pristane-induced arthritis is cd4+ t-cell dependent

8/3/2019 Pristane-Induced Arthritis is CD4+ T-Cell Dependent

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1 9 9 7 9 0 8 1 - 8 6

P r i s t a n e - i n d u c e d a r t h r i t i s i s CD4 + T - c e l l d e p e n d e n tL . M. STASIUK, M. GHORAISHIAN, C . J . ELSON & S . J . THOMPSON D e p a r t m e n t o f P a t h o l o g y a n d M i c r o b i o l o g y ,U n i v e r s i t y o f B r i s t o l , B r i s t o l , UK

S U M M A R YT h e d e v e l o p m e n t o f a r t h r i t i s i n d u c e d i n m i c e b y i n t r a p e r i t o n e a l i n j e c t i o n o f t h e n o n - a n t i g e n i cm i n e r a l o i l p r i s t a n e ( 2 , 6 , 1 0 , 1 4 - t e t r a m e t h y l p e n t a d e c a n e ) was shown t o d e p e n d on t h e p r e s e n c e o fCD4+ T c e l l s . I n i t i a l e x p e r i m e n t s a ss e ss e d t h e i n f l u x o f l y m p h o i d c e l l s i n t o t h e p e r i t o n e a l c a v i t yo f C B A / I g b m i c e a f t e r p r i s t a n e i n j e c t i o n . B o t h CD4+ a n d CD8+ c e l l n u m b e r s were m a x i m a la r o u n d 5 0 d a y s . O t h e r e x p e r i m e n t s c o n f i r m e d o ur o r i g i n a l o b s e r v a t i o n t h a t i r ra d i a t e d p r i s t a n e -t r e a t e d m i c e f a i l e d t o d e v e l o p a r t h r i t i s u n l e s s t h e y were r e c o n s t i t u t e d w i t h s p l e e n c e l l s f r o mn o r m a l d o n o r s . T h i s f i n d i n g h a s b e e n e x t e n d e d b y s h o w i n g t h a t t h e p o p u l a t i o n o f t r a n s f e r r e ds p l e n i c l y m p h o i d c e l l s must c o n t a i n CD4+ T c e l l s , w h i l e CD8+ T c e l l s and B c e l l s were n o tr e q u i r e d f o r r e c o n s t i t u t i o n . C o n v e n t i o n a l l y h o u s e d a n d h s p 6 5 - i m m u n i z e d a n i m a l s are kno w n t oh a r b o u r T c e l l s r e a c t i v e w i t h h s p 6 5 . I n a d d i t i o n , h s p 6 5 - i m m u n i z e d m i c e are r e s i s t a n t t o t h ed e v e l o p m e n t o f p r i s t a n e - i n d u c e d a r t h r i t i s ( P I A) . T h u s , a d d i t i o n a l e x p e r i m e n t s a s s e s s e d t h ep o p u l a t i o n o f s p l e n i c T c e l l s a c t i v a t e d a n d p r o l i f e r a t i n g a g a i n s t m y c o b a c t e r i a l 6 5 0 0 0 MW h e a t -s h o c k p r o t e i n ( h s p 6 5 ) . I n c u l t u r e s o f p u r i f i e d s p l e n i c T c e l l s d e r i v e d f r o m b o t h c o n v e n t i o n a l a n dh s p 6 5 - i m m u n i z e d m i c e , r e m o v a l o f CD4+ T c e l l s s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d t h e p r o l i f e r a t i v e responset o h s p 6 5 , w h i l e r e m o v a l o f CD8+ T c e l l s o f t e n e n h a n c e d t h e r e s p o n s e . T h e s e p r o l i f e r a t i v ere sponse s w e r e a l s o s h o w n t o b e m a j o r h i s t o c o m p a t a b i l i t y c o m p l e x (MHC) c l a s s r e s t r i c t e d .T h e p r e s e n t f i n d i n g s d e m o n s t r a t e t h a t PIA i s CD4+ T - c e l l m e d i a t e d , a n d i m m u n o d o m i n a n te n v i r o n m e n t a l a n t i g e n s s u c h as h s p 6 5 a c t i v a t e t h i s p o p u l a t i o n o f l y m p h o c y t e s . The CD4+ h s p6 5 - r e a c t i v e p o p u l a t i o n may b e p a t h o g e n i c o r p r o t e c t i v e i n P I A , d e p e n d i n g u p o n t h e r o u t e o fs e n s i t i z a t i o n .

I N T R OD U C T I O Ni n j e c t e d i n t h e p e r i t o n e u m w i t h t h e p a r a f f i n o i l p r i s t a n e

d e v e l o p a c h r o n i c a r t h r i t i sr h e u m a t o i d a r t h r i t i s ( R A ) i n a n u m b e r o f r e s p e c t s .

o r e x a m p l e , p r i s t a n e - i n d u c e d a r t h r i t i s ( P I A ) i s c h a r a c t e r i z e db y p o l y m o r p h o n u c l e a r c e l l i n f i l t r a t i o n a n d t h eo f p a n n u s i n a f f e c t e d j o i n t s . ' B o t h P I A a n d RA a r e

b y c i r c u l a t i n g r h e u m a t o i d f a c t o r , 2 e l e v a t e d l e v e l sa g a l a c t o s y l i m m u n o g l o b u l i n G ( I g G ) " 4 a n d i n t e r l e u k i nT h e PIA m o d e l i s u n i q u e among t h e a n i m a l m o d e l sRA i n t h a t t h e i n d u c i n g a g e n t , p r i s t a n e , i s n o n - a n t i g e n i c .t h e o n s e t t i m e i s v e r y l o n g , w i t h d i s e a s e a p p e a r i n g

6 0 a n d 2 0 0 d a y s l a t e r , d e p e n d i n g o n t h e s t r a i nm i c e . " 1 2 ' 8RA i s t h o u g h t t o b e a n i m m u n o l o g i c a l l y m e d i a t e d d i s e a s e .R e c e i v e d 7 M a y 1 9 9 6 ; r e v i s e d 8 S e p t e m b e r 1 9 9 6 ; a c c e p t e d

S e p t e m b e r 1 9 9 6 .A b b r e v i a t i o n s : h s p , h e a t - s h o c k p r o t e i n ; P I A , p r i s t a n e - i n d u c e dC o r r e s p o n d e n c e : Dr S . J . T h o m p s o n , P a t h o l o g y a n d M i c r o b i o l o g y ,e M e d i c a l S c h o o l , U n i v e r s i t y W a l k , U n i v e r s i t y o f B r i s t o l , B r i s t o l

8 1 T D , UK.

G e n e t i c a n a l y s e s h a v e s h o w n a n a s s o c i a t i o n b e t w e e n i m m u n er e sp o n s e g e n e s a n d d i s e a s e i n b o t h RA a n d P I A . 2 ' 9 " 0 T h a tt h e i m m u n e s y s t e m i s i n v o l v e d i n P I A h a s b e e n c o r r o b o r a t e de x p e r i m e n t a l l y , b y s h o w i n g t h a t a n i n t a c t i m m u n e s y s t e m i sn e c e s s a r y f o r d e v e l o p m e n t o f d i s e a s e . T h u s i r r a d i a t i n g a n i m a l sp r i o r t o p r i s t a n e i n j e c t i o n p r e v e n t s d i s e a s e d e v e l o p m e n t .F u r t h e r m o r e , t r a n s f e r o f n a i v e s p l e e n c e l l s t o i r r a d i a t e d a n i -m a l s r e c o n s t i t u t e s t h e i r a b i l i t y t o d e v e l o p P I A . " "T w i n s t u d i e s h a v e s u g g e s t e d t h a t t h e g e n e t i c c o n t r i b u t i o nt o RA d i s e a s e s u s c e p t i b i l i t y may b e a t m o s t 5 0 % . 1 2 T h e r e f o r e ,e n v i r o n m e n t a l f a c t o r s m u s t m a k e a s u b s t a n t i a l c o n t r i b u t i o n ,s u g g e s t i n g t h a t RA i s t r i g g e r e d b y e x o g e n o u s a n t i g e n s w h i c ha r e i m m u n o l o g i c a l l y c r o s s r e a c t i v e w i t h s e l f p r o t e i n s . " ' S t u d i e su s i n g t h e P I A m o d e l i n d i r e c t l y s u p p o r t t h i s h y p o t h e s i s , s h o w -i n g s u s c e p t i b i l i t y t o PIA i s i n f l u e n c e d b y t h e e n v i r o n m e n t . " '

I n s e a r c h i n g f o r a p o s s i b l e c r o s s - r e a c t i n g e n v i r o n m e n t a la n t i g e n , p r o t e i n s f r o m t h e h e a t - s h o c k p r o t e i n ( H S P ) 6 0 g e n ef a m i l y h a v e r e c e i v e d much a t t e n t i o n . T h e s e p r o t e i n s a r e knownt o b e v e r y i m m u n o g e n i c a n d a c t a s t h e d o m i n a n t a n t i g e n s i ni n f e c t i o u s d i s e a s e s . ' 5 T h e HSP60 g e n e f a m i l y i n c l u d e s b o t hm a m m a l i a n h s p 5 8 a n d m y c o b a c t e r i a l h s p 6 5 , w h i c h s h a r e50% s e q u e n c e i d e n t i t y . C o n s e q u e n t l y , e p i t o p e s o n h s p 6 5 mayb e s h a r e d b y s e l f h s p 5 8 , a n d t h u s h s p 6 5 w o u l d c o n s t i t u t e ac r o s s - r e a c t i v e e n v i r o n m e n t a l a n t i g e n . E v i d e n c e d e m o n s t r a t i n g1 9 9 7 B l a c k w e l l S c i e n c e L t d 8 1


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L . M. S t a s i u k e t a l .a r o l e f o r HSP60 p r o t e i n s i n e x p e r i m e n t a l a r t h r i t i d e s i n c l u d e st h e f i n d i n g t h a t s p l e n i c T c e l l s f r o m m i c e , w h e t h e r a r t h r i t i c ,n o n - a r t h r i t i c o r n a i v e , can m o u n t i n v i t r o p r o l i f e r a t i v eresp onses t o h s p 6 5 , 1 1 w h e r e a s o n l y T c e l l s d e r i v e d f r o ma r t h r i t i c m i c e r e sp o n d t o m a m m a l i a n h s p 5 8 . 1 6 H e n c e , a r t h r i t i cm i c e h a r b o u r a u t o r e a c t i v e T c e l l s , t a r g e t t i n g s e l f h s p 5 8 , ana n t i g e n w h i c h i s f o u n d t o b e u p - r e g u l a t e d i n a f f e c t e d j o i n t s . ' 7I n a d d i t i o n , p r e i m m u n i z a t i o n w i t h m y c o b a c t e r i a l h s p 6 5 i ni n c o m p l e t e F r e u n d ' s a d j u v a n t ( I F A ) p r o t e c t s o t h e r w i s e susce p-t i b l e a n i m a l s a g a i n s t P I A , 1 " " 8 " 1 9 a d j u v a n t a r t h r i t i s 2 0 a n d s t r e p -t o c o c c a l c e l l w a l l a r t h r i t i s . 2 1 T h e m e c h a n i s m o f p r o t e c t i o n b yh s p 6 5 i m m u n i z a t i o n i s n o t y e t f u l l y u n d e r s t o o d , b u t i s h i g h l ya n t i g e n s p e c i f i c , " a n d c a n b e t r a n s f e r r e d u s i n g s p l e n o c y t e s t on a i v e s u s c e p t i b l e r e c i p i e n t s . 2 2

P r e v i o u s w o r k , i n r e l a t i o n t o p r i s t a n e - i n d u c e d p l a s m a c y -t o m a s , a n a l y s e d t h e c e l l s i n f i l t r a t i n g i n t o t h e p e r i t o n e u m o fm i c e i n j e c t e d w i t h p r i s t a n e , a n d s h o w e d t h a t b o t h CD4' a n dCD8 + c e l l s e n t e r . I n m i c e m a i n t a i n e d i n s p e c i f i c p a t h o g e n - f r e e( S P F ) c o n d i t i o n s , t h e r e was a s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d CD4+ c e l li n f l u x a f t e r p r i s t a n e i n j e c t i o n . 2 3 A s SPF m i c e a re r e s i s t a n t t oP I A , t h i s s u g g e s t e d t h a t a p e r i t o n e a l i n f l u x o f CD4+ c e l l sc o u l d b e i n v o l v e d i n d i s e a s e i n d u c t i o n . H o w e v e r , i n v i v od e p l e t i o n s t u d i e s s h o w e d t h e r e t o b e no s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c ei n t h e i n c i d e n c e o f PIA i n m i c e t r e a t e d w i t h d e p l e t i n g a n t i -b o d i e s a g a i n s t CD4 o r CD8 a n t i g e n s , 2 4 l e a v i n g t h e r o l e o ft h e s e T - c e l l s u b s e t s i n PIA u n c l e a r .

T h e p r e s e n t w o r k p h e n o t y p e s t h e T c e l l s i n v o l v e d i n PIAd i s e a s e i n d u c t i o n a n d r e s i s t a n c e . Normal ( s u s c e p t i b l e ) m i c ew e r e c o m p a r e d w i t h p r i s t a n e - i n j e c t e d m i c e , o r m i c e mader e s i s t a n t t o P I A , e i t h e r t h r o u g h i r r a d i a t i o n o r pre-i m m u n i z a t i o n w i t h h s p 6 5 . T h r e e a p p r o a c h e s w e r e t a k e n .F i r s t l y , t h e p r i s t a n e - i n d u c e d c e l l u l a r i n f l u x i n t o t h e i n j e c t i o ns i t e ( p e r i t o n e a l c a v i t y ) was e s t a b l i s h e d i n s u s c e p t i b l e m i c e , h s p6 5 p r o t e c t e d a n i m a l s a n d r e s i s t a n t i r r a d i a t e d m i c e . S e c o n d l y ,s t u d i e s i n v i v o c o m p a r e d t h e a b i l i t y o f d i f f e r e n t l y m p h o c y t ep o p u l a t i o n s t o r e c o n s t i t u t e d i s e a s e s u s c e p t i b i l i t y i n i r r a d i a t e dr e c i p i e n t s . T h i r d l y , i n v i t r o assays w e r e u s e d t o p h e n o t y p e t h ec e l l s a c t i v a t e d a n d p r o l i f e r a t i n g a g a i n s t h s p 6 5 , a g a i n c o m pa r-i n g p r o t e c t e d , s u s c e p t i b l e a n d a r t h r i t i c m i c e .

M A TERI AL S AND METHODSA n i m a l sM a l e C B A / I g b m i c e a g e d b e t w e e n 4 a n d 8 w e e k s w e r e u s e d .C B A / I g b m i c e w e r e o r i g i n a l l y a g i f t f r o m P r o f e s s o r H . S .M i c k l e m , D e p a r t m e n t o f Z o o l o g y , E d i n b u r g h , U K . T h e y w e r eo b t a i n e d b y b a c k - c r o s s i n g ( 1 0 1 s t r a i n x CBA) F l h y b r i d s t oCBA m i c e a n d s e l e c t i n g t h o s e m i c e w i t h I g b a l l o t y p e i nt h e i r serum.I n d u c t i o n a n d p r e v e n t i o n o f a r t h r i t i sA r t h r i t i s was i n d u c e d b y two i n t r a p e r i t o n e a l i n j e c t i o n s o f0 5 ml o f p r i s t a n e 5 0 d a y s a p a r t ( A l d r i c h C h e m i c a l C o . ,M i l w a u k e e , W I ) . The a n i m a l s w e r e e x a m i n e d f o r t h e i n c i d e n c eo f a r t h r i t i s i n t h e a n k l e j o i n t s a t v a r i o u s t i m e p o i n t s , w i t h t h ef i n a l i n c i d e n c e b e i n g a s s e s s e d 2 0 0 d a y s p o s t p r i s t a n ei n j e c t i o n . 1 1 . 1 8 , 1 9G r o u p s o f m i c e w e r e i m m u n i z e d ( i . p . ) 1 0 d a y s b e f o r ep r i s t a n e c h a l l e n g e w i t h 5 0 p g o f m y c o b a c t e r i a l h s p 6 5 a d m i n i s -t e r e d as a n e m u l s i o n i n I F A . T h i s r e g i m e h a s p r e v i o u s l y b e e nr e p o r t e d t o s p e c i f i c a l l y b l o c k t h e d e v e l o p m e n t o f P I A . " 1 " 1 8 " 1 9

W h e r e s t a t e d , groups o f m i c e were i r r a d i a t e d s u b l e t h a l l yw i t h 5 0 0 r a d f r o m a c a e s i u m s o u r c e ( G r a v a t o m I n d u s t r i e s ,G o s p o r t , UK).A n t i g e n sT h e r e c o m b i n a n t m y c o b a c t e r i a l h s p 6 5 f o r i m m u n i z a t i o na n d c u l t u r e s was k i n d l y p r o v i d e d b y t h e W o r l d H e a l t hO r g a n i z a t i o n G e n e B a n k . I r r e l e v a n t c o n t r o l a n t i g e n s , b o v i n eserum a l b u m i n ( B S A ) a n d human I g G w e r e a l s o u s e d a l o n gw i t h t h e m i t o g e n c o n c a n a v a l i n A ( C o n A ) a s c o n t r o l s i n v i t r o .P r e p a r a t i o n o f c e l l sP e r i t o n e a l c e l l s w e r e c o l l e c t e d b y i n j e c t i n g 7 m l o f Hanksb a l a n c e d s a l t s o l u t i o n w i t h h e p a r i n ( 1 0 u n i t s / m l ) , g e n t l em a s s a g i n g o f t h e a b d o m e n , f o l l o w e d b y a s p i r a t i o n . P e r i t o n e a lc e l l s w e r e a n a l y s e d b y d u a l c o l o u r f l o w c y t o m e t r y ( B e c t o nD i c k i n s o n F A C S c a n , O x f o r d , U K ) u s i n g P h a r m i n g e n a n t i -b o d i e s a g a i n s t C D 4 , C D 8 , x B - T - c e l l r e c e p t o r (TCR) a n dy b - T C R .

S p l e e n s o f i n d i v i d u a l m i c e w e r e a s e p t i c a l l y r e m o v e d a n ds i n g l e c e l l s u s p e n s i o n s made i n R P M I - 1 6 4 0 medium sup-p l e m e n t e d w i t h 2 0 mm HEPES (p H 7 2 , F l o w L a b s , I r v i n e ,UK).

F o r t r a n s f e r e x p e r i m e n t s , s p l e e n c e l l s u s p e n s i o n s w e r ed e p l e t e d o f B c e l l s b y i m m u n o m a g n e t i c c e l l s e p a r a t i o n u s i n gD y n a b e a d s M-450 ( s h e e p a n t i - m o u s e I g G ) a n d a D y n a l mag-n e t i c p a r t i c l e c o n c e n t r a t o r ( D y n a l C o . , W i r r a l , U K ) a c c o r d i n gt o t h e m a n u f a c t u r e r ' s i n s t r u c t i o n s . T - c e l l d e p l e t i o n s w e r ec a r r i e d o u t u t i l i z i n g a n t i - T h y l 2 m o n o c l o n a l a n t i b o d y( S e r a l a b , C r a w l e y Down, S u s s e x , UK). CD4+ T - c e l l d e p l e t i o nwas c a r r i e d o u t u s i n g 2 i l per 1 0 7 c e l l s o f a n t i - m u r i n e CD4m o n o c l o n a l a n t i b o d y ( Y T S - 1 9 1 1 ) , d e p l e t i o n o f CD8 + T c e l l swas c a r r i e d o u t u s i n g s u p e r n a t a n t f r o m c l o n e Y T S - 1 6 6 - 4 , a na n t i b o d y s p e c i f i c f o r CD8a ( k i n d g i f t s f r o m b o t h P r o f e s s o r H .Waldmann a n d Dr S . C o b b o l d , U n i v e r s i t y o f C a m b r i d g e ,UK). A f t e r 4 5 m i n i n c u b a t i o n a t 4 0 , c o m p l e m e n t m e d i a t e dl y s i s was c a r r i e d o u t u s i n g 0 - 1 m l o f r a b b i t c o m p l e m e n t (LowT o x - M , C e d a r l a n e L a b o r a t o r i e s L t d , O n t a r i o , C a n a d a ) per1 0 7 c e l l s f o r 4 5 m i n a t 3 7 . D e p l e t i o n e f f i c i e n c y was d e t e r -m i n e d b y f l o w c y t o m e t r y u s i n g f l u o r e s c e i n i s o t h i o c y a n a t e( F I T C / p h y c o e r y t h r i n ( P E ) - c o n j u g a t e d CD4/CD8 a n t i b o d i e s( P h a r m i n g e n , S a n D i e g o , C A ) . A f t e r d e p l e t i o n , CD4+ a n dCD8+ T c e l l s m a d e up l e s s t h a n 0 - 6 % and 0 - 7 % o f t h e t o t a lc e l l n u m b e r , r e s p e c t i v e l y .

F o r c u l t u r e s , T c e l l s w e r e e n r i c h e d a c c o r d i n g t o t h e p a n n i n gm e t h o d o f E n g l e m a n e t a l . 2 5 A p u r i t y o f > 85% was a c h i e v e das a s s e s s e d b y a n t i - T h y 1 - 2 s t a i n i n g u s i n g f l o w c y t o m e t r y( F A C S c a n , B e c t o n D i c k i n s o n L t d ) . CD4 a n d CD8 d e p l e t i o n sw e r e c a r r i e d o u t a s a b o v e .N o r m a l mouse s p l e e n c e l l s w e r e u s e d as a n t i g e n p r e s e n t i n gc e l l s ( A P C ) . The APC w e r e i r r a d i a t e d w i t h 1 0 0 0 r a d s from ac a e s i u m source ( G r a v a t o m I n d u s t r i e s ) .C u l t u r e a n d assay o f p r o l i f e r a t i o nT h i s was c a r r i e d o u t as d e s c r i b e d p r e v i o u s l y . "The mediume m p l o y e d was a l p h a m o d i f i c a t i o n o f E a g l e ' s medium ( a l p h aMEM) ( F l o w ) s u p p l e m e n t e d w i t h 4 mM 1 - g l u t a m i n e ( F l o w ) ,1 0 0 U / m l b e n z y l p e n i c i l l i n ( G l a x o L t d , G r e e n f o r d , UK),1 0 0 M g / m l s t r e p t o m y c i n s u l p h a t e ( E v a n s M e d i c a l L t d ,G r e e n f o r d , UK), 5 x 1 0 - 5 M 2 - m e r c a p t o e t h a n o l ( S i g m a , P o o l e ,D o r s e t , UK), 2 0 mm HEPES a n d 0 - 5 % f r e s h n o r m a l mouse

1 9 9 7 B l a c k w e l l S c i e n c e L t d , I m m u n o l o g y , 9 0 , 8 1 - 8 6

8 2


3/6

PIA i s C D 4 ' T - c e l l d e p e n d e n tT h e c u l t u r e s c o n s i s t e d o f f i n a l c o n c e n t r a t i o n s o f

2 5 x 1 0 6 p er m l p u r i f i e d s p l e n i c T c e l l s p l u s 1 - 2 5 x 1 0 6 per m lP C i n t h e presence o r a b s e n c e o f a n t i g e n ( 1 0 M g / m l ) .A f t e r t h e p e r i o d s o f i n c u b a t i o n i n d i c a t e d , 1 0 0 u 1 s a m p l e sp u l s e d w i t h 2 mCi o f [ 3 H ] t h y m i d i n e ( s p e c i f i c a c t i v i t y

C i / m m o l ; Amersham I n t e r n a t i o n a l L t d , A m e r s h a m ,K ) f o r 6 h r . T h e [ 3 H ] t h y m i d i n e i n c o r p o r a t e d w a s m e a s-u s i n g c o n v e n t i o n a l l i q u i d s c i n t i l l a t i o n p r o c e d u r e s w i t h aK B r a c k b e t a c o u n t e r ( K B - W a l l a c L t d , P h a r m a c i a ,

a l a , S w e d e n ) .o f MHC c l a s s II a n t i g e n r e q u i r e m e n t s f o r p r o l i f e r a t i o n

assays were c a r r i e d o u t as d e s c r i b e d a b o v e , w i t he a d d i t i o n o f a n t i - c l a s s I I H - 2 ' a n t i b o d i e s ( 1 - 5 , 3 o r 6 y g / m l ) ,i s o t y p e m a t c h e d c o n t r o l a n t i - H - 2 q v ( 3 o r 6 j u g / m l ) ( a l lP h a r m i n g e n , C a m b r i d g e B i o s c i e n c e s , C a m b r i d g e , UK).w e r e c o m p a r e d u s i n g S t u d e n t ' s t - t e s t .

RESULTSc e l l i n f l u x

i n d u c e P I A , p r i s t a n e i s i n j e c t e d i n t o t h e p e r i t o n e a l c a v i t yn a i v e C B A / I g b m i c e . I n o r d e r t o d e t e r m i n e w h i c h l y m p h o i d

a p p e ar i n t h e c a v i t y i n response t o p r i s t a n e c h a l l e n g e ,w e r e r e c o v e r e d , e n u m e r a t e d a n d a n a l y s e d b y f l o w c y t o m e -T h e i n j e c t i o n o f t h e n o n - a n t i g e n i c , a d j u v a n t o i l p r i s t a n e

a p e r i t o n e a l i n f i l t r a t e w h i c h p e a k e d b e t w e e n 4 0 a n dd a y s a f t e r i n j e c t i o n ( F i g . l a ) . T h e i n f i l t r a t e i n c l u d e d b o t h

a n d CD8+ c e l l s , i n s i m i l a r p r o p o r t i o n s ( F i g . l b and c ) .n o r m a l m i c e , T c e l l s make up a b o u t 30% o f t h e p e r i t o n e a lw h e r e a s a t t h e p e a k o f i n f i l t r a t i o n , t h e T c e l l s

o n l y 16% o f t h e r e c o v e r e d c e l l s . T h i s p a t t e r n o fa f t e r p r i s t a n e i n j e c t i o n o c c u r r e d r e g a r d l e s s o for n o t t h e m i c e h a d b e e n p r e i m m u n i z e d w i t h h s p 6 5are p o o l e d f o r F i g . 1 , as t h e r e was no d i f f e r e n c e ) . Thec e l l s w h i c h e n t e r e d t h e p e r i t o n e u m were b e a r i n g t h e a 4 -r a t h e r t h a n t h e y b - T C R ( d a t a n o t s h o w n ) .T h e p o p u l a t i o n s o f c e l l s i n f i l t r a t i n g t h e p e r i t o n e a l c a v i t y

n o r m a l , p r i s t a n e i n j e c t e d a n d i r r a d i a t e d r e s i s t a n t m i c e w e r ee n u m e r a t e d b y d i f f e r e n t i a l c o u n t i n g u n d e r a l i g h t m i c r o -

T a b l e 1 s h o w s t h a t t h e p r i s t a n e i n d u c e d l y m p h o c y t i cw a s a b l a t e d b y i r r a d i a t i o n . T h e l a r g e s t p r o p o r t i o na f t e r p r i s t a n e i n j e c t i o n o c c u r r e d i n t h e m o n o c y t e /p o p u l a t i o n . T h i s was m u t e d b u t s t i l l p r e s e n t i nm i c e . T h e p o l y m o r p h o n u c l e a r p o p u l a t i o n , w h i c ha f t e r p r i s t a n e , was u n a f f e c t e d b y i r r a d i a t i o n .

o f s u s c e p t i b i l i t y t o PIA u s i n g p o p u l a t i o n s o fs p l e n o c y t e sA c a n n o t b e i n d u c e d i n i r r a d i a t e d m i c e b u t c a n i n i r r a d i a t e d

o f n o r m a l s p l e e n c e l l s . " " C e l l t r a n s f e r s t u d i e s weret o d e t e r m i n e t h e p h e n o t y p e o f t h e r e c o n s t i t u t i n g popu-G r o u p s o f i r r a d i a t e d a n i m a l s r e c e i v e d no c e l l s , s p l e e no r s p l e e n c e l l s d e p l e t e d o f d i f f e r e n t l y m p h o c y t e p o p u -p r i o r t o p r i s t a n e i n j e c t i o n . T h e s e g r o u p s were com-t o t h a t o f a c o n t r o l g r o u p o f n o n - i r r a d i a t e d p r i s t a n e -

a n i m a l s . F i g u r e 2 c o n f i r m s t h e p r e v i o u s f i n d i n g t h a tb l o c k s d e v e l o p m e n t o f P I A , w h i l e r e c o n s t i t u t i o n

n a i v e s p l e e n c e l l s r e s t o r e s PIA s u s c e p t i b i l i t y . I n tw os p l e e n c e l l s d e p l e t e d o f B c e l l s w e r e a b l e t o

16-x I "2 1 2 -

4

2 - (b )

1 . 2 -

0 . 80.4

0N02 (C)

00.8

0.4

Normal 20-40 40-60 60-80 >80mice D a y s p o s t - p n s t a n eF i g u r e 1 . E f f e c t o f p r i s t a n e on c e l l u l a r i n f l u x i n t h e p e r i t o n e a l c a v i t yo f ( a ) t o t a l c e l l s ( b ) CD4+ c e l l s a n d ( c ) CD8+ c e l l s . S i x t o e i g h t -w e e k - o l d m a l e C B A / I g b m i c e were g i v e n a s i n g l e i . p . i n j e c t i o n o f0 5 ml p r i s t a n e a n d , a t r e g u l a r i n t e r v a l s , a n i m a l s w e r e k i l l e d f o r t h ec o l l e c t i o n o f p e r i t o n e a l e x u d a t e c e l l s . A l l c e l l s w e r e s t a i n e d d i r e c t l yw i t h F I T C - a n t i - C D 4 a n d P E - a n t i - C D 8 a n t i b o d i e s a n d i m m e d i a t e l ya n a l y s e d on a B e c t o n D i c k i n s o n F A C S c a n . A l l d a t a p o i n t s r e p r e s e n tt h e mean o f up t o 1 3 mice+SEM.

T a b l e 1 . C e l l r e c o v e r y f r o m p e r i t o n e a l c a v i t i e s ( n = 3 p e r g ro u p ) ,a s s e s s e d b y d i f f e r e n t i a l c e l l c o u n t s , 2 0 d a y s a f t e r p r i s t a n e i n j e c t i o n .P e r c e n t a g e s a r e c a l c u l a t e d r e l a t i v e t o t h e 1 0 0 % f o u n d i n n o r m a l m i c e

P r i s t a n e i n j e c t e d I r r a d i a t e d ( d a y 2 ) a n dC e l l t y p e ( % ) p r i s t a n e i n j e c t e d ( % )M o n o c y t e / m a c r o p h a g e 1 1 0 0 3 6 0L y m p h o c y t e 1 6 5 1 8P o l y m o r p h o n u c l e a r 3 8 0 4 2 0


8 3


4/6

L . M . S t a s i u k e t a l .2 0 - ( a )

1 5 -

11010 1 0 -5--

( b )

I r r a d i a t i o n ( d a y - 2 ) - + +R e c o n s t i t u t i o n ( d a y - 1 ) - - 1 x 1 0 8B d e p l .P r i s t a n e ( d a y 0 ) + + + +n= 2 1 2 0 2 6 2 1

+ + + +- 1 X 1 0 8 5 x 1 0 7 6 x 1 0 7S p l e e n B d e p l . T d e p l .+ + + +21 26 28 27

F i g u r e 2 . E f f e c t o f t h e r e c o n s t i t u t i o n w i t h n o r m a l s p l e e n c e l l s ,B - d e p l e t e d (A a n d B ) , o r T - d e p l e t e d ( b ) s p l e e n c e l l s on t h e i n c i d e n c eo f a r t h r i t i s i n i r r a d i a t e d p r i s t a n e - c h a l l e n g e d m i c e . C o n t r o l a n i m a l sw e r e c h a l l e n g e d w i t h p r i s t a n e o r i r r a d i a t e d a n d c h a l l e n g e d w i t hp r i s t a n e . T e s t m i c e w e r e i r r a d i a t e d ( d a y - 2 ) , r e c o n s t i t u t e d ( d a y - i )a n d c h a l l e n g e d w i t h p r i s t a n e ( d a y 0 ) .r e c o n s t i t u t e t h e a b i l i t y o f m i c e t o d e v e l o p PIA ( F i g . 2 a a n db ) . I n c o n t r a s t , T - d e p l e t e d s p l e e n c e l l s w e r e u n a b l e t o r e c o n s t i -t u t e s u s c e p t i b i l i t y t o r e c i p i e n t s ( F i g . 2 b ) .I n o r d e r t o d e t e r m i n e w h i c h T c e l l s are r e s p o n s i b l e f o rr e c o n s t i t u t i o n , i r r a d i a t e d a n i m a l s w e r e g i v e n n a i v e s p l e e n c e l l so r s p l e e n c e l l s d e p l e t e d o f CD4+ o r CD8+ c e l l s . R e c i p i e n t s o fC D 4 + - d e p l e t e d s p l e e n c e l l s h a d a s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d i n c i -d e n c e o f P I A , r e l a t i v e t o t h e r e c i p i e n t s o f C D 8 + - d e p l e t e ds p l e e n c e l l s , w i t h t h e same n u m b e r o f c e l l s t r a n s f e r r e d ( F i g . 3 ) .P h e n o t y p e o f c e l l s p r o l i f e r a t i n g a g a i n s t h s p 6 5I n h s p 6 5 - a c t i v a t e d s p l e n i c c e l l c u l t u r e s f r o m n o r m a l m i c e ,a r t h r i t i c m i c e a n d h s p 6 5 - p r o t e c t e d m i c e , b o t h CD4+ a n dCD8 + T c e l l s show s i g n s o f c e l l u l a r a c t i v a t i o n , u p r e g u l a t i n gCD71 ( t r a n s f e r r i n r e c e p t o r ) a n d CD25 ( I L - 2 R ) a n t i g e n s . TheCD4+ p o p u l a t i o n h a s a much l a r g e r p e r c e n t a g e o f a c t i v a t e dc e l l s , w i t h up t o f o u r t i m e s more CD4+ c e l l s t h a n CD8 + c e l l sb e c o m i n g a c t i v a t e d ( d a t a n o t s h o w n ) . I n o r d e r t o d e t e r m i n ew h i c h o f t h e s e a c t i v a t e d c e l l s are t h e p r o l i f e r a t i n g p o p u l a t i o n ,s p l e n i c T c e l l s f r o m P I A - s u s c e p t i b l e ( n o r m a l ) m i c e and P I A -r e s i s t a n t ( h s p 6 5 - i m m u n i z e d ) m i c e were d e p l e t e d o f e i t h e rCD4+ o r CD8 + T c e l l s p r i o r t o c u l t u r e . P o s i t i v e c o n t r o l

2 5 -20-

1115I r r a d i a t i o n ( d a y - 2 ) -R e c o n s t i t u t i o n ( d a y - 1 )P n s t a n e ( d a y 0 ) +n= 2 1

I1 x108S p l e e n c e l l s+28

II x108CD4 d e p l e t e d29

c u l t u r e s w e r e a m i x t u r e o f t h e tw o d e p l e t e d c e l l p r e p a r a t i o n s ,t o g i v e t h e o r i g i n a l r a t i o o f CD4+ t o CD8 + c e l l s . F i g u r e 4i l l u s t r a t e s r e p r e s e n t a t i v e p r o l i f e r a t i o n d a t a s h o w i n g t h a t t h ed e p l e t i o n o f CD4+ c e l l s p r i o r t o c u l t u r e g r e a t l y d e c r e a s e s ap o p u l a t i o n ' s a b i l i t y t o p r o l i f e r a t e i n re sponse t o h s p 6 5 . I nc o n t r a s t , d e p l e t i o n o f CD8+ T c e l l s e n h a n c e d a n t i g e n s p e c i f i cp r o l i f e r a t i o n i n f o u r o u t o f s i x t r i a l s ( F i g . 4 ) .MHC d e p e n d e n c y o f h s p 6 5 r e s p o n s e sA n t i g e n p r e s e n t a t i o n i n t h e c o n t e x t o f MHC c l a s s I T m o l e c u l e si s r e q u i r e d f o r a CD4+ T - c e l l m e d i a t e d r e s p o n s e . T h u s , i no r d e r t o c o r r o b o r a t e t h e e v i d e n c e f o r CD4 + T c e l l p r o l i f e r a t i o nt o h s p 6 5 , t h e e f f e c t o f b l o c k i n g MHC c l a s s I I - m e d i a t e da n t i g e n p r e s e n t a t i o n was a s s e s s e d b y t h e a d d i t i o n o f MHCc l a s s T I - b l o c k i n g a n t i b o d i e s t o s p l e n i c c u l t u r e s . T c e l l s f r o mC B A / I g b m i c e ( H - 2 k ) w e r e c u l t u r e d w i t h h s p 6 5 a n d A P C i nt h e presence o f b l o c k i n g a n t i b o d y a g a i n s t H - 2 k , o r i s o t y p em a t c h e d c o n t r o l b l o c k i n g a n t i b o d y a g a i n s t H - 2 s v . W h i l e t h ec o n t r o l a n t i b o d y h a d no s i g n i f i c a n t e f f e c t , a c l e a r d o s e -d e p e n d e n t d e c r e a s e i n p r o l i f e r a t i o n was seen w i t h i n c r e a s i n gd o s e s o f a n t i - H - 2 k a n t i b o d i e s , i n c u l t u r e s o f c e l l s f r o m n o r m a lm i c e , h s p 6 5 - p r o t e c t e d a n i m a l s a n d a r t h r i t i c m i c e ( F i g . 5 ) .

4 0 0 0 0 1 I ( a )3 0 0 0 0 -

Q 2 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 -

600001 ( t5 0 0 0 0 -4 0 0 0 0 -3 0 0 0 0 -2 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 -

n-2 3 4 5 6 7 8 9 2 3 456 7 8 9

D a y s o f c u l t u r e

F i g u r e 4 . T - c e l l p r o l i f e r a t i v e responses t o h s p 6 5 i n CD4 o r CD8d e p l e t e d c u l t u r e s o f c e l l s f r o m ( a ) a n o r m a l mouse a n d ( b ) a n h s p6 5 - i m m u n i z e d mouse . The r e s u l t s are p r e s e n t e d as c . p . m . w h e r e t h eb a c k g r o u n d p r o l i f e r a t i o n w i t h no a n t i g e n h a s b e e n s u b t r a c t e d .[ 3 H ] t h y m i d i n e u p t a k e b y ( A ) C D 8 - d e p l e t e d c u l t u r e s ( @ )C D 4 - d e p l e t e d c u l t u r e s a n d ( U ) p o s i t i v e c o n t r o l c u l t u r e s o f r e m i x e dd e p l e t e d p o p u l a t i o n s g i v i n g t h e o r i g i n a l c e l l r a t i o s . Data p r e s e n t e d a sc . p . m . o f 1 0 0 p l a l i q u o t s .

25000-20000-

t 1 5 0 0 0 -6.c i

C 10000-5000-

0-

1 X1 08CD8 d e p l e t e d+28

F i g u r e 3 . E f f e c t o f r e c o n s t i t u t i o n w i t h n o r m a l s p l e e n c e l l s ,C D 4 - d e p l e t e d , o r C D 8 - d e p l e t e d s p l e e n c e l l s on t h e i n c i d e n c e o fa r t h r i t i s i n i r r a d i a t e d p r i s t a n e - c h a l l e n g e d m i c e . C o n t r o l a n i m a l s w e r ec h a l l e n g e d w i t h p r i s t a n e o n l y . T e s t m i c e w e r e i r r a d i a t e d ( d a y - 2 ) ,r e c o n s t i t u t e d ( d a y - 1 ) a n d c h a l l e n g e d w i t h p r i s t a n e ( d a y 0 ) .( * P < 0 . 0 2 5 , X 2 - t e s t ) .

ONo a n t i b o d yE l H - 2 K 1 . 5 g g / m le I H-qKo. linml* H-2K 6 9 g / m lL 9 ~ 1 H - 2 q s v 6 g t g / m l

*~~~~~~~~~~~~~. . . . i

N o r m a l h s p 6 5 p r e - i m m u n i z e d A r t h r i t i cT c e l l s f r o m :

F i g u r e 5. T - c e l l p r o l i f e r a t i v e r e s p o n s e s t o h s p 6 5 i n t h e p r e s e n c e ofMHC c l a s s I I - b l o c k i n g a n t i b o d i e s . S p l e n i c T c e l l s from n o r m a l , h s p6 5 - p r o t e c t e d a n d p r i s t a n e - i n j e c t e d m i c e were c u l t u r e d i n t h e p r e s e n c eo f h s p 6 5 a n d i r r a d i a t e d APC. F r o m 1 5 j g / m l t o 6 y g / m l o f a n t i -H - 2 k o r 6 j g / m l a n t i - H - 2 q , , ( e x c e p t c u l t u r e s o f c e l l s from a r t h r i t i cm i c e , w h i c h r e c e i v e d 3 p g / m l ) was a d d e d t o t h e t e s t c u l t u r e s d u r i n gt h e e n t i r e c u l t u r e p e r i o d . B a r s r e p r e s e n t means o f d u p l i c a t e a l i q u o t sw h e r e t h e s a m p l e error i s l e s s t h a n 1 0 % . * P < 0 . 0 5 ; * * P < 0 . 0 1 ;***P


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P I A i s C D 4 ' T - c e l l d e p e n d e n t 8 5DISCUSSION

r e p o r t d e t a i l s s t u d i e s o n p e r i t o n e a l i n f l u x e s o f n o r m a la f t e r p r i s t a n e i n j e c t i o n , s h o w i n g B c e l l s , C D 4 ' a n dc e l l s a b l e t o e n t e r . T o d i s t i n g u i s h t h e r o l e o f t h e s ei n P I A , d i f f e r e n t p o p u l a t i o n s o f c e l l s w e r e p u r i f i e dn d u s e d i n r e c o n s t i t u t i o n e x p e r i m e n t s . D i s e a s e r e s i s t a n t ,m i c e , w h i c h w e r e s h o w n h e r e t o h a v e n o p e r i t o n e a li n f l u x , w e r e u s e d a s r e c i p i e n t s . O n l y C D 4 ' T c e l l st u t e d d i s e a s e s u s c e p t i b i l i t y i n t h e s e m i c e ( s e e b e l o w ) .t o g e t h e r t h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e CD4+ c o m p o n e n tf t h e p e r i t o n e a l i n f i l t r a t e i s n e c e s s a r y f o r t h e d i s e a s e .t h e p r e s e n c e o f a n i n t a c t CD4+ c e l l p e r i t o n e a la l o n e d o e s n o t l e a d t o d i s e a s e , a s s h o w n b y i t si n t h e h s p 6 5 - p r o t e c t e d a n i m a l s . W e d e m o n s t r a t et h a t i n b o t h p r e - i m m u n i z e d a n d s u s c e p t i b l e m i c e , t h ec e l l s p r o l i f e r a t i n g a g a i n s t h s p 6 5 a r e MHC c l a s s I I - r e s t r i c t e dT c e l l s . W e p r o p o s e t h e r e f o r e t h a t i t i s t h i s h s pp o p u l a t i o n o f C D 4 ' T c e l l s t h a t m e d i a t e r e s i s t a n c ei m m u n i z e d m i c e , a n d t h e n o n - i m m u n i z e d C D 4 ' h s pp o p u l a t i o n w h i c h m e d i a t e s d i s e a s e i n s u s c e p t i b l e

U n d e r t h i s s c h e m e , a s n e i t h e r S P F 2 3 n o r i r r a d i a t e d m i c ea n i n f l u x o f CD4' c e l l s , t h e h s p 6 5 - s p e c i f i c C D 4 'i s a b s e n t , a n d t h e m i c e a r e r e s i s t a n t .T h e r e i s a c r i t i c a l p h a s e w h i c h r e q u i r e s t h e p r e s e n c e o fs h o r t l y a f t e r p r i s t a n e i n j e c t i o n , i n o r d e r f o r t h et o b e s u s c e p t i b l e t o t h e d e v e l o p m e n t o f P I A . T h i s w i n d o wb e t w e e n t h e d a y o f c h a l l e n g e a n d a b o u t 4 0 d a y s l a t e r , a su s i n g i r r a d i a t i o n a n d r e c o n s t i t u t i o n e x p e r i -

I n l o o k i n g a t t h e p e r i t o n e a l l y m p h o i d p o p u l a t i o n sd u r i n g t h i s t i m e f r a m e , we f o u n d t h e i n f l u x t o c o n s i s t

f e q u a l n u m b e r s o f C D 4 ' a n d CD8+ T c e l l s , t o g e t h e r w i t hB c e l l s . 2 3 W e c a r r i e d o u t f u r t h e r r e c o n s t i t u t i o n e x p e r i -i n o r d e r t o d i s t i n g u i s h t h e r o l e o f e a c h l y m p h o i di n d i s e a s e . A s p r e v i o u s l y , n a i v e s p l e e n c e l l s w e r et o r e s t o r e d i s e a s e s u s c e p t i b i l i t y i n r e s i s t a n t ( i r r a d i a t e d )I n i t i a l l y , T - a n d B - c e l l d e p l e t e d p o p u l a t i o n s w e r ed i r e c t l y i n t o t h e p e r i t o n e u m o f i r r a d i a t e d a n i m a l s .c e l l s w e r e n o t r e q u i r e d , a s p r e - d e p l e t i o n o f B c e l l s d i d n o tt h e c a p a c i t y o f t h e c e l l s t o r e c o n s t i t u t e s u s c e p t i b i l i t y . I nt h e r e m o v a l o f T c e l l s a b l a t e d t h e c o m p e t e n c y o fc e l l s t o r e s t o r e s u s c e p t i b i l i t y . T h i s d a t a a c c o r d s w i t he o b s e r v a t i o n o f W o o l e y e t a l . t h a t m i c e c a r r y i n g t h e n u / n u

a r e n o t s u s c e p t i b l e t o P I A . 2 T h e r o l e o f d i f f e r e n ts u b s e t s i n d i s e a s e s u s c e p t i b i l i t y i s c l e a r f r o m F i g . 2 ,s h o w s t h a t CD4+ T c e l l s w e r e r e q u i r e d f o r P IA d e v e l o p -w h e r e a s CD8+ c e l l s w e r e n o t e s s e n t i a l .

Ho w c o u l d t h e i n f l a m m a t i o n - i n d u c i n g i r r i t a n t a n d a d j u v a n to f p r i s t a n e 2 6 a n d t h e p r e s e n c e o f CD4+ T c e l l s i n t h eb e l i n k e d i n m e d i a t i n g d i s e a s e ? S e v e r a l t h e o r i e s

b e e n p r o p o s e d . F i r s t l y , i r r i t a t i o n c a u s e d b y p r i s t a n er e s u l t i n a l t e r e d g u t p e r m e a b i l i t y , a l l o w i n g b a c t e r i a lt o e n t e r t h e p e r i t o n e u m f r o m t h e i n t e s t i n e s . " 1 ' 4 R e l e a s eg u t a n t i g e n s h a s p r e v i o u s l y b e e n i m p l i c a t e d i n l e a d i n g t o

i n f l a m m a t i o n i n p a t i e n t s w i t h C r o h n ' s d i s e a s e , 2 7 a n dh a v i n g u n d e r g o n e j e j u n o - i l e a l b y p a s s s u r g e r y . 2 8 T h i s

o f c o n t a m i n a t i o n f r o m t h e i n t e s t i n e s w o u l d i n c l u d eb a c t e r i a l a n t i g e n s s u c h a s HSP60 p r o t e i n s .a n t i g e n s c o u l d a c t i v a t e CD4+ T c e l l s , 2 9 ' 3 0 w h i c h c o u l dc r o s s r e a c t w i t h t h e u p r e g u l a t e d j o i n t h s p 5 8 , ' 7 c a u s i n gi n f l a m m a t i o n . S e c o n d l y , i n f l a m m a t i o n u p r e g u l a t e s s e l f

h s p 5 8 1 7 3 1 a n d c o n s e q u e n t l y a c t i v a t e s C D 4 ' T c e l l s s p e c i f i cf o r s e l f h s p 5 8 . 2 9 As w i t h t h e c r o s s - r e a c t i v e T c e l l s a b o v e , t h e s eh s p 5 8 - r e a c t i v e T c e l l s c o u l d l e a d t o j o i n t i n f l a m m a t i o n .T h i r d l y , t h e p r o - i n f l a m m a t o r y c y t o k i n e s i n d u c e d b y p r i s t a n e ,s u c h a s i n t e r f e r o n - y ( I F N - y ) , 3 2 may a l t e r t h e a n t i g e n p r o c e s s i n ga n d p r e s e n t a t i o n o f e i t h e r e n d o g e n o u s o r e x o g e n o u s a n t i g e n s ,l e a d i n g t o c r y p t i c e p i t o p e s b e i n g r e v e a l e d , a n d a c t i v a t i n go t h e r w i s e q u i e s c e n t a u t o r e a c t i v e T c e l l s ( f o r f u r t h e r d i s c u s s i o n ,s e e E l s o n e t a l . 1 6 ) .I t i s c l e a r f r o m o u r r e s u l t s t h a t CD4+ T c e l l s i n t h e s p l e e n so f s u s c e p t i b l e , a r t h r i t i c o r p r o t e c t e d m i c e ( h s p 6 5 p r e -i m m u n i z e d ) a r e r e s p o n s i v e t o h s p 6 5 . 1 1 1 7 W e p r o p o s e t h a t i ti s t h e s e h s p 6 5 - s p e c i f i c CD4' T c e l l s , a s T - h e l p e r 1 ( T h l ) c e l l si n s u s c e p t i b l e m i c e , w h i c h a r e c a p a b l e o f i n d u c i n g a n i n f l a m -m a t o r y r e s p o n s e i n t h e j o i n t s l e a d i n g t o a r t h r i t i s . I n s u p p o r to f t h i s p r o p o s i t i o n , T c e l l s f r o m a r t h r i t i c m i c e , c u l t u r e d w i t hh s p 6 5 , p r o d u c e I F N - y a n d I L - 2 , i n t h e a b s e n c e o f I L - 4 a n dI L - 5 p r o d u c t i o n ( B e e c h e t a l . m a n u s c r i p t s u b m i t t e d ) . On t h eo t h e r h a n d , we p r o p o s e t h a t t h e c e l l s r e c o g n i z i n g h s p 6 5 w h i c ha r i s e i n p r e - i m m u n i z e d ( p r o t e c t e d ) a n i m a l s , a r e Th2 C D 4 'T c e l l s w h i c h w o u l d p r o t e c t b y v i r t u e o f s e c r e t i o n o f a n t i -i n f l a m m a t o r y c y t o k i n e s . A T h 2 p h e n o t y p e f o r t h e s e c e l l s i ss u p p o r t e d b y t h e f i n d i n g t h a t t h e y p r o d u c e I L - 4 a n d I L - 5 ,w h e n c u l t u r e d w i t h h s p 6 5 ( B e e c h e t a l . m a n u s c r i p t s u b m i t t e d ) .W e h a v e n o t e x c l u d e d t h e p o t e n t i a l r o l e o f h s p 6 5 - a c t i v a t e dCD8 + T c e l l s i n PIA a s t h e y c o u l d c l e a r l y c o n t r i b u t e t o a p r o -i n f l a m m a t o r y d i s e a s e m e c h a n i s m . H o w e v e r , i t w a s c l e a r f r o mt h e r e c o n s t i t u t i o n s t u d i e s t h a t CD8 + T c e l l s c a n n o t t r a n s f e rd i s e a s e s u s c e p t i b i l i t y , a n d t h u s a p u r e l y c y t o t o x i c r e s p o n s ed o e s n o t i n i t i a t e P I A .

I n c o n c l u s i o n , t h e p r e s e n t s t u d y d e m o n s t r a t e s a c r i t i c a lr o l e o f CD4+ T c e l l s , a n d a p o t e n t i a l r o l e o f h sp 6 5 - r e a c t i v eCD4+ T c e l l s i n b o t h t h e d e v e l o p m e n t o f a n d p r o t e c t i o n f r o mP I A . T h e p r o t e c t i v e m e c h a n i s m s o f i r r a d i a t i o n a n d h s p 6 5p r e - i m m u n i z a t i o n p r o b a b l y d o n o t a c t b y t h e s a m e m e a n s , a st h e h s p 6 5 p r o t e c t i o n s e e m s t o r e l y o n T - c e l l r e s p o n s e s t o t h ea n t i g e n i n a n i n h i b i t o r y f a s h i o n , w h e r e a s i r r a d i a t i o n a b l a t e st h e p e r i t o n e a l T - c e l l i n f i l t r a t i o n n e c e s s a r y f o r d i s e a s e i n i t i a t i o n .F u r t h e r u n d e r s t a n d i n g o f d i s e a s e p r o c e s s e s w i l l a i d i nd e v e l o p i n g new s t r a t e g i e s f o r i m m u n o - i n t e r v e n t i o n i n t h et r e a t m e n t o f i n f l a m m a t o r y j o i n t d i s e a s e s .

ACKNOWLEGMENTSS . J . T h o m p s o n i s a n A RC R e s e a r c h F e l l o w a n d L . M . S t a s i u k w a sa l s o s u p p o r t e d b y a g r a n t f r o m t h e A r t h r i t i s a n d R h e u m a t i s m C o u n c i l ,UK. M. G h o r a i s h i a n w a s s u p p o r t e d b y t h e I r a n i a n G o v e r n m e n t . T h i si n v e s t i g a t i o n a l s o r e c e i v e d f i n a n c i a l s u p p o r t f r o m t h e UNDP/WorldBank/WHO S p e c i a l P r o g r a m m e f o r r e s e a r c h a n d t r a i n i n g i n t r o p i c a ld i s e a s e s ( T D R ) .

REFERENCES1 . B E D W E L L A . E . , E L S O N C . J . & H I N T O N C . E . ( 1 9 8 7 ) I m m u n o l o g i c a l

i n v o l v e m e n t i n t h e p a t h o g e n e s i s o f p r i s t a n e i n d u c e d a r t h r i t i s .S c a n d J I m m u n o l 2 5 , 3 9 3 .2 . WOOLEY P . H . , S E I B O L D J . R . , WHALEN J . D . & C H A P D E L A I N E J . M .( 1 9 8 9 ) P r i s t a n e - i n d u c e d a r t h r i t i s . T h e i m m u n o l o g i c a l a n d g e n e t i cf e a t u r e s o f a n e x p e r i m e n t a l m u r i n e m o d e l o f a u t o i m m u n e d i s e a s e .A r t h r i t i s Rheum 3 2 , 1 0 2 2 .3 . P A R E K H R . B . , DWEK R . A . , S U T T O N B . J . e t a l . ( 1 9 8 5 ) A s s o c i a t i o no f r h e u m a t o i d a r t h r i t i s a n d p r i m a r y o s t e o a r t h r i t i s w i t h c h a n g e si n t h e g l y c o s y l a t i o n p a t t e r n o f t o t a l s e r u m I g G . N a t u r e 3 1 6 , 4 5 2 .



6/6

8 6 L . M . S t a s i u k e t a l .4 . ROOK G . , THOMPSON S . , BUCKLEY M. e t a l . ( 1 9 9 1 ) T h e r o l e o fo i l a n d a g a l a c t o s y l I g G i n t h e i n d u c t i o n o f a r t h r i t i s i n r o d e n t

m o d e l s . E u r J I m m u n o l 2 1 , 1 0 2 7 .5 . H O U S S A I u F . A . , D E V O G E L A E R J . P . , VA N DA M ME J . , DE

D E U X C H A I S N E S C . N . & V A N S N I C K J . ( 1 9 8 8 ) I n t e r l e u k i n - 6 i ns y n o v i a l f l u i d a n d s e r u m o f p a t i e n t s w i t h r h e u m a t o i d a r t h r i t i s a n do t h e r i n f l a m m a t o r y a r t h r i t i d e s . A r t h r i t i s Rheum 3 1 , 7 8 4 .6 . H I R A N O T . , MATSUDA T . , TURNER M. e t a l . ( 1 9 8 8 ) E x c e s s i v e

p r o d u c t i o n o f i n t e r l e u k i n 6 / B c e l l s t i m u l a t o r y f a c t o r - 2 i n r h e u m a -t o i d a r t h r i t i s . E u r J I m m u n o l 1 8 , 1 7 9 7 .7 . H I T S U M O T O Y . , THOMPSON S . J . , ZHANG Y . W . , ROOK G . A . W . &E L S O N C . J . ( 1 9 9 2 ) R e l a t i o n s h i p b e t w e e n i n t e r l e u k i n 6 , a g a l a c t o s y lI g G a n d p r i s t a n e - i n d u c e d a r t h r i t i s . A u t o i m m u n i t y 1 1 , 2 4 7 .

8 . P O T T E R M. & W A x J . S . ( 1 9 8 1 ) G e n e t i c s o f s u s c e p t i b i l i t y t op r i s t a n e i n d u c e d p l a s m a c y t o m a s i n B A L B / c A n : r e d u c e d s u s c e p t i -b i l i t y i n B A L B / c J w i t h a b r i e f d e s c r i p t i o n o f p r i s t a n e i n d u c e da r t h r i t i s . J I m m u n o l 1 2 7 , 1 5 9 1 .9 . WATANABE Y . , TOKUNGA K . , T A K E U C H I F . e t a l . ( 1 9 8 9 ) P u t a t i v ea m i n o a c i d s e q u e n c e o f H L A - D R / 3 c h a i n c o n t r i b u t i n g t o r h e u m a -t o i d a r t h r i t i s s u s c e p t i b i l i t y . J E x p M ed 1 6 9 , 2 2 6 3 .1 0 . S T A S N E Y P . ( 1 9 7 8 ) A s s o c i a t i o n o f t h e B c e l l a l l o a n t i g e n DR w4w i t h r h e u m a t o i d a r t h r i t i s . New E n g l J M ed 2 9 8 , 8 6 9 .

1 1 . THOMPSON S . , ROOK G . , B R E A L E Y R . , VA N DER Z E E R . & E L S O NC . ( 1 9 9 0 ) A u t o i m m u n e r e a c t i o n s t o h e a t s h o c k p r o t e i n s i n p r i s -t a n e - i n d u c e d a r t h r i t i s . E u r J I m m u n o l 2 0 , 2 4 7 9 .1 2 . S I L M A N A . J . , MACGREGOR A . J . , T H O M S O N W. e t a l . ( 1 9 9 3 ) T w i nc o n c o r d a n c e r a t e s f o r r h e u m a t o i d a r t h r i t i s : r e s u l t s f r o m a n a t i o n -w i d e s t u d y . B r i t J R h e u m a t o l 3 2 , 9 0 3 .1 3 . MCCULLOCH J . , LYDYARD P . M . & ROOK G . A . W . ( 1 9 9 3 )R h e u m a t o i d a r t h r i t i s : how w e l l d o t h e t h e o r i e s f i t t h e e v i d e n c e ?C l i n E x p I m m u n o l 9 2 , 1 .1 4 . THOMPSON S . J . & E L S O N C . J . ( 1 9 9 3 ) S u s c e p t i b i l i t y t o p r i s t a n e -i n d u c e d a r t h r i t i s i s a l t e r e d w i t h c h a n g e s i n b o w e l f l o r a . I m m u n o lL e t t 3 6 , 2 2 7 .

1 5 . K A U F M A NN S . H . E . , VA TH U . , THOLE J . E . R . , VAN EMBDEN J . D . A .& E M M R I C H F . ( 1 9 8 7 ) E n u m e r a t i o n o f T c e l l s r e a c t i v e w i t hM y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s o r g a n i s m s a n d s p e c i f i c f o r t h e r e c o m -b i n a n t m y c o b a c t e r i a l 6 4 kDa p r o t e i n . E u r J I m m u n o l 1 7 , 3 5 1 .1 6 . ELSON C . , BARKER R . , THOMPSON S . & WILLIAMS N . ( 1 9 9 5 )I m m u n o l o g i c a l l y i g n o r a n t a u t o r e a c t i v e T c e l l s , e p i t o p e s p r e a d i n ga n d r e p e r t o i r e l i m i t a t i o n . I m m u n o l T o d a y 1 6 , 7 1 .

1 7 . BARKER R . N . , WELLS A . D . , GHORAISHIAN M . e t a l . ( 1 9 9 6 )E x p r e s s i o n o f m a m m a l i a n h s p 6 0 i n j o i n t s o f m i c e w i t h p r i s t a n e -i n d u c e d a r t h r i t i s . C l i n Exp I m m u n o l 1 0 3 , 8 3 .

1 8 . BARKER R . N . , WEBB G . R . , THOMPSON S . J . , GHORAISHIAN M . ,P O N S F O R D F . M . & E L S O N C . J . ( 1 9 9 2 ) D i f f e r e n t i a l e f f e c t s o fi m m u n i s a t i o n w i t h m y c o b a c t e r i a l 6 5 kDa h e a t s h o c k p r o t e i n ont w o m o d e l s o f a u t o i m m u n i t y . A u t o i m m u n i t y 1 4 , 7 3 .1 9 . THOMPSON S . J . , H I T S U M O T O Y . , G H O R A I S H I A N M . , VA N DER ZEE R .

& E L S O N C . J . ( 1 9 9 1 ) C e l l u l a r a n d h u m o r a l r e a c t i v i t y p a t t e r n t ot h e m y c o b a c t e r i a l h e a t s h o c k p r o t e i n h s p 6 5 i n p r i s t a n e i n d u c e da r t h r i t i s s u s c e p t i b l e a n d h s p 6 5 p r o t e c t e d DBA/1 m i c e .A u t o i m m u n i t y 1 1 , 8 9 .2 0 . V A N EDEN W . , T H O L E J . E . R . , V A N D E R Z E E R . e t a l . ( 1 9 8 8 )C l o n i n g o f t h e m y c o b a c t e r i a l e p i t o p e r e c o g n i ze d b y T l y m p h o c y t e si n a d j u v a n t a r t h r i t i s . N a t u r e 3 3 1 , 1 7 1 .2 1 . VA N DEN B R O E K M . , H O G E R V O R S T E . J . M . , VA N BRUGGEN M . C . J . ,VA N EDEN W . , VA N DER Z E E R . & VA N DEN BERG W. ( 1 9 8 9 )P r o t e c t i o n a g a i n s t s t r e p t o c o c c a l c e l l w a l l - i n d u c e d a r t h r i t i s b yp r e t r e a t m e n t w i t h t h e 6 5 - k D m y c o b a c t e r i a l h e a t s h o c k p r o t e i n .J E x p M ed 1 7 0 , 4 4 9 .2 2 . G H O R A I S H I A N M . , E L S O N C . J . & THOMPSON S . J . ( 1 9 9 3 )C o m p a r i s o n b e t w e e n t h e p r o t e c t i v e e f f e c t s o f m y c o b a c t e r i a l 6 5 - k Dh e a t s h o c k p r o t e i n a n d o v o m u c o i d i n p r i s t a n e - i n d u c e d a r t h r i t i s :r e l a t i o n s h i p w i t h a g a l a c t o s y l I g G . C l i n E x p I m m u n o l 9 4 , 2 4 7 .2 3 . BYRD L . G . , McDONALD A . H . , GOLD L . G . & P O T T E R M. ( 1 9 9 1 )S p e c i f i c p a t h o g e n - f r e e B a l b / c A n m i c e a r e r e f r a c t o r y t o p l a s m a -c y t o m a i n d u c t i o n b y p r i s t a n e . J I m m u n o l 1 4 7 , 3 6 3 2 .2 4 . L E VI TT N . G . , FERNANDEZ-MADRID F . & WOOLEY P . H . ( 1 9 9 2 )P r i s t a n e i n d u c e d a r t h r i t i s i n m i c e . I V . I m m u n o t h e r a p y w i t h mono-c l o n a l a n t i b o d i e s d i r e c t e d a g a i n s t l y m p h o c y t e s u b s e t s . J R h e u m a t o l1 9 , 1 3 4 2 .2 5 . ENGLEMAN E . G . , B E N I K E C . J . , GRUMET C . & E V A N S R . L . ( 1 9 8 1 )A c t i v a t i o n o f human T l y m p h o c y t e s u b s e t s : h e l p e r a n d s u p p r e s s o r /c y t o t o x i c T c e l l s r e c o g n i z e a n d r e s p o n d t o d i s t i n c t h i s t o c o m p a t -i b i l i t y a n t i g e n s . J I m m u n o l 1 2 7 , 2 1 2 4 .2 6 . WILNER B . I . , E V E R S M . A . , TROUTMAN H . D . , TRADER F . W . &McLEAN I . W . ( 1 9 6 3 ) V a c c i n e p o t e n t i a t i o n b y e m l u s i f i c a t i o n w i t hp u r e h y d r o c a r b o n c o m p o u n d s . J I m m u n o l 9 1 , 2 1 0 .2 7 . AINSWORTH M . , E R I K S E N J . , RASMUSEN J . W . , S C H A F F A L I T Z K Y D . E .& MUCKADELL O . B . ( 1 9 8 9 ) I n t e s t i n a l p e r m e a b i l i t y t o 5 1 C r - l a b e l l e de t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d i n p a t i e n t s w i t h C r o h n ' s d i s e a s ea n d t h e i r h e a l t h y r e l a t i v e s . J G a s t r o e n t e r o l 2 4 , 9 9 3 .2 8 . S T E I N H . B . ( 1 9 8 1 ) T h e i n t e s t i n a l b y p a s s a r t h r i t i s / d e r m a t i t i s s y n -d r o m e . A r t h r i t i s R h e u m 2 4 , 6 8 4 .2 9 . ANDERTON S . M . , VA N DER Z E E R . & G O O D A C R E J . A . ( 1 9 9 3 )I n f l a m m a t i o n a c t i v a t e s s e l f h s p 6 0 - s p e c i f i c T c e l l s . E u r J I m m u n o l2 3 , 3 3 .3 0 . ZUGEL U . , SCHOEL B . , Y AM A M O TO S . , HENGEL H . , MOREIN B . &KAUFMANN S . H. E . ( 1 9 9 5 ) C r o s s r e c o g n i t i o n b y CD8 T c e l l r e c e p t o ra B c y t o t o x i c T l y m p h o c y t e s o f p e p t i d e s i n t h e s e l f a n d t h em y c o b a c t e r i a l h s p 6 0 w h i c h s h a r e i n t e r m e d i a t e s e q u e n c e h o m -o l o g y . E u r J I m m u n o l 2 5 , 4 5 1 .3 1 . P O L L A B . S . ( 1 9 8 8 ) A r o l e f o r h e a t s h o c k p r o t e i n s i n i n f l a m m a t i o n ?I m m u n o l T o d a y 9 , 1 3 4 .3 2 . McDONALD A . H . & D E G R A S s I A . ( 1 9 9 3 ) P r i s t a n e i n d u c e s ani n d o m e t h a c i n i n h i b i t a b l e i n f l a m m a t o r y i n f l u x o f CD4+ T c e l l sa n d I F N - y p r o d u c t i o n i n p l a s m a c y t o m a - s u s c e p t i b l e B A L B / c A n P tm i c e . C e l l I m m u n o l 1 4 6 , 1 5 7 .


pristane-induced arthritis is cd4+ t-cell dependent

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