prinsip teknologi dna rekombinan 2010
TRANSCRIPT
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 11
PRINSIP TEKNOLOGI PRINSIP TEKNOLOGI DNA REKOMBINANDNA REKOMBINAN
DEBBIE S. RETNONINGRUM
SEKOLAH FARMASI
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 22
PUSTAKAPUSTAKA
1. Glick, BR and JJ Pasternak, 2003, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA,hal. 47-89 dan 101-110
2. Groves MJ, 2006, Pharmaceutical Biotechnology, hal. 44-55
3. Brown TA, 2006, Gene Cloning & DNA analysis, hal. 3-6 dan 8-12; 54-80 dan 87-97
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 33
TEKNOLOGI DNA REKOMBINANTEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
• Rekombinasi antara molekul DNA dari organisme berbeda: fenomena umum di alam.
• Corynebacterium diphtheriae yang diinfeksi oleh virus βmenghasilkan toksin yang bertanggung jawab terhadap gejala difteri.
• Perubahan genetik dalam bakteri ini disebabkan oleh virus dan merupakan suatu rekayasa genetik dalam alam.
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 44
TEKNOLOGI DNA REKOMBINANTEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
• Duplikasi fenomena alam di laboratorium• Mengembangkan metode introduksi berbagai informasi
genetik ke dalam suatu organisme.
• Manipulasi genetik
E. coli dan Bacillus subtilis (bakteri) Saccharomyces cerevisiae (ragi)
• Produksi bahan mahal atau tidak mungkin dibuat secara tradisional.
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 55
CONTOH PRODUK REKOMBINANCONTOH PRODUK REKOMBINAN
– ANTIBODI REKOMBINAN
– PROTEIN TERAPEUTIK: insulin, interferon, albumin serum manusia, hormon pertumbuhan manusia, aktivator plasminogen jaringan, antithrombin, faktor pembekuan darah, limfokin, faktornekrosis tumor, dismutase superoksida, dan gonadotropin manusia
– VAKSIN: hepatitis B, herpes, influenza, malaria
– VAKSIN DNA
– TERAPI GEN
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 66
CONTOH PRODUK REKOMBINANCONTOH PRODUK REKOMBINAN
– PRODUK PERTANIAN: tanaman tahan penyakit, resistensi pestisida, bioinsektisida, fiksasi nitrogen
– PRODUK BIOREMEDIASI: pengurai lemak/minyak, penghilangan herbisida, pendegradasi pestisida
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 77
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN (KLONING GEN)TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN (KLONING GEN)
• PENYEDIAAN DNA: SISIPAN DAN VEKTOR (Ex: PLASMID)
• LIGASI: PENGGABUNGAN DNA SISIPAN DAN VEKTOR (= VEKTOR REKOMBINAN)
• TRANSFORMASI: TRANSFER INFO GENETIK KE SEL INANG& PERBANYAKAN DNA
• SELEKSI: SEL YG MENGANDUNG PLASMID/ VEKTOR REKOMBINAN
• DETEKSI: KEBERADAAN DNA SISIPAN, KEBENARAN DNA SISIPAN (UKURAN DAN URUTAN NUKLEOTIDA)
1972 Stanley Cohen danHerbert Boyer
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 88
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN (KLONING GEN)TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN (KLONING GEN)
DNA kromosom
Potong dengan enzim restriksiDNA plasmid
ligasi
DNA rekombinan
transformasi sel
transforman1 sel tumbuh jadi 1 koloni
klon
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 99
KloningKloning DNA DNA keke PlasmidPlasmid
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1010
SUMBER DNA SISIPANSUMBER DNA SISIPAN
• TIGA PENDEKATAN:– KEPUSTAKAAN DNA (DNA LIBRARY): DNA
GENOMIK
– PRODUK PCR
– mRNA cDNA (eukariot)
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1111
Kepustakaan genomikKepustakaan genomik (genomic library)(genomic library)
• Koleksi klon yang jumlahnya cukup mencakup semua gen dari suatu organisme
• Contoh ukuran genom:– Bacillus anthracis: 5,1 – 5,2 Megabasa
– Escherichia coli: 4 Megabasa
– Pseudomonas putida: 6,0 – 6,1 Megabasa
– Staphylococcus aureus: 2,9 Megabasa
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1212
KROMOSOM KROMOSOM vsvs PLASMID PLASMID
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1313
PLASMIDPLASMID
• DNA UNTAI GANDA• BERBENTUK LINGKARAN• BERSALINAN TINGGI• BERUKURAN KECIL (MUDAH DIMANIPULASI)• DAPAT BEREPLIKASI SENDIRI DI DALAM SEL• DAPAT DISISIPI DNA ASING (DNA SISIPAN)• ADA DUA GEN MARKER:
– UNTUK MENDETEKSI ADANYA VEKTOR– UNTUK MENDETEKSI ADANYA DNA SISIPAN
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1414
VEKTOR (Plasmid)VEKTOR (Plasmid)
• VEKTOR KLONING
HANYA UNTUK MENDAPATKAN DNA
• VEKTOR EKSPRESI
UNTUK MENDAPATKAN PROTEIN (tambahankomponen untuk mempermudah proses “downstream”/pemurnian)
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1515
Beberapa contoh vektor kloningBeberapa contoh vektor kloning
Nama Tipe Sel inang Keterangan
pBR322 Plasmid E. coli Resistensi terhadap ampisilin, tetrasiklin. Vektor untuk tujuan umum
pUC8 Plasmid E. coli Resistensi terhadap ampisilin, skrining lac. Vektor untuk tujuan umum
pBluescript Plasmid E. coli Resistensi terhadap ampisilin, skrining lac.
λgt10 Bakteriofaga E. coli Kloning cDNA
YEp24 Plasmid E. coli/ragi Resistensi ampisilin. Vektor ragi shuttle
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1616
PETA PLASMIDPETA PLASMID
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1717
ENZIM RESTRIKSIENZIM RESTRIKSI
• MEMBATASI PERTUMBUHAN VIRUS PADA INFEKSI VIRUS PADA BAKTERI
• TIPE II: DIGUNAKAN PADA DNA REKOMBINAN
• MEMOTONG IKATAN FOSFODIESTERASE
• MENGENALI URUTAN PALINDROM
5’ GAATTC 3’
3’ CTTAAG 5’
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1818
DNA (ligase)
5’- NNNGOH PAATTCNNN -3’
3’- NNNCTTAAP OHGNNN -5’
ligase
5’- NNNGAATTCNNN -3’3’- NNNCTTAAGNNN -5’
ENZIM RESTRIKSI & LIGASEENZIM RESTRIKSI & LIGASEDNA (enzim restriksi)
5’- NNNGAATTCNNN -3’3’- NNNCTTAAGNNN -5’
EcoRI
5’- NNNGOH PAATTCNNN -3’
3’- NNNCTTAA P OHGNNN -5’
• Sisi pengenalan enzim restriksi
• Urutan nukleotida rantai atas = Urutan nukleotida rantai bawah
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1919
CONTOH CONTOH ENZIM RESTRIKSIENZIM RESTRIKSI
• EcoRI (Escherichia coli galur R): G↓AATTC (ujung lancip)
• BamHI (Bacillus amyloliquefaciens): G↓GATCC (ujung lancip)
• BglII (Bacillus globigii): A↓GATCT (ujung lancip)
• SalI (Streptomyces albus): G↓TCGAC (ujung lancip)
• PstI (Providencia stuartii 164): CTGCA↓G (ujung lancip)
• HindIII (Haemophilus influenzae): A↓AGCTT (ujung lancip)
• KpnI (Klebsiella pneumonia): GGTAC↓C (ujung lancip)
• XbaI (Xanthomonas bradii): T↓CTAGA (ujung lancip)
• HaeIII (Hemophilus aegyptius): GG↓CC (ujung tumpul)
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 2020
KloningKloning ProdukProduk PCRPCR
PCR
S. pyogenes M12 Gen ska
Ligasi
pGEMTrekombinan
SDM
Transformasi
pGEMT/skaE. coli XL-Blue
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 2121
LIGASI PRODUK PCR KE LIGASI PRODUK PCR KE pGEMpGEM--TT
Gen ska
A A
pGEM-T
+
pGEM-T REKOMBINAN
ligasi Transformasi
E. coli JM109
E. coli pGEM-T REKKontrol +Kontrol –
LB/Amp LB/Amp/X-Gal/IPTGLB/Amp
Streptococcus pyogenes
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 2222
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 2323
TransformasiTransformasi
• info genetik ditransfer ke sel inang denganmetode transformasi
• Sel inang dibuat kompeten (siap menerima“DNA asing”) → modifikasi struktur dinding sel
• Metode transformasi : heat shock/elektroporasi
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 2424
Transformasi
Sel kompeten
Seleksi Biru-Putih
SeleksiSeleksi TransformanTransforman
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 2525
SELEKSI BIRU PUTIHSELEKSI BIRU PUTIH
• MENGETAHUI APAKAH DNA SISIPAN SUDAH ADA?
• PADA MCS TERDAPAT GEN lacZ (MENGKODE GALAKTOSIDASE)
• X-GAL → BIRU
• DNA SISIPAN AKAN MERUSAK GEN lacZ →GALAKTOSIDASE TIDAK DIPRODUKSI →
X-GAL TIDAK DIURAIKAN → PUTIH
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 2626
DeteksiDeteksi keberadaankeberadaan DNA DNA sisipansisipan
• Analisis migrasi
• Analisis restriksi Elektroforesis gel
• PCR
• Penentuan urutan DNA sisipan (sekuensing)
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 2727
ELEKTROFORESIS ELEKTROFORESIS GELGEL
• Gel agarosa atau poliakrilamid
• DNA bermuatan negatif (ada gugus fosfat): bergerak dari kutub negatif ke kutub positif
• DNA bermigrasi tergantung dari ukurannya: migrasi DNA ukuran kecil > ukuran besar
• Visualisasi: – etidium bromida / Syber Green (DNA berfluorosensi
dengan pemaparan UV)
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 2828
Elektroforesis Elektroforesis GGelel AgarosaAgarosa
Joe Sambrook dan Bill Sugden: elektroforesis gel agarose untuk DNA
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 2929
KONFIRMASIKONFIRMASI pGEMpGEM--T REKOMBINANT REKOMBINAN
Isolasi pGEM-T/ska
(kit Qiaprep, Qiagene)
1 = pGEM-T rekombinan2 = pGEM-T tanpa DNA sisipan
1 2
Ukuran plasmid tanpa DNA sisipan <ukuran plasmid dengan DNA sisipan
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 3030
1419 pb
517 pb
Isolasi Plasmid Rekombinan
1 2 3
Koloni PutihKoloni Biru
Elektrogram hasil isolasi plasmid koloni biru dan putih :1. Koloni biru2. Koloni putih3. Koloni biru
KoloniBiru
pGEM-T (3000 bp)
881 pbDNA sisipan
1 2
Elektrogram hasil restriksi Nde/BamHI1. Marka pUC19/HinfI2. Hasil Pemotongan NdeI/BamHI
Analisis Restriksi pGEM-T rekombinan
KONFIRMASIKONFIRMASI pGEMpGEM--T REKOMBINANT REKOMBINAN
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 3131
HASIL HASIL PENENTUAN URUTAN NUKLEOTIDA PENENTUAN URUTAN NUKLEOTIDA DNA SISIPANDNA SISIPAN (DNA Sequencing)(DNA Sequencing)
Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB BioteknologiBioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 3232
HASIL SEKUENSINGHASIL SEKUENSING
Bandingkan urutan hasil sekuensing dg urutan DNA sisipan asal
(Analisis homologi/kesamaan – program BLAST dari NCBI)