primera reunión nacional de virología. · por virus que producen manifestaciones clínicas...

Vol. 8/No. 2/Abril-Junio, 1997

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mayoría de las enfermedades virales no se han con-trolado aún. Cada año en las estaciones de invier-no y principios de la primavera, y en ambos hemis-ferios del planeta, se presentan epidemias ocasio-nadas por virus que afectan los sistemas respirato-rios y gastrointestinales, las infecciones por saram-pión se presentan en forma cíclica cada dos años,y en forma esporádica se observan brotes por losvirus de la rubéola, la varicela y el dengue. Lasinfecciones endémicas por virus son también im-portantes, sobresaliendo aquellas causadas porpapilomavirus, virus de la familia herpesvirus y losvirus de las hepatitis.

En los últimos 30 años han ocurridoepidemias de origen viral con sintomatología queno se encontraba descrita en la literatura médica.El caso más conocido es el del Virus de laInmunodeficiencia Humana (VIH), responsable delsíndrome de inmunodeficiencia adquirida. Estevirus se encuentra distribuido a nivel mundial y seestima que más de 15 millones de personas estáninfectadas por él, y el número continuaaumentando. Además de la epidemia por VIH,recientemente se han reportado otras en diferentesregiones del mundo, ocasionadas principalmente

EXPOSICIÓN DE MOTIVOS.Las enfermedades virales no son recientes,

y algunas de ellas se conocen desde la antigüedad.Hay por ejemplo registros de casos de poliomielitisque datan de la época de los faraones en Egipto, yde casos de rabia desde el siglo XXIII A.C. enBabilonia. De igual manera, la descripción de lossignos y síntomas característicos de algunas en-fermedades virales se tienen desde antes de nues-tra era. Hipócrates, en el siglo V A.C., fue el pri-mero en describir las manifestaciones clínicas deenfermedades como la parotiditis, viruela y polio,enfermedades que, excepto por la viruela, se pre-sentan en la actualidad y con los mismos cuadrosclínicos. El virus de la Viruela es el único agenteinfeccioso que se ha erradicado de la faz de la tie-rra, y probablemente poliovirus sea el siguiente enunos cuantos años.

Las epidemias por virus han ocurrido tam-bién desde épocas remotas. La plaga de Atenas enel año 430 A.C., una de las primeras epidemias re-gistradas, y con una mortalidad del 30%, fue pro-bablemente causada por el virus de la influenza.Actualmente, a pesar de los avances en la medici-na y de la mejoría en las condiciones sanitarias, la

Primera Reunión Nacional deVirología.

Rev Biomed 1997; 8:115-132.

ORGANIZADORES

Carlos F. Arias1, Patricio Gariglio

2, Beatriz Gómez

3.

1Instituto de Biotecnología, U.N.A.M., Cuernavaca, Mor., México.

2Depto. de Genética y Biología

Molecular, CINVESTAV, IPN, 3Depto. de Microbiología y Parasitología, Fac. de Medicina, U.N.A.M.,

México, D.F.

Realizada en Oaxtepec, Mor., México, del 23-25 de Enero de 1997.Solicitud de sobretiros: Dr. Carlos F. Arias. Instituto de Biotecnología, U.N.A.M., Apdo. Postal 510-3, Col. Miraval, C.P. 62250. Cuernavaca, Mor.,México.

por virus que producen manifestaciones clínicashemorrágicas como el Ebola, Hantavirus Sin Nombre,Junin, Sabia, Rift Valley, Guanarito, etc. En contrade lo que se pensaba hace algunos años, es claro ahoraque las enfermedades infecciosas, en particular las deorigen viral, no están bajo un control eficaz y que lasepidemias se seguirán presentando en forma regular,tanto aquellas causadas por virus conocidos comotambién por virus nuevos. Por otra parte, existetambién un número considerable de virus que infectantanto plantas como animales de interés agropecuario,y que son responsables de pérdidas económicas degran magnitud en este sector.

Además de la importancia de los virus desdeel punto de vista de salud pública, veterinaria y agrí-cola, su estudio ha sido también un factor importantepara el avance del conocimiento en diversos aspec-tos de la biología de las células eucariontes. Por ejem-plo, el genoma del virus del mosaico de tabaco (TMV)fue el primero en emplearse para probar que la infor-mación genética podía ser almacenada en moléculasde RNA, y experimentos con este virus fueron tam-bién cruciales para correlacionar la informacióngenética con la secuencia de aminoácidos en las pro-teínas, y para confirmar la universalidad del códigogenético. La caracterización del genoma segmentadode reovirus permitió describir la estructura del “cap”,la cual se encuentra presente en el extremo 5’ termi-nal de los mRNAs eucariontes y es esencial para sutraducción eficiente. El estudio de los adenovirus lle-vó al descubrimiento del procesamiento que experi-mentan los RNA mensajeros antes de ser exportadosdel núcleo al citoplasma celular. Los virus de bacte-rias también han jugado un papel crucial en el desa-rrollo de la biología molecular y celular. Por ejemplo,el descubrimiento del RNA mensajero se hizo al ca-racterizar la composición de bases de RNA obtenidade la bacteria Escherichia coli infectada con elbacteriofago T2. Los virus pequeños de DNA, comoöX174 y M13, fueron los primeros organismos delos cuales se determinó la secuencia completa delgenoma, permitiendo entender ampliamente su ciclode vida. Estos virus son tan sencillos que su materialgenético depende de las enzimas celulares para

replicarse.Por esta razón, su estudio ha sido útil paraidentificar y analizar las proteínas celularesinvolucradas en la replicación del DNA.

Debido a su relativa simplicidad, el estudiode la replicación de los virus ha progresado rápida-mente y ha iluminado muchos de los mecanismosgenéticos básicos de la célula. Así, el modelo del vi-rus SV40 ha servido para estudiar la estructura y fun-ción de la cromatina. En particular, losminicromosomas de SV40 han llevado a entender losmecanismos relacionados con estos virus tumorales,junto con los retrovirus que contienen oncogenes, hanayudado a establecer el concepto de carcinogénesisen humanos y al descubrimiento de los oncogenescelulares. En el campo de la inmunología, el virus dela linfocoriomeningitis sirvió como modelo para iden-tificar a las moléculas del complejo mayor dehistocompatibilidad (MHC) clase I como el ligandode los receptores de las células T citotóxicas, descri-biendo así el fenómeno de restricción por el MHC.El virus de la influenza fue también una herramientafundamental para estudiar la presentación de antígenospor moléculas del MHC clase Y. La caracterizacióndetallada de los virus ha permitido su manipulacióngenética y el aprovechamiento de su tropismo paraser empleados como vectores de expresión, tanto encélulas en cultivo, como en organismos completos,en aplicaciones de terapia génica. Adenovirus,retrovirus, vaccinia, el virus Sindbis y baculovirus sonsólo algunos ejemplos de virus empleados en estasaplicaciones.

A pesar de la clara importancia de los viruscomo agentes etiológicos de un sin número de enfer-medades en humanos, animales y plantas, de relevan-cia regional y global, así como de su intenso uso comoherramientas para caracterizar biología celular ymolecular de células procarióticas y eucarióticas, elnúmero de investigadores dedicado al estudio de al-guna de las áreas de la virología en nuestro país, hasido tradicionalmente muy pequeño. Aunque el bajonúmero de investigadores es un problema general dela ciencia en México, este problema es particularmenteagudo en el caso de la virología. Esto se refleja, porejemplo, en la débil respuesta de la comunidad cien-

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Revista Biomédica

tífica del país ante la actual epidemia del VIH; antelas infecciones por papilomavirus, primera causa decáncer en mujeres mexicanas; ante el riesgo de unbrote importante de dengue hemorrágico, ante losbrotes anuales de rotavirus; ante la presencia de vi-rus de gran impacto en la salud de la población infan-til como el virus sincitial respiratorio; ante epidemiascomo la de influenza aviar, de gran importancia eco-nómica para el país; y ante la clara necesidad de esta-blecer métodos diagnósticos rápidos y efectivos paraenfermedades virales en plantas. Sin duda alguna serequiere de un programa bien establecido para for-mar recursos humanos en diversas áreas de lavirología moderna que sean capaces de responder alreto que nos presentan las actuales enfermedadesvirales ya presentes en México, y aquellas que segu-ramente surgirán o re-surgirán en un futuro cercano.

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Con el propósito de promover la interacciónentre investigadores dedicados al estudio de lavirología, los cuales además de ser escasos se encuen-tran aislados en diversas instituciones de la Repúbli-ca Mexicana, y de estimular el interés de estudiantesy jóvenes investigadores en esta área, se realizó laPrimera Reunión Nacional de Virología. La parti-cipación en esta reunión fue entusiasta, habiendo con-tado con más de 90 investigadores y estudiantes de18 instituciones diferentes. Durante esta reunión sepresentaron 61 trabajos sobre diversos aspectos derotavirus, poliovirus, virus sincitial respiratorio, vi-rus del dengue, papilomavirus, VIH, virus de la rabiay virus de la hepatitis, así como baculovirus, y virusde la mancha anular de la papaya. Los resúmenes deestas presentaciones se reproducen en el presente nú-mero de la REVISTA BIOMEDICA.

RESUMENES

Pasado y presente del tifo en México

Calderón-Romero Leticia1, Bravo-Lindoro Amalia2. Sanchez-Vergara Josefina3, Cruz-Viruel Nelly3 y Acu-ña-Soto Rodolfo1.

1Departamento de Microbiología y Parasitología. Facultad de Medicina. Universidad Nacional Autónoma deMéxico. 2Banco de Sangre del Instituto Nacional de Pediatría. 3Programa NUCE, Facultad de Medicina,Universidad Nacional Autónoma de México.

El invierno de 1915-1916 fue una de las peores épocas para la población civil durante la revolu-ción mexicana, en ese tiempo apareció en la ciudad de México una de las numerosas epidemias de tifo. Con untotal de aproximadamente 9,000 casos en un corto período de tiempo, la capacidad de los hospitales se rebasórápidamente. Para establecer orden en atención médica y evitar la sobrecarga de algunos hospitales el gobiernoorganizó un sistema de traslado de enfermos de sus domicilios a los diferentes hospitales de la ciudad. Para estose inició un registro centralizado de todos los enfermos. En él anotaron sistemáticamente algunos datos paracada enfermo, estos incluían: número consecutivo, fecha, nombre, edad, sexo, domicilio, médico que hacia eldiagnóstico y solicitaba el traslado, hospital al que fue trasladado y observaciones. El registro se llevó cuidadosa-mente desde el inicio de la epidemia en el mes de Octubre de 1915 hasta que los casos disminuyeron conside-rablemente en marzo de 1916. Afortunadamente los originales de dichos registros se conservan completos y enbuen estado. Utilizando mapas de la época hemos podido reconstruir la epidemia día por día y seguir la trayec-toria y casuística de una forma muy precisa. Una de las primeras observaciones que resulta de este análisis esque la trayectoria general de la epidemia de tifo de 1915-1916 es muy semejante a otras epidemias bien descritay que había ocurrido en los años de 1875-1876. Su inicio fue en ambos casos en el noroeste de la ciudad en elpueblo de Tacuba, ambas epidemias afectaron inicialmente a los mismos barrios pobres de la periferia con unpatrón casi idéntico, para posteriormente propagarse en todas direcciones. Datos sobre tasas de ataque, veloci-dad de dispersión y patrones de propagación en la misma unidad habitacional, particularmente en vecindades,serán presentados en la reunión.

La pregunta natural que resulta del estudio de la historia del tifo es indagar cual es la situación deesta enfermedad en la actualidad. Hoy en día existen tres posibles formas en que el tifo puede estar presente, oausente, en la Ciudad de México. 1.-Erradicada completamente. 2.-Se mantiene a muy bajo nivel con casosmuy ocasionales provenientes probablemente en medio murino. 3.-Presente en números relativamente eleva-dos con casos frecuentes pero con ausencia de transmisión horizontal por la ausencia del vector humano yconfundido con otras enfermedades particularmente con fiebre tifoidea. Con el objeto de explorar esta interro-gante decidimos realizar una encuesta seroepidemiológica en habitantes de la Ciudad de México. Se estudiaronun total de 2000 sueros provenientes de donadores que asistieron al Banco de sangre del Instituto Nacional dePediatría. Los sueros fueron estudiados por medio de la reacción de Weil-Felix. El resultado global resulta en un5% de casos positivos con títulos mayores de 1:360. La técnica de Weil-Felix es altamente específica pero nomuy sensitiva. Es muy probable que se hayan escapado algunos casos positivos. Aún considerando este errorencontramos un número muy elevado de casos frecuentemente positivos. Se han reportado algunos casos deinmunidad cruzada con otras enfermedades producidas por rikettsias, en particular con la fiebre manchada delas montañas rocallosas lo cual de ser cierto resultaría sumamente extraño. Los resultados obtenidos tienen queser confirmados por otras técnicas, particularmente inmunonofluorescencia. Todos los sueros positivos y algu-nos negativos están en proceso de confirmación por el Dr. David Walker del laboratorio de referencia paraenfermedades producidas por rikketsia del Centro Médico de la Universidad de Texas en Galveston así comopor el laboratorio de patógenos especiales del CDC. Los resultados finales de la encuesta seroepidemiológicaasí como sus implicaciones se presentarán en la reunión.

Human herpesvirus-6 in bronchioloalveolar carcinoma

Wagner M. Krueger GRF. Rojo J. Cruz H. Linder R. Sharp M, Delas Heras M. LeyssensN. Schneider B. Rose V, Suzumlya J. Kikuchi M.

University of Cologne, Germeny.University of texas, Houston, TX. United States of America.University of Mexico, Mexico DF, Mexico.Medica University of Luebeck. Germany.Moredun Research Institute Edinburgh, Scotland, Grat Britain.University of Zaragoza, Zaragoza, Spain.University of Maryland. MD, United States of America.Fukouka University Japan.

Morphologically, sheep pulmonary, adenomatosis (syn; SPA, ovinepulmonary carcinoma jaagsiekte) shows some resemblance to subtypes ofbronchioloalveolar carcima (syn.: BAC, human pulmonary adenomatosis) Althoughthe role of animal herpesviruses in SPA has already been well characterized, the roleof human herpesviruses in BAC is not yet clear, In this histological pilot study 30specimens of mucinous and mon-mucinous BAC were screened for latent humanherpesvirus-6(HHV-6) infection using monoclonal antibodies (HAR 3) to the lateantigen gp 110/60 of HHV-6 and in situ hybridization, 61% of the cases investigatedshowed positive results for HHV-6 regardless of the tumor subtype (mucinous ormon.mucinous) or the predominating tumor cell type, In addition to H.AR 3 expressedin Tlymphocytes in case of infection. two patients presented latent HHV-6 in tumorcells. Searching for vial coinfections and signs of transactivation we found two casespositive for parvovirus B19 (with one of the also hosting latent HHV-6). One casewas positive for cytomegalovirus (CMV)but negative for HHV-.6. No case was foundpositive for human herpervirus-7 (HHV-7) respiratory syneytial virus (RSV)Epstein.Barr virus (EBV) human papilomavirus (multi-type screening) adenovirustype 2, human herpesvirus type 1 and 2 Presence or absence of HHV-6 infectiondid not correlate with and of the following features BAC subtype, expression rates ofp53 gene product. p21 WAF1/Cip1/Sdil protein proliferating cell nuclear antigen(PCNA), and the proliferation marker MiB1, the tumber of apoptotic cells per HPF(using in situ end labeling for detection) or the amount of scarification and interstitialfibrosis, An evaluation of BAC (sub-) classification criteria using neuronal networkcomputers.to reduce inter-observer variability will be attempted after submission ofthis abstract, The authors are most grateful to j. Luka(Easten Virginia Medical School Norfolk,VA, USA) for kindly providing us with the monoclonal antibody to latent HHV-6This study was kindly supported by the International Institute of ImmunopathologyInc. (1.1.1.P.), Houston, TX, USA.

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Efecto de mutaciones puntuales en la cristalización de la poliedrina en elnucleopoliedrovirus de Autographa californica.

Alejandro Bravo Patiño, Jorge E. Ibarra

Departamento de Biotecnología y Bioquímica. CINVESTAV-IPN. Unidad Irapuato, Apdo.Postal 629, 36500 Irapuato, Gto.

El cuerpo de oclusión (CO) del VPNMAc está construido de maneramayoritaria de poliedrina, la cual contiene 245 aminoácidos (aa) en promedio ytiene un peso aproximado de 29 kDa. Para que pueda formarse el CO en la etapatardía de la infección, la poliedrina producida en el citoplasma de la célula infectadanecesita introducirse al núcleo de la misma, cosa que hace principalmente pormedio de una señal de localización nuclear (SLN) comprendida entre los aa 32 a35.

En el presente trabajo se evaluaron los cambios en la cristalización de lapoliedrina al introducirse mutaciones puntuales en su secuencia, cambiando los aaen las posiciones 34, Lys (AAG); 36, His (CAC) y 37, Phe (TTC) por 3 Trp (TGG).Estas mutuaciones fueron realizadas por medio de la técnica de PCR, empleandopara ello dos oligonucleótidos específicamente diseñados. El producto del PCR seclonó en el vector pGEM-T, del cual se extrajo para construir el vector detransferencia pUCEcoW. Con esto último vector, y junto con DNA total del virusBacPAK6, que no expresa el gen de la poliedrina, se cotransfectaron células de lalínea Tn5 B1 para generar, mediante recombinación homóloga, el virus con el genmutante de la poliedrina, el cual se reconoció por la generación de CO en los núcleosde las células infectadas.

Los resultados muestran que la poliedrina mutada no presentó proble-mas para entrar eficientemente al núcleo, a pesar de que se alteró uno de los aaque conforman la SLN. Además se observaron CO en el núcleo de las célulasinfectadas. La morfología de los mismos se vió completamente alterada, pues seobservaron CO sin una forma definida y variable, además se disminuyó el tama-ño del mismo, quedando abierta la posibilidad de que los aa alterados jugaran unpapel importante en el proceso correcto de cristalización de la poliedrina. Sin em-bargo, los estudios no nos permiten definir si el efecto es a nivel de la estructuraparacristalina o a nivel supramolecular en el proceso de cristalización de lapoliedrina.

Secuenciación parcial del gen de la proteína de la capside del virus de la mancha anu-lar de la papaya (vmap), aislado “Veracruz”

Ruiz Castro B.S., Silva Rosales L.

Depto. Ing. Genética, CINVESTAV-IPN Unidad Irapuato Apdo. Postal 629. C.P. 36500.Irapuato, Gto. lsilva_irapuato.ira.cinvestav.mx

El virus de la mancha anular de la papaya (VMAP) se encuentra dentrodel grupo de los potyvirus. Los potyvirus son virus de RNA de cadena sencilla deaproximadamente 10 Kb. Durante su replicación producen una poliproteína que esprocesada por una proteinasa codificada por el mismo virus, Las partículas virales,vistas al microscopio electrónico parecen varillas flexibles y forman inclusiones enla célula infectada. Estos virus infectan a varias especias de paraya (Carica papa-ya) y son trasmitidos eficientemente ya sea por vía mecánica o por áfidos de unamanera no persistente.

El VMAP aislado del estado de Veracruz se inoculó mecánicamente aplantas jóvenes de papaya bajo condiciones de invernadero. 25 días después de lainoculación se observaron los síntomas típicos de este virus: mosaico, amarillamientoy distorsión de hojas. Con el mismo aislado se inocularon distintas plantas que fue-ron utilizadas como plantas.diferenciales para la caracterización inicial de nuestrovirus. Ninguna de éstas presentó síntomas, a excepción de la especie Cucumismetuliferus, en donde también hemos propagado nuestro aislado.

Se aisló RNA total de hojas de plantas de papaya infectadas con esteaislado. Después de verificar su integridad en un gel de agarosa, se llevó a cabo unareacción de transcripción reversa, seguida de una reacción en cadena de polimerasa(RT-PCR). Para tal propósito se diseñaron dos oligonucleótidos complementarios alas bases de los extremos 5’ y 3’ respectivamente del gen de la proteína de la cápside.El producto obtenido se ligó posteriormente en el vector PCRII, y se clonó usandola cepa DH5 a de E. coli. Se obtuvieron varias clonas con el inserto deseado y seescogió una de ellas para llevar a cabo la secuenciación de nucleótidos.

Se comparó la secuencia obtenida, con las secuencias existentes en elbanco de genes y se observó una alta homología con otros aislados del VMAP dediferentes regiones geográficas reportadas en la literatura. Se discutirá la implica-ción de ésta homología.

Mapeo del dominio de hemaglutinación de los rotavirus.

P. Isa. S. López, C. F. Arias.

Depto de Genética y Fisiología Molecular del Instituto de Biotecnología, UNAM. Cuernavaca,Mor. 62210.

Los rotavirus son la principal causa de diarrea severa enniños menores de 3 años, estimándose que en este grupo de edad sonresponsables de aproximadamente 800,000 muertes al año en todo elmundo, Los rotavirus están formados por un genoma de RNA de do-ble cadena cubierto por tres capas concéntricas de proteína. La capamás externa esta formada por dos proteínas, VP4 y VP7, siendo VP4la proteína que forma las espículas que se proyectan de la superficiedel virus. La mayoría de las cepas de rotavirus aisladas de animalesson capaces de aglutinar eritrocitos (Hemaglutinación), y a VP4 se leha identificado como la hemaglutina viral. La hemaglutinación de losrotavirus está mediada por ácidos siálicos en la glicoforina A. La uniónde los rotavirus a la célula blanco también está mediada por ácidossiálicos. Para mapear los aminoácidos en VP4 que están directamen-te involucrados en el contacto con el ácido siálico, analizamos pormutagénesis dirigida la proteína VP8 (un producto de VP4 despuésde tratamiento con tripsina), del rotavirus de simio RRV, la cual ex-presada en E. coli tiene actividad hemaglutinante. Las tirosinas yserinas fueron seleccionadas para mutagénesis en base al análisis deotras hemaglutininas virales (el virus de influenza y polyomavirusmurino), de las cuales se ha determinado su estructura mediante aná-lisis cristolográfico del complejo de hemaglotinina y ácido siálico.Los cambios en serina 114 y tirosinas 165, 194 y 219 no afectan elnivel de actividad de hemaglutinación. De los otros aminoácidos ana-lizados los cambios en tirosinas 188 y 189 eliminaron la capacidadde hemaglutinación sin afectar la estructura de VP8.

El factor ap1 participa en el mecanismo de represión de la actividad del promotor delos genes e6 y e7 de hpv-18 por el producto del gen supresor de tumor RB.

M. en C. Cristina Castañeda Patlán1, Dr. Patricio Gariglio Vidal1 y Dr. Efraín Garrido Gue-rrero2

1 Departamento de Genética y Biología Molecular CINVESTAV-IPN. Av. IPN 2508 Col,San Pedro Zacatenco, 07000 México D.F.2 Laboratorio de Inmunología UMF ENEP-Iztacala UNAM. Av. de los Barrios S/N Col, LosReyes Iztacala, Tlalnepantla 54090 Edo. de México.

El producto del gen supresor de tumor RB (pRb) regula la expresión devarios genes celulares cuyos productos proteícos son factores de transcripción talescomo c-myc y c-fos. La expresión de los genes tempranos E6 y E7 de papilomavirushumano tipo 18 (HPV-18), controlada por el promotor P105, también es reguladanegativamente por pRb. Aunque se han detectado dos posibles sitios E2F en la LCRde HPV-18 y se ha demostrado su funcionalidad, la importancia del factor de trans-cripción AP1 (formado por los productos proteícos de los genes celulares de las fami-lias fos y jun ) en el control de la actividad transcripcional de P105, sugiere su posi-ble participación en la regulación de este promotor por pRb. Mediante ensayos deretardamiento en gel, utilizando extractos nucleares de células C-33A transfectadascon un plásmido que permite expresar niveles elevados de pRb en células eucariontes,observamos que la actividad de unión del factor AP1 se modifica significativamente.Mediante ensayos de contransfección transitoria analizamos también el efecto de lasobreexpresión del pRb sobre la actividad transcripcional del promotor P105 cuandose han mutado en la LCR los sitios AP1 (proximal, distal y ambos ) observando que larepresión por pRb en la LCR natural es mayor que en las construcciones que poseenlas mutaciones en los sitios AP1. Mas aún, pRb efecta la actividad transcripcional deun promotor heterólogo (timidina cinasa del virus Herpes simple) al que se ha inserta-do uno de los sitios AP1 de la LCR de HPV-18, de Hecho, mediante ensayos decontransfección múltiple adicionado al sistema un plásmido de expresión del gen c-fos (uno de los componentes del complejo proteíco AP1), hemos observado que serecupera la actividad transcripcional basal en esta construcción. Estos resultados per-miten concluir que un mecanismo alternativo que involucra al factor AP1, además dela presencia de sitios E2F en la LCR, es también responsable del efecto represor depRb sobre el promotor P105 de HPV-18.

Revista Biomédica

La expresión de los oncogenes e6/e7 del vph-16 episomal en cáncer cervical es consecuenciade la regulación post-transcripcional del gen E2.

Ordoñez Razo R.M1, Berumen Campos, J1, García Carrancá, A1,2

1 Laboratorio Multidisciplinario de Investigación de la Escuela Militar de Graduados de Sanidad, UDEFA.

2

Instituto de Investigaciones Biomédicas. UNAM, México D.F.

El mecanismo mediante el cual el Virus de Papiloma Humano (VPH) transforma a las célulasepiteliales del cérvix, aún no esta totalmente esclarecido, pero se ha planteado que el paso necesario para laprogresión maligna de las lesiones neoplásicas, intraepiteliales avanzadas (NIC III) a cáncer invasor es laintegración del genoma viral al DNA celular. Principalmente porque al integrarse el virus pierde los genes E1 yE2 provocando con ello la desrepresión de los oncogenes E6 y E7. En las lesiones benignas el DNA viral se haencontrado en forma episomal y en la mayoría de las lesiones malignas y líneas celulares derivadas de carcinomascervicales el virus se encuentra integrado. Sin embargo, se ha observado que alrededor del 64% de los tumorespositivos para VPH16 conservan íntegros los genes E1 y E2 y en la mayoría el virus se encuentra en formaepisomal.

Se analizó el nivel de expresión de los genes E6/E7 y E1/E2 mediante la técnica de RT/PCR, sucorrelación con el nivel de amplificación y status virus (episomal o integrado) en 12 carcinomas con el VPH16episomal y en 7 con el virus integrado.

Los genes E6/E7 se expresaron en el 100% de los carcinomas con el virus episomal y sólo en el71.4 % de los tumores con el virus integrado. Además, el nivel de expresión fue mucho mayor en los episomalesy se correlacionó con el nivel de amplificación viral. Se encontraron 4 transcritos diferentes para los genes E6/E7, uno es el transcrito sin procesamiento post-transcripcional, y los otros 3 con procesamiento post-transcripcional, que corresponde el E6*I, al E6*II y el último aún no reportado, que hemos denominado E6*V.

En ningún caso se encontraron transcritos que diera origen a las proteínas E1 y E2. Sin embargo,el 75% de los tumores con el virus episomal presentaron el transcrito E1Ê4 (nt 880-3357), el cual da origen ala proteína E4. Estos datos indican que la integración del virus no es esencial para impedir la expresión de E6 yE7, y sugieren que la expresión del gen E2 es modulada a nivel post-transcripcional. Además, la presencia deltranscrito E1Ê4 y el mecanismo de “splicing” que lo genera pudiera represar una especie de “switch” pararegular la expresión del gen E2 de acuerdo a factores aún desconocidos. Este hallazgo explica la presencia deformas episomales en una proporción elevada de tumores positivos para VPH16.

Es por lo anterior, que ahora nos hemos propuesto diseñar y realizar un modelo celular in vitropara reproducir el fenómeno de desrepresión de los oncogenes E6 y E7 por efecto de la ausencia de expresiónde E2 debida al “splicing” diferencial.

En resultados preliminares, encontramos que al transfectar células 3T3F4 (que llevan integradola LCR de VPH18 y el gen B-galactosidasa) con plásmidos que lleva el gen E2 bajo el control de un promotorfuerte, se inhibe la expresión del gen B-galactosidasa, y que cuando se transfectan las construcciones quellevan los genes E1 y E2 también bajo un promotor fuerte la inhibición se reduce completamente. Cuando seanalizaron los transcritos obtenidos en estas transfecciones, se encontró que cuando está el gen E2 solo, sí seencuentra el transcrito correspondiente a la proteína E2, en contraste, cuando se encuentran juntos los genesE1 y E2 se presenta el “splicing” E1Ê4 además de dos transcritos que corresponden a la proteína E2. Esto nosindica la existencia de un mecanismo de regulación a nivel post-transcripcional para la proteína E2. Sin embargo,esta expresión diferencial de E2 será analizada en una línea celular procedente de cáncer cervical, la cual nocontenga al VPH16 tal como C33A. Además debido a que el transcrito E1Ê4 ha sido asociado con diferenciacióncelular es necesario analizar lo que ocurre cuando las células se encuentra diferenciadas.

Identificación del procesamiento celular de la oncoproteina e 7 de papilomavirus humano16 en células caski provenientes de cáncer cervical.

Herrera OA., Pedroza, SA., Juárez PL., Valdovinos, TH. y Gutiérrez XL.

Depto. Virus y Cáncer, CISEI-INSP. Cuernavaca Mor.

En la actualidad se tiene datos, tanto epidemiológicos como biológicos que consi-deran a los papilomavirus humanos (HPVs) como los agentes etiológicos más importantes enel desarrollo del cáncer uterino. Se ha reportado que la proteína E7 de los HPVs de alto riesgo(por su progresión a malignidad) se encuentra expresada en la mayoría de los carcinomas cer-vicales positivos para HPV y en líneas celulares derivadas de éstos. La transfección del oncogeneE7 puede inducir transformación morfológica en líneas celulares de ratón e inmortalizarqueratinocitos humanos, además en cooperación con los oncogenes ras y fos, E7 es capaz detransformar células primarias de ratón.

Nosotros hemos estudiado algunas de las características de la proteína E7 deHPV16, tales como su localización celular, fosforilación y procesamiento, así como suinteracción con otras proteínas celulares. El entendimiento del proceso de transformación ce-lular nos permitirá desarrollar métodos terapéuticos dirigidos selectivamente a células trans-formadas por HPV.

Para el desarrollo de estos experimentos fue necesario producir un anticuerpopoliclonal contra la proteína E7, y mediante inmunoensayos se demostró que éste es capaz dereconocer específicamente la proteína E7 de HPV16 en líneas celulares como CaSki, que con-tiene secuencias de DNA de HPV16 exclusivamente. En experimentos de marcado metabólicocon 35S-metionina, encontramos que la proteína E7 tiene una vida media de 6h, y que pormodificaciones postranscripcionales se procesa rápidamente a dos formas de menor pesomolecular de 16 y 15 kDa. A través de fraccionamiento celular, se determinó que E7 se en-cuentra en su mayor parte en la fracción membranal y solo una pequeña proporción de estenúcleo. Esto parece contradictorio ya que una de las funciones de E7, es la de bloquear a laproteína antioncogénica de Retinoblastoma (pRb), la cual se localiza en la fracción nuclear. Esinteresante mencionar que las formas de la proteína E7 que interaccionan con pRb son sólo lade 16 y 15 kDa. Estamos realizando experimentos para determinar cuáles son las diferentesmodificaciones que sufre la proteína durante su procesamiento.

El procesamiento de la proteína E7 de HPV16 se lleva a cabo en 2 etapas, una delas cuales involucra fosforilación y es dependiente de factores de crecimiento. La interaccióndiferencial de E7 con pRB sugiere que sólo una de las 3 formas de E7 es la que se encuentra ensu estado activo.

Caracterización virológica, inmune y molecular de la epidemia de sida en méxico.

Carmen Soler, L. Adalid, P. Alcántara, A. Barquet, MC. Basualdo, G. Cruz, C. Gómez, R.Gómez, J.C. Guñido, F. Martínez, A.Puente, J. Vázquez.

Unidad de Investigación en Retrovirus Humanos, Instituto de Investigaciones Biómedicas,UNAM e Instituto Nacional del Diagnóstico y Referencia Epidemológicos, SSA.

La pandemia de VIH/SIDA se ha convertido en uno de los pro-blemas primordiales de Salud mundial. Actualmente se reportan por la OMSaproximadamente 22 millones de personas en el mundo ya sea infectadaso viviendo con SIDA. Este problema por sus características ha tenido queenfrentarse de una manera multidisciplinaria con la intervención de profe-sionales de muy diversas disciplinas. Una interacción que se ha visto comoindispensable es entre los diversos sectores de Servicios de Salud y loslaboratorios de diagnóstico e Investigación dedicados al problema. Con respecto a la investigación en VIH/SIDA, sobre todo en paí-ses en vías de desarrollo, se ha dado una problemática especial. La infraes-tructura científica en estos países no ha permitido la creación demacrogrupos con los recursos suficientes para abordar coherentemente elproblema, sin embargo, si existe la capacidad mínima de poder caracteri-zar las situaciones concretas que se están presentando en las distintas áreasgeográficas. Bajo estas premisas la UIRH se ha abocado a estudiar y des-cribir las características de la epidemia en nuestro país principalmente enlos aspectos virológicos, inmunes y moleculares.

Los distintos proyectos que se llevan a cabo en la UIRH se en-cuentran interrelacionados entre sí para permitir la respuesta a diversaspreguntas relacionadas tanto a los virus circulares en nuestro país en suscaracterísticas feno y genotípicas que se encuentran relacionadas a su ca-pacidad patogénica y de transmisibilidad, como a la respuesta inmune enel contexto genético y de memoria inmune de la población mexicana.

Otra área del trabajo de la UIRH está relacionada al desarrollo eimplementación de metodología de diagnóstico aplicable en nuestro país ycon una adecuada relación costo-beneficio en su uso.

Genotipificación de aislados mexicanos de VIH-1.

José Carmen Guñido Rosales, Patricia Alcántara García, Ma Fernanda Martínez Salazar y Carmen SolerClaudín.

Unidad de Investigación en Retrovirus Humanos. Instituto de Investigaciones Biomédicas UNAM e Insti-tuto Nacional de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicas SSA.

Introducción. Estudios filogenéticos de las secuencias del genoma de distintas cepas del virus deinmunodeficiencia humana (VIH-1) ha revelado la existencia hasta el momento de 2 grupos principales delvirus; M y O. La gran mayoría de los virus aislados en el mundo pertenecen al grupo M, el cual se hasubdividido en 10 subtipos genéticos del VIH-1 (A-J). Dado que la obtención de una vacuna de amplioespectro, útil contra todas las variantes virales parece ser poco probable de obtener hasta el momento, laestrategia de desarrollar varias vacunas, contra grupos de variantes virales, no puede ser descartada. Estaestrategia solo será posible si se identifican las variantes genéticas circulares en una población en un mo-mento determinado. Por ello nos planteamos el presente estudio que tiene como objetivo identificar elsubtipo genético al cual pertenecen 7 cepas de VIH-1 aisladas en México entre 1989 y 1993.Métodos. El DNA obtenido de cultivos celulares infectados con las distintas cepas virales (MEXA3, MEXP2,MESP4, MEXP42, MEXP42m. y MEXP42p ) se utilizó para la amplificación enzimática de 3 fragmentosde DNA correspondientes al gene env (1.2 kb, 0.7 kb y 0.5 kb de largo). Estos productos de amplificación sesometieron a ensayos de formación de heteroduplex (híbridos de DNA con hebras de diferente origen) conlos productos de amplificación equivalentes obtenidos a partir de plásmidos de referencia de cepas viralesprototipo. Los oligonucleótidos y plásmidos fueron proporcionados por el “NIH” “Reference ReagentsProgram”, mediante el estuche “Heteroduplex Movility Assay”. La presencia de heteroduplex se analizópor electroforesis de DNA en geles de poliacrilamida al 5% teñidos con bromuro de etidio.Resultados Para determinar el subtipo genético al cual pertenece cada cepa viral se midió la distancia quehay entre la parte superior del gel y el punto medio entre las 2 bandas de heteroduplex de mayor migracióny se dividió entre la distancia al punto medio entre las bandas de homoduplex. De esta manera se obtuvo unvalor entre 0 y 1 (índice de similitud), cuya magnitud es directamente proporcional a la homología ensecuencia de DNA entre los virus comparados.Los resultados obtenidos muestran que los 6 aislados estu-diantes pertenecen al subtipo B, lo cual corrobora que el origen de la epidemia en México pertenece alpatrón occidental de transmisión del subtipo B de virus. Sin embargo, encontramos que algunos aisladospresentaron además la formación de bandas de heteroduplex con los virus prototipo C con índices demagnitud equiparable a los índices determinados para los virus prototipo B, lo cual nos sugiere que estosaislados pueden tener similitudes en secuencia compartida con ambos grupos de virus prototipo, particular-mente en las regiones del genoma viral que involucra los fragmentos de 0.5 y 0.7 kb.Conclusiones. Nuestros resultados confirman los datos epidemiológicos que relacionan la epidemia enMéxico a la de los países occidentales. Sin embargo, dada la aparición de cepas virales pertenecientes asubtipos diferentes del B en Centro y Sudamérica y los resultados de índices de alta similitud encontradospara los virus subtipo C hace necesario mantener un monitoreo continuo para determinar la posibleintroducción de otros subtipos virales en la población.

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Detección del primer brote de rotavirus del grupo C en niños con gastroenteritis enMéxico.

García Lozano Herlinda, Rodríguez Castillo Aracelí, Ramírez González J. Ernesto Melo Munguía Mar-tín, Olivera Díaz Hiram.

Laboratorio de Rotavirus del Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (INDRE),Carpio 470, Col, Sto Tomás, México D.F.

Los Rotavirus del Grupo C (RGC) han sido reconocidos como agentes etilógicos de lagastroenteritis aguda. Estudios seroepidemiológicos sobre la prevalencia de anticuerpos y la incidenciade las infecciones por RGC en población humana han revelado que los individuos mayores de 4 añospresentan un mayor riesgo de contraer la infección por estos agentes, en contraste con la infección deRotavirus del Grupo A (RGA), la cuál es más común en niños menores de tres años.

Los RCG son morfológicamente idénticos a los RCA pero genética y antigénicamentediferentes, además de presentar un electroferotipo distinto. Las infecciones por este agente han sidoreportadas en humanos y cerdos con diarrea severa en ciertas regiones geográficas. Existen algunosreportes en la literatura de casos esporádicos y pequeños brotes en Japón, Australia, Brasil; Inglaterra,Reino Unido, Nepal, Tailandia, Canadá y Estados Unidos. Aún cuando los RGC han sido reconocidospor más de una década como agentes productores de gastroenteritis en humana, solo han sido reporta-dos aproximadamente 30 casos en todo el mundo.

En este trabajo reportamos por primera vez un brote de RGC en niños mayores de 6 añoscon gastroenteritis en un orfanato de Santa Rosalía en Baja California Sur en marzo de 1996.

Mediante la técnica de PAGE al 10% se determinó el perfil electroforético de RNA viral ypor ELISA se excluyó a los RGA.

La extracción de RNA viral se realizó a partir de materia fecal con fenol:cloroformo,alcohol:isoamílico y trizol, y se purificó con fibra de celulosa (CF-11). Posteriormente se procedió a latranscripción reversa acoplada a la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) para determinar a losRCG utilizando oligonicleótidos específicos a este grupo. Los productos se verifican en geles de agarosateñido con bromuro de etidio.

De un total de 8 muestras analizadas, 6 presentaron por PAGE un electroferotipo caracte-rístico de RGC, además estas mismas muestras resultaron ser negativas a RGA utilizando el ensayoinmunoenzimático, descartando así la posibilidad de pertenecer a este grupo. Se realizó la técnica de RT-PCR a estas muestras para la confirmación de los RGC y se observó un fragmento de 356 pb correspon-diente a los RGC.

Por otra parte, con esta misma metodología, fue posible determinar la presencia de uncaso esporádico de RGC en un paciente de 9 años de edad con gastroenteritis proveniente del HospitalInfantil de Monterrey durante el mismo período.

Consideramos que la utilización de estas metodologías moleculares (RT-PCR y PAGE)pueden ser de gran ayuda en los estudios de transmisión y epidemiología de los RGC, de los cuales pocose conoce en nuestro país. Este reporte muestra la importancia potencial que representan estos virus unavez detectados en la comunidad y la vigilancia que se debe tener en su búsqueda. Este estudio confirmala distribución mundial que pueden presentar estos agentes virales.

Análisis de la variabilidad genética de la proteína de envoltura de virus dengue (serotipo4) aislados en méxico.

Javier Mota José Ramos & Celso Ramos.

Centro de Investigaciones Sobre enfermedades infecciosas. Instituto Nacional de Salud Pu-blica.

La fiebre del dengue es causada por el virus del mismo nombre,del cual existen cuatro serotipos (Den-1, Den-2, Den-3 y Den-4). Los virusdengue se clasifican dentro de la familia Flaviviridae . El virus dengue conti-núa siendo la causa principal de epidemias en la mayoría de las regiones tro-picales y sub-tropicales del mundo. La caracterización genética de los virusdengue es importante para entender la patología de la enfermedad, los patro-nes epidémicos y el diseño de vacunas y herramientas de diagnóstico. EnMéxico las infecciones causadas por virus dengue (serotipo 4) son importan-tes debido al número de casos que anualmente se asocian con este serotipo,sin embargo, no existen estudios sobre la variabilidad genética de este serotipo.En el presente trabajo se reportan los resultados del estudio de la variabilidaddel gene que codifica para la proteína de envoltura (proteína E ) del virusdengue serotipo 4 aislados en México mediante el análisis de patrones conenzimas de restricción. Se estudiaron virus aislados de pacientes de diferentesaños y en diferentes regiones geográficas de México (Guerrero, Puebla,Yucatán, San Luis Potosí) y de otras regiones del mundo (Dakar, Malasia,China, India, Venezuela y Rep. Dominical ). Los virus se amplificaron encélulas del mosquito (C6/36), se extrajo el RNA total; el RNA viral fue am-plificado por RT-PCR usando oligonucléotidos específicos para el dominio B(400 pb) del gene de la proteína E; los productos amplificados fueron digeri-dos por separado con las enzimas de restricción MaeIII, AluI. DdeI, SacI,CfoI y NlaIII. Los resultados preliminares muestran que los virus aislados enMéxico no presentan diferencias en los patrones de restricción con las 6 enzimasutilizadas, sin embargo, se observaron diferencias con la cepa prototipo aisla-da en Filipinas en 1956 (H-241). Las digestiones de los otros virus están enproceso.

Estudio seroepidemiológico de la infección por el virus norwalk en niños mexicanos.

Velázquez- Castillo FR1. Jiang X2, Galvan ML1, Bustamante ME1, Fernández G3, Tapia-Conyer R3, Torres JI, Muñoz O1.

1. Unidad de Investigación en Enfermedades Infecciosas, H. Pediatría, CMN-Siglo XXI, IMSS2. Center for Pediatric Research, Eastern Virginia Medical School, Va.3. Dirección de Epidemiología, Secretaría de Salud.

INTRODUCCIÓN. El virus Norwalk (VN) se ha asociado con gastroenteritis epidé-mica aguda que rápidamente se disemina a través de familias, instituciones y comuni-dades, afectando a todos los grupos de edad. La participación del VN como posibleagente causal de diarrea en niños de nuestro país se desconoce.OBJETIVO. Determinar la seroprevalencia y característica sociodemográficas de lainfección por VN en niños menores de 10 años de edad de la República Mexicana.MÉTODOS. Estudio transversal, descriptivo y analítico de una muestra seleccionadade manera aleatoria y probabilística de la Encuesta Nacional Seroepidemiológica,realizada en marzo de 1987 a mayo de 1988, que incluyó 2,988 niños menores de 10años representativos de dicho grupo de edad a nivel nacional, Los anticuerpos séricosIgA e IgG específicos contra VN se determinaron por ELISA, empleando antígenorecombinante de la cápside viral expresando en baculovirus. (rVN).RESULTADOS. La prevalencia nacional de anticuerpos contra VN fue de 96%, conuna seroprevalencia de 74% en niños de 1 a 2 años que se incrementó a 98% en los de9 a 10 años de edad (P<0.001). Los títulos séricos de IgA e IgG específica contra VNse incrementaron conforme aumentó la edad (P=0.004 y P<0.001). La infección porVN fue más común en áreas rurales (P=0.003) ocurrió con mayor frecuencia entrefamilias extensas. (P=0.01 ) y hacinadas (P=0.0005) y hacinadas (P=00005), quieneshabitaban viviendas en malas condiciones de saneamiento e higiene (P=0.02 ) y queconvivían en un nivel socioeconómico bajo (P=0.0003).CONCLUSIONES: La infección por VN ocurrió de manera frecuente en niños mexi-canos, desde temprana edad y principalmente durante los tres primeros años, posible-mente continuando con infecciones repetidas que inducen un incremento paulatinodel título de anticuerpos específicos al avanzar la edad. El mejoramiento de las condi-ciones de higiene, saneamiento ambiental y en general del nivel socioeconómicointrafamiliar podrían influir en la prevención de la infección por VN. Se requierenestudios subsecuentes que determinen la morbilidad de la infección por VN y su posi-ble impacto como agente causal de diarrea en niños mexicanos.

Seroprevalencia del virus humano herpes-7 en disponentes de sangre de nueve países.

J.Rojo, GRF. Krueger, Z. Berneman, C.Horwitz, T, Sloots, M. Margalith, JD Conradie, S. Imai, I.Urasinski, M. deBruyere, R. Bonifaz, J. Krueger, DV. Ablashi.

Hospital General de México, Fac. de Medicina, UNAM. Lab. de Inmunopatología, Clínica de la Universidad deColonia, Alemania. Depto. de Patología, Univ. de Tejas, EUA, Depto. de Hematología, Univ. de Amberes, Bélgica,Hospital Abbott Northwestern, Minneapoli, EUA. Virus Research Centre, Brisbane, Australia, Univ. de Ben-GuriónIsrael, Servicio de Transfusión Sanguínea, Durban, Sudáfrica, Centro Univ. de Cáncer Hokkaido, Japón, AcademiaPolaca de Hematología, Szcecin, Polonia, Depto. Hematología de la Univ, Católica de Bruselas, Bélgica.

El HHV-7 es un virus linfotrópico aislado de las células CD4 de individuos sanos. No se ha aislado decélulas no activadas, lo que sugiere su presencia en forma latente. Se ha aislado también de saliva y se sabe que esinmunológicamente distinta al HHV-6 pero puede dar reacción cruzada con éste. Actualmente se investiga su posi-ble participación como causante de enfermedades en humanos y su prevalencia en diferentes regiones geográficas.

El Objetivo del estudio fue el de conocer la prevalencia de HHV-7 en una muestra de poblaciónabierta de nueve países.

Material y Método: se incluyó un mínimo de 200 sueros de disponentes de sangre de cada uno de lossiguientes países Alemania (A) , México (Mex), Bélgica (B), Polonia (P), Israel (Isr), Sudáfrica (SA), Japón (J),Australia (Aus) y EUA. La edad del grupo varió de 16 a 73 años. Además se investigaron 107 y 56 personas sanas deJapón y de Alemania respectivamente con edades de 7 meses a 14 años. Se realizó la serología de rutina en cada unode los Bancos de Sangre para excluir hepatitis B y C, SIDA, Brucella y Sífilis. La determinación de Ac-anti-HHV-7se realizó mediante la prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFA) utilizando las células T-linfobláticas SupT1infectadas con el aislado de HHV-7 de Berneman, cepa JI. Se comprobó infección de las células Supt1 mediante IFAcon sueros positivos conocidos y por hibridación in situ . Se consideró serología positiva cuando los títulos de IgGeran iguales a mayores a 1:40.

Resultados: la positividad de Ac varió entre 98 y 99% en disponentes de sangre de México y Sudáfrica,entre 75 y 85% para Alemania, Bélgica, Israel, Polonia, Australia y EUA y 44% para Japón. De manera similar losvalores medios de títulos de Ac variaron de 74.2 a 101.8 para Alemania, Bélgica, Israel, Polonia, Japón, EUA yAustralia; para México fueron de 148.7 y para Sudáfrica de 271.7 (títulos inversos).

Conclusiones: la positividad de HHV-7 es menor en Japón en comparación con todos los demáspaíses desconociéndose la razón de tal discrepancia, dado que se incluyeron niños (a diferencia de los otros países )e incluso se tomó un valor de corte (cut-0ff) de 1:10 con el mismo sistema de estudio, estos hallazgos coinciden conotros realizados en Japón por Yoshikawa. Los niveles más altos se observaron en México y en Sudáfrica lo cualpodría deberse a estimulación inespecífica de infecciones. Sin embargo al respecto se encontró que la sífilis, lahepatitis B y la brucella no elevaron significativamente los títulos de Ac de HHV-7.

Con su amplia distribución y linfotropismo el HH7-7 es al igual que el HHV-6 y el Virus de EpsteinBarr un candidato potencial de involucración en alteración crónicas que afectan al sistema inmune. El HHV-7 se haaislado de algunos casos de Mononucleosis Infecciosa, puede ser cultivado en linfocitos posterior a estimulacióncelular y además de su potencial patogénico puede reactivar al HHV-6 latente. De acuerdo a estudios realizados en elLaboratorio. de Inmunopatología de Alemania el HHV-7 parece ser menos lítico que el HHV-6 y puede escaparhacia la latencia en células linfoides posterior a replicación transitoria, y las células infectadas inician la proliferaciónotra vez. El HHV-7 parece por lo tanto un candidato ideal que hibernar en poblaciones de células linfoides, por lo quese requiere estudios que investiguen su patogenicidad en el hombre.

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Revista Biomédica

Dilucidación de un mecanismo de recuperación de plantas transformadasgenéticamente con la proteína de 49 kda del virus del jaspeado del tabaco.

Basurto-Ríos. R1, Castro Ruiz, S1, Dougherty, W2 y Silva-Rosales, L1

1Depto. de Ingeniería Genética, CINVESTAV- IPN U. Irapuato Apdo. Postal 629 Irapuato, Gto.36500.México.2Dept. of Microbiology. Oregon State University. Corvallis, OR USA. [email protected]

El virus del jaspeado del tabaco (VJT) es un potyvirus de RNA de cadena sen-cilla positiva, de aproximadamente 10,000 nucleótidos, que es trasmitido mecánicamente ypor áfidos. EL RNA del genoma está unido covalentemente a una proteína codificada por elvirus en su extremo 5’ y tiene una secuencia 3’ poliadenilada. El RNA genómico se expresainicialmente como una poliproteína que se procesa proteolíticamente en nueve productosvirales maduros. La proteína de 49 kDa del VJT es una proteínasa responsable de procesarla mayor parte de la poliproteína producida por el virus durante su ciclo de replicación. Sehan obtenido tantas plantas transgénicas de tabaco con el gen de esta proteínasa viral, lascuales presentan tres clases de fenotipos de resistencia al virus: susceptibilidad, inmunidad yrecuperación.

El fenotipo de recuperación es particularmente interesante ya que consiste enque plantas transgénicas inoculadas con el VJT muestran los síntomas de virosis a los 8-10días posteriores a la inoculación (en forma idéntica a una planta. susceptible ), y aproximada-mente 15 días después de que se ha presentado la infección sistémica, las hojas jóvenesempiezan a aparecer con los síntomas virales disminuidos hasta tener hojas completamentesanas (en forma idéntica a una planta inmune).

Con el objeto de dilucidar los mecanismos por los cuales ocurre este fenómenode recuperación, estamos analizando algunos de los eventos que se llevan a cabo en éstasplantas transgénicas antes. durante y después de ésta respuesta.

Algunos de los resultados iniciales nos indican que los niveles del transcrito de laproteína de 49 kDa en las plantas recuperadas se encuentran disminuidos con respecto aaquellos de plantas no inoculadas, pero no se observa ninguna diferencia en las velocidadesde transcripción. Esto es indicativo de un proceso a nivel post-transcripcional.

Una segunda parte de la estrategia, es buscar alguna diferencia en la expresióngénica mediante el uso de la técnica de despliegue diferencial a partir del RNA. Para elloutilizamos¨ 1) RNA obtenido de plantas de tabaco transformadas que no han sido inoculadascon el VJT; 2) RNA de plantas que están en la etapa de recuperación y 3) RNA a partir deplantas que están completamente recuperadas. Resultados preliminares nos indican que exis-ten diferencias en la expresión de genes en las tres condiciones mencionadas previamente.

Divergencia genotípica de tres cepas de nucleopoliedrovirus aisladas del falso me-didor de la col, Trichoplusia ni.

Ma. Cristina del Rincón-Castro y Jorge E.Ibarra

Departamento de Biotecnología y Bioquímica, CINVESTAV-IPN. Unidad Irapuato Apdo Postal629, CP 36500 Irapuato, Gto.

Se analizaron tres cepas de virus de la poliedrosis nuclear sim-ples, aisladas del falso medidor de la col, Trichoplusia ni (VPNSTn), perode diferente origen geográfico: México (LB1V-4), Canadá (LBIV-8) y Chi-na (LBIV-10). Se compararon entre las cepas, el tamaño de su genoma, lospatrones de fragmentos de restricción generados con las enzimas EcoR1,HindIII y BamH1, el nivel de virulencia de cada una mediante la estimaciónde la CL50, así como la ultraestructura de poliedros y viriones mediantemicroscopía electrónica. Asimismo, se comparó la homología de sus genomasmediante análisis Southern, empleando los genomas completos como son-das. También se analizó el contenido de proteínas de poliedros y viriones; yfinalmente, se probó la especificidad in vitro del hospedero infectando cua-tro líneas celulares de lepidópteros. Los tamaños del genoma para LBIV-4,LBIV-8 y LBIV-10 fueron de 112, 119, y 106 kb, respectivamente. Las trescepas presentaron porcentajes de similitud del 72% entre LBIV-4 y LBIV-8, 46% entre LBIV-4 y LBIV-10 y del 51% entre LBIV-8 y LBIV-10, asicomo índices de divergencia de 1.87, 4.55 y 3.8, respectivamente. La viru-lencia de LBIV-4 (0.39 cpi/mm_) fue 3.5 y 4.9 veces mayor que la de LBIV-8(1.35 cpi/mm_) y LBIV-10 (1.91 cpi/mm_), respectivamente. Asimismo,la virulencia de LBIV-8 fue 1.4 veces mayor que la de LBIV-10. Laultraestructura fue muy similar entre las tres cepas, así como el contenidode proteínas y el análisis Southern de su genoma. Ninguna de las cepas sereplicó en las líneas probadas. Tanto las diferencias presentadas, como lascaracterísticas similares, son argumentos para creer que las tres cepas re-presentan grupos divergentes de virus con un mismo ancestro común.

Estudios de caracterización de la hemaglutinina-neuraminidasa delrubulavirus porcino.

Reyes-Leyva J.1, Espinosa B2. Zenteno R2. González C3 Hernández-Jáuregui P1 y Zenteno E4

1. Laboratorio de Virología, Centro de Investigación Biomédicas de Oriente, IMSS.2. Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, UNAM.3. Unidad de Investigación Médica en Inmunoquímica, IMSS.4. Departamento de. Bioquímica, INER. SS.

La Hemaglutinina-Neuraminidasa (HN) de los Rubulavirus es una glicoproteína(gp) cuya función es la identificación y adherencia a receptores celulares. Este trabajo describelas características de la gpHN del Rubulavirus porcino. El virus fue concentrado por precipita-ción en polietilenglicol 8000 y purificado por centrifugación en gradientes de sacarosa, los virionesfueron lisados mediante sonicación y las gp de la envoltura separadas de la nucleocápside me-diante ultracentrifugación en gradientes de sacarosa. En la fracción 25-30% del gradiente seobtuvo una proteína con actividad hemaglutinante equivalente a 2500 UHA/ml, la cual mostró enelectroforesis en geles de poliacrilamida una banda única con movilidad relativa de 65 kDa. Laglicosilación de esta fracción fue comprobada mediante oxidación con m-peryodato de sodiopara ser conjugada a biotina-L C-hidracida y posterior identificación mediante ELISA en puntocon avidina-peroxidasa. La composición de carbohidratos en las cadenas laterales de esta proteí-na fue determinada bioquímicamente, encontrándose los residuos manosa, galactosa, N-acetilagalactosamina y N-acetiglucosamina con relaciones molares de 3:3:2:1, con trazas de áci-do N-acetilneuramínico, estos carbohidratos correspondieron al 1% del peso molecular de la gp.Además se determinó la composición de aminoácidos y el punto isoeléctrico. Ensayos de compe-tencia mostraron que la función de esta gp es inhibida específicamente con ácido N-acetilneuramínico y su anómero sialil(á2,3)lactosa. Por otra parte, basándose en la secuencia deaninoácidos de un cDNA se realizó el análisis fisicoquímico y la predicción de la estructurasecundaria de la gpHN utilizando 5 algoritmos para estructura secundaria, 3 para característicasfisicoquímicas y 3 para determinantes antigénicos. El promedio de la estructura secundaria fuede 11.7% para alfa helice, 43.3% para hebras beta y 45% para giros y asas; observándose hebrasbeta alternadas con asas e interrumpido este patrón ocasionalmente por estructura alfa helice. Seidentificaron 8 determinantes antigénicos potenciales de los cuales se seleccionaron 2 con lasmejores propiedades fisicoquímicas y estructurales (flexibilidad, exposición al solvente ehidropatía), los cuales correspondieron a las regiones 251-267 y 533-544. Para comprobar laantigenicidad de las regiones definidas como epitopos potenciales se sintetizó un oligonucleotidoque codificara para la región 533-544 de la gpHN para insertarlo dentro del gen de la proteínaOMC de Salmonella typhi, el cual se utilizó como vector para expresar el péptido de interés enuna de las asas de la proteína recombinante y determinar así su importancia en ensayosinmunoenzimáticos.

Proyecto parcialmente financiado por PAPIIT y PADEP, DGAPA, UNAM y CONACYT.

Regiones cromosomicas involucradas en la integración del hpv16 en cán-cer cervical.

Hernández-Ramón E 1,2; Villegas SN1, Salcedo M3, Gariglio P2 y Berumen J1.

1 Laboratorio Multidisciplinario de Investigación, Escuela Militar de Graduados de Sanidad2 Departamento de Genética y Biología Molecular, Centro de Investigación y de EstudiosAvanzados del IPN.3 Unidad de Investigación Médica en Enfermedades Oncológicas, Centro Médico NacionalSiglo XX1.

La integración del genoma viral en el DNA celular ha sido propuestacomo un mecanismo de activación para la progresión de las lesiones preinvasorasavanzadas (CIN III) a cáncer Invasor del cuello uterino. El virus habitualmentese rompe en la región E1/E2, lo que sugiere que esta región juega un papel im-portante en el mecanismo de integración. La mayor frecuencia de integración delHPV18 en relación al HPV16 apoya esta hipótesis y sugiere que podría existirsecuencias parecidas a las de E1/E2 en la DNA celular que facilitarán la integra-ción del virus por un mecanismo de recombinación. El objetivo del proyecto escaracterizar los sitios de integración del HPV en el genoma celular a nivel desecuencia en 5 tumores cervicales positivos para HPV16. El DNA de la líneacelular SiHa (derivada de cáncer cervical y positiva para HPV16) y de los tumo-res T45, T81, G6, G9 y G105, se cortó con la enzima de restricción Hind III, queno tiene sitios blanco en la secuencia del HPV16. Posteriormente se ligaron losfragmentos generados en condiciones que favorecieran la autoligación ocircularización, con el fin de poder amplificar, mediante la reacción en cadena dela polimerasa (PCR), las uniones DNA celular-DNA viral, utilizando “primers”divergentes complementarios a las secuencias virales. Con la técnica de SouthernBlot se comprobó que los fragmentos amplificados incluían parte del genomaviral. La presencia de DNA celular en dichos fragmentos se comprobó por laexistencia de un sitio para Hind III. Finalmente se procedió a la secuenciación deestos fragmentos. Esta estrategia experimental permitió analizar los sitios de inte-gración del virus de una manera más rápida y sencilla que las técnicas habitual-mente utilizadas como librerias genómicas o hibridomas.

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Sobreexpresión de myc en líneas celulares derivadas de CaCu conteniendosecuencia de HPV

M. Salcedo1, A. Aguilar2, A. Hidalgo1, P. Chávez2, C. Arguello2 y P. Gariglio2.

1Hospital de Oncología, CMN-IMSS,2CINVESTAV-IPN, México D.F.

El carcinoma cérvico-uterino (CaCu) es el cáncer ginecológico que sepresenta con mayor frecuencia en los países en desarrollo, provocando más de 500,000muertes de mujeres al año. Estudios epidemiológicos muestran que el papilomavirushumano (HPV), puede ser un agente etiológico del CaCu. Existen HPV de alto ries-go, entre los que podemos mencionar los tipos 16 y 18. Se ha demostrado que lainfección por el HPV no es suficiente para que se lleve a cabo la transformaciónmaligna, por lo que se sugiere que otros factores genéticos (oncogenes celulares )están involucrados en el desarrollo de esta enfermedad.

Nuestro grupo ha encontrado que el oncogén c-myc juega un papel im-portante en el desarrollo del CaCu. Hemos reportado que en algunas lesionesdisplásicas del cérvix existen alteraciones de c-myc y que más del 70% de los CaCupresentan amplificaciones y/o rearreglos de este gen. Asimismo, determinamos quealteraciones del gen c-myc correlacionan con la sobreexpresión de la proteína, Porotro lado, observamos que el 10-20 % de las muestras de CaCu con alteraciones delgen c-myc presentaron secuencias del HPV-16 integradas cerca de esta oncogén(cromosoma 8q24).

Se han reportado sitios de integración del HPV en cormosomas específi-cos (cromosomas 3, 8, 9, 12, 20). Por ejemplo, en las células Caski (500 copias deHPV-16) se encontraron secuencias virales en los cromosomas 8, 12 y 20. En célulasHeLa se detectaron secuencias del HPV-18 (10 copias ) a 30 Kpb del extremo 5’del gen c-myc, encontrándose niveles elevados de transcritos myc, estos datos sugie-ren que la activación de c-myc pudiera ser provocada por integración de las secuen-cias virales. Con la finalidad de conocer los sitios de integración de HPV-16, asícomo la posible sobreexpresión de la proteína c-myc en células Caski en una prime-ra etapa llevamos a cabo la hibridación in situ sobre preparaciones de cromosomasy experimentos de inmunohistoquímica en células cultivadas. Nuestras observacio-nes indican que las células Caski, a pesar de tener un elevado número de copiasvecinas a c-myc, presentan una concentración menor de myc que las células HeLa.

En todo caso, la expresión de myc en HeLa y Caski (HPV +) fue mayorque en células C33 (HPV -).

Interacción in vivo y localización intracelular de las proteínas no estructu-rales, nsp1 y nsp3, de los rotavirus.

R.A. González, M.A. Torres-Vega, S. López y C.F. Arias.

Depto. de Genética y Fisiología Molecular, Instituto de Biotecnología UNAM, Cuernavaca,Mor. 62210.

El ciclo de replicación de los rotavirus se lleva a cabo en el citoplasmade la célula que infectan. El proceso que va de la síntesis de mRNAs virales a laformación de la nucleocápside, involucra la participación de 4 proteínas estructu-rales (VP1, VP2, VP3 y VP6) y cinco proteínas no-estructurales (NSP1,NSP2,NSP3,NSP5 Y NSP6). Mientras que la función de las proteínas estructura-les es relativamente claro, el papel de las proteínas no estructurales se desconoce.Estudios recientes sugieren que estas proteínas podrían estar involucradas en lareplicación y encapsidación del genoma. Un número limitado de interaccionesentre las proteínas no-estructurales y estructurales ha sido encontrado y no se hareportado ninguna interacción entre las proteínas no-estructurales. Por otra parte,a pesar de que la distribución intracelular de cada una de estas proteínas ha sidodescrita, se desconoce si existe colocalización de éstas durante el ciclo dereplicación.

Mediante estudios de inmunofluorescencia, observamos que las pro-teínas NSP1 Y NSP3 presentan una clara codistribución. Asimismo, utilizando elsistema genético de levadura de los “Dos-Híbridos”, hemos obtenido una serie deinteracciones entre las proteínas no-estructurales. De manera particular, los resul-tados indican que existe una interacción entre NSP1, y NSP3. Esta interacción esabatida al deletar, en NSP1, la región que comprende los 270 aminoácidos aminoterminales, o regiones de aminoácidos internas, del residuo 255 al 450 y del 340al 450. De la misma manera la deleción de 38 aminoácidos carboxilo terminalesabate la interacción; sin embargo, la deleción de 6 aminoácidos carboxilo termi-nales, resulta en un incremento en la capacidad de asociación con NSP3. Por otraparte la deleción de los aa 220 a 311 de NSP3 reduce en un 50% la capacidad deasociación con NSP1. Este enfoque deberá permitirnos definir los dominiosinvolucrados en la interacción entre estas proteínas.

Efecto de la persistencia del virus sincitial respiratorio en las propiedadesinmunes de macrófagos.

M.A. Guerrero Plata2 y B. Gómez1.

1Departamento de Microbiología y Parasitología Facultad de Medicina de la UNAM.2 Departamento de Inmunología, Instituto de Investigaciones Biomédicas. Universidad Na-cional Autónoma de México. 04510, México, D.F.

La enfermedad respiratoria aguda causada por el virussincitial respiratorio (RSV) es una infección severa en infantes y enniños pequeños. Los macrófagos son considerados como las principa-les células inmuno-efectoras de las vías respiratorias y están expues-tos al virus durante el curso de la infección. Estudios en infecciónaguda de macrófagos tanto murinos como humanos con RSV in vivoe in vitro han demostrado varias modificaciones en las propiedadesinmunológicas de los macrófagos. Sin embargo el efecto de la pre-sencia y expresión del genoma viral sobre las funciones inmunes delos macrófagos en infecciones persistentes aún no ha sido reportado.Debido a las dificultades de trabajar con sistemas in vivo, decidimosinvestigar en un modelo experimental in vitro de persistencia viral,si la expresión del genoma de RSV en macrófagos altera las funcio-nes inmunes de la célula. El modelo experimental consistió en lacepa Long de RSV y la línea celular murina P388D1 (macrophages-like). Las propiedades inmunes estudiadas fueron: producción decitocinas (TNF-á, IL-6, IL-1 e IL-8) e intermediarios reactivos deloxígeno, fagocitosis (específica e inespecífica) y expresión de recep-tores Fc. Las alteraciones en estas propiedades inmunes fueron com-parativamente determinadas en células con infección aguda y persis-tente por RSV.

Nuestros resultados sugieren que la persistencia viral noconduce a una activación de los macrófagos.

Células th especificas para la proteína interna de rotavirus vp6 potencian larespuesta de anticuerpos neutralizantes.

F. Esquivel, S. López, S. García y C. Arias.

Departamento de Genética y Fisiología Celular, Instituto de Biotecnología/UNAM Cuernavaca,Morelos.

La infección por rotavirus es una de las principales causas degastroenteritis en infantes y un gran número de animales neonatos de importanciaeconómica, tanto en países desarrollados como subdesarrollados. Las proteínas VP4y VP7, que conforman la capa externa del virión, son los blancos de anticuerposneutralizantes, que muy probablemente juegan un papel preponderante en protec-ción y depuración de la infección. Las células Th son esenciales para la prolifera-ción y diferenciación de las células B a través de la secreción de interleucinas. Enotros sistemas virales se ha encontrado que las células Th específicas para las proteí-nas internas de los virus pueden auxiliar a células B específicas para las proteínasexternas por medio del fenómeno llamando “ayuda intermolecular“. De esta manerase quizo ver si las células Th dirigidas contra alguna proteína interna del rotavirus,tal como VP6, podían auxiliar en la producción de anticuerpos neutralizantes. Así,ratones BALB/c fueron inoculados i.p. con un lisado de bacterias que expresan VP6del rotavirus porcino YM fusionado a GST (GST-VP6). Como control, se inocula-ron ratones con el lisado de bacterias que producen GST solo. Después de 15 días,los ratones fueron retados i.p. con un lisado YM. A partir del reto, se obtuvo el suerode los ratones en los 7 y 15 y los niveles de anticuerpos neutralizantes se determina-ron en un ensayo in vitro de reducción de focos de infección. Se encontró que losratones inoculados con GST-VP6 mostraron una respuesta de anticuerposneutralizantes de hasta 8 veces superior a la del control, tanto a los 7 como a los 15días. Este resultado sugiere que las células Th específicas para VP6 expandidas auxi-liaron a las células B específicas para VP4 o VP7 o ambas a producir anticuerposneutralizantes. Resultados similares se encontraron cuando los ratones fueron inocu-lados con un péptido sintético que tiene la secuencia de aminoácidos de la región289-302 de VP6, que representa un epítope de células Th presentado en el contextode la molécula de MHC clase II 1de. Estos resultados tienen implicaciones impor-tantes para el diseño de una vacuna contra la infección por rotavirus.

Revista Biomédica

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Modulación de la expresión de las moléculas del complejo principal de histocompatibilidaden la infección por citomegalovirus humano.

Pedro Sánchez1, Vianney Ortiz2, Rosana Pelayo1

1Departamento de Inmunología Lab. Multidisciplinario de Investigación, Escuela Militar de Graduadosde Sanidad, S.D.N., México.2Unidad de Investigación Médica en Inmunoquímica, Centro Médico Nacional Siglo XX1, IMSS, México.

El citomegalovirus humano (HCMV), el miembro más grande de la familia de losherpesvirus, es un patógeno ubicuo capaz de causar un espectro que va desde el establecimiento de unainfección asintomática (en personas inmunocompetentes) hasta un daño fatal, constituyendo una de lasprincipales causas de morbi-mortalidad en recién nacidos e individuos inmunocomprometidos. Una vezresuelta la primoinfección, el virus tiene la capacidad de permanecer en estado de latencia y reactivarse,particularmente cuando el huésped cae en estado de supresión inmune. Se ha propuesto varios mecanis-mos por los cuales HCMV consigue evadir la respuesta inmune del huésped, incluyendo el ocultamien-to viral, el efecto de inmunosupresión y la desregulación de la expresión de moléculas del complejoprincipal de histocompatibilidad (MHC) sobre la superficie de las células infectadas. Presumiblementeestas estrategias le permiten al virus la prevención del desencadenamiento de las fases efectoras de larespuesta inmune, con lo que es posible la persistencia prolongada en el organismo.

El objetivo del presente trabajo fue investigar el efecto de la infección in vitro por HCMVen la expresión de moléculas clase 1 (MHC-1) y 11 (MHC-11) en la superficie y citoplasma de célulaspermisivas (MRC-5 y U-373 MG) y no permisivas (THP-1 y U-937), comprometidas en la infección invivo.

Las líneas celulares fueron infectadas con HCMV AD-169 a baja (BM1) o muy baja(MBM1) multiplicidad de infección. A tiempos determinados post-infección, se analizó la expresión demoléculas MHC y de la proteína viral 1E-1 por citometría de flujo. A dosis de BM1 el HCMV induceuna disminución progresiva de la expresión de MHC-1 en la superficie de MRC-5 desde 12 h postinfección,siendo a las 72 h del 50% con respecto a las células no infectadas. A dosis MBM1 el efecto a las 12 h fuede incremento molecular (probablemente debido a un efecto “bystander” en células no infectadas),tanto en la superficie como intracelularmente en MRC-5 y U-373, seguido de una desregulación de laexpresión. Por otro lado, en monocitos infectados THP-1 y U-937, en los cuales es posible que ocurra lalatencia y transporte virales, la disminución de MHC-1 se evidencia en superficie y al interior de lascélulas desde 12 h postinfección y un incremento inicial en la densidad de MHC-11, seguido de undecremento pronunciado hasta las 120 h postinfección. Mientras tanto, la expresión de la proteína viral1E-1 muestra un comportamiento similar en todos los sistemas estudiados, alcanzando un pico máximoa las 24 h, seguido de una disminución pronunciada.

Estos resultados demuestran el efecto directo de HCMV, dosis dependiente y desde etapastempranas de infección, en la modulación de la expresión de moléculas de MHC en diferentes estirpescelulares, entre las que se incluyen células potencialmente comprometidas en el fenómeno de estableci-mientos de un estado de latencia viral. Los mecanismos responsables aún deben ser determinados, perolos datos mostrados sugieren que el efecto no es consecuencia de acumulaciones citoplásmicas.

Respuesta linfoproliferativa hacia antígenos del HIV en niños y adultos infectados y no infectadoscon HIV-1.

Martínez Salazar María Fernanda, Soler Claudin Carmen.

Unidad de Investigación en Retrovirus Humanos, Instituto de Investigaciones Biomédicas UNAM. Insti-tuto Nacional de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos.

INTRODUCCIÓN. La historia natural de la infección con HIV esta caracterizada por un daño progresivodel sistema inmune. La defensa del hospedero hacia la infección por HIV-1 involucra la generación decélulas T4 ayudadoras seguido por la generación de células T citotóxicas. Una manera de conocer larespuesta inmune celular que un individuo infectado posee como mecanismo de defensa contra el virus,es a través de la medida de la inducción de la síntesis de DNA después de la exposición de las célulassanguíneas mononucleares periféricas (PBMC) a antígenos virales esto resulta de gran importancia yaque nos asegura que existe una cascada de activación de linfocitos. Sin embargo se han reportado conclu-siones contradictorias en cuanto a la capacidad de linfocitos humanos de personas HIV-1 positivas deproliferar específicamente ante antígenos virales.

La importancia de este proyecto es evaluar las características de la respuesta linfoproliferativaen adultos infectados, además de cuantificar una respuesta inmune celular como medida del posible me-canismo de protección en niños no infectados nacidos de mujeres infectadas.MATERIALES Y MÉTODOS. Se obtuvieron PBMC de adultos y de niños nacidos de mujeres HIV-1positivas, para los ensayo de proliferación celular se utilizaron 1x105 PBMC resuspendidas en medioRPMI 1640 al 10% de SFB se colocaron por triplicado en placas de 96 pozos y se adicionaron los antígenosen tres concentraciones distintas. Los antígenos específicos que se utilizaron fueron: a) virus completoinactivado por calor y obtenido a partir del sobrenadante de la línea celular permanentemente infectada111b-Molt, b) péptido sintético T1 correspondiente a los residuos de aminoácidos 428-443 de la glicoproteínagp120 de la envoltura viral, y fitohemaglutinina (PHA) como control positivo de activación. Se incubó laplaca a 37 ºC en atmósfera húmeda y 5% de CO2 y durante un tiempo de 3 a 5 días; 20 horas antes deltérmino de incubación se adicionó 1 ìCi de timidina tritiada y posteriormente se cosechó y se determina-ron las cuentas por minuto en un contador de centello líquido. Se determinaron los índices de estimulación(S1) de cada uno de los ensayos dividiendo las cpm promedio obtenidas en las PBMC con antígeno entrelas cpm obtenidas de las PBMN sin antígeno.RESULTADOS. Tomando según la literatura un SI >2.0 como indicador de una respuesta linfoproliferativapositiva se obtuvo: para los ensayos en los que se utilizó el virus completo (VC) se encontró respuestapositiva en 66% de las muestras de adultos infectados, mientras que para los ensayos en los que se utilizóel péptido T1 se encontró respuesta en el 57% de las muestras estudiadas. Para adultos no infectados nose encontró respuesta contra el VC, mientras que con el peptido T1 fue de 25%. Se observó una disminu-ción de la respuesta linfoproliferativa ante la PHA en personas adultas infectadas que en personas noinfectadas. No se encontró respuesta linfoproliferativa en ninguna de las muestras de los niños estudia-das.CONCLUSIONES. Los resultados obtenidos sugieren que si existe respuesta inmune celular específicadel HIV en algunas de las nuestras analizadas, además de que existe una capacidad de respuesta proliferativadeficiente ante la presencia de un mitógeno en los individuos infectados. Debido al poco número demuestras con las que se trabajó no es posible todavía sacar resultados concluyentes, es necesario seguirtrabajando con un mayor número de muestras.

Expresión de genes de citocinas en cáncer cérvico uterino con papiloma virus humano.

Juan M. Alcocer-González1, L. Guzmán-Rojas, 1,3,Margarita Bahena3 Cinthya Díaz2, Victor H.Bermudez3, Patricio Gariglio2 y V. Madrid-Marina3

1Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma de Nuevo León, Monterrey, N.L. 2Departa-mento de Genética y Biología Molecular, CINVESTAV, IPN, México, D.F.3Dirección de Virología Molecular, Centro de Investigaciones Sobre Enfermedades Infecciosas InstitutoNacional de Salud Pública. Cuernavaca Morelos.

ANTECEDENTES. Durante el desarrollo del cáncer cervico úterino(CaCu) participan: 1) alteracionesen oncogenes (c-myc, ras), 2) antioncogenes (p53, Rb), 3) Los virus del papiloma humano (HPV) y 4) elestado inmunológico del huésped. Muy importantes es la respuesta inmune celular anti-tumoral, inducidapor citocinas de los linfocitos T CD4+ Th1 e inhibida por los Th2 (inmunosupresión). Los Th1 producen1L-2, IL-12, e INF-ã y los Th2 IL-4, IL-5, IL-10. Existe la posibilidad de manipulación de las subpoblacionesTh1 o Th2 que nos permitirá activar el mecanismo anti-tumoral y reducir el estado de inmunosupresión.OBJETIVO Estudiar el estado de la respuesta inmune celular local en pacientes con CaCu avanzandomediante el análisis de la expresión de citocinas Th1/Th2 y moléculas de superficie de activación de loslinfocitos T infiltrantes.MÉTODOS. Se realizó un estudio comparativo de casos y controles. Se Seleccionaron 20 especímenesde pacientes con CaCu invasivo de células escamosas avanzando, HPV-positivos, sin tratamiento y diezde epitelio cervical normal como controles, HPV-negativos. La presencia del HPV16 en biopsias de CaCuse llevó a cabo por medio de la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR); la tipificación delHPV16 se hizo por medio de un análisis con enzimas de restricción del producto de PCR. La expresióndel RNAm de CD3, CD4, y CD8, de citocinas producidas por los linfocitos Th1 (IL-2, IL-12, INF-ã) Th2(IL-4, IL-10), y citocinas inflamatorias (TNF-á e IL-6) se analizó mediante RT-PCR (Transcriptasa Reversa-Reacción en Cadena de la Polimerasa) inmunohistoquímica y Western blot.RESULTADOS. Todos los tumores HPV-16 positivos presentaron alta expresión de CD8 y una ligeraexpresión de CD4. No se encontró expresión de citocinas Th1 (IL-2, IL-12) ni de citocinas inflamatorias(IL-6 y TNF-á) e INF-ã, se expresa ligeramente en todos los tumores. La expresión de citocinas Th2 (IL-4), y otras como TGH-b se expresan en todos ellos. El 80% de los tumores también expresaron el RNAmde IL-10 además se detectó niveles altos de esta proteína en las células tumorales con alta expresión delRNAm de IL-10, lo que muestra una alta correlación.ANÁLISIS. Nuestros resultados muestran una expresión diferencial de citocinas Th1/ Th2, con preferen-cia en expresión de IL-4, IL-10 y TGF-b, las que ejercen un papel inhibitorio de la inmunidad anti-tumoral.Además, no encontramos expresión de la citocina inflamatoria, TNF-á que también tiene acción anti-tumoral. Todo esto indica un estado de inmunosupresión local en pacientes con CaCu avanzado.CONCLUSIONES. Estos datos sugieren la participación de la respuesta inmune celular local en el desa-rrollo del CaCu inducido por el virus del papiloma humano y nos ayudarán a establecer mejores estrate-gias de inmunoterapia en CaCu avanzado, que eliminen el componente Th2 (inmunosupresión), permi-tiendo activar la respuesta de Th1 y por lo tanto aumentar la actividad anti-tumoral de los macrófagos,células asesinas naturales y linfocitos T citotóxicos CD8+. Este tipo de tratamiento ayudará al sistemainmune a generar una respuesta más eficiente para impedir el desarrollo del CaCu.

Multiplicación y persistencia del virus herpes simple tipo 1 en macrófagos.

J.Bustos1,2 y B. Gómez2.

1Depto Atención a la Salud, UAM-Xochimilco, México D.F. 04960.2Depto. de Microbiología. Fac. Medicina. UNAM, México D.F. 04510.

Se estudió la infección del virus Herpes Simple Tipo 1(HSV-1) cepa MP, en una línea de células similares a macrófagos(línea celular P388D1). Cuando el HSV-1 se replicó en las célulasP388D1, estas resultaron ser moderadamente permisivas en com-paración con las células Vero que son permisivas al virus. El efec-to citopático que se observó en los macrófagos fue la formación desincitios.

Se estableció una infección persistente utilizando bajasmultiplicidades de infección y sin ayuda de agentes externos. Lainfección se mantuvo por más de 160 días subcultivando las célu-las cada 2 ó 3 días. La infección persistente se caracterizó por unpatrón cíclico de daño celular acompañado de influaciones en laproducción de virus extracelular. Se detectaron antígenos viralespor pruebas inmunoquímicas en 1 a 15% de las células. El porcen-taje de células que liberaron virus infeccioso estaba en un rango de<1 al 12.5%. Las células persistentes fueron resistentes a lareinfección con el virus original a una alta multiplicidad de infec-ción.

Virus aislados durante la infección persistente presenta-ron cambios fenotípicos respecto al virus original en relación altamaño y morfología de la placa y el patrón electroforético de lasproteínas en células infectadas.


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Propiedades biológicas de aislados de HIV-1

Basualdo M.C. Gómez, R. y Soler, C.

Unida de Investigación en Retrovirus Humanos UNAM/SSA.

Objetivo: Determinar si los parámetros biológicos, tales como el fenotipo dado por la habilidad paraformar sincicios en PBMC y MT2, el patrón de replicación en líneas celulares, la capacidad de replicación delvirus en cultivo primario y la carga viral del paciente mediada por la rapidez con que se detecta el virus encultivo, tiene relación con el estado clínico del paciente, la edad o la transmisión del virus en la etapa perinatal.

Metodología: 1. Se aislaron por cocultivo los virus usando una proporción 1:3 de células sanguíneasmononucleares periféricas (PBMC) de pacientes y PBMC de donadores.

2. Se realizó observación microscópica tres veces por semana, una vez por semana antígeno ensobrenadante (Ag en SN) y se llevó record del tiempo de aparición de sincicios en PBMC, tiempo para tener elprimer dato positivo de Ag en SN que dependerá de la carga viral del paciente y del tiempo para que la D.O. dela determinación de Ag en SN sea 1 o mayor, lo cual es un indicador de la capacidad replicativa del virus.

3. Una vez que se tuvieron 2 determinaciones positivas de Ag en SN se hicieron dos pases en PMBCinfectando la primera vez 1 ml de sobrenadante y cuando el cultivo fue positivo se cuantificó al Ag en SN y serealizó la segunda infección con 1 ng de Ag por millón de PBMC. Se usaron 6 millones de PBMC no infectados.

En todo el proceso se hicieron observaciones para detectar la formación de sincicios.4. En el día 7 a 10 de infección de PBMC se determinó antígeno y si la D.O. fue mayor de 2 se procedió

a infectar por cocultivo 3x106 células de las líneas U937, CEM, MT2 y Sup T1 con 1x10

6 PBMC. Se considera

que hay crecimiento viral cuando al menos hay 3 determinaciones de antígeno positivas. (La primera determi-nación se hace 7 días de la infección.) tres veces a la semana se observaron los cultivos para detectar formaciónde sincicios.muerte celular y formación de células en globo.

Resultados: Se realizó fenotipificación de 19 aislados: 5 niños entre 4 y 16 meses, 4 niños entre 2 y 6años, 6 mujeres, dos no transmisoras y 4 transmisoras de infección a sus bebes, 2 seropositivos con caracterís-ticas de pacientes no progresores y 2 seropositivos progresores normales.

Entre los bebes el tiempo para obtener el primer antígeno positivo esta entre 5 y 16 días lo cual habla decargas virales altas en todos ellos. Así mismo la capacidad de multiplicación es alta en todos los casos exceptouno que ha recibido AZT los 7 meses anteriores al aislamiento. Este bebé es el único asintomático.

El tiempo para obtener el 1er antígeno positivo va de 5 a 16 días. Los fenotipos observados en PBMCson NS1 excepto uno que cambia de S1 a NS1. Los patrones de replicación en líneas celulares indican 2 altos/rápido y 3 bajos/lentos 2 ó 3.

De las 6 mujeres estudiadas, 2 son no transmisoras y coinciden que tomaron tratamiento durante elembarazo y continúan con él. Todos los valores de antígeno fueron altos desde el primer momento de ladetección en cultivo primario. Los fenotipos fueron NS1 en 5 de ellas y 1 que presenta cambio de NS1 a S1.

Todos forman sincicios en MT2 y se clasifican 3 como altos/rápidos y 3 bajos/lentos.De las 3 parejas madre-hijo estudiadas se observaron idénticas características en los aislados de cada

pareja salvo que el aislado de P283M induce sincicios en MT2.Los datos obtenidos de los 2 pacientes no progresores y los 2 progresores normales indican que independientemente

de sus cuentas de CD4 y su estado clínico se aislaron virus S1 con patrones de replicación altos/rápidos o bajos/lentos 3 yque el tiempo necesario para obtener el primer antígeno positivo y valores de DO superiores de 1 son menores de 10 días.

La conclusión que se puede obtener de los resultados obtenidos es que los parámetros biológicos son independientesdel estado clínico de los pacientes, aunque la capacidad de multiplicación es menor en los pacientes sometidos a tratamientocon antiretrovirales y en las dos mujeres tratadas durante el embarazo no se presentó la trasmisión del virus al bebé.

Cambios de la expresión del genoma del virus sincitial respirato-ria en una infección persistente

RE, Sarmiento, R. Tirado y B. Gómez.

Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Medicina, Universidad Autóno-ma de México. 04510 México, D.F. MÉXICO.

Bajo ciertas condiciones de infección, virus citolíticos soncapaces de establecer infecciones persistentes no citolíticas en líneascelulares. La transición normal de infección citolítica a persistente invivo e in vitro ha sido reportada para diversos virus de DNA asícomo de RNA. En cultivos persistentemente infectados y subcultivadospor períodos prolongados se ha observado una continua expresión deantígenos virales, replicación del genoma viral y producción de virusextracelular. En este estudio se reporta el establecimiento de una in-fección persistente en la línea celular similar a macrófagos (P388D1)con un virus de RNA de naturaleza citolítica, el Virus Sincitial Res-piratorio (RSV). La infección persistente se estableció a una multi-plicidad de infección de 1 y bajo estas condiciones el 80% de lascélulas sobrevivió, las cuales se han subcultivado en promedio dosveces por semana. La persistencia del genoma viral en el cultivo per-sistente se confirmó por RT-PCR, la expresión del genoma porinmunoblot, la presencia de antígenos virales por inmunocitoquímicay la producción de virus extracelular por titulación de la infectividad(TCID50 ML). Nuestros resultados indican que el virus sincitial res-piratorio puede persistir en una línea celular similar a macrófagos deorigen murino contrariamente a estudios que reportan infecciónabortiva en macrófagos alveolares murinos y encontramos que exis-ten cambios en la expresión del genoma en los cultivos persistentesvs infección aguda.

Permeabilización de células ma-104 a toxinas mediada por rotavirus.

Mariela A. Cuadras, Carlos F. Arias y Susana López

Departamento de Genética y Fisiología Molecular, Instituto de Biotecnología UNAM.Cuernavaca Morelos. México.

Los rotavirus son el principal agente de gastroenteritis viral en hu-manos y animales. La partícula viral madura esta formada por tres capasconcéntricas de proteínas un genóma de 11 segmentos de RNA de doble cade-na.

El conocimiento del mecanismo de penetración de los rotavirus asu célula huésped es muy limitado, se sabe que las proteínas de capa externaVP4 y VP7 son indispensables para que ocurra la penetración; y que es depen-diente de la activación proteolítica por tripsina. Existen evidencias que propo-nen que rotavirus cortados con tripsina penetran rápidamente por la vía directay son infecciosos; mientras que los virus no activados entran por endocitosis yno conducen a una infección productiva. Sin embargo aún no es claro cual esel mecanismo por el cual los rotavirus llegan al citoplasma celular. Una alter-nativa para el estudió de este mecanismo es estudiar la coentrada de toxinas yotras macromoléculas al interior de la célula; se ha observado en otros siste-mas virales que la interacción del virus con su receptor induce unapermeabilización temprana, permitiendo con ello la coentrada de toxinas yplásmidos.

En este trabajo se estudió la permeabilización de distintas líneascelulares a ásarcina mediada por la penetración del rotavirus RRV. Los resul-tados muestran que la coentrada de ásarcina depende de la entrada del virus yel grado de permeabilización está en función de la multiplicidad de infecciónutilizada y de la activación del virus con tripsina. Asimismo, de tres líneascelulares que se probaron, la coentrada de ásarcina correlaciona con la permi-sividad de las células a la infección por rotavirus. También encontramos que lacoentrada es inhibida por anticuerpos anti-rotavirus que bloquean la adsorcióny penetración del virus a su célula. En conjunto los resultados sugieren que lapermeabilización de células MA104 a ásarcina, correlaciona con lasuceptibilidad de la célula a ser infectada por el rotavirus.

Infection of neuroblastoma cells by dengue -2 virus and itsbinding to 65 kda cellular protein.

Ramos Imbert P.J.L1, C.J.J.C1., Barron. R.B. L3 and Ramos, G. C2

1Departamento de Bioquímica y Genética Microbiana, C.I.C.M., Benemérita UniversidadAutónoma de Puebla, A.P. 1622, Puebla México.2Departamento de Arovirus, Centro de Investigaciones Sobre Enfermedades Infecciosas,I.N.S.P., Cuernavaca, Morelos, México3Laboratorio de Virología, Departamento de Microbiología, E. N. C. B., I. P. N, México.

Dengue 2 virus was studied in neuroblastoma cellsfrom murine (NIE-115) and human (SK- N-SH) origin. Cellswere differentiated by Me2SO treatment and viral infectiondetected by inmunofluorescence. It was found that dengue vi-rus infection was highly dependent on cell differentiation, sinceMe2SO treated murine cells showed 100% of infection incontrast with 26% of untreated culturales. Similar results wereobtained with the human cells. However Me2SO treated oruntreated cells, showed by a virus overlay protein blot assay(VOPBA), a cellular protein of approximately 65 kDa whichwas recognized by dengue virus type 2. A similar protein wasalso found with known permissive cells such as, P388D1 andLLC-MK2 and absent in NIE-115 cells digested with trypsinand chicken fibroblast. These results suggest that Me2SOinfluences neuron cells permissiveness for virus infection.

Revista Biomédica

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Análisis funcional de los genes E2 de variantes de HPV

Miriam C. Guido, Marcela Lizano1,2, Olga Medina1, Jaime Berumen3 y Alejandro García.Carrancá1,2

1Depto Biología Molecular, Biomédicas- UNAM2 Unidad de Oncología Molecular, INCan, SS.3Lab. Multidisciplinario de Investigación. Escuela Militar de Graduados de Sanidad, EMM.México, D.F.

En la actualidad los Virus del Papiloma Humano (HPV) forman unafamilia de más de 70 miembros. Algunos tipos virales, como los HPV-16 y 18,constituyen el principal factor en el desarrollo del Cáncer Cérvico Uterino (CaCu)ya que en la mayoría de los tumores se encuentran secuencias virales activas y sugenoma contiene dos oncogenes, E6 y E7, capaces de inmortalizar células huma-nas. El genoma contiene además, dos genes cuyos productos participan en el con-trol de la replicación y la transcripción viral; E1 y E2. Los genes E2 se encuentranmuy conservados y codifican proteínas que se unen específicamente al DNA me-diante dominios localizados en el extremo carboxilo-terminal. Los dímeros de laproteína E2 se unen al DNA viral en la región que controla la transcripción de losoncogenes E6 y E7 y, en el caso de los HPV-16 y 18, reprimen su expresión. A lafecha se han descrito diversas variantes moleculares de los HPV-16 y 18. En estetrabajo se pretende analizar la funcionalidad de los genes E2 de algunas variantesdetectadas en tumores de la población mexicana. Los genes E2 de variantes deHPV-16 y 18 se clonaron en vectores de expresión para analizar su función enensayos de transfección en células en cultivo. Además, los genes se clonaron envectores apropiados para ser usados en sistemas acoplados de transcripción-tra-ducción, en lisados de reticulocitos, y posteriormente evaluar la actividad de uniónal DNA de sus productos en geles de retardo con sondas apropiadas. Los resulta-dos preliminares muestran que la proteína. E2 de la variante del HPV-16 se une alDNA con menor afinidad que la proteína silvestre. De la misma manera, los ensa-yos de expresión en células co-transfectadas con el gen E2, silvestre o mutado, yun vector que contiene el promotor viral arriba del gen reportero CAT, muestranque la proteína proveniente del gen E2 “variante” no reprime la transcripción dela misma manera que lo hacen los productos de los genes silvestres.

Identificación de mutaciones que afectan la neuro-virulencia en el virus del dengue.

Irma Sánchez, Blanca Ruiz.Depto. Biología Molecular, Instituto de Investigaciones Biomédicas. U.N.A.M.

El dengue es un virus de RNA de cadena sencilla de 11 kb que codifica para unprecursor poliproteínico ( 3386 a.a.) que por cambios postraduccionales genera 3 proteínas estructu-rales y 7 no estructurales ( 5’ C-prM-M-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5 3’). La proteínaE tiene 495 a.a. y es responsable de las principales funciones biológicas del virus como son: enlaceal receptor, fusión a membrana, presenta los determinantes antigénicos de neutralización,hemaglutinación y fijación de complemento, y tiene un papel importante en la patogenicidad delvirus, definiendo el tropismo celular y/o afectando la penetración viral.

Recientemente se han reportado varios trabajos sobre el análisis de secuencias entrecepas paraenterales y vacunales de fiebre amarilla, encefalítis japonesa y encefalítis del Valle deMurray, donde se asocia la variabilidad genómica con una reducción en la patogenicidad, sin embar-go, no se han podido determinar cambios específicos sobre la proteína E asociados con la virulenciade la cepa.

Nosotros hemos aislado 11 clonas de la cepa de dengue-2 mexicano, de acuerdo a sucapacidad de generar placas líticas grandes (D2ML1, D2ML2, D2ML3), medianas (D2MM1, D2MM2,D2MM3 y D2MM4) y pequeñas (D2MS1, D2MS2, D2MS3 y D2MS4). Posteriormente se purificó elRNA de cada una de ellas y se formaron heterohíbridos RNA:RNA con una ribosonda específica(obtenida por transcripción in vitro) que comprende de todo el gen que codifica para la proteína E.Los heterohíbridos formados se dirigieron con RNasaA y los fragmentos generados, se analizaronpor electroforésis en UREA-PAGE al 6%, observando que existe una variación a nivel genómicoentre las clonas. Al mismo tiempo se determinó la capacidad virulenta de cada una de las clonas enun modelo de encefalítis murino. Se observó que existe una relación directa entre la variacióngenómica y la capacidad de virulencia de las clonas. También observamos que el fenotipo de la clonacorrelaciona con la virulencia, con excepción de la clona D2MS3, que presenta un fenotipo de placalítica pequeña, tiene una variación genómica y una virulencia parecida a una clona que produce unaplaca lítica grande.

Posteriormente se llevo a cabo la secuenciación de las clonas con el fin de conocercual es el cambio responsable del incremento o disminución en la virulencia. Al hacer el análisis desimilitud de secuencia entre ellas, observamos un cambio importante en el dominio III de la proteínaE, en el aminoácido 390 de Asp a His en las clonas que son altamente virulentas (D2;L1, D2ML2,D2ML3). Este cambio cae dentro de la región like-inmunoglobulina, que se piensa que es la regiónresponsable de la fusión a membrana dependiente de pH ácido. Al llevarse a cabo el análisis desecuencia entre los favivirus que producen encefalítis se observó que todos presentan una His enésta posición. Sin embargo en cambio las clonas que producen una placa lítica pequeña, poco viru-lentas, presenta en éste sitio el cambio de Asp por Asn, que es un aminoácido presente en la cepavacunal M3 de Malasia (Den-2). Por lo cual podemos concluir que el cambio en la posición 390 esimportante en la capacidad de producir encefalítis en dengue.

Rotavirus como causa de morbilidad y mortalidad por diarrea en niños mexicanos.

Gómez a1, velázquez-castillo fr1, fierro h2, lugo a2, torres fj1, muñoz o1.

1Unidad de Investigación en Enfermedades Infecciosas, H. Pediatría, CMN-Siglo XX1, IMSS.2Departamento de Análisis e Integración de la Información, IMSS.

INTRODUCCIÓN: Diversos estudios epidemiológicos han demostrado que la diarreagrave asociada a rotavirus (RV) ocurre en México con mayor frecuencia entre niños me-nores de un año de edad y durante la temporada de otoño-invierno (septiembre a febre-ro).OBJETIVO: Realizar una estimación nacional de la magnitud de la morbilidad y mortali-dad por diarrea asociada a RV en niños menores de 5 años de edad.MÉTODOS: Las hospitalizaciones debidas a diarrea en niños menores de 5 años de edadfueron obtenidas del sistema nacional de registro del Instituto Mexicano del Seguro Social(IMSS) durante el período de 1990-1994. La información de egresos y muertes ocurridasen 259 hospitales fue recopilada especificando que dentro de los 3 principales diagnósti-cos se incluyera algún tipo de enfermedad diarreica. La edad y estacionalidad característi-ca de la diarrea asociada a RV fueron usados como marcadores epidemiológicos paraconsiderar las hospitalizaciones y muertes por diarrea que pudiesen haberse asociado aRV.RESULTADOS: En general las hospitalizaciones debidas a diarrea disminuyeron de 16%en 1990 a 8% en 1994 (P<0.001). Esta disminución ocurrió principalmente durante latemporada de primavera-verano, (marzo a agosto), ocurriendo un exceso paulatino dehospitalizaciones por diarrea durante la temporada de otoño e invierno, sobre todo enniños menores de un año. La mortalidad asociada a diarrea también disminuyó de 1.6%en 1990 a 0.4 % en 1994 (P<0.001), ocurriendo un exceso progresivo de muertes debi-das a diarrea durante la temporada de otoño-invierno. que también ocurrió en niños me-nores de un año. Los picos de hospitalización por diarrea durante la temporada de otoño-invierno, se iniciaron en septiembre-octubre en el noroeste del país, moviéndose hacia elcentro en noviembre-diciembre, hacia el sur en diciembre-enero y terminan en enero-febrero en el sureste.CONCLUSIONES: El decremento global en la morbilidad y mortalidad debida a diarreasugiere un mejoramiento del saneamiento ambiental y refleja el impacto de la terapia derehidratación oral. Un patrón estacional cambiante en la epidemiología de las enfermeda-des diarreicas ocurrió con una disminución de la morbi-mortalidad durante la temporadade primavera-verano, e incremento paulatino durante la temporada de otoño-invierno, locual aunado a un patrón de migración de los brotes de otoño-invierno del oeste al este delpaís, sugiere la participación de RV.

¿Cuál es la diversidad de la proteína vp4 de rotavirus de humano con la quedebería contender una vacuna?

L. Padilla-Noriega, M. Méndez Toss, G. Menchaca, J.F. Contreras, P. Romero Guido, S. López,C. Arias.

Grupo Mexicano para el Estudio de Infecciones Gastrointestinales, Depto. de Genética y Fi-siología Molecular, Instituto de Biotecnología UNAM, Cuernavaca, Morelos 62210.

Los rotavirus de humano (RVH) presentan dos proteínas en sucápside externa, VP4 y VP7, y ambas son capaces de inducir anticuerposneutralizantes por lo que la especificidad serotípica de los RVHs es dual.Así, son cuatro los serotipos de VP7 epidemiológicamente importantes(G1 a G4), mientras que para VP4 son relevantes dos subtipos (A y B)del serotipo P1, y en menor medida un subtipo (A) del serotipo P2, Asi-mismo, se ha observado que los serotipos P1A, PIB, y P2A correspon-den a los tipos genómicos P-gen 8, P-gen 4, P-gen 6, respectivamente,determinados por PCR.

Nosotros hemos utilizado un ensayo inmonuoenzimático conun panel de anticuerpos monoclonales neutralizantes anti-VP4 para es-tudiar la estructura antigénica de VP4 de rotavirus de humano proceden-te de varias poblaciones de México, y hemos determinado también el tipogenómico de VP4 en un subgrupo de las muestras analizadas. Nuestrosresultados coinciden con los de otros autores en que los principales tiposgenómicos de VP4 son P-gen 8, P-gen 4 y P-gen 6. Asimismo, observa-mos que las proteínas VP4 de cepas del mismo tipo genómico sonantigénicamente heterogéneas, ya que presentan diversas combinacio-nes de epítopes de neutralización, y algunos de estos epítopes son com-partidos entre cepas pertenecientes a tipos genómicos diferentes. Quedapor determinar la relevancia de las distintas variedades antigénicas obser-vadas dentro del mismo tipo genómico en relación al nivel de proteccióncruzada que sean capaces de inducir.


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Anticuerpos séricos IgA específicos adquiridos naturalmente como un marcador deprotecciones en contra de la infección y diarrea por rotavirus.

Velázquez-castillo fr1, calva jj2, matson do3, estes mk4, pickering lk3, ruiz-palacios gm2.

1UIMEIP H. Pediatría, CMN SXX1, México.2Infectología, Instituto Nacional de la Nutrición, México.3Eastern Virginia Medical School, VA, USA.4Baylor College of Medicine, TX; USA.

INTRODUCCIÓN: Los rotavirus humanos del grupo A (RV) son la causa principalde diarrea grave en niños. Es necesario conocer como se adquiere la inmunidad natu-ral e identificar marcadores que indiquen el nivel de protección alcanzado en contrade la infección y diarrea por RV para así desarrollar estrategias de prevención ade-cuadas.OBJETIVO: Evaluar la asociación de anticuerpos séricos IgA e IgG anti-RV adquiri-dos naturalmente con protección en contra de la infección y diarrea asociada a RV.MÉTODOS: Una cohorte de 200 niños fue seguida desde el nacimiento hasta los dosaños de edad mediante visitas domiciliarias semanales Muestran de heces colectadasen cada visita y durante los episodios diarreicos fueron probadas para RV medianteensayo inmuno enzimático (EIA). La gravedad de la diarrea fue calificada por unmédico. Sueros colectados durante la primer semana de edad y cada cuatro mesesfueron titulados para anticuerpos IgA e IgG anti-RV mediante EIA.RESULTADOS: Un total de 316 infecciones por RV fueron detectadas, 56% porexcreción y 77% por seroconversión, Los niños con un título de IgA >1:800 tuvieronun menor riesgo de infección y diarrea (riesgo relativo ajustado, RRa, 0.22 y 0.14) yfueron completamente protegidos en contra de diarrea moderada-grave asociada aRV, comparando con niños con título de IgA _1:800. Los niños con un título de IgG>1:3,200 tuvieron un menor riesgo de infección, diarrea y diarrea moderada-graveasociada a RV (RRa, 0.46, 0.44 y 0.65, respectivamente), comparando con niños contítulos de IgG _1:3,200. Un título de IgA >1:800 fue obtenido a la edad de 18 mesesy después de dos infecciones naturales por RV, sin importar que estas infeccionesfueran sintomáticas ó asintomáticas.CONCLUSIONES: Los anticuerpos IgA anti RV en suero fueron un mejor marcadorde protección en contra de la infección y diarrea asociada. a RV. Dos infecciones porRV consecutivas, sintomáticas ó asintomáticas, fueron necesarias para alcanzar untítulo de IgA >1:800, el cual se asoció con protección completa en contra de diarreamoderada grave asociada a RV.

Obtención de la proteína E. Recombinante del virus dengue (serotipo 2) y su uso en ladetección de anticuerpos contra el virus dengue.

José Ramos-Castañeda1, Raymunda Figueroa1, Ricardo Rosales2 y Celso Ramos1

1Depto de Arbovirus CISEI/INSP.2Depto de Biología Molecular, IIB/UNAM.

La fiebre por dengue (FD) y la Fiebre Hemorrágica por Dengue/Síndrome de Choquepor Dengue (FHD/SCD) son producidas por cualquiera de los cuatro serotipos del virus dengue (VD)el cual pertenece a la familia Flaviviridae . El humano adquiere el virus a través de la picadura delmosquito Aedes aegypti; se estima que la incidencia anual de FD es de alrededor de 10 millones decasos y de varios miles de casos de FHD/SCD; este último cuadro ha provocado aproximadamente30,000 defunciones desde mediados de los años 50’s. La FD y su cuadro grave se consideran comoenfermedades emergentes y priotitarias, por ello la detección oportuna de casos de FD es una medidaimportante en el control de la enfermedad. Sin embargo, la ausencia de métodos serológicos de diag-nóstico específicos y sencillos impide en cierta medida el reconocimiento oportuno de casos. El pre-sente trabajo pretende contribuir al mejoramiento de la vigilancia epidemiológica de esta enfermedadmediante la generación de un ensayo de ELISA para la detección de anticuerpos contra el VD utilizan-do como antígeno proteínas recombinantes. El VD es un virus envuelto cuyo genoma está contituídopor una cadena sencilla de RNA de polaridad positiva de aproximadamente 11 kb de longitud; en elextremo 5’ del genoma se encuentran las regiones que codifican para las tres proteínas estructuralesque forman el virión, de éstas clonamos a la proteína de envoltura (E) en la cual residen la mayoría delas funciones biológicas y determinantes antigénicos. Inicialmente trabajamos con el vector de expre-sión inducible por choque térmico pTT15, proporcionado por el Dr. R. Padmanabhan (U. Kansas, USA).Este vector tiene clonado, bajo el control del promotor derecho del fago lambda, una región de 1340nucleótidos del gene de la proteína E de VD serotipo 2 (NGC); este segmento codifica para una proteí-na truncada de 21 aminoácidos del extremo amino terminal, sin que ello afecte su inmunogenicidadtipo específica. Se obtuvo una fracción enriquecida con la proteína viral recombinante por precipita-ción con sulfato de amonio del extracto proteínico de bacterias sometidas a choque térmico y seestandarizó un ensayo de ELISA para detectar anticuerpos contra la proteína en suero de pacientes condiagnóstico presuntivo de FD o con serología positiva para IgM o IgG contra el VD. Los resultadospreliminares sugieren que el sistema de ELISA que diseñamos podría presentar varias ventajas, porejemplo: es muy simple ya que solo se acopla el antígeno a la placa y, en principio se podría detectarIgM o IgG específica, además se utiliza una dilución de trabajo del suero mayor que la del ensayo decaptura por lo que, en principio, esta prueba podría ser más sensible. No obstante lo anterior, el sistemausado todavía presenta varios problemas de inespecificidad debido a las proteínas de la bacteria dondese presenta el plásmido y que coprecipitan con la proteína viral recombinante. Actualmente, estamosprobando diferentes sistemas que permiten la purificación de la proteína recombinante en un solo pasopara lo cual clonamos la proteína E en el plásmido pET-14b mediante PCR; con esta construcción setransformaron bacterias BL21 y se indujo la expresión de la proteína E con IPTG. Estamos en el proce-so de aislar la proteína para utilizarla en el sistema de ELISA antes descrito.

Una nueva variante del virus del papiloma humano tipo 16 encontrada en la pobla-ción mexicana, se asocia con un alto nivel de replicación viral y un comportamien-to clínico agresivo.

Leonora Casas A1, Pilar Figueroa1, Alejandro García2, Marcela Lizano2, Miriam Guido1 yJaime Berumen1.

1Laboratorio Multidisciplinario de Investigación, Escuela Militar de Graduados Sanidad Uni-versidad del Ejército y Fuerza Aérea,2Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM.

El virus del papiloma humano (HPV) es un factor determinante en el cáncerde cérvix. Tipificando carcinomas positivos para HPV por “Southern blot” con BamH1 yPst1, encontramos diferencias en el patrón de restricción (RFLP) en carcinomas positivospara el HPV16. Se determinó que las diferencias en el tamaño de las bandas son produci-das por un par de mutaciones puntuales que causan la pérdida de un sitio para Pst1 y laganancia de un sitio nuevo para la misma enzima en la región 3’ del gen E2. Este patrónde restricción se presentó en el 24% de los casos de cáncer invasor positivos para HPV16,lo cual sugiere que no se trata de mutaciones adquiridas al azar durante el desarrollo de lalesión. Al analizar la edad de las pacientes, encontramos que aquellas que presentan HPV16con patrón “Variante” fueron, en promedio, 10 años más jóvenes que aquellas que pre-sentan el HPV16 con el patrón prototipo (42.6_2.6 años y 52.6_2.1 años, respectivamen-te). La mayoría de estos tumores (73%), presentan más de 50 copias/célula. Con base enlos datos anteriores, se ponen de manifiesto diferencias importantes entre el virus quepresenta un patrón de restricción, “variante”, por lo cual se investigó si existían más dife-rencias en el genoma de éste. Hasta la fecha se han secuenciado las regiones E2, E6, E7 yLCR de esta variante, encontrándose un total de 51 mutaciones (que representan el 1.8%del DNA secuenciado), de las cuales 24 están en el gen E2, 6 en el gen E6, 3 en gen E7 y18 en la región de control. Un total de 17 mutaciones producen modificación en la estruc-tura primaria de la proteína E2, 3 en la proteína E4, 4 en la proteína E6 y ninguna en laproteína E7. Actualmente se está secuenciado el gen E1. Las mutaciones encontradas enE2 pudieran estar directamente relacionadas con el nivel de amplificación viral de estavariante y reflejar una selección en favor de un alto nivel de replicación. La asociación deesta variante con pacientes más jóvenes que las que presentan el prototipo, sugiere que setrata de una variedad, más oncogénica y este hecho puede estar relacionado con las muta-ciones tanto en E2 que es un regulador transcripcional, como en E6 que es un oncogenviral y en la región de control o LCR, que contiene sitios de unión de factores reguladorestanto en celulares como virales.

Variantes moleculares de papilomavirus humanos tipo 16M 18 y 45 en tumores delcuello uterino, en méxico.

Marcela Lizano, Miriam Guido, Jaime Berumen y Alejandro García Carracá.

Unidad de Oncología Molecular, Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM.Instituto Nacional de Cancerología, SS.Escuela Militar de Graduados de Sanidad, EMM. México, D.F.

El cáncer cérvico uterino (CaCu) representa aún la primera causa de morta-lidad por neoplasias entre las mujeres mexicanas. La participación de los virus delpapiloma humano (HPV) es determinar en el desarrollo de estas neoplasias, pues ac-tualmente sabemos que es más del 90% de todos estos tumores se encuentran secuen-cias virales activas, principalmente en los tipos 16, 18, 31, 33 y 45. Estudios recientesen distintas partes del mundo han demostrado la existencia de variantes moleculares delos HPV-16 y 18 y esto ha permitido establecer patrones de dispersión durante la evo-lución viral, que se considera tan antigua como la del hombre mismo. De esta manera,se han identificado cinco diferentes ramas filogenéticas para el HPV-16, y se ha podidoestablecer que la diversidad viral se asocia con la etnicidad de las poblaciones. En estetrabajo se buscaron secuencias virales en tumores de la población mexicana y se obser-vó la presencia de variantes de los tipos 16, 18 y 45 en ellos. En los tumores positivospara el HPV-16, se encontró una variante en más de la mitad de los casos, que parece-ría tener un comportamiento más agresivo que el prototipo, dado que está presente entumores de mujeres más jóvenes. En los tumores positivos para el HPV-18, se encon-traron en cerca de la cuarta parte de las muestras, dos variantes moleculares que apa-rentemente presentan un comportamiento biológico diferente. Una de ellas, aparente-mente menos agresiva, solo se encontró en tumores de origen escamoso, que tiene unmejor pronóstico que tumores de otros orígenes. En contraste, en tumores de origenneuroendócrino, que presentan una conducta sumamente agresiva, solo se encontró alHPV-18 prototipo, lo que refuerza la idea de un comportamiento diferente para estasvariantes. Finalmente todas las muestras positivas para el HPV-45 mostraron la presen-cia de una variante molecular, aún no reportada en la literatura, y sorprendentementecorrespondieron exclusivamente a tumores de origen adenoescamoso. El hecho de quealgunas de estas variantes, se encontraron claramente asociadas con determinadas va-riedades histólogicas de tumores del cuello uterino, sugiere que ellas participan de ma-nera importante ya sea en el desarrollo, o comportamiento específico, de ciertos tiposhistológicos de CaCu.

Revista Biomédica

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Búsqueda de nuevas alternativas terapéuticas para las infecciones herpéticas.

Esther Ramírez, Hernández Armida, Gabriel Betanzos y Blanca L. Barrón.

Esc. Nacional de Ciencias Biológicas, Lab. de Virología, IPN, Carpio y Plan de Ayala S/N Casco de SantoTomás México D.F. 11340.

Debido a que las infecciones virales son un problema importante de salud humana, reciente-mente se ha retomado el estudio de las plantas medicinales y diversos productos naturales para la búsquedade nuevos agentes terapeúticos. En este trabajo se evaluó la eficacia antiviral de varios productos de origennatural en modelos in vitro como en modelos in vivo y se presentan los resultados de tres grupos deproductos.

De una primera selección de plantas en base a la información recolectada por el InstitutoNacional Indigenista, se escogieron varias plantas, cuya actividad antiviral in vitro se determinó para HSV-1 y HSV-2. Entre ellas se encontró que la albahaca (Ocimum basilcum) tenía actividad, por lo cual seprocedió a su estudio en la infección zosteriforme murina inducida con virus herpes simplex (HSV) tipo 1 y2. Se administró oralmente 8 h antes y cada 12 h después de la inoculación viral, en dosis de 300 mg/Kgdurante 8 a 12 días. La administración de la albahaca en los animales infectados con HSV-2 produjo unamejoría leve, sin embargo cuando esta infusión se administró en animales infectados con HSV-1 se logróreducir la tasa de mortalidad a 0% en comparación con el 20 % observada en animales no tratados; laslesiones no progresaron a su forma severa y no se encontró virus en el cerebro de los animales tratados.

Otro producto natural que en los últimos años ha recibido gran atención en Spirulina maxima,que es una cianobacteria en la cual de un 60-70% de su peso seco es proteína, también se ha demostrado queno es teratogénica, tiene un efecto hipocolesterolémico y algunas otras propiedades farmacológicas, por loque decidimos determinar la actividad antiviral de un extracto acuoso de esta cianobacteria (EA). Para ello,las células MA104 fueron tratadas con concentraciones desde 0.08 mg/ml hasta 50 mg/ml del EA, y se lesadicionó una suspensión conteniendo 1000 DICT50/ml de HSV-1 o HSV-2. Se encontró que la concentra-ción mínima citotóxica del 50% (ID50) del EA fue de 22.59 mg/ml; y la concentración mínima protectora al50% (ED50) del EA para las células infectadas con HSV-1 fue de 0.94 mg/ml, y para las células infectadascon HSV-2 fue de 0.6 mg/ml. Podemos concluir que la concentración del extracto acuoso de Spirulinamaxima que protege al 50% de las células MA104 contra HSV-1 o HSV-2 es 25 y 45 veces respectivamentemás pequeña que la que produce citotoxicidad.

En estudios previos se ha demostrado que la combinación ácido ascórbico-Cu++ causa unefecto letal sobre los bacteriófagos, sin embargo se desconoce si tiene el mismo efecto sobre virus de orga-nismos superiores. El objetivo de este trabajo fue investigar el efecto del ácido ascórbico-Cu++ sobre lainfectividad de los HSV-1 y HSV-2, en células de pulmón embrionario de cobayo (PC), para ello una sus-pensión de HSV-1 conteniendo 105.7 DICT50/ ml y de HSV-2 con 106.6 DICT50/ml fueron tratadas conconcentraciones de 2, 5, 10, 15 y 20 mM de ácido ascórbico manteniendo constante la concentración deCu++ (1mM). Las concentraciones de 15 y 20 mM de ácido ascórbico con 1mM de Cu++, provocaron lainactivación de HSV-1, mientras que concentraciones de 2.0 mM de ácido ascórbico y 1mM de Cu++,fueron suficientes para inactivar a HSV-2. Cuando los virus se trataron con ácido ascórbico o Cu++, demanera aislada, a las mismas concentraciones anteriores, éstas fueron inocuas para ambos virus. Estos resul-tados comprueban el efecto letal biológico del ácido ascórbico en presencia de metales de transición comopreviamente fue reportado para otros virus.

¿La nucleocáspide del virus de la rabia promueve el crecimiento de los ratones?.

Adriana Elvia Mata-Villegas1, Agustín Montaño-García2 y Juan Antonio Montaño-Hirose1

1Departamento de Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina Veterinaria yZootecnia. UNAM. 2Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Ixtapalapa

El virus de la rabia está constituido por dos unidades estructurales y fun-cionales: nucleocáspide y envoltura. Durante mucho tiempo, la presencia de lanucleocápside fue considerada cono sinónimo de poca calidad en las vacunas antirrábicas,hasta que en 1992 Lafon demostró que poseía propiedades superantigénicas en el hu-mano y en el ratón, no descritas anteriormente.

En 1993, al inocular ratones lactantes de la línea C57 BL/6 para un trabajode investigación sobre las propiedades superantigénicas de la nuclecáspide del virus dela rabia, uno de los autores (Montaño-Hirose) observó consistentemente un aumentoen el tamaño y peso de los ratones inoculados en relación a los ratones controles (datosno publicados). Esto contrasta con los trabajos publicados hasta la fecha sobre el sín-drome de desgaste (wasting-syndrome) de la rabia.

En efecto, la pérdida de peso es una medida de la virulencia de las cepas devirus rábico. En un trabajo publicado por Wiktor en 1985, una figura muestra que lascepas virulentas causan una dramática pérdida de peso corporal en los ratones, hastadel 40%. Sin embargo, en la misma figura se puede observar que los animales inocula-dos con cepas avirulentas tiene un aumento de peso de aproximadamente 10% en unintervalo de 4 días, aumento que no fue comentado en el texto por los autores.

Como parte de un estudio para demostrar que el virus de la rabia provocaun aumento del crecimiento cuando no produce la enfermedad y el consecuente síndro-me de desgaste, y que este aumento se debe a la nucleocápside, se inocularon variascamadas de ratones con vacuna antirrábica tipo Fuenzalida. Esta vacuna es producida apartir de ratones inoculados con el virus de la rabia. Los cerebros son cosechados cuan-do los animales se encuentran enfermos, y macerados para extraer el virus. Este méto-do de extracción viral destruye las células y trae como consecuencia un elevado títulode nucleocápside en la vacuna.

Los resultados muestran diferencias significativas (p<0.05) entre los ani-males inoculados con el vacuna antirrábica tipo Fuerzalida y el grupo control inoculadocon PBS. Para poder atribuir estos resultados a la nucleocápside, es necesario inocularlos ratones con nucleocápside purificada a partir del virus rábico obtenido de cultivoscelulares.

Eliminación de substancias inhibidoras presentes en materia fecal para la detec-ción de rotavirus por RT-PCR.

Araceli Rodríguez-Castillo y Herlinda García Lozano.

Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencias Epidemiológicas, INDRE, Laboratorio deRotavirus. México, D.F.

Los rotavirus son los agentes etiológicos más importantes de la diarrea severaen niños menores de tres años de edad en ciudades desarrolladas y en desarrollo.

Debido a que estos agentes virales presentan grandes dificultades para culti-varlos, in vitro a partir de muestras clínicas, las infecciones por rotavirus son generalmen-te identificadas por métodos inmunoenzimáticos que determinan de manera directa elantígeno rotaviral en muestras diarreicas. Sin embargo, aproximadamente del 20 al 30%de las cepas de rotavirus no son tipificadas, como consecuencia de que las partículasvirales estén incompletas o bien existan variaciones de epítopes.

El objetivo de este trabajo fue desarrollar un método rápido y sencillo para lapurificación del RNA viral a partir de materia fecal y la eliminación de aquellas substan-cias inhibidoras en la misma, que pueden inhibir la actividad enzimática en la reacción dela cadena de la polimerasa acoplada a la transcríptasa reversa (RT-PCR).

A partir de la muestra clínica, se realizó la extracción de RNA viral confenol:cloroformo. La purificación y eliminación de inhibidores fue removida con fibra decelulosa (CF-11), durante 24 horas a 4ºC en constante rotación y lavados sucesivos consolución reguladora de sodio-tris base-EDTA (STE) y se eluyó en agua con dietilpirocarbonato (HDPC). La presencia del genoma viral fue verificado en geles depoliacrilamida al 5% teñidos con nitrato de plata y la cuantificación se determinó en unespectrofotómetro a 260 nm. Posteriormente, se realizó la técnica de RT-PCR conoligonucleótidos específicos de grupos y serotipos.

De un total de 50 muestras diarreicas purificadas con CF-11, 47 (94%) fueposible determinar el grupo en la primera amplificación y en la segunda a serotipos derotavirus, sólo en 3 casos no fue posible su identificación.

La utilización de CF-11 permitió obtener más del 90% de pureza del genomaviral y la eliminación completa de proteínas.

Consideramos que la purificación del RNA viral por CF-11, previa a la reac-ción de amplificación con transcriptasa reversa y taq-polimerasa es determinante paraaumentar la sensibilidad en reacciones de amplificación de ácidos nucléicos e identifica-ción de rotavirus a partir de muestras clínicas y como herramienta de laboratorio para elanálisis de estudios de epidemiología molecular (tipificación a VP7 y VP4 por RT.PCR).

Desarrollo del método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detec-ción del virus sincicial respiratorio en muestras de pulmón de niños fallecidos por neu-monía o bronquiolitis.

Bustamante-Calvillo ME1, Velázquez-Castillo FR1, Peña-Arguelles AL1, Enciso-Moreno JA2,Cabrera-Muñoz ML2, Gómez Delgado A2, Torres-López J1, Muñoz Hernández O1.

1Unidad de Investigación Médica en Enfermedades Infecciosas y Parasitarias.2Hospital de Pediatría, C.M.N. Siglo XX1, México D.F.

ANTECEDENTES. El virus sincicial respiratorio (VSR) es el principal agente causal de infec-ciones graves de las vías respiratorias que conducen a neumonía o bronquiolitis en niños meno-res de dos años de edad. La información que existe, indica que es causa importante de muerte,considerándose necesario conocer con qué frecuencia la infección por éste virus se asocia aletalidad en niños hospitalizados con estos padecimientos.OBJETIVO. Desarrollar y aplicar el método de la reacción en cadena de la polimerasa para laidentificación del VSR a partir de muestras de pulmón incluidas en parafina.MATERIAL Y MÉTODOS. Para la validación de la PCR se cultivaron células VERO quefueron infectadas por VSR (control positivo) y no infectadas (control negativo). La presenciadel VSR en los cultivos fue verificada mediante efecto citopático característico del virus y porinmunofluorescencia directa. Ambos tipos de controles fueron no incluidos e incluidos en para-fina. Los controles positivos (P) y negativos (N) no incluidos en parafina se trataron directa-mente con trizol® (Gibco) para favorecer la lisis celular y extracción del ARN total. Los contro-les celulares (P y N) incluidos en parafina, fueron previamente desprendidos con tripsina. Laextracción del ARN total se realizó a partir de cortes de 10ì de espesor, habiéndose probadocinco métodos diferentes de desparafinación. Del RNA total obtenido a partir de controles po-sitivos y negativos de las células VERO incluidas o no en parafina, se realizó la trascripciónreversa obteniéndose ADNc, el cual, se empleó en la PCR usando oligucleótidos específicosque codifican para la glicoproteína F de éste virus, así como, un segundo PCR para confirmar laregión amplificada previamente.RESULTADOS. De los cinco métodos de desparafinación empleados, solamente con ladesparafinación y trizol® (Gibco) se pudo obtener ARN total. Del ADNc obtenido y amplifica-do en la PCR 1 y posteriormente con la PCR 2, se observaron bandas características del VSR de390 pb y de 207 pb respectivamente, en geles de agarosa al 1.5% y teñidos con bromuro deetidio. Estas mismas bandas fueron observadas con los controles P no incluidos en parafina.CONCLUSIÓN. El método de la PCR desarrollado en este estudio, ya puede ser empleado parala búsqueda de VSR en especímenes de pulmón incluidos en parafina, lo cual nos permitirádeterminar la frecuencia de la letalidad por neumonía o bronquiolitis en niños menores de 2años hospitalizados con estos padecimientos.


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Mapeo de epitopos en p24 que reconocen 15 anticuerpos monoclonales y desarrollo deun elisa en sandwich para captura del HIV.

Adalid Laura1, Soler Carmen1, Ziola Barry2.

1Unidad de Investigación en Retrovirus Humanos, INDRE/UNAM.2Departamento de Microbiología, Universidad de Saskatchewan Canadá.

INTRODUCCIÓN: La detección cuantitativa de antígenos virales de HIV emplean-do un ELISA de captura, es un método ampliamente utilizado para estudios de historia natural dela infección y para la detección del virus en sobrenadantes de cultivos, ya sea para aislamiento opara ensayos de neutralización. Existen ELISAs comerciales para detección de p24 (proteína denucleocápside) o de todas las proteínas virales. Sin embargo, el costo de estos ensayos es elevado.Ante la disponibilidad de 15 hibridomas obtenidos por inoculación de ratones con virus, p24 seprocedió a su caracterización y al posterior desarrollo de un ELISA, de captura para p24.

MATERIALES Y MÉTODOS. se procedió a obtener (líquido ascítico), concentrar(precipitación con sulfato de amonio) y marcar (peroxidasa) los 15 anticuerpos monoclonales.Paralelamente se obtuvieron anticuerpos policlonales contra virus completo en ratón y en conejo.Se empleó un ensayo de competencia para determinar no efecto, competencia o cooperatividadentre pares de anticuerpos. Finalmente se estandarizaron las condiciones para el ELISA en sand-wich, probándose combinaciones de diversos anticuerpos para captura y detección de p24, eva-luándose la capacidad de detección del ensayo desarrollando.

RESULTADOS: los resultados obtenidos con el ELISA de competencia nos permiteestablecer que los 15 anticuerpos monoclonales se diferencian en 8 grupos, cuatro de ellos estánformados por más de un anticuerpo y de acuerdo a los resultados podría pensarse que cada gruporepresenta la reactividad en un epítopo diferente, los miembros de un mismo grupo podrían estarreaccionando con sitios superpuestos o parciales de epítopo,

En el desarrollo del ELISA se determinó que 2 ìg por pozo es la concentraciónóptima de anticuerpos para captura del antígeno p24, posteriormente se evaluó la capacidad decaptura al emplear combinaciones de anticuerpos y finalmente se estableció en 1:5,000 la concen-tración óptima de anticuerpos para la detección del complejo antígeno anticuerpo formado.

Bajo las condiciones establecidas se encontró que los mejores anticuerposmonoclonales para captura de la p24 recombinante fueron dos anticuerpos denominados 3A y 5Cy para detección los anticuerpos monoclonales marcados con peroxidasa: 6 y 2B. El ELISA desa-rrollando presentó un límite de detección para p24 recombinante de 100 pg/ml.

CONCLUSIONES: Se dispone de un panel de anticuerpos monoclonales que reco-nocen 8 epítopos diferentes de la p24. Estos anticuerpos tienen características de cooperatividad(sinergismo) en su unión a la proteína mencionada y pueden ser empleados en un ELISA paradetección de antígenos. Se obtuvo un ELISA en sandwich que es capaz de detectar el antígenop24 recombinante con un límite de 100 pg/ml (el comercial tiene mayor sensibilidad). La capaci-dad de detección de proteínas nativas del virus en fluidos biológicos (plasma, sobrenadantes decultivo viral) se encuentra en proceso.

Sistema olfatorio vía de ingreso del rubulavirus porcino al sistema nervioso central. II. Dis-tribución y papel de los ácidos siálicos.

Reyes-Leyva J1, Sánchez ME1, Santos G2, Hernández-Jáuregui P1, Zenteno E3

1Lab de Virología y Patología, Centro de Investigación Biomédica de Oriente, IMSS. 2DeptoBioquímica Fac. de Medicina UNAM. 3Dept. Bioquímica. INER, SS.

El Rubulavirus porcino produce un complejo de alteraciones neurológicas en cerdoslactantes, las cuales no se manifiestan en cerdos adultos. La búsqueda secuencial del antígeno viralen los cerdos lactantes infectados experimentalmente, ha permitido demostrar el ingreso de rubulavirusal SNC siguiendo las vías de conducción del estímulo olfatorio. Nuestro grupo ha demostrado que laexpresión de moléculas sialilo2,3lactosa en la superficie de células PK15, es indispensable para quese realice el proceso de infección con el rubulavirus porcino. En este trabajo determinamos la distri-bución de moléculas sacarídicas, en especial sialilo2,3lactosa, en el SNC de cerdos sanos con elobjeto de reconocer su papel en la susceptibilidad a la infección viral. 3 grupos de cerdos fueronutilizados de acuerdo a las siguientes edades: a) 3 días, b) machos de 3 meses c) hembras de 11meses. Muestras tisulares conservadas en congelación fueron analizadas mediante fluorescenciautilizando diversas lectinas acopladas a biotina y reveladas con conjugados avidina-fluoresceína.Las siguientes lectínas, cuya especificidad se muestra entre paréntesis, fueron utilizadas: Limuluspolyphemus (ácido N-acetilneuramínico); Maackia amurensis (sialilo2,3galactosa); Sambucusnigra (sialilo2,6galactosa); Machrobrachium rosenbergii (9-0-aceltineuramínico); Arachishypogaea (galactosa N-acetilgalactosamina), Concanavalina-A (manosa). Los resultados mostra-ron que hay una gran expresión de ácido siálico (N-acetilneuramínico y sus glicósidos unidos enenlaces a 2,3 y a 2,6 a galactosa) en los cerdos neonatos, los cuales se distribuyen ampliamente enlos lóbulos de la corteza cerebral, en los componentes del sistema conductor del estímulo olfatorio:bulbo y tracto olfatorio, corteza del lóbulo piriforme y hasta Ammon; en el tálamo y en menorcantidad en el hipotámalo, cerebelo; reduciéndose aún más en los cuerpos piramidales, puente deVarolio y médula oblonga. En la corteza cerebral, sistema olfatorio y tálamo se observó una mayorexpresión de sialilo2,3galactosa que de sialilo2,.6, lo cual se invirtió en las otras estructuras anató-micas sializadas, sobretodo en el cerebelo. En los cerdos de 3 y 11 meses la expresión de ácidossiálicos se reduce en forma importante en la corteza cerebral, tracto olfatorio, lóbulo piriforme ehipotálamo. Es de notar que la expresión de sialilo2,3lactosa en el bulbo y tracto olfatorio es nula enestos animales. El análisis de los resultados obtenidos en este trabajo en conjunto con los obtenidosen infecciones experimentales en cerdos de las mismas edades permite concluir que las moléculassialilo2,3lactosa son importantes para determinar la suceptibilidad de una porción del SNC a lainfección por el rubulavirus porcino. En los lechones el virus ingresa a el SNC utilizando las víasnerviosas olfatorias abundantes en sialilo2,3lactosa, mientras que en el adulto la falta de este azúcaren el bulbo olfatorio evita el ingreso del virus al SNC.Proyecto parcialmente financiado por PAPIIT y PADEP, DGAPA, UNAM, y CONACYT.

Participación del virus del dengue en el desarrollo del proceso hemorrágico.

Monroy M. Verónica y Ruiz O. Blanca.

Departamento de Biología Molecular del Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM.

El dengue es una virosis ocasionada por el virus del misno nombre, el cualpertenece a la familia flaviviridae y comprende cuatro serotipos diferentes (1,2,3 y 4). Laenfermedad es de amplio espectro, puede manifestarse desde la forma leve conocida comoDengue Clásico hasta las formas graves como el Síndrome de choque por dengue y/oFiebre Hemorrágica por dengue (SCD/FHD). Estas últimas se han asociado con la pre-sencia de una infección secundaria, favoreciendo la facilitación mediada por anticuerposcontra un serotipo diferente, que da como resultado la activación del macrófago (célulablanco), el cual a su vez activa sistemas tales como el complemento, fibrinolisis y/o coa-gulación; sin embargo, se han reportado casos de infección primaria (en la cual no existenanticuerpos previos) y dengue hemorrágico, estos se han asociado a la variabilidad genéticaque sufren las cepas mientras circulan en la naturaleza. Basados en lo anterior, nosotrosnos propusimos estudiar la posible participación del virus del dengue en el desarrollo delproceso hemorrágico, mediante la activación de la fibrínolisis.

Con base al planteamiento anterior se desarrolló en el laboratorio un modeloin vitro que nos permitiera evaluar tanto la activación de plasminógeno [PLG (Zimógenode la plasmina)] por medio de un producto cromogénico, así como su acción sobre fibrinay/o el fibronógeno. Así mismo, estudiamos el proceso anterior en presencia de un inhibidorespecífico de la plasmina llamado a-2-antiplasmina, con el objeto de observar posiblesdiferencias en la regulación de la activación del PLG entre aislados hemorrágicos y clási-cos del virus del dengue.

Observamos que el virus del dengue es capaz de activar el plasminógeno aplasmina independientemente de la cepa. La plasmina generada fue activa, degradandotanto a la fibrina como al fibrinógeno. A llevar a cabo nuestros ensayos con el inhibidor(a-2 antiplasmina), la cepa hemorrágica presentó mayor afinidad por el PLG puesto queel zimógeno continuó activándose, lo que no ocurrió con la cepa de dengue clásico, loanterior sucedió tanto en presencia de fibrina como de fibrinógeno descartando la posibi-lidad de que la fibrina estuviese inhibiendo la acción de la a-2-antiplasmina.

El virus del dengue es capaz de activar el proceso fibrinolítico alterando elproceso de la regulación del mismo de manera diferencial en un aislado clásico y/ohemorrágico, siendo un fenómeno importante en el establecimiento del procesohemorrágico. Nuestros resultados aportan una alternativa para explicar el caso de las ma-nifestaciones hemorrágicas en el curso de una primoinfección, en la que no existe la pre-sencia de anticuerpos preformados contra un serotipo diferente o contra otro flavivirus.

Expresión de interleucinas en el cerebro de ratones infectados experimen-talmente con el virus dengue.

Gilma Sánchez1, Rogelio Hernández2 y Celso Ramos1

1Centro de Investigación Sobre enfermedades Infecciosas, Instituto Nacional de Salud Públi-ca, Cuernavaca Mor., México.2Departamento de Patología Instituto Nacional de la Nutrición, México, D.F.

En el ratón lactante la infección experimental con el virus dengue cau-sa alteraciones neurológicas que se caracterizan por incordinación motora, paráli-sis de las extremidades posteriores y en la mayoría de los casos la muerte. El virusdengue se replica en las células del sistema retículo endotelial (macrófagos), ade-más en el ratón las principales células susceptibles son las neuronas y posible-mente también los macrófagos residentes del cerebro (microglía). Nuestro grupoha demostrado que la infección in vitro de macrófagos induce la expresión delfactor de necrosis tumoral (TNF-á) y de interleucina 1 alfa (IL-1á). En variasinfecciones virales que afectan al sistema nervioso central (SNC) se ha sugeridoque las interleucinas (ILs) participan como mediadores de las alteracionesneuropatológicas. El objetivo de este trabajo fue el de estudiar la participación delas ILs en la patogénesis del SNC en ratones infectados experimentalmente con elvirus dengue. Se inocularon ratones Balb/c de 2-3 días de edad por víaintraperitoneal con el virus dengue serotipo 2 (NGC). Se obtuvo el RNA total delcerebro de ratones (día 7) con el reactivo TriPure siguiendo las indicaciones delprovedor y se determinó la expresión de los RNAm para IL-1á, IL-6 y TNF-á porRT-PCR empleando “primers” específicos. Los resultados preliminares revelaronque la infección induce la expresión de los RNAm para IL-1á y TNF-á en el cere-bro de los ratones inoculados. Está pendiente la determinación de la expresión delRNAm para IL-6. Las tinciones histológicas e inmunohistoquímicas de cortes decerebro de ratones infectados muestran necrosis de algunas regiones del cerebroacompañada de nódulos gliales, desmielinización y escaso infiltrado de célulasinflamatorias; estas alteraciones patológicas correlacionan con las áreas de locali-zación del virus y de IL-1á. Estos resultaron sugieren que la patogénesis de lainfección experimental por el virus dengue puede ser mediada por la infeccióndirecta de las neuronas y además por los efectos de las ILs producidas por lascélulas residentes del SNC.

Revista Biomédica

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Tropismo de poliovirus mediado por la región no traducida 5’

Ana Lorena Gutiérrez Escolano y Rosa Ma. del Angel

Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN

Poliovirus, el agente causal de la poliomielitis es capaz de infectar de manera naturalsolamente al humano, aunque también puede infectar a algunos primates cuando el virus se inocu-la directamente en el Sistema Nervioso Central (SNC). Este tropismo de poliovirus se encuentradeterminado principalmente por la presencia de una molécula de superficie que funciona como elreceptor (PVR) (Mendelshon, C. y Racaniello, V. R. 1989), ya que se ha observado que introdu-ciendo el gene de PVR de humanos en ratones transgénicos (TgPVR) estos se vuelven sensibles ala infección (Ren, R. y Cols 1990. Ren, R. y Recanierllo, V. R. 1992). Sin embargo, a pesar deque el PVR se expresa en la mayoría de los tejidos, la infección se restringe a pocos de ellos,como a las neuronas del cerebro y espina dorsal, músculo esquelético y tejido adiposo pardo(Racaneillo, V. R. y Ren, R., 1994). Estos resultados indican que al menos en este modelo animal,el tropismo de tejido no se encuentra gobernado exclusivamente por la expresión del gene delPVR (Ren, R. y Racaniello, V. R., 1992 ).

Hasta la fecha se desconoce la naturaleza del bloqueo interno de la infección depoliovirus en tejidos de ratón TgPVR y en la mayoría de las líneas celulares en las que la replicaciónviral difiere dependiendo del estadio de diferenciación y del linaje celular (Okada, Y, y Cols,1987). Existe evidencia de que la regulación puede ocurrir durante la síntesis de las proteínasvirales, debido posiblemente a una variación en la accesibilidad de algunos de los factores celula-res que participan en la traducción viral (Nobis, P. y Cols, 1985. Pelletier, J, y Cols, 1988. LópezGuerrero, J. A. y cols, 1989. Gamarnik, A. y Andino, R. 1996).

Basándonos en estos antecedentes decidimos analizar la capacidad de interacciónde ciertas proteínas provenientes de tejidos de ratón TgPVR permisivos y no permisivos a lainfección por poliovirus y la RNT 5’ de poliovirus.

Los tejidos permisivos escogidos fueron el cerebro, el músculo y extractos de célu-las de riñón cultivadas, in vitro que son permisivas a la infección por poliovirus, y los no permisivosel riñón y el timo.

Nuestros resultados mostraron una correlación entre la unión de una proteína de 97kDa a la RNT 5’ y la permisividad a la infección por poliovirus. La suceptibilidad adquirida de lascélulas de riñón cultivadas in vitro también coorrelacionó con la presencia de una proteínaentrecruzada de 97 kDa. La interacción de la proteína de 97 kDa proveniente de células HeLa y decerebro de ratón y la RNT 5’ de poliovirus fue específica y estable. Hasta la fecha no sabemos cuales el papel de la proteína de 97 kDa en la traducción de poliovirus, sin embargo Hunt, S. y cols, en1996 reportaron la presencia de una proteína de 97 kDa en una fracción proteica indispensablepara que la traducción de rinovirus se lleve a cabo. La creación de anticuerpos anti-p97 será degran utilidad para tratar de establecer la importancia de esta proteína en la traducción de poliovirus.

Expresión de la proteína E2 de papilomavirus humanos como marcador de progresióna cáncer-cervicouterino.

Jorge Alejandre 1, Leticia Rocha, 1, Fernando Cruz-Talonia 2 y Alejandro garcía-Carrancá2.

1 Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM. 2 Centro Nacional Clínica de Displasias,Hospital General de México, S.S.

Los Papilomavirus humanos (HPV) se han asociado al desarrollo del CáncerCérvico-Uterino (CaCU), especialmente los tipos 16 y 18. El proceso de malignización llevavarios años, una vez establecida la infección, el virus se mantiene en estado episomal y sóloen ocasiones se integra al genoma. Esta integración aumenta en las lesiones avanzadas. Du-rante este proceso, el gen temprano E2, que codifica para un regulador negativo de los oncogénesvirales E6 y E7, se rompe y por consiguiente deja de expresarse. Mediante pruebas de ELISAse ha detectado un incremento de anticuerpos del tipo IgA dirigidos contra la proteína E2 enpacientes con neoplasia intraepitelial cervical (NIC), el cual disminuye en relación directacon la progresión de las lesiones. Esto ha sugerido que los anticuerpos contra la proteína E2podrían ser considerados como marcadores de progresión a CaCU. Para evaluar esta posibili-dad, y para establecer en que momento las lesiones empiezan a presentar cambios en la expre-sión de E2, medimos la relación existente entre la presencia de la proteína E2 y de anticuerposcontra ella en biopsias de pacientes infectas por HPV. También evaluamos posibles cambiosen la expresión del antígeno E2 y los niveles de anticuerpos en lesiones con diferentes gradosde malignidad. Se tomaron biopsias cervicales a 3 grupos de pacientes: 10 con infección porHPV, 12 con NIC y 12 con CaCU. Se hicieron cortes de las biopsias y se extrajo DNA paradetectar la presencia de HPV por PCR, utilizando oliglonucleótidos universales. A las mues-tras que resultaron positivas se les realizó un segundo ciclo de amplificación conoligonucleótidos específicos para HPV 16 y 18. A todas las muestras positivas para HPV yotro contra la proteína L1 de cápside que está muy conservada en los HPV. Simultáneamentea la toma de biopsia, se tomo sangre periférica y secreciones cervicales en la solución salina.El plasma se utilizó para detectar IgG e IgA y las secreciones se utilizaron para medir sIgA,todas por el método de ELISA. Se encontró poca correlación del análisis por PCR con eldiagnóstico clínico en las lesiones diagnosticadas como HPV; sin embargo la correlación enlos NIC y los tumores fue casi de 100%. Se observó la presencia de IgG e IgA circulantes enlos grupos de pacientes, comparados con la población normal. Además se encontró un altonivel de positividad a sIgA en pacientes con infección por HPV que disminuye en un 50% enel grupo con NIC y en un 80% en el grupo con CaCU, lo cual podría estar relacionado concambios en el nivel de expresión de E2. Pensamos que estos resultados nos permitirán esta-blecer una posible relación entre la expresión de E2 y el proceso de malignización.

Los cultivos celulares como herramienta para estudios y virulencia hacia el snc de losherpesvirus simplex

Gloria Martínez, Patricia Bárcenas y Blanca Y.

Esc. Nacional de Ciencias Biológicas Lab, de Virología IPN, Carpio y Plan de Ayala S/N Cascode Santo Tomás México. D.F. 11340.

Los virus herpes simplex poseen una gran afinidad por células del sistema nerviosocentral (SNC) y son una de las causas más comunes de encefalitis viral en humanos. La disemina-ción y replicación del virus en el SNC es objeto de numerosos estudios.

Los cultivos de células in vitro de origen neuronal ofrecen un sistema para abordarlos estudios de patogenía de virus que afectan al SNC, así como los de células no neuronales,que contribuyen en la identificación de las similitudes y diferencias del comportamiento viral yde alguna manera comprender la afinidad del virus por el SNC.

En este estudio se evaluó en forma comparativa la infección por herpes simplex tipo1 y tipo 2 (HSV-1, Machntyre y HSV-2, cepa G) in vitro utilizando dos líneas celulares deorigen epitelial (PC y Vero) y una de fibroclastos (MRC-5) y dos líneas celulares de origenneuronal, NIE-115 (neuroblastoma murino) y SK-N-SH (neuroblastoma humano).

La infección viral se realizó con una MOI de 0.1 para todas las líneas. Las célulasde neuroblastoma se diferenciaron por tratamiento con dimetil sulfóxido, al 1% para NIE-115 y0.5% para SK-N-SH. Para determinar la cinética de infección viral, a diferentes horas posinfecciónse tomaron alícuotas del sobrenadante (virus liberado), alícuotas del sobrenadante y células (vi-rus total) y por diferencia de estos valores se calculó la concentración de virus que había dentrode las células. Las alícuotas se titularon por el método de DICT50 y el título viral se obtuvo porla formula de Sperman-Karber:

Los resultados obtenidos fueron: la mayor producción de virus total se logró enlíneas celulares de origen epiterial (Vero, PC), tanto para HSV-1 (log 6.8 TCID50 /100 ìL) comoHSV-2 (Log 6. 8. TCID50/100 ìL) como HSV-2 (Log 6.0 TCID50/100 ìL). Esto ocurrió paraHSV-1 a las 24 hr. postinfección y a las 48 hrs para HSV-2.

Las líneas de neuroblastoma murino fueron semipermisivas y de lenta progresiónpara HSV-1, alcanzando una producción total de virus de log 3.37 TCID50/100 ìl, al quinto díapost infección. Estas células fueron no permisivas para HSV-2. En el caso de la línea deneuroblastoma humano HSV-1 alcanzó una producción viral de log 5.3/100 ìl, a las 36 hs ynuevamente HSV-2 alcanzó únicamente log 3.5 TCID50/100 ìL

Los resultados muestran que la multiplicación de HSV-1 ocurre con una cinéticamás rápida y con mayor producción de partículas virales en células de origen neuronal, epitelialeso fibroblásticas, en comparación con HSV-2 que muestra una menor producción de partículasvirales e inclusive en células neuronales de ratón como las NIE-115 no se multiplican cuandoéstas no están diferenciadas. Sin embargo, el daño celular que produce la infección viral ocurreen mayor extensión y menor tiempo cuando las células se infectan con HSV-2, produciendosincítios enormes. Esto sugiere que in vitro se pueden apreciar las diferencias que tienen estosvirus en cuanto a sus propiedades de invasividad y virulencia.

Mutaciones que alteran la RNT-5´ de poliovirus modifican su efi-ciencia de replicación y traducción.

Mónica Denova-Ocampo, Ana Lorena Gutiérrez-Escolano y Rosa Ma. del Angel.

Departamento de Patología Experimental. Centro de Investigación y Estudios Avanzados delIPN. México. D.F.

El virus de la poliomielitis (poliovirus) ha sido usado como mo-delo para el estudio del mecanismo de traducción cap-independiente. Cier-tas mutaciones en la región no traducida-5´ (RNT-5’) de los tres serotiposde las cepas vacunales de poliovirus (Sabin), son las responsables de sufenotipo atenuado. Los determinantes principales de atenuación se localizanen los nucléotidos 480, 481 y 472 de poliovirus tipo 1, 2 y 3 del dominio Vde la RNT-5’. Se ha postulado que mutaciones que alteran la estructura se-cundaria de la RNT 5’ reduce la eficiencia de traducción del RNA viral.Con el fin de conocer el efecto directo de mutaciones en la RNT 5’ depoliovirus en los procesos de traducción, replicación y virulencia se trabajócon las cepas PRV 6.1 (Silvestre), PRV 7.3 (C472U), SFP8 (C472U y G482A)y la revertante de la cepa SFP8 llamada V957 (G482A y C529U). La cepaSFP8 cuyo fenotipo es atenuado fue deficiente en replicación y traduccióntanto en células Hela como células nerviosas, sin embargo, la cepa mutanteen la base 472 solo muestra deficiencia en la traducción y replicación encélulas nerviosas y no en células Hela. La simple mutación en la base 472parece no desestabilizar la estructura secundaria pues solo afecta la traduc-ción en células nerviosas, con la segunda mutación en la base 482, la deses-tabilización parece ser mayor, reduciendo la eficiencia de traducción en am-bas líneas celulares. Por el contrario la revertante V957 cuyos cambios enlas bases 472 y 529 restablecen la estructura secundaria, mostró una eficien-te replicación y traducción en ambas líneas celulares. Estos datos enfatizanque la estabilidad de la estructura secundaria de la RNT-5’, así como suinteracción con factores celulares son al parecer determinantes para la efi-ciente traducción independiente de cap y para la virulencia.


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Desarrollo de un modelo murino para el estudio de la infección por el HIV.

Vázquez Pérez Joel A., Soler Claudín Carmen.

Unidad de Investigación en Retrovirus Humanos, I.I.B. UNAM, INDRE S.S.

Introducción : Todos los conocimientos de la estructura biológica y molecular del agente etiológicodel SIDA, el virus de la inmudeficiencia humana (HIV) se han descrito a partir de estudios encultivo celular de células mononucleares de sangre periférica humanas y clonas de linfocitos T.Estos estudios han dado como resultado la identificación y el mapeo de los genes del HIV y elciclo de replicación, pero poco se sabe acerca de la biología del HIV in vivo. Por este motivo sehan diseñado diferentes modelos animales para estudiar la infección por el HIV, entre estos seincluyen modelos murinos transplantados con órganos hematopoyéticos o células mononuclearesde sangre periférica humanos en ratones inmunodeficientes (SCID). Estos ratones permiten elcrecimiento de células linfoides humanas a partir de las dos semanas del xenotransplante permi-tiendo la posterior infección de estas células con el VIH.Objetivos: Construir un ratón inmunodeficiente genéticamente reconstituido con células linfoideshumanas (órganos hematopoyéticos o células mononucleares periféricas-PBMC) e infectar estosratones con cepas HIV-1 aisladas en México y medir parámetros moleculares e inmunológicos dela infección.Resultados: Los resultados preliminares de este trabajo son obtención y criopreservación de lostejidos y/o células humanas.

1.-Se estandarizaron las condiciones para llevar a cabo el transplante de los órganosfetales humanos en ratones inmunodeficientes. Se realizaron diversas cirugías transplantandomaterial inerte en la cápsula del riñón izquierdo en ratones normales. Dichas cirugías resultaronexitosas no presentándose infecciones ni defunciones. Se estableció un convenio con el Hospitalde la Mujer S.S.A., para la obtención de cadáveres fetales de aproximadamente 14-23 semanas degestación. Esta donación se está llevando a cabo de acuerdo a los estatutos para la investigacióncon órganos de la Secretaria de Salud.

Se construyó un banco de órganos fetales hemotopoyéticos hígado, bazo y timo,obteniéndose mediante citometría de flujo las poblaciones de linfocitos T de dos de estos órga-nos. Timo 1 CD3 + 22%, CD4+ 14.5%, CD8+ 9.22%, CD4+ CD8+ 69%. Hígado 1 CD3+ CD4+< 0.1%. Se llevó a cabo la estandarización de métodos de criopreservación de fragmentos o desuspensiones celulares de estos órganos resultando en una viabilidad después de descongelar del80% para fragmentos del hígado y un 30% para fragmentos de timo.

2- Actualmente se esta trabajando con ratones hipotímicos desnudos (CD1 et/et)donados por la FES-Zargoza UNAM (Domínguez Casalá, Rosas P, Marroquín R datos no publi-cados) en los cuales se llevará a cabo los transplantes. Estos ratones se están inmunodeprimiendocon anticuerpos anti. CD4 (YTS 191V3105 Metcalfe et al. Cambrigde) y posteriormente se ino-cularán las células mononucleares periféricas o se transplantarán los órganos hematopeyéticoshumanos. Todos estos experimentos se realizarán en una campana de aislamiento (Isotec Ltd)dentro de una zona de bioseguridad nivel 3.

Sensibilidad de las células de sarcoma de Kaposi (KS4) a Fibroquel®

Gómez Palomino Claudia, Soler Claudin Carmen.

Unidad de Investigación en Retrovirus Humanos Instituto de Investigaciones Biomédicas UNAM.Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos

INTRODUCCIÓN. El Sarcoma de Kaposi (KS) se define como una condición tumoral caracteri-zada por la proliferación de una mezcla de células en forma de huso y estructuras vasculares,mezcladas con células endoteliales, fibroblastos y macrófagos con evidencia de angiogénesis.Estas células producen citocinas que están probablemente involucradas en el control autócrino yparacrino de proliferación celular in vivo e in vitro . Estas citocinas incluyen TGFbbbbb y PDGF-Ay PDGF-B. El PDGF es un factor necesario para permitir el crecimiento de células de sarcomade Kaposi in vitro Las células KS expresan el receptor subtipo á del PDGF y especialmente elsubtipo b. El TGFb es producido por células endoteliales, macrófagos y es infiltrado a las célu-las KS. El RNAm del TGFb es expresado en las células de sarcoma de Kaposi. Krotzch- GómezF.E. y col. mostraron que en cultivos de fibroblastos derivados de biopsias de piel normal, cica-trices hipertróficas y/o queloides, y cicatrices hipertróficas y/o queloides tratadas con FibroquelMR,los niveles de PDGF-AB en las biopsias tratadas alcanzaron los niveles de PDGF-AB de losfibroblastos derivados de la piel normal, mientras que en los cultivos de fibroblastos derivadosde las cicatrices hipertróficas y/o queloides sin tratamiento fueron 100% más elevados. El TGFbdisminuyó aproximadamente un 66% en fibroblastos derivados de cicatrices hipertróficas y/oqueloides tratadas con fibroquelMR

OBJETIVO: Determinar la toxicidad de FibroquelMR en las líneas de células Hut 78, Hela-CD4(donada por Bruce Chesebro) y KS4 (Donada por la Dra. Barbara Ensoli NIH Maryland Bethesda).MÉTODO. 2X104 células Hela CD4, 4X103 células de Sarcoma de Kaposi (KS4) y 2X105 decélulas Hut 78 se cultivaron por separado en cajas de 24 pozos en presencia de sueros hastaalcanzar un 80% de confluencia. Posteriormente se adicionó el Fibroquel al 25, 12.5, 6.25 y3.125% y se incubó durante 48 horas a 37ºC. Las células Hela-CD4 y la KS4 se tiñeron concristal violeta y disolviéndose los residuos de colorante con ácido acético se midió la densidadóptica, mientras que las células Hut 78 se tiñeron con azul tripan y se contaron en cámara deNewbahuer.RESULTADOS: Los porcentajes de FibroquelMR de 25, 12.5 resultaron ser tóxicos para las treslíneas celulares produciendo un 100% de muerte celular. Los porcentajes de FibroquelMR de6.25 y 3.125% permitieron un 80 y 100% de viabilidad celular respectivamente en ambas líneasHela-CD4 y Hut 78, en tanto que para la línea KS4 el porcentaje de Fibroquel de 6.25 indujo un100% de muerte celular y el porcentaje de 3.125 un 50%.CONCLUSIONES. Las Células SK4 resultaron ser más sensibles a los porcentajes de fibroquelMR

de 6.25 y 3.125% con respecto a las líneas Hut 78 y Hela-CD4. Se propone que la resolución delesiones de sarcoma de kaposi in vivo puede ser debida a un efecto sinérgico de la toxicidad y dela disminución en la producción de citocinas en los linajes celulares que constituyen la lesión.

El sistema olfatorio vía de ingreso del rubulavirus porcino al sistema nervioso centra. I.Infección experimental y detección de antigeno.

Reyes-Leyva J1, Ramírez H2, M Hernández J3, Sánchez ME1, Rodriguez J2, Mercado C2, Carreón R2,Adair B4, Herron B4, Alan G4, Kennedy S4, Zenteno E5 y Hernández- Jauregui P1

1Lab. de Virología y Patología, Centro de Investigación Biomédica de Oriente, IMSS.2Dept. Producción Animal Cerdos, Fac. Medicina Veterinaria y Zootecnia, UNAM.3Dept. de Bioquímica, Fac Medicina UNAM.4Dept, Virology Queen´s University, N.I.5Dept. Bioquímica, INER SS. México.

El rubulavirus porcino es el agente causal de la enfermedad del ojo azul de los cerdos.Durante un brote natural la infección se presenta con manifestaciones de meningoencefalitis que afectaprincipalmente a los cerdos neonatos y lactantes menores de un mes de edad, cerdos de mayor edad (3-4 meses ) suelen presentar también signos nerviosos en algunos brotes, pero los cerdos adultos nopresentan manifestaciones neurológicas. Con el objeto de conocer la patogenía producida por elrubulavirus porcino en el sistema nervioso central realizamos diversas series de infecciones experimen-tales en cerdos de distintas edades. En todas las series los cerdos se infectaron por vía intranasal con105 DICT50% de la cepa PAC3 del rubulavirus porcino. En la primera serie se utilizaron dos grupos de10 lechones cada uno, de 3 días y de 17 días de edad. En esta serie los cerdos fueron sacrificadosdiariamente. En la segunda serie se utilizaron 10 cerdos de 3 meses de edad sacrificados cada 3 días,.Enla tercera se infectaron 15 machos adultos de 8 meses de edad y 10 hembras de un año de edad, loscuales se sacrificaron cada 7 días después de la infección. En todas las series los cerdos se sacrificaronutilizando métodos eutanásicos y se tomaron muestras en congelación para detectar antígeno viralmediante inmunofluorescencia y para identificar los sitios de replicación mediante la infección de cul-tivos celulares. Los resultados de los grupos a y b de la primera serie mostraron que el virus puedeidentificarse desde el tercer día post-infección en la mucosa nasal y en el bulbo olfatorio. El virus sedisemina dentro del sistema nervioso central siguiendo las vías de conducción del estímulo olfatorio(bulbo, tracto y corteza olfatoria del lobulo piriforme), llegando el día 7 post-infección a las estructurasmesencefálicas: hipocampo, tálamo e hipotálamo. Hasta este momento la infección parece seguir unasola cadena neuronal, ya que sólo unas cuantas neuronas dan reacción positiva, en adelante el virus sedisemina siguiendo varias vías nerviosas y puede encontrarse en diversas regiones de la corteza cere-bral y en los nervios trigémino, glosofaríngeo y óptico. Los lechones 3 y 17 días de edad presentaronconsistentemente ataxia, tremor muscular, alteraciones postulares, del movimiento y de la conducta,todas ellas reflejo de un meningoencefalitis con afección del sistema límbico. Los cerdos de 3 mesesmostraron como signos nerviosos letargo, tremor e hiperexitabilidad pasajera acompañados conestornudos, taquípnea y secreción nasal abundante; mientras que los cerdos adultos machos y hem-bras no presentaron alteraciones neurólogicas, sin embargo se reprodujeron las alteraciones reproductivascaracterísticas Los análisis histopatológicos han mostrado una ligera meningitis no supurativa pasajeradurante los primeros 10 días postinfección en los cerdos de 3 meses y adultos, sin embargo, no se hademostrado la presencia de virus o antígeno viral en alguna región de su sistema nervioso central.Proyecto financiado por PADEP Y PAPIIT, DGAPA, UNAM, CONACYT y Comunidad EconómicaEuropea.

El sistema inmune blanco de la infección por rubulavirus porcino.

Reyes-Leyva J1, Hernández J2, Aguirre G1, Santos G1, García 01, Hernández-Jauregui P1 yZenteno E3.

1Lab. Virología y Patología, Centro Investigación Biomédica de Oriente, IMSS Puebla.2Dept Bioquímica, Fac. de Medicina, UNAM.3Dept. Bioquímica, INER, SS.

En este trabajo se analizaron las características de la respuesta inmune en cerdosinfectados experimentalmente con el rubulavirus porcino. Los títulos de anticuerpos inhibidoresde la hemaglutinación, la cuenta diferencial de leucocitos (CDL) y los índices de prolifera-ción linfocitaria en presencia de mitógenos y antígeno viral (virus y proteína HN) fueron re-gistradas semanalmente en un experimento y cada 3 días en otro. Los resultados indican unabuena producción de anticuerpos antivirales desde la primera semana postinfección, los cua-les se mantienen elevados a lo largo del experimento. Por su parte, la CDL mostró ligeradisminución en los niveles de leucocitos totales durante los primeros 15 días postinfecciónregresando a sus niveles normales de la cuarta semana en adelante. No observamos cambiossignificativos en la respuesta mitogénica en los cerdos infectados y testigos a lo largo delexperimento, y como se esperaba los linfocitos de cerdos infectados respondieron al exponer-se in vitro al antígeno viral. Los valores de subpoblaciones celulares se analizaron mediantecitofluorometría de flujo, utilizando anticuerpos monoclonales contra las moléculas de super-ficie CD2+, CD4+, CD8+ de linfocitos T, IgM de linfocitos B y CD14 de monocitos. Nues-tros resultados indican que el virus induce una disminución notable en los niveles de célulasIgM+ y CD14+ y ligera de células CD2+; Esta disminución celular es compensada en algunosanimales con un aumento en las subpoblaciones de linfocitos CD4-, CD8+ y CD4+CD8+.Los niveles de las otras células no fue afectado durante la infección. Para saber si la disminu-ción celular se debió a una actividad directa del virus sobre el sistema inmune de los cerdos serealizó la detección de antígeno viral en células mononucleares de sangre periférica y en cor-tes de tejidos linfáticos mediante inmunofluorescencia. Estos ensayos mostraron que el viruspuede identificarse en tonsila, bazo y nódulos linfáticos de los cerdos infectados, así como encélulas mononucleares (IgM+ y CD14+) mantenidas en cultivo en cámaras portaobjetos. Ade-más realizamos la identificación histoquímica del receptor celular del rubulavirus porcino(sialilá2,3lactosa), utilizando la lectina de Maackia amurensis, en frotis de sangre total, encortes de tejido linfático y en cultivos de células mononucleares, encontrando que monocitos,linfocitos B y un 30% de los linfocitos CD2+ expresan dicho receptor.

Proyecto parcialmente financiado por PAPIIT y PADEP, DGAPA, UNAM Y CONACYT.

Revista Biomédica

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Identificación de variantes virulentas naturales del rubulavirus porcino asociadas ala enfermedad de ojo azul de los cerdos.

Reyes-Leyva J1, Ramírez H2, Hernández J3, Santos G1, Hernández L1, Hernández-Jauregui1 yZenteno E3.

1Lab. de Virología, Centro de Investigación Biomédica de Oriente, IMSS.2Dept. Producción Animal Cerdos, Fac, Medicina Veterinaria y Zootecnia.3Dept. de Bioquímica. Fac. de Medicina, UNAM. Y 4. Depto.Bioquímica, INER, SS.

La enfermedad del ojo azul de los cerdos es un complejo de alteraciones neurológicas,respiratorias y reproductivas acompañadas por opacidad de la córnea. En los primeros brotes de laenfermedad las manifestaciones neurológicas se limitaban a cerdos neonatos y lechones menoresde un mes de edad. En ese entonces se aislaron dos rubulavirus porcinos el virus de la PiedadMichoacán (LPM) y el paramixovirus del ojo azul (POA). En brotes posteriores, se observó unincremento en la virulencia viral, ya que se identificaron cerdos en desarrollo de 3 a 4 meses deedad con signos neurológicos. A partir de 1988, un nuevo cambio en la virulencia fue identificadoconsistente en la presentación de epididimitis, orquitis y atrofía testicular en cerdos adultos, ade-más de las características alteraciones neurológicas en los lechones. Este trabajo incluye la carac-terización de seis virus (PAC1 a PAC5 y CHOPOS) aislados de distintos brotes de la enfermedaddel ojo azul. Análisis de las manifestaciones clínicas y las lesiones presentadas durante los brotesnaturales permitieron identificar tres variantes virales: en la primera el virus CHOPOS que al igualque los virus POA Y LPM causaron básicamente alteraciones neurológicas en lechones; en lasegunda los virus PAC1, PAC4 Y PAC5 causantes de alteraciones neurológicas tanto en lechonescomo en cerdos en desarrollo con manifestaciones reproductivas en adultos, y tercera los virusPAC2 Y PAC3 que produjeron principalmente alteraciones reproductivas en los machos adultos.Infecciones experimentales de lechones de 3 días de edad con los virus PAC1, PAC2, PAC3 YPAC4 reprodujeron las alteraciones nerviosas en todos los cerdos infectados mostrando que elvirus PAC1 es más virulento que los otros virus, ya que mató a todos los cerdos en los días 5º y 6ºpost-infección, mientras que los otros virus tomaron más días para producir la muerte de los le-chones. El virus PAC1 mostró también mayor rapidez que los demás virus para producir la lisis decultivos de células PK-15, lo que fue directamente proporcional a la identificación de virus libera-do de los cultivos infectados. La actividad hemaglutinante fue similar para todos los virus cuandose realizó a 4ºC, pero tres variantes virales pudieron ser identificadas de acuerdo con su capacidadpara eluir los eritrocitos aglutinados (efecto de la actividad neuraminidasa) cuando la incubaciónse realizó a 37ºC. Así los virus LPM Y CHOPOS eluyeron 5 horas después de la hemaglutinación,los virus POA, PAC2, PAC4, y PAC5 eluyeron a las 2 horas, mientras que los virus PAC3 y PAC1sólo tomaron 20 min para eluir; éste último fue el único virus que eluyó los eritrocitos después de20 min de realizada la aglutinación a temperatura ambiente, mientras que los otros virus tomaronmás de 4 horas a este temperatura. Diversos ensayos inmunológicos no pudieron identificar dife-rencias entre los virus analizados. Nuestros resultados sugieren que los cambios observados en lavirulencia de los rubulavirus aislados que se deban a una mayor actividad de la neurominidasaviral, al menos en lo que corresponde al virus PAC1. Proyecto parcialmente financiado por PAPIIY PADEP, DGAPA, UNAM.

Análisis del dominio de serin-proteasa de la proteína no estructural 3 (NS3) delvirus del dengue

Rosales B. H. Ruiz.

Depto. Biología Molecular,. Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM, México, D.F.

La mayor parte de los ARN virus de cadena sencilla cuya polaridades positiva, codifican para un número limitado de proteínas no estructurales,las cuales han sido asociadas con funciones claves en la expresión y replicacióndel genoma viral. Recientemente, se han propuesto algunas funcionesbiológicamente importantes a las proteínas no estructurales de los flavivirus,siendo una de las más relevantes NS3, debido a su papel en los procesos dereplicación viral y procesamiento del precursor poliproteínico.

En base a ello, nos hemos propuesto llevar a cabo el análisistridimensional de ésta proteína mediante modelaje y dinámica molecular, ana-lizando los diferentes confórmeros posibles en una relación dinámica. Inicial-mente se llevaron a cabo búsquedas en las bases de datos especializadas enbusca de proteínas homólogas, una vez hecho este escrutinio, se formó unabase de datos propia a partir de la cual se llevaron a cabo los análisis de es-tructura primaria y secundaria. Por otro lado, buscamos firmas en las secuen-cias de aminoácidos con ayuda del algorítmo Prosite.

Actualmente, hemos logrado detectar firmas relacionadas con serín-proteasas ubicadas de manera principal en el extremo N-terminal y firmas re-lacionadas con helicasas ubicadas en el extremo C-terminal. De manera simi-lar nuestra base de datos cuenta con proteínas homólogas, entre las que se en-cuentran helicasas y protesas serínicas. Los análisis de predicción de estructu-ra secundaria nos permiten proponer que NS3 es una proteína de tipo á-b.

Durante la segunda fase del proyecto se llevó a cabo la búsqueda deproteínas ya cristalizadas en el Proteín Data Bank (PDB), cuyos dominios confunción de helicasa y serín-proteasa sean homólogos a la proteína NS3 delvirus dengue (las conformaciones detectadas son: 1SNV y 2CGA, las cualescorresponden a quimiotripsina, y la proteasa del virus sindbis). Estas confor-maciones, junto con los análisis de estructura primaria servirán como punto departida para los análisis de modelaje molecular.

Inhibición de la replicación del virus del dengue ocasionada por flavonoides.

Sánchez, I1, Galicia. G1, Gomez, G2, Calderon, J2, Taboada, J2 y Ruiz, B1.

1Depto. Biología Molecular, Instituto de Investigaciones Biomédicas,2Instituto de Química, U.N.A.M.

El dengue es una enfermedad causada por un virus perteneciente a lafamilia Flaviviradae del cual se conocen cuatro serotipos, y es trasmitido al hom-bre por la picadura del mosquito Aedes agypti que infecta preferencialmente a lascélulas del sistema fagocífico mononuclear, causando grandes epidemias a través detodas las regiones tropicales y subtropicales del mundo. Aunque la enfermedad deldengue se manifiesta de mediana a moderadamente severa y la mortalidad es baja,existe una forma más severa conocida como Síndrome de choque y/o Fiebrehemorrágica ocasionada por una infección secundaria con todo serotipo. No hay untratamiento efectivo contra la enfermedad, y a las personas afectadas generalmentese les administra antipiréticos y analgésicos, con reposo en cama, y en caso de deshi-dratación reposición de fluidos y electrolitos. Por otro lado, los flavonoidoes soncompuestos naturales que se encuentran en plantas (frutos y vegetales cítricos) po-seen una estructura polifenólica de bajo peso molecular. Presentan un potente efectopiciscidal, insecticida, repelente, anticancerígeno y anti-inflamatorio y se desconocesu mecanismo de acción a nivel molecular. Existen reportes en la literatura deflavonoides que presentan actividad antiviral como es el caso de Isoscutellarein (ex-traído de la hoja Scutellaria baicalensis) que presenta actividad inhibitoria para elvirus de la influenza (Nagai, T., et al 1992). Nosotros hemos analizado si flavonoidesextraídos de plantas del género Tephrosia, extraídos en el Instituto de Química, (seencuentran en forma endémica en el Oeste de la República Mexicana, principalmen-te T. madrensis y T. viridiflor); presentan actividad antiviral in vitro , utilizando elmodelo formación de placa lítica utilizando el aislado mexicano del virus del den-gue-2. Los flavonoides, glabranina, 2-metilglabranina elongatina y el tephrobotinolque fueron analizados, disminuyeron 62%, 75%, 75% y 53.9% respectivamente elnúmero de placas líticas formadas (p.f.u.) con respecto a los controles positivos. Encambio otros flavonoides (heptametoxi y octametoxiflavonas), resultaron ser dema-siado tóxicos para las células utilizadas en el ensayo (MK2). Estos resultados sugie-ren que los flavonoides analizados, poseen una actividad antiviral moderada sobreel virus del dengue in vitro dependiendo de la posición y tipo del sutituyente.

Caracterización de un anticuerpo monoclonal contra la superficie de célu-las MA-104, que neutraliza la infección por rotavirus.

Espinosa, E. Méndez, S. López y C.F. Arias.

Depto. de Genética y Fisiología Molecular, Instituto de Biotecnología UNAM, Cuernavaca,Mor. 62210.

Los rotavirus son capaces de unirse a una gran variedad de tiposcelulares, sin embargo sólo son capaces de infectar productivamente a unsubgrupo de estas células. Así, se ha propuesto que existen cuando menosdos interacciones de los rotavirus con su célula huésped; la primerainteracción, dependiente de ácido siálico (AS) es de naturaleza promiscua,mientras que la segunda interacción independiente de AS es más específicay podría determinar, al menos en algunos casos, si las células son suscepti-bles o no a la infección por rotavirus. Estamos interesados en la identifica-ción y caracterización del receptor AS-independiente de las células MA104.Para identificar y caracterizar el receptor celular resistente a neuraminidasaestamos en proceso de aislar AcM’s dirigidos contra componentes de lamembrana de células MA104 que sean capaces de bloquear la infectividadde los rotavirus. Después de fusionar el bazo de un ratón inmunizado concélulas MA104 tratadas con neuraminidasa, con células de mieloma Fox,aislamos un hibridoma (de aprox. 2000 analizados), que secreta un AcM(2D9) que es capaz de bloquear de manera eficiente y específica lainfectividad de los rotavirus en células tratadas con neuraminidasa. EsteAcM es específico ya que sólo es capaz de inhibir la infección de las célulasMA104 por rotavirus, pero no neutraliza la infectividad de otros virus comopoliovirus y reovirus. Estos resultados sugieren que el AcM 2D9 está dirigi-do contra el receptor celular A-S-independiente. Este AcM es una IgM einteracciona específicamente con la superficie de la membrana celular, de-tectado por inmunomicroscopía electrónica. Estamos en el proceso de ca-racterizar que molécula de la superficie celular es reconocida por este anti-cuerpo monoclonal.


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Caracterización genómica y antigénica de cepas no serotipificablesde rotavirus de humano.

Pedro Romero y Luis Padilla-Noriega

Departamento de Genética y Fisiología Molecular del Instituto de Biotecnología U.N.A.M.Cuernavaca, Morelos. México.

Los rotavirus (RV) del grupo A presentan dos proteínas en su capaproteica externa, VP4 y VP7 y ambas son capaces de inducir anticuerposneutralizantes. VP7 se ha clasificado en cuatro serotipos principales por ensa-yos de neutralización o ensayos inmunoenzimáticos (ELISA) con anticuerposmonoclonales neutralizantes (AMC), mientras que VP4 se ha clasificado endos serotipos principales por enzayos de neutralización, pero aun no se haimplementado su tipificación por ELISA con AMC, dificultando llevar a caboamplios estudios epidemiológicos. VP4 también ha sido estudiada por análi-sis de secuencia genómica, método por el cual se han identificado 19 tiposgenómicos, tres de los cuales, P-gen 8, P-gen 4, y P-gen 6, corresponden a losserotipos de VP4 P1A, PIB Y P2, respectivamente. En un estudio a nivel na-cional se determinó la diversidad de las proteínas de superficie de RV aisladosde niños infectados usando ensayos inmunoenzimáticos con AMCN anti-VP7y anti-VP4. En ese estudio se analizaron 408 muestras, de las cuales 359 (88%)fueron tipificadas en distintos patrones de reactividad con AMC anti-VP4 su-giriendo que pertenecen a los principales serotipos de VP4 conocidos (P1A,PIB Y P2A) y 49 muestras (12%) no fueron tipificables. Con el fin de identi-ficar posibles nuevas variedades de VP4 de RVHs hemos iniciado la caracte-rización genómica y antigénica de esta proteína en las 49 muestras de RVHno tipificables con AMCN. Así, hemos determinado la presencia de VP4 en30 de las 49 muestras analizadas por ELISA con un AMC, YO-2C2, que re-accionan con VP4 DE RVH independientemente del serotipo. De las 30 mues-tras, 24 (80%) no reaccionaron con el AMC YO-2C2, sugiriendo la ausenciade VP4, y seis si reaccionaron. En estas muestras que si presentan VP4 sedeterminó el tipo genómico por RT-PCR identificándose cuatro como P-gen8, una como P-gen 4 y una no fue tipificable. Estos resultados sugieren que enla muestra analizada no existe un número importante de nuevas variedadesantigénicas o genómicas de VP4.

Expresión de proteínas de rotavirus en salmonella sp. Ylactobacillus sp. Y su caracterización inmunológica.

M.E. Munguía1, P. Romero1, S. López1, R. Leer2, W. Boersma2 y C.F. Arias1.

1Depto. Genética y Fisiología Molecular, Instituto de Biotecnología. UNAM. AV Universi-dad No. 2001, Cuernavaca Mor., 62210. México.2TNO Nutrition and Food Research Institute. P.O. Box 5815, 2280 HV Rijswijk Holanda.

El agente causal más común en infecciones intestinales tanto en re-cién nacidos de humanos como en crías de otros mamíferos es rotavirus. Se haestimado que provoca anualmente más de 870,000 muertes así como perdidaseconómicas en el área pecuaria por lo cual el desarrollo de una vacuna contrarotavirus ha sido prioridad para la Organización Mundial de la Salud. En pro-gramas de vacunación donde un gran número de individuos estas involucrados,la administración de una única dosis oral es considerada la ruta de inmuniza-ción más conveniente y logísticamente eficiente. El diseño de una nueva vacunadebe cubrir una serie de requisitos como ser; segura, estable, económica y fácilde administrar. Las vacunas basadas en microorganismos vivos no patógenoscomo Lactobacillus sp o patógenos atenuados como Salmonella sp ofrecen unaserie de ventajas que los hacen atractivos candidatos para ser usados como va-cunas recombinantes.

Se sabe que la capa externa de rotavirus esta compuesta por las pro-teínas VP4 y VP7 las cuales son capaces de evocar anticuerpos neutralizantes.VP6 es la proteína más abundante del virus que constituye la cepa interna ycontiene epítopes de reacción cruzada. VP4, VP6 y VP7 se han expresado comoproteínas de fusión de Lactobacillus casei y Salmonella tiphymurium SL3261.En el caso de L. casei se han expresado en forma extracelular tanto asociada a lamembrana celular como secretada al medio y en formas citoplásmica. Actual-mente se está evaluando la respuesta inmune de ratones inmunizados con estasbacterias recombinantes. Resultados preliminares indican que la cepa deSalmonella typhimurim que expresa VP6 y VP8 (peptido derivado de VP4)como proteína de fusión con la proteína glutation-S-transferasa de E. coli soncapaces de inducir una respuesta humoral contra la proteína recombinante.

Modificación de la expresión de antígenos del virus sincitial poracción del anticuerpo antivirial.

Hernández1, E. Ortega2 y B. Gómez1

1Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Medicina.UNAM.2Departamento de Inmunología, Instituto de Investigaciones Biómedicas; Universidad Na-cional Autónoma de México, D.F.

El virus sincitial respiratorio (RSV) ocasiona la más impor-tante causa de enfermedad del tracto respiratorio bajo en infantes y ni-ños, ocasionando neumonía y bronquiolitis. El RSV pertenece a la fa-milia paraximovirididae , es un virus pleomórfico de entre 150-300nm de diámetro. El material genético es una hebra de ARN nosegmentado de polaridad negativa. El genoma del RSV codifica paradiez ARNm y cada uno de ellos para una proteína sencilla (F, G, M,M2, N, P, L, NS1, NS2 y SH). El mecanismo por el cual el sistemainmunológico protege contra la infección y reinfección del RSV no estácompletamente entendido. Clásicamente el papel de los anticuerpos secreyó que pudo ser la neutralización del virus extracelular, evitando ladiseminación del virus y previniendo las reinfecciones. Ahora el anti-cuerpo también parece estar implicado en la iniciación de la infecciónpersistente por ciertos virus. El efecto de distribuir los antígenos viralesen la membrana celular, así como la regulación de la expresión delgenoma viral por el anticuerpo antivirial se le conoce comoinmunomodulación o modulación antigénica inducida por anticuerpo.Nosotros pretendemos analizar si el anticuerpo anti-RSV induce uncambio en la expresión de los antígenos virales expresadas en célulasinfectadas, presentamos resultados de una infección aguda de célulasHep-2 infectadas con RSV Long. El efecto del anticuerpo antiviral enla expresión de proteínas virales fue detectado por Western blot en unacinética de infección y por inmunofluorescencia indirecta. Los resulta-dos obtenidos hasta el momento indican que muy probablemente el an-ticuerpo si induce un cambio en la expresión de proteínas virales.

Revista Biomédica

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primera reunión nacional de virología. · por virus que producen manifestaciones clínicas...

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