Nuove proposte a livellointernazionale per laapplicazione di metodi rapidi e innovativi per la ricerca di batteri e virus negli alimenti

D. De Medici e M. Paniconi

“FOCUS SU SICUREZZA D’USO E NUTRIZIONALE DEGLI ALIMENTI” Roma 21 - 22 novembre 2005

Metodi classici per la determinazione di patogeni

• Lunghi (4-6 giorni)• Costosi• Non quantitativi• MPN

Metodi alternativi

•Rapidi

•Meno costosi

•Automatizzati

•Possibilmente quantitativi

Armonizzazione e Standardizzazione di un nuovo metodo microbiologico

Validazione del metodo attraverso ring trial interlaboratorio

Definizioni di linee guida.Corsi di training

Metodo standardizzato

Identificazione dei metodi riportati in letteratura

Valutazione delle tecniche di preparazione del campione in relazione alle matrici

Comparazione intralaboratorio delle performance dei differenti metodi A

rmoniz

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Sta

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ISO, CEN, UNI

Attività di laboratorio

Attività di normazione

Progetti di ricerca

Metodi Rapidi: attività di normazione

• ISO 16140:2003 CEN/TC 275/WG 6: Microbial

contamination

• CEN/TC275 WG 6 TAG3 "General requirements relating to methods of detecting microorganisms in foodstuffs using PCR"

• CEN/TC275 WG 6 TAG4 "Detection of Viruses in food"

Progetti Europei5th Framework• FoodPCR• Foodborne virus in Europe

6th Framework• FoodPCR 2• SeaFoodPlus

Food-PCRValidation and Standardization of Diagnostic Polymerase Chain Reaction for Detection of Foodborne Pathogens5th Framework Program, Project QLK1-CT-1999-00226

Coordinator: Jeffrey Hoorfar, DFVF

Total budget: 2.5 MIO Euro, 1.7 MIO Euro EC funding

12 expert and 24 end-user laboratories from EU and other European countries (Italy ISS and CoopItalia)

www.pcr.dk

Patogeni studiati

•Salmonella spp.

•Foodborne thermotolerant Campylobacter spp.:

(C. jejuni, C. coli, C. lari)

•Enterohemorragic Eschericia coli (EHEC)

•Listeria monocytogenes

•Yersinia enterocolitica

Organizzazione del progettoWP1: Construction of DNA banks

WP2: Validation of thermocyclers

WP3: Pre-PCR sample treatment

WP4: Collaborative trials

WP5: Automated detection

WP6: Guidelines, standards and workshops

Risultati ottenuti• Reference DNA for each pathogen

• Thermocycler validation study

• Optimized PCR for each pathogen assay

• Pre-PCR treatments for carcass swab, carcass rinse, and milk

• 4 + 1 validated PCR assays

• > 30 publications.

AQUA DEST50µl

TEMPERATURE RECORDING UNIT

FIX THE LOCATION OF THE THERMOSENSORWITHIN THE PCR TUBE

SCHODER et al. 2001

Thermocycler validation study

Biochemical Testing: Amplification efficiency

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A a aB b bC c cD d d

E a a b c d aF b bG c cH d d

Positioning pattern:• a, b, c and d reaction equivalents to ≅ 15000, 1500, 150 and 15 target copies• five replicates

Time Temp.

InitialDenaturing 1 min 95°C

Denaturing 10 s 95°C

Annealing 20 s 63°C

Elongation 20 s 72°C

TerminalElongation 5 min 72°C

PCR conditions:• 40 PCR cycles• modified thermosensitive target sequence, similar to Penicillin binding factor A from Listeria• amplicon of 116 bp

Kuhn et al. 2001

Results of the collaborative trials of the PCR-based methods

54.381.869.730.3Y. enterocolitica /Swine carcass

10010084.6100Salmonella spp. /Poultry carcass

10010084.6100Salmonella spp. /Swine carcass

10010010092.6EHEC / Cattle carcass

10010010096.7Campylobacter /Poultry carcass

95.696.1 83.394.2Campylobacter / Swine carcass

Concordance (%)Accordance (%)Specificity

(%)Sensitivity

(%)

Una reazione di PCR negativa può essere dovuta a vari fattori: assenza del target, malfunzionamento dell’apparecchio, presenza di sostanze inibenti, scarsa attività della polimerasi ecc.

Necessità di validare attraverso ring trial internazionali solo metodi che includono la presenza di Internal AmplificationControl (IAC).

Un risultato falsamente negativo è un problema di sanità pubblicaUn risultato falsamente positivo è un problema commerciale

FOOD-PCR 2WP 10 of MedVetNet Network of Excellence, www.MedVetNet.org

WP leader: DFVF

19 partners: 9 main (funded) and 10 associated (no funding).

12 countries.

18 months: Sept. 1st 2004 – March 1st 2006.

Budget: 251 000 Euro, incl. 210 000 Euro from EC.

5 tasks and 6 deliverables.

www.foodpcr.com

Central Service Laboratory -York

National Veterinary and Food Research Institute

Università di Vienna

Congen-Berlino

Università di Giessen

Università di Liegi

Iceland FisheringLaboratories

Danish Meat ResearchInstitute

Instituto di Ricerca e Tecnologia Alimentare

WP1 Microarraystandardization

WP2 General requirements for real-time PCR standardization:

WP3 Preparation of ring-trials andreference materials for Salmonella

WP4 PCR testing ofanimal faeces

WP5 Standards for virus in produce

Real-Time PCR in Italia•10 Istituti Zooprofilattici Sperimentali •Istituto Superiore di Sanità -Roma•Consorzio di Bioingegneria e Informatica (Pavia)•Università Cattolica del Sacro Cuore - Piacenza

Ricerca Finalizzata 2005: Sicurezza Alimentare: studio e applicazione di modelli di controllo e di microbiologia predittiva su base Real-TimePCR per valutare la presenza e il comportamento di patogeni in prodotti tradizionali italiani

Responsabile: Dr.ssa N. Losio IZS della Lombardia e dell’Emilia

Validazione di due metodi per la ricerca e numerazione della Listeria monocytogenes e della Salmonella in prodotti tipici italiani

Rapid detection of transnational foodborneviral infections and elucidation of transmission routes through moleculartracing and development of a common databaseA research proposal on “Quality of Life and Management of Living Resources”(1999/C 64/14)

FBVE Network

11 centri ricerca in 9 Paesi

ISS:L. Croci,

D. De MediciF.M. Ruggeri

RIVM

M. Koopmans

Risultati del FBVEIl progetto prevedeva principalmente lo sviluppo di un data base europeo per l’archiviazione delle sequenze dei virus enterici isolati in E.U. (https://hypocrates.rivm.nl/bnwww/)

Sviluppo e validazione di metodi di Real-TimePCR quantitativi per la determinazione di HAV e norovirus in molluschi

Attività di normazione nel CEN

CEN/TC275 WG 6 TAG3 "General requirements relating to methods of detecting micro-organisms in foodstuffs using PCR"

Inizio dei lavori:Berlino Dicembre 2000

10 riunioni

CEN/TC275 WG 6 TAG4 "Detection of Viruses in food“

Inizio Lavori: Saint Denis Marzo 2004

3 riunioni

CEN/TC275 WG 6 TAG3 "General requirements relating to methods of detecting microorganisms

in foodstuffs using PCR"EN ISO 22714

Microbiology of food and animal feeding stuffs – Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens – General requirements and definition

Lo standard EN-ISO 22174 è stato pubblicato il 15-02-2005

CEN ISO TS 20836

Microbiology of food and animal feeding stuffs – Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens –Performance criteria for thermal cycler

La specificazione tecnica CEN ISO/TS 20836 è stata adottata e pubblicata ad

Agosto 2005

CEN/TC275 WG 6 TAG3 "General requirements relating to methods of detecting microorganisms in foodstuffs

using PCR"

prEN ISO TS 20837

Microbiology of food and animal feeding stuffs – Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens – Requirements of sample preparation for qualitative methods

prEN ISO TS 20838

Microbiology of food and animal feeding stuffs – Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens –Requirements for amplification and detection for qualitative methods.

Lo votazione per questi due standard è iniziata a settembre 2005

ISO 22174 General requirements and

• Procedura analitica• Aree di lavoro• Controlli da effettuare

ISO 22174 Procedura analitica

• Pre-arricchimento del campione• Estrazione e purificazione del DNA o RNA • Amplificazione con primers specifici• Determinazione dei prodotti della PCR• I campioni positivi possono (dovrebbero)

essere confermati utilizzando i metodi colturali*

* la positività del campione deve essere confermata quando esiste un metodo culturale ISO

ISO 22174 StruttureIl laboratorio deve disporre di un minimo di quattro

aree separate:a) Preparazione della soluzione di acidi nucleici da

materiale da saggiob) Preparazione delle mastermixc) Preparazione delle miscele di amplificazione con

l’aggiunta delle soluzioni di acidi nucleicid) Determinazione e conferma dei prodotti della PCR

L’amplificazione può essere effettuata sia nell’area c) che d)Se il termal-cycler è posta nell’area c) i tubi dopo amplificazione non possono essere aperti nell’area c) ma nell’area d).

ISO 22174 Controlli

Determinazione

Amplificazione

Estrazione DNA

Trattamento del campione

Controllo negativo

PCR

Controllo positivo

PCR

Controllo interno di

amplificazione

Controllo negativo di estrazione

Controllo positivo di processo

Controllo negativo di processo

Possibile inibizione---+--

Possibile contaminazione±±++++

negativa++-++-

positiva+±-+++

Interpretazione dei risultati

Controllo di amplificazion

e esternoIAC

Controlli negativi (processo, estrazione

PCR)

Controllo positivo

PCR

Controllo postivo di processo

Risultato del test

ISO 20836 Performance of Termal cycler

• Performance test– Annex A Biochemical performance test– Annex B Physical performance test

GRAZIE !!!!