeni. Multedintre proprietile propolisului se pot raporta la coninutul mare de rini. Seciteaz i prezena unor acizi rezinici, ca acidul abietic i acidul pimaric care facparte din constituenii cei mai caracteristici ai rinilor naturale.

Alte componente amintite deja, frecvent ntlnite n rini, ca acidulbenzoic, acidul cinamic, acidul ferulic, acidul cafeic, cumarine i triterpenoidepentaciclice au fost identificate n propolis. Acidul benzoic atinge 1,33-20%(BRILEANU i col., 1978)[33] i alturi de acidul cinamic este una dintresubstanele cele mai caracteristice din rina de Styrax benzoin de la care i tragenumele, fiind totodat o component comun a mai tuturor rinilor de pe muguri,ca i acizii ferulic i cafeic.

Cercetarea esterilor aromatici din propolis de tipul celor citai anterior ichiar mai complicai ca structur (prin identificarea unor acizi polifenoliciesterificai) a condus la descoperirea deosebit de valoroaselor proprieti


86

antimicrobiene ale propolisului, prin prezena sau absena lor, putnd fi explicatinconsecvena de activitate antimicrobian a diferitelor sorturi de propolis(METZNER i col., 1975, 1977, 1978) [27, 34, 35].

Din punct de vedere cantitativ, fraciunea rinoas se consider creprezint cca. 55% din propolis, cu meniunea cuprinderii n aceast fraciune i aunor balsamuri. Se tie c balsamurile se definesc ca amestecuri de rini i uleiurivolatile (eseniale) n care ultimele, ca regul general, trebuie s fie n proporie decel puin 40%. Este posibil ca numai mirosul balsamic al propolisului s fi generataceast exprimare deoarece studiile efectuate nu au relevat prezena de uleiurivolatile n astfel de proporii.

3. Extracte de propolis tehnologii de obinere a extractelorstandardizate

3.1. Tehnologia prelucrrii propolisului

Aa cum se poate observa din prezentarea compoziiei chimice apropolisului, principalele grupe de componente ale propolisului brut, n ordineadescrescnd a concentraiilor, sunt: substanele rinoase, ceara, bioflavonoizii,impuritile i corpurile strine, srurile minerale, vitaminele, enzimele etc.

Fiind un amestec att de complex, primele ncercri de caracterizare aacestuia au avut ca scop fracionarea sa.

Urmare a extraciei alcoolice se obine aa numita fraciune rezinic.Dup extracie rmne fraciunea insolubil n alcool sau fraciunea de ceruri.

Fraciunea cunoscut sub denumirea de balsam se refer lacomponentele ce pot fi extrase cu alcool de concentraie 70%.

Propolisul brut este supus mrunirii la dimensiuni a particulelor ct maimici pentru a se putea mri suprafaa de contact a solventului cu materialulextractibil. Pentru a facilita mrunirea, dar i pentru a pstra ct mai binefraciunea volatil de compui, propolisul este pstrat la temperaturi foarte sczute chiar congelat dup care este mcinat (devenind friabil). n instalaii speciale specifice industriei farmaceutice instalaii de extracie percolatoare, produsuleste supus extraciei cu alcool etilic absolut la temperatura ambiental. Alcooluletilic absolut prezint avantajul unei foarte bune selectiviti . extrgnd cel maibine flavonoidele i substanele rinoase, eliminnd din extract ceara. Prin acestprocedeu se obine totui o mic fraciune de cear, solubil n alcool, respectivceroleina, care ns n propolis nu este prezent dect n cantiti de 0,78 1,63%(POLINICENCU i col., 1981, 1984) [19, 36].


87

Capacitatea extractiv a etanolului absolut este secondat de alcoolul etilicde 70, aceton, metanol, alcool etilic de 50, cloroform i clorura de metilen.

Tehnologia de preparare prin aplicarea acestei metode urmrete realizareaa dou variante : un extract fluid cu coninut de 10% bioflavonoide exprimate ncrizin i un extract uscat cu coninut de 5% bioflavonoide exprimate n crizin(POPESCU i col., 1985) [37].

Prepararea extractului de propolis fluid standardizat cu 10% bioflavonoideexprimate n crizin tehnologie I.C.C.F-Cluj-Napoca

n principiu procedeul de preparare a EPS fluid se bazeaz pe obinereaunei soluii extractive din propolisul brut, concentrarea acestei soluii sub presiunesczut, la temperaturi mai mici de 50C i standardizarea extractului obinut laconcentraia de 10% bioflavonoide exprimate n crizin.

Un detaliu important n obinerea EPS fluid este calitatea propolisului brutluat n lucru: propolisul trebuie s fie de uz medicinal caracterizat deci prin lipsacorpurilor strine (impuriti) vizibile cu ochiul liber i printr-un coninut minim de15% bioflavonoide specifice.

Cercetrile efectuate au demonstrat necesitatea combinrii a dou procedeeexxtractive: macerarea repetat i percolarea. Utiliznd numai macerarea repetat,extracia principiilor active din propolis nu este cantitativ. La aplicarea combinata percolrii se obine extragerea cantitativ a principiilor active, operaia nsdecurgnd foarte ncet datorit coninutului ridicat de substane rinoase dinpropolis i a colmatrii filtrelor. Deaceea aplicarea preliminar de macerri repetatei apoi a percolrii conduc la cele mai bune rezultate.

n vederea extraciei, propolisul brut trebuie mrunit la fineea sitei culatura ochiurilor de 6,3 mm (sita I, FR.IX.). Mrunirea se realizeaz cu ajutorulunor dispozitive mecanice de tiere i rzuire. Deoarece n timpul acesteioperaiuni propolisul se nclzete i devine plastic, se recomand nghearea(rcirea) propolisului brut prin meninerea 6 12 ore la temperaturi cuprinse ntre10 20C, cnd acesta devine casant, iar operaiunea se desfoar cu mai multuurin.

Propolisul mrunit se supune la trei macerri repetate, fiecare a cte 24ore, ntr-o prim etap utilizndu-se o cantitate dubl de alcool concentrat fa decantitatea de propolis luat n lucru, apoi nc de dou ori cu o cantitate egal dealcool fa de cantitatea iniial de propolis. n timpul macerrii, soluia se agitocazional. Soluiile extractive obinute se decanteaz, se filtreaz i se reunesc.

Materia prim extras parial prin macerare repetat, este supus, ncontinuare, extraciei prin percolare. Reziduul de la macerarea repetat se introducen percolator, se acoper cu alcool, se elimin aerul i se regleaz astfel viteza decurgere a percolatului, nct n 24 de ore s se percoleze 1,5 pri fa de cantitatea


88

de propolis introdus n percolator. Se continu percolarea pn la epuizareapropolisului, respectiv pn la obinerea unui lichid de culoare slab glbuie, cuindicele de refracie cuprins ntre 1,3720 1,3655. Soluia extractiv obinut prinpercolare se colecteaz separat de soluia extractiv obinut prin macerarerepetat.

Faza urmtoare cuprinde determinarea concentraiilor de bioflavonoide alecelor dou soluii extractive obinute prin macerare repetat i respectiv prinpercolare, stabilindu-se volumul aproximativ la care trebuiesc concentrate pentru arealiza extractul fluid cu coninutul standard de 10% bioflavonoide specifice.

Concentrarea soluiilor se face la presiuni reduse i temperaturi care s nudepeasc 50C. Cele dou concentrate obinute se omogenizeaz, se determinconinutul de bioflavonoide i se aduce extractul fluid la concentraia final de 10%bioflavonoide exprimate n crizin. (Figura 1)

Alcoolul etilic concentrat, recuperat prin distilare, se poate utiliza la o nouextracie.

Prepararea EPS uscat cu 5% bioflavonoide exprimate n crizin (tehnologieICCF- Cluj Napoca)

Obinerea EPS uscat se face pornind de la EPS fluid; acesta se adsoarbe peo pulbere inert, se usuc, se pulverizeaz i se aduce la concentraia de 5%bioflavonoide specifice. Dintr-o parte EPS fluid se obine 2 pri EPS uscat.

Procedeul de preparare este urmtorul: se amestec 1 parte EPS fluid cu1,5 pri pulbere adsorbant (amidon). Amestecul obinut se ntinde pe tvi i seusuc la temperaturi sub 50C, iar dac este posibil i la presiune redus. Extractuluscat obinut se pulverizeaz, se omogenizeaz, se face determinarea cantitativ aflavonoidelor i se aduce la concentraia de 5% principii active exprimate ncrizin, adugndu-se pulbere adsorbant. Extractul uscat se reomogenizeaz i seaduce n final la fineea sitei cu laturile ochiurilor de 250 (sita VI, FR.IX).

Tehnologia de obinere a extractului moale (spiss) de propolis pentru uzfarmaceutic (tehnologie original ICDA-Bucureti) (PALO i col., 1975) [38]

Toate produsele cu destinaie terapeutic pe baz de propolis realizatepentru prima oar n lume n Romnia, folosesc ca materie prim activ extractulde propolis spiss (moale). Prin extract moale (spiss) de propolis se nelegepreparatul obinut prin extracia selectiv a principiilor active din propolis cuajutorul alcoolului etilic utilizat ca solvent i concentrarea soluiei extractiveobinute pn la realizarea unei mase vscoase care prezint cel mult 20% solveni.


89

Procesul tehnologic de fabricaie a extractului de propolis spiss cuprindeurmtoarele etape:- selectarea propolisului ( acesta nu trebuie s conin un procent ridicat de

cear, impuriti sau semne de degradare);- mrunirea blocurilor de propolis pn la o granulare de 2-4 mm care

permite creterea suprafeei de contact cu solventul facilitnd extracia.Mrunirea propolisului este o operaie foarte dificil avnd n vedereconsistena sa dur, lipicioas, care face ca echipamentele folosite n modobinuit n acest scop s nu dea rezultate pozitive. Procesul se mrunire seface n dou etape: mrunirea blocurilor de propolis pn la dimensiuni de 20-30 mm, dup care granulele mari sunt aduse la dimensiunea de 3-4 mm. Pentruprima operaiune se folosete o pres mecanic de 150 kg/cm la care seadapteaaz tane cu cuite din oel foarte dur. Pentru faza a doua se folosete omoar cu cuite prevzut cu un tambur robust, mobil, pe care sunt fixatecuitele i care n timpul rotirii tamburului trec printre cuitele unei plci fixe.

- Macerarea: extracia principiilor active din propolis se realizeaz cu alcooletilic de 90 n arje formate din 70 litri alcool i 30 kg propolis n granule.Materiile prime se introduc ntr-un extractor din inox cu perei dubli prin carecircul ap cald la temperatura de 40C. masa este agitat mecanic cu unagitator de turaie mic (1 rpm); folosirea agitrii i a temperaturii moderateaccelereaz i mbuntete procesul de extracie; dup 48 ore se obine ocantitate de 75-80 kg extract fluid de propolis care este supus filtrrii;

- Filtrarea se execut n scopul separrii reziduurilor nedizolvate. ntr-o primfaz se aplic o decantare, apoi filtrare grosier printr-un filtru de vid tip nucei n final o filtrare fin prin hrtie de filtru la aparat prevzut cu pomp de vid.

- Concentrarea extractului const n reducerea cantitii de solvent pn lalimita de 20% i recuperarea acestuia cu ajutorul unui aparat de concentrare lavid. Aparatul este format dintr-un blaz de distilare, din tabl de inox, cu pereidubli prin care circul ap nclzit la temperatura de 70-80C. evaporarea lavid i nclzirea moderat asigur conservarea principiilor active alepropolisului n condiiile unei concentrri rapide. Vaporii de solvent trec dinblazul de distilare ntr-un condensor format dintr-o serpentin cufundat n aprece cu circulaie continu; condensatul recuperat se colecteaz ntr-un vasspecial la care este conectat pompa de vid.

- Verificarea calitii produsului se face prin determinarea densitii care estecuprins ntre 1,096 - 1,159, identificarea flavonelor conform specificaiilor dinfarmacopee i identificarea acizilor aromai. Extractul de propolis spiss estecaracterizat din punct de vedere calitativ i cantitativ prin determinareaconcentraiei n flavonoizi totali exprimai n quercetin, procedeu aprobat deAgenia Naional a Medicamentului.


90

Tehnologia de obinere a extractului de propolis hidrosolubil liofilizat procedeu original brevetat la ICD Apicultur Bucureti

Extractul de propolis moale (spiss) este folosit ca materie prim pentruobinerea extractului hidrosolubil liofilizat produs obinut printr-un procedeuoriginal i care permite solubilizarea propolisului n solveni apoi cu destinaieterapeutic ap distilat, ser fiziologic, solveni specifici cu destinaie noftalmologie, etc.(OITA i col., 1981) [39]

Principiul metodei de preparare se bazeaz pe solventarea compuiloractivi din propolis ntr-un solvent organic (etilendiamin sau dietilaminoetanol),solubilizarea extractului obinut n soluie fiziologic, filtrarea reziduurilor decear, i apoi liofilizarea extractului n flacoane de tip antibiotic. Extractulhidrosolubil obinut se prezint sub forma unei mase de consisten spumoas carese solubilizeaz n orice proporie cu apa distilat, serul fiziologic i solveni apoispecifici destinaiei terapeutice pentru care este folosit.

Cu acest extract hidrosolubil se prepar soluii pentru aerosoli ntratamente ORL i bronhopulmonare precum i soluii i aerosoli de uz oftalmic.

3.2. Solventarea principiilor active din propolis

Prin aplicarea metodelor de nalt performan cromatografie lichid(HPLC) (BANKOVA i col., 1982) [40] gaz-cromatografie cuplat cuspectrometrie de mas (ABD EL-HADY i col., 1994 (a,b) [41,42] au izolat dinpropolis urmtoarele grupe de compui:

- esteri ai acizilor fenolici - 72,7%- acizi fenolici - 1,1%- acizi alifatici - 2,4%- dihidrochalcone - 6,5%- chalcone - 1,7%- flavanone - 1,9%- flavone - 4,6%- derivai de tetrahidrofuran - 0,7%Pentru detectarea acestor compui, propolisul a fost supus extraciei n

urmtorul amestec de solveni: metanol-eter etilic-aceton-cloroform n raport 1:1:1:1.Alte extracii aplicate propolisului brut au utilizat ca solveni alcoolul etilic

15% (v/v), alcool etilic 70% i alcool etilic absolut rece sau fierbinte.Aa cum arat rezultatele obinute, n extractele alcoolice de propolis se

regsesc compui flavonoizi, terpene, derivai ai acidului cinamic, acizi alifatici iacizi fenolici.


91

Fraciunea volatil de distilat prin antrenare cu vapori de ap a prezentaturmtorii compui: acid benzoic, alcool benzilic, acid sorbic, vanilin i eugenol.Distilatul prin antrenare cu vapori conine: eter fenil vinilic, anisil-vinil-eter iciclohexil benzoat compui presupui a fi artefacte experimentale.

Studiile efectuate pe propolisul recoltat de pe mugurii i scoara de eucalipt specific Braziliei i zonelor cu climat mediteraneean s-au identificat un marenumr de hidroxi i metoxi stilbeni, explicaia unei astfel de prezene putnd fifaptul c albinele la recoltarea materialului rinos transform stilbenii naturali prinmetilare sau demetilare n pterostilbeni.

Alte tipuri de extracii aplicate propolisului brut au fost cele care utilizeazca solveni apa i diferite concentraii de etanol. Capacitatea de extracie a acestorsolveni se poate estima prin msurarea spectrului de absorbie n UV.

Prepararea extractelor apoase i etanolice de propolis

PARK i col., (1998) [43] au ncercat obinerea unui extract etanolic depropolis pentru care s-a aplicat urmtorul procedeu: propolisul brut, uscat, a fostmcinat pentru obinerea unei pudre fine din care s-au prelevat mostre a cte 2 gtratate cu cte 25 ml soluie apoas de etanol 80%. Amestecul obinut este meninuttimp de 30 de minute sub agitare continu la temperatura de 70C. Dup extracie,amestecul este centrifugat, iar supernatantul obinut este denumit extract etanolicde propolis.

Pentru obinerea extractului apos MATSUSHIGE i col., (1996) [44] aufolosit eantioane de 2 g de propolis care au fost tratate cu 25 ml ap deionizat,agitate timp de 2 ore la temperatura de 95C, dup marcarea prealabil a niveluluidin tuburile de testare; dup agitare, extractele se rcesc la temperatura camerei ise revine la nivelul iniial al soluiei prin adugarea de ap deionizat. Coninutultuburilor este centrifugat pentru obinerea supernatantului desemnat ca fiindextractul apos de propolis. Este important de menionat c s-a lucrat pe eantioanede propolis recoltat din diferite regiuni ale Braziliei.

Pentru determinarea coninutului n principii active din extractele obinutes-a aplicat metoda de msurare a spectrelor de absorbiei n UV . Extractele au fostscanate la lungimile de und cuprinse ntre 200 500 nm, la un spectrofotometruUV. Pentru determinarea spectrelor de absorbie analiza s-a efectuat pe complexulmetal (aluminiu)-flavonoid (chelatizare). Reactivul folosit a fost azotatul (nitratul)de aluminiu 10% - 0,1 ml, 0,1 ml acetat de potasiu 1M i 4,3 ml etanol 80%. Cte0,1 ml din fiecare extract de propolis au fost tratai cu cte 0,5 ml de amestec dereactivi.

Nivelul de absorbie (absorbana) al extractelor etanolice i a extractuluiapos de propolis sunt prezentate n tabelul 2. Toate probele analizate au prezentatun maxim de absorbie la lungimea de und de 290 nm. Totui gradul de absorbie


92

la 290 nm a fost variabil n funcie de concentraia soluiilor de etanol. Extractulapos a prezentat cea mai sczut valoare a absorbiei, care totui a crescut progresivcu concentraia de etanol pn la 80%. Extractele cu concentraii de etanol de 90%i 95% au prezentat o scdere a absorbiei la 290 nm. Aa cum s-a menionat nlucrri anterioare (MARKHAM, 1982; KUNO, 1987), [45, 46] apariia benzilor deabsorbie la lungimile de und de 270 330 nm este atribuit flavonoizilor ifenolilor. Cu alte cuvinte cea mai mare concentraie de flavonoizi a fost eliberat lautilizarea etanolului de 80%. Pe de alt parte, amestecurile de extracte etanolice depropolis cu nitrat de aluminiu i acetat de potasiu modific complet spectrele deabsorbie, cu formarea unui nou peak de absorbie maxim la lungimea de und de310 nm. Modificarea maximului de absorbie se datoreaz formrii complexului(chelat) metalic cu flavonoizii. Cea mai mare parte a flavonoizilor naturali suntpolifenoli care conin una sau mai multe grupri O-dihidroxil i hidroxiceto caresunt implicate n formarea complecilor metalici. Formarea complexuluimetal.flavonoizi induce o schimbare a spectrului de absorbie maxim (JURD iGEISSMAN, 1956; PORTER i MARKHAM, 1970) [47, 48].

Tabelul nr.2Absorbana extractelor etanolice i apos de propolis

Extracte de propolis Absorbana extractelor Absorbana complex La 290 nm la 310 nm

Extract apos 0,4434 0,4341

10% etanol 0,5115 0,4782

20% etanol 0,5965 0,5471

30% etanol 0,7401 0,7002

40% etanol 1,0575 0,9290

50% etanol 1,7802 1,5637

60% etanol 2,4668 2,1455

70% etanol 2,6931 2,2860

80% etanol 2,9844 2,7154

90% etanol 2,6334 2,2692

95% etanol 2,5298 2,1980


93

Aa cum se poate observa din acest tabel, s-a concluzionat cu extractele depropolis n soluie etanolic 80% conin cea mai mare concentraie de flavonoizi.

Pentru determinarea activitilor biologice ale propolisului, n Japonia(MIYATAKA i col., 1997)[49] propun prepararea unor extracte etanolice iapoase de propolis, aplicnd tehnici de laborator specifice.

Conform acestor autori propolisul este supus extraciei n etanol deconcentraie de 99,5%. 5 pri (volume) de etanol 99,5% sunt introduse ntr-unrecipient etan ce conine 1 parte (greutate) propolis brut. Amestecul obinut estelsat n repaus timp de 10 zile, cu agitri ocazionale. Soluia obinut dup perioadade extracie este supus filtrrii printr-un filtru No.2 (dimensiunea porilor 5).Reziduul de pe hrtia de filtru este splat cu solventul de extracie. Soluia desplare este combinat cu filtratul obinut i volumul total al soluiei obinute esteadus la 200 ml cu etanol 99,5%. Reziduurile au fost n prealabil uscate pe sulfat desodiu anhidru. Dup msurarea greutii reziduului obinut cantitatea extras nfiecare extract i concentrare n etanol de 99,5%, se determin prin scderea valoriiobinute din masa iniial a propolisului luat n lucru. Concentraia extractului depropolis accesibil pe piaa internaional este cuprins ntre 2,7 12,5%.

In cazul extractului apos, 5 pri (volumetric) de ap distilat degazat prinnclzire i apoi rcit la temperatura camerei sunt introduse ntr-un vas etan cu 1parte (n greutate) de propolis. Amestecul obinut este lsat n repaus timp de 10zile cu agitri ocazionale. Toate operaiile ulterioare sunt identice celor pentruprepararea extractelor etanolice.

Teste asupra aciunii biologice a propolisului au fost efectuate i cu alt tipde extract de propolis respectiv cu un extract apos de concentraie 13% w/vprodus n Danemarca de firma Propharma A/S.

In Cuba se prepar un extract de propolis rou prin suspendarea a 1 gprodus brut n etanol 95% (v/v). suspensia este decantat dup 48 ore de pstrare latemperatura camerei. Extractul obinut are o concentraie de 70% (w/v) i serecomand pstrarea sa la temperatura de 4C (NELSON MERINO i col., 1996) [50].

Tot pe propolisul brazilian s-au efectuat teste pe extracte obinute cu apfierbinte. Alte extracte obinute n metanol i cloroform au fost preparate prinreluarea reziduului de la filtrare cu aceti solveni. (BASNET i col., 1996) [51].

4. Activitatea biologic a extractelor de propolis i a diferitelorfraciuni ale acestora

Propolisul este cunoscut astzi ca unul dintre cele mai surprinztoareproduse naturale datorit studiilor i cercetrilor efectuate care atribuie acestuia idiferitelor sale fraciuni nenumrate aciuni biologice i efecte terapeutice. ntre


94

aciunile terapeutice se pot enumra: antimicrobian, antibiotic, antifungic,antiinflamatorie, analgezic, antioxidant i anti-tumoral.

La ora actual, pe plan mondial, propolisul este utilizat pe scar larg ndiferite formule de medicamente (ndeosebi n Europa rsritean), suplimente sauaditivi alimentari i buturi pentru a mbunti starea de sntate i pentruprevenirea unor afeciuni: inflamatorii, boli cardiace, hepatice, diabetul i chiarunele forme de cancer.

Cu toate aceste dovezi asupra virtuilor sale terapeutice, ansa de a setransforma dintr-un remediu empiric ntr-un medicament, depinde foarte mult depurificare, standardizare i supunerea sa la toate celelalte etape de cercetare icontrol: chimic, tehnologic, toxicologic, preclinic i clinic.

Progresul realizat n domeniul chimiei, farmacodinamiei i a tehnologiilorfarmaceutice au condus la stabilirea anumitor reguli pentru medicamente, ntrecare cea mai sever este cea privitoare la o anumit relaie ce trebuie s existe ntreprodusul respectiv i efectele sale asupra organismelor. Din aceast relaie se natenoiunea de doz terapeutic, mai ales pentru substanele active pure, indiferent deforma farmaceutic n care acestea sunt prezentate.

Prin standardizarea extractelor, tincturilor, etc., noiunea de doz poate fiextins i la medicamentele sau produsele care sunt amestecuri naturale desubstane active. Standardizarea nseamn deci uniformizarea concentraiei nprincipii active din produsele finite dimensiune ce poate fi exprimat princomponentul cel mai caracteristic.

Atunci cnd metodele fizico-chimice nu pot fi aplicate, standardizarea sepoate face utiliznd o metod de control biologic. Oricum, standardizareaextractelor naturale este de mult vreme o condiie de la sine neleas.

Propolisul este cunoscut ca fiind activ la nivelul organismelor, dar n cursulultimelor decenii, s-a raportat o larg varietate a compuilor si. De aceea extractele depropolis de uz medicinal trebuie s rspund cerinei privitoare la raportul dintrecantitatea administrat i efectul obinut; aceasta nseamn c att experimentele delaborator ct i cele clinice trebuiesc efectuate numai cu extracte standardizate.

Orice extract, presupune nainte de orice altceva, s se obin un produsmai pur; un extract standardizat ofer posibilitatea de a fi administrat n anumitecantiti ce conin concentraii controlate de substane active, astfel nct cusiguran el s fie lipsit de toxicitate, s ofere o eficiena terapeutic maxim i spermit individualizarea tratementelor.

Extractul de propolis standardizat, departe de a fi un produs toxic, estetotui capabil s prezinte o serie de efecte secundare atunci cnd anumite doze suntdepite. Modificarea dozelor poate induce efecte diferite sau chiar eecuriterapeutice.


95

n acest sens, experiena Romniei prin Centrul Medical de Apiterapie alInstitutului de Cercetare i Dezvoltare pentru Apicultur, a dovedit c rezultateleexperimentelor biochimice i farmacologice efectuate pe organisme sntoaseprecum i efectele sale pe organisme animale cu stri patologice induse suntelemente fundamentale n planificarea i efectuarea unui experiment clinic.

Extractul de propolis standardizat (extractul moale sau spiss) a fost supusunor experimente biochimice pentru a i se demonstra eficacitatea asupra ficatului,sngelui, sistemului muscular, organelor limfatice, glandelor suprarenale,metabolismul general al glucidelor precum i n anumite aspecte imunobiologice.

Datele privitoare la efectele propolisului asupra organismului animal cucondiii patologice induse privesc aciunile hepatoprotectoare i antiinflamatoareprecum i investigaii asupra aciunii epitelizante, asupra permeabilitii vascularei aciunea antiviral (testat pe anumite virusuri multiplicate n culturi de esuturi).

4.1. Aciuni fundamentale ale flavonoizilor i consecinele lor fiziologice

Efectele observate ca urmare a consumului de flavonoizi i pot aveaoriginea din cele trei principii fundamentale ale aciunii lor:

- modificarea activitilor enzimatice prin fosforilare- antioxidare- represie genicConsecinele fiziologice ale acestor 3 aciuni principale sunt:- aciunea antialergic- aciunea antiviral- aciunea anestezic- aciunea anti-tumoral- aciunea antiinflamatoare (aspirin-like)

Aciunea antialergic

Simptomele reaciilor alergice ca dispneea obstrucia cilor aeriene princontracia musculaturii bronice nroirea pielii, secreia excesiv a nasului(rinit) i de suc gastric precum i creterea temperaturii, apar ca rezultat aleliberrii de histamin din mastocite. Histamina este eliberat atunci cnd agentulpatogen (alergenul) este legat de imunoglobulina E din membrana extern amastocitelor. Ca rezultat, pe fondul consumului de ATP, canalele specifice pentruionii de calciu din membrana extern a mastocitelor se deschid, permindpenetrarea acestora n celule. Datorit sarcinii lor pozitive duble, ionii de calciupermit eliberarea a dou molecule de histamin, care la rndul lor poart fiecarecte o singur sarcin pozitiv.


96

Datorit marii capaciti de reacie, adenozintrifosfatul (ATP) caredeschide canalele de calciu, va aciona preferenial pentru fosfat. Ca urmare, nprezena flavonoizilor, canalele de calciu rmn nchise i mastocitele nu mai potelibera histamina astfel nct simptomele reaciei alergice nu se mai produc. Estecunoscut faptul c chromoglycan-ul i medicamentul Intal constau dintr-un inelcromanic i un flavonoid. Aceste substane sunt folosite de mult vreme camedicamente n combaterea alergiilor ( KLIMMEK, 1988) [52].

Dup cum se tie, propolisul conine o anumit cantitate de polen i atuncicnd acesta nu este eliminat prin procedee corespunztoare, unii pacieni maisensibili pot dezvolta alergii la propolis. Este unul din motivele pentru carepropolisul este suspectat a fi un potenial alergen. Propolisul poate fi nsincriminat de apariia alergiilor i datorit coninutului (n unele sorturi) n esteri aiacidului cinamic i ai acidului cafeic (HAUSEN i col., 1987; SCHULER i col.,1988; ITOH i col., 1994) [53, 54, 55].

O alt potenial surs de alergenicitate este veninul de albine prezentdeasemenea n propolis n cantiti foarte mici. De obicei, veninul de albine esteextras cu solveni apoi, motiv pentru care i acesta poate fi incriminat pentruaciunea alergic a propolisului.

Aciunea antiviral

Se tie c virusurile constau dintr-un nucleu infecios ce conine un acidnucleic (DNA sau RNA) i o manta proteic. Adeseori, acestea pot penetra uor ncelulele umane. Pentru a deveni active, mantaua lor proteic trebuie s fie digeratde enzimele prezente n lizosomi. Lizosomii sunt vezicule acoperite de omembran lipidic care n prezena flavonoizilor nu poate fi penetrat de virusuri.Fondul acestui fenomen nu este nc deplin neles, dar se poate emite o ipotez.Un exemplu ar putea fi neutralizarea gruprilor amino din mantaua proteic prinfosforilare o prezumie pentru penetrarea membranelor lipidice lizosomale.

DEBIAGGI i col., (1990)[56] au testat efectele antivirale a 5 specii deflavonoizi specifici prezeni n propolis: crizina, kaempferol, acacetina, galanginai quercetina. Utiliznd culturi de celule in vitro, s-a determinat replicarea iinfectivitatea unor tulpini de virus herpetic, adenovirus, coronavirus i rotavirus.Crizina i kaempferolul au prezentat o aciune inhibitorie dependent de dozasupra replicrii virale intracelulare a tuturor tulpinilor virale testate dar nuafecteaz infectivitatea acestora. Ambii flavonoizi se dovedesc foarte activi ninhibarea replicrii diferitelor tipuri de virusuri herpetice (HSV herpes simplex):HSV-2 (0,2 g/ml si 0,1 g/ml), HSV-1 (0,5 g/ml i 2 g/ml). La 10 g/mlcrizina i kaempferolul reduce replicarea virusurilor n proporii de 45% irespectiv 65% la coronavirusul bovin, 30% i 50% la coronavirusul uman,


97

rotavirusul SA-II 25% i respectiv 35%. Quercetina la doza de 60g /ml i crizinala 10 g/ml au redus infectivitatea virusurilor herpetice (HSV-2, HSV-1 i TK-HSV-1) cu aproximativ 65% i respectiv 50%. (CHENG i WONG, 1996) [57].

AMOROS i col., (1992a) [58] au observat c propolisul este foarte activin vitro mpotriva virusului polio i herpetic. La o concentraie de 30 g/mlpropolisul reduce titrul virusurilor herpetice de 1000 de ori, inhib replicarea HSVcu 99,5% i inhib total formarea plgii de poliovirus. S-a observat de asemeneai o aciune virulicid asupra virusurilor ncapsulate, herpes simplex i virusulstomatitei veziculare (VSV). n acest caz se sugereaz c flavonoizii galangin icrizin majoritari n eantioanele de propolis recoltat din Frana (i n general dinzona european) acioneaz sinergic n aciunea antiviral a propolisului.

ntr-un studiu mai aprofundat asupra aciunii inhibitoare a flavonoizilorasupra virusurilor, AMOROS i col., (1992b) [59] au observat efecte sinergiceindividuale i binare ale flavonolilor (galangin, kaempferol i quercetin),flavonelor (crizin, apigenin, luteolin i tectocrizin) i a flavanonelor(pinocembrin i izosakuranetin) asupra infeciei cu virus herpetic de tip I ireplicarea acestuia n celule renale de maimu in vitro. Tot aceast echip aconstatat c flavonolii sunt mai eficieni n reducerea titrului virusurilor; totui s-aconstatat c galangina este activ n timp ce crizina nu prezint activitate,contrazicnd astfel rezultatele obinute de DEBIAGGI i col., (1990)[56]. Autoriiau atribuit contradicia:

diferenei ntre tulpinile de HSV-1 diferenei dintre timpii de incubaie (48 de ore mai puin dect Debiaggi i

col., 1990) [56] diferiilor parametri de lucru

Activitatea flavonolilor descrete n ordine invers cu numrul de gruprihidroxil substituite: galangin > kampferol > quercetina. Afinitatea compusului lalipide (lipofilie) pare s aib o importan deosebit pentru activitatea biologic.Numai galangina, kaempferolul i balsamul de propolis pare s fie activi cuadevrat mpotriva HSV-I. Ali constitueni de tipul metoxiflavonelor minore sauconjugai de tip cafeoil pot contribui la rndul lor la aciunea antiviral. n plus,atunci cnd doi flavonoizi diferii au fost administrai mpreun, s-a observat unsinergism semnificativ mpotriva HSV-I, cu combinaii de flavonoli i flavone careproduc o reducere semnificativ a virusului. Cele mai importante combinaii binareau fost: kaempferol + luteolin; quercetin + crizin; galangin + apigenin;kaempferol + apigenin; quercetin + apigenin. Adeseori sinergismele indicdiferite moduri de aciune dar ntruct mecanismul (ele) inhibiiei virale maitrebuie nc elucidate, se fac nc speculaii.


98

Propolisul i extractele sale precum i o serie de soluii de flavonoizi s-audovedit mijloace eficiente n sistarea replicrii agentului patogen al hepatitei viraleHbsAg (MORFEI i col., 1980) [60].

Aciunea analgezic

Unele procese dureroase apar ca rezultat al producerii de prostaglandine lalocul leziunii (rnii). Formarea acestor prostaglandine poate fi stopat de flavonoiziprin aciunea lor de inhibare a aciunii enzimei prostaglandin-ciclooxigenaza (PG-ciclooxigenaz).

Aciunea anti-tumoral (anti-cancer)

Una dintre explicaiile acestei aciuni a flavonoizilor este urmtoarea:celulele tumorale sunt caracterizate printr-o activitate insuficient a pompelorionice ale ATP-azei. Ca urmare, n timp, enzima ATP-az devine inactiv,deoarece centrul su activ este blocat prin fosforilare. Flavonoizii modific acestproces de fosforilare probabil prin captarea gruprilor fosfat. Prin acest proces,activitatea celulelor poate reveni la normal (KLIMMEK, 1988) [52]

n 1991 (MATSUNO i col.,) [61] a raportat prezena n propolisulbrazilian a trei compui cu aciune anti-tumoral. Aceti compui sunt quercetina,esterul fenetilic al acidului cafeic i un nou compus clerodan-diterpenoid ultimul fiind centrul ateniei. Clerodan-diterpenoidul a demonstrat stopareadezvoltrii celulelor tumorale n faza S i a prezentat o degradare masiv asupracelulelor tumorale HuH13 n nu mai puin de 3 zile n medii de cultur. Pe dealt parte, un slab efect citotoxic a fost observat asupra celulelor renale de iepureaflate n stadiu primar fr transformri, i asupra celulelor diploide umane.Urmrind aceast substan s-a demonstrat c ea prezint i aciune antibacterian,poate ucide celulele tumorale hepatice fr a le leza pe cele normale. Un an maitrziu, 1992 [62], acelai autor a artat c prin administrarea de propolis brazilianla un pacient afectat de cancer, s-a produs o activare a limfocitelor T-killer i amacrofagelor din esutul afectat fapt ce a produs inhibarea creterii tumorii.

n 1993, ARAI i col., [63] de la laboratoarele biochimice Hayashibara auajuns la concluzia c propolisul activeaz macrofagele, induce producia decitokine i restrnge dezvoltarea de metastaze n cancerul de colon. n rapoartelelor ei au artat clar c propolisul acioneaz direct asupra macrofagelor pentru a leamplifica funciile i lucrnd mpreun cu antigenul induce producia de factor denecroz tumoral, interleukin-1 i interferon, innd metastazele la nivelulplmnilor la valori sub 60%.


99

KIMOTO i col., (1994, 1995) [64, 65] au reuit s identifice i s izolezedin propolisul brazilian artepillina C un compus cu o puternic aciune anti-tumoral prezent n produs n concentraii de aprox. 5%. Artepillina C s-adovedit extrem de eficient ndeosebi asupra celulelor leucemice i se ateapt can viitor ea s fie administrat prin injecii intravenoase ca adjuvant nchemoterapia acestei afeciuni.

Studiile efectuate au demonstrat c constituenii propolisului care prezinto puternic aciune anti-tumoral sunt:

- derivai ai acidului cafeic- flavonoizi- acidul 2,2-dimetil-8-prenil-cromen-6-propendioic- artepillina- acidul 17-hidroxicleroda-3m(13Z)-dien-15-oic (MARCUCCI, 1995;

MATSUNO i col., 1995, 1996, 1997) [66, 67, 68, 69]

Aciunea de tip aspirin (aspirin-like)

Aspirina acidul acetilsalicilic inhib, n acelai mod ca iflavonoizii, aciunea enzimelor reponsabile pentru sinteza prostaglandinelor PG-ciclooxigenaz i lipooxigenaz. Acesta este principalul motiv pentru careflavonoizi sunt recunoscui ca aspirin natural.

4.2. Mecanisme de aciune ale flavonoizilor

Inhibarea sau activarea unor enzime

Asemnarea dintre aminoacidul tirozin (Tyr) i structura de baz aflavonoizilor poate conduce la un proces competitiv de fosforilare. Fiind mainucleofili dect tirozina, flavonoizii sunt fosforilai naintea aminoacidului. Acestaeste un posibil mecanism prin care se poate produce inhibarea sau activarea unorenzime. Tot acest proces poate fi o posibil explicaie pentru oprirea evoluieitumorilor.

Aciunea antioxidant

Structura de baz a flavonoizilor conine un inel cromanic care n condiiide oxidare poate fi deschis cu uurin pentru a forma un radical liber (RL).Radicalul liber format poate distruge cu uurin ali radicali liberi pe care igsete n organism i care produc distrugerea tisular. Radicalii liberi pot fi


100

produi ca rezultat al iraadierii cu raze X (raze Roentgen) sau iradiere cu substaneradioactive.

Aciunea reductoare a flavonoizilor stopeaz distrugerea acidului ascorbic(vitamina C) prin oxidare i tansform ionul de fier trivalent (Fe3+) n forma safiziologic bivalent. n plus, flavonoizii se pot lega puternic de ioni de metalegrele (cupru bivalent, mercur bivalent i plumb bivalent). Altfel, unele metale grelevor avea tendina de a cere autooxidarea anumitor elemente eseniale : substanenutritive, acizi grai polinesaturai i de asemenea de a inhiba activitatea anumitorenzime.

Represia genic

Represia genic este o aciune important a anumitor hormoni cum suntestrogenii i glucocorticoizii.

Hormonii glucocorticoizi controleaz metabolismul carbohidrailor. Uniiflavonoizi prezint astfel de aciuni de tip hormon-like. Flavonoidul sylibina icortizonul au o foarte apropiat asemnare structural, fapt ce ar putea explicaaciunea lor comun.

Aciunea flavonoizilor n diabetul zaharat

n aceast boal zaharoza este transformat n grsimi i astfel circulaiasanguin la nivelul organelor ochi i intestin, de exemplu este oprit. Cu ctglucoza este meninut mai mult timp la nivelul unui organ, ea este redus deenzima aldosereductaz la hexitol un compus stabil ce nu mai sufertransformri. Prin osmoz hexitolul atrage mult ap din snge i o reine n celule,care la nivel funcional sunt marcate. La nivelul ochilor se produce o suprapresiunen timp ce la nivelul intestinului absorbia compuilor nutritivi este diminuat.

Flavonoizii inhib activitatea aldosereductazei, diminund astfel tulburrilela nivelul ochilor i normaliznd funcia intestinal.

Aciunea antimicrobian a flavonoizilor din propolis

Extractul etanolic de propolis (EEP, 70% extract etanolic) cunoscut dup s-a menionat i sub denumirea de balsam de propolis a fost utilizat de GRANGEi DAVEY (1990) [70] n culturi bacteriene n plac, demonstrndu-se eficacitateasa n inhibarea dezvoltrii unor tulpini de Staphylococcus aureus mai ales ceacare a devenit rezistent la antibioticul methicillin. Mai mult, balsamul de propolisacioneaz preferenial n inhibarea cocilor i bacililor Gram-pozitivi la oconcentraie de 3 mg/ml. Se speculeaz c compuii activi din balsamul de propolis


101

cuprind flavonoidul galangin (3,5,7-trihidroxiflavon) i CAPE (esterul fenetilical acidului cafeic caffeic acid phenethyl ester) i c aceste sinergisme, n careefectele mai multor componente se combin pentru a obine un efect maiputernic, sunt posibile ntruct componentele singulare au efecte inhibitorii multmai reduse.

Mecanismul de aciune este considerat a fi o inhibare a RNA-polimerazelorbacteriene dependente de DNA prin aciunea unui component hidrosolubil dinpropolis cu absorbie n UV (GRANGE i DAVEY, 1990; SIMUTH i col., 1986)[70, 71].

BRUMFIT i col., (1990) [72] au observat c extractele de propolisobinute n ap i soluii tampon la pH 5 i 6, sau extractele n petrol nu prezintnici un fel de activitate asupra tulpinilor bacteriene testate. Totui extractele nsoluii tampon la pH 7 sau 8, extractele etanolice, cele n DMSO (dimetil-sulfoxid),cloroform sau aceton au inhibat tulpini de Staphylococcus aureus, Bacteroidessubtilis i Candida albicans. Zonele de inhibiie variaz ntre 7 14 mm ndiametru. Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus faecalis i grupul B de cocinu au fost inhibai de nici unul dintre extractele menionate. Extractele obinute cusolveni organici au fost slab active asupra unor tulpini de Staphylococcus aureus(3 sensibile la methicillin i 2 rezistente la acest antibiotic), Streptococcusepidermis, Clostridium spp. i Candida albicans, dar inactive asupra streptococilor,Corynebacterium xerosis i speciile Gram-negative. ntr-un alt studiu, efectuat invivo nu s-a constatat nici un fel de activitate n urina prelevat de la 3 voluntari careau consumat 500 mg de pudr de propolis, de 3 ori pe zi, timp de 3 zile.

O bun aciune antibacterian (mai ales asupra bacteriilor Gram-pozitive),antifungic (n special asupra fungilor responsabili de apariia infeciilorsuperficiale ale pielii) i antiinflamatoare (fa de modele de inflamaii acute icronice) au fost observate de DOBROWOLSKI i col., (1991) [73].

4.3. Aciunea esterilor acizilor fenolici

CAPE (esterul fenetilic al acidului cafeic) este un alt constituent alpropolisului cu aciune biologic important. GRUNBERGER i col., (1988) [74]au observat efectul CAPE asupra celulelor canceroase umane in vitro prinmsurarea gradului de incorporare a timidinei tritiate n structura DNA acaarcinoamelor umane de sn (MCF-7) i linii de celule de melonoame (SK-MEL-28, SK-MEL-170). Concentraiile de CAPE de 5 g/ml i 10 g/ml inhib iblocheaz complet incorporarea de timidin tritiat. Acelai tip de inhibiie a fost


102

Tabel nr.3Aciunea antibacterian i antifungic a propolisului

Organisme Gram-pozitiveStaphylococcus aureus - comun n infeciile localizate productoare de

puroiStreptococcus pyogenes - infecii ale gtuluiStreptococcus viridans - flora normal a tractului respirator superior ce

poate produce infecii la bolnavi cu imunodeficienStreptococcus pneumoniae - cauza comun a pneumoniilor bacterieneCorynebacterium diphteriae - produce difteria

Aciunea antifungicMicrosporum canis - viermi inelari la pisici i cini ce se transmit la omMicrosporum gzpseum - infecii al pielii capului i corpului n America de

SudPhialophora jeanselmei - urmare injectrii acest fung poate provoca moartea

esuturilor profunde din corpPiedraia hartae - fung parazit la nivelul pruluiTrichophyton mentagrophytes - atac prul, unghiile i pieleaTrichophyton rubrum - atac prul unghiile i pieleaTrichosporon cutaneum - se gsete n intestin, tractul respirator i pe piele

i poate afecta pacienii cu debiliti, rar fatal.

Propolisul n doze de 2 g/kg corp a fost bine tolerat de oareci.Conform DOBROWOLSKI i col., 1991

observat i pentru carcinoamele de colon HT29 i renale dei autorii nu prezintaceste date. Invers, liniile de celule normale, necanceroase (1434 fibroblaste imelanocite) necesit o cantitate de 50 g/ml CAPE pentru incorporarea de timidintritiat. Cu totul interesant, liniile de celule tumorale sunt mai sensibile dect liniilede celule normale la aciunea CAPE. Toate proprietile CAPE natural i sintetic aufost identice.

n 1991, SU i col.,[75] au studiat toxicitatea CAPE fa de celulelenormale transformate n celule canceroase cu adenovirusul tip 5 ce conine ofraciune de DNA genomic necaracterizat cu proprieti iniiatoare de cancer.


103

Aceast fraciune provoac activarea transcripiei genelor celulare i virale, inducesinteza DNA i mitoza celulelor difereniate. n mod clar, caracteristicile celulelortransformate par a produce cancer. Rezultatele arat c compusul CAPE inhibpreferenial sinteza DNA i creterea n celulele transformate AD5EIA, iar laconcentraii ridicate de CAPE, celulele transformate sunt ucise. Mecanismulinhibiiei competitive este necunoscut dar se crede c este legat de starea detransformare. Cnd celulele au fost transformate cu alte gene cum ar fi de exempluHa-ras oncogen i virusul papilomului bovin tip I, au fost la rndul lor inhibateselectiv. Probabil, celulele transformate au funcii ale membranelor celularealterate sau o fiziologie celular care permite activitatea CAPE.

ntr-un studiu de confirmare, GUARINI i col., (1992) [76] au determinatefectele CAPE asupra a dou linii de celule tumorale, melanomul uman HO-I iglioblastomul multiform uman GBM-18- rezultatele au fost comparate cu ale altormodulatori, mezerein (MEZ), acidul micofenolic (MPA) i acidul retinoic (RA).Mai mult, s-au studiat i combinaii ale CAPE cu aceti modulatori. Rezultatelesurprinztoare arat c n combinaie cu MEZ , CAPE prezint un foarte puternicefect antiproliferativ i a fost singurul tratament care a suprimat complet creterean linia de celule GBM-18.

4.4. Ali esteri aromatici

Derivaii sintetici ai esterilor acidului cafeic prezint la rndul lor efectesimilare cu CAPE. Cafeatul de metil (MC), fenetil cafeatul (PEC) i feniletildimetilcafeatul (PEDMC) au fost testai pe tulpini mutagenizate cu 3,2- dimetil-4-aminobifenil de Salmonella typhimurium (TA 98 i TA 100) i pe celule decarcinom de colon (HT-29) (RAO i col., 1992) [77]. S-a artat c PEC i PEDMCmai lipofili sunt mai eficieni n inhibarea creterii celulare i a sintezei de DNAdect MC, fapt ce arat c penetrarea prin membranele celulare este importantpentru activitatea esterilor acidului cafeic. Mai mult, aceti compui au redusactivitatea ornitin-decarboxilazei i a protein-tirozinkinazei, dou enzime asociatecu creterea nelimitat a noilor celule i proliferarea acestora.

Detalierea ulterioar a efectelor acestor compui, a mecanismelor, afarmacocineticii i a relaiilor structur-activitate va permite realizarea deexperimente clinice pe subieci umani.

5. Probleme legate de aplicarea extractelor de propolis i apreparatelor acestuia n terapeutica uman

Aa cum s-a vzut, unii flavonoizi sunt hidrosolubili, alii nu sunt.Solubilitatea lor depinde de starea n care se gsesc n natur: legai de zaharuri(agliconi flavonoidici) sau nu.


104

n plus, cunoscui ca antioxidani exogeni naturali (fenoli i derivaifenolici), totui flavonoizii nu se comport ca antioxidanii fenolici clasici de tipulalfa-tocoferolului ci prezint activiti moderate de rupere a catenelor (chain-breaking). Ei pot fi chain breaking donors ( fenolii i polifenolii ce formeazun radical mai stabil ce nu mai reacioneaz) sau chain breaking acceptors caresunt activi la presiuni reduse de oxigen cnd nivelul concentraiei de alkil este egalcu cel al radicalului peroxid i acioneaz ca radical scavenger, cum este cazulaminelor aromatice i din nou fenoli mascai.

Ca pentru toi antioxidanii fenolici i polifenolici activitatea lor estedeterminat de gruprile OH mascate (aceast categorie cuprinde i derivaii depirocatechol, trifenoli, tetrafenoli i n special tocoferolii i derivaii acestora caresunt cei mai importani antioxidani biologici.

Eficacitatea lor antioxidant este strns legat de numeroi factori, ntrecare foarte mult de etapa de reacie radicalic, tipul mecanismului de aciune icinetica reaciei n care sunt implicai.

n medicin, n vederea obinerii unei mai bune stabilizri a substratului, sefolosesc pe larg amestecuri de antioxidani. Eficacitatea de aciune a acestoramestecuri se datoreaz aciunii antioxidante rezultant din aciunea fiecruicomponent. Propolisul este un astfel de amestec natural de antioxidani cu aciunesinergic. Aciunea sinergic a compuilor din propolis se datoreaz de obiceiaceluiai tip de mecanism de aciune (de exemplu chain-breaking chain-breaking, sau unul diferit: chain-breaking radical scavenger).

Aciunea antioxidant a propolisului a fost demonstrat prin diferite studiiin vitro i in vivo. Aceast activitate antioxidant are ca rezultat multe efecte cliniceobinute ca urmare a aplicrii preparatelor pe baz de propolis (BASNETi col.,1996; RODRIGUEZ i col., 1997; MATSUSHIGE i col., 1996) [51 , 78, 44].

Unul dintre cele mai impresionante efecte ale propolisului este cel legat deaciunea protectoare mpotriva radiaiilor (n special radiaii gamma, dar i celempotriva radiaiilor UV KROL i col., 1990; HERMANN i BRACAMONTE,1990) [79 , 80]. Producerea de radicali liberi n organismele expuse la acesteradiaii are ca rezultat distrugerea esuturilor.

Extractele apoase de propolis utilizate au prezentat un efect inhibitorasupra creterii asociate a peroxidrii lipidelor precum i o accentuare a activitiiSOD la organismele expuse.

Studiile in vitro arat c aceleai extracte apoase de propolis prezint prinaceeai activitate antioxidant o bun protecie hepatic (RODRIGUEZ i col.,1997; BASNET i col., 1996; LIN i col., 1997; BASNET i col., 1996(2);MERINO i col., 1996; MARKHAM i col., 1996; GIURGEA i col., 1987) [78,81, 82, 83, 50, 84, 85]. Aceste extracte protejeaz mpotriva eliberrii de lactat-dehidrogenaz glutathion-dependent i mpotriva formrii de peroxizi lipidici.


105

Revenind asupra efectelor sinergice ale compuilor din propolis (CHENGi WONG, 1996) [57] trebuiesc menionate efectele antioxidante ale balsamului depropolis n inhibarea linoleatului de metil de ctre benzil-cafeat.

Flavonoizii i n acest caz propolisul s-au dovedit un excelent mijlocnatural n inhibarea puternic a xenobioticelor cum este cazul intoxicrii indusecu tetraclorur de carbon i intoxicaia alcoolic la nivelul ficatului (GIURGEA icol., 1987) [85]. Tetraclorura de carbon CCl4 produce un radical foarte toxic ifoarte reactiv CCl3 implicat n peroxidarea lipidelor sau legarea covalent cumacromoleculele eseniale la nivelul hepatocitelor.

Bioflavonoizii particip ca antioxidani la metabolizarea acestorxenobiotice prin sistemul enzimatic al oxidazelor cu funcie mixt; se tie cactivitatea enzimatic este prima int a substanelor toxice i ale derivailoracestora. Efectul de protecie este observat n special la nivelul activitilor succinatdehidrogenazei (SDH), glutamat dehidrogenazei (GDH) i citocrom oxidazei.

Efectele propolisului n afeciunile hepatice

Efectele propolisului asupra ficatului nu se datoreaz n exclusivitateaciunii sale antioxidante. Aciunea hepatoprotectoare potenial poate fi explicati printr-o scdere a nivelului glucozei sanguine i o cretere a niveluluiglicogenului.

Acizii nucleici (DNA i RNA) prezint niveluri de concentraie uormodificate. Scderea uoar a nivelului DNA la 10 zile dup administrarea deextract etanolic de propolis poate fi interpretat ca rezultat al inhibrii sintezeiproteice. Se tie c unele substane din grupa flavonoizilor inhib sinteza proteic,iar cei aparinnd grupului flavonelor i flavonolilor cu grupri HO n poziiile 3-4 i 7 sunt poteniali inhibitori ai ribonucleazelor.

Transaminazele (GOT i GPT) cele mai comune enzime verificate nanalizele de laborator, prezint niveluri variabile, creteri i descreteri, ceea cereflect fie o inhibare fie o activare a activitii lor la nivelul esutului hepatic. Oalt posibil explicaie poate fi i modificarea permeabilitii membranelor celularece favorizeaz intrarea sau eliberarea lor din celule.

Fosforilaza hepatic prezint deasemenea niveluri variabile de activitatela diferite intervale de timp: creteri la intervale de 10, 30 i 60 de zile i scderi laintervalul de 20 i respectiv 90 de zile. n acest caz, flavonoizii intr n competiiecu procesul metabolic al adrenalinei, aciune ce este sinergic cu cea a aciduluiascorbic (vitamina C). n acest caz, flavonoizii pot fi privii ca factori deeconomisire i protecie pentru adrenalin.

Glucozo-6-fosfataza este o enzim esenial dar nu specific pentrugluconeogenez. Activitatea acestei enzime reflect capacitatea esutului hepatic dea sintetiza glucoza. Urmare a administrrii de extract de propolis se observ oscdere dup 10 zile i respectiv 90 de zile i o cretere a activitii sale dup uninterval de 30 de zile de la aplicare.


106

Steatoza hepatic este rezultatul acumulrii de acizi grai la nivelulesutului hepatic ca surs de energie pentru hepatocite, datorit consumului excesivde alcool. O alt potenial cauz este eliberarea de catecholamine, care prinlipoliz periferic, genereaz producerea de acizi grai ce sunt direcionai spreficat pentru sinteza lipidelor.

Efectele propolisului asupra sngelui

Principalii parametri ce sunt studiai n testele sanguine sunt cei legai deelementele figurate: eritrocite i leucocite.

Viteza de sedimentare a eritrocitelor (VSH = ESR) prezint o puternicdescretere dup 10 zile de la administrarea extractului etanolic de propolis.

Coninutul n hemoglobin prezint o scdere dup 10 zile i apoi ocretere

propolisul si extractele propolisului

Documents