prof. laura carmona salazar semestre:...
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FACULTAD DE QUÍMICADEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
CURSO DE BIOQUÍMICA CLÍNICA(CLAVE 1807)
Licenciatura de QFB
Prof. Laura Carmona Salazar
Semestre: 13-II
Este material es exclusivamente para uso educativo y no de lucro
ENZIMOLOGÍA CLÍNICA
• Los enzimas como catalizadores biológicos
• Determinación de la actividad enzimática
• Los enzimas como marcadores de lesión tisulartisular
• Enzimas séricas de importancia en el diagnóstico clínico
EL ARREGLO DE UNA PROTEÍNA PARTICULAR ES ELRESULTADO DESU SECUENCIA ÚNICA Y ESPECÍFICA DE AMINOÁCIDOSY ES INDISPENSABLE PARA SU FUNCIONALIDAD
Ha y Loh, 2012Chemistry 18 (26):7984
LAACTIVIDAD CATALÍTICA DEPENDEDE LA INTEGRIDAD DE SU CONFORMACIÓNPROTEICA NATIVA
ADEMÁS PUEDEN REQUERIR DE OTROS COMPONENTESQUÍMICOS ADICIONALESQUÍMICOS ADICIONALES
VITAMINA COENZIMA REACCIÓN EN LA QUE ESTÁ INVOLUCRADA
Tiamina (vitamina B1) Tiamina pirofosfato Activación y transferencia de aldehídos
Riboflavina (vitamina B2) Flavin mononucleótido o FMN; flavin adenin dinucleótido o FAD+,
Oxidación-reducción
Niacina Nicotin amida adenin dinucleótido o NAD+; Nicotin amida adenin dinucleótido fosfato o NADP+
Oxidación-reducción
COENZIMAS FUNDAMENTALES PARA LA ACTIVIDAD CATALÍTICA DE VARIOS ENZIMAS
fosfato o NADP+
Ácido pantoténico Coenzima A Activación y transferencia de grupos acilo
Piridoxina Fosfato de piridoxal Reacciones que involucran la activación de aminoácidos
Biotina Biotina Activación y transferencia de CO2
Ácido lipoico Lipoamida Activación del grupo acilo:oxidación-reducción
Ácido fólico Tetrahidrofolato Activación y transferencia de grupos funcionales de un sólo carbono
Vitamina B12 Adenosil cobalamina; metil cobalamina
Isomerizaciones y transferencia de grupos metilo
CLASIFICACIÓN DE LOS ENZIMAS ACORDE A LA REACCIÓN QUE CATALIZAN
1) Oxidoreductasas.- Reacciones redox que involucran transferencia de electrones
2) Transferasas.- Reacciones de transferencia de grupos funcionales
3) Hidrolasas.- Reacciones de hidrólisis3) Hidrolasas.- Reacciones de hidrólisis
4) Liasas.- Crean dobles enlaces
5) Isomerasas.- Reacciones de isomerización
6) Ligasas.- Formación de puentes con rompimiento de ATP
LOS ENZIMAS CATALIZAN REACCIONES DE MANERAEFICAZ Y ALTAMENTE ESPECÍFICA
INTERACCIÓN PRECISA DEL ENZIMA-SUSTRATO
COMPLEJA ESTRUCTURACIÓN PROTEICA
ESPECIFICIDAD
INTERACCIÓN PRECISA DEL ENZIMA-SUSTRATO
Energía libre
Estado de transición S
LOS ENZIMAS FACILITAN LA FORMACIÓN DEL ESTADO DE TRANSICIÓN
(Proporcionando una superficie complementaria a su estereoquímica, polaridad
o carga)
Coordenada de reacción(cambios químicos)
Energía libre
Estadobasal
Estadobasal
Energíalibre
S P
REACCIÓN QUÍMICA
EL EQUILIBRIO DEPENDE DEL ∆G
Y LA VELOCIDAD DE LA ENERGÍA LIBREDE ACTIVACIÓN
EN UNA REACCIÓN CATALIZADA POR UN ENZIMA, ÉSTA MODIFICA LA VELOCIDAD
CINÉTICA ENZIMÁTICA.- Disciplina que se encarga deestudiar el mecanismo de una reacción catalizadaenzimáticamente.
OBJETIVO.- Determinar la velocidad de la reacción y
evaluar como se ve modificada ésta en
respuesta a cambios en los parámetros
experimentales
VELOCIDAD= Cantidad de sustrato desaparecido oproducto formado por la enzima por unidad de tiempo
Por tanto sus unidades soncantidad de compuesto sobre unidad de tiempo:
moles µmoles
nmolesgramos
miligramosµgramos
hora
minuto
segundo
¿QUÉ ES ACTIVIDAD Y CANTIDAD DE UN ENZIMA?
• ACTIVIDAD: Cantidad transformada por unidad de tiempo
(moles/s)
• ACTIVIDAD ESPECÍFICA: Actividad • ACTIVIDAD ESPECÍFICA: Actividad enzimática por cantidad de enzima
(moles/s/mg de proteína)
• CANTIDAD: Se refiere a la concentración del enzima (mg, mg/mL, actividad enzimática/mL)
METODOLOGÍA UTILIZADA PARA LA DETERMINACIÓN DE ENZIMAS EN MUESTRAS BIOLÓGICAS
�MÉTODOS INMUNOLÓGICOS.- Que determinan la cantidad de enzima
�MÉTODOS �MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS.- Que establecen la actividad catalítica de las enzimas
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
La velocidad de una reacción se puede expresar
como cantidad de sustrato consumido
o como cantidad de producto formado
Lo cual puede monitorearse espectrofotométricamente a través de determinarLo cual puede monitorearse espectrofotométricamente a través de determinarlos cambios en la absorción óptica de la solución que contiene lossustratos y el enzima
1 UNIDAD DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICACantidad de enzima que puede transformar 1 µmol de sustrato por minuto
Donde:
· εεεε = coeficiente de extinción molar· b = es el espesor de la cubeta· VF = es el volumen total de reacción· VI = es el volumen de muestra en el ensayo
Los parámetros:
son constantes por tanto podemos la fórmula anterior
queda como:
UI/L=?A/min · cte
� No utilizar muestras congeladas y descongeladasvarias veces.
• Separar lo antes posible el coágulo del suero• Evitar trabajar con muestras hemolizadas
CONSIDERACIONES IMPORTANTES EN LOS ENSAYOS DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
• El transporte de las muestras debe realizarse en frío sincongelar, salvo que se vaya a prolongar mucho tiempo.
• Evitar estasis venosa durante la extracción• Evitar el envejecimiento de las muestras
Variables que afectan al análisis clínico. EDTA y hemólisis
EDTA:
Su efecto anticoagulante se basa en su capacidad para quelar iones
divalentes como calcio o magnesio. No es posible determinar la
actividad de enzimas que requieran estos iones.
CONSIDERACIONES IMPORTANTES EN LOS ENSAYOS DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
MUESTRAS HEMOLÍTICAS:
La ruptura de los eritrocitos hace que su contenido pase al plasma.
Las muestras presentan una coloración roja intensa muy característica
debida a la presencia de hemoglobina.
La hemólisis puede ser causada por una patología o, en la
mayor parte de los casos, un procesamiento
indebido de la muestra.
LOS ENZIMAS SE UTILIZAN COMO MARCADORES DE LESIÓN TISULAR
SIGNIFICADO CLÍNICO DEL PATRÓN ISOENZIMÁTICO DE ALGUNOS ENZIMASISOENZIMÁTICO DE ALGUNOS ENZIMAS
- Alanina aminotransferasa (ALT)
- Aspartato aminotransferasa (AST)
- Creatina kinasa (CK)
- Fosfatasa alcalina (AP, ALP, SAP)
ENZIMAS UTILIZADOS EN EL DIAGNÓSTICO CLÍNICO
- Fosfatasa alcalina (AP, ALP, SAP)
- g-glutamil transpeptidasa (GGT)
- Amilasas
-Lipasas
Función: cataliza la transferencia de alanina al ácido a-cetoglutárato, formando piruvato y ácido glutámico)
Localización: citoplasma
ALANINA AMINOTRANSFERASA (ALT)
También llamada GPT (Transaminasa glutámico-pirúvica)
•Valores normales: < 50 U/ml•Valores normales: < 50 U/ml•Aumento importante: Shock, hepatitis•Aumento moderado: cirrosis, mononucleosis,ictericia,
ASPARTATO AMINOTRANSFERASA (AST)También conocida como GOT (Transaminasa glutámico-oxalacético)
-Función: cataliza la transferencia del grupo a-amino del ácidoaspártico al ácido a-cetoglutárico, formando oxaloacetato yglutámico)
Localización: citoplasma y mitocondria
•Valores normales: < 40U/ml•Valores normales: < 40U/ml•Aumento importante: Infarto del miocardio, hepatitis, traumatismos•Aumento moderado: cirrosis, mononucleosis, ictericia, hemólisis
CREATINA CINASA (CK Ó CPK)
Función: importante para la contracción muscular. Transfiere elfosfato de la fosfocreatina al ADP, formando ATP
Localización: citoplasma y mitocondria de miocitos
Isoenzimas:CK-1: isoenzima BB, cerebroCK-2: isoenzima MB, músculo cardíaco y esqueléticoCK-3: isoenzima MM, músculo esquelético y cardíacoCK-3: isoenzima MM, músculo esquelético y cardíacoCK-Mt: membranas mitocondriales. Músculo cardíaco
•Valores normales: < 160U/ml en varonesy <130U/ml en mujeres•Aumento importante: Infarto demiocardio CK-MB•Aumento moderado: miopatías, distrofiamuscular, accidente cerebro-vascular
FOSFATASA ALCALINA (AP, ALP, SAP)
Función: metaloenzima que cataliza la hidrólisis dediferentes ésteres de fosfato. Requiere pH alcalino ycofactores (iones zinc y magnesio)
Localización: asociada a membrana
• Valores normales: 85-190U/ml en el adulto. Hasta 500U/ml en niños endesarrollo
• Aumento importante: ictericia obstructiva, colelitiasis, neoplasia devías biliares, cirrosis, hepatomas• Aumento moderado: neoplasias óseas osteogénicas, osteomalacia,enf. Paget, hiperparatiroidismo
G-GLUTAMIL TRANSPEPTIDASA (GGT)
Función: Cataliza la transferencia de grupos glutamilC-terminales de unos péptidos a otros o aaminoácidos. Es importante en el metabolismo delglutatión, la absorción de aminoácidos y en la anti-oxidación
Localización: membrana y citoplasma (5%)
•Valores normales: < 35U/ml en varones y <25U/ml en mujeres•Aumento importante: Hepatitis vírica, obstrucción biliar, metástasishepáticas, enf. alcohólica•Aumento moderado: infecciones que afectan al hígado(citomegalovirus, mononucleosis infecciosa)
AMILASAS (αααα-AMILASA)
Función: hidroliza carbohidratos complejos para formarmaltosa y glucosa
Localización: Se produce en páncreas, hígado e intestinodelgado. Se filtra y reabsorbe a través del riñón
• Valores normales: <50U/ml•Aumento importante: pancreatitis aguda y crónica,cáncer de páncreas.•Aumento moderado: parotiditis, algunos carcinomas,procesos parapancreáticos (gastritis, úlcera duodenal,peritonitis, obstrucción intestinal.
LIPASAS
Función: hidroliza triglicéridos
Localización: Se sintetiza en el páncreas y en la mucosa
gástrica. Se elimina a través del riñón
Causas del incremento de lipasa:PancreatitisGastrointestinalesRenales