LABORATORIO CLINICO DE REFERENCIAREFERENCIA

PROLABPROLAB

GRUPO DE INVESTIGACIONES YGRUPO DE INVESTIGACIONES Y EPIDEMIOLOGIA

MEDELLIN ANTIOQUIAMEDELLIN, ANTIOQUIA2010

Fabio Restrepo Restrepo, MDMedico microbiólogo laboratorista

G t S l d PúbliGerente en Salud Pública

Natalia Loaiza DíazMédico Magister en Microbiología

Marcela Arrubla VillaBacterióloga Epidemióloga

Sandra Patricia Cossio CossioSandra Patricia Cossio CossioBacterióloga Área Inmunología

Jaime Ordóñez Molina MD PhDJaime Ordóñez Molina, MD, PhDAsesor, Epidemiólogo

AGRADECIMIENTOS

Al laboratorio Clínico PROLAB, sus directivas y a todo su gran equipo profesional, por su apoyo y decisión en g q p p p p y yel desarrollo de la investigación, a la casa comercial

Quick por facilitar logística a la investigación, asi como l U i id d CES í l di ña la Universidad CES por su asesoría en el diseño epidemiológico y desarrollo de la investigación.

ESTRUCTURA DE LA HEMOGLOBINAESTRUCTURA DE LA HEMOGLOBINA

PESO MOLECULAR 64456 kDALTONSPESO MOLECULAR 64456 kDALTONS

COMPONENTE PROTEICO: GLOBINA

ES UN TETRÁMERO

4 SUBUNIDADES POLIPEPTÍDICAS:

C/U CON UN BOLSILLO EXTERIOR

ENTRE LAS 4 :UNA CAVIDAD CENTRAL

2 α (141 AA)Y 2 NO α (146AA)

LAS CADENAS DE GLOBINASLAS CADENAS DE GLOBINAS

SonSon laslas subunidadessubunidades proteicas,proteicas, enen lala moléculamolécula dedehemoglobinahemoglobina hayhay 44 globinasglobinas concon unun grupogrupo hemohemo enenhemoglobinahemoglobina hayhay 44 globinas,globinas, concon unun grupogrupo hemohemo enencadacada unauna dede ellasellas (( totaltotal cuatrocuatro hemohemo))..

TiposTipos dede cadenascadenas globínicasglobínicas:: alfaalfa αα ,, betabeta ββ,, gammagamma γγ,,deltadelta δδ,, épsilonépsilon εε,, yy zetazeta ξξ..deltadelta δδ,, épsilonépsilon εε,, yy zetazeta ξξ..

VaríanVarían segúnsegún lala especieespecie yy sonson expresadasexpresadas enen diferentesdiferentesVaríanVarían segúnsegún lala especie,especie, yy sonson expresadasexpresadas enen diferentesdiferentesetapasetapas deldel desarrollodesarrollo..

SINTESIS Y PRESENTACIÓN DE LA HEMOGLOBINA A SINTESIS Y PRESENTACIÓN DE LA HEMOGLOBINA A LO LARGO DEL DESARROLLOLO LARGO DEL DESARROLLOLO LARGO DEL DESARROLLO.LO LARGO DEL DESARROLLO.

Embrión, Gower I: (ξξ22-- εε22).).Gower II: (αα22 -- εε22))

Saco vitelino Saco vitelinoGower II: (αα22 εε22).).Portland I: (ξξ 22-- γγ22).).Portland II: (ξξ2 2 . . ββ22).).Portland III: (Portland III: (ξξ 22-- δδ22).).((ξξ ))

8 semana

HígadoHemoglobina Fetal F : (αα22-- γγ22).).> 10% de Hb A: (> 10% de Hb A: (αα22-- ββ22))

18 semana-nacimiento.

Medula ósea. 6 meses de vida la Hb F ha bajadoa un 2 - 3%a un 2 3%.

* En el adulto: Hb A (>90%) y Hb minoritaria A2 ( 2.0 – 3.0%) (αα22-- δδ2).2).

HEMOGLOBINA NORMAL DEL ADULTO

TIPO DETIPO DE HbHb ESTRUCTURAESTRUCTURATIPO DE TIPO DE HbHb ESTRUCTURAESTRUCTURA

ß2ß2A (96%)A (96%) αα 2 2 ß2ß2

A2(2.5A2(2.5--3%)3%) αα 22δ2δ2

F(<1%)F(<1%) αα 2 2 γγ22

FUNCIONES DE LA HEMOGLOBINAFUNCIONES DE LA HEMOGLOBINAFUNCIONES DE LA HEMOGLOBINAFUNCIONES DE LA HEMOGLOBINA

Transporte de oxigeno OTransporte de oxigeno O22 desde los pulmones hasta los desde los pulmones hasta los tejidos y de anhídrido carbónico C0tejidos y de anhídrido carbónico C022 en sentido inverso.en sentido inverso.

Cada molécula de HEMOGLOBINA, puede unirse a un Cada molécula de HEMOGLOBINA, puede unirse a un máximo de cuatro moléculas de Omáximo de cuatro moléculas de O22 una por cada HEMOuna por cada HEMOmáximo de cuatro moléculas de Omáximo de cuatro moléculas de O2 2 una por cada HEMO.una por cada HEMO.

HEMOGLOBINA + O2 REVERSIBLEHEMOGLOBINA + O2 REVERSIBLEHEMOGLOBINA + O2 REVERSIBLE.HEMOGLOBINA + O2 REVERSIBLE.

•La ( ) de O2 ó la Po2 ⇑ = Hb+ O2 (saturación).•Po2 ⇓ = Hb libera O2.

El ERITROCITOEl ERITROCITOEs un disco bicóncavo el cual posee una depresión central, esta Es un disco bicóncavo el cual posee una depresión central, esta desprovisto de desprovisto de organelasorganelas, su misión fundamental es transportar y proteger , su misión fundamental es transportar y proteger ll HEMOGLOBINAHEMOGLOBINA d li f ió i t id li f ió i t i

SobrevidaSobrevida:: 120120 díasdías

la la HEMOGLOBINAHEMOGLOBINA para que pueda realizar su función respiratoria.para que pueda realizar su función respiratoria.

SobrevidaSobrevida:: 120120 díasdías..

RecorreRecorre 600600 KmKm.. dede territorioterritorioll ddvascular,vascular, pasapasa porpor vasosvasos dede

diámetrodiámetro 1010 vecesveces inferiorinferior alalsuyosuyo..

Alta capacidad de Alta capacidad de deformabilidaddeformabilidad..

ElEl eritrocitoeritrocito senilsenil eses eliminadoeliminadoporpor elel SMFSMF deldel bazobazo

•• El producto final de la muerte y El producto final de la muerte y catabolismo del eritrocito es la catabolismo del eritrocito es la porpor elel SMFSMF deldel bazobazo..bilirrubina.bilirrubina.

ESTRUCTURALES:

DEFECTOS HEREDITARIOS EN LA ESTRUCTURA DEDEFECTOS HEREDITARIOS EN LA ESTRUCTURA DE LA GLOBINA

(CUALITATIVAS)(CUALITATIVAS)

NO ESTRUCTURALES

DEFECTOS HEREDITARIOS EN LA TASA DEDEFECTOS HEREDITARIOS EN LA TASA DE SÍNTESIS DE ALGUNA DE LAS CADENAS DE

GLOBINA

(CUANTITATIVAS)

ESTRUCTURALES:

-- MUTACIÓN PUNTUAL: SUSTITUCIÓN DE UN

AMINO ACIDO POR OTRO HbS HbCAMINO ACIDO POR OTRO, HbS, HbC

-- MUTACIONES : SUSTITUCIÓN DE 2 AA

DELECIÓN DE UNO O MÁS AA-- DELECIÓN DE UNO O MÁS AA

-- ALARGAMIENTO DE UNA DE LAS CADENAS

FUSIÓN DE CADENAS-- FUSIÓN DE CADENAS

-- MÁS DE 700 VARIANTES DE DIFERENTE

Í ÍEXPRESIVIDAD CLÍNICA(LA MAYORÍA SON

BENIGNAS)

ESTRUCTURALES:

FORMACIÓN DE POLÍMEROS (TACTOIDES)( )

DISTORSIÓN DE LA FORMA (FALCIFORMACIÓN)

DISMINUCIÓN DE LA SOLUBILIDAD, PRECIPITACIÓN

(IRREVERSIBLE)(IRREVERSIBLE)

ESTANCAMIENTO

DISMINUCIÓN LOCAL DE PO2

MODIFICACIÓN DE LA CARGA :MENOS NEGATIVA

TALASEMIAS:TALASEMIAS: Grupo de trastornos genéticos en la síntesis de Grupo de trastornos genéticos en la síntesis de

hemoglobina, en los que se forman cadenas hemoglobina, en los que se forman cadenas globínicasglobínicas de estructura de estructura g qg q gg

normal pero se sintetizan a menor velocidad.normal pero se sintetizan a menor velocidad.

αα TalasemiasTalasemias:: DisminuciónDisminución enen lala sintsint.. dede lala cadenacadena αα..

ββ TalasemiasTalasemias:: DisminuciónDisminución enen lala síntesissíntesis dede lala cadenacadena ββ..

PROBABILIDADESPROBABILIDADESPROBABILIDADESPROBABILIDADES

NORMALAA

PORTADORAS/AC/Aß+

ENFERMOSS/SC/Sß+

PROBABILIDADESPROBABILIDADESPROBABILIDADESPROBABILIDADES

AA X AA

AA = 100%

PROBABILIDADESPROBABILIDADESPROBABILIDADESPROBABILIDADES

AA X ASAA X AS

AA = 50%

AS = 50%

PROBABILIDADESPROBABILIDADESPROBABILIDADESPROBABILIDADES

AA X ACAA X AC

AA = 50%

AC = 50%

PROBABILIDADESPROBABILIDADESPROBABILIDADESPROBABILIDADESDOS PORTADORES

SILENCIOSOS

AS X AS

SILENCIOSOS

AS X AS

AA = 25%

AS = 50%AS = 50%

SS = 25%

PROBABILIDADESPROBABILIDADESDOS PORTADORES

SILENCIOSOS

AS X Aß+

AA = 25%

AS 25%

Aß+ = 25%

AS = 25%

Sß+ = 25%

PROBABILIDADESPROBABILIDADESDOS PORTADORES

SILENCIOSOS

AS X AC

AA = 25%

AS 25%

AC = 25%

AS = 25%

SC = 25%

PROBABILIDADESPROBABILIDADESPROBABILIDADESPROBABILIDADES

AA X SS

AS = 100%

MANIFESTACIONESAnemia Anemia hemoliticahemolitica cronicacronica

MANIFESTACIONES CLÍNICAS:

ANEMIA Vaso oclusión de la Vaso oclusión de la ANEMIA

DOLOR ARTICULARmicrovasculaturamicrovasculatura(necrosis)(necrosis)

NECROSIS ÓSEA

INFARTO DE ÓRGANOSInfecciones Infecciones

INFARTO DE ÓRGANOS

ASINTOMÁTICA Secuestro esplénico agudoSecuestro esplénico agudo

Úlcera vascular Necrosis de cadera

Complicaciones De HbSSComplicaciones De HbSS

Causas de Dolor AgudoCausas de Dolor AgudoCausas de Dolor Agudo.Causas de Dolor Agudo.–– Crisis vaso oclusiva.Crisis vaso oclusiva.–– Síndrome Síndrome torátoráccicoico agudo.agudo.–– Síndrome manoSíndrome mano--pie.pie.–– Secuestro esplénico.Secuestro esplénico.–– PriapismoPriapismo–– Priapismo.Priapismo.–– Síndrome del cuadrante superior derecho.Síndrome del cuadrante superior derecho.

Epidemiología de las Hemoglobinopatías

Se estima que alrededor de 250 millones de personas en el mundo (4.5%) sonportadoras de un gen de la hemoglobina potencialmente patológico

Cada año nacen unos 300.000 niños afectados

La enfermedad de células falciformes constituye alrededor del 70% de ylas alteraciones de la hemoglobina en el mundo.

En Estados Unidos país con una elevada proporción de población negra seEn Estados Unidos, país con una elevada proporción de población negra, se estima que la anemia de células falciformes afecta aproximadamente a unas 72.000 personas y hasta uno de cada 1.000 nacidos vivos puede presentarla.presentarla.

En Europa el porcentaje de portadores de hemoglobinopatías se sitúo, según un documento publicado en 1995, entre el 9% para Grecia o el 5% para Italia y el 0.14% para Dinamarca o el 0.19% para Alemania, lo que indica la existencia de gran variación entre países.

En Australia (Melbourne) un estudio realizado en el año 1999 en mujeres embarazadas puso de manifiesto que EL 6% de la población estudiada eraembarazadas, puso de manifiesto que EL 6% de la población estudiada era portadora de algún tipo de hemoglobinopatía, siendo la más frecuente la betatalasemia con un 3%, seguida de la Hemoglobina S con un 1.8%.

La mayor prevalencia de hemoglobinopatias está centrada en las regiones del área Mediterránea, Norte de África. Oriente Medio, India, Sudeste de Asia y Sur de China, en las que la frecuencia de portadores se sitúa entre el 1 y el 20% í á G C C f20%. En países mediterráneos como Grecia, Chipre o Cerdeña esta cifra se sitúa entre el 13 y el 18%.

Organización Mundial de la Salud dos resoluciones sobre las hemoglobinopatías. Resolución de la 59ª Asamblea Mundial de la Salud (mayo de 2006) sobre la anemia falciforme y la resolución de la 118ª reunión del Consejo Ejecutivo de la OMS b l t l iOMS sobre la talasemia.-Se pide a los países afectados y a la Secretaría de la OMS que fortalezcan su respuesta a estos trastornos. Concretamente, la OMS:

- Llevará a cabo una labor de concienciación de la comunidad internacional acerca de la carga mundial de estos trastornos;

Fomentará el acceso equitativo a los servicios de salud;- Fomentará el acceso equitativo a los servicios de salud; - Prestará apoyo técnico a los países en materia de prevención y tratamiento de estos trastornos, y Fomentará y apoyará la investigación para mejorar la calidad de vida de los afectados29de vida de los afectados .

29 Organización Mundial de la Salud. Drepanocitosis y otras hemoglobinopatías. Nota descriptiva No 308, Agosto 2006

Frecuencia de hemoglobinopatías reportadas para diferentes regiones del país.Frecuencia de hemoglobinopatías reportadas para diferentes regiones del país.

FRECUENCIA DE HEMOGLOBINOPATIAS REPORTADAS PARA VARIAS REGIONES DEL PAIS

ESTUDIO POBLACION MUESTRA FRECUENCIA

Restrepo y cols.

Espinel

Mixta

Negra

2.817

1 043

7.6%

3 8%Espinel

Bernal y cols.

Silva y cols

Negra

Mixta

Mixta

1.043

544

230

3.8%

14.3%

10 0%Silva y cols. Mixta 230 10.0%

Porque investigar sobre hemoglobinopatias?

- Prevalencia alta de la enfermedad a nivel mundial

- Programas de tamizaje universal en otros países

-Recursos técnicos y logísticos presentes en nuestro país

-Ofrecer alternativas profilácticas y terapéuticas oportunas

E t di i il t i d l d- Estudios similares en otras regiones del mundo

DESARROLLO DE LA INVESTIGACION

- Revisión de literatura, recopilación de bibliografia, orientada a estudios de prevalencia en el mundo y latinoaméricaprevalencia en el mundo y latinoamérica

- Diseño del estudio y asesoría epidemiológica y estadística

- Presentación de Anteproyecto

- Desarrollo CronológicoDesarrollo Cronológico

- Apoyo logístico con casa comercial

- Apoyo con universidad CES, para diseño epidemiológico y desarrollo de la investigación

- Inicio de procesamiento de muestras y recopilación de datos.

-Estudio de tipo prospectivo ……………..prevalencia de hemoglobinopatías

- Población de recién nacidos del área metropolitana de la ciudad de Medellín,

- Febrero y Agosto de 2009.

- Software estadístico Epi-Info

-Muestra….. 520 muestras………………. prevalencia esperada del 7% d t dí ti í i d 80%poder estadístico mínimo de 80% y

intervalo de confianza del 95%.

-Se aumento la muestra de estudio a 2637Se aumento poder estadístico a casi el 100%,

Disminuyendo los errores tipo 1 y 2 al mínimo.

-Muestras que llegan al laboratorio clínico PROLAB Papel de filtro de cordón umbilical de Recien NacidosPapel de filtro de cordón umbilical de Recien NacidosHospitales públicos y privados TSH Neonatal.

Procesamiento en la sección de Pruebas Especiales del laboratorio, 1º test de tamizaje de TSH neonatal2º Determinación de hemoglobinas normales y anormales2º Determinación de hemoglobinas normales y anormales

VARIANT IIcromatografía liquida de alta resolución (HPLC)separa e identifica las diferentes fracciones de hemoglobinas: Fetal (F)separa e identifica las diferentes fracciones de hemoglobinas: Fetal (F), A1c, Adulto (A), S, C, E/A2 y D.

Punto de referencia : 1% del área total de la hemoglobinaPunto de referencia : 1% del área total de la hemoglobinaAnte la presencia de una hemoglobina anormal o variante, Confirmación por electroforesis en medio alcalino y o ácido como método de referencia para detectar y diferenciar hemoglobinasde referencia para detectar y diferenciar hemoglobinas.

C i i d h dCriterios de rechazo de muestras:

Muestras que no traspasaban el papel de filtro Muestras con secado insuficienteMuestras con secado insuficienteMuestras diluídas con haloMuestras con coágulosMuestras con coágulosMuestras sobresaturadas

VARIANT II HEMOGLOBIN TESTING SISTEM (Bio-Rad).

-Intercambio catiónico, tiempo de retención.

-espectrofotómetro a dos longitudes de onda, una inicial a 415 nm y una final de 690 nm

- Dos controles de calidad interno, con distintas variantes de hemoglobina. El control 1

(C1) constituido por hemoglobinas F, A, A2/, E, S y el control 2 (C2) por hemoglobina

F, A, D, C.

RESULTADOSRESULTADOSTotal de muestras recibidas

2637recibidasTotal de muestras descartadas

10 0.4%

T t l d t 2627 100%Tatal de muestras analizadas

2627 100%

Total muestras positivas 93 3.53%Hb por tipos:

HbS 54 58%HbC 38 41%HbD 1 1.%HbSC 0HbSC 0HbSD 0HbA2 0

RESULTADOS

Sensibilidad de la prueba en los

lt d

100%

resultados

Especificidad de la prueba en los

99.1%prueba en los resultados

Valor PP 75.5%

Valor PN 100.0%

Total de muestras 43 100 % de correlaciónanalizadas por electroforesis

con la cromatografia

HbS 29HbS 29

HbC 13

HbD 1HbD 1