producción biotecnológica de biodiésel a partir de...

Universidad de Costa Rica Facultad de Ciencias Escuela de Química

"Producción biotecnológica de biodiésel a partir de rastrojo de piña"

Trabajo Final de Graduación presentado como requisito para optar por el grado de Licenciatura en Química

Anthony Marchena Mora

Ciudad Universitaria Rodrigo Facio

San Pedro. Montes de Oca

2019

El presente Trabajo Final de Graduación ha sido aceptado por la Escuela de Química de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Costa Rica, como requisito parcial para optar por el grado de Licenciatura en Química

:::¡if~t-1 (,¡ i ( \ M.Sc. Paola Fuentes & Í1weizer

Directora de Tesis

'

-~/( , ' Dr. Carlos León Rojas

Asesor de Tesis

aja García Asesora de Tesis

~ ~~/ Ph.D- . -C-n-.s~rb1-p-h-er Camacho Leandro

Miembro del Tribunal

B.Q. Anthony Marchena Mora Postulante

¡¡

Índice

Portada .................................................................................................................................................... i

Hoja de aprobación ............................................................................................................................... .ii

Índice .................................................................................................................................................... iii

Agradecimientos ................................................................................................................................... vi

Lista de cuadros ................................................................................................................................... vii

Lista de figuras ................................................................................................................................... viii

Lista de ilustraciones .............................................................................................................................. x

Lista de abreviaturas ......... .................................................................................................................... xi

Resumen ............................................................................................................................................... 12

Justificación .................. ...... ................................................................. ..... .. ......................................... 13

Capítulo 1 ............................................................................................................................................. 17

Estado de la cuestión ............................................................................................................................ 1 7

1.1. Biodiésel ................................................................................................................................ 17

1.1.1. Aspectos generales ......................................................................................................... 1 7

1.1.2. Especificaciones del biodiésel ....................................................................................... 19

1.1.3. Proceso de obtención de biodiésel ........................................ ............ ............................. 22

1.1.4. Catalizadores y mecanismo de reacción . ....................................................................... 24

1.1.5. Biodegrabilidad del biodiésel ........................................................................................ 26

1.1.6. Biomasa en la producción de biodiésel. ......................................................................... 28

1.1.6.1. Piña .............................................................................................................................. 28

1.1 . 7. Pretratamiento ................................................................................................................ 29

1.2. Situación energética a nivel mundial .................................................................................... 31

1.3. Situación energética de Costa Rica ....................................................................................... 33

Capítulo 2 ......................... .................................................................................................................... 35

Sección experimental ..... .... ................................................................................................................ 3 5

2.1. Tratamiento de la biomasa .................................................................................................... 36

2.1.1. Pretratamiento de la fracción sólida de la ñonga ........................................................... 36

2.1 .1.1. Equipo y materiales ...................................................................................................... 36

2.1.1.2. Procedimiento .................. .... ........................................................................................ 3 7

¡¡¡

2.1.2. Cosecha del hidrolizado y preparación del medio de cultivo ........................................ 37

2.1.2.1. Equipo y materiales ...................................................................................................... 38

2.1.2.2. Procedimiento .............................................................................................................. 38

2.1.3. Preparación de la suspensión de esporas ....................................................................... 39

2.1.3.1. Equipos y materiales .................................................................................................... 39

2.1.3.2. Procedimiento .............................................................................................................. 39

2.1.4. Preparación de la semilla, fermentación y análisis de azúcares en la fermentación ...... 40

2.1.4.1. Equipos materiales ....................................................................................................... 40

2.1.4.2. Procedimiento .............................................................................................................. 40

2.1.5. Cosecha de la biomasa del hongo .................................................................................. 41


2.1.5.2. Procedimiento .............................................................................................................. 42

2.2. Extracción de lípidos ............................................................................................................. 43

2.2.1. Equipo y materiales ........................................................................................................ 43

2.2.2. Procedimiento ................................................................................................................ 43

2.2.3. Cromatografia de capa fina y en columna .................................................................... .44

2.3. Transesterificación ................................................................................................................ 44


2.3.2. Procedimiento ................................................................................................................ 45

2.4. Purificación ........................................................................................................................... 45


2.4.2. Procedimiento ................................................................................................................ 46

2.4.2.1. Separación de glicerina y eliminación de agua ........................................................... .46

2.5. Caracterización (UNE-EN-14103, 2013)(Fuentes & Monge, 2015) .................................... 47


2.5.2. Procedimiento ................................................................................................................ 47

2.6. Pruebas de calidad ................................................................................................................. 48

2.6.1. Determinación de glicerina libre y total (D6584-00, 2014)(Fuentes & Monge, 2015) .48


2.6.1.2. Procedimiento .............................................................................................................. 49

2.6.2. Determinación del porcentaje de agua (ASTM D6304, 2016) ...................................... 49


2.6.2.2. Procedimiento .............................................................................................................. 50

iv

2.6.3. Determinación de Ja estabilidad a la oxidación (UNE-EN-14112, 2003) ..................... 50


2.6.3.2. Procedimiento .............................................................................................................. 51

Capítulo 3 ............................................................................................................................................. 52

Resultados y discusión ......................................................................................................................... 52

3.1. Prensado del sólido e hidrólisis enzimática ........................................................................... 52

3.2. Fermentación ......................................................................................................................... 54

3.3. Extracción de lípidos ............................................................................................................. 57

3.4. Proceso de esterificación ....................................................................................................... 58

3.4.J. Acidezyhumedad .......................................................................................................... 58

3.5. Purificación ........................................................................................................................... 61

3.6. Caracterización ...................................................................................................................... 65

3. 7. Parámetros de calidad ............................................................................................................ 68

3. 7 .1. Glicerina ......................................................................................................................... 69

3.7.2. Contenido de agua .......................................................................................................... 70

3.7.3. Estabilidad de oxidación ............................................................................................... 71

Capítulo 4 ............................................................................................................................................. 72

Conclusiones ........................................................................................................................................ 72

Recomendaciones ................................................................................................................................ 73

Capítulo 5 ............................................................................................................................................. 74

Bibliografía .......................................................................................................................................... 74

Capítulo 6 ............................................................................................................................................. 81

Anexos ................................................................................................................................................. 81

Apartado l. ........................................................................................................................................... 81

Apartado 11 ........................................................................................................................................... 82

Apartado 111. ......................................................................................................................................... 83

Apartado IV ......................................................................................................................................... 85

V

Agradecimientos

En primera instancia, a mi mamá, mi hermana, mi tío, mi abuela, mi abuelo ( q.e.d.p ), mi primo, por

todo el apoyo constante e incondicional durante todo mi proceso educativo. Por brindarme educación

y todo lo necesario en mi vida, por siempre estar presentes, cuando los necesito. Sin ellos, no podría

ser Ja persona que soy hoy en día.

A mi directora de tesis Paola Fuentes S, por toda su dedicación y su guía, por brindarme los

conocimientos necesarios para terminar este proyecto de investigación. Por siempre estar pendiente

del avance del proyecto y disponible ante cualquier duda sobre el proyecto. Por permitirme ser parte

de este proyecto.

A mi asesora María Elena Sibaja, por siempre estar anuente ayudarme en lo que necesitara, porque

siempre que le solicité ayuda, ella estuvo ahí para colaborarme, y, además, por todos los conocimientos

que me brindó durante mi etapa de asistente en el CELEQ, los cuales fueron pieza clave para terminar

este proyecto.

A mi asesor Carlos León, por permitirme realizar este proyecto en el Centro de Investigaciones en

Electroquímica y Energía Química.

A todo el personal de laboratorio del Centro de Investigaciones Agronómicas, especialmente a Mariana

Murillo, por ayudarme durante el desarrollo de este proyecto.

A las profesoras Irene Jiménez y Susana Rodríguez, por los conocimientos que me brindaron durante

los cursos de química analítica, tanto como estudiante como asistente, Jos cuales fueron de suma

importancia para mi educación, para Ja realización de este proyecto y para mi vida profesional.

A Martín e Ignacio de la sección de química analítica, por prestarme el equipo necesario para realizar

el proceso de transesterificación. A don Giovanni del laboratorio de química de alimentos de la Escuela

de Tecnología de Alimentos, por prestarme el equipo necesario para realizar Ja extracción de lípidos.

A todos mis profesores de Ja Universidad de Costa Rica, por su dedicación, por formarme como

profesional.

A todos, muchas gracias.

vi

Lista de cuadros

Cuadro l. Ventajas de la producción de biodiésel (Avellaneda, 20 l 0) .............. ..... ......... .................... 18 Cuadro 11. Especificaciones de la calidad del biodiésel. Obtenido de (Flores, Gallegos, Morales, & Morales, 20 l 7b ) .. ........... ... ........... ..................................... ........................... .... ...... .. .. .. ...... ....... ...... ..... 21 Cuadro III. Composición química de una muestra de rastrojo de piña. (Irías & Lutz, 2014) .. .... ..... .. 29 Cuadro IV. Nutrientes necesarios para preparar el medio de cultivo ...... ..... .. .......... ...... ... ...... .. .......... 38 Cuadro V. Características Fisicoquímicas de la planta entera de piña ... ... ....................... .. ... ....... ...... 52 Cuadro VI. Rendimientos de las hidrólisis realizadas para la obtención de biodiésel. ... ... ..... .. ... ....... 53 Cuadro VII. Contenido de Fames obtenido para dos sistemas de disolventes estudiados .. ... .. ............ 65

Cuadro VIII. Contenido de Fames utilizando una preesterificación como fase previa a la transesterificación. La extracción se realizó utilizando cloroformo y agua como disolventes . ........... 66 Cuadro IX. Contenido de Fames utilizando como fase previa una purificación en columna .............. 66 Cuadro X. Resultados de los análisis de calidad del biodiésel de rastrojo de piña .... ... ... .. ... ............... 68 Cuadro XI. Tiempos de retención relativos para la identificación de picos en la muestra de biodiésel. ... .... ..... ...... ... .. .. ...... ... ... ... .... .... ...... ..... ......... ..... .. ..... .... ... .. ... ... ....... ............ ...... .. ... .... ... .. .. ... .... ... ....... .... . 69 Cuadro XII. Tiempos de retención de los ésteres metílicos ..... ................. ......... ............ ... .......... .... ..... 84 Cuadro XIII. Volúmenes de las respectivas disoluciones estándares para realizar la curva de calibración para la determinación de glicerina. (Anayansi & Douglas, 2015) ....... ....... ... ........ .. ....... .. 85

vii

Lista de figuras

Figura 1. Reacción de transesterificación para la producción de biodiésel utilizando metano\ e hidróxido de potasio como catalizador ................................................................................................ 23 Figura 2. Mecanismo de reacción utilizando metano! como alcohol y un catalizador básico homogéneo. (a) Formación del metóxido; (b) Secuencia de pasos al atacar el metóxido al grupo carbonilo del triglicérido. (Parte b obtenida de: Li y Guo, 2017) ........................................................ 25 Figura 3. (A) Biodegrabilidad del biodiésel a 20 ºC utilizando como microorganismos: Bacillus sp., Proteus sp., Pseudomonas sp., Citrobacter sp. and Enterobacter sp. (B) biodegrabilidad del diésel a 20 ° C utilizando como microorganismos: Bacillus sp, Proteus . Obtenido de (Lutz, Chavarría, Arias,

& Mata-Segreda, 2006) ........................................................................................................................ 27 Figura 4. Estructura de biomasa lignocelulósica. Obtenido de (Morales, 2015) ................................. 30 Figura 5. Consumo de fuentes de energías primarias a nivel mundial en el año 2017. Datos obtenidos de ("Statistical Review of World Energy 1Home1BP,"2018) .......................................................... 31 Figura 6. Consumo mundial de energía primaria desde el año 1992 hasta el 2017. Datos obtenidos de ('"lnternational Energy Agency,'" 2018) ............................................................................................... 32 Figura 7. Reservas de petróleo registradas en el año 2017. Datos obtenidos de ("Statistical Review of World Energy 1Home1BP,"2018) ................................................................................................. 32 Figura 8. Emisiones de C02 generadas por el consumo de petróleo. Datos obtenidos de ("Statistical

Review of World Energy 1Home1BP,"2018) .................................................................................... 33 Figura 9. Producción de Energía primaria en Costa Rica en el año 2017. Datos obtenidos de (ICE, 2017) .................................................................................................................................................... 34

Figura 1 O. Metodología empleada para la obtención biotecnológica de biodiésel a partir de rastrojo de piña .................................................................................................................................................. 36 Figura 11. Liberación de azúcares y ácido acético a través del tiempo en hojas de piña expuestas a un pretratamiento de 15 min a 121 ºC, seguido por cinco días de hidrólisis enzimática ( 17 FPU/g celulasa y 37 U/g xilanasa) a 50 ºC y 180 rpm .................................................................................... 53 Figura 12. Esquema simplificado del metabolismo del hongo Umbelopsis lsabellina. Adaptado de

(Meeuwse et al., 2012) ......................................................................................................................... 54 Figura 13. Metabolismo para la generación de xilitol en el hongo Umbelopsis lsabellina. Imagen obtenida de (Rojas, 2013) .................................................................................................................... 56 Figura 14. Consumo de glucosa a través del tiempo durante la etapa de fermentación. Condiciones: 180 rpm, 27 ºC durante 5 días. Coeficiente de variación de los datos: 5% ......................................... 56 Figura 15. Porcentaje de lípidos extraídos utilizando dos sistemas de disolventes diferentes. Sistema 1 metano!: cloroformo: agua (2:2: 1 ). Sistema 2 cloroformo: agua (2: 1 ) ............................................. 57 Figura 16. Reacción de saponificación ................................................................................................ 59 Figura 17. Reacción de neutralización de los ácidos grasos ................................................................ 59 Figura 18. Reacción de preesterificación utilizando metano! y KOH ................................................. 60 Figura 19. Porcentaje de conversión utilizando preesterificación y aceite sin preesterificar utilizando cloroformo y agua como disolventes en la extracción ......................................................................... 60 Figura 20. Espectro RMN-H 1 de una muestra patrón de triglicéridos. Obtenido de ("SciELO Scientific Electronic Library Online," 2018) ....................................................................................... 62 Figura 21. Espectro RMN-H 1 de la muestra extraída .......................................................................... 62

viii

Figura 22. Compuesto Ergosterol. ....................................................................................................... 64 Figura 23. Cromatograma obtenido para el biodiésel producido con un contenido de FAMES de ( 45,8± O, l) % analizado mediante cromatografía de gases. Véase sección experimental para la condiciones y equipo utilizado ............................................................................................................. 67

Figura 24. Cromatograma para la determinación del contenido de glicerina en el biodiésel producido analizado mediante cromatografia de gases. Véase sección experimental para las condiciones y

equipo utilizados .................................................................................................................................. 70 Figura 25. Reacción de transesterificación .......................................................................................... 81 Figura 26. Cromatograma experimental para realizar la identificación de las señales en el cromatograma del biodiésel (Anayansi & Douglas, 2015) .................................................................. 83

ix

Lista de ilustraciones

Ilustración 1. (a) Ñonga mezclada con agua antes de iniciar el pretratamiento; (b) proceso de incubación ............................................................................................................................................ 3 7 Ilustración 2. Cosecha del hidrolizado una vez transcurrido el proceso de incubación ...................... 39 Ilustración 3. Crecimiento del hongo Umbelopsis isabellina . ............................................................ .40 Ilustración 4. Hidrolizado en el biorreactor a 27 ºC y 180 rpm .......................................................... .41 Ilustración 5. Proceso de molienda de la biomasa. (a) antes de moler la muestra; (b) después de moler la muestra ............................................................................................................................................. 42 Ilustración 6. (a) Equipo Ultraturrex utilizado para la extracción; (b) etapa de extracción ................ .44 Ilustración 7. Etapa de transesterificación .......................................................................................... .45 Ilustración 8. Etapa de purificación del biodiésel. (a) Separación de la glicerina; (b) separación del jabón. En ambos casos, la glicerina y el jabón corresponden a la capa inferior ................................. .46 Ilustración 9. Cromatógrafo de gases utilizado para la caracterización del biodiésel y para la determinación de glicerina ................................................................................................................... 48 Ilustración 1 O. Equipo utilizado en la medición del porcentaje de agua presente en la muestra de biodiésel. .............................................................................................................................................. 50 Ilustración 11. Equipo utilizado en la medición de la estabilidad a la oxidación ................................ 51 Ilustración 12. (a) Biodiésel a partir de aceite sin preesterificar. (b) Biodiésel a partir de aceite preesterificado ...................................................................................................................................... 60 Ilustración 13. TCD para identificar impurezas en la muestra debido al hongo Umhelopsis /sahellina. Mezcla de disolvente: Hexano:acetato de etilo (7:3). El punto identificado como A es el desplazamiento para Ergosterol. La línea negra muestra el desplazamiento del Ergosterol desde su punto de aplicación hasta su corrimiento final. La línea azul muestra el desplazamiento del disolvente ............................................................................................................................................. 63 Ilustración 14. Cromatografía de columna para eliminar Ergosterol de la muestra de biodiésel. Mezcla de disolventes: Hexano: acetato de etilo (7:3) ........................................................................ 65

Lista de abreviaturas

F AME, Ésteres metílicos de ácidos grasos

MSTF A, N-metil-N-trimetilsilil-trifluoroacetamida

ASTM, American Society for Testing and Materials

EN, Comité europeo de normalización

xi

Resumen

En este trabajo se llevó a cabo la producción de biodiésel utilizando como materia prima residuos

de piña, específicamente el rastrojo piña. La parte del rastrojo de piña que se utilizó fue la ñonga, es

decir el tallo del fruto.

Para ello, se realizó una hidrólisis enzimática a los residuos sólidos cortados, utilizando celulasa y

xilanasa, posteriormente el material hidrolizado se empleó como sustrato en la fermentación con el

hongo Umbe/opsis lsabellina con el fin de incrementar el acceso a los compuestos fermentables de los

compuestos lignocelulósicos y acumular lípidos. Los lípidos acumulados fueron extraídos utilizando

dos sistemas de disolventes, metano}: cloroformo: agua (2:2:1) y cloroformo: agua (2:1), donde se

obtuvo que la segunda mezcla fue la mejor al obtenerse un rendimiento de (40±1) % mientras que el

primer sistema se obtuvo ~n porcentaje del (32±1) %.

La transesterificación de los triglicéridos se efectuó utilizando alcohol metílico y como catalizador

hidróxido de potasio. Se pudo observar que resulta necesario realizar una preesterificación utilizando

ácido sulfúrico al 0,6% y metano!. Al utilizar esta etapa previa se obtuvo un contenido de ésteres

metílicos de ácidos grasos, (FAMES, por sus siglas en inglés) de (33,6 ±0,1) % en masa y sin realizar

esta etapa el porcentaje de FAMES fue de (2,9±0,l) % en masa.

Con el fin de aumentar la pureza del biodiésel, se procedió a realizar un análisis mediante RMN-

1 H, lo que indicó la presencia de impurezas en la mezcla extraída, por ende, se efectuó una

cromatografía por capa fina para identificar la sustancia, la cual resultó ser Ergosterol.

Se realizó la purificación por cromatografía de columna utilizando como fase estacionar gel sílice

y como fase móvil hexano: acetato de etilo 7:3 para eliminar dicha impureza. Con este procedimiento

se obtuvo un porcentaje de FAMES del (45,8 ±0,1) % en masa en el biodiésel. El rendimiento final

del proceso de obtención de biodiesel a partir de la biomasa seca del hongo Umbelopsis Isabellina fue

del (14±1) %.

Se comprobó que el uso de rastrojo de piña para la obtención de biodiésel resulta ser viable y que

tiene propiedades adecuadas, sin embargo, es conveniente seguir investigando para mejorar los

rendimientos en la producción de biodiésel.

12

Justificación

La presente investigación se refiere a la producción biotecnológica de biodiésel a partir de rastrojo

de piña, que se puede definir como un proceso que permite la conversión de materia biomásica en un

biocombustible de alta calidad.

Biocombustible es un término con el cual se denomina a cualquier tipo de combustible que se

derive de biomasa. Es una fuente de energía renovable a diferencia de otros recursos naturales como

el petróleo y combustibles nucleares.

Los biocombustibles conocidos hasta ahora son el biodiésel, biogás, el bioetanol y el gas de

síntesis. El biogás es una mezcla gaseosa compuesta principalmente por metano y dióxido de carbono,

que se produce mediante la digestión de materia orgánica por acción microbiana. Por su parte, el

bioetanol es un alcohol proveniente de la fermentación enzimática de azúcares (Cortes, 2013). El gas

de síntesis, conocido como syngas es un combustible gaseoso que contiene mayoritariamente

hidrógeno y monóxido de carbono, y en cantidades minoritarias dióxido de carbono, agua y metano.

Este combustible se obtiene a partir de sustancias con un alto contenido de carbono, tales como hulla,

carbón, biomasa entre otras (Drift & Boerrigter, 2006)

En el caso del biodiésel se refiere a ésteres monoalquílicos de ácidos grasos, que se producen a

partir de aceite vegetal, grasa animal o restos de aceite de cocina mediante una reacción llamada

transesterificación. En los Estados Unidos, el aceite de soja es la principal materia prima, mientras que

el aceite de colza se utiliza en Europa y el aceite de palma juega un gran papel en países tropicales

como Malasia, Indonesia, Colombia, Ecuador y Costa Rica (Gil, 2017).

La motivación para realizar esta investigación es que en Costa Rica existen 44 500 hectáreas

dedicadas al cultivo de la piña, las cuales se distribuyen principalmente en la Zona Norte, con 56 %

del área cultivada y la zona Atlántica que representa el 25%. El ciclo de producción de la piña tiene

una duración de 27 meses, una vez transcurrido este periodo, se debe eliminar los desechos para

preparar el suelo para un nuevo ciclo de producción. Estos desechos reciben el nombre de rastrojo, y

actualmente el método convencional para la degradación del rastrojo de piña involucra la aplicación

de herbicidas como desecantes en la planta, seguido de su incorporación al campo. Desde el punto de

vista ambiental, esta práctica no resulta eficiente ya que la aplicación de herbicidas podría generar una

13

afectación al ambiente. El empleo de rastrojo como materia prima para la producción de fuentes de

energías renovables es una alternativa a los métodos de degradación de este residuo (MINAE, MAG,

2009), (CANAPEP, 2018)

Asimismo, se estima que por cada hectárea se produce alrededor de 200 y 250 toneladas por

hectárea de residuos de piña anuales, es decir, existen más de 7 millones de toneladas de residuo de

piña que se podrían aprovechar en la producción de energía renovable, específicamente con esta

investigación se utilizan esos residuos para la elaboración de biodiésel.

Otra de las motivaciones de realizar este proyecto radica en que el biodiésel tiene diversas ventajas,

entre las cuales se destaca que la generación de C02 al producir este biocombustible a partir de residuos

agrícolas es menor que el dióxido de carbono generado por combustibles fósiles, por lo tanto, la huella

de carbono es menor y colaboraría con el compromiso internacional que tiene nuestro país desde el

2009 ante la Cumbre de las Naciones Unidas para convertirse un país carbono neutral en el año 2021

(Chen et al., 2015), (Gobierno de Costa Rica, n.d.). Sin embargo, en la administración Solís, se

estableció un nuevo programa país sobre carbono neutralidad en donde se buscar descarbonizar la

economía en tres tractos: uno en el 2030, otro en el 2050 y finalmente en el 21 OO.

Con el fin de aprovechar la energía proveniente de desechos agrícolas, se han realizado algunas

investigaciones en Costa Rica, entre las cuales se destaca la investigación de la Facultad de Ingeniería,

el Instituto de Investigaciones en Ingeniería (INII) de la Universidad de Costa Rica y la Red

Centroamericana de Instituciones de Ingeniería (REDICA) los cuales se unieron para generar

electricidad a partir del rastrojo de piña, en un proyecto denominado Gasificación a partir de Desechos

Agrícolas para la Producción de Energía. Este trabajo de investigación tiene como objetivo ampliar

la experiencia en gasificación de desechos para la producción de energía. El proyecto presta atención

a los residuos de piña y su misión es procurar un uso eficiente de los recursos y una reducción en los

costos de producción (REDICA-UCR, n.d.).

Otra investigación es el proyecto titulado Evaluación del Impacto Ambiental Generado por la

Eliminación del Rastrojo de Piña a través de su Incorporación al Suelo presentado en el 2009 por el

Ministerio de Ambiente y Energía de Costa Rica (MINAE) y el Ministerio de Agricultura y Ganadería

(MAG) (MINAE, MAG, 2009). Ese proyecto brinda una perspectiva de la problemática del manejo

convencional para la eliminación del rastrojo y, además, ayuda a comprender la importancia de la

utilización de residuos agrícolas en la producción de energía desde el punto de vista económico y

ambiental.

14

Con respecto al uso específico de biodiésel, en el Plan Nacional de Desarrollo 2006-2010 (PND),

se crearon una serie de pasos para promover el desarrollo de biocombustibles en Costa Rica, para lo

cual en el año 2008 el MINAE y el MAG presentaron el plan conocido como Programa Nacional de

Biocombustibles (PNB). El programa tiene como objetivos propiciar el desarrollo social en zonas de

alta vulnerabilidad a partir del desarrollo del sector de biocombustibles, desarrollar la industria de

biocombustibles la cual sea competitiva y eficiente, entre otros (MINAE, 2008). Además, en el Plan

Nacional de Energía 2015-2030 se implementaron políticas sobre la energía nacional, con el fin de

lograr un desarrollo energético sostenible y bajo en emisiones de gases de efecto invernadero (MINAE,

2015).

A nivel mundial, el área de investigación en Jos biocombustibJes adquirió re]evancia a partir de Ja

crisis energética que comenzó en 1973, cuando se disminuyó la venta del petróleo y aumentó su precio

y se estableció una campaña para la racionalización y uso eficiente de combustibles (García, 2013).

Se planteó la necesidad de encontrar nuevas fuentes de energía alternativa, tales como otros

combustibles fósiles (carbón, gas), energía nuclear y energía renovable (M. Chaves, 2003).

Entre estas fuentes de energía alternativas que surgió para garantizar la seguridad energética, el

precio en los combustibles y proteger el medio ambiente se encuentra la utilización de utilización de

biomasa para producir biocombustible (García, 2008)

Desde 1973, los precios en los combustibles han tenido una gran volatilidad y recientemente en los

últimos años han experimentado una tendencia oscilante en los precios de los mismos. Aunado a esto,

debido a la explotación de combustibles fósiles que producen una alta cantidad de gases de efecto

invernadero, como por ejemplo C02, han ocasionado un aumento en la temperatura media, que según

varias investigaciones podría alcanzar 1 ºC para el 2020, inclusive 2 ºC para el 2050, lo que provocaría

un impacto negativo en el planeta que se vería reflejado en la aparición de sequías y lluvias

devastadoras (MINAE, 2008) (British Petroleum, 2017) (lnternational Energy Agency,2018)

Debido a lo anterior, las investigaciones relacionadas con el desarrollo de nuevas tecnologías en la

producción de biocombustibles se han incrementado a nivel mundial. Un aspecto importante en la

obtención de biocombustibles es que debido a la complejidad de los compuestos lignocelulósicos que

se utilizan como fuente de materia prima es imprescindible un pretratamiento de estos sustratos para

incrementar el acceso a los compuestos fermentables (hemicelulosa y celulosa) (Morales, 2015)

Para este fin, se han reportado diversos tratamientos, tales como hidrotermólisis, ozonólisis,

oxidación, hidrólisis ácida o básica, tratamientos enzimáticos, entre otros. Por otro lado, la biomasa

15

debe ser tratada para facilitar su degradación biológica, para esto se inocula con microorganismos con

la habilidad de degradar monosacáridos y acumular lípidos. Entre esos microrganismos se destaca el

hongo Umbelopsis isabellina el cual tiene capacidad para crecer en sustratos sólidos de baja actividad

de agua y, además, tiene habilidad para acumular lípidos. En el caso de la producción de biodiésel,

estos lípidos posteriormente son extraídos y esterificados (García, 2008), (Meeuwse, K.lok, Haemers,

Tramper, & Rinzema, 2012).

En este trabajo se desarrolló una metodología para la producción biotecnológica de biodiésel a

partir de rastrojo de piña, específicamente a partir de ñonga de piña la cual incluye el tallo y raíces de

la planta de la fruta. Además, se evaluó la calidad del biodiésel obtenido por medio de la determinación

de parámetros de desempeño tales como estabilidad a la oxidación, contenido de agua y glicerina.

El presente trabajo, además, es parte de un macroproyecto aprobado por el Ministerio de Ciencia,

Tecnología y Telecomunicación llamado Aprovechamiento del rastrojo de piña para la producción de

energía el cual contempla tanto la producción de biodiésel a partir de la fase sólida del rastrojo como

la producción de biogás a partir de la fracción líquida.

Los objetivos del presente trabajo son los siguientes:

General: Establecer una metodología de obtención de biodiésel de Umbelopsis isabellina alimentado

con rastrojo de piña.

Específicos

l. Extraer los lípidos contenidos en el material lignocelulósico del hongo Umbelopsis isabellina para

su posterior transesterificación.

2. Efectuar la transesterificación de los lípidos extraídos para la obtención de biodiésel.

3. Purificar el producto obtenido para eliminar excesos de reactivo y subproductos de reacción.

4. Evaluar la calidad del biodiésel obtenido.

16

Capítulo l

Estado de la cuestión

1.1. Biodiésel

l. l. l. Aspectos generales

El biodiésel es definido como "ésteres monoalquílicos de ácidos grasos de cadena larga derivados

de aceites 11ege1ales o grasas animales, para uso en motores de diésel" (ASTM D6751-15, 2015)

En general, este biocombustible es biodegradable, renovable, posee baja toxicidad, tiene un punto

de inflamación relativamente alto, es un combustible seguro y fácil de manipular debido a que posee

un punto de ignición alto (Knothe, 2010). Asimismo, es una alternativa de combustible que reduce las

emisiones de dióxido de azufre, monóxido de carbono e hidrocarburos aromáticos policíclicos

(Quintero, Carvajal, & Aldunce, 2012), (Gil, 2017).

A continuación, en el cuadro 1 se detallan las ventajas del biodiésel, clasificadas en tres tipos:

ambientales, técnicas y sociales

17

Cuadro l. Ventajas de la producción de biodiésel (Avellaneda, 2010).

Tipo

Ambiental

Técnica

Social

Ventajas

);;- Se puede obtener a partir de residuos

agrícolas, por lo tanto, su elaboración es

una alternativa al tratamiento de estos

residuos.

~ Es un combustible renovable.

~ El contenido de azufre es bajo, por ende,

no contribuye a la lluvia ácida.

~ Es biodegradable, por lo cual en caso de

derrame se previene la contaminación al

medio.

);;- Contribuye a disminuir las emisiones de

C02.

>-- No es nocivo para la salud humana,

vegetación y animales.

);;- Tiene buena lubricidad, por lo cual

facilita su empleo en el pistón del motor

);;- Minimiza el desgaste del motor.

);;- Se puede obtener mezclas con diésel en

cualquier proporción, aumentando de

esta manera el rendimiento en el motor.

~ Tiene una combustión limpia debido a

que se encuentra oxigenado lo cual

facilita la oxidación.

);;- Fomenta un desarrollo sostenible.

);;- Fortalece la agroindustria.

1 );;- Es una fuente de empleo en zonas rurales.

-~~~-J

18

Entre las desventajas, se encuentra que presenta una alta viscosidad lo que hace que tenga

problemas de fluidez a bajas temperatura, su combustión puede contribuir a un aumento de óxidos de

nitrógeno y su costo de producción es alto, ya que algunas materias primas tienen precios elevados y

se requiere de una inversión para llevar a cabo las etapas de pretratamiento, extracción,

transesterificación y purificación (Mittelbach & Remschmidt, 2004). Empero, se pueden reducir estos

costos operando continuamente y recuperando la glicerina para su posterior comercialización (Gil,

2017).

1.1.2. Especificaciones del biodiésel

Hay varios factores que afectan la calidad del biodiésel. Un factor está asociado con la reacción

de transesterificación, proceso en el cual quedan algunas impurezas tales como alcohol utilizado en el

proceso de obtención de biodiésel, glicerina generada como subproducto de reacción, materia prima

no convertida o parcialmente convertida y el catalizador utilizado. El alcohol es incompatible con

algunos elastómeros y metales en los sistemas de combustible de automóviles. Por su lado, la glicerina

es un líquido viscoso que puede separarse del biodiésel y formar depósitos en el fondo de los tanques

de almacenaje de combustible ocasionando una obstrucción en los filtros del combustible (Tyson,

Bozell, Wallace, Petersen, & Moens, 2004).

Los altos niveles de materia prima no convertida o parcialmente convertida provocan un

deterioro en el inyector de combustible y además generan depósitos en los cilindros en motores de

diésel, reduciendo la vida del motor. Asimismo pueden causar problemas operativos a corto plazo, a

bajas temperaturas, tanto en motores de combustión de diésel como en calderas (Sheehan, Camobreco,

Duffield, Grabosk, & Shapouri, 1998).

El catalizador, usualmente KOH o NaOH, debe eliminarse para evitar el desgaste del sistema

de inyección de combustible, la generación de depósitos, o bien la contaminación del lubricante del

motor (Tyson et al., 2004). También pueden presentarse impurezas debido a las condiciones de

almacenamiento del biocombustible (Knothe, 2010).

Debido a todo lo anterior, el biodiésel dispone de una serie de especificaciones que garantizan

su calidad. En Costa Rica, el reglamento vigente donde se indican las especificaciones que debe tener

el biodiésel para poder ser comercializado como combustible es el Reglamento Técnico

Centroamericano (RTCA) en su versión 75.02.43.07, el cual es una adaptación de las especificaciones

que aparecen en las normas ASTM D 6751-07 y EN 14214:2003. Además, en nuestro país existe el

Instituto de Normas Técnicas de Costa Rica, INTECO, que es el ente nacional de normalización según

19

la ley Nº 8279 del año 2002, que publicó la norma INTE E44: 2017 donde se especifican los requisitos

y los métodos de ensayo de los ésteres metílicos de ácidos grasos suministrados y comercializados

para emplearse como combustibles en motores diésel. Las especificaciones establecidas en dicha

norma se muestran en el cuadro 11.

20

Cuadro II. Especificaciones de la calidad del biodiésel. Obtenido de (lnteco, 2017).

Característica Unidades Método de ensayo Parámetro

Contenido de Ésteres % masa EN 14103 96,5 mínimo

Contenido de metano! o etanol % masa EN 14110 0,20 máximo ----f-ASTM 01298

Densidad a 15 ºC kg/m3 , g/ml ASTM 04052

Reportar ISO 3675

ISO 12185 ------ -·

Estabilidad a la oxidación, 11 O ºC h EN 14112

6,0 mínimo EN 15751

Punto de Inflamación ("Flash ASTM 093

(Je ISO 2719 101,0 mínimo point")

ISO 3679 Agua y sedimentos % volumen ASTM 02709 0,05 máximo

Viscosidad cinemática a 40 ºC mm2/s ASTM 0445 (1,9 a 6,5)

ISO 3104

Ceniza sulfatada %masa ASTM 0874

0,020 máximo ISO 3987

ASTM 05453 ASTM 02622

Contenido de azufre total mg/kg ASTM 04294

10 máximo ISO 20846 ISO 20884 ISO 13032

Corrosión tira de Cobre, 3h. 50 ASTM 0130 Nº 3 máximo

ºC --

ISO 2160

Número de Cetano ASTM 0613

51 mínimo ------ ISO 5165 Punto de enturbamiento •JC ASTM 02500 Reportar

Residuo de carbón %masa ASTM 04530

0,050 máximo ISO 10370 -

ASTM 0664 Número ácido mg KOH/g ASTM 0974 0,50 máximo

ISO 6618 ASTM 06584

Glicerina libre %masa EN 14105 0,020 máximo EN 14106

Glicerina T atal % masa ASTM 06584

0,240 máximo EN 14105

ASTM 04951 Contenido de fósforo mg/kg EN 14107 4.0 máximo

EN 16294 Temperatura de destilación,

temperatura equivalente ºC ASTM 01160 360 máximo atmosférica, 90 % recup erado

Sodio (Na) y potasio (K) EN 14108

mg/kg EN 14109 5 máximo combinados

EN 14538 ~lcio (Ca) y magnesio (Mg) -- ·~

combinados mg/kg EN 14538 5 máximo

21

1.1.3. Proceso de obtención de biodiésel

El proceso utilizado para la elaboración de biodiésel es la transesterificación, la cual comprende

una secuencia de tres reacciones, donde una molécula de triacilglicérido contenida en el aceite vegetal

o en la grasa animal reacciona con tres moléculas de un alcohol de bajo peso molecular como metano},

etanol, propano} y butano}, para degradarse primero a diacilglicérido, luego a monoacilglicérido y

finalmente en glicerina; en cada una de estas etapas se genera una molécula de éster alquílico

(biodiésel) (Ruiz, 2016). Esta reacción se produce en presencia de un catalizador con el fin de mejorar

la velocidad de reacción y el rendimiento final. Los catalizadores pueden ser ácidos homogéneos,

ácidos heterogéneos, enzimáticos, básicos heterogéneos y básicos homogéneos, siendo estos los más

utilizados ya que actúan mucho más rápido y permiten operar en condiciones moderadas (García,

2006), por ejemplo, entre estos catalizadores se encuentran el hidróxido de sodio o hidróxido de

potasio, cuya reacción que tiene lugar a presión atmosférica y a una temperatura comprendida entre

60 - 70ºC (Gracia, 2004).

El proceso para la elaboración de biodiésel utilizando metanol en presencia de KOH como

catalizador se muestra en la figura 1.

22

CH2 - O - CO - R1 CH 2 -0-CO-R1

CH2 - O - CO - R1

KOH CH-0-CO Rz + CH30H CH3 - o - ca - R3 + CH -O-CO-R2

CH 2 - O - CO - R3 CH2 - OH

Triacilglicérido Diacilglicérido

CH2 o co Ri CH2 - OH

KOH CH - O - CO - R2 + CH30H CH3-0-CO-R1 + CH-O - CO - R2

CH 2 - OH CH 2 - OH

Diacilglicérido Monoacilglicérido

CH2 OH CH 2 - OH

KOH CH o CO-R2 CH30H CH3 - o - ca - Rz + CH OH

CH 2 - OH Ésteres metílicos CH 2 - OH

(Biodiésel)

Monoacilglicérido Glicerina Libre

Figura l. Reacción de transesterificación para la producción de biodiésel utilizando metano! e hidróxido de potasio como catalizador.

Es importante mencionar que el comportamiento de los ésteres metílicos y los demás grupos

alquilo es muy similar, sin embargo, se ha demostrado que los metílicos generan una potencia mayor

y, además, poseen una menor viscosidad. Por otro lado, el metano! tiene un menor costo comparado

con los otros alcoholes y reacciona rápido a una baja temperatura (Barros, 2015). Por todo esto, es el

alcohol más utilizado en el proceso de obtención de biodiésel tal y como se muestra en la figura 1.

23

1.1.4. Catalizadores y mecanismo de reacción.

Tal y como se mencionó anteriormente, los catalizadores empleados para la reacción de

transesterificación pueden clasificarse en diferentes tipos a saber, enzimáticos, entre los cuales se

encuentran las lipasas tales como candida, penicillium y pseudomonas; ácidos homogéneos tales como

H2S04, H3PÜ4 y HCl; ácidos heterogéneos como por ejemplo zeolitas y resinas sulfónicas; alcalinos

heterogéneos, MgO, CaO NaOH/Na/ Al203 y alcalino homogéneos, KOH y NaOH. Generalmente se

usan catalizadores básicos homogéneos debido a que proporcionan mayor velocidad de reacción

comparada con la velocidad de los otros catalizadores {Quintero et al., 2012).

En la catálisis homogénea básica, el factor determinante para que la reacción se produzca es

producir el alcóxido nucleofilico a partir del alcohol, que posteriormente ataca la región electrofilica

del grupo carbonilo. Desde el punto de vista mecanístico, la transesterificación consiste en tres pasos;

en el primer paso se forma un intermediario tetraédrico debido al ataque nucleofilico del alcóxido al

carbono del grupo carbonilo del triacilglicérido. En el segundo paso, la molécula generada se reordena

y produce un éster alquílico y un diacilglicérido iónico. Seguidamente, en el tercer paso se da la

protonación de esta molécula iónica por acción del alcohol produciendo un diacilglicérido y el ion

alcóxido. El nucleófilo ataca al grupo carbonilo del diacilglicérido ocasionado que este se degrade a

monoacilglicérido y finalmente a glicerina; en cada una de estas etapas se genera una molécula de

éster alquílico (biodiésel) (Li & Guo, 2017) .

24

MeOH +Off ---(a)

(b)

Meo·+ füO

o R,_lLO- \k

Figura 2. Mecanismo de reacción utilizando metanol como alcohol y un catalizador básico homogéneo. (a) Formación del metóxido; (b) Secuencia de pasos al atacar el metóxido al grupo carbonilo del triglicérido. (Parte b obtenida de: Li y Guo, 2017).

En la catálisis homogénea ácida, el grupo carbonilo del triglicérido se protona debido al

catalizador ácido, posteriormente, una molécula del alcohol ataca a este grupo carbonilo, formándose

un intermediario tetraédrico. Este intermediario es inestable, por lo tanto se reordena en el éster del

ácido graso y el ion diacilglicérido. La secuencia se repite hasta la formación del éster alquílico

(Castellar, Angulo, & Cardozo, 2014).

El mecanismo de reacción por catálisis heterogénea usando ácidos o bases es similar al

mecanismo por catálisis homogénea, el cual se basa en las propiedades nucleofilicas y electrofilicas

25

del triglicérido y el alcohol. En ambos casos, ya sea ácido o base la reacción puede ocurrir un uno o

dos sitios activos del catalizador (Endalew, Kiros, & Zanzi, 2011).

1.1.5. Biodcgrabilidad del biodiéscl

Entre las ventajas del biodiésel sobre el diésel, se encuentra que el primero se ajusta a los

principios de la química verde, específicamente al principio de biodegrabilidad. Si bien es cierto, el

biodiésel es más caro que el diésel, los biocombustibles tienen mayor compatibilidad ambiental.

Los microorganismos son capaces de degradar el biodiésel, no obstante, con el diésel la

biodegrabilidad bacteriana no es completa, tal y como se demostró en el estudio realizado por Giselle

Lutz, et al, 2005 A continuación, en la figura 3 se adjuntan los resultados obte.nidos en dicho estudio.

26

8 :?: 7

-5 6

~ 5 ' g. 4

~ 3 ~2 ;.-: 1 o

O ·

D 100 200 300 400 500 600 700

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(A)

·5

4 :a E ,, 3 3

1 o.. ::>

~ 2 "° .... "" o

1 •

o Q 100 200 300 400 500

timclh

(B)

Figura 3. (A) Biodegrabilidad del biodiésel a 20 ºC utilizando como microorganismos: Bacillus sp., Proteus sp., Pseudomonas sp., Citrobacter sp. and Enterobacter sp. (B) biodegrabilidad del diésel a 20 º C utilizando como microorganismos: Bacillus sp, Proteus . Obtenido de (Lutz, Chavarría, Arias, & Mata-Segreda, 2006)

Como se puede observar en la figura 3, la biodegrabilidad del diésel no realiza de manera

completa, esto se debe a que la composición del diésel es alrededor 50% hidrocarburos alifáticos y

50% hidrocarburos aromáticos y cíclicos no aromáticos (Lutz et al., 2006). Los microorganismos solo

pueden degradar los hidrocarburos alifáticos, por consiguiente, la biodegrabilidad se queda a la mitad,

tal y como se puede observar en la figura 3.

27

1.1.6. Biomasa en la producción de biodiésel

La biomasa es definida como toda materia orgánica que proviene de árboles, plantas y desechos

de animales, residuos agrícolas y urbanos que pueden ser convertidos en energía. Las fuentes más

importantes de biomasa son los campos forestales y agrícolas ya que en ellos se produce gran cantidad

de residuos (rastrojos). Por lo general, solo un bajo porcentaje de ellos son utilizados con fines

energéticos (Biomass Users Network, 2002).

La biomasa se puede emplear como materia prima para la producción de biodiésel. La

generación de este biocombustible, a partir de biomasa lignocelulósica se le denomina biocombustibles

de segunda generación. Estos residuos provienen de agroindustrias, los cuales son materias en estados

sólido o líquido que se generan a partir del consumo directo de productos primarios. Estos no son de

utilidad para el proceso en los que se generaron, pero pueden ser aprovechados en la obtención de otro

producto con valor económico.

1.1.6.1. Piña

Entre los residuos agroindustriales con un valor agregado se encuentran los residuos de piña,

la cual es un fruto tropical de la familia de las Bromeliáceas, originaria de América del Sur; se estima

que en el mundo existen más de l 400 especies, específicamente en Paraguay, Brasil y Argentina. La

piña es la tercera fruta tropical de importancia económica en el mundo, su producción a nivel mundial,

entre los años 2006 y 2010, fue de alrededor de 17,5 y 18 millones de toneladas de fruta, siendo

Filipinas, Brasil, Tailandia, China y Costa Rica los principales productores, los cuales representan el

55% del total de la producción (Acuña, 2006).

En Costa Rica se ha producido piña desde hace mucho tiempo y hasta hace unas pocas décadas

la producción estaba homogéneamente distribuida por todo el país debido a que el proceso era natural

y no necesitaba el uso de tecnología ni de procesos químicos para acelerar la producción de la fruta.

No obstante, con la aparición desde hace 20 años de la empresa Piñas de Costa Rica (Pindeco ), una de

las primeras empresas en incursionar en la producción de piña para la exportación, se produjo una serie

de cambios en el proceso productivo de la piña en el país (Acuña, 2006).

Actualmente, esta empresa controla el 50% de la producción de piñera en C.R, con unas 15

000 hectáreas de la producción total. Pindeco introdujo paquetes tecnológicos para acceder a nuevos

mercados, además, provocó una expansión horizontal de la producción e introdujo una nueva variedad

de piña para la exportación.

28

Por otro lado, como se ha mencionado anteriormente, los residuos de piña en nuestro país son

tratados con herbicidas y posteriormente son quemados, lo que provoca la liberación de sustancfas

químicas dañinas para el medio ambiente. Otro de los métodos consiste en dejar el rastrojo en el campo

lo que provoca la proliferación de la mosca stomoxys calcitrans, que es causante de enfermedades en

el ganado y riesgos en la salud humana.

Parte de que este residuo biomásico no se ha utilizado, generalmente porque no están

debidamente caracterizados y sus propiedades no son conocidas por los entes generadores.

El cuadro III muestra la composición típica del rastrojo de piña.

Cuadro 111. Composición química de una muestra de rastrojo de piña (Irías & Lutz, 2014).

Parámetro ºlo en masa Humedad 86 --Cenizas en base seca 12 ... Extractos en etanol/tolueno en base seca i7

... Extractos en ai.,'ll a caliente en base seca 20,5 Li !-111 ina 8 Holocelulosa 66

El alto contenido de la humedad representa una ventaja para la producción de biocombustibles,

debido a que los microorganismos fermentativos involucrados necesitan humedad para actuar y

reproducirse (Irías & Lutz, 2014).

1.1.7. Pretratamiento

Debido a la complejidad de los compuestos lignocelulósicos que se utilizan como fuente de

materia prima es imprescindible un pretratamiento de estos sustratos para incrementar el acceso a los

compuestos fermentables (celulosa y hemicelulosa). Para este fin, se han reportado diversos

tratamientos, tales como hidrotermólisis, ozonólisis, oxidación, hidrólisis ácida o básica, tratamientos

enzimáticos, entre otros (Morales, 2015).

Para. comprender mejor la complejidad de la biomasa lignocelulósica se debe conocer la

composición química de esta. La lignocelulosa es el principal componente de la parte celular de las

plantas y se puede dividir en tres fracciones orgánicas con las siguientes composiciones en peso: 20-

50% celulosa, 15-35% hemicelulosa y 10-30% lignina. Además, contiene componentes minoritarios

tales como: proteínas, lípidos, azucares solubles, entre otros (Morales, 2015).

29

ó OH

AICOllol p..curunnco AICoftol con11er1r::o A1eono1 ~111411J1•co

llhcrofibr;i

Ll(lnlna

ttemiceluk>M - 10.20 MI

Figura 4. Estructura de biomasa lignocelulósica. Obtenido de (Morales, 2015).

La celulosa es un polímero de O-glucosa unida por enlaces glucosídicos B-1,4 que tiene una

estructura en cadenas largas lineales unidas por puentes de hidrógeno y fuerzas de van der Waals,

formando de esta manera una estructura cristalina resistente a la hidrólisis y regiones amorfas

susceptibles a la degradación enzimática (Cuervo, Folch, & Quiroz, 2009).

La hemicelulosa está compuesta por polímeros de diferentes azúcares de cadenas cortas y

ramificadas, lo que la hace más amorfa y por consiguiente más fácil de hidrolizar que la celulosa. Por

otro lado, la lignina es un heteropolímero amorfo, tridimensional y ramificado formado por alcoholes

aromáticos que da soporte estructural, rigidez, impermeabilidad y protección a los polisacáridos

estructurales (celulosa y hemicelulosa) y es altamente resistente a la degradación química y biológica

(Morales, 2015).

Debido a toda esta complejidad, la biomasa lignocelulósica debe ser tratada para facilitar su

degradación biológica, para esto es necesario realizar una hidrólisis. El objetivo de esta etapa es reducir

30

la cristalinidad de la celulosa, aumentar la porosidad de los materiales lignocelulósicos, además de

eliminar la lignina. Como se mencionó previamente, existen varios tipos de hidrólisis, una de ellas es

la enzimática, en la cual se elimina la lignina y la hemicelulosa se degrada a xilosa y la celulosa a

glucosa (Morales, 2015).

1.2. Situación energética a nivel mundial

Para el año 2017 la dependencia del petróleo a nivel mundial fue del 34,2%, siendo todavía la .. . principal fuente de energía primaria que se consume. Por su parte, la energía proveniente de fuentes

renovables fue la de menor consumo, tal y como se muestra en la figura 5.

• petróleo

• gas natural

•carbón

•energía nuclear

• Hidroeléctrica

• renOYable

Figura 5. Consumo de fuentes de energías primarias a nivel mundial en el afio 2017. Datos obtenidos de ("Statistical Review of World Energy 1Home1BP,"2018).

Sin embargo, el petróleo fue el combustible de menor crecimiento en la última década; caso

contrario a la energía renovables que en los últimos años su consumo ha sido el de mayor crecimiento.

Por su parte, la energía nuclear tuvo un descenso en el consumo desde 2007 hasta el 2013, y a partir

de ese año su consumo ha vuelto a aumentar.

31

Figura 6. Consumo mundial de energía primaria desde el año 1992 hasta el 2017. Datos obtenidos de ( .. lntemational Energy Agency,'' 2018).

No obstante, debido a las reservas reportadas en el año 2017 de petróleo, las cuales se estima

que alcanzan para 5 décadas de producción de este combustible, se espera que el petróleo permanezca

como la principal fuente de energía.

Figura 7. Reservas de petróleo registradas en el año 2017. Datos obtenidos de ("Statistical Review of World Energy 1 Home 1 BP,'' 2018).

32

Uno de los principales problemas de la utilización de combustibles no renovables es la

generación de emisiones de C02 tal y como se explicó anteriormente. Durante el año 2016 y 2017 las

emisiones de carbono producto al consumo de energía se incrementaron en 1,6% (British Petroleum,

2017)

N o u e¡¡

"C

"' e¡¡ e o

·¡;; .E w

34000

33000

32000

31000

30000

29000

28000

27000 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017

Años

J Figura 8. Emisiones de C02 generadas por el consumo de petróleo. Datos obtenidos de ("Statistical Review ofWorld Energy 1Home1BP,"2018).

Debido al impacto ambiental negativo que genera el consumo de combustibles fósiles en

diversos países, incluido Costa Rica, es que se ha fomentado el uso de fuentes de energías renovables

y de ahí el incremento en su utilización como se pudo observar previamente en la figura 6.

1.3. Situación energética de Costa Rica

Para el año 2017, el país tuvo una producción de energía primaria de 11 0192 GWh, donde las

contribuciones más significativas son la hidráulica y la eólica que representan una producción de

77,40% y 11,49% respectivamente.

33

0,78% bagazo

0,02% solar

0,33% Térmico

• Hidráulica

• Térmico

• Geotérmico

•Solar

• Bagazo

Eólico

Figura 9. Producción de energía primaria en Costa Rica en el año 2017. Datos obtenidos de (ICE, 2017).

Como se puede apreciar en la figura 9, en Costa Rica no se dispone del petróleo y sus derivados

para la producción de energía primaria y eso justifica el hecho de que la infraestructura para la

explotación esté dirigida a la producción y distribución de energía primaria y al almacenamiento,

procesamiento y distribución del petróleo y sus derivados (Zárate & Ramírez, 2016).

La energía primaria necesita ser transformada para ser aprovechada, a este tipo de energía se le

denomina energía secundaria, entre las cuales se distinguen la electricidad y los derivados de petróleo

(nafta, diesel, etc.) (Herrera, 2017). En el caso específico de Costa Rica la energía primaria es

transformada en energía eléctrica, lo que conlleva a que se consuma una gran cantidad de terajulios en

producirla. Por ejemplo, entre los años 2005 y 2015 entre el 40% y 55% de la energía primaria fue

transformada en electricidad (Zárate & Ramírez, 2016). Aun así, el país ha sido noticia mundialmente

porque ha logrado durante meses producir gran parte de la energía eléctrica a partir de fuentes

renovables. Por ejemplo, según datos del Centro Nacional de Control de Energía, Costa Rica produjo

el 99,06% de su electricidad a partir de cinco fuentes renovables (agua, viento, geotermia, biomasa y

solar). (Instituto Costarricense de Electricidad, n.d.)

No obstante, es importante señalar que la principal fuente de energía en Costa Rica, considerando

la producción de energía primaria y la importación, fueron los derivados del petróleo. Es decir, la

energía primaria en Costa Rica es proveniente de fuentes renovables, pero la energía secundaria

proviene de fuentes no renovables (73%). Del mismo modo, el sector transporte consume más del 80%

de toda la energía proveniente del petróleo.

34

Capítulo 2

Sección experimental

El proceso de obtención de biodiésel a partir del rastrojo de piña requirió de las siguientes etapas:

prensado del residuo sólido de la planta entera de la piña, tratamiento de la biomasa mediante una

hidrólisis enzimática, fermentación con el hongo Umbelopsis isabelina, extracción de los lípidos

acumulados, proceso de esterificación de los triglicéridos y purificación del biodiésel obtenido. El

biodiésel obtenido se caracterizó mediante cromatografia de gases y además se evaluaron los siguientes

parámetros para determinar la calidad del biodiésel producido: glicerina libre y total, estabilidad a la

oxidación y cantidad de agua.

La primera etapa de este proyecto consistió en una serie de pasos de hidrólisis enzimática para

incrementar el acceso a los compuestos fermentables de los compuestos lignocelulósicos.

Seguidamente, se procedió a realizar el tratamiento biológico utilizando el hongo Umbelopsis

isabellina (Liao, 2015). Esta parte del proyecto se realizó en el Centro de Investigaciones

Agronómicas (CIA) de la Universidad de Costa Rica

Los lípidos acumulados en la etapa anterior fueron extraídos utilizando como disolventes agua y

cloroformo (1 :2) (Bligh & Dyer, 1959). Esta etapa se realizó en el laboratorio de alimentos de la

escuela de Tecnología de Alimentos de la Universidad de Costa Rica

Una vez concluida la etapa anterior se procedió a realizar la transesterificación utilizando KOH

como catalizador al 1 % en masa-volumen, una temperatura de 65 ºC y una relación de aceite: metanol

de 1:7 con agitación constante por 4 h (Chen et al., 2015). Seguidamente, se efectuó una destilación

simple con el fin de purificar el biodiésel producido. El proceso anterior se realizó en los laboratorios

de química analítica de la Escuela de Química de la UCR

Finalmente, se evaluaron los parámetros indicados anteriormente Esta evaluación se realizó en

las instalaciones del Centro de Investigación en Electroquímica y Energía Química de la UCR.

El resumen de la metodología utilizada se muestra en la figura 10

35

Residuos de piña

Hidrólisis enzimática

Sólido 11-1 -------~ Sustrato

Biomasa

Fermentación con U. isabellina

-------

Extraccion lipidos y

proceso de esterificadón

Biodiesel

Figura 10. Metodología empleada para la obtención biotecnológica de biodiésel a partir de rastrojo de piña.

A continuación, se detalla el equipo y materiales y el procedimiento utilizado en cada etapa del

proceso.

2.1. Tratamiento de la biomasa

El material del cual se obtiene el biodiésel es a partir de ñonga (tallo) de piña de la empresa Valle del

Tarso ubicada en Upala.

2.1.1. Prctratamiento de la fracción sólida de la ñonga

El objetivo es tratar la mayor cantidad de residuos para obtener un hidrolizado con una alta cantidad

de azúcares fermentables, pero sin generar sustancias que inhiban el crecimiento del hongo.

2.1.1.1. Equipo y materiales

• Celulasa.

• Xilanasa.

• Incubadora.

• Hidróxido de sodio marca Merck lote 106462.

• Equipo de autoclave.

• Frascos de vidrio de capacidad de 400 g.

• Papel de pH universal.

• Espátulas.

36

2.1.1.2. Procedimiento

1. En frascos de vidrio, colocar aproximadamente 190 g de ñonga y 200 g de agua desionizada.

2. Preparar un amortiguador de citrato de sodio e hidróxido de sodio 1 mol/ L.

3. Autoclavar la mezcla preparada en el punto 1, junto con el NaOH y el amortiguador de citrato

de sodio. Además, autoclavar una botella de volumen suficiente para preparar el coctel

enzimático de celulasa y xilanasa. El tiempo del autoclave es por 1 hora.

4. Una vez transcurrido el tiempo y estando a temperatura ambiente, ajustar el pH de la ñonga a

4,5 con NaOH 1 mol/L. Agregar el amortiguador de citrato de sodio y el coctel enzimático

según el volumen requerido.

S. Agitar hasta que la celulasa se disuelva.

6. Todo el proceso se realiza dentro de una cámara de transferencia para mantener las condiciones

estériles.

7. Colocar los frascos en una incubadora con agitación a 50 ºC y 170 rpm por cinco días.

(a) (b)

Ilustración 1. (a) Ñonga mezclada con agua antes de iniciar el pretratamiento; (b) proceso de incubación.

2.1.2. Cosecha del hidrolizado y preparación del medio de cultivo

Una vez que hayan transcurrido los cinco días de hidrólisis, el material líquido o hidrolizado se deberá

separar de las fibras que no se degradaron. El hidrolizado constituye el medio de cultivo para el hongo

Umbelopsis isabellina.

37

2. 1.2. J. Equipo y materiales

• Incubadora.

• Centrifuga marca Eppendorf, modelo: Centrifuge 5810 R.

• Congelador.

• Autoclave.

• Balanza granataria.

• Nutrientes.

• Hidróxido de sodio Merck lote 106462.


1. Sacar los frascos de la incubadora, y transferir todo el material a botellas de 750 mL para

centrífuga.

2. Centrifugar a 3000 rpm por 20 mio.

3. Decantar el líquido de cada frasco en un envase tarado para registrar la masa de líquido

obtenida y poder calcular el rendimiento de la hidrólisis.

4. Almacenar el hidrolizado en el congelador.

5. Preparar el medio de cultivo, agregando las siguientes sales:

Cuadro IV. Nutrientes necesarios para preparar el medio de cultivo.

g/L en el Concentración del stock Reactivo

medio g/L

KH2P04 1,0 Afiadir directamente el reactivo

MgC'2*6H20 0,50 Afiadir directamente el reactivo

ZnS04*7H20 0,0014 1,4

MnS04 0,0016 1,3

CoC'2*2Hi0 0,0036 3,6

FeS04*7H20 0,0028 7,8

38

6. Ajustar el pH a 6,0 utilizando NaOH ( l mol/L).

7. Preparar una disolución (50 g/L) de extracto de levadura.

8. Autoclavar a 121 ºC el recipiente con el medio de cultivo (hidrolizado +sales) y el recipiente

con el extracto de levadura. Tiempo de autoclavado depende del volumen de los recipientes.

Ilustración 2. Cosecha del hidrolizado una vez transcurrido el proceso de incubación.

2.1.3. Preparación de la suspensión de esporas

Este paso se debe realizar manteniendo las condiciones estériles. Es recomendable mantener un

respaldo del hongo en platos de PDA en la refrigeradora, a temperatura ambiente y varias suspensiones

de esporas.

2.1.3.l. Equipos y materiales

• Incubadora.

• Hisopos.

• cámara de Neubauer.


1. Poner a crecer el hongo en platos de PDA + ácido. Incubar a 25 ºC en oscuridad por al menos

1 semana.

2. Una vez que haya crecido y esporulado suficiente, recolectar con un hisopo estéril las esporas

y colocar en un criovial con agua estéril.

39

3. Usando la cámara de Neubauer, contabilizar la concentración de esporas. Para tener una

suspensión con una concentración de 1 x 107, se debe usar aproximadamente 2 platos en 5 mL

de agua estéril.

4. Almacenar dentro de una caja bien cerrada y limpia a 4 ºC.

Ilustración 3. Crecimiento del hongo Umbelopsis isabellina.

2.1.4. Preparación de la semilla, fermentación y análisis de azúcares en la fermentación

2.1.4.1. Equipos materiales

• Botellas de plástico.

• Incubadora.

• Placas Petri.

• Levadura.

• Biorreactor marca Eppendorf, modelo New Brunswick, serie número: B l l 5DN80314 l.

• Cromatógrafo de alta resolución marca agilent 1260 infinity.


l. Calcular cuánta semilla se requiere, considerando que la inoculación se hace al 10% v/v de

medio; por ejemplo, si se quiere inocular 2 L de medio, se debe preparar 200 mL de semilla.

40

No es recomendable preparar toda la semilla junta, sino en varios recipientes, esto para evitar

contaminación de la semilla.

2. Preparar PDB con 8 g/L de extracto de levadura, dejando un espacio aéreo del 80%.

3. Inocular la mezcla preparada en el punto anterior con un 1 % de suspensión de esporas.

4. Colocar las botellas inoculadas en una incubadora a 180 rpm y 27 ºC por 48 horas.

5. Después de 48 horas, tomar una pequeña muestra (dentro de la cámara de transferencia) para

verificar que no haya contaminación.

6. Manteniendo las condiciones estériles, añadir al hidrolizado con sales (medio de cultivo), el

volumen de la disolución de extracto de levadura correspondiente y la semilla.

7. Colocar el hidrolizado inoculado en el biorreactor a 27 ºC y 180 rpm durante 5 días.

8. Analizar el contenido de azúcares durante la etapa de la fermentación según el procedimiento

de azúcares por HPLC del Centro Nacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos (CITA) de

la Universidad de Costa Rica (Artavia, 2018).

Ilustración 4. Hidrolizado en el biorreactor a 27 ºC y 180 rpm.

2.1.5. Cosecha de la biomasa del hongo

Para poder extraer los lípidos del hongo, éste deberá ser separado del medio de cultivo. Además, para

determinar el consumo de azúcares, se deberá tomar una muestra de al menos 1 mL y almacenar en el

congelador hasta su análisis.

41

2.1.5.1. Equipo y materiales

• Centrifuga marca Eppendorf, modelo: Centrifuge 581 O R.

• Equipo de filtración al vacío.

• Estufa.

• Congelador.

• Moledor de café marca Cusinart, modelo: DCG-20.


1. Al finalizar los 5 días de fermentación, el líquido de la biomasa a recipientes de centrífuga.

2. Centrifugar a 3000 rpm por 1 O minutos.

3. Decantar y descartar el sobrenadante, lavar con agua, volver a centrifugar. Repetir este proceso

al menos dos veces para eliminar la máxima cantidad de hidrolizado.

4. Pesar cuántos papeles filtros se considere necesario para filtrar toda la biomasa.

5. Filtrar al vacío.

6. Colocar los papeles con la biomasa en una estufa a 40 ºC hasta que se haya secado.

7. Remover la biomasa del papel con cuidado y moler la biomasa hasta obtener un sólido fino con

el moledor de café.

8. Almacenar en refrigeración hasta que se vaya a realizar la extracción de lípidos.

(a) (b)

Ilustración 5. Proceso de molienda de la biomasa. (a) antes de moler la muestra; (b) después de moler la muestra.

42

2.2. Extracción de lípidos

Mediante una extracción con agua y cloroformo se busca separar la fracción lipídica. Además,

posteriormente a la extracción se realiza una purificación con el fin de eliminar las impurezas del

hongo contenidas en el biodiésel mediante una purificación en columna.

2.2.1. Equipo y materiales

• Cloroformo marcaJ.T. Barker, lote: 9180-03.

• Ultraturrex marca Tissue Tearor, modelo: 985370-395.

• Pipetas Pasteur.

• Embudos.

• Viales.

2.2.2. Procedimiento

1. Pesar 0,5 g de biomasa molida.

2. Agregar 2,5 mL de cloroformo y agitar por 3 min con el Ultraturrax.

3. Añadir otros 2,5 mL de cloroformo y agitar por 1 minuto.

4. Agregar 2,5 mL de agua desionizada y agitar por 1 minuto.

5. Con una pipeta de plástico, remover y descartar fracción superior correspondiente a fase

acuosa.

6. Filtrar para obtener la fase orgánica la cual contiene el material lipídico.

7. Eliminar el cloroformo y pesar el material obtenido.

43

(a) (b)

Ilustración 6. (a) Equipo Ultraturrex utilizado para la extracción; (b) etapa de extracción.

2.2.3. Cromatografía de capa fina y en columna.

1. Usar sílica gel 40 como fase estacionaria y hexano: acetato de etilo 7:3 como fase móvil. 2. Aplicar la muestra en la placa cromatográfica y eluir con la mezcla de disolventes.

3. Poner a secar la placa y medir el corrimiento de las muestras con una regla.

4. Una vez identificada las impurezas, proceder con la cromatografía en columna.

5. Empacar la columna con sílica gel 40 y agregar la mezcla de disolventes hexano: acetato de

etilo 7:3.

6. Agregar la muestra y diluirla con los disolventes hasta separarla en fracciones.

7. Recolectar las fracciones y guardarlas para su posterior análisis.

2.3. Transesterificación


• Equipo para reflujo 24/40.

• Hidróxido de potasio marca Technompey, Lote: 161.

• Metanol marca J.T. Baker, lote: E48B28.

• Plantillas de calentamiento.

44


1. Pesar la cantidad de biomasa que se desea pre-transesterificar y agregar metano) muy

lentamente hasta obtener una relación molar 7: 1 metano): aceite utilizando ácido sulfúrico

como catalizador al 0,6%. La reacción se lleva a cabo de una temperatura de 60 ºC durante 60

minutos con agitación constante.

2. Después del transcurrido el tiempo de reacción, se deja decantar la mezcla de reacción en un

embudo separador. Se retira la fase superior y la fase inferior se lava con agua destilada.

Después del proceso de lavado se coloca la mezcla en una estufa a 11 O ºC por 60 minutos.

3. Una vez terminado el proceso anterior, se procede con la etapa de transesterificación, para esto

se mezcla el aceite tratado previamente con KOH al 1 % con respecto al aceite y con metano(

con una relación molar 7: 1 metano): aceite (véase sección de anexos, apartado 1).

4. Se pone la mezcla en un reflujo por 4 ha 65 ºC con agitación constante.

5. Dejar reposar la mezcla de reacción por 48 h en un embudo separador.

Ilustración 7. Etapa de transesterificación.

2.4. Purificación

El objetivo de esta etapa es eliminar la glicerina que se forma como subproducto de reacción, el

catalizador y metano) remanente, así como el agua que se utiliza en los lavados del biodiésel producido.


• Embudo separador.

• Plantilla de calentamiento.

45

• Probetas.

• Columna de separación.

• Acetato de etilo marca Merck lote 9061702.

• Hexano marca Merck lote 77895423.

• Sílice gel marca Merck lote 5 l 7TA 753430.


2.4.2.1. Sepuraciún de glicerina y eliminación de agua.

1. Separar la glicerina que se forma después de 48 horas.

2. Agregar 15 mL de agua destilada al biodiésel contenido en el embudo separador, agitar y dejar

reposar hasta que se dé la formación de dos capas: biodiésel y jabón.

3. Separar el jabón formado y realizar lavados con agua acidulada hasta alcanzar un pH

comprendido entre 6,5 - 7,0.

4. El biodiésel se seca durante 120 minutos en una estufa a 11 O ºC, luego se enfría a temperatura

ambiente y se almacena en frasco de vidrio ámbar para su posterior análisis.

(a) (b)

Ilustración 8. Etapa de purificación del biodiésel. (a) Separación de la glicerina; (b) separación del jabón. En ambos casos, la glicerina y el jabón corresponden a la capa inferior.

46

2.5. Caracterización (UNE-EN-14103, 2013)(Fuentes & Monge, 2015)

El propósito de esta etapa es determinar el contenido de F AME del biodiésel producido.


• Cromatógrafo de gases marca HP 6890 serie 11. Columna capilar marca Supe leo (EQUITY-1) de

sílice fundida, de 30 m de longitud, con un diámetro interno de 0,25 mm y 0,25 µm de espesor de

película, con fase estacionaria de poli(dimetil siloxano), que funciona con una temperatura

máxima de 350 ºC, con inyector split/splitless y detector de ionización de llama FID.

• Patrón FAME mix C8-C24 marca Supelco, lote: XA24588V.

• Patrón Nonadecanoato metílico marca Sigma, Lote: BCBV8809.

• Tolueno.

• Balanza analítica de 5 decimales.

• Pipeta Pasteur.

• Probetas de 1 O mL.


l. Pesar con precisión unos 100 mg (precisión± O, 1 mg) de la muestra de biodiésel purificada

en un vial de 1 O mL.

2. Pesar con precisión unos 100 mg (precisión± O, 1 mg) del nonadecanoato metílico en el vial

que contiene la muestra de biodiésel.

3. Diluir con 1 O mL de tolueno.

4. Analizar 1 µL de esta disolución mediante cromatografía de gases de acuerdo con las

condiciones descritas en el apartado 11 de los anexos

5. Realizar la identificación de picos en la muestra utilizando la información brindada en los

anexos, apartado 111

47

Ilustración 9. Cromatógrafo de gases utilizado para la caracterización del biodiésel y para la determinación de glicerina.

2.6. Pruebas de calidad.

2.6.1. Determinación de glicerina libre y total (06584-00, 2014)(Fuentes & Monge, 2015)

2.6. J. J. Equipo y materiales

• Cromatógrafo de gases marca HP 6890 serie 11. Columna capilar marca Agilent, modelo BD

ASTM 06584, de 15 m de longitud con un diámetro interno de 0,32 mm y O, 1 µm de espesor

de película, que funciona a altas temperaturas (hasta 400 ºC), con inyector cool on column.

• Balanza analítica con resolución de O, 1 mg.

• Balones aforados de l 0,00 mi, 25,00 mi y 50 mi.

• Capilla extractora de gases.

• Cronómetros.

• Jeringa de 10,00 µI para inyección en cool on column.

• Jeringas de 100,00 µI y 250,00 µl.

• Viales de vidrio de 1 O mi con septum de PTFE.

• Heptano grado reactivo.

• N-metil-N-trimetilsilil-tritluoroacetamida (MSTFA) grado reactivo.

• Piridina grado reactivo.

48


1. Pesar con precisión 100 mg de la muestra de biodiésel (precisión± O, 1 mg) y agregar 100 µL

de cada estándar interno (butanotriol y tricaprin) y 100 µL de MSTFA.

2. Agitar por 3 min y dejar reposar por 15 min.

3. Añadir 8 mL de heptano.

4. Preparar la curva de calibración de patrones de glicerina, monoleína, dioleína, trioleína,

butanotriol, tricaprin.

5. En un vial, colocar la alícuota indicada de cada patrón (véase apartado IV de los anexos) y

agregar 100 µL de cada estándar interno ( butanotriol y tricaprin) y 100 µL de MSTFA.

6. Se repiten los pasos 2 y 3 de este apartado.

7. Analizar 1 µL de esta disolución mediante cromatografia de gases.

2.6.2. Determinación del porcentaje de agua (ASTM 06304, 2016)

2.6.2. J. Equipo y materiales

• Jeringa de vidrio o plástico.

• Equipo Metrohm 852 de Karl Fischer provisto con un stand coulombimétrico, un stand

volumétrico y un controlador digital (touch control).

• Papel toalla o absorbente.

• Balanza analítica.

• Dosinos:buretas automáticas.

• Hydranal coulomat CG: reactivo utilizado en el método de análisis Coulombimétrico como

cato lito.

• Hydranal coulomat AG-H o AG:reactivo utilizado en el método de análisis

Coulombimétrico como anolito, se recomienda utilizar el anolito Coulomat Oíl si la muestra

que se va a analizar es un aceite.

• Composite 5: reactivo utilizado para el método volumétrico. Es el valorante que contiene

yodo en metanol.

• Metanol: reactivo utilizado para el método volumétrico. Contiene dióxido de azufre disuelto

en metanol.

49


1. Extraer con una jeringa aproximadamente 4 mL del biodiésel, eliminar las burbujas, y secar

cuidadosamente la punta de la jeringa

2. Colocar en una balanza analítica y pulsar el botón ''tarar".

3. Inyectar aproximadamente entre 0,5 y 2 g de la muestra en el equipo Karl Fisher.

4. Colocar nuevamente la jeringa en la balanza previamente tarada y obtener por diferencia la

masa de muestra analizada.

5. Digitar el valor anterior de masa en el equipo y permitir que el equipo automáticamente

determine la cantidad de agua en la muestra.

Ilustración 10. Equipo utilizado en la medición del porcentaje de agua presente en la muestra de biodiésel.

2.6.3. Determinación de la estabilidad a la oxidación (UNE-EN-14112, 2003)

2.6.3./. Equipo y materiales

• Filtro de aire.

• Bomba de gases de diafragma.

• Viales de reacción.

• Electrodos.

• Aparato de medida y registro que incluye un amplificador y un registrador.

• Termómetro de contacto.

50

• Bloque calefactor.

• Pipetas de 50,00 mL.

• Horno.

2. 6.3.2. Procedimiento

1. Pesar con precisión 3 g de la muestra (precisión ± 0,0001 g) en el vial de reacción.

2. Llenar las cubetas de medida con 50 mL de agua destilada.

3. Encender la bomba de gases de diafragma y fijar el flujo de exactamente 10 l/h. Conectar los

tubos de entrada y salida de aire con los viales de reacción y las cu betas de medición, utilizando

las gomas de conexión

4. Introducir el vial de reacción con el tapón de sellado en el baño calefactor.

5. Dejar que el equipo en funcionamiento hasta alcanzar el l 00% de la escala de registro.

Ilustración 11. Equipo utilizado en la medición de la estabilidad a la oxidación.

51

Capítulo 3

Resultados y discusión

3.1. Prensado del sólido e hidrólisis enzimática

El primer paso para la obtención de biodiésel consiste en triturar y prensar el rastrojo de piña, con

el fin de aumentar el área de contacto, facilitando el acceso de las enzimas a las fibras de la celulosa y

hemicelulosa y aumentado de esta manera el rendimiento de la hidrólisis (Morales, 2015),(Rinaldi &

Schuth, 2009).

En el cuadro V se muestran las características químicas de la piña triturada antes de realizar el proceso de hidrólisis enzimática.

Cuadro V. Características fisicoquímicas de la planta entera de piña .

Sólidos

29± 1 42 ± 1 4,7 ±0,2 45 ± 1 0,8 ± O,,,_l ___ -1

55 ± 1 Sólidos totales % 27 ± 1 Sólidos volátiles (% 26±1

Como se puede ver en el cuadro V el material lignocelulósico es complejo, donde contiene altas

cantidades de hemicelulosa, celulosa y lignina tal y como se mencionó previamente en el estado de la

cuestión. Por esta razón, el material prensado y cortado de la ñonga se sometió a hidrólisis enzimática

con el fin de romper las estructuras de celulosa y hemicelulosa y generar más azúcares sencillos como

glucosa y xilosa. Estos monosacáridos son un sustrato adecuado para la etapa de fermentación.

Con el objetivo evaluar el proceso de hidrólisis, se procedió a realizar un análisis de azúcares

reductoras mediante HPLC. Los datos se muestran en la figura 11.

52

12,0 24,0 36,0 48,0 60,0 72,0 84,0 120.0 Tiempo (horas)

-+-Glucosa ...,._ Xjl()~ª -+-Acido ª-~~ticQ_

Figura 11. Liberación de azúcares y ácido acético a través del tiempo en hojas de piña expuestas a un pretratamiento de 15 min a 121 ºC, seguido por cinco días de hidrólisis enzimática ( l 7 FPU/g celulasa y 37 U/g xilanasa) a 50 ºC y 180 rpm.

En la figura 11 se puede observar que la concentración de glucosa y xilosa aumentan con el

transcurso del proceso de hidrólisis. Es decir, con este análisis se puede comprobar, que esta etapa fue

adecuada y se pudo realizar la transformación de polisacáridos (celulosa y hemicelulosa) a

monosacáridos de cinco y seis átomos, como xilosa y glucosa. Además, en la figura 11 se muestra la

producción de ácido acético, que surge de la degradación de la glucosa. La cantidad de este ácido

orgánico se mantiene constante y a una baja concentración, lo que quiere decir que la degradación de

la glucosa fue baja, lo cual resulta adecuado ya que la glucosa y la xilosa como se mencionó

anteriormente son los sustratos que se requieren para la etapa de fermentación.

En el Cuadro VI se detallan los rendimientos obtenidos de las hidrólisis realizadas en el presente

trabajo final de graduación con sus respectivos porcentajes de rendimiento.

Cuadro VI. Rendimientos de las hidrólisis realizadas para la obtención de biodiésel.

Hidrólisis Masa del líquido Masa FSf;i inicial diluida Masa coctél enzimático añadido Rendimiento

l 1445,5 4000 225,1 38,3

2 1259,5 3600 136,0 36,4

3 2069,8 4000 277,3 55,6

4 1162,4 3200 194,5 38,7 - 1 -

-

5 852,1 3200 191,8 28,3

6 1876,2 6000 235,0 32,5

7 1479,9 4000 211,1 39,1

Como se observa en el cuadro VI, se realizaron varias etapas de hidrólisis y en promedio se obtuvo

un porcentaje de rendimiento del 38,4% de hidrolizado, lo que representa la cantidad fermentable en

la biomasa del rastrojo de piña.

53

La cantidad total de hidrolizado producida es aproximadamente 2 L por cada 4 kg de ñanga.

3.2. Fermentación

El siguiente paso en la metodología necesario para producir biodiésel, consiste en inocular el

sustrato generado en la etapa anterior con microorganismos con la habilidad de degradar

monosacáridos y acumular lípidos. Entre esos microrganismos se destaca el hongo Umbelopsis

isabel/ina el cual tiene capacidad para crecer en sustratos sólidos de baja actividad de agua y, además,

tiene habilidad para acumular lípidos (García, 2008).

Para este proyecto se escogió este hongo debido a sus altos niveles de acumulación de

triacilglicéridos intracelulares, donde acumula lípidos en más del 40% de su biomasa, además, de su

versatilidad en la utilización de nutrientes y alta tasa de crecimiento (Takeda et al., 2014),(Rosi,

Arnaretti, & Leonardi, 2004),(Anastasiou, Lorentz, Stein, & Mitchell, 2014)

La figura 12 muestra un esquema simplificado del metabolismo de un organismo oleaginoso. El

organismo usa una fuente de carbono, que en el caso específico de este proyecto son los azúcares de

la ñonga, una fuente de nitrógeno (levadura) y oxígeno para producir material celular, lípidos,

carbohidratos, C02, agua y material libre de lípidos.

Figura 12. Esquema simplificado del metabolismo del hongo U mbelopsis lsabellina. Adaptado de (Meeuwse et al., 2012).

Una fuente de nitrógeno en la producción de lípidos microbianos es muy importante, ya que

los lípidos se producen principalmente cuando se agota la fuente de nitrógeno. Cuando la fuente de

carbono y nitrógeno se agotan casi simultáneamente se limita la producción de lípidos. Asimismo, la

difusión de oxígeno en la biopelícula también afecta esta producción (Meeuwse et al., 2012).

54

En el cuadro V se puede apreciar que la relación carbono/nitrógeno es alta, por ende, se tiene una

influencia significativa en el crecimiento y esporulación del hongo, lo que favorece el proceso de

fermentación, tal y como se puedo observar experimentalmente, donde se pudo observar un

crecimiento alto (véase ilustración 3). Por otro lado, debido al alto contenido de nitrógeno presente en

la biomasa de la piña tal y como se detalla en el cuadro V, no se requirió de una fuente adicional de

nitrógeno, como levadura, para realizar esta etapa.

Con este tratamiento se obtuvo un rendimiento de 30% en masa de lípidos. Según lo reportado en

la literatura, el rendimiento de la fermentación utilizando Umbe/opsis isabellina varía dependiendo de

las condiciones de esta etapa, especialmente de la concentración de la fuente de carbono (Gardeli et

al., 2017), (Batrakov, Konova, & Sheichenko, 2004).

En la investigación de (Gardeli et al., 2017) se reportó que el máximo rendimiento de producción

de lípidos fue de 61 %; esto cuando la glucosa fue la única fuente de carbono empleada, mientras que

el rendimiento más bajo (3 7%) fue cuando se utilizó xilosa como fuente de carbono. La concentración

de xilosa en el medio de crecimiento se correlacionó a la inversa con la acumulación de lípidos. Al

aumentar las concentraciones de xilosa en la mezcla, el almacenamiento de lípidos disminuyó,

mientras que se produjo xilitol en concentraciones significativas.

Como se puede apreciar en la figura 11 (véase página 53), el hidrolizado contiene 14,0 g/L de

xilosa y 28,5 g/L de glucosa como fuentes de carbono, por lo cual, la concentración de xilosa es

probablemente la que esté afectando el rendimiento en la fermentación. Esta correlación, que entre

mayor sea la concentración de xi losa menor es el rendimiento en la fermentación se debe a que durante

el catabolismo de la xilosa por levaduras o cepas de hongos, la xilosa se reduce inicialmente a xilitol

por el NADH y, posteriormente, se secreta el xilitol de la célula (para los microorganismos

productores de xilitol) o se oxida a xilulosa por una xilitol deshidrogenasa dependiente de NAO o

NADP, seguida de su fosforilación para producir la síntesis de xilulosa-5-P (Zikou, Chatzifragkou,

Koutinas, Papanikolaou, & S., 2013).

Las enzimas implicadas con el metabolismo de la xilulosa-5-P están saturadas y no pueden

canalizar aún más el flujo de carbono hacia la síntesis de aceti!CoA, o falta NADPH intracelular

indispensable para la síntesis de lípidos microbianos, y por esta razón se produce el cambio metabólico

y la producción de xilitol (Zikou et al., 2013). Los pasos metabólicos y de regeneración de cofactores

en la conversión de xilosa en xilitol se muestran en la figura 13.

SS

Figura 13. Metabolismo para la generación de xilitol en el hongo Umbelopsis lsabellina. Imagen obtenida de (Rojas, 2013 ).

Por otro lado, para verificar el proceso de fermentación se realizó el estudio de consumo de

azúcares reductores, tal y como se muestra en la figura 14 que muestra la variación de la concentración

de la glucosa en función del tiempo de fermentación.

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o o 1 2 3 4 5 6

1 Tiempo de la fermentación (días)

-- --

Figura 14. Consumo de glucosa a través del tiempo durante la etapa de fermentación. Condiciones: 180 rpm, 27 ºC durante 5 días. Coeficiente de variación de los datos: 5%.

Como se aprecia en la figura anterior, la concentración de la glucosa disminuye con el transcurso

de la fermentación, debido que el hongo Umbelopsis isabellina tiene la habilidad de degradar

monosacáridos como la glucosa y acumular lípidos.

56

3.3. Extracción de lípidos

El primero paso de la extracción consiste en moler la biomasa utilizando el equipo

Ultraturrex®. Esto se debe a que el tamaño de la partícula determina cuanto material se extrae y a que

velocidad se realiza la extracción. Cuanto se tiene una molienda más fina, el flujo de disolventes es

más lento, por lo cual, el tiempo de contacto es mayor y se favorece la extracción de los lípidos. Entre

mayor sea el grado de trituración se favorece la disolución y menor es el tiempo necesario para alcanzar

el equilibrio de concentraciones y, por ende, menor es el tiempo de extracción (Wankat, 2006)

El siguiente paso consiste en una extracción líquido-líquido, la cual se lleva a cabo entre dos

líquidos inmiscibles entre sí. El compuesto de interés, en este caso los lípidos se reparten entre ambos

disolventes hasta llegar a un punto de equilibrio.

En el presente proyecto, la extracción de lípidos contenidos en el material lignocelulósico del

hongo Umbelopsis isabellina se realizó utilizando dos sistemas de disolventes, metano!: cloroformo:

agua (2:2: 1) y cloroformo: agua (2: 1 ).

45 ~ o 1

~ 40 QI ·e 35

~ 30 ~ 25 QI

~ 20 1

-~ 15 i ~ 10 ' QI u :s 5 i o. o _,

40%

• Sistema 1

• Sistema 2

1

Sistemas de disolventes _ _J

Figura 15. Porcentaje de lípidos extraídos utilizando dos sistemas de disolventes diferentes. Sistema 1 metano!: cloroformo: agua (2:2: 1 ). Sistema 2 cloroformo: agua (2: 1 ).

El éxito de una extracción depende de la relación de las concentraciones del compuesto a

extraer en cada disolvente a una temperatura dada. Esa relación es llamada coeficiente de reparto, K,

la cual depende de la temperatura del par de disolventes considerados (Wells, 2003)

K = (Alz (A]¡

57

( 1)

Donde [Alz representa la concentración en el equilibrio del compuesto a extraer en el disolvente 2

y [A] 1 la concentración en el equilibrio en el disolvente 1. Además, la solubilidad del extracto en el

disolvente 2 es mayor que en disolvente 1.

Dichas concentraciones en el equilibrio se pueden relacionar con la solubilidad del extracto en cada

disolvente puro, por consiguiente, el rendimiento de una extracción se correlaciona con la solubilidad

relativa del compuesto a extraer en el par de disolventes elegidos (Wells, 2003)

Es decir, los lípidos tienen una mejor solubilidad relativa en el sistema 2 que con respecto al sistema

1. Esto se debe a que existe mayor semejanza entre las propiedades eléctricas de los lípidos y el sistema

2, por lo cual, las fuerzas intermoleculares son mayores, propiciando la disolución de una en la otra.

Por otro lado, en esta etapa se obtuvo un porcentaje de rendimiento del 40%, lo cual resulta alto

con respecto a lo reportado en algunos artículos (Plata, Kafarov, & Moreno, 2009), donde se reporta

que los rendimientos en este proceso son menores al 30%

3.4. Proceso de esterificación

Existen diferentes variables que afectan la conversión completa de triglicéridos en ésteres alquílicos, entre las cuales se destaca la siguiente.

3.4.1. Acidez y humedad Para tener una reacción con una conversión alta es necesario que la materia prima posea un

contenido de ácidos grasos libres menor al 3% ya que cuanta más alta sea la acidez en el aceite, se

obtendrán porcentajes de conversión más bajos. Del mismo modo entre mayor sea la proporción de

ácidos grasos libres y humedad, se disminuye el rendimiento ya que se produce como reacción

secundaria la reacción entre los triglicéridos y el catalizador para producir jabones (García, 2006). Esta

reacción se llama saponificación.

58

CH 2 - O - CD - R1

CH 2 - 0 - CO - R1

CH - O - CO - R2

CH2 - O - CO -R3

Triacilglicérido

+ KOH

Figura 16. Reacción de saponificación.

Jabón potásico

CH 2 - OH

+ CH - OH

CH2 - OH

Glicerina Libre

Para prevenir esta reacción se debe controlar la cantidad del catalizador, ya que un exceso de

este ocasiona que de la formación del jabón. Además, se debe utilizar aceites y alcoholes anhidros

porque el agua favorece la saponificación. Al mismo tiempo se debe eliminar los ácidos grasos libres

presentes en el aceite ya que estos pueden reaccionar con el catalizador en presencia de agua

produciendo de igual manera jabón (García, 2006). Para eliminar los ácidos grasos libres se utiliza una

neutralización, en la cual se calienta el aceite a 75 ºC y se añade una base, en la mayoría de los casos

hidróxido de sodio, en una cantidad tal que neutralice los ácidos grasos libres en el aceite y con un

exceso de manera que favorezca la separación de jabones (Avellaneda, 2010).

"20 R-COOH + KOH

Ácido graso Jabón potásico

Figura 17. Reacción de neutralización de los ácidos grasos.

Otro proceso que se puede utilizar cuando se tiene un aceite con alta acidez es una

preesterificación. En este caso los ácidos grasos libres se convierten en alquil éster por acción del

alcohol.

R - COOH Ácido graso

+ CH3 0H KOH• Metano!

59

R - COO - CH3

Metil ester

Figura 18. Reacción de preesterificación utilizando metanol y KOH.

La preesterificación debe ser completada con una catálisis alcalina para terminar de convertir

los triglicéridos remanentes y debe esta manera aumentar el porcentaje de conversión.

Experimentalmente, se obtuvo que el porcentaje de acidez fue del 5%, por lo cual se realizó

una preesterificación como fase previa con el fin de mejorar el porcentaje de conversión de triglicéridos

a biodiésel. El porcentaje de conversión a F AMES sin y con preesterificación se muestra en la figura

19.

..... 35,0 o ~ 30,0 e: :~ 25,0 (¡j ~ 20,0 o ~ 15,0

"O QJ 10,0 -~ .... ~ 5,0 u

o 0,0 c..

33.6

• Sin preesterificación

• Con preesterificación

2,9

1

Biodiesel

Figura 19. Porcentaje de conversión utilizando preesterificación y aceite sin preesterificar utilizando cloroformo y agua como disolventes en la extracción.

Podemos observar que con el aceite preesterificado se favorece la contenido de metil ésteres

(33,6±0, 1 %) en masa, debido a que con el aceite utilizado tiene una alta acidez y al utilizar esta fase

previa se convierte los ácidos grasos libres en metil ésteres y posteriormente con la transesterificación

los triglicéridos remantes se transforman en biodiésel.

(a) (b)

Ilustración 12. (a) Biodiésel a partir de aceite sin preesterificar. (b) Biodiésel a partir de aceite preesteri ficado.

60

Por último, el rendimiento del proceso de esterificación fue del (80± 1) % en masa, antes de la

purificación el resultado acorde para una transesterificación utilizando catalizadores básicos como

KOH, según lo indicado en la literatura (Li & Guo, 2017)

3.5. Purificación

Una vez finalizada la reacción de transesterificación y de dejar reposar la mezcla de reacción se da

una separación de fases debido a la inmiscibilidad de las mismas; la glicerina y el biodiésel. La primera

(fase inferior) debe separarse por medio de decantación o centrifugación y puede ser utilizado en otras

aplicaciones, como por ejemplo en la elaboración de productos cosméticos.

Después de la separación de la glicerina, el biodiésel debe lavarse con agua para eliminar restos de

metanol y KOH remanentes y glicerina, los cuales afectan la calidad del biodiesel como se detallará

más adelante. Utilizar agua acidula es recomendable para neutralizar los jabones que se puedan formar

y eliminar trazas de glicerina (Avellaneda, 2010). Posteriormente el biodiésel debe ser secado para

eliminar el agua remanente.

Debido a que el análisis cromatográfico de gases mostraba un porcentaje de conversión a Fames

muy bajo (33,6±0, 1) % en masa (vease sección 3.6 caracterización), se procedió a realizar una revisión

bibliografica de posibles compuestos contenidos en el hongo, los cuales posteriormente podrían quedar

en el biodiésel como impurezas, y de esta manera causar interferencias en la determinación del

contenido de Fames.

Con la revisión de literatura se encontró que los hongos contienen en su membrana celular

esteroles, siendo el ergosterol el componente principal (Gardeli et al., 2017) (Takeda et al., 2014), por

lo cual, se procedió a realizar un análisis a la muestra extraída mediante RMN-Hl para confimar si

contenía ergosterol como contaminante. La muestra analizada mediante esta técnica instrumental fue

la muestra extraída con el sistema de dislventes agua-cloroformo ( 1 :2). A continuacion, en la figura

20 y 21 se muestra respectivamente un espectro patrón para una muestra típica de triglicéridos y el

espectro obtenido experimentalmente.

61

o H(h) (c)2HC - O (af'i H(a)

1

_.............._,,,.... CH3 o H(h) (h)

(b)HC - 0 u ':f(h) _,,. = 1 o CH30>

(c)2HC - O - ~ 'ie';\g) ~f) (a ji H(a) H(h) (i) -......,,.,,,. - CH3(i) "' H H(g)

H(f) H(dl H(d) (e)

(a) (e)

(d) (j) (f)

(g) (e)

(b)

6 5 4 3 2 11

Figura 20. Espectro RMN-Hl de una muestra patrón de triglicéridos. Obtenido de ("SciELO - Scientific Electronic Library Online," 2018).

lhl' 11

1

/'

111

lb) (e)

'\

l•I lf) t \

l•l

i5 4 3 2

6 /ppm

Figura 21. Espectro RMN-Hl de la muestra extraída.

62

Mediante la comparación de las figuras 20 y 21 se pude notar que en la muestra extraída hay

diferencia entre las señales típicas del patrón de triglicéridos y el del extracto, por ejemplo, en la figura

21 un pico entre las señales "c" en 4,08 ppm. Esta señal no se encuentra en la figura 20. Además, en

la figura 21 hay una señal 3,60 ppm, no así en la figura 20. A través de estos datos espectrales y

mediante comparación con la literatura (Márquez, Juárez, & Trigos, 2013) (Moreno & Martínez, 2011)

se evidencia que es probable que estas señales se traten de esteroles tales como, ergosterol, peróxido

de ergosterol, cerevisterol, 3p,5a,6p, 9a-tetrahidroxiergosta-7,22-dieno y 3p,5a, 9a-trihidroxiergosta-

7,22-dien-6-ona, esteroles los cuales su RMN-1 H son muy parecidos. Además, varios autores han

reportado, que después de la fermentación, lo lípidos obtenidos tienen presencia de los esteroles

mencionados (Martínez, Alvarez, Campi, Bravo, & Vila, 2015) (Gardeli et al., 2017). Para tener

información adicional, se procedió a realizar un análisis por cromatografia de capa fina, donde se

obtuvo varias señales como se muestra en la ilustración 13.

En la señal identificada como "A", se obtuvo un Rf= 0,49, el cual es muy cercano al

desplazamiento que tiene el Ergosterol al aplicarle la misma mezcla de disolventes en la misma

proporción. Dicho Rf es de 0,5 (Moreno & Martínez, 2011 ).

Es decir, todas las evidencias apuntan a que la muestra extraída contiene Ergosterol como

impureza, por lo tanto, se recomienda caracterizar esa impureza por medio de técnicas instrumentales

tal como cromatografia de gases.

1

Ilustración 13. TCD para identificar impurezas en la muestra debido al hongo Umbelopsis lsabellina. Mezcla de disolvente: Hexano:acetato de etilo (7:3). El punto identificado como A es el desplazamiento para Ergosterol. La línea negra muestra el desplazamiento del Ergosterol desde su punto de aplicación hasta su corrimiento final. La línea azul muestra el desplazamiento del disolvente.

63

Figura 22. Compuesto Ergosterol.

Una vez identificado el compuesto se realizó una purificación en columna utilizando sílica gel

40 como fase estacionaria y hexano: acetato de etilo 7:3 como fase móvil (Martínez et al., 2015)

(Márquez et al., 2013). En la cromatografia de columna, se establece un equilibro entre la muestra

absorbida en la fase estacionaria (Si02) y la fase móvil que fluye por la columna. Como cada uno de

los componentes de la mezcla interactúan de manera diferente con la fase móvil y estacionaria, estos

eluyen a diferentes velocidades lográndose la separación.

La fase estacionaria (sílica gel) tiene un carácter polar, mientras que el sistema de disolventes

empleados (hexano/acetato de etilo) son no polares, por lo tanto, los compuestos con menor polaridad

van a eluir primero y los compuestos afines a la fase estacionario (mayor polaridad) serán retenidos

mayor tiempo y su tiempo de elución será mayor.

Comparando las figuras 1 y 22, se puede apreciar los triglicéridos tienen mayor cantidad de

grupos polares que el ergosterol, es decir, el ergosterol es más afina la fase móvil y sus fracciones son

las primeras en eluir de la columna cromatográfica.

64

Ilustración 14. Cromatografia de columna para eliminar Ergosterol de la muestra de biodiésel. Mezcla de disolventes: Hexano: acetato de etilo (7:3).

3.6. Caracterización

A continuación, en el cuadro VII se muestra los resultados obtenidos de F AMES para los dos

sistemas de extracción empleados.

Cuadro VII. Contenido de Fames obtenido para dos sistemas de disolventes estudiados.

metano!: cloroformo: agua cloroformo: agua (2:1). (2:2:1 )

Sustancia {±0,1%) en masa (±0,1%) en masa C16:0 0,5 0,4

C18:3n6 0,3 0,3 C20:0 0,4 1,0 C22:0 1,1 1,2

Contenido de Fames 2,9 (±0.1%) en masa 2,3

Tal como se puede observar en el cuadro VII, el contenido de Fames es bajo. Esta baja pureza

en el biodiésel obtenido se puede deber a que el aceite obtenido tiene una alta acidez, por esta razón se

procedió a realizar la determinación del porcentaje de acidez en el aceite.

Como se mencionó en la sección 3.4 de proceso de esterificación, el resultado obtenido fue de

5% de acidez, por lo cual se realizó una preesterificación como fase previa con el fin de mejorar el

porcentaje de conversión de triglicéridos a biodiésel.

65

Cuadro VIII. Contenido de Fames utilizando una preesterificación como fase previa a la transesterificación. La extracción se realizó utilizando cloroformo y agua como disolventes.

Sustancia {±0,1%) en masa Cl6:0 6,2

Cl8:3n6 10,4 C20:0 9,0 C22:0 8, 1

Contenido de Fames 33,6

A pesar de que el contenido de Fames se incrementa notablemente, sigue estando por debajo de lo

especificado en el reglamento técnico centroamericano, el cual estipula que el mismo debe ser mínimo

del 96,5%.

Por dicha razón, se realizó la purificación en columna mencionada en la sección anterior, y se

procedió a determinar nuevamente el contenido de ésteres metílico en el biodiésel; obteniéndose los

resultados mostrados en el cuadro IX y en la figura 23.

Cuadro IX. Contenido de Fames en el biodiésel utilizando como fase previa una purificación en columna.

Sustancia Tino de ácido (±0, 1 % ) en masa Cl6:0 Palmítico 4,3

Cl8:3n6 Gamma linolénico 26,4 Cl8:0 Esteárico 2,1 C20:0 Araouídico 1,1 C21:0 Heneicosanoico 5,0 C22:0 Behénico 6,9

Contenido de Fames - 45,8

66

-" •

..

Figura 23. Cromatograma obtenido para el biodiésel producido con un contenido de FAMES de (45,8± 0,1) % analiz.ado mediante cromatografía de gases. Véase sección experimental para las condiciones y equipo utiliz.ado.

Como se observa en el cuadro IX, el biodiésel de rastrojo de piña está constituido

mayoritariamente por triglicéridos formados por ácido gamma linolénico, el cual es un ácido

poliinsaturado, que se encuentra presente en el aceite de onagra, en aceites vegetales como el girasol,

uva, lácteos, grasas animales y semillas (bibliografía). Por otro lado, la composición de ácidos grasos

de los lípidos celulares totales de Umpelobsis isabellina obtenidos durante el crecimiento a base de

glucosa y xilosa, son similares a los reportados en otras investigaciones (Gardeli et al., 2017)

Por otra parte, al purificar la muestra de biodiésel, se elimina la impureza del Ergosterol, por

consiguiente, la masa del biodiésel ya no contempla esa masa generando que el contenido de Fames

en el biodiésel se incremente. Para poder alcanzar la especificación de la pureza de biodiésel indicado

en el reglamento técnico centroamericano, es ineludible seguir purificando la muestra y mantener

controlado rigorosamente todo el proceso con el fin de eliminar humedad, impurezas, materia no

convertida o cualquier otra afectación que provoque bajos porcentajes de pureza de Fames.

67

3.7. Parámetros de calidad

En el cuadro X se muestran los resultados obtenidos para lo parámetros de calidad analizados en

la muestra de biodiésel. Dichos parámetros fueron Glicerina libre y total, contenido de agua y

estabilidad a la oxidación.

Cuadro X. Resultados de los análisis de calidad del biodiésel de rastrojo de piña.

Análisis Método Resultado 1 nccrtidumbrc

Unidades Normativa Cumplimiento ±

Contenido de ASTM 0,03 () .() 1

%en Máximo 06304 volumen 0,05

SI agua

Glicerina ASTM 0,02 (l.(ll %masa

Máximo si

libre 06584 0,020

Estabilidad a EN 14112 0,3 IU hora

Mínimo ó la oxidación h

no

FAMES EN 14103 45,8 1,1 %masa Mínimo

96,5 no

El no cumplimiento del parámetro de estabilidad a la oxidación debe a que el biodiésel

producido contiene ácidos grasos poliinsaturados y probablemente impurezas de esteroles que también

poseen insaturaciones, lo que provoca que el biodiésel tenga una baja resistencia a cambios fisicos y

químicos debido a la interacción con el medioambiente y por consiguiente sea más propenso a la

oxidación (Ahmad, Khan, Zafar, & Sultana, 2012),(Aguilar, Rodríguez, González, & Ríos, 2015).

El bajo contenido de agua significa que el proceso de purificación es altamente eficiente. El

bajo contenido de agua se asegura que este biocombustible producido no cause corrosión en los

componentes del motor y, además, se evita un ambiente apto para la propagación de microorganismos.

68

A continuación, se detalla el análisis de cada parámetro.

3.7.1. Glicerina

La glicerina puede estar presente en el biodiésel de dos formas; como glicerina libre que

corresponde a un producto derivado de la reacción de transesterificación y como glicerina total la cual

es la suma de la glicerina libre y glicerina ligada. La glicerina ligada se refiere a la suma de

monoacilglicéridos, diacilglicéridos y triacilglicéridos que provienen de reacciones incompletas de

esterificación (W ong, 2015) . Mediante la determinación de este parámetro por cromatografia de

gases, se pudo verificar que la muestra de biodiésel solo contiene glicerina libre, es decir, no contiene

monoglicéridos ni diglicéridos, por consiguiente, la reacción de transesterificación es completa, esto

al no haber sustancias intermedias.

El cuadro XI muestra los tiempos de retención relativos para la identificación de picos en la muestra

de biodiésel.

Cuadro XI. Tiempos de retención relativos para la identificación de picos en la muestra de biodiésel.

1 ---Comoonente Tiemoo de Retención Relativo

ASTMD6584 CELEQ 1 12,4 Butanotriol 1.00 l ,00

Glicerina 0,85 0,86 TricaPrin 1,00 l 00 Monoacil t!licéridos 0.83 - 0.86 0,86 Diacil1d icéridos l,05 - 1,09 1,08 Triacili;:licéridos 116 - 1.31 1,27

En la figura 24 se muestra el cromatograma del biodiésel de rastrojo de piña para la determinación de

glicerina.

69

1 1

1

Butanotriol ( Sl}

1/ Tricaprin (52)

t1l / e ¡: Q¡

Metil ésteres (FAMES) .~

~. l3

f.Ll -J l -

~· ~ .

;

10 20

Minutos

Figura 24. Cromatograma para la detenninación del contenido de glicerina en el biodiésel producido analizado mediante cromatografía de gases. Véase sección experimental para las condiciones y equipo utilizados.

Una alta conversión de esteres alquílicos aseguran una baja concentración de glicerina total,

por su lado la glicerina libre depende del proceso de producción, donde un valor alto indica una mala

purificación del biodiésel y provoca una incrementos en las emisiones de aldehídos y acroleínas que

provocan perjuicios en la salud humana y animal (Chaves & Espinoza, 2013) (Ruiz, 2016). Por esta

razón se recomienda lavar el biocombustible con agua caliente o con agua acidulada.

A nivel mecánico, una alta concentración de glicerina aumenta la viscosidad del biodiésel,

generando problemas de depósitos en el inyector, obstrucción de los filtros, daños en los sistemas de

inyección debido a la presencia de compuestos inorgánicos y jabones que se acumulan en la glicerina

y una mala combustión a altas temperaturas (Chaves & Espinoza, 2013).

3.7.2. Contenido de agua

El biodiésel es una sustancia higroscópica y absorbe 40 veces más agua que el diésel. La

presencia del agua en este biocombustible causa corrosión en los componentes del motor y bajo

condiciones ácidas genera daños en los tanques de almacenamiento. Otra problemática es que el agua

crea un ambiente apto para propagación de microorganismos, los cuales provocan la formación de

lodos que pueden obstruir los filtros. Por otro lado, algunos microorganismos tienen la capacidad de

convertir el azufre contenido en el biodiésel en ácido sulfúrico que causa corrosión en los tanques de

almacenamiento (Avellaneda, 2010). El biodiésel generado tiene un (0,03±0,01) % en volumen, por

70

consiguiente, cumple con el contenido máximo de agua permitido (0,05% en volumen), y no se tiene

la problemática de un ambiente húmedo que cause la propagación de microorganismos.

3.7.3. Estabilidad de oxidación

Cuando ocurre la oxidación del biodiésel ocurren cambios en las propiedades del mismo tales

como un aumento en el índice de acidez, en la viscosidad y en el índice de peróxido y una disminución

en el índice de yodo y en el contenido de alquilesteres. Todos estos cambios afectan adversamente la

calidad del biodiésel, por lo cual los estudios de estabilidad a la oxidación son de suma importancia

(Zuleta, Ríos, & Calderón, 2012).

La estabilidad a la oxidación se define como la resistencia a cambios fisicos y químicos debido

a la interacción con el medio. Este parámetro es útil para determinar el tiempo de almacenamiento y

la degradación del combustible durante su almacenamiento (Avellaneda, 201 O).

La estabilidad obtenida en el biodiésel fue de (0,3±0,3) h, por lo cual este parámetro no cumple

con la especificación. Esto se puede se debe a que el biodiésel de rastrojo de piña contiene

mayoritariamente ácido gamma linolénico, el cual es un ácido poliinsaturado y por tal razón, al

contener instauraciones es más propenso a oxidarse lo que genera una baja estabilidad a la oxidación

(Aguilar et al., 2015),(Rodríguez, Villanueva, Glorio, & Baquerizo, 2015),(Ahmad et al., 2012).

Asimismo, las posibles impurezas del biodiésel, como esteroles, contienen insaturaciones lo que

contribuye al no cumplimiento en este parámetro.

Para solucionar el no cumplimiento en esta propiedad, varios autores han sugerido utilizar

antioxidantes sintéticos ascorbil palmitato y propil galato o bien, realizar mezclas binarias con otros

tipos de biodiésel, como, por ejemplo, biodiésel de aceite de palma cuya composición en ácidos grasos

saturados es alta, confiriéndole una buena estabilidad oxidativa (Aguilar et al., 2015).

71

Capítulo 4

Conclusiones

El uso de rastrojo de piña para producir biodiésel es un método verde para el tratamiento de estos

residuos. El método actual para la degradación del rastrojo de piña involucra la aplicación de herbicidas

como desecantes en la planta, posterionnente de su incorporación al campo, lo que resulta una práctica

muy ineficiente ya que podría ocasionar problemas al medioambiente, por consiguiente, el uso de

rastrojo en la producción de biodiésel es una alternativa al método actual, sin embargo, es necesario

mejorar el proceso para obtener un biodiésel con mayor pureza.

Los compuestos lignocelulósicos utilizados como sustrato para la producción de biocombustibles tiene

una elevada complejidad por lo cual es necesario utilizar un pretratamiento para incrementar la

accesibilidad a los compuestos fermentables, como la celulosa. Esta etapa se logró utilizando una

hidrólisis enzimática y una fermentación con el hongo Umbelopsis Jsabellina. A través de un análisis

de azucares reductores se pudo verificar que la concentración de la glucosa disminuye con el avance

de la fermentación, lo cual es indicativo que se está degradando este monosacárido y se está

acumulando lípidos. En el presente proyecto, además, se determinó que es necesario realizar una

purificación en columna con el propósito de eliminar las impurezas impregnadas en la etapa de

fermentación, esto es, eliminar el Ergosterol que surge como contaminante el cual causa una

disminución en el contenido de FAMES.

Se determinó que la mezcla de disolventes cloroformo: agua (2: 1) resultó más eficiente que el

sistema metanol: cloroformo: agua (2:2: 1) al obtenerse porcentajes de extracción de 40 y 32%

respectivamente. Esto se debe a que el rendimiento de una extracción es directamente proporcional a

la solubilidad relativa del compuesto a extraer, es decir, la solubilidad relativa los lípidos de la biomasa

son más solubles en el sistema de cloroformo: agua.

72

Durante la etapa de la transesterificación existen varias variables que afectan la conversión de

triglicéridos a biodiésel, por lo cual es importante tener un control riguroso durante el desarrollo de

este proceso. Se debe controlar la cantidad del catalizador ya que un exceso de este ocasiona que se dé

la formación de jabones. Además, se debe utilizar alcoholes anhidros porque el agua favorece la

saponificación. Paralelo a esto, se debe eliminar los ácidos grasos libres, ya que cuanto más alto sea la

acidez en el aceite, la cantidad de F AMES será menor. Para esto, se utilizó una pretransesterificación

donde los ácidos grasos libres se convierten en alquil éster por acción del alcohol.

Se comprobó que el uso de rastrojo de piña para la obtención de biodiésel resulta ser viable y

que tiene propiedades adecuadas. Tiene un bajo porcentaje de agua, por lo tanto, se evita la

propagación de lodos los cuales causan obstrucción en los filtros del sistema de almacenamiento. Por

otro lado, se tiene un bajo porcentaje de glicerina, por consiguiente, se tiene una menor viscosidad y

una mejor combustión.

Recomendaciones

Es necesario aumentar esfuerzos en investigación y desarrollo con el fin de mejor los rendimientos en

la producción de biodiésel y su posterior purificación.

Se debe mantener un control riguroso en las condiciones de producción del biodiésel para asegurarse

que el biocombustible tiene las propiedades adecuadas y de esta manera cumpla con las

especificaciones del reglamento técnico centroamericano de biocombustibles.

Se debe trabajar e investigar en encontrar disolventes para la etapa de extracción de lípidos que

cumplan con los principios de la química verde.

73

Capítulo 5

Bibliografía

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80

Capítulo 6

Anexos

Apartado l. Determinación de la cantidad de metano! necesaria para realizar la

transesterificación.

CH - 0 - COR2

CH2 - COR3

Triglicéridos

Figura 25. Reacción de transesterificación

KOH

CH3 - O - CO - R1

CH3 - O - CO - R2

CH3 - O - CO - R 3

Ésteres metílicos

(Biodiésel)

La reacción se puede representar de la siguiente manera

Triglicéridos + 3 MeOH < > 3 biodiésel + glicerina

+

El grupo R de los triglicéridos en general está formado por 17-18 átomos de carbono.

Siendo R= 18 entonces se tiene que: CnH2n+ 1= C1sH37

CH 2 - OH

CH - OH

CH 2 - OH

Glicerina Libre

En total se tiene 3 grupos R (R1, R2 y R3) además adicionalmente la molécula contiene 6 carbonos, 6

oxígenos y 5 hidrógenos, por consiguiente, la masa molecular del triglicérido es:

60 Carbonos= 12 gimo! * 60= 720 glmol

116 hidrógenos= 1 glmol* 116= 116 glmol

6 oxígenos= 16 g/mol * 6= 96 g/mol

Masa molar= 932 gimo!

Suponiendo que se quieren transesterificar l 00 g de aceite:

81

n aceite= 100 g/932 g/mol= O, 107 mol

por la estequiometría de la reacción se sabe que 3n aceite= n MeOH, sin embargo como se detalló en

la discusión se requiere que 7n aceite= n MeOH, por lo tanto

7*0,107 mol aceite= 0,749 mol de MeOH.

Por lo tanto la cantidad de metanol que se requiere en mL es:

0,749*32 g/mol

0,79 g/ml 30 mL MeOH

Apartado II. Condiciones cromatográficas para realizar la caracterización del biodiésel de rastrojo

de piña.

Columna

Presión= 15,7 psi flujo=l,2 ml/min velocidad promedio=32 cm/s modo=presión cte

Inyector

T=250

Hold time= O min

Run time= 28,667

Horno

Ti - 100 hold time min= O run time=O

Rampa 1 = flujo= 15 C/min Ti=200 hold=O run time= 6,66

Rampa 2= flujo=5 T=300 hold time=2 min run time=28,6667

Post run= 300

Post run time= O

Detector (FID)

Heater= 300

H2 flow= 40 mUmin

82

Air flow= 400 mL/min

Make up flow(N2)= 28,8 mL/min

Const col+ makeup= 30 mL/min

Lit offset= 1 pA

Si goal

Data rate/ mínimum peak width= 1 O Hz/ .02 Min

Apartado 111. Datos experimentales para realizar la identificación de los esteres metílicos

contenidos en el biodiésel de pifia.

4,

• !i)

l"I :11

"' 1

11'1 'J. f .- ....

•

• ti

JJll 41!1

•

.. _,_

:i

Jiríl d ..

Figura 26. Cromatograma experimental para realizar la identificación de las seíiales en el cromatograma del biodiésel (Anayansi & Douglas, 2015).

83

Cuadro XII. Tiempos de retención de los ésteres metílicos.

Número Ester Metílico Tiempo de Número Ester Metílico Tiempo de de Ácido Retención de Ácido Retención

(mio) {mio} (1) Butírico (C4:0) 2.472 (20) Linoleaídico -

CC18:2n60 1 Capróico (C6:0) 2.596 (21) y-linolénico 12.388

(C18:3n6) 3 Caprílico (C8:0) 3.700 (22) a-linolénico -

(C18:3n3 ) 4 Cáprico (Cl 0:0) 5.211 23 Araquídico ( C20:0) 15.800

(5) Undecanóico (Cl 1:0) 6.009 (24) cis-11-eicosenóico 15.398 (C20:ln9)

6 Láurico (Cl2:0) 6.800 (25) cis-11, 14- -

eicosenóico (C20:2> (7) Tridecanóico (Cl 3:0) 7.619 (26) cis-8, 11, 14- 15.021

eicosenóico (C20:3n6)

Mirístico (C14:0) 8.517 (27) cis-11, 14, 17- -eicosenóico (C20:3n3 )

(9) Miristoléico (Cl4:1) 8.368 (28) Araquidónico 14.764 (C20:4n6)

(10) Pentadecanóico 9.506 (29) Cis-5,8,11,14,17- -(C15:0) eicosapentanóico

(C20:5n3) (I 1) cis-10- 9.368 (30) Heneicosanóico 17.198

pentadecanóico (C21:0) (Cl5: 1)

l 2 Palmítico (C16:0 ) 10.604 31 Behénicol C22:0) 18.600 (13) Palmitoléico (Cl 6:1 ) 10.350 (32) Eúrico (C22:ln9) 18.211 14 Heptadecanóico 11.794 (33) Cis-13,16- 18.118

tCl 7:0 1 docoseinóico (C22:2) (15) cis-10-heptadecanóico l l.521 (34) Cis-4,7, 10, 13,16,19- 17.359

(C17:1) docosahexanóico 1

(C22:6n3) 16 Esteárico (C18:0) 13.076 (35) Tricosanóico (C23:0) 19.984

(17) Oléico (C18:ln9c) 12.716 36 Lim1océrico (C24:0) 21.353 t

' ( 1 ~) Eláidico ( C 18: 1 n9t) (37) Nervónico C24:ln9'1 20.985 t -- -

(19) Linoléico IC18:2n6c ) -

84

Apartado IV. Preparación de la curva de calibración para la determinación de la cantidad de

glicerina en el biodiésel.

Cuadro XIII. Volúmenes de las respectivas disoluciones estándares para realizar la curva de calibración para la determinación de glicerina. (Anayansi & Douglas, 2015).

Disolución Estándar Volumen Adicionado, V (µ,I)

1 2 3 4 5 Glicerina 10 30 50 70 100

Monoleína 20 50 100 150 200

Di oleína JO 20 40 70 100

Tri oleína 10 20 4D 70 100

Butanotriol 100 100 100 100 100

Tricaprin 100 100 100 100 100

85

producción biotecnológica de biodiésel a partir de...

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