prezentace aplikace powerpoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace,...
TRANSCRIPT
![Page 1: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/1.jpg)
2018
![Page 2: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/2.jpg)
• Co je proteomika ? Proteom? Protein?
• Experimentální strategie proteomiky
• Vlastnosti AMK a proteinů
• dezintegrace, lyzace, frakcionace
• detergenty
• srážení, precipitace, denaturace
• koncentrace, filtrace
• stanovení koncentrace
• značení bílkovin
• separace proteinů
METODY PRÁCE S PROTEINY
![Page 3: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/3.jpg)
Precipitace v praxi :
• Nízkou iontovou silou
• Vysolováním (salting-out)
• Organickými rozpouštědly
Rozpustnost proteinu je výsledkem:
• polárních interakcí s vodným rozpouštědlem
• iontových interakcí s přítomnými solemi• odpudivých elektrostatických sil mezi shodně nabitými molekulami
Rozpustnost proteinu závisí na:
• struktuře proteinu
• pH, I a typu soli, T
• struktuře vody v solvatačním obalu
Precipitace je POTENCIÁLNĚ spojena s DENATURACÍ!
Precipitace bílkovinPrecipitace bílkovin
Snížení solvatačního potenciálu rozpouštědla vedoucí k tvorbě
precipitátu
![Page 4: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/4.jpg)
![Page 5: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/5.jpg)
Precipitace
Denaturace
Stabilita proteinu
Precipitace
Denaturace
Stabilita proteinu
Jednotlivé soli se liší schopností precipitovat/denaturovat proteiny
SALTING-OUT - VYSOLOVÁNÍ
Franz
Hofmeister
(1850-1922).
![Page 6: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/6.jpg)
Precipitace
Denaturace
Stabilita proteinu
Precipitace
Denaturace
Stabilita proteinu
Precipitace síranem amonným
Denaturace guanidinium thiokyanátem
[CH6N3]+.
![Page 7: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/7.jpg)
PRECIPITACE ORGANICKÝMI ROZPOUŠTĚDLY
Vytěsnění vody ze solvatačního obalu– převáží elektrostatické a van
der Waalsovy síly (přitahují se opačně nabité úseky což způsobí
precipitaci)
Etanol
Aceton (méně denaturující, více volatilní)
Mělo a by být provozováno v teplotách pod bodem mrazu
(prevence denaturace – malá konformační flexibilita,
solvent se nedostane dovnitř molekuly)
Precipitace 10 % kyselinou trichloroctovou (TCA)
![Page 8: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/8.jpg)
výsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe
- pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusí precipitovat
(odpudivé síly nabitých skupin)
• teplotní (zvýšení pohyblivosti molekul naruší vodíkové můstky)
• pH (změna náboje, vnitřní odpuzování, ztráta solventu)
• organickým rozpouštědlem (vyvázání hydrofobních úseků
rozpouštědlem, při nízkých teplotách neproniká organika dovnitř
molekul a nedenaturuje je) agregace je způsobena interakcí
opačně nabitých úseků na površích
• detergenty
Denaturace
Dezintegrace terciální struktury narušením vodíkových, S-S
a jiných slabých interakcí – ztráta funkce proteinu
![Page 9: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/9.jpg)
• Co je proteomika ? Proteom? Protein?
• Experimentální strategie proteomiky
• Vlastnosti AMK a proteinů
• dezintegrace, lyzace, frakcionace
• detergenty
• srážení, precipitace, denaturace
• koncentrace, filtrace
• stanovení koncentrace
• značení bílkovin
• separace proteinů
METODY PRÁCE S PROTEINY
![Page 10: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/10.jpg)
• precipitací
• odpařením solventu
• dialýzou proti nevodnému solventu (polyvinylpyrrolidon)
• přidáním suché matrice přijímající vodu (Sephadex)
• (centrifugační) ultrafiltrací na molekulárních filtrech
Zahušťování roztoku bílkovin
Filtry s definovaným
filtračním rozsahem pro různé
MW a pro různá rozpouštědla
100 000
30 000
10 000
5 000
3 000
![Page 11: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/11.jpg)
• Co je proteomika ? Proteom? Protein?
• Experimentální strategie proteomiky
• Vlastnosti AMK a proteinů
• dezintegrace, lyzace, frakcionace
• detergenty
• srážení, precipitace, denaturace
• koncentrace, filtrace
• stanovení koncentrace
• značení bílkovin
• separace proteinů
METODY PRÁCE S PROTEINY
![Page 12: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/12.jpg)
• UV spektrofotometrie 280 nm (Trp, Tyr)
• UV spektrofotometrie 190-205 nm (peptidická vazba)
• Redukce Cu2+ na Cu 1+ ionty – Biuret, Lowry nebo BCA (kys. bicinchonová)
• Komplexy AA s pigmenty (CBB G250) – dle Bradforda
Stanovení celkové koncentrace proteinu ve vzorku
![Page 13: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/13.jpg)
• Co je proteomika ? Proteom? Protein?
• Experimentální strategie proteomiky
• Vlastnosti AMK a proteinů
• dezintegrace, lyzace, frakcionace
• detergenty
• srážení, precipitace, denaturace
• koncentrace, filtrace
• stanovení koncentrace
• značení a imobilizace bílkovin
• separace proteinů
METODY PRÁCE S PROTEINY
![Page 14: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/14.jpg)
ZNAČENÍ A ZAKOTVOVÁNÍ
PROTEINŮ
Reaktivní skupiny bílkovin
sulfhydryl (–SH)
primární amin (–NH2)
karboxyl (–COOH)
karbonyl sacharidu (–CHO)
![Page 16: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/16.jpg)
Iodacetyl
Cys
SH-
![Page 17: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/17.jpg)
N´, epsilon aminoskupina Lys
N-hydroxysuccinimid
NH2-
![Page 18: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/18.jpg)
-COOHProtein +
C´, Asp. Glu
COOH-
Crosslinker EDC
![Page 19: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/19.jpg)
Biotin Hydrazide bind to oxidized carbohydrates through the hydrazide group (–NH-NH2), forming a hydrazone linkage. Oxidation of glycoproteins generates reactive aldehydes that react specifically with hydrazide groups.
Cukry
hydrazid
![Page 20: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/20.jpg)
• Co je proteomika ? Proteom? Protein?
• Experimentální strategie proteomiky
• Vlastnosti AMK a proteinů
• dezintegrace, lyzace, frakcionace
• detergenty
• srážení, precipitace, denaturace
• koncentrace, filtrace
• stanovení koncentrace
• značení bílkovin
• separace proteinů
METODY PRÁCE S PROTEINY
![Page 21: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/21.jpg)
Liquid Chromatography (LC)
Liquid flow
Liquid
flow
Time 1 2 3 4 5
Separation according to:
-molecular weight/ size
-charge
-hydrophobicity
-affinity
Sample containing
proteins or peptides
•Vzorek se rozděluje mezi mobilní a stacionární (pevnou) fázi
![Page 22: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/22.jpg)
METODY Chromatografické SEPRACE BIOMOLEKUL
VELIKOST
AKTUÁLNÍ NÁBOJ
SPECIFICKÉ
INTERAKCE
Gelová filtrace
(Size-exclusion chromatography)
Iontoměničová chromatografie
(Ion exchange chromatography)
Afinitní chromatografie
(Affinity chromatography)
HYDROFOBICITA Chromatografie v reverzní fázi
(Reverse phase chromatography)
HYDROFILNOST Chromatografie hydrofilních interakcí
(Hydrophilic interaction LC)
![Page 23: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/23.jpg)
•Atmosférická
•Nízkotlaká (FPLC, MPLC)
•Vysokotlaká (HPLC)
Klesá : objem vzorku, průtok
a průměr kolony
Roste: rychlost separace
MATRIX :
• kroslinkovaný dextran (Sephadex)
• kroslinkovaná celulóza (Sephacel)
• kroslinkovaná agarosa (Sepharose)
• polyakrylamid (Sepahacryl)
• silica - kyselina ortokřemičitá
• polystyren a jiné synt. polymery
KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE (LC)
![Page 24: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/24.jpg)
SIZE-EXCLUSION CHROMATOGRAPHY
GEL-PERMEATION CHROMATOGRAPHY
Částice se v porézní matrix rozdělují na základě velikosti
Lze provádět za nativních podmínek !
Separační rozmezí až do 1000-2 000 000 Da
Vhodná pro proteiny.
GELOVÁ FILTRACE
![Page 25: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/25.jpg)
ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY
IONTOMĚNIČOVÁ CHROMATOGRAFIE
• Dělí na základě aktuálního celkového náboje
+-
Anex je pozitivně nabitý
Katex je negativně nabitý
![Page 26: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/26.jpg)
Funkční skupiny iontoměničů
![Page 27: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/27.jpg)
+++ (DEAE) - - - (CM)
KATEXANEX
- +
ELUCE:
Zvýšená iontová síla =
snížení ES interakcíZměna pH = chromatofokusace
+++ (DEAE)
ELUCE:
Zvýšená iontová síla =
snížení ES interakcíZměna pH = chromatofokusace
- - - (CM)
+-
![Page 28: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/28.jpg)
AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE
Interakce proteinu s jeho
specifickým ligandem
metabolit, kov, DNA,
protilátka…..
Eluce:
• ligand
• pH
• iontová síla
• denatuační činidlo
![Page 29: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/29.jpg)
Aktivované matrice:
NHS Sepharose……lze vázat za aminoskupinu (succiimid)
CNBr Sepharose…..lze vázat za aminoskupinu
EAH Sepharose …..lze vázat protein za karboxyl (karbodiimid)
Thiol sepharose……lze vázat za SH cysteinu
Matrice s afinitou pro IgG
Protein G Sepharose
Protein A sepharose
Protein A, G magnetic beads
Matrice s afinitou pro glykoproteiny
ConA Sepharose
Velké ligandy (DNA, protein) lze vázat přímo na matrix.
Malé ligandy (nukleotid, NADP, hormon…) se váží přes inertní „spacer arm“.
AFINITNÍ MATRIX
![Page 30: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/30.jpg)
REVERZNÍ FÁZE (REVERSE PHASE CHROMATOGRAPHY)
Dělení na základě interakce s hydrofobní matricí
(na základě odlišné hydrofobicity peptidů/proteinů)
•Matrice a ligand:
vysoce hydrofobní
alifatické řetězce
•Vzorek je v hydrofilním
rozpouštědle
•Eluce: gradientem
organického rozpouštědla
![Page 31: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/31.jpg)
H3
Matrice - nerozpustná, odolná organice a vysokému tlaku
– silica, polystyren…
Ligandy – hydrofobní alifatické řetězce C2-C18
Vhodnost: proteiny, peptidy
Kompatibilita s MS!
C18
![Page 32: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/32.jpg)
HILIC – hydrophilic interaction liquid
chromatography
(chromatografie hydrofilních interakcí)
Stacionární fáze – polární, retenční čas roste s polaritou analytu
Mobilní fáze – organické rozpoštědlo, eluce zvyšující se polaritou
(podílem vody a/nebo soli)
Dělí analyty na základě jejich schopnosti polárních interakcí
Komplexní proces - Podílí se více typů interakcí a mechanismů separace
Polární interakce OH peptidu s
polární skupinou stacionární fáze
![Page 33: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/33.jpg)
HILIC matrice
![Page 34: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/34.jpg)
Nano
HPLC25-100 μm 24-4000 nL/min
Capillary
HPLC
100-100
μm0.4-200 μL/min
Micro
HPLC
1.0-2.1
mm50-1000 μL/min
Normal
HPLC
4.0-5.0
mm1.0 -10.0 mL/min
Vnitřní průměr
kolony Průtok
HPLC podle průtoku
On-line MS
![Page 35: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/35.jpg)
Zip-TipsMacrotrapHPLC
![Page 36: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/36.jpg)
Komplexita proteomu – Kolik je proteinů?
~20 600 lidských genů
Kódující
gen
mRNA
mRNA
mRNA
mRNA
mRNA
? mRNA ?
x 4-6 variant
??? Proteinů ???
JAK JE DEFINOVÁN PROTEIN?
GENOCENTRICKÝ vs. PROTEOCENTRICKÝ POHLED
PROTEIN a PROTEOFORMA
![Page 37: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/37.jpg)
Jaká je koncentrace jednotlivých proteinů
a dynamický rozsah?
V savčí buňce: 1-10 000 000 kopií/buňku (108)
V séru/plazmě: pg/ml až mg/ml (1010)
![Page 38: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/38.jpg)
Separace směsi BÍLKOVIN
Elektroforéza, chromatografie a jejich kombinace
Štěpení vybraných
bílkovin + čištění
peptidů
Získání hmotnostních
spekter
Měření přesné hmotnosti peptidů
( a jejich fragmentů)
Identifikace bílkovin (+ kvantifikace)
Porovnání hmotností sady
peptidů (jejich fragmentů) s
údaji o všech dostupných
ORFs v databázích
PROTEOMICKÝ EXPERIMENT
Štěpení všech
bílkovin (trypsin)
Separace směsi PEPTIDŮ
„SHOT-GUN“
STRATEGIE
„KLASICKÁ“
STRATEGIE
![Page 39: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/39.jpg)
KLASICKÁ
STRATEGIE
2-DE-MS
„SHOT-GUN“
STRATEGIE2D-LC-MS
IEF-LC-MS
(proteiny)
(peptidy)
![Page 40: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/40.jpg)
• chromatografie
• elektroforézy
SEPARAČNÍ METODY
2-DE • příprava vzorků
• izoelektrická fokusace
• ekvilibrace
• SDS-PAGE
• detekce bílkovin a DIGE
• zpracování dat a vyhodnocení
• digesce vzorku a extrakce peptidů
• limty a záludnosti 2-DE
![Page 41: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/41.jpg)
Liquid Chromatography (LC)
Liquid flow
Liquid
flow
Time 1 2 3 4 5
Separation according to:
-molecular weight/ size
-charge
-hydrophobicity
-affinity
Sample containing
proteins or peptides
•Vzorek se rozděluje mezi mobilní a stacionární (pevnou) fázi
![Page 42: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/42.jpg)
METODY Chromatografické SEPRACE BIOMOLEKUL
VELIKOST
AKTUÁLNÍ NÁBOJ
SPECIFICKÉ
INTERAKCE
Gelová filtrace
(Size-exclusion chromatography)
Iontoměničová chromatografie
(Ion exchange chromatography)
Afinitní chromatografie
(Affinity chromatography)
HYDROFOBICITA Chromatografie v reverzní fázi
(Reverse phase chromatography)
HYDROFILNOST Chromatografie hydrofilních interakcí
(Hydrophilic interaction LC)
![Page 43: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/43.jpg)
•Atmosférická
•Nízkotlaká (FPLC, MPLC)
•Vysokotlaká (HPLC)
Klesá : objem vzorku, průtok
a průměr kolony
Roste: rychlost separace
MATRIX :
• kroslinkovaný dextran (Sephadex)
• kroslinkovaná celulóza (Sephacel)
• kroslinkovaná agarosa (Sepharose)
• polyakrylamid (Sepahacryl)
• silica - kyselina ortokřemičitá
• polystyren a jiné synt. polymery
KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE (LC)
![Page 44: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/44.jpg)
SIZE-EXCLUSION CHROMATOGRAPHY
GEL-PERMEATION CHROMATOGRAPHY
Částice se v porézní matrix rozdělují na základě velikosti
Lze provádět za nativních podmínek !
Separační rozmezí až do 1000-2 000 000 Da
Vhodná pro proteiny.
GELOVÁ FILTRACE
![Page 45: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/45.jpg)
ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY
IONTOMĚNIČOVÁ CHROMATOGRAFIE
• Dělí na základě aktuálního celkového náboje
+-
Anex je pozitivně nabitý
Katex je negativně nabitý
![Page 46: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/46.jpg)
Funkční skupiny iontoměničů
![Page 47: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/47.jpg)
+++ (DEAE) - - - (CM)
KATEXANEX
- +
ELUCE:
Zvýšená iontová síla =
snížení ES interakcíZměna pH = chromatofokusace
+++ (DEAE)
ELUCE:
Zvýšená iontová síla =
snížení ES interakcíZměna pH = chromatofokusace
- - - (CM)
+-
![Page 48: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/48.jpg)
AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE
Interakce proteinu s jeho
specifickým ligandem
metabolit, kov, DNA,
protilátka…..
Eluce:
• ligand
• pH
• iontová síla
• denatuační činidlo
![Page 49: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/49.jpg)
Aktivované matrice:
NHS Sepharose……lze vázat za aminoskupinu (NHsucciimid)
CNBr Sepharose…..lze vázat za aminoskupinu
EAH Sepharose …..lze vázat protein za karboxyl (karbodiimid)
Thiol sepharose……lze vázat za SH cysteinu
Matrice s afinitou pro IgG
Protein G Sepharose
Protein A sepharose
Protein A, G magnetic beads
Matrice s afinitou pro glykoproteiny
ConA Sepharose
Velké ligandy (DNA, protein) lze vázat přímo na matrix.
Malé ligandy (nukleotid, NADP, hormon…) možnost vazby přes inertní „spacer arm“.
AFINITNÍ MATRIX
![Page 50: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/50.jpg)
REVERZNÍ FÁZE (REVERSE PHASE CHROMATOGRAPHY)
Dělení na základě interakce s hydrofobní matricí
(na základě odlišné hydrofobicity peptidů/proteinů)
H3
Matrice - nerozpustná, odolná organice a vysokému tlaku
– silica, polystyren…
Ligandy – hydrofobní alifatické řetězce C2-C18
Vhodnost: proteiny, peptidy
Kompatibilita s MS!
C18
![Page 51: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/51.jpg)
REVERZNÍ FÁZE (REVERSE PHASE CHROMATOGRAPHY)
Dělení na základě interakce s hydrofobní matricí
(na základě odlišné hydrofobicity peptidů/proteinů)
•Matrice a ligand:
vysoce hydrofobní
alifatické řetězce
•Vzorek je v hydrofilním
rozpouštědle
•Eluce: gradientem
organického rozpouštědla
![Page 52: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/52.jpg)
HILIC – hydrophilic interaction liquid
chromatography
(chromatografie hydrofilních interakcí)
Stacionární fáze – polární, retenční čas roste s polaritou analytu
Mobilní fáze – organické rozpoštědlo, eluce zvyšující se polaritou
(podílem vody a/nebo soli)
Dělí analyty na základě jejich schopnosti polárních interakcí
Komplexní proces - Podílí se více typů interakcí a mechanismů separace
Polární interakce OH peptidu s
polární skupinou stacionární fáze
![Page 53: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/53.jpg)
HILIC matrice
![Page 54: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/54.jpg)
Nano
HPLC25-100 μm 24-4000 nL/min
Capillary
HPLC
100-100
μm0.4-200 μL/min
Micro
HPLC
1.0-2.1
mm50-1000 μL/min
Normal
HPLC
4.0-5.0
mm1.0 -10.0 mL/min
Vnitřní průměr
kolony Průtok
HPLC podle průtoku
On-line MS
![Page 55: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/55.jpg)
Zip-TipsMacrotrapHPLC
![Page 56: Prezentace aplikace PowerPoint - biocev.lf1.cuni.cz filevýsledkem je fyzická agregace, „zamotají“ se do sebe - pokud je I nízká, a pH daleko od pI, protein nemusíprecipitovat](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022022805/5ca5f92688c99388498d5089/html5/thumbnails/56.jpg)