PRODUCTOS BIOLGICOS DE ORIGEN BACTERIANO

INDICE

I. INTRODUCCINpg. 2II. OBJETIVOS. ...pg. 2III. PRODUCTOS BIOLGICOS PE ORIGEN MICROBIANO. Obtencin de antgenos de Salmonella typhipg. 31. CLASIFICACIN DEL GNERO Salmonellapg.3 2. Principales caractersticas del Gnero Salmonellapg. 53. Caractersticas Moleculares De La Pared Celular (Antgenos O Y H)....pg. 54. Estructura Antignica de Salmonella typhi..pg. 6a. Antgeno O (Somtico)....pg. 7b. Antgeno H (Flagelar)....pg. 9c. Antgeno capsular o de envoltura (Vi)pg. 11IV. MTODOS CUANTITATIVOS PARA UNA POBLACIN DE Salmonella1) MEDIDA DE MASA BACTERIANA. .pg. 12A. METODO INDIRECTO. ..pg. 122) MEDIDA DEL NUMERO DE INDIVIDUOS. ..pg. 14B. METODOS INDIRECTOS. ...pg.14 RECUENTO DE VIABLES EN PLACA. ....pg. 14.C. DILUCIONES SERIADAS DE LAS SUSPENSIONES CELULARES ANTES DE LA SIEMBRA EN LA PLACA..pg. 14D. NMERO MS PROBABLE (NMP).pg. 20V. BASES TERICAS PARA LA OBTENCIN DE ANTGENOS O Y HA. OBTENCIN DEL ANTGENO O....pg. 22B. OBTENCIN DEL ANTGENO H...pg. 23VI. FENMENOS DE VARIACIN QUE AFECTAN LA SEROTIPIFICACINpg. 24VII. PROCESAMIENTO DEL MICROORGANISMO, INOCULACIN Y OBTENCIN DE ANTISUEROS O Y H..pg. 25VIII. CONCLUSIONES: ....pg. 32IX. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS. ...pg. 33

I. INTRODUCCIN.Un producto biolgico o biofrmaco es aquel que ha sido elaborado con materiales de partida de origen biolgico, tales como microorganismos, rganos y tejidos de origen vegetal o animal, clulas o fluidos de origen humano o animal y diseos celulares (sustratos celulares, sean o no recombinantes - incluidas las clulas primarias) as como otros de origen biotecnolgico que se obtienen a partir de una protena o cido nucleico por tecnologa de ADN recombinante.Los productos biolgicos son extremadamente ms complejos que la mayora de los medicamentos convencionales (que tienen principios activos con molculas pequeas (1,2). En comparacin con estas pequeas molculas que constituyen el principio activo principal de los medicamentos sintetizados qumicamente, los productos biolgicos tienen un peso molecular mucho ms alto y una complejidad mayor; pueden ser mezclas de muchas especies moleculares que tienen perfiles de impureza nicos, los cuales invariablemente dependen del proceso de manufactura.Actualmente los productos biotecnolgicos aceptados para su comercializacin ya tratan o ayudan a prevenir: ataques cardiacos, infarto cerebral, esclerosis mltiple, leucemia, hepatitis, artritis reumatoide, cncer de mama, cncer de pulmn, linfomas, cncer renal, cncer de colon, diabetes mellitus, insuficiencia cardiaca, fibrosis qustica entre otras enfermedades.

II. OBJETIVOS.

Conocer la estructura antignica de salmonella typhi.

Conocer los diferentes mtodos de cuantificacin para una poblacin de Salmonella typhi

Conocer los pasos para la obtencin del antgeno O y H.

III. PRODUCTOS BIOLGICOS PE ORIGEN MICROBIANOObtencin de antgenos de Salmonella typhi

1. CLASIFICACIN DEL GNERO SalmonellaLa taxonoma del gnero Salmonella ha sido objeto de amplios debates. Inicialmente se consideraba que estaba formado por una sola especie dividida en serotipos siguiendo el esquema establecido por Kaufimann-White y basado en los diferentes tipos de antgenos flagelares (H) y somticos (O).El antgeno H est constituido por la protena ms abundante del flagelo (la flagelina), que es la estructura que permite el movimiento.El antgeno O est formado por una cadena repetitiva de polisacridos, que forma parte del lipopolisacrido (LPS), que se genera y sobresale de la membrana externa y que acta como una barrera de proteccin a los agentes externos.Segn la clasificacin de Kauffmann-White; en la actualidad se reconocen aproximadamente 2 500 serotipos. Este nmero est en constante aumento. Los serotipos ms comunes que causan infeccin en humanos y en animales de consumo pertenecen a la subespecie enterica. Los serotipos de las otras subespecies son frecuentes en animales poiquilotermos (de sangre fra) y en el ambiente, aunque algunos serotipos de S. arizonae y S. diarizonae se han asociado con enfermedades en pavos y en ovejas.El gnero Salmonella se consideraba integrado por una sola especie denominada Salmonella enterica que se subdivida en siete subespecies a partir de los resultados obtenidos mediante estudios para establecer sus perfiles bioqumicos y confirmados por tcnicas de hibridacin del ARN/ADN y mtodos serolgicos. En este sentido en el Subgrupo I, por ejemplo, se integraban la mayora de cepas con capacidad patgena para los animales. Los subgrupos III a y IIIb incluan las cepas consideradas como Salmonella arizonae.En los ltimos aos se ha propuesto una nueva clasificacin que incluye ms de 2 375 serovares de Salmonella y se considera que el gnero est integrado por dos especies: Salmonella bongori y Salmonella enterica.Sin embargo, algunos autores indican que Salmonella typhi, actualmente clasificada como un serotipo o serovar de Salmonella enterica subsp. enterica, debera ser considerada como especie con entidad propia, dada su importancia clnica ya que se describe como el agente etiolgico de la fiebre tifoidea en humanos.Salmonella entrica se subdivide en seis subespecies denominadas:

Nomenclatura anteriorNomenclatura actual

Subespecie I :

sub especie enterica

Subespecie II :

sub especie salamae

Subespecie Illa:

sub especie arizonae

Subespecie IIIb:

sub especie diarizonae

Subespecie IV:

sub especie houtenae

Subespecie VI:sub especie indica

El smbolo V se reserva para los serotipos de S. bongori a fin de evitar confusiones con el nombre de serotipo de S. enterica subesp. entericaA su vez las subespecies de Salmonella enterica y la especie Salmonella bongori se dividen en ms de 2400 serovariedades, que estn definidas en funcin de diferentes asociaciones de factores antignicos somticos O y flagelares H.Dado que las serovariedades no tienen nivel taxonmico de especie, sus nombres, escapan al dominio del "Cdigo Internacional de Nomenclatura Bacteriana" y por ello deben escribirse en letra tipo romano, no en itlica, de la siguiente manera: Salmonella enterica subesp. enterica serovar Typhimurium; a los fines prcticos : Salmonella Typhimurium.Las serovariedades pertenecientes a las subespecies restantes y a Salmonella bongori, de baja incidencia en patologa humana o animal, se designan con el nombre de la subespecie, seguido de la frmula antignica, por ej: Salmonella subesp. IV 5O: b: - .Los nombres de las serovariedades estn condensados en el Esquema de Kauffinann-White, publicado por el "Centro Colaborador de la OMS de Referencia e Investigacin de Salmonella", del Instituto Pasteur de Pars.2. Principales caractersticas del Gnero SalmonellaLos miembros del gnero Salmonella son bacilos gram-negativos, de 0,7-1,5 x 2,0-5um, generalmente mviles por flagelos peritricos (excepto S. Gallinarum) lo cual las diferencia de Pseudomonas y Vibrio, son anaerobios facultativos, no esporulados. No fermentan la lactosa (excepto S. enterica subep. arizonae y & enterica subesp. diarizonae), fermentan glucosa con produccin de gas (excepto S. typh)\ no producen indol; no degradan urea; descarboxilan lisina y ornitina, producen hidrgeno sulfurado a partir del tiosulfato (fuente inorgnica de azufre).3. Caractersticas Moleculares De La Pared Celular (Antgenos O Y H)

La pared celular est constituida por una fina capa de peptidoglicano, recubierta por la membrana externa compuesta por el lipopolisacrido, que a su vez est dividido en tres fracciones. La fraccin interna o lipido A corresponde a la endotoxina y el polisacrido comprende las otras dos fracciones que se identifican con el antigeno O, termoestable: una fraccin central compuesta por oligosacridos y KDO (cido cetodesoximanulosoctnico), que al ser comn a la mayora de bacilos gramnegativos explica la existencia de reacciones cruzadas, y una fraccin externa constituida par cadenas terminales de oligosacridos, que son variables y responsables de la especificidad.Algunas especies pueden presentar antgenos superficiales o antgenos K, de naturaleza polisacrida, en forma de cpsulas bien definidas (. coli, Klebsiella) o de una fina capa mucosa (antgeno M o mucoide de Salmonella, antgeno Vi de S. typhi), que recubren el antgeno O.Intervienen en la accin patgena por sus propiedades antifagocitarias. Las cepas mviles presentan antgenos flagelados proteicos y termolbiles, de importancia en la clasificacin en serotipos.

4. Estructura Antignica de Salmonella typhi

Bsicamente la estructura antignica de Salmonella es similar a la de otras Enterobacterias, con dos clases de antgenos principales presentes; antgenos O (somticos) y antigenos H (flagelares). Salmonella typhi adems presenta un tercer tipo como antgeno de superficie, siendo anlogo funcionalmente a los antgenos K de otros gneros, ste antgeno se denomin antgeno Vi, acta como protector impidiendo la destruccin intracelular de la clula bacteriana y de ah su nombre Vi de virulencia.

d. Antgeno O (Somtico)

Este antgeno est localizado en la pared celular. La fraccin interna se encuentra asociada con la endotoxina (lpido A) y la fraccin externa o terminal es responsable de la especificidad serolgica.El antgeno somtico O, constituye la parte ms externa de la pared lipopolisacrida de la clula, nombrado as del alemn "Ohne hauch", que significa sin movimiento, est compuesto por complejos de fosfolpidos y polisacridos; su composicin es aproximadamente: 60% polisacridos, 20-30% lpidos y 3,5-4% hexosamina.Son cadenas laterales de polisacridos del lipopolisacrido de envoltura (LPS) que se encuentra en todos los microorganismos Gram negativos.La cadena de polisacridos del Ag O es un polmero de unidades repetidas de oligosacridos (de 3 a 5 azcares) lineales o ramificados. La naturaleza de los grupos terminales y el orden en que se encuentran las unidades repetidas de la cadena determina la especificidad antignica somtica de la bacteria.Este antgeno est localizado en la pared celular. La fraccin interna se encuentra asociada con la endotoxina (lpido A) y la fraccin externa o terminal es responsable de la especificidad serolgica.Como esta estructura difiere ampliamente entre las distintas serovariedades, hay diferencias en la especificidad antignica O.Estos antgenos son termoestables (resistentes al calor) y resistentes a cidos diluidos y alcohol y habitualmente se detectan mediante aglutinacin bacteriana.Por tratamiento de suspensiones vivas por el calor se destruye el antgeno H y Vi, y se obtienen suspensiones O puras, que en presencia del anticuerpo especfico producen una aglutinacin lenta y granular, que no se deshace por agitacin (aglutinacin somtica). Los anticuerpos contra el antgeno O aparecen luego de 6 a 8 das de iniciada la enfermedad y desaparecen posteriormente entre 3 y 6 meses. Los anticuerpos de los antgenos O son predominantemente Ig M.Por lo general, el antgeno O no es nico, sino que est constituido por diversos factores antignicos, algunos de los cuales pueden ser comunes con otros serotipos y permiten dividir las Salmonella en grupos O, por ejemplo, O: 9 y O: 12. La estructura somtica se denomina con la letra O seguida de nmeros arbigos separados por comas, por ej. S. typhimurium 0:1, 4, 5, 12; S. entertidis 0:1, 9, 12. Clasificacin del antgeno O Factores mayores, que identifican el grupo antignico O; por ej. El factor O: 4, el factor O: 9. Factores menores, que pueden ser: Los que tienen poco o ningn valor discriminativo porque siempre estn asociados a otro factor, por ej., 0:12 que siempre est asociado con 0:2, 0:4 y 0:9, como se presenta en S. paratyphi A O: 1, 2,12; S. typhimurium O: 1, 4, 5,12 y S. entertidis 0:1, 9,12 Los que surgen como consecuencia de una modificacin qumica de los Ags mayores; por ej. 0:5 resulta de la acetilacin de la abecuosa presente en las unidades repetidas del polisacrido responsable de la especificidad 0:4,12; 0:1 resulta de la insercin de un residuo de glucosa en la galactosa de la cadena de polisacrido, como es el caso de la serovariedad S. Typhimurium 0:1, 4, 5,12. Estos antgenos O son extremadamente txicos para los animales. Son denominados endotoxinas, debido a que estn unidas fuertemente a la superficie celular y slo son liberadas cuando las clulas son lisadas. Cuando estos lipopolisacridos se disgregan en sus dos fracciones, toda la toxicidad est asociada con el lpido. Es probable que la resistencia a la destruccin por el suero normal se deba a que los polisacridos del antgeno O actan como escudo protector del lpido A, activador del complemento y del ncleo polisacrido del LPS.e. Antgeno H (Flagelar)

El antgeno H es un antgeno termolbil, de naturaleza proteica, constituidos por una protena flagelina (su peso molecular oscila entre 30000 y 50000 Dalton), cuya composicin en aminocidos es constante para un tipo antignico determinado, contenido en los flagelos.Su nombre deriva igualmente del alemn "Hauch", por el halo producido en un medio de cultivo a raz del movimiento, es una protena termolbil (sensibles al calor) a diferencia del antgeno O.

El flagelo es una estructura compleja que consiste en un cuerpo basal, un segmento de unin ("hook") y un filamento. El cuerpo basal ancla el flagelo a la envoltura de la clula y el "hook" une el cuerpo basal con el filamento. En la serotipificacin flagelar de Salmonella se usa solamente la especificidad antignica del filamento.

El filamento est constituido por flagelina, protena de alto peso molecular. En Salmonella se han encontrado ms de 60 especificidades antignicas flagelares. Las diferencias antignicas surgen debido a variaciones en la estructura primaria (contenido en aminocidos y orden de ubicacin) de las distintas molculas de flagelina.Este antgeno se inactiva por el calor, alcohol y cidos; por el contrario, el tratamiento con formol conserva, fija los flagelos y se obtienen suspensiones de bacterias flageladas (S. typh), que aunque tambin contienen el antgeno O, por producirse la aglutinacin con el antgeno H ms rpidamente y a titulo ms elevado, se comportan como suspensiones flageladas puras. La aglutinacin flagelar es rpida, en forma de grumos grandes, blandos y algodonosos, que rpidamente se deshacen por agitacin.Estos antgenos H se aglutinan con anticuerpos H, principalmente Ig G. Los anticuerpos contra el antgeno H aparecen a los 8 a 12 das, alcanzando ttulos ms elevados con respecto a los anti-0 y pueden persistir por ms de 1 ao.El antgeno flagelar depende de dos genes estructurales H1 y H2, que corresponden a la fase 1 y a la fase 2. La mayora de las cepas del gnero Salmonella tienen los dos genes que codifican para los dos antgenos flagelares, pero se pueden expresar las dos especificidades de su antgeno H (difsicos), sin embargo, existen algunas que pueden expresar solamente una sola, ya sea la uno la dos (monofsicas).Son monofsicas, cuando contienen siempre el mismo antgeno flagelar, generalmente especfico (S. typh (9,12 [VI]:d:-), S. paratyphi A), y difsicas, cuando el antgeno flagelar puede presentarse alternativamente en fase especifica (fase 1), caracterstica del serotipo, o en fase menos especfica (fase 2), que puede, ser comn con otras Salmonella, por ej., Salmonella typhimurium (l,4,5,12:i:l,2) y Salmonella hadar (6,8:z10:e,n,x), que expresan la fase 1 (constituida en los ejemplos por los antgenos: i Zio ) y la fase 2 ( por los antgenos: 1,2 y e, n, x respectivamente).Cuando se asla una Salmonella en fase 2, generalmente es necesario proceder a una inversin de fase (Mtodo de Sven Gard) para reconocer el antgeno flagelar especifico y llegar a la identificacin del serotipo.El ADN invertible y el fenmeno de variacin de fase, comprenden la inversin de un segmento de DNA de una orientacin a la otra. Cuando el segmento est orientado en una direccin se expresa un gen particular, en tanto que cuando est orientado en la direccin opuesta, se expresa un gen distinto (Brock 1991).

"Mtodo de inversin de fase": El mtodo consiste en inmovilizar la fase flagelar que se expres, mediante el agregado del antisuero de fase correspondiente, de esta manera se permite la expresin de la otra fase flagelar.

f. Antgeno capsular o de envoltura(Vi)

El nico de este tipo que se conoce en Salmonella es el existente en S. typhi, S. paratyphi C y S. dublin. Es un antgeno capsular termolbil, polisacrido, constituido por cido N- acetilglucosaminournico; la presencia de este antgeno hace imposible la aglutinacin de sueros anti O. La expresin de este factor depende de al menos dos genes (ViA + ViB); deben existir ambos en la bacteria para que dicha expresin tenga lugar (Linder 1995).Por la adicin de un suero Vi se produce una aglutinacin lenta y granular ms fina que la O (aglutinacin Vi). Por tratamiento con el calor se destruye el antgeno Vi y la suspensin se hace aglutinable por un suero O. El antgeno Vi, junto con el O, es el responsable de la virulencia, y los anticuerpos Vi presentan poder protector. Estn asociados con la invasivdad y virulencia (le da cierta proteccin contra la acidez gstrica, permitiendo que inculos pequeos puedan producir enfermedad). No todas las S. typhi las poseen, algunas son Vi negativas. Confiere actividad antifagoctica, este antgeno interfiere con la oponizacin mediada por anticuerpos, aumenta la resistencia al perxido y confiere resistencia contra la lisis mediada por el complemento. En consecuencia, el antgeno Vi podra inhibir la fagocitosis de las salmonelas por parte de los neutrfilos sin interferir en la induccin de fagocitosis por parte de macrfagos y clulas epiteliales ms permisivas.Los anticuerpos contra el antgeno Vi aparecen ms tardamente, a la tercera semana, sin embargo lo hacen en ttulos bajos 1:10-1:20 con respecto a los anteriores. La vacuna de polisacrido capsular Vi purificado de Salmonella typhi presenta entre sus ventajas: la de provocar escasas reacciones adversas y de propiciar alta capacidad inmunognica y protectora con una sola dosis.

IV. MTODOS CUANTITATIVOS PARA UNA POBLACIN DE Salmonella3) MEDIDA DE MASA BACTERIANA.E. METODO INDIRECTO.

i. METODO TURBIDIMETRICO.La base comn de este mtodo consiste en la medicin de la cantidad de luz dispersada o transmitida a travs de un cultivo bacteriano.Las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que cualquier partcula pequea suspendida en agua (efecto Tyndall).La dispersin de la luz es, dentro de ciertos lmites, proporcional a la masa del cultivo. Cuantas ms clulas estn presentes, mayor ser la luz dispersada, y por lo tanto mayor ser la turbidez.Es un instrumento para medir partculas suspendidas en un lquido, es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo sensor est situado en ngulo recto respecto de la direccin de la luz incidente, y lo que se mide es pues, la luz dispersada directamente por la preparacin. Posee mayor sensibilidad que el espectrofotmetro.La utilidad de la escala es poder realizar suspensiones bacterianas ajustadas a un patrn. La finalidad, es establecer una relacin entre una precipitacin qumica y una suspensin bacteriana. Se trata de una serie de patrones de turbidez previamente calibrados, 10 estndares. Consiste en varios tubos de vidrio hermticamente cerrados que contienen 1% de Ba Cl2 + cantidades crecientes de H2 SO4 al 1%, por lo tanto en cada tubo se origina un precipitado de Ba SO4, el que da origen a la turbidez, esto servir para crear un recta patrn, de tal forma que se pueda detectar la concentracin de las diluciones bacterianas de manera aproximada, ya que depende de factores como el tamao de la bacteria.

TUBOCl2Ba1%SO4H21%u.f.c/ml

10,19,93,0x108

20,29,86,0x108

30,39,79,0x108

40,49,61,2x109

50,59,51,5x109

60,69,41,8x109

70,79,32,1x109

80,89,22,4x109

90,99,12.7x109

101,09,03,0x109

4) MEDIDA DEL NUMERO DE INDIVIDUOS.

F. METODOS INDIRECTOS.

RECUENTO DE VIABLES EN PLACA.

Es un mtodo de recuento de clulas viables (Clula viable es aquella capaz de dividirse y originar descendencia). Se cuentan las clulas de una muestra que son capaces de formar colonias cuando se inoculan en un medio de cultivo solido adecuado.Hay dos modalidades de siembra:1. En su superficie (siembra por extensin): Un volumen de la muestra (0.1 ml) se coloca sobre la superficie de la placa que contiene el medio y se extiende con ayuda de asa de extensin.2. En profundidad (siembra por vertido en placa): L a muestra se mezcla con el medio de cultivo y se vierte en la placa estril. Permite inocular volmenes mayores de la muestra.En la mayora de los casos antes de realizar la siembra las muestras tienen que diluirse (diluciones seriadas) Unas vez inoculadas las placas se incuben a la temperatura adecuada y cuando aparecen, se cuentan las colonias. Normalmente, una clula origina una colonia, pero con el fin de evitar errores a la hora de dar el resultado se suele hablar de Unidades Formadoras de Colonias (UFC), en lugar de clulas. El resultado se expresa como UFC/ml.G. MTODOS DE SIEMBRA

En el mtodo de extensin en placa Un cierto volumen de cultivo diluido, que no suele ser superior a 0.1 ml, se extiende sobre la superficie de una placa con medio slido utilizando una asa estril de extensin. La placa se incuba despus hasta que aparecen las colonias y se cuenta su nmero. Para esto es importante que la superficie del medio este seca, de modo que el lquido de la muestra se pueda absorber. No se suelen usar volmenes mayores de 0,1 ml porque el exceso de lquido no es absorbido, y puede ser la causa de que las colonias se unan al formarse, dificultando su recuento. En el mtodo del vertido en placa o mtodo de vaciado en placa Se pipetea un volumen conocido (normalmente 0,1-1,0 ml) de cultivo en una placa petri estril. Sobre la que se aade el medio con agar fundido y se mezcla bien mediante un suave movimiento giratorio de la placa sobre la superficie de la mesa, antes de dejar que se solidifique. Como la muestra se mezcla con el medio fundido, se pueden usar volmenes de inoculo mayores que en el mtodo de recuento por extensin. Sin embargo, para poder hacer uso de este mtodo, el organismo que se cuenta debe ser capaz de resistir brevemente la temperatura del agar fundido a 45C, sin perder su viabilidad.

H. DILUCIONES SERIADAS DE LAS SUSPENSIONES CELULARES ANTES DE LA SIEMBRA EN LA PLACAEn los mtodos anteriormente mencionados, es importante que el nmero de colonias que aparezcan en las placas no sea demasiado grande, ya que en placas muy atestadas algunas colonias se podran fusionar, provocando clculos errneos. Tambin es importante que el nmero de colonias no sea demasiado bajo para que el clculo sea estadsticamente significativo. En la prctica, el nmero de colonias por placa oscila entre 30 y 300. Para obtener el nmero apropiado de colonias casi siempre se diluye la muestra. Como raramente se sabe de antemano el nmero de clulas viables, normalmente se hace ms de una dilucin. Es comn usar varias diluciones decimales de la muestra. Para hacer una dilucin de 10-1 se mezclan 0,5 ml de la muestra con 4,5 ml de diluyente o 1 ml de la muestra con 9 ml del diluyente. Si se necesita una dilucin de 10-2, se puede mezclar 0,05 ml de la muestra con 4,95 ml del diluyente o 0,1 ml con 9,9 ml. Por otra parte, una dilucin 10-2 se puede hacer de modo seriado haciendo sucesivamente dos diluciones de tipo 10-1. En la mayora de casos se realizan dichas diluciones seriadas para alcanzar la dilucin final que se desea, por ejemplo si se requiere una dilucin 10-6, se puede lograr haciendo tres diluciones sucesivas de 10-2 o seis sucesivas de 10-1. El lquido usado para hacer las diluciones es importante y lo mejor es que sea idntico al lquido utilizado para preparar el medio solidificado, aunque por economa, es posible usar soluciones estriles de sales inorgnicas o un amortiguador de fosfatos.

Cuando se hacen diluciones es importante que se utilice una pipeta diferente para cada dilucin, aun cuando sea de la misma muestra.

Fuentes de error en el Recuento en PlacaEl nmero de colonias que se obtiene en una determinacin de viables no solo depende del tamao del inculo, sino tambin: De lo adecuado que sea el medio de cultivo De las condiciones de incubacin, De la duracin de la incubacin. Las clulas depositadas en la placa no se desarrollaran todas en colonias a la misma velocidad, y si se emplea un corto tiempo de incubacin, se obtendrn menos colonias de las posibles. El tamao de las colonias no siempre es el mismo, y si se desarrollan colonias muy pequeas pueden pasar desapercibidas en el recuento. Es habitual establecer las condiciones de incubacin (medio, temperatura y tiempo) que permitan obtener el mayor nmero de colonias para un determinado organismo y usar luego estas mismas condiciones. La determinacin de viables puede estar sujeta a grandes errores, y si se desean recuentos precisos, se deben hacer con cuidado, y hacer las placas de las diluciones por duplicado. Una agrupacin de dos o ms clulas solo producir una colonia, de modo que el recuento de viables ser errneamente menor. El recuento de viables se expresa a menudo como unidades formadoras de colonias obtenidas, ms que como nmero de clulas viables (ya que una unidad formadora de colonias pudo originarse a partir de una o ms clulas inciales).Pese a estas dificultades el recuento de viables suministra buena informacin sobre el nmero de clulas viables y este procedimiento se usa ampliamente.

Anomala del Recuento en Placa A pesar de ser una tcnica muy sensible, el recuento en placa puede ser irrealizable cuando se trata del recuento de muestras naturales, tales como suelo, o agua. El recuento directo en muestras naturales suele dar un nmero mucho mayor de organismos que los que se obtienen en cultivo en placas de cualquier tipo de medio de cultivo, algunos microbilogos se refieren a este hecho como la gran anomala del recuento en placa, pero por qu los recuentos en placa dan menores nmeros de clulas que los recuentos directos al microscopio? Esto se debe a una combinacin de factores: El hecho de que los mtodos microscpicos cuentan clulas muertas, mientras que los mtodos de viables no. El hecho de que diferentes organismos, incluso en una muestra muy pequea, tienen ciertos requerimientos nutricionales y de cultivo muy diversos. Por lo tanto, aunque los recuentos en placa especficos con medios altamente selectivos, como el anlisis microbiano de aguas residuales o de alimentos, puede dar resultados fiables, los recuentos del nmero total de clulas, pueden ser subestimados en varios rdenes de magnitud.

VENTAJAS DEL MTODODESVENTAJAS DEL MTODO

Su gran sensibilidad. Si se utiliza un medio y unas condiciones de incubacin adecuadas, puede detectarse incluso una nica clula viva.No mide el nmero total de clulas sino nicamente las viables.

No requiere un equipo complicado.Es lento, tedioso y no es preciso, porque la precisin depende del recuento de un nmero elevado de colonias.

I. NMERO MS PROBABLE (NMP)El mtodo del nmero ms probable (NMP), al igual que el mtodo de recuento en placa, nos proporciona un recuento de viables. Se basa en el principio de que una nica clula viva puede desarrollarse y producir un cultivo turbio. El NMP requiere la realizacin de una serie de diluciones seriadas al dcimo de la muestra de cultivo, en un medio lquido adecuado para el crecimiento de dicho organismo. Posteriormente, se incuban las muestras de dichos tubos problema. Una vez que ha pasado suficiente tiempo como para que crezca el microorganismo, se examinan los tubos. Aquellos tubos que fueron inoculados con una o ms clulas microbianas a partir de la muestra, se pondrn turbios, mientras que los tubos que no recibieron ninguna clula permanecern transparentes. A medida que se aumenta el factor de dilucin, se alcanzar un punto en el cual algunos tubos contendrn tan slo un organismo y otros, ninguno. Al determinar la probabilidad de que los tubos no recibieran ninguna clula, se puede determinar el nmero ms probable de microorganismos presentes en la muestra original, utilizando para ello una tabla estadstica.La precisin del nmero ms probable aumenta con el nmero de tubos que se usan, aunque cinco tubos por dilucin se consideran como una relacin apropiada entre la precisin y la economa.El mtodo del NMP se utiliza para contar microorganismos que son difciles de cultivar en medio slido. Tambin se usa para determinar el nmero de clulas de un cultivo mixto que pueden crecer en un medio lquido determinado.Por ejemplo, puede emplearse para determinar la contaminacin del agua potable, determinando el nmero de bacterias que pueden crecer en un medio que contiene lactosa. Estas bacterias probablemente sean Escherichia coli provenientes de aguas residuales contaminadas, y la presencia de E. coli en el agua potable es una prueba presuntiva de contaminacin.

El mtodo del nmero ms probable (NMP) proporciona un recuento de viables. Al aumentar el factor de dilucin, se alcanza un punto en el que algunos tubos contienen slo un organismo y los otros, ninguno. A partir del nmero, determinado por los tubos que presentan turbidez en tres diluciones sucesivas (en este caso 5, 3, 1), puede determinarse el nmero ms probable de clulas estadsticamente (11,0) en la primera de las tres diluciones, mediante una tabla de nmeros ms probables. Este valor, multiplicado por el factor de dilucin nos proporciona el nmero de clulas viables de la muestra.

CALCULOS: Factor de dilucin (primero usado) x NMP (tabla anterior) = n clulas/ ml

V. BASES TERICAS PARA LA OBTENCIN DE ANTGENOS O Y H

C. OBTENCIN DEL ANTGENO O

Para obtener el antgeno O es necesario que la cepa de Salmonella typhi est en forma lisa, para ello hay que sembrar la cepa en un vial con agar TSA a 37C por 12-16 horas (cepa madre). El antgeno O se encuentra en las cepas L ms no en las R, por ello debemos asegurarnos que se mantengan en la forma L. Conviene que las suspensiones microbianas a preparar sean procedentes de cultivos en medios slidos, pues la transicin de las formas L a R es menos manifiesta en estos medios. Para verificar que el cultivo se encuentre en forma lisa: Mezclar una ansada de cultivo puro mezcla con una gota de solucin salina fisiolgica estril al 2%, cuidadosamente con un palillo. Rotar suavemente la lmina, durante 2 minutos. Observar la presencia o ausencia de grumos: Si hay grumos la cepa est rugosa. Si no presenta grumos se realiza la serotipificacin somtica O (es decir la cepa es lisa).

Para revertir la rugosidad se debe realizar subcultivos de la cepa en agar sangre o en agar Meller Hinton, para recuperar la forma lisa y poder continuar con la Serotipificacin somtica O.Si no es posible la reversin de la forma rugosa a la lisa, se debe confirmar su identificacin bioqumica y realizar la Serotipificacin flagelar H.

Cuando se comprueba que la cepa es lisa se procede a inactivar el microorganismo a travs de mtodos fsicos y mtodos qumicos:i. Mtodo Fsico: Temperatura

La suspensin bacteriana se coloca en bao Mara a 100/30 minutos, realizando as el tratamiento trmico para inactivar a la bacteria desnaturalizando flagelina de antgeno H, dejando solo antgeno O, por ser termoestable. Por tratamiento de suspensiones vivas, por el calor se destruye el antgeno H y Vi, y se obtienen suspensiones O puras, que en presencia del anticuerpo especfico producen ii. Mtodo Qumico: Fenol

Estos antgenos son resistentes a cidos diluidos y alcohol (mata a las bacterias y suelta a los flagelos) y habitualmente se detectan mediante aglutinacin bacteriana. Los anticuerpos de los antgenos O son predominantemente Ig M.Al aadir a la suspensin bacteriana SSFF con 0.5-1% de fenol, mantenindolo a 20C por 12 horas; esto matar a la bacteria y el fenol actuar a nivel de ligando como hapteno del Ag O (adyuvante). Realizar la prueba de viabilidad con la finalidad de comprobar que no hay crecimiento de la bacteria y poder decir que la bacteria ha sido inactivada correctamente, para ello hay que sembrar 0.1ml de la suspensin sometida al tratamiento trmico en agar SS e incubar. Si no existe crecimiento entonces tenemos el antgeno O el cual se puede conservar en refrigeracin a 4 C hasta su utilizacin.

D. OBTENCIN DEL ANTGENO H

Para obtener el antgeno H hay que sembrar la cepa en agar TSA a 37C por 8-12 horas (cepa madre), el aislamiento debe estar en forma lisa.Realizar una dilucin de la suspensin bacteriana agregando 0.5ml de solucin salina fisiolgica estril y comparar la turbidez del cultivo con el tubo N3 (9x108 m.o. /ml) del nefelmetro de Mc Farland.Realizar coloracin de flagelos para confirmar la presencia del antgeno H.Proceder a inactivar el microorganismo a travs de mtodos fsicos y qumicos:Este antgeno se inactiva por el calor, alcohol y cidos.

a) Mtodos Fsicos: Temperatura

El antgeno H es un antgeno termolbil, sensible al calor a diferencia del antgeno O. Sin embargo este antgeno se puede obtener utilizando una temperatura de 50C 60C por 510 minutos.b) Mtodo Qumico: Formol o formalina

El tratamiento con formol conserva, fija los flagelos debido a que poseen protenas resistentes al formaldehido y se obtienen suspensiones de bacterias flageladas (S. typhi), que aunque tambin contienen el antgeno O, por producirse la aglutinacin con el antgeno H ms rpidamente y a ttulo ms elevado, se comportan como suspensiones flageladas puras. Estos antgenos H se aglutinan con anticuerpos H, principalmente Ig G.La aglutinacin flagelar es rpida, en forma de grumos grandes, blandos y algodonosos, que rpidamente se deshacen por agitacin. Es por ello que una sustancia adecuada para la obtencin del antgeno H es formalina con una concentracin de 0.3%. En la preparacin de vacunas se utiliza una concentracin de 0.2% y para la conservacin de toxoide en un 0.4% de formalina.Para realizar el tratamiento qumico; hay que agregar de formol o formalina al 0.2% y dejar por un periodo de 24 horas, el formol fija flagelos e inactiva a la bacteria; este compuesto desnaturaliza las protenas al reaccionar con los grupos aminos.Realizar la prueba de viabilidad con la finalidad de comprobar que no hay crecimiento de la bacteria y poder decir que la bacteria ha sido inactivada correctamente, para ello hay que sembrar 0.1ml de la suspensin sometida al tratamiento con formol en agar SS e incubar. Si no existe crecimiento entonces tenemos el antgeno H.

VI. FENMENOS DE VARIACIN QUE AFECTAN LA SEROTIPIFICACIN Para una correcta Serotipificacin de Salmonella sp. Es necesario entender y conocer los fenmenos de variaciones somticas y flagelares que pueden ocurrir.a) Variaciones somticas

a. Variacin S - R (Lisa - Rugosa) Es debido a una mutacin que elimina las cadenas laterales del core del polisacrido. No es una variacin abrupta, por el contrario ocurre gradualmente y existen grados intermedios de rugosidad en la transicin de la forma lisa(S) a la rugosa(R). Los cultivos R dan colonias rugosas de borde irregular, con tendencia a producir desarrollo granular en caldo y auto aglutinan cuando se las enfrenta con solucin salina al 2%, es decir no son serotipificables. En el laboratorio para revertir una cepa de la forma R a la forma S, se realizan subcultivos sucesivos de la mismas en medios de enriquecimiento (agar sangre o agar Meller Hinton). Una cepa que se encuentre en la fase rugosa, debe ser reaislada a fin de tratar de identificar colonias lisas. Si no es posible revertir la rugosidad, se debe confirmar la identificacin por pruebas bioqumicas y realizar la serotipificacin flagelar H. Cuando la cepa es rugosa se informa como O: Rugosa, acompaada de la frmula del antgeno flagelar que corresponda. Variacin no fimbriada - fimbriada

Adems de los flagelos, las bacterias pueden producir otras estructuras filamentosas, llamadas fimbrias, ms finas y cortas, localizadas en la superficie de la bacteria en nmero de 100 a 250 por clula. Se encontr que en los cultivos fimbriados se pueden producir variaciones entre formas fimbriadas y no fimbriadas. Algunos cultivos de Salmonella que poseen fimbrias pueden inhibir la aglutinacin somtica.b) Variaciones flagelares

b. Variacin OH - O Se debe a la prdida de los flagelos, o sea que una cepa mvil se transforma en inmvil. Esto ocurre por una mutacin o por una prdida de los genes responsables de la sntesis de la flagelina. Este fenmeno se observa con relativa frecuencia en el gnero Salmonella.

VII. PROCESAMIENTO DEL MICROORGANISMO, INOCULACIN Y OBTENCIN DE ANTISUEROS O Y H

a. Procesamiento del microorganismoEn primer lugar se debe aislar el microorganismo a partir de muestras (heces o alimentos) diluidas, para luego sembrar en una placa con agar Salmonella-Shigella e identificar a travs de pruebas bioqumicas (Pruebas de IMVIC, TSI, LIA, prueba de ureasa, prueba de reduccin de nitratos) Salmonella typhi.

Determinar cuantitativamente la poblacin de Salmonella, comparando la turbidez de la suspensin bacteriana con el tubo N3 (9x108 m.o./ml); del nefelmetro de Mc Farland (Mtodo Nefelomtrico), siendo ste un valor estndar debido a su relativa proximidad con el nmero de microorganismos capaces de causar septicemia y muerte en el animal de laboratorio.

b. Obtencin de los antgenos O y H:Antgeno O: Empleando el mtodo fsico (Bao Mara a 100/30 minutos).Antgeno H: A travs del mtodo qumico (Tratamiento con formol al 0.3%), previo a esto realizar la coloracin para flagelos.Luego realizar la prueba de viabilidad.

Determinar anticuerpos basales para saber si el cobayo ha estado en contacto con el microorganismo.c. Inoculacin del microorganismoVa de inoculacin: Intraperitoneal, es una zona rica en ndulos linfoides y ganglios asociados a las mucosas; esta va se elige tomando en cuenta la rpida absorcin y el fcil acceso a la misma, es una de las vas ms utilizadas en el laboratorio. Una vez obtenido la suspensin con la bacteria inactivada (Ag O o Ag H), procedemos a inocularla en el animal de experimentacin, previamente desinfectar la zona a inocular. 1 Inoculacin: 0.5ml, esperar 4 das. 2 Inoculacin: 1.0ml, esperar 4 das ms. 3 Inoculacin: 2.0ml, esperar 4 das ms. 4 Inoculacin: 4.0mlAl terminar la cuarta inoculacin; dejar reposar el cobayo por 6 das.Determinacin de anticuerpos anti O y anti H post-inoculacin.

d. Obtencin de antisueros O y HTitulacin de anticuerposEl ttulo de anticuerpos puede medirse mediante aglutinacin, precipitacin, enzimoinmunoanlisis (ELISA), mtodos de inmovilizacin o radioinmunoensayo (RIA), dependiendo de la situacin.

La tcnica general consiste en establecer una serie de diluciones del suero (habitualmente diluciones al doble) y determinar la dilucin mxima a la que se produce la reaccin antgeno anticuerpo. Estos mtodos se denominan test serolgicos porque todos ellos utilizan suero. En primer lugar obtener sangre del cobayo por puncin cardiaca, para obtener el suero evitando la hemlisis.

e. Mtodo de Titulacin en Tubo

Mezclar bien la suspensin de antgenos mediante agitacin suave y preparar una dilucin 1:20 de cada uno de los antgenos a utilizar, en solucin salina. En una gradilla colocar 6 tubos de dilucin; para cada antgeno a probar, marcndolos del 1 al 5 y el tubo 6 como control. Aadir al tubo 1; 1.8ml de solucin salina fisiolgica estril y 1ml a los 5 tubos restantes. Aadir 0.2ml del suero a probar al tubo nmero 1, mezcle bien y transfiera 1ml al tubo nmero 2. Continuar esta operacin hasta el tubo nmero 5, eliminar 1ml de esta dilucin. El tubo 6 (Control negativo) tendr nicamente solucin salina, obtenindose diluciones 1/10, 1/20, 1/40, 1/80 y 1/160. Hacer para cada suspensin de antgenos bacterianos, la galera siguiente junto con las diluciones del suero (en ml):

Diluciones del suero1/101/201/401/801/160Testigo antgeno

Suero diluido 0.10.10.10.10.1--

Sol. Salina----------0.1

Suspensin de Ag.0.90.90.90.90.90.9

Dilucin final1/1001/2001/4001/8001/160--

Agitar bien la gradilla para mezclar el antgeno y el suero e incubar en bao de agua. El tiempo y temperatura recomendado es el siguiente.

Antgeno TemperaturaTiempo de Incubacin

Tfico OT ambiente18-24 horas

Tfico H37C2 horas

Despus de la incubacin, sacar la gradilla que contiene los tubos y observar la aglutinacin. La utilizacin de una fuente de luz directa contra un fondo negro dar mejores condiciones para la lectura. Para determinar la presencia de antgeno H se debe registrar la presencia o ausencia de flculos con luz indirecta. La aglutinacin flagelar tiene una apariencia flocular, menos compacta que la aglutinacin somtica. Su estructura tridimensional no es estable, por lo tanto no se deben agitar los tubos luego de la incubacin a fin de no disgregar los flculos. Registrar los resultados como sigue: 4+: Todos los microorganismos 100% aparecen sedimentados en el fondo del tubo y el sobrenadante es totalmente claro. 3+: Aproximadamente el 75% de los microorganismos se encuentran sedimentados y el sobrenadante es ligeramente turbio. 2+: Aproximadamente el 50% de los microorganismos se encuentran sedimentados y el sobrenadante es moderadamente turbio. 1+: Aproximadamente el 25% de los microorganismos se encuentran sedimentados y el sobrenadante es turbio. Negativo: No se observa aglutinacin y la suspensin es turbia.

Para las investigaciones epidemiolgicas detalladas es necesario identificar las cepas, y tales investigaciones han descansado tradicionalmente en mtodos bioqumicos y serolgicos, en el fagotipado de algunos serotipos y en los antibiogramas. En los ltimos aos se ha utilizado con xito el anlisis genotpico de los microorganismos mediante la determinacin molecular de las huellas del ADN.

Los anlisis del perfil de plsmidos suponen un mtodo rpido y relativamente fcil para caracterizar cepas, y se han empleado para estudiar la dispersin de Salmonella tanto en medicina humana como veterinaria. Esta tcnica presenta limitaciones, pues no todas las cepas de Salmonella presentan plsmidos, y los plsmidos se pueden adquirir con facilidad o ser de un tamao similar pero genticamente diferentes

Para suplementar los estudios del perfil de los plsmidos se han utilizado otras tcnicas genticas alternativas, como la electroforesis en gel de campo pulsante o el ribotipado. El genotipado es un campo de trabajo en expansin y, en los ltimos aos se han desarrollado muchos mtodos nuevos. Debe tenerse en cuenta que un nico mtodo puede no servir para todos los aislamientos y que puede ser necesario evaluar diferentes tcnicas hasta encontrar un mtodo o combinacin de mtodos que resulte satisfactorio y capaz de diferenciar clones de un serotipo o fagotipo particular.

El aislamiento de salmonelas y su posterior identificacin depende no slo de la calidad de la muestra sino tambin del medio de cultivo y de las caractersticas de crecimiento del serotipo, particularmente, en aquellos casos en que estn adaptados a una especie hospedadora.

REACCIONES FEBRILES

Determina y cuantifica a travs de pruebas serolgicas, los ttulos de anticuerpos contra antgenos bacterianos para evaluar la presencia de enfermedades como fiebre tifoidea, brucelosis, entre otras; que se caracterizan por provocar en el paciente un sndrome febril

REACTIVOS: Un equipo para Reacciones Febriles que contiene los siguientes antgenos:

Esta prueba representa un mtodo de laboratorio til para seguir la secuencia de ciertas infecciones con acceso febril, causadas por bacterias. Son reacciones de aglutinacin entre los antgenos de Salmonella, Brucella y Proteus y los anticuerpos contra estos antgenos presentes en el suero del paciente.

1- Reaccin de Widal para diagnstico de la fiebre tifoidea, entrica y ondulante.La reaccin mide el ttulo de anticuerpos (aglutininas) en el suero contra una suspensin de antgenos conocidos de Salmonella typi, S.paratyphi A y S.paratyphi B.2.- Reaccin de Huddleson para la brucelosis (Brucella abortus, B.suis o B. melitensis).3.- Reaccin de Weil-Felix para el tifo. Las especies de Rickettsias que causan tifo, tienen componentes antignicos idnticos a Proteus (cepas OX-19, OX-2 y OXK).

REACCION DE VIDALLa reaccin de Widal es un test basado en el principio de aglutinacin antgeno-anticuerpo, donde se determina la presencia de anticuerpos contra el antgeno O y H de la Salmonella typhi para el serodiagnstico de fiebre tifoidea, sin embargo debido a su falta de especificidad, debe ser interpretado en el contexto clnico del paciente. Para considerar el diagnstico de fiebre tifoidea con un ttulo Anti-O y Anti-H aislado, se debe conocer su prevalencia en una determinada comunidad, en trminos generales, se acepta ttulos anti-O y anti-H 1: 160-200 y 1: 50-100 en zonas endmicas y no endmicas, respectivamente.

VIII. CONCLUSIONES: Por lo tanto, puedo concluir que dentro de los mtodos de recuento los recuentos en placa son especficos con medios altamente selectivos, como el anlisis microbiano de aguas residuales o de alimentos, puede dar resultados fiables, los recuentos del nmero total de clulas, pueden ser subestimados en varios rdenes de magnitud. Salmonella typhi en su estructura antignica presenta el antgeno 0 antgeno HIX. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.

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Manual de procedimientos para la caracterizacin de salmonellahttp://www.cdc.gov/ncidod/dbmd/gss/publications/documents/argentina-leveli/manual_procedimientos_salmonella.pdf

catedra: ppbb31