příklady biochemických metod turbidimetrie, nefelometrie
DESCRIPTION
Příklady biochemických metod turbidimetrie, nefelometrie. Miroslav Průcha. Atomová absorpční spektrofotometrie Absorpční spektrofotometrie Absorpční spektrofotometrie kinetická Denzitometrie Fluorimetrie Luminometrie Nefelometrie Nefelometrie laserová. Polarimetrie - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Příklady biochemických metod turbidimetrie, nefelometrie
Miroslav Průcha
Příklady optických technik Atomová absorpční
spektrofotometrie Absorpční
spektrofotometrie Absorpční
spektrofotometrie kinetická
Denzitometrie Fluorimetrie Luminometrie Nefelometrie Nefelometrie laserová
Polarimetrie Refraktometrie Spektrofotometrie
reflexní Spektrofotometrie
infračervená Spektroskopie Turbidimetrie UV spektrometrie
Optické metody Rozptyl světla je soubor jevů, které způsobují, že disperzní
soustava se při průchodu světla jeví zakalená. Při průchodu světla soustavou s disperzními částicemi se světelné paprsky mohou:
od částic odrážet, mohou částicemi procházet, přičemž index lomu částic je
téměř vždy odlišný od indexu lomu disperzního prostředí, takže paprsek mění směr,
vyvolat oscilaci částice (pokud je částice dostatečně malá tj. je–li průměr částice r< 0,1 l), takže částice sama se stane zdrojem záření o stejné vlnové délce.
Nefelometrie a turbidimetrie
Reakce založené na měření množství imunitních komplexů vytvořených interakcí specifických protilátek s antigenem.
Koncentrace příslušného antigenu je úměrná rychlosti tvorby nebo hustotě zákalu.
Turbidimetrie a nefelometrie – principy metod V důsledku reakce mezi antigenem a protilátkou dochází k
precipitaci a vznikají tři zóny – zóna nadbytku protilátky, zóna ekvivalence a zóna nadbytku protilátky
Precipitační křivka - oblast využitelná pro měření, bezpečnostní oblast, oblast za kritickým bodem
Kritický bod – nejvyšší koncentrace antigenu, který může analyzovaný vzorek obsahovat a nedojde přitom k naměření falešně nízkých koncentrací
Reakce probíhají v tekutém prostředí, v měřící kyvetě (pufr, enhancující látka, antigen a protilátka.
Nefelometrie – zdroje světla – výbojka nebo laser (670 nm) Turbidimetrie – zdroj světla dioda
Turbidimetrie a nefelometrie
Nefelometrie
Turbidimetrie a nefelometrie Systém end point – po smíchání antigenu a protilátky
proběhne měření po dosažení rovnovážného stavu, možnost falešně negativní (nízká) koncentrace antigenu
Proto nastavení systému tak, aby měření probíhala v oblasti lineární části křivky
Systém kinetický - reakce je rychlejší, měří se přírůstek vzniku precipitátu v pravidelných časových intervalech, po dosažení rovnovážného stavu (desítky vteřin) se měření ukončuje.
Výhoda – možnost vyhodnocování atypických koncentrací měřené látky
Turbidimetrie Smísí-li se rozpustný antigen ve vhodném poměru
s odpovídající protilátkou, vytvoří se precipitát. Kvantitativně byla tato reakce popsána již v r. 1929 Heidelbergem a Kendallem
Po průchodu světelného paprsku suspensí imunitních komplexů dochází k poklesu jeho intensity v důsledku rozptylu, absorpce a odrazu.
Pokles intensity paprsku je úměrný množství imunitních komplexů v roztoku.
Při konstantní vysoké koncentraci specifických protilátek, je množství vytvořených imunitních komplexů (turbidita analyzovaného vzorku tělní tekutiny) přímo úměrné koncentraci analytu.
Turbidimetrie Optická metoda spočívající na měření procházejícího světla
zeslabeného rozptylem na částicích (zákalu) Stupeň zákalu – turbidita Precipitační reakce mezi antigenem(Ag) a protilátkou (Ab) Na částicích dochází k rozptylu záření a částečně i jeho absorpci Sleduje se pokles intenzity záření procházejícího absorbující a
rozptylující vrstvou. Nutno získat reakční směs dostatečně stálou (ochranný polymér –
polyetylenglykol) Fotometrická citlivost je nepřímo úměrná vlnové délce, proto je
vhodné měřit při nejkratší vlnové délce dosažitelné standardním fotometrem (340 nm v blízké UV oblasti
Turbidimetrie Průchod záření nehomogenním prostředím způsobí
absorpci záření, která se měří absorpčními fotometry a spektrofotometry.
Fotometrická citlivost je nepřímo úměrná vlnové délce, proto se specifické proteiny stanovují při nejkratší vlnové délce dosažitelné standardním fotometrem tj. při 340 nm.
Největší citlivost turbidimetrických metod se dosahuje modrým světlem (435-480 nm)
Turbidimetrie Turbiditu lze měřit na jakémkoli fotometru nebo
spektrofotometru, pokud je suspenze bezbarvá Ruší hemolýza Vztah mezi absorbancí a koncentrací částic je pro malé
částice lineární, tato lineární závislost se může měnit na nelineárné se změnou vlnové délky
It = I0 . Exp (- זL) (I intenzita prošlého záření, I0 intenzita světelného zdroje, ז turbiditní koeficient, L světelná dráha kyvetou
Reprodukovatelnost 5%
Nefelometrie k měření se využívá světelného toku rozptýleného disperzní
soustavou Optická metoda měření intenzity difuzně rozptýleného
světla na dispergovaných částicích Rozptýlené (Tyndallovo) světlo vychází z roztoku všemi
směry a měří se pod úhlem, který je odlišný od směru dopadajícího záření
Světelný zdroj – helium neonového nebo argonového laseru
Nefelometrie
Je měřeno světlo rozptýlené na precipitátu Úhel rozptylu je dán velikostí částic a vlnovou
délkou dopadajícího světla Měření kinetické, měření rychlosti změny rozptylu
světla, která je přímo úměrná rychlosti vzniku IK – Ag-Ab
Srovnatelná citlivost s turbidimetrií
Praktické aplikace IgA,G,M, podtřídy, volné řetězce kappa, lambda, reaktanty
akutní fáze (CRP, haptoglobin, orosomukoid, ceruloplasmin, alfa 1 antitrypsin, alfa 2 makroglobulin)
Léky
Finanční nákladnost
Příklady analyzátorů – Beckman, Olympus