projeto fapergs - edital pqg (2013)
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Laboratrio de Gentica Molecular Humana PPG em Biologia Celular e Molecular
Aplicada Sade (PPGBioSade) Universidade Luterana do Brasil (ULBRA)
Laboratrio de Biologia Molecular Servio de Endocrinologia Hospital de Clnicas de
Porto Alegre (HCPA)
O Papel dos MicroRNAs na Patognese da Retinopatia Diabtica em
Pacientes com Diabetes Mellitus Tipo 2:
Estudo de Associao de Polimorfismos Genticos e Nveis Plasmticos
Coordenadora: Profa. Dra. Ktia Gonalves dos Santos
Pesquisadores: Lus Henrique Canani (professor), Daisy Crispim Moreira (professora),
Naiana Silvia Soares Corra (aluna de graduao IC), Renan Csar Sbruzzi (aluno de
graduao IC)
EDITAL FAPERGS n. 001/2013
PROGRAMA PESQUISADOR GACHO PqG
Junho, 2013
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SUMRIO
1. Fundamentao Terica ................................................................................................ 3
1.1. Diabetes Mellitus............................................................................................... 3
1.2. Complicaes Crnicas do Diabetes Mellitus .................................................. 4
1.3. Retinopatia Diabtica ........................................................................................ 5
1.4. MicroRNAs ....................................................................................................... 7
1.4.1. Biognese e Funo ............................................................................ 7
1.4.2. Perfil de Expresso de MicroRNAs na Retinopatia Diabtica ........... 8
1.4.3. Polimorfismos de MicroRNAs na Retinopatia Diabtica ................. 10
2. Justificativa de Pesquisa ............................................................................................... 11
3. Hipteses Conceituais ................................................................................................... 11
4. Objetivos ........................................................................................................................ 12
4.1. Objetivos Gerais ............................................................................................... 12
4.2. Objetivos Especficos ....................................................................................... 12
5. Materiais e Mtodos ..................................................................................................... 13
5.1. Populao de Estudo e Grupos Experimentais ................................................ 13
5.2. Diagnstico da Retinopatia Diabtica.............................................................. 14
5.3. Anlises Moleculares ...................................................................................... 14
5.3.1.Genotipagem (Extrao de DNA, PCR-RFLP e qPCR) ................... 14
5.3.2. Expresso Gnica (Extrao de RNA e qRT-PCR) ......................... 15
5.4. Anlises Estatsticas ........................................................................................ 15
5.5. Aspectos ticos ............................................................................................... 16
6. Cronograma do Estudo ............................................................................................... 17
7. Oramento Detalhado .................................................................................................. 18
8. Referncias Bibliogrficas ........................................................................................... 22
9. Adequao e Descrio da Equipe de Pesquisa ......................................................... 28
10. Infra-estrutura e Apoio Tcnico Disponvel ............................................................. 29
11. Resultados Esperados e Contribuies Cientficas .................................................. 30
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1. FUNDAMENTAO TERICA
1.1. Diabetes Mellitus
O diabetes mellitus (DM) uma sndrome metablica caracterizada por hiperglicemia
resultante de defeitos na secreo e/ou na ao da insulina. A hiperglicemia crnica no DM
est associada disfuno e falncia, a longo prazo, de mltiplos rgos, afetando
principalmente os olhos, rins e corao (American Diabetes Association, 2013; Trisha
Dunning, 2013). O DM pode ser etiologicamente classificado em quatro categorias, que so:
DM tipo 1 (DM1), DM tipo 2 (DM2), outros tipos de DM e DM gestacional. Apesar de
apresentarem etiologias distintas, os quatro tipos de DM tm como alterao em comum a
incapacidade de manter a homeostase glicmica (American Diabetes Association, 2013).
O DM2 corresponde a 80-90% dos casos de DM e ocorre principalmente em adultos
aps os quarenta anos de idade. Os pacientes com DM2 apresentam diferentes graus de
deficincia insulnica, variando desde uma pequena intolerncia glicose at a forma
insulinopnica similar ao DM1, que requer tratamento com insulina exgena (American
Diabetes Association, 2013). A hiperglicemia crnica observada nos pacientes com DM2
resultante dos efeitos combinados da resistncia ao da insulina (que pode preceder o
incio do quadro clnico) e de uma deficincia das clulas beta em compensar para a elevada
demanda de insulina (que se acentua com o decorrer dos anos de evoluo da doena). Um
terceiro fator agravante, sempre associado, o aumento da produo heptica de glicose
decorrente das duas primeiras alteraes (DeFronzo, 2004). A obesidade, o sedentarismo, a
hipertenso, a dislipidemia, a idade avanada, a histria familiar de DM e o DM gestacional
prvio so alguns dos principais fatores de risco para o desenvolvimento de DM2 (Oliveira,
2004; Murea et al., 2012; American Diabetes Association, 2013).
O DM2 constitui um grave problema de sade pblica em razo de sua elevada
prevalncia, acentuada morbidade e mortalidade e das repercusses econmicas e sociais
decorrentes do impacto das complicaes vasculares, que comprometem a qualidade de vida
e a produtividade dos indivduos afetados, alm dos elevados custos do seu tratamento
(Oliveira, 2004). Anlises globais estimaram uma prevalncia mundial de diabetes de 6,4%
em 2010. Entre 2010 e 2030, estima-se que haja um aumento de 69% no nmero de adultos
com diabetes nos pases em desenvolvimento. Entre os fatores que explicariam essa
prevalncia crescente esto o aumento da populao mais idosa (como consequncia da maior
expectativa de vida da populao) e as mudanas no estilo de vida (Shaw et al., 2010).
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1.2. Complicaes Crnicas do Diabetes Mellitus
No incio do DM2, os indivduos podem apresentar nveis de insulina prximos ou at
mesmo mais elevados do que os nveis de um indivduo normoglicmico. Com o passar do
tempo, as clulas beta entram em exausto e cessam a produo de insulina (DeFronzo, 2004;
American Diabetes Association, 2013). Como a hiperglicemia geralmente se desenvolve de
forma gradual, o DM2 frequentemente assintomtico em seus estgios iniciais. Assim, o
paciente pode permanecer sem diagnstico por vrios anos. No entanto, medida que se
desenvolve, a hiperglicemia crnica provoca danos em diversos rgos, levando ao
desenvolvimento de complicaes vasculares crnicas que muitas vezes so detectadas no
momento do diagnstico do DM2 (DeFronzo, 2004; Oliveira, 2004). As complicaes micro-
e macroangiopticas so as causas mais comuns de morbidade e mortalidade nos pacientes
com DM (Forbes e Cooper, 2013).
Quanto s complicaes microvasculares, os rgos afetados so aqueles que no
dependem de insulina para a absoro da glicose. De acordo com a intensidade e o tempo de
exposio hiperglicemia, ocorrem leses estruturais no endotlio de pequenos vasos
sanguneos, provocando alteraes funcionais de vrios rgos e tecidos. Morfologicamente,
estas alteraes se caracterizam pela constrio progressiva dos vasos sanguneos, pelo
espessamento da membrana basal dos capilares e pelo aumento da permeabilidade s
protenas plasmticas (Roy et al., 2010). Clinicamente, os maiores problemas so a
retinopatia (DM a causa no-traumtica mais frequente de cegueira em adultos), a
nefropatia (DM a principal causa de falncia e transplante renal) e a neuropatia (DM a
principal causa de amputao dos membros inferiores nos pases em desenvolvimento)
(Forbes e Cooper, 2013).
A hiperglicemia induz a disfuno endotelial por meio de efeitos txicos diretos e
tambm indiretamente pela perturbao de rotas de sinalizao intracelular inter-relacionadas
(via do poliol, via da hexosaminase, formao dos produtos finais de glicao avanada e
ativao de isoformas da protena cinase C) (Giacco e Brownlee, 2010; Chistiakov, 2011;
Murea et al., 2012; Ola et al., 2012). Essas alteraes resultam na amplificao dos fatores
endoteliais que promovem a proliferao celular e a inflamao (Murea et al., 2012). Apesar
disso, as bases moleculares e celulares da fisiopatologia das complicaes vasculares do DM
so muito mais complexas e existem vrias outras rotas bioqumicas implicadas (Forbes e
Cooper, 2013).
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Recentemente, vrios estudos tm identificado uma classe de RNAs no-codificantes
com funes regulatrias, conhecidos como microRNAs (miRNAs ou miRs), que controlam
aproximadamente 60% dos genes codificadores de protenas em humanos (Bartel, 2009). As
evidncias mostram que os microRNAs podem exercer um papel essencial na patognese do
diabetes e suas complicaes crnicas por meio de sua capacidade de regular os nveis de
expresso dos genes que atuam na diferenciao, crescimento e proliferao celular, assim
como na apoptose (Kantharidis et al., 2011; Lorenzen et al., 2012; Natarajan et al., 2012;
Shantikumar et al., 2012), como ser visto na seo 1.4.
1.3. Retinopatia Diabtica
A retinopatia diabtica (RD) uma complicao crnica do diabetes, que ocorre em
mais de 60% dos pacientes com DM2. A RD constitui a principal causa no-traumtica de
novos casos de cegueira, em adultos de 20 a 74 anos de idade, nos pases ocidentais
(Chistiakov, 2011; Sivaprasad et al., 2012). Um estudo realizado pelo nosso grupo de
pesquisa com pacientes com DM2 atendidos nos ambulatrios de trs centros mdicos
gachos verificou que a frequncia de RD foi de 48%, sendo que 15% apresentavam RD
proliferativa. Essa complicao tambm estava presente em uma proporo considervel de
pacientes com tempo de DM inferior a 5 anos (27%) (Scheffel et al., 2004).
A RD se caracteriza por alteraes gradualmente progressivas na microvasculatura da
retina que, ao atingirem sua forma mais grave, podem resultar na perda irreversvel da viso
(Chistiakov, 2011). Alm disso, a RD tambm est associada com um aumento no risco de
doena cardiovascular (Kawasaki et al., 2011; Kramer et al., 2011) e com a mortalidade por
todas as causas (Kramer et al., 2011) nos pacientes com diabetes.A RD pode ser classificada
em diferentes estgios de acordo a gravidade das alteraes na vasculatura retiniana (Agardh
e Agardh, 2004; Chistiakov, 2011). A classificao mais simples e comumente utilizada na
literatura agrupa a RD em trs categorias: ausente, no-proliferativa (presena de
microaneurismas, hemorragias retinianas, edema retiniano e exsudatos duros) e proliferativa
(neovascularizao no disco ptico ou em outras regies) (Wilkinson et al., 2003; Kollias e
Ulbig, 2010; Chistiakov, 2011).
O capilar retiniano formado pelas clulas endoteliais, pelas clulas intramurais (ou
pericitos) e pela membrana basal (Agardh e Agardh, 2004). Na etapa inicial da RD, ocorre a
degenerao seletiva dos pericitos e o espessamento da membrana basal, resultando na
formao de capilares acelulares e no enfraquecimento da parede vascular.
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Consequentemente, as clulas endoteliais proliferam-se, levando formao de capilares
dilatados (microaneurismas). Com o subsequente desequilbrio na autorregulao do fluxo
sanguneo ocorre um aumento da presso hidrosttica nos capilares retinianos, levando ao
rompimento da barreira hematorretiniana. Com isso, aumenta a permeabilidade vascular, que
resulta em hemorragias retinianas e no acmulo extracelular de fluidos, lipdios e
lipoprotenas (que so clinicamente denominados de exsudatos duros). A ocluso dos
capilares, causada pelo espessamento da membrana basal, pela agregao plaquetria, pela
ativao de leuccitos e/ou migrao das clulas gliais atravs das paredes vasculares, resulta
em reas de no-perfuso e hipxia, com a subsequente dilatao dos capilares pr-existentes
ou formao de vasos em forma de colar. A ocluso dos capilares tambm resulta em
anormalidades microvasculares intrarretinianas e no extravasamento generalizado de fluidos.
As reas de no-perfuso estimulam o crescimento de novos vasos que se formam na
superfcie da retina, no disco ptico ou em outras regies. Por serem anmalos e frgeis, estes
neovasos so propensos a extensas hemorragias. A neovascularizao pode permanecer
estvel e sofrer regresso espontnea, ao passo que, em alguns casos, ocorre uma rpida
progresso que confere um elevado risco para a subsequente perda visual. Alm disso, o
tecido conjuntivo que se forma ao redor dos neovasos pode contrair, levando trao e ao
descolamento da retina. Assim, as hemorragias, o descolamento da retina e o tecido fibroso
residual contribuem para a perda irreversvel da viso (Agardh e Agardh, 2004; Kollias e
Ulbig, 2010; Antonetti et al., 2012).
Alm disso, em qualquer estgio da RD, os pacientes com DM podem tambm
desenvolver edema macular, que envolve o espessamento da retina na regio macular. O
edema ocorre aps o rompimento da barreira hematorretiniana como consequncia do
extravasamento de fluidos dos capilares e microaneurismas (Kollias e Ulbig, 2010;
Chistiakov, 2011). Indivduos com retinopatia moderada a grave podem ter sensibilidade e
acuidade visual prejudicada causando dificuldade para ler, dirigir e realizar outras atividades
do dia a dia (Antonetti et al., 2012).
Os principais fatores de risco para o desenvolvimento e a progresso da RD so o mau
controle glicmico, o tempo de durao do DM e a hipertenso (Kollias e Ulbig, 2010; Ding e
Wong, 2012). Porm, reconhecido que a RD uma doena multifatorial, com o
envolvimento de fatores genticos (Abhary et al., 2009; Liew et al., 2009; Ng, 2010). Estudos
familiares e ensaios clnicos tm demonstrado que a etnia um fator de risco independente
para essa complicao. A prevalncia e a gravidade da RD so maiores nos afro-americanos,
hispnicos e sul-asiticos do que nas populaes caucasianas. Essa diferena no pode ser
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atribuda exclusivamente alta frequncia do DM ou dos fatores de risco para a RD nessas
populaes (Cheung et al., 2010; Ding e Wong, 2012).
Alm disso, vrios estudos observaram que ocorre uma agregao familiar de casos de
RD em diferentes grupos tnicos. Ainda, existem pacientes que no desenvolvem RD, a
despeito de um controle glicmico deficiente, ao passo que outros desenvolvem complicaes
crnicas apesar de controlarem a glicemia de forma adequada (Liew et al., 2009; Ng, 2010;
Murea et al., 2012). Neste contexto, inmeros estudos tm sido realizados com o intuito de
identificar os genes que conferem suscetibilidade RD, principalmente por meio dos estudos
de associao do tipo caso-controle, em diferentes populaes. Os potenciais genes
candidatos para essa complicao incluem os genes que codificam produtos envolvidos no
metabolismo da glicose e na funo endotelial. Porm, at o momento, poucos estudos tm
demonstrado uma associao significativa entre um gene candidato e a ocorrncia ou a
gravidade da RD (Abhary et al., 2009; Liew et al., 2009; Ng, 2010).
1.4. MicroRNAs
1.4.1. Biognese e Funo
Os microRNAs (miRNAs ou miRs) so pequenos RNAs endgenos (com
aproximadamente 20-22 nucleotdeos), no-codificantes, que regulam a expresso gnica ao
nvel ps-transcricional pela degradao ou inibio dos seus genes-alvo. A variao
significativa no grau de complementariedade das sequncias permite que um nico
microRNA atinja vrios mRNAs, regulando mltiplos genes, enquanto cada mRNA pode ser
regulado por vrios microRNAs (Kim, 2005; Filipowicz et al., 2008). Em 2007, mais de
1.500 microRNAs j tinham sido descritos (Beuvink et al., 2007). Os estudos sobre os
microRNAs predominam na Oncologia (Srivastava e Srivastava, 2012; Baer et al., 2013),
enquanto seu padro de expresso em outras doenas, especialmente no diabetes e suas
complicaes crnicas, comearam a ser objeto de investigao apenas recentemente
(Kantharidis et al., 2011; Lorenzen et al., 2012; Natarajan et al., 2012).
Os microRNAs so transcritos primeiramente pela RNA polimerase II em transcritos
primrios (pri-miRs) no ncleo. Os pri-miRs so relativamente longos e podem conter uma
ou mais estruturas em forma de grampo. Um complexo formado por uma ribonuclease
(Drosha) associada protena DGCR8 processa o pri-miR em pr-miR (precursor), que
possui uma estrutura secundria em forma de grampo deaproximadamente 70 nucleotdeos.
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Posteriormente, esse pr-miR exportado para ocitoplasma, atravs da exportina-5, onde
reconhecido e clivado pela ribonuclease Dicer e seus cofatores, gerando a molcula madura
de microRNA, composta de cerca de 22 nucleotdeos. Aps, a protena argonauta, da famlia
das endonucleases, interage para formar o complexo de silenciamento induzido por RNA
(RISC), essencial para direcionar o microRNA at o mRNA-alvo. O reconhecimento do alvo
pelo microRNA ocorre na regio 3' do mRNA-alvo, devido complementariedade com a
sequncia seed presente na regio 5 do microRNA. Dependendo do grau de
complementariedade, o mRNA-alvo clivado ou sua traduo inibida, ou ainda,
direcionado para a degradao nos corpsculos P (Kim, 2005; Filipowicz et al., 2008).
Considerando que os miRNAs podem modular processos fisiolgicos e a
patofisiologia de diversas doenas, reconhecido que existe a necessidade de identificar os
microRNAs (e seus alvos) associados com as complicaes do diabetes, pois isto propiciaria
a identificao de novos biomarcadores e alvos teraputicos (Kantharidis et al., 2011;
Lorenzen et al., 2012; Natarajan et al., 2012; Shantikumar et al., 2012; Guay e Regazzi,
2013). Alm da sua funo intracelular, estudos recentes demonstraram que os microRNAs
podem ser exportados ou liberados pelas clulas na circulao em uma forma estvel. A
descoberta dos microRNAs circulantes sugeriu a possibilidade intrigante de utilizao dos
padres de expresso destas molculas como biomarcadores, avaliados de forma no-
invasiva, para a deteco precoce das complicaes diabticas, o que poderia auxiliar no
manejo clnico dos desfechos de longo prazo (Lorenzen et al., 2012; Natarajan et al., 2012;
Shantikumar et al., 2012; Guay e Regazzi, 2013).
1.4.2.Perfil de Expresso de MicroRNAs na Retinopatia Diabtica
Estudos recentes tm mostrado o papel dos microRNAs no desenvolvimento do
diabetes, nefropatia diabtica e doenas cardiovasculares (Kantharidis et al., 2011; Lorenzen
et al., 2012; Natarajan et al., 2012). Um estudo prospectivo com 800 pacientes diabticos do
tipo 2 identificou uma assinatura capaz de predizer o diabetes, baseada em 10 microRNAs
plasmticos, incluindo uma reduo nos nveis do miR-126 (Zampetaki et al., 2010). Porm,
somente nos ltimos trs anos os microRNAs passaram a ser objeto de investigao no que
diz respeito aoseu envolvimento na patognese da RD, como pode ser visualizado a seguir.
Em 2011, McArthur e colaboradores analisaram o perfil de expresso de microRNAs
na retina de ratos com diabetes induzido por estreptozotocina. Os pesquisadores avaliaram os
nveis de RNAm e de protena nas clulas endoteliais dos grandes vasos e nos capilares
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retinianos, com ou sem injeo de um mimtico ou de um antagonista do miR-200b. O miR-
200b foi hipoexpresso na retina de ratos diabticos e nas clulas endoteliais incubadas em
glicose. A transfeco das clulas endoteliais e a injeo dentro do vtreo do mimtico do
miR-200b preveniu o aumento nos nveis do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF)
e tambm a permeabilidade e a angiognese. Da mesma forma, a transfeco das clulas com
o antagomir levou ao aumento na produo de VEGF. Um estudo recente realizado em
camundongos Akita (um modelo gentico de diabetes tipo 1) mostrou que o miR-200b estava
hiperexpresso na retina destes animais (Murray et al., 2013). Nesse mesmo estudo, a
transfeco de clulas de Mller humanas com um inibidor do miR-200b atenuou o estresse
oxidativo e a apoptose. Da mesma forma, a transfeco celular com um mimtico do miR-
200b aumentou o nmero de clulas que entraram em apoptose.
Em outro estudo de 2011, Kovacs e colaboradores avaliaram o perfil de expresso de
microRNAs na retina e clulas endoteliais retinianas em ratos com diabetes induzido por
estreptozotocina, trs meses aps o desenvolvimento do diabetes. Aproximadamente
100microRNAs foram diferencialmente expressos nos ratos diabticos e controles. Entre eles,
o miR-146, miR-155, miR-132 e miR-21estavamhiperexpressos nas clulas endoteliais dos
ratos diabticos. Devido retroalimentao negativa do miR-146 na ativao do fator nuclear
kappa B (NF-kB) nas clulas endoteliais, os autores sugeriram que o miR-146 poderia servir
como um potencial alvo teraputico para a RD por meio da inibio do NF-kB.Por outro
lado, em outro estudo (Feng et al., 2011), observou-se que a expresso do miR-146a estava
diminuda na retina e nas clulas endoteliais de animais com diabetes tipo 1 e 2 (ratos com
diabetes induzido por estreptozotocina e camundongos db/db, respectivamente).O ensaio
funcional de transfeco com um mimtico e com um antagonista do miR-146a mostrou que
a diminuio dos nveis deste microRNA provocam o aumento na expresso de fibronectina,
o que pode contribuir para a hipertrofia e fibrose.
Alm destes estudos, Silva e co-autores (2011) demonstraram que o miR-29b estava
hiperexpresso cerca de 30 dias aps a induo de diabetes por estreptozotocina na retina de
ratos diabticos em comparao aos controles. O resultado obtido pelos pesquisadores sugere
que o aumento na expresso do miR-29 nos estgios iniciais do diabetes pode ter um efeito
protetor contra a apoptose das clulas retinianas. Em um modelo de neovascularizao
retiniana induzida por isquemia em camundongos, Bai e colaboradores (2011) avaliaram o
efeito do miR-126 neste processo. Os autores observaram que os nveis do miR-126 estavam
diminudos na retina dos camundongos com retinopatia induzida por oxignio e que a
restaurao do miR-126 (por injeo intra-vtreo) superou os nveis aumentados de VEGF,
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assim como reduziu a neovascularizao retiniana neste modelo de retinopatia induzida.
No ano passado, Wu e colaboradores (2012) avaliaram o perfil de expresso de
microRNAs na RD em ratos com diabetes induzido por estreptozotocina. Os resultados
demonstraram que 11 microRNAs estavam hiperexpressos, enquanto 6 microRNAs
estavamacentuadamente hipoexpressos nos ratos com RD. Os nveis do miR-182, miR-96,
miR-183, miR-211, miR-204 e miR-124 estavam aumentados durante o progresso da RD, ao
passo que os nveis do miR-10b, miR-10a, miR-219-2-3p, miR-144, miR-338 e miR-199a-3p
estavam diminudos. Porm, at o momento, nenhum estudo avaliou o perfil de expresso de
microRNAs na RD em humanos.
1.4.3.Polimorfismos de MicroRNAs na Retinopatia Diabtica
A maior parte dos estudos de associao gentica tm avaliado a ocorrncia de
polimorfismos nas regies codificadoras dos genes. Porm, as evidncias sugerem que
polimorfismos nas regies no-codificadoras, incluindo o promotor, os acentuadores e as
regies seed dos microRNAs, podem ter um efeito significativo na patognese de diversas
doenas (Natarajan et al., 2012). Considerando que os microRNAs podem afetar a expresso
gnica por almejar a regio 3-UTR dos genes-alvo, qualquer variao de sequncia presente
prximo aos stios de processamento de microRNA ou na sequncia seed do microRNA
maduro poderia alterar a biognese assim como suas funes e seus genes alvo, alterando o
perfil de expresso destes genes (Sun et al., 2009; Bruno et al., 2012). Essa modificao, por
sua vez, poderia afetar a suscetibilidade doena, como tem sido demonstrado para a doena
de Parkinson, asma, doena cardiovascular e vrios tipos de cncer, entre outros. Por essa
razo, foi reconhecido que mais ateno deveria ser dada aos polimorfismos nos genes
codificadores dos microRNAs (Mishra e Bertino, 2009; Bruno et al., 2012).
Porm, at o momento, apenas um estudo de caso-controle investigou a ocorrncia de
variantes genticas em genes de microRNAs em pacientes diabticos (Ciccacci et al., 2013).
Estes pesquisadores avaliaram 13 locos diferentes em 163 italianos com DM2 e 185
indivduos saudveis. Os dados mostraram que dois polimorfismos estavam associados com a
suscetibilidade ao DM2. O alelo G do polimorfismo rs895819 (A>G) no gene do miR-27a
estava associado reduo no risco, enquanto o alelo G do polimorfismo rs531564 (C>G) do
gene do miR-124a estava associado ao risco aumentado de DM2. No entanto, com relao
RD, nenhum estudo investigou a relao de polimorfismos nos genes codificadores dos
microRNAs com esta complicao.
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2. JUSTIFICATIVA DE PESQUISA
Como descrito nas sees anteriores, o DM e suas complicaes crnicas
representam, atualmente, uma questo de sade pblica de grande impacto ao nvel mundial,
devido aos elevados custos e crescente prevalncia.Evidncias recentes e cada vez mais
numerosas mostram que os microRNAs podem exercer um papel essencial na patognese do
diabetes e suas complicaes crnicas por meio de sua capacidade de regular os nveis de
expresso dos genes que atuam na diferenciao, crescimento e proliferao celular, assim
como na apoptose. Apesar disso, at o momento, poucos estudos investigaram o perfil de
expresso de microRNAs na RD, sendo que todos foram realizados em modelos animais.
Alm disso, diversos investigadores avaliaram a possibilidade de utilizar a
mensurao plasmtica de microRNAs como biomarcadores de patologias especficas,
fornecendo uma alternativa anlise tecidual (obtida por mtodo invasivo) e servindo para
fins diagnsticos e/ou prognsticos. Outro aspecto importante a demonstrao de que
polimorfismos presentes prximos aos stios de processamento do microRNA ou na
sequncia seed do microRNA maduro podem alterar a biognese ou a sua funo, alterando
o perfil de expresso destes genes o que, por sua vez, poderia afetar a suscetibilidade
doena, como tem sido demonstrado para as doenas cardiovasculares e vrios tipos de
cncer, entre outros.
At o momento, nenhum estudo em humanos se props a avaliar os polimorfismos
nos genes codificadores de microRNAs e sua expresso na suscetibilidade RD. No presente
estudo, avaliaremos a ocorrncia de trs polimorfismos eo perfil de expresso de cinco
microRNAs plasmticos, em pacientes diabticos do tipo 2, com ou sem RD. Assim, os
resultados do presente estudo permitiro uma melhor compreenso dos mecanismos
regulatrios e do impacto dos microRNAs na patognese da RD, alm de possibilitar o
auxlio na identificao do paciente suscetvel a esta complicao e potencial proposio de
estratgias de tratamento especficas para o manejo da RD.
3. HIPTESES CONCEITUAIS
H1. O perfil de expresso de microRNAs plasmticos est alterado nos pacientes com
RD, particularmente naqueles com a forma proliferativa da doena, em relao aos pacientes
sem esta complicao, potencialmente servindo como biomarcadores no-invasivos para fins
diagnsticos e prognsticos.
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H2. Os nveis de expresso dos microRNAs esto associados aos polimorfismos nos
genes que codificam estes microRNAs.
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo Geral
O presente estudo de caso-controle tem por finalidade avaliar a associao de trs
polimorfismos em genes codificadores de microRNAs e do perfil de expresso de cinco
microRNAs plasmticos com a RD em pacientes ambulatoriais com DM2.
4.2. Objetivos Especficos
Subprojeto 1
1. Determinar as frequncias gnicas e genotpicas de trs polimorfismos em genes
codificadores de microRNAs em pacientes ambulatoriais com DM2 e comparar com a
prevalncia destes polimorfismos em um grupo de indivduos da populao em geral, a saber:
rs531564 (miR-124a), rs4636297 (miR-126) e rs2910164 (miR-146a).
2. Avaliar a associao dos trs polimorfismos acima mencionados com a presena e a
gravidade da RD nos pacientes com DM2.
Subprojeto 2
3. Mensurar o nvel de expresso de cinco microRNAs no plasma de pacientes
ambulatoriais com DM2 e verificar se os nveis de expresso esto associados com a presena
e a gravidade da RD, a saber: miR-29b, miR-124a, miR-126, miR-146a e miR-200b.
4. Avaliar a relao dos polimorfismos rs531564 (miR-124a), rs4636297 (miR-126) e
rs2910164 (miR-146a) com os nveis plasmticos dos respectivos microRNAs nos pacientes
com DM2.
-
13
5. MATERIAIS E MTODOS
5.1. Populao de Estudo e Grupos Experimentais
Este estudo ser realizado na Universidade Luterana do Brasil (ULBRA) e no
Hospital de Clnicas de Porto Alegre (HCPA) com pacientes ambulatoriais com diagnstico
de DM2 e indivduos saudveis da populao em geral, arrolados entre os doadores de banco
de sangue.
Para contemplar os objetivos especficos do Subprojeto 1, sero elegveis para o
estudo os pacientes com DM2 atendidos nos ambulatrios dos Servios de Endocrinologia
dos seguintes hospitais: Hospital de Clnicas de Porto Alegre (HCPA), Grupo Hospitalar
Conceio (Porto Alegre/RS), Hospital So Vicente de Paulo (Passo Fundo/RS) e Fundao
Universitria de Rio Grande (Rio Grande/RS). Sero selecionados 800 indivduos a partir de
um banco de dados de aproximadamente 2500 pacientes com DM2, que so participantes de
um estudo multicntrico que teve incio em 2002 no Estado do Rio Grande do Sul. Este
estudo tem por objetivo investigar os fatores de risco genticos associados com a
predisposio ao DM e suas complicaes crnicas (Canani et al., 2005; Santos et al., 2005;
Santos et al., 2006; Errera et al., 2007; Crispim et al., 2010; Santos et al., 2011; Santos et al.,
2012).
Os pacientes com DM2 sero classificados em casos (n=400) ou controles (n=400), de
acordo com a presena ou ausncia de RD. Os controles devem ter, no mnimo, 10 anos de
DM para serem includos no estudo. Os pacientes avaliados neste estudo realizaram exames
clnicos, laboratoriais e uma entrevista (por meio de questionrio padronizado), para o
registro da histria clnica, incluindo o tabagismo, uso de medicamento e presena de
comorbidades. Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento informado, cujo
protocolo foi aprovado pelos comits de tica de todas as instituies envolvidas e pelo
CONEP (processo n 25000.001632/2003-72, parecer 258/2003).
Alm disso, tambm sero includos neste estudo, 100 indivduos doadores de banco
de sangue do HCPA, sem histria pessoal ou familiar de DM, avaliados por meio de uma
entrevista com questionrio padronizado, que constituiro uma amostra que servir como
referncia da distribuio dos trs polimorfismos na populao em geral.
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14
Para contemplar os objetivos especficos do Subprojeto 2, sero selecionados 100
pacientes sem RD (com pelo menos 10 anos de diabetes), 50 pacientes com RD no-
proliferativa e 50 pacientes com RD proliferativa, todos provenientes do ambulatrio do
Servio de Endocrinologia do HCPA. Os pacientes sero selecionados durante os turnos de
atendimento ambulatorial e atendero aos mesmos critrios de incluso dos pacientes
includos no Subprojeto 1. Aps a identificao dos pacientes que atenderem aos critrios de
incluso, ser aplicado o consentimento informado para aqueles que aceitarem participar do
estudo e ser coletada uma amostra de sangue (10 mL). A amostra ser processada e
armazenada para as anlises moleculares.
5.2. Diagnstico da Retinopatia Diabtica
A presena de RD avaliada por meio da fundoscopia direta aps dilatao pupilar, e
classificada,considerando o olho mais gravemente afetado,como: (1) ausente; (2) RD no-
proliferativa (microaneurismas, hemorragia, exsudatos duros); ou (3) RD proliferativa
(presena de neovasos e/ou tecido fibroso na cavidade vtrea) (Wilkinson et al., 2003).
5.3. Anlises Moleculares
5.3.1. Genotipagem (Extrao de DNA, PCR-RFLP e qPCR)
O DNA ser extrado de leuccitos do sangue perifrico por um mtodo de salting out
(Lahiri e Nurnberger Jr., 1991). A genotipagem ser realizada por meio da tcnica de PCR-
RFLP ou por PCR em tempo real. Para a genotipagem do polimorfismo rs2910164 (miR-
146a), as amostras de DNA sero amplificadas por PCR, utilizando-se primers e condies
de amplificao especficos para esta variante, como descrito por Rah et al. (2013). Aps a
confirmao da amplificao, os produtos de PCR sero submetidos digesto com a
endonuclease de restrio SacI, segundo as instrues do fabricante. Os produtos da digesto
sero separados por eletroforese em gel de poliacrilamida 8%, corados com brometo de
etdeo e diretamente visualizados sob luz ultravioleta. Os polimorfismosrs531564 (miR-124a)
e rs4636297 (miR-126) sero identificados por meio de PCR em tempo real, utilizando-se
primers e sondas contidos em ensaios comerciais de discriminao allica especficos para
a genotipagem destas variantes (TaqMan, Life Technologies, Carlsbad, EUA).
-
15
5.3.2. Expresso Gnica (Extrao de RNA e qRT-PCR)
Para a extrao dos microRNAs do plasma ser utilizado o kit comercial miRvana
PARIS (Ambion), conforme as orientaes do fabricante. Na etapa inicial do protocolo sero
adicionados 50pM de um microRNA sinttico, proveniente do nematdeo Caenorhabditis
elegans (cel-miR-39) (Qiagen), que ser utilizado posteriormente como normalizador da
reaode transcrio reversa seguida pela reao em cadeia da polimerase quantitativa (qRT-
PCR). A reao de converso dos microRNAs em cDNA ser feita utilizando-se o kit
TaqManmicroRNA Reverse Transcription (Life Technologies) com primers especficos
para cada microRNA. Para o PCR em tempo real ser utilizado o ensaio comercial TaqMan
microRNAassay (Life Technologies), que contm sondas especficas para cada microRNA a
ser estudado. Como no h um consenso na literatura sobre um microRNA que seja o
normalizador ideal para a anlise da expresso gnica de microRNAs no plasma, utilizaremos
o cel-miR-39 como controle endgeno da reao de qRT-PCR. O nvel relativo de expresso
ser calculado a partir da seguinte equao: expresso gnica relativa = 2 (Ct amostra
Ct controle).
5.4. Anlises Estatsticas
As comparaes entre os grupos de indivduos sero feitas por meio de testes
paramtricos e no-paramtricos no pacote estatstico SPSS (verso 18.0). As freqncias
allicas sero determinadas pela contagem direta dos alelos e o equilbrio de Hardy-Weinberg
ser verificado por meio do teste de qui-quadrado. As diferenas nas distribuies gnicas e
genotpicas entre os grupos de indivduos sero avaliadas por meio do teste de qui-quadrado
ou do teste exato de Fisher. As diferenas nos nveis de expresso entre os grupos de
pacientes sero comparadas pelo teste t de Student ou pelo teste de Mann-Whitney. A anlise
de regresso logstica ser realizada para avaliar a relao de cada varivel com a presena
e/ou a gravidade da RD, para controlar o efeito dos diversos fatores de confuso, bem como
para identificar possveis fatores de interao entre as variveis. Um valor de p < 0,05 ser
considerado como estatisticamente significativo.
-
16
5.6. Aspectos ticos
Para contemplar os objetivos especficos do Subprojeto 1, sero utilizadas as
informaes constantes do banco de dados e as amostras de DNA j coletadas no estudo
transversal multicntrico que teve incio em 2002. Foi explicado, durante a apresentao do
termo de consentimento informado aos pacientes, que as informaes clnicas e a coleta de
sangue para a extrao de DNA seriam utilizadas para a anlise clnica e gentica de novos
polimorfismos analisados pelo nosso grupo de pesquisa, desde que aprovados por uma
comisso de tica. Para executar o Subprojeto 2, o projeto de pesquisa ser submetido ao
Comit de tica em Pesquisa do HCPA e da ULBRA e somente ter incio aps a avaliao e
aprovao pelos mesmos.
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6. CRONOGRAMA DO ESTUDO
Atividades Previstas 01/2014-
06/2014
07/2014-
12/2014
01/2015-
06/2015
07/2015-
12/2015
Seleo dos pacientes e dos doadores de banco de
sangue
X
Coleta de dados e/ou de amostras X
Genotipagem (extrao de DNA, PCR-RFLP e
PCR em tempo real)
X X X
Mensurao da expresso gnica (extrao de
RNA e qRT-PCR)
X X X X
Atualizao do banco de dados e anlise dos
dados
X X
Redao do(s) artigo(s) cientfico(s) X
Atividades Previstas Valor em R$
(% Total)
01/2014-
06/2014
07/2014-
12/2014
01/2015-
06/2015
07/2015-
12/2015
Seleo dos pacientes e dos doadores
de banco de sangue
0,00
-
0,00
Coleta de dados e/ou de amostras 0,00
0,00
Genotipagem (extrao de DNA,
PCR-RFLP e PCR em tempo real)
8.666,78
(19,7%)
2.566,78 4.300,00 1.800,00
Mensurao da expresso gnica
(extrao de RNA e qRT-PCR)
35.351,83
(80,3%)
18.809,73 6.616,84 6.616,84 3.308,42
Atualizao do banco de dados e
anlise dos dados
0,00
0,00 0,00
Redao do(s) artigo(s) cientfico(s) 0,00 0,00
Total 44.018,61
(100%)
21.736,51
(48,6%)
10.916,84
(24,8%)
8.416,84
(19,1%)
3.308,42
(7,5%)
-
18
7. ORAMENTO DETALHADO
Material de Consumo - Item Valor
Unitrio
(R$)
Quantidade Valor
Total
(R$)
rgo de
Fomento
Coleta de Material e Exames
Coleta de sangue 5,00 200 1.000,00 FIPE
Materiais Plsticos Diversos
Tubos cnicos para centrfuga (15
mL) (100 unidades)
32,19 2 64,38 FIPE
Ponteira azul sem filtro P1000 (1000
unidades)
54,52 1 54,52
FIPE
Ponteira amarela sem filtro P200
(1000 unidades)
48,50 20 970,00 FIPE
Ponteira sem filtro P10 (1000
unidades)
50,62 5 253,10 FIPE
Ponteira azul com filtro P1000 (1000
unidades)
216,62 5 1.083,10 FIPE
Ponteira amarela com filtro P200
(1000 unidades)
207,35 1 207,35 FIPE
Ponteira com filtro P100 (1000
unidades)
217,85 1 217,85 FIPE
Ponteira com filtro P10 (1000
unidades)
207,35 1 207,35 FIPE
Microtubos 2 mL (500 unidades) 47,00 2 94,00 FIPE
Microtubos 1,5 mL (500 unidades) 46,15 1 46,15 FIPE
Microtubos para PCR 0,6 mL (1000
unidades)
83,50 3 250,50 FIPE
Microtubos para PCR 0,2 mL (1000
unidades)
155,60 2 311,20 FIPE
-
19
Reagentes para Extrao de DNA
Tris-HCl (250g) 188,00 1 188,00 FIPE
Cloreto de potssio (500g) 33,57 1 33,57 FIPE
Cloreto de magnsio (500g) 59,99 1 59,99 FIPE
EDTA (500g) 595,10 1 595,00 FIPE
SDS (100g) 258,00 1 258,00 FIPE
Etanol absoluto (1L) 68,50 1 68,50 FIPE
Reagentes para PCR-RFLP
Oligonucleotdeos (bases) 1,70 48 81,60 FAPERGS
Mix de dNTPs (2 mM) (5 x 1mL) 549,25 1 549,25 FAPERGS
Taq DNA polimerase (500U) 240,19 3 720,57 FAPERGS
Enzima de restrio SacI (2000U) 405,12 3 1.215,36 FAPERGS
Reagentes para eletroforese
Agarose (500g) 234,25 1 234,25 ***
Acrilamida (500g) 102,27 1 102,27 ***
Bis-acrilamida (10g) 25,96 1 25,96 ***
TEMED (30 mL) 141,00 1 141,00 ***
Persulfato de amnio (100g) 502,00 1 502,00 ***
Tris (1 kg) 239,06 1 239,06 ***
cido brico (1 kg) 85,26 1 85,26 ***
EDTA (500g) 181,71 1 181,71 ***
GelRedcorante para gel (0,5 mL) 602,00 1 602,00 ***
Tampo de corrida (1 mL) 50,00 1 50,00 ***
Marcador de peso molecular 50 pb
(50 ug)
450,00 1 450,00 ***
-
20
Reagentes e plsticos para qPCR
Custom TaqMan SNP Genotyping
kit (1200 reaes)
1.800,00 2 3.600,00 FAPERGS
TaqMan Genotyping Master Mix
(4000 reaes)
2.500,00 1 2.500,00 FAPERGS
Tubos pticos em tiras de 8 unidades 421,00 5 2.105,00 ***
Tampas pticas em tiras de 8
unidades
407,50 2 815,00 ***
Reagentes para Extrao de RNA
Kit miRvana PARIS (Ambion) (20
reaes)
932,97 10 9.329,70 FAPERGS
RNA sinttico de C. elegans (cel-
miR-39)
550,10 1 550,10 ***
Reagentes para qRT-PCR
TaqMan microRNA RT kit (200
reaes)
910,98 6 5.465,88 FAPERGS
TaqMan Gene Expression Master
Mix (2000 reaes)
6.171,61 1 6.171,61 FAPERGS
TaqMan microRNA assay (50
reaes)
599,36 24 14.384,64 FAPERGS
Tubos e tampas pticas Material j computado no item anterior
Outros materiais
Luvas de ltex (caixa com 50 pares) 14,50 50 725,00 FIPE
Resumo do Oramento
Valor Total 56.852,78
Valor do Material J Adquirido 6.083,61
Valor Solicitado ao FIPE-HCPA 6.687,56
Valor Total Solicitado FAPERGS 44.018,61
-
21
FIPE-HCPA: Fundo de Incentivo Pesquisa e Eventos do Hospital de Clnicas de Porto
Alegre. O valor correspondente ser solicitado a este rgo de fomento (o FIPE-HCPA
concede at R$ 8.000,00 para os projetos que envolvem seres humanos).
FAPERGS: Valor solicitado neste edital.
***: Material j adquirido pelo grupo de pesquisa por ocasio do desenvolvimento de outros
projetos de pesquisa.
-
22
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28
9. ADEQUAO E DESCRIO DA EQUIPE DE PESQUISA
Profa. Dra. Ktia Gonalves dos Santos: Bacharel em Cincias Biolgicas (1999) pela
Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), tem mestrado (2001) e doutorado
(2005) em Gentica e Biologia Molecular pela UFRGS. Desde 2007 professora adjunta da
Universidade Luterana do Brasil (ULBRA), onde atua como orientadora no Programa de Ps-
Graduao em Biologia Celular e Molecular Aplicada Sade (PPGBioSade). O
PPGBioSade foi aprovado em 2011 pela CAPES, resultando da fuso do PPG em Gentica
e Toxicologia Aplicada (PPGGTA) e do PPG em Diagnstico Gentico e Molecular
(PPGDGM). Atua tambm como professora colaboradora do Programa de Ps-Graduao em
Cincias da Sade: Cardiologia e Cincias Cardiovasculares da UFRGS, exercendo
atividades de pesquisa junto ao Grupo de Insuficincia Cardaca e Transplante do Hospital de
Clnicas de Porto Alegre (HCPA). Tem experincia na rea de Gentica, com nfase em
Gentica Humana e Mdica, atuando principalmente nos seguintes temas: insuficincia
cardaca, hipertrofia cardaca, microRNAs, diabetes mellitus, complicaes crnicas do
diabetes e polimorfismos genticos.
Prof. Dr. Lus Henrique Canani: Graduado em Medicina pela Universidade Federal do
Rio Grande do Sul (1989), mestrado em Medicina: Cincias Mdicas pela Universidade
Federal do Rio Grande do Sul (1996) e doutorado em Cincias Mdicas: Endocrinologia pela
Universidade Federal do Rio Grande do Sul (1999). Ps-Doutorado na Joslin Diabetes Center
- Harvard University, Boston, EUA. Atualmente Professor Adjunto da Universidade
Federal do Rio Grande do Sul. Coordenador substituto da Ps-Graduao em Cincias
Mdicas: Endocrinologia da UFRGS nos anos de 2009 e 2010. Coordenador eleito da Ps-
Graduao em Cincias Mdicas: Endocrinologia da UFRGS - 2011. Tem experincia na
rea de Medicina, com nfase em Endocrinologia, atuando principalmente nos seguintes
temas: diabetes melito, nefropatia diabtica, retinopatia diabtica e gentica. Pesquisador
CNPq 1C. ndice H = 19 em maro de 2013.
Profa. Dra. Daisy Crispim Moreira: Graduao em Cincias Biolgicas - nfase em
Gentica e Biologia Molecular, pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul (1998).
Mestrado em Gentica e Biologia Molecular pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul
(2000). Doutorado em Gentica e Biologia Molecular pela Universidade Federal do Rio
Grande do Sul (2005). Ps-doutorado em Biologia Molecular e Celular pela Universit Libre
de Bruxelles, Bruxelas, Blgica (2006). Atualmente trabalha como Pesquisadora - Biloga II
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29
contratada pelo Servio de Endocrinologia do Hospital de Clnicas de Porto Alegre, onde a
responsvel pelo desenvolvimento do novo Laboratrio de Biologia das Clulas-Beta
Humanas para isolamento de ilhotas pancreticas para pesquisa e transplante em pacientes
com diabetes mellitus tipo 1. Tambm Professora Permanente do Programa de Ps-
Graduao em Cincias Mdicas: Endocrinologia da Universidade Federal do Rio Grande do
Sul, desde Julho de 2007. Tem experincia na rea de Gentica e Biologia Molecular e
Celular, com nfase em Gentica Humana e Mdica, atuando principalmente nos seguintes
temas: Gentica do diabetes mellitus e de suas complicaes crnicas; Isolamento de ilhotas
pancreticas humanas para transplante em pacientes com diabetes mellitus tipo 1; e Biologia
celular das ilhotas pancreticas. Bolsista de Produtividade CNPq - Nvel 2.
Graduanda Naiana Slvia Soares Corra: Acadmica de Biomedicina da Universidade
Luterana do Brasil. bolsista de iniciao cientfica PROBIC/FAPERGS/ULBRA e
desenvolve atividades de pesquisa junto ao Laboratrio de Gentica Molecular Humana da
ULBRA, sob a orientao da Profa. Ktia Gonalves dos Santos. Tem experincia na rea de
Gentica Humana e Mdica, atuando principalmente nos temas: insuficincia cardaca,
metalloproteinases de matriz e polimorfismos genticos.
Graduando Renan Csar Sbruzzi: Acadmico de Biomedicina da Universidade Luterana
do Brasil, possui bolsa PROUNI. aluno de iniciao cientfica voluntrio no Laboratrio de
Gentica Molecular Humana da ULBRA, sob a orientao da Profa. Ktia Gonalves dos
Santos.
10. INFRA-ESTRUTURA E APOIO TCNICO DISPONVEL
Todos os recursos fsicos e laboratoriais necessrios para a execuo deste projeto de
pesquisa esto disponveis no Programa de Ps-Graduao em Biologia Celular e Molecular
Aplicada Sade da ULBRA e no Servio de Endocrinologia do HCPA. Alm disso, a
equipe de profissionais (professores e alunos de iniciao cientfica) possui experincia em
estudos genticos de associao, nas tcnicas previstas neste projeto e/ou na anlise de dados
epidemiolgicos envolvendo as complicaes crnicas do diabetes. Porm, para a realizao
deste projeto de pesquisa, necessrio um novo aporte de recursos financeiros para a
aquisio dos materiais de consumo a serem utilizados na avaliao dos polimorfismos e da
expresso gnica, conforme indicado no oramento detalhado (seo 7).
-
30
11. RESULTADOS ESPERADOS E CONTRIBUIES CIENTFICAS
Diversas evidncias recentes sugerem que os microRNAs podem representar uma
pea-chave na regulao das vias intracelulares envolvidas na fisiopatologia do diabetes e
suas complicaes crnicas. Porm, at o momento, poucos estudos investigaram os nveis de
expresso de microRNAs como marcadores de progresso para a RD, sendo que todos os
estudos foram conduzidos em modelos animais. Alm disso, a avaliao de polimorfismos
em genes codificadores de microRNAs como marcadores da ocorrncia ou da gravidade da
RD ainda indita. Por isso, no presente estudo pretendemos avaliar a associao de
diferentes microRNAs polimorfismos e nveis de expresso com a presena e a gravidade
da RD. Assim, os resultados do presente estudo permitiro uma melhor compreenso dos
mecanismos regulatrios e do impacto dos microRNAs na patognese da RD, alm de
possibilitar o auxlio na identificao do paciente suscetvel a esta complicao e potencial
proposio de estratgias de tratamento especficas para o manejo da RD.
Alm do conhecimento cientfico e do melhor entendimento dos marcadores
biolgicos que esto associados ao desenvolvimento e agravamento da RD, as contribuies
cientficas desta proposta de pesquisa envolvem a: (1) formao de capital humano, com a
participao direta de alunos de doutorado, mestrado e iniciao cientfica; (2) a possibilidade
de expanso da equipe do laboratrio, uma vez que o volume de trabalho e o aporte de
recursos financeiros permitiro o acesso e o envolvimento de novos alunos neste projeto; e,
(3) o fortalecimento da colaborao j estabelecida entre os pesquisadores das duas
instituies executoras deste projeto de pesquisa (Laboratrio de Gentica Molecular
Humana do PPG em Biologia Celular e Molecular Aplicada Sade da ULBRA e
Laboratrio de Biologia Molecular do Servio de Endocrinologia do HCPA).
A expectativa inicial dos investigadores de que os resultados obtidos com a
realizao deste projeto de pesquisa permitam a publicao de artigo(s)original(is) em
peridicos cientficos com maior fator de impacto (Qualis A1 ou A2). Alm disso, os
resultados parciais obtidos ao longo do desenvolvimento do projeto sero apresentados em
eventos cientficos.