Proiect: PN-III-P2-2.1-PED-2016-1932

Contract: 252PED ⁄ 2017 (UEFISCDI)

Personal: Cristina Niculite, PhD; Gisela Gaina, PhD; Sevinci Pop, PhD; Stefania Rogozea; Victor

Ionescu; Valeriu Cismasiu, PhD (coordonator)

Perioada: 08/2017 – 14/12/2018

R A P O R T F I N A L

Cuprins

- rezumatul proiectului, prezentare succinta a rezultatelor

- obiectivele prevăzute/realizate

- gradul de atingere a rezultatelor estimate

- nivelul de maturitate tehnologică (TRL) la finalul proiectului

- modul de atribuire şi exploatare de catre parteneri a drepturilor de proprietate

- impactul rezultatelor obţinute

- raport stiintific si tehnic (etapa I, etapa II)

1

Rezumatul proiectului

Testele moleculare sunt esențiale pentru un diagnostic complet și un tratament țintit către

pacient. În majoritatea cazurilor, răspunsul organismului la tratament este foarte dificil de anticipat și

de aceea testele moleculare sunt instrumente medicale indispensabile prin care pacienții sunt

monitorizați, pentru a stabili dacă tratamentul este eficient sau trebuie modificat. Chimerismul este un

parametru care indică dacă transplantul de grefă hematogenă are succes și dacă celulele bolnave ale

pacientului sunt înlocuite de cele sănătoase, generate de grefă. Obiectivul proiectului a fost stabilirea

unei metode cu specificitate și limite de detecție îmbunătățite, ca alternativă la procedurile actuale de

evlauare a chimerismului. În acest scop, au fost testate diferite tipuri de gene ale ARN necodificatoare

(cum sunt microARNurile și ARNurile lungi noncodante), precum și evaluarea raportului celulă

sănătoasă / celulă bolnavă prin detecția și dozarea unor mutații patogene. Din punct de vedere

tehnologic, proiectul a urmărit implementarea metodei PCR în emulsie în diagnosticul molecular.

În cadrul proiectului s-a pus la punct o metodă inovativă privind utilizarea PCR în emulsie

pentru detecția unor mutatii cu secvență variabilă și care constituie obiectul unei cereri de brevet de

invenție (A/01065/2018), cu titlul “Set de doi primeri și două sonde și o metodă PCR digital în emulsie,

pentru detecția specifică, în exonul 14 al genei flt3, a duplicării unei regiuni cu secvența terminală

GAGAATATGAATATGATCTCA” depus la Oficiul de Stat pentru Invenții și Mărci, Bucuresti,

Romania.

2

Obiectivele prevăzute/realizate

Rezultatele activitatilor etapelor I si II, descrise in extenso in rapoartele stiintifice si tehnice ale

etapelor, demonstreaza ca obiectivele proiectului, prevazute in planul de activitate al etapelor I si II

din contractul de cercetare au fost indeplinite dupa cum urmeaza:

Etapa I

1) realizarea unei proceduri experimentale pentru testele de evaluare a chimerismului

(procedura in vivo a transplantului si analiza ARN prin ddPCR);

2) selectia unor fragmente ARN ca tinte pentru determinarea chimerismului (selectia a 6 ARN

cu INDELS, testate in etapa II);

Etapa II

3) optimizarea unei proceduri experimentale bazate pe tehnica ddPCR pentru determinarea

chimerismului la nivelul genelor pentru ARN necodificator;

4) testarea si selectarea a unor gene ale ARN necodificator (microARN si ARN lung) ca tinte

pentru determinarea chimerismului (ARN cu modificari genetice, mutatii). O parte dintre rezultatele

acestei etape constituie subiectul unei cereri de brevet national.

Gradul de atingere a rezultatelor estimate

In cadrul etapei I din planul de realizare a proiectului au fost prevazute urmatoarele activitati:

Evaluarea bioinformatica a genomului si identificarea genelor corespunzatoare ARN-urilor care contin

secvente polimorfe (activitatea 1.1); Testarea si optimizarea transplantului de celule hematopoietice in

animalul de laborator (activitatea 1.2); Testarea si optimizarea metodei PCR digital in emulsie pentru

dozarea ARN in celulele hematopoietice (activitatea 1.3). Rezultate obtinute si descrise in raport sunt:

in urma analizei genomului s-au identificat o serie de tipuri de ARN care au secvente polimorfice si

care sunt exprimate in celulele hematopoietice; s-a realizat transplantul de celule marcate CD45.2 in

animale marcate cu CD45.1, iar analiza ulterioara a dovedit eficienta metodei prin prezenta celulelor

hematopoietice derivate din grefa; s-a dozat ARN necodificator prezent in celulele hematopoietice prin

combinarea metodei de transcriere inversata cu metoda PCR fluorescent in emulsie.

In cadrul etapei II din planul de realizare a proiectului au fost prevazute urmatoarele activitati:

Obtinerea profilului de expresie a microARN in celule stem/progenitoare hematopoietice si

identificarea celor utiliabile la determinarea chimerismului (activitatea 2.1); Realizarea si optimizarea

unei tehnologii de dozarea a microARN-urilor prin PCR digital in emulsie (activitatea 2.2);

Transplantul de celule hematopoietice si determinarea chimerismului in sangele periferic, la nivel de

ARN, prin tehnica PCR digital in emulsie (activitatea 2.3); Transplantul de celule hematopoietice si

3

determinarea chimerismului prin dozarea de microARN in progenitorii hematopoietice izolati din

maduva osoasa (activitatea 2.4). Rezultate obtinute si descrise in raport sunt: obtinerea profilului de

expresie a 700 microARNuri in progenitorii hematopoietici si selectarea unor microARN pentru

evaluarea individuala; s-a realizat optimizarea metodei de dozare a microARN prin tehnologia PCR in

emulsie si a fost aplicata pentru microARNurile selectate pe baza profilului de expresie; s-a testat

expresia de ARN necodificator (atat microARN cat si cel din clasa “long non-coding RNA”) pe probe

biologice de sange periferic recoltat de la soarci transplantati.

Rezultate au fost prezentate la trei conferinte nationale sub forma de postere sau comunicare

orala. O parte dintre rezultate au fost publicate intr-o revista cu factor de impact > 4, iar rezultatele

privind utilizarea mutatiilor genetice ca metoda de chimerism (raport intre celule sanatoase si celule

leucemice) sunt subiectul unei cereri de brevet national.

Nivelul de maturitate tehnologică (TRL) la finalul proiectului

Din punctul de vedere al inovatiei tehnologice, diferite metode experimentale, utilizate frecvent

in cercetarea fundamentala (TLR2), cu sunt amplificarea ARN si ADN tinta prin PCR, detectia

mutatiilor genetice si a polimorfismului prin PCR cu fluorescenta sau tehnicia PCR in emulsie, au fost

combinate in cadru proiectului si optimizate pentru a fi compatibile intre ele, pentru a realiza

echivalentul unui prototip tehnologic (TLR4), respectiv o metoda noua privind dozarea chimerismului

la nivel molecular. Domeniul de aplicabilitate este reprezentat testele medicale din sfera diagnosticului

molecular sau monitorizarea post-tratament a pacientilor.

In cadrul proiectului a fost pusa la punct o noua metoda de monitorizare a unor mutatii cu mare

valoare prognostica in leucemia mieloida acuta si pentru care a fost inaintata la Oficiul de Stat pentru

Invenții și Mărci, Bucuresti, Romania, cererea de brevet de inventie A/01065/2018, cu titlul “Set de doi

primeri și două sonde și o metodă pcr digital în emulsie, pentru detecția specifică, în exonul 14 al genei

flt3, a duplicării unei regiuni cu secvența terminală GAGAATATGAATATGATCTCA”.

Modul de atribuire şi exploatare de catre parteneri a drepturilor de proprietate

Proiectul a fost realizat in totalitate in cadrul Institutului National de Cercetare-Devoltare in

Domeniul Patologiei si al Stiintelor Biomedicale “Victor Babes”. Rezultatele cercetărilor obținute pe

baza derulării Contractului aparțin Contractorului, conform legislației în vigoare referitoare la titlurile

de proprietate industrială și drepturile de autor. Rezultatele cercetărilor sunt administrate de proprietarii

acestora, cu toate drepturile care decurg din calitatea de proprietar.

Rezultatele cercetărilor obținute pe baza derulării contractului aparțin membrilor echipei de

cercetare și instituției (INCD Victor Babeș) conform legislației în vigoare referitoare la titlurile de

4

proprietate industrială și drepturile de autor. Contractul colectiv de muncă conține prevederi specifice

privind identificarea, încadrarea și stabilirea drepturilor de proprietate intelectuală rezultată din

activitatea personalului implicat în proiect. Rapoartele de activitate precum și comunicările științifice

vor fi editate într-o formă publicabilă, astfel încât să nu aducă atingere sau prejudicii în ceea ce privește

drepturile de proprietate intelectuală.

Rezultatele de inovare vor fi protejate prin brevetul de invenție solicitat.

Impactul rezultatelor obţinute

Rezultale obtinute au fost diseminate sub forma unei lucrari publicate in revista cotata ISI si

prin comunicari scris/oral la conferinte. Aceasta a favorizat interatia stiintifica dintre laboratorul nostru

si grupurile implicate in diagnosticul molecular, atat in cercetarea aplicativa cat si pentru laboratoarele

de servicii medicale.

In cadrul proiectului a fost creat un nou loc de munca si a fost angajat un tanar cercetator.

In cadrul proiectului s-a pus la punct o metoda inovativa privind utilizarea PCR in emulsie

pentru detectia unor mutatii cu secventa variabila si care constituie obiectul unei cereri de brevet de

inventie A/01065/2018, cu titlul “Set de doi primeri și două sonde și o metodă pcr digital în emulsie,

pentru detecția specifică, în exonul 14 al genei flt3, a duplicării unei regiuni cu secvența terminală

GAGAATATGAATATGATCTCA” depus la Oficiul de Stat pentru Invenții și Mărci, Bucuresti,

Romania.

Efectele socio-economice ale proiectului sunt:

- diversificarea activitatilor și serviciilor din portofoliul centrului de diagnostic al institutului și

creșterea cifrei de afaceri a institutului;

- reducerea costurilor pentru diagnostic și monitorizare prin aplicarea unor tehnici țintite pe

caracteristicile bolii și personalizată pentru pacient;

- creșterea calității vieții pacienților prin monitorizare personalizată a eficienței tratmentului;

- instruirea tinerilor cercetători în tehnici moderne de biologie moleculară;

5

Raport stiintific si tehnic

Etapa I

Suma (devizul postcalcul): 176.442,00 lei

Perioada etapei: 08/2017-12/2017

Descrierea etapei

In cadrul acestui proiect ne propunem sa validam atat in vitro cat si in vivo (teste pre-clinice cu

animalele de laborator), o nouă metodă de analiza a chimerismului prevazuta cu urmatoarele elemente

de noutate: metoda vizeaza ARN-ul, mai degraba decat ADN-ul genomic; ARN-ul evaluat este

exprimat în mod exclusiv sau preponderent în populația de interes, adică celulele hematopoietice stem

si progenitorii multipotenti (HSPCs) sau celule mieloide, proprii grefei sau organismului transplantat;

testul evaluează secventele polimorfice (variatii mononucleotidice - SNP sau insertii si deletii -

INDEL) care sunt transferate la ARN în timpul translației ADN genomic; ARN-ul si polimorfismul

sunt cuantificate cu ajutorul tehnologiei PCR digital in emulsie (ddPCR).

Evaluarea bioinformatica a genomului si identificarea genelor corespunzatoare ARN-urilor

care contin secvente polimorfe (activitatea 1.1)

Analiza a pornit de la bazele de date generate de studiile care au identificat ARN necodificator

exprimat in celulele hematopietice. Exemplele unor astfel de studii sunt: doi

10.1016/j.stem.2015.02.002; doi 10.7554/eLife.25607.001; doi 10.1182/blood-2013-12-544494. S-a

utilizat si pagina de web “ag-klusmann.shinyapps.io/lncScape/”. Analiza a implicat evaluarea a peste

1000 de tipuri de ARN. Au fost selectate 22 de tipuri de ARN necodificatoare pentru pasii urmatori ai

analizei: HOTAIRM1, Halr1, Hottip, Pvt1, Carlr, Malat1, H19, lincRNAp21 (Trp53cor1), BIC

(miR155HG), mir17hg, Gm27580, Xist, Gm15441, B430010I23Rik, DNM3OS, MEG3,

2610507I01Rik, GAS5, H2-K2, 5830416P10Rik, 1700020I14Rik, 1810058I24Rik.

Etapa urmatoare a reprezentat analiza polimorfismului acestor ARN in functie de subspecie. In

acest scop s-a generat un altgoritm complex de analiza comparativa. Protocolul cuprinde 5 etape,

descrise mai jos.

Etapa 1: se deschide adresa www.ensembl.org/Mus_musculus/Info/Index si se introduce numele genei;

se alege varianta cu transcriptul cel mai lung – apare organizarea genei in cromozom, apoi se folosesc

separat doua cai; calea 1 – se alege din stanga “Genetic Variation/Variant table” care se deschide prin

6

activare – si se apasa la coloana “conseq. Type” pentru a grupa si analiza tipul “non coding trascript

exon variant” – se urmaresc coloanele din stanga care spun despre tipul de variatie (SNP sau ins sau

del) si frecventa (simbolurile); calea 2- care arata pozitia SNP-urilor identificate pe calea 1 in raport cu

exonii (mai ales daca gena are mai multi transcripti) – in imaginea corespunzatoare organizarii genei

(inainte de initiarea caii 1) se activeaza “Go to Region in Detail for more tracks and navigation

options” – ceea ce determina schimbarea imaginii (se prezinta zona din cromozom care corespunde

transcriptilor genei dar cu mai multe detalii, inclusiv SNP) – se poate face zoom pe zona unde SNPurile

sunt plasate in regiunile exonilor comune transcriptilor – prin zoom se vor vedea si codurile “rs…” ale

SNP; aceste coduri se selecteaza si se confrunta cu tabelul din calea 1, pentru frecventa si tip; aceste

coduri se confrunta la etapa 4 de mai jos;

Etapa 2: analiza SNP dpv al subspeciei - se deschide http://www.informatics.jax.org/snp si se foloseste

“Search by gene”, se tipareste numele genei, se selecteaza in dreapta “Current symbols/names,

synonyms & homologs”, se selecteaza “within specified genes” – apasa “search” si se deschide tabelul

cu SNP – se deschide “Filter SNPs by: dbSNP Function Class” unde se selecteaza “Noncoding-

Transcript-Variant”, urmat de butonul “filter” – apare lista de SNP si distributia lor pe tip de soarece –

casutele goale semnifica faptul ca nu exista date pentru soiul respectiv

Etapa 3: analiza SNP doar pentru cele gasite pe zonele comune ale transcriptilor (etapa 1 calea 2): (a) la

fereasta obtinuta la etapa 1 calea 2, sunt precizate si se identifica nr cromozomului si zona

cromozomului; (b) se deschide http://www.informatics.jax.org/snp si folosim “Seach by region” – unde

se selecteaza nr cromozomului si se precizeaza intervalul bazelor (preluate de la pc (a) – click “search”

si se deschide un tabel cu SNP (mai putine ca la etapa 2, deoarece avem doar o zona din gena – aceea

comuna pentru mai multi transcripti daca exista); ca si la etapa 2, se deschide “Filter SNPs by: dbSNP

Function Class” unde se selecteaza “Noncoding-Transcript-Variant” sis e apasa “filter” – apare lista de

SNP si distributia lor pe tip de soarece – casutele goale semnifica faptul ca nu exista date pentru soiul

respectiv – aceste SNP sunt cele dorite si se urmareste frecventa lor pe baza simbolurilor din coloana

respectiva;

Etapa 4: se confrunta SNP (codurile “rs…”) de la etapa 1 calea 2 cu cele de la etapa 3: sa selecteaza pe

rand fiecare SNP precizat in tabelul de la etapa 3 se identifica in zoom de pe zona cu SNP de la etapa 1

calea 2 si se click pe denumirea lui, apoi se face click cu buton drapta pe “more about rs…” si se

selecteaza sa se deschida in fereastra nou – aici precizeaza tipul de nucleotide variate (sa coincida cu

tabelul de la etapa 1 calea 2) - uneori se precizeaza frecventa; tot aici se selecteaza mai jos imagini cu

informatii despre respectivul SNP

7

Etapa 5: analiza pentru stabilirea secventelor primerilor si a sondelor cu fluorescenta: pentru obtinerea

secventei ARN (transcript) se deschide http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Info/Index; se tipareste

la “search” numele genei; din coloana stanga se alege “Transcript comparison”; se alege transcriptul

care contine zonele comune cu ceilalti transcripti si se click pe “ENSMUSTnrnrnrnrnrnrnrnrnrnrnr.nr”

din tabel; apare o fereastra unde se selecteaza cDNA din coloana din stanga; astfel apare secventa

cDNA und sunt marcati exonii prin alternanta culorilor si sunt marcate SNP; secventele se pot analiza

si incarca; SNP se pot deschide in ferestre separate prin click pe litera de deasupra secventei.

Folosind acest algortim s-a reusit selectia unui numar mare de secvente variabile cu

polimorfism de tip SNP sau INDEL. Pentru studiul experimental privind dozarea acestor secvente,

prevazut in etapa 2 a proiectului, s-au stabilit si sintetizat seturi de primeri si sonde. In figura 1 este

prezentat un polimorfism la nivel de ARN intre soarecii C57 si BALBc format din 5 SNP grupate intr-

un interval de 12 baze. Un numar de 6 astfel de secvente vor fi studiate in etapa a doua a proiectului.

Testarea si optimizarea transplantului de celule hematopoietice in animalul de laborator

(activitatea 1.2)

Obiectivul major al proiectului este acela de a stabili o metoda noua pentru evaluarea

chimerismului in pacientii supusi transplantului hematogen. Obiectivul acestei etape a proiectului a fost

de a stabili un protocol optimizat pentru reproducerea fenomenului clinic in soarecele de laborator.

Practic se genereaza un model in vivo pentru a studia chimerismul.

Grefa a fost produsa prin extragerea maduvei hematogene din soarecii de tip C57 marcati cu

CD45.2. Suspensia hematopoietica a fost evaluata fenotipic, iar celulele hematopoietice stem (HSC) au

fost identificate ca fiind pozitive pentru cKit, Sca1, Cd150 (figura 2). Celulele HSC au fost sortate cu

instrumentul Astrios EQ (Beckman Coulter, SUA), iar populatia izolata a fost analizata fenotipic din

nou pentru a confirma succesul procedurii de sortare (figura 2).

8

Celulele sortate HSC au fost injectate intravenos in soareci marcati cu CD45.1 si care au fost

iradiati (raze X) cu o doza suficient de mare pentru a elimina propriile celule hematopoietice (7 Gy).

Deoarece animalele iradiate sunt vulnerabile la infectii, grupurile experimentale transplantate au fost

tinute timp de o luna in conditii de sterilitate, iar apa de baut a fost suplimentata cu antibiotice.

Animalele au fost monitorizate zilnic, iar cele cu semne clinice au fost sacrificate. Marcajul CD45

diferit intre grefa (izoforma 2) si soarecele transplantat (purtator al izoformei 1) a permis monitorizarea

in paralel la nivelul sangelui periferic al reconstituirii hematopoiezei cu origine in grefa sau in celulele

endogene (neafectate de iradiere). Figura 3 indica un rezultat tipic al transplantului: analiza fenotipica a

populatiilor mieloide din sangele periferic, la doua luni post-transplant, arata ca hematopoieza isi are

originea in celulele HSC grefate. Soarecii control reprezinta soareci care nu au fost supusi iradierii si

transplantului si la care se observa lipsa populatiei CD45.2. Prin urmare, marcajul populatiei CD45.2 in

cazul animalelor transplantate prezinta in mod specific grefa. Analiza priveste celulele mieloide (Mac1

pozitive, CD19 si CD3 negative), deoarece granulocitele au o rata de inlocuire foarte mare si, in

consecinta, dinamica acestei populatii reflecta cel mai bine activitatea celulelor stem. Rezultatul

demostreaza ca protocolul este optimizat si procedura este pregatita pentru studiul chimerismului

conform planificarii etapei a doua.

9

Testarea si optimizarea metodei PCR digital in emulsie pentru dozarea ARN in celulele

hematopoietice (activitatea 1.3)

Tehnologia PCR cu fluorescenta in emulsie (ddPCR) este considerata metoda PCR cu cel mai

crescut grad de sensibilitate; sensibilitatea metodei este de 10-100 ori mai mare dacat in cazul PCR cu

fluorescenta monitorizata in timp real (qPCR). In etapa raportata s-a testat aceasta metoda pentru a

identifica si doza ARN cu ajutorul aparatului QX200 (Bio-Rad, USA). Celulele hematopoietice tinta au

fost lizate si s-a izolat ARN-ul total. ARN a fost convertit in ADN complementar (ADNc) prin

procedura denumita transcriptie inversata. ADNc a fost evaluat prin ddPCR. In faza initiala se amesteca

componentelor de PCR (include ADNc, polimeraza, dNTP, primeri si sonda fluorescenta), care apoi se

combina automat cu o solutie lipidica. Se realizeaza o emulsie cu aproximativ 20000 de picaturi

lipidice. Deoarece fiecare picatura este bine individualizate si izolata de celelalte se considerata ca

amestecul initial de reactie a fost partitionat in 20000 de reactii PCR independente. Reactia PCR se

desfasoara intr-un aparat de PCR standard. Reactiile de PCR testate sunt de tip TaqMan, al caror

principiu este descris in figura 4. Sonda este marcata cu un fluorocrom si cu un compus care inhiba

emisia florescenta, astfel ca fluorocromul atasat de sonda nu emite semnal fluorescent. Digestia sondei

in timpul actiunii polimerazei determina eliberarea fluorocromului, iar dozarea PCR se bazeaza pe

cantitatea de fluorocrom liber.

In ultima faza, dupa terminarea reactiei PCR, emulsia este incarcata intr-un instrument care va

evalua fluorescenta fiecarei picaturi. Daca picatura lipidica contine cel putin o copie de ADNc, atunci

se petrece reactia PCR cu eliberarea de fluorocrom, iar picatura respectiva devine fluorescenta. In lipsa

10

ADNc, picatura lipidica va fi negativa pentru fluorescenta. Dozarea cantitativa este raportata ca

numarul de picaturi fluorescente dintr-un numar total de picaturi evaluate. In cadrul acestei etape a fost

evaluata dozarea ARN sno202, iar in figura 5 este prezentat un rezultat semnificativ (in stanga este o

dilutie 1:50 iar in dreapta este rezultatul unei dilutii 1:100). Punctele albastre reprezinta picaturi

fluorescente, iar cele negre sunt fara fluorescenta. Rezultatele certifica optimizarea procedurii ddPCR

care va fi folosita in etapa II pentru dozarea polimorfismului si stabilirea chimerismului posttransplant.

Concluzii si Indicatori de rezultat

Obiectivele etapei I au fost atinse si cele doua rezultate estimate in planul de activitate (contract) au fost indeplinite: 1) realizarea unei proceduri experimentale pentru testele de evaluare a chimerismului (procedura in vivo a transplantului si analiza ARN prin ddPCR); 2) selectia unor fragmente ARN ca tinte pentru determinarea chimerismului (selectia a 6 ARN cu SNP care vor fi testate in etapa urmatoare). Rezultatele au fost prezentate sub forma unor postere: A) A 47-a Conferință Anuală de Imunologie, Bucuresti, Romania, “Deleția clusterului miR-17-92 în celulele stem hematopoietice și progenitori urmată de evaluarea fenotipică a populațiilor mieloide”, Rogozea S, Cismasiu V, Gaina G, Niculite C B) Al 10-lea Simpozion National de Patologie, Institutl National de Patologie "Victor Babes", Bucuresti, Romania, “MLL-AF9 murine model of human acute myeloid leukemia”, Rogozea S, Cismasiu V, Gaina G, Surcel M, Fenyo M

11

Raport stiintific si tehnic

Etapa II

Suma (devizul postcalcul): 298.530,00 lei

Perioada etapei: 01/2018-12/2018

Descrierea etapei

Profilul de expresie a 700 microARNuri in progenitorii hematopoietici (activitatea 2.1)

Analiza a pornit de la probele de maduva hematogena ca atare si de la populatiile de progenitori

hematopoietici care au fost sortate din maduva hematogena. S-a extras ARN total si s-a evaluat

expresia de microARN cu ajutorul sistemului Megaplex combinat cu TaqMan PCR, conform

indicatiilor producatorului (Thermo Fischer Scientific, SUA). Analiza a fost facuta cu 5 determinari

independente. Sumarul rezultatelor este prezentat in figura 1, fiecare microARN fiind reprezentat de o

curba de fluorescenta, in fiecare proba.

Figura 1

Dintre toate tintele, au fost selectate cateva care au fost testate ulterior prin RT-qPCR. In figura

2 sunt prezentate datele statistice pentru cele mai relevante microARN.

Figura 2

12

Realizarea si optimizarea unei tehnologii de dozarea a microARN-urilor prin PCR digital in

emulsie (activitatea 2.2)

Pentru microARNurile selectate prin activitatea 2.1, a fost testata si optimizata procedura

TaqMan in cazul aplicarii acesteia la PCR digital in emulsie (ddPCR). Tehnologia a fost evaluata in

etapa precendenta, cand toti parametrii chimici si fizici au fost monitorizati si a fost stabilita combinatia

lor optima (activitatea 1.3). In aceasta etapa tehnologia a fost ajustata in functie de particularitatile

ARN tinta, si anume: etapa de transcriere inversata se realizeaza cu un primer specific pentru fiecare tip

de micrARN; ampliconul amplificat prin PCR este foarte scurt; primerii sunt judicios alesi astfel incat

sa nu amplifice nespecific fragmente ARN scurte asemanatoare ca secventa cu microARNul tinta.

Deoarece instrumentul folosit pentru ddPCR (QX200, BioRad, SUA) permite monitorizarea simultana

a doua fuorescente diferite, probele au fost testate simultan pentru un microARN si o gena de referinta

(sno202). Figura 3 prezinta cateva profile caracteristice obtinute cu probe ARN convertite in ADN

complementar, derivate din populatii de celule sortate. Culoarea albastru semnifica detectia si

amplificarea genei de referinta, iar culoarea verde reprezinta microARNul testat. In particulele de

culoare bej a avut loc amplificarea ambelor gene astfelca se detecteaza simultan ambele fluorescente.

Figura 3

Transplantul de celule hematopoietice si determinarea chimerismului in sangele periferic, la

nivel de ARN, prin tehnica PCR digital in emulsie (activitatea 2.3);

Pentru aceasta activitate a fost necesar sa identificam gene din clasa ARN necodificator (altele

decat microARN) care sa prezinte polimorfism, astfel incat identificarea lor si, implicit, a celulelor din

care povin, sa se faca pe baza acestor diferente genetice. Am cautat preponderent polimorfism de tipiul

deletiilor sau insertiilor, folosindu-ne de avantajul faptului ca genomul diferitelor linii de soareci a fost

secventiat complet. Am cautat si identificat ARN necodificator de marime mare (“long noncoding

RNA”, lncRNA) care prezinta diferente intre soarecii C57 si BALB/c.

Protocolul utilizat este prezentat sumar mai jos.

1) selectia lncRNA din tabel suplimentar 2 care au expresie mare in cel putin populatiile HSC si Gr; 13

2) analiza SNP introducand numele genei in Ensembl - mouse, dupa metoda: se deschide

http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Info/Index; se tipareste sus dreapta la search numele genei; din

lista de date se alege varianta cu transcriptul cel mai lung si se deschide – apare organizarea genei in

cromozom, apoi se cauta INDELS; aceste coduri se selecteaza si se compara la pc 5 de mai jos;

3) analiza SNP dpv al soiurilor de soarece la baza de date MGI a lui Jax – pe baza denumirii si nu a

zonei din cromozom: se deschide http://www.informatics.jax.org/snp si se foloseste “Search by gene”,

se tipareste numele genei;

4) analiza SNP dpv al soiurilor de soarece doar pentru cele gasite pe zonele comune ale transcriptilor

(punctul 2): se deschide http://www.informatics.jax.org/snp unde se foloseste “Seach by region” –

apare lista de SNP si distributia lor pe tip de soarece – casutele goale semnifica faptul ca nu exista date

pentru soiul respectiv – aceste SNP sunt cele dorite si se urmareste frecventa lor pe baza simbolurilor

din coloana respectiva;

5) se confrunta SNP (codurile “rs…”) de la pc 2 cu cele de la pc 4: sa selecteaza pe rand fiecare SNP

precizat in tabelul de la pc 4 se identifica in zoom de pe zona cu SNP de la pc 2; tot aici se selecteaza

imagini cu informatii despre respectivul SNP

6) stabilirea secventelor primerilor si a sondelor cu fluorescenta: pentru obtinerea secventei ARN

(transcript) se se deschide http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Info/Index; se tipareste sus dreapta

la search numele genei; astfel apare secventa cDNA und sunt marcati exonii prin alternanta culorilor si

sunt marcate SNP; secventele se pot analiza si incarca; SNP se pot deschide in ferestre separate prin

click pe litera de deasupra secventei

Dintre toate variantele identificate am testat in aceasta activitate a etapei II, polimorfismele cu

codurile rs220616168, rs386843366 si rs233890847. rs233890847 (lncRNA 2610507I01Rik_201) GCACCTCCAGGGCTTACAATAAACCGCTGYCATAAGCTCAAAASGGCGGAGAGCTTCAGGA[-/CCCTTTAGTGTCGGG]CCACTCACGAGACACTAGTGGGGTSCTTGAAAGTCCTGTGCTCTTTGGTTCTGAAGAGCCGACTGTTCTCTAAAGAT rs386843366 (lncRNA 2610507I01Rik_201) CTTGAAAGTCCTGTGCTCTTTGGTTCTGAAGAGCCGACTGTTCTCTAAAGATRTTCCTCACGAGT[-/ACCGCAGT]GACTCCAACTCCTTCACCTTRGCTGTTTTGCCAACCCAACTTGGCACTTGGATGTTCC rs220616168 (lncRNA 5830416P10Rik=Mirt1_201) CCCTTCCTTCATTTCTTTAAAGAGTGTATTCTACAGAGTTAGTCATGTTTGTTTCCCACCAA[CAGTGTCCAGGGCATCCTACTAG/-]CACTAGTAATGGTTTTTACATGGTAGCTGCTCTGATAGGTGGGAAGTAGTTTCTGTTTG

Au fost proiectate primerii si sondele, astfel incat sondele sa recunoasca fiecare cate o varianta

genetica. Cu alte cuvinte, diferentele genetice sunt vizualizate cu fluorescente diferite, pentru ca fiecare

sonda, specifica doar uneia dintre secvente, are un marker fluorescent distinct.

Celulele amestecate in diferite proportii au fost transplantate in animale iradiate in prealabil,

dup aprocedura optimizata in etapa I. Dupa 6-12 zile, s-a recoltat sange periferic de unde a fost analizat

14

lncARN, cu ajutorul tehnilogiei ddPCR. In figura 4 sunt prezentate cateva rezultate semnificative:

punctele albastre reprezinta genele exprimate de celulele C57, alese ca referinta. Se observa ca numarul

punctelor, chiar daca intensitatea semnalului variaza de la o proba la alta, este oarecum similar si

certifica faptul ca s-au transplantat grefe cu numar cosntant de celule C57. Punctele verzi reprezinta

gene codificate de celulele BALB/c (identificate prin prezenta mutatiei INDEL detctata de sonda

“verde”). Grefele au fost astfel preparate incat numarul de celule BALB/c hematopoietice a fost

variabil in sens descrescator. Rezultatul a reprodus cu mare fidelitate valorile teoretice ceea ce

dovedeste ca acest tip de analzia (polimorfism determinat prin ddPCR), bazat pe ARN

necodificator, este utilizabil in stabilirea chimerismului.

Figura 4

Transplantul de celule hematopoietice si determinarea chimerismului prin dozarea de

microARN in progenitorii hematopoietice izolati din maduva osoasa (activitatea 2.4)

Testele au la baza urmatorul principiu: dupa iradiere, numarul de celule stem hematopoietice si

progenitori hematopoietici scade ca urmare a apoptozei celulare; transplantul grefei are rolul de a

inlocui celulele iradiate cu celule de acelasi tip (stem si progenitori) dar sanatoase; daca grefarea se

desfasoara normal, atunci numarul de celule stem si al progenitorilor multipotenti creste in perioada

post-transplant, iar daca grefa este respinsa de organism atunci numarul de celule stem si progenitori

scade. Monitorizarea evolutiei populatiilor stem si a progenitorilor in maduva postransplant poate fi

15

realizata prin analzia secventiala a nivelului de expresie a unor microARN preferential sau unic

exprimate in aceste tipuri celulare. Testele sau realizat cu maduva recoltata de la soareci iradiati si

transplantati cu cantitati descrescatoare ale grefei hematogene, iar microARNurile evaluate au fost

dintre cele testate la activitatea 2.1. Procedurile privind iradierea, transplantul, extragerea ARN au fost

similare cu cele utilizate in activitatea 2.3, in baza unor protocoale optimizate in etapa I. In figura 5 este

prezentat un rezultat caracteristic, unde se observa ca nivelul de microARN (numar de picaturi

fluorescente) descreste odata cu reducerea numarului de celule stem si progenitori din grefa.

Figura 5

Concluzii si Indicatori de rezultat

Obiectivele etapei II si ale proiectului au fost atinse si cele doua rezultate estimate in planul de activitate (contract) au fost indeplinite: 1) optimizarea unei proceduri experimentale bazate pe tehnica ddPCR pentru determinarea chimerismului la nivelul genelor ARN necodificator; 2) testarea unor fragmente ARN ca tinte pentru determinarea chimerismului (ARN cu modificari genetice, mutatii). Rezultatul acestei etape constituie subiectul unei cereri de brevet national. Lucrare publicata in revista cotata ISI: Rosca et al. “Collagen regulates the ability of endothelial progenitor cells to protect hypoxic myocardium through a mechanism involving miR-377/VE-PTP axis”, J Cell Mol Med. 2018; 22(10):4700-4708 (factor de impact: 4.3) Comunicare orala: Ionescu et al. “Detection and quantification of rare mutant alleles by droplet digital PCR”, 11th National Pathology Symposium, Annual Scientific Meeting, Bucharest, Romania (11/2018) Postere: Pop et al. “Evaluation of DNMTs activity and DNA methylation pattern on human tumor cell lines after prolonged treatment with unsaturated fatty acids”, 11th National Pathology Symposium, Annual Scientific Meeting, Bucharest, Romania (11/2018)

16

Gaina et al. “The MLPA assay improves diagnostic in genetic diseases”, 11th National Pathology Symposium, Annual Scientific Meeting, Bucharest, Romania (11/2018) Cerere de brevet national: Cismasiu et al. “Set de doi primeri și două sonde și o metodă pcr digital în emulsie, pentru detecția specifică, în exonul 14 al genei flt3, a duplicării unei regiuni cu secvența terminală GAGAATATGAATATGATCTCA”, Oficiul de Stat pentru Invenții și Mărci, Bucuresti, Romania, cererea de brevet de inventie A/01065/2018 Director proiect Valeriu Cismasiu

17