Přehled analytických metod II.

Metody

• atomová spektrometrie (AAS, AES, kvantometry)• molekulová spektrometrie (UV/VIS, IČ, NMR)• chromatografie (GC, HPLC, TLC, CE)• hmotnostní spektrometrie• spojené techniky

Schéma spektrometrů

emise

absorpce

fluorescence,rozptyl světla

Plamenová fotometrieplamen – monochromátor – fotoelektrický násobič –

zpracování signálu

• plamen – odpaření roztoku, atomizace a excitace atomů

• (zářivou) deexcitací dochází k záření, jehož frekvence (vlnová délka) odpovídá rozdílu dvou energetických hladin elektronů

• záření prochází monochromátorem a dopadá na fotonásobič

• intenzita záření je závislá na množství analytu

Plamenová fotometrie• princip plamenové emisní spektroskopie s použitím

plamene o nízké teplotě (propan, butan, jejich směsi nebo zemní plyn)

• vlnové délky – Na+ - 589 nm, K+ - 767 nm, Ca2+ - 423 nm..

• kvantitativní analýza alkalických kovů a kovů alkalických zemin

• vhodné pro stanovení v potravinách, nápojích, hnojivech,

půdě, při těžbě kovů, v chemickém, farmaceutickém, papírenském a olejářském průmyslu

Atomová emisní spektrometrie

• atomizace a excitace atomů – zářivá deexcitace• působení vysokých energií• čím složitější elektronový obal atomu, tím složitější

spektrum (větší počet čar ve spektru)• čáry neionizovaných atomů, iontů• budící zdroj – záření (lasery), elektrická energie (oblouky,

jiskry, výboje, plazmatron), chemické energie (plameny)• disperzní systém (mřížka, hranol)• detekce – fotonásobič (historie – fotografická deska) • kvantometry – rychlá multielementární analýza

Atomová absorpční spektrometrie

výbojka s dutou katodou

plamen

zavádění aerosolu vzorku

mřížkový monochromátor

štěrbinaFN

dutá katoda – materiál ze stanovovaného kovuanoda– těžko tavitelný materiál (Zr, W..)

Atomová absorpční spektrometrie

FotonásobičMonochromátor

mřížkadutá zrcadla

uspořádání Czerny-Turner

Co s kolísáním signálu a neatomovou absorpcí ?

VDK-výbojka s dutou katodou, DV-deuteriová výbojka, PZ-polopropustná zrcadla, DZ-dutá zrcadla, MOD-modulátor (rotující clona), PL-plamen (nebo grafitová kyveta), VZ-aerosol vzorku, MON-mřížkový monochromátor, FN-fotoelektrický násobič

AAS - shrnutí

• atomizace (zmlženého) vzorku v plameni

• emise záření s charakteristickými spektrálními čárami pro stanovovaný prvek – z duté katody

• absorpce tohoto záření atomy analytu v plameni (nebo kyvetě)

• zbytek záření (neabsorbované) prochází na fotonásobič

• fotonásobič převede fotony na elektrony, zesílí signál a zaznamená proud

Molekulová spektrometrie• Ultrafialová a viditelná oblast (200 – 380 – 800 nm)• absorpcí záření určité vlnové délky dochází k excitaci valenčních elektronů• zdroj – deuteriová výbojka (UV), wolframová žárovka• disperzní systém (hranol, mřížka, filtr)• kyveta (křemenná – UV, skleněná, plastová), průtočná• detekce – fotonásobič• jednopaprskové• dvoupaprskové• diodové pole

Využití UV/VIS spektrometrie• kvalitativní analýza

– poloha a intenzita pásů ve spektru (charakteristické pro chromoforní skupiny v molekule), atlasy spekter, malé rozdíly – často doplňkové informace k dalším metodám)

• kvantitativní stanovení látek (kalibrace)

Kalibrační graf - fenol

y = 0.1542x - 0.0236R2 = 0.9979

0

0.2

0.4

0.6

0.8

0 2 4 6

koncentrace (mg/l)

abso

rban

ce

Infračervená spektrometrie (IČ, IR)• absorpce záření v oblasti (10 – 500 – 4000 – 10000)

• absorpce je spojená se změnou vibračních a rotačních stavů molekuly

• !! základní podmínka interakce IČ záření – musí docházet ke

změně dipólového momentu během vibrace – HCl absorbuje, N2

neabsorbuje, CO2 ?

• kvalitativní analýza – poloha a intenzita pásů ve spektru

• ve spektru – valenční vibrace – vzdálenost jader- deformační vibrace – valenční úhly

IČ instrumentace• zdroj záření – tuhé zářiče z polovodičových materiálů

(globar – SiC, Nernstova tyčinka oxidy zirkonia a yttria)

• disperzní systém (několik mřížek, interferometr FT-IR)

• kyvety – pro kapaliny a plyny (materiál KBr, NaCl)

• pevné vzorky – tablety s KBr, nujolová suspenze

(nasyc uhlovodíky –C20- C30), reflexní spektra

• detekce - termoelektrický článek

• zpracování signálu (odečet absorbance, v případě FT – matem. transformace, porovnání s databází)

IČ spektrum

C-halogen,mimorovinné deformační C-H

oblast otisku prstu(C-C, C-N, C-O)

valenční vibraceY-H, násobné vazby

Příklady IČ vibracíTyp vibrace Skupina Vlnočet Intenzita - OH 3600-3650 silná - OH s H-vazbou 3400-3550 silná (širší)as - NH2 3480-3500 střední

s - NH2 3370-3420 střední

as - CH3 290-2970 silná

-C=O 1850-1630 * silná(rov) - NH2 1590-1650 střední-silná

-C-Cl 600-800 silná -C-Br 500-650 silná(mimorov) p- R1-benz.-R2 800-860 silná

(mimorov) o- R1-benz.-R2 735-770 silná

IČ spektrum

C

R2

O

R1

Nukleární magnetická rezonance (NMR)• měřená látka je umístěna v silném magnetickém poli

• musí být přítomna jádra s nenulovým jaderným magnetickým momentem se

• absorpcí radiofrekvenčního záření dojde ke změně orientace magnetického momentu jádra – do vyšších energetických stavů (E1 E2)

precesní pohyb

2

00

Bv

Larmorova frekvence

2

012

hBhvEEE

gyromag. poměr jádra

do základní stavu přechází relaxačními procesy

NMR - instrumentace• magnet (supravodivý) – a - póly, b - přídavné cívky pro změnu B

• vysokofrekvenční vysílač (elektromagnetické pole je orientováno kolmo na osu vnějšího pole magnetického) - c

• sonda – kyveta se vzorkem - e

• přijímač – indukční cívka - e

• zpracování signálu (pulsní techniky – Fourierova transformace)

e, f, g – registrační část

k – kontrolní oscilokop

NMR – chemický posun• elektrony v okolí jádra ovlivňují velikost magnetické

indukce v místě jádra chemický posun

610

ST

STM

vvv

vM – frekvence měřeného pásu

vST – rezonanční frekvence standardu

(TMS)

Spin – spinová interakce a integrální intenzita signálu

A – důvod rozštěpení methylového píku- sousední methylenové protony

1:3:3:1

B – důvod rozštěpení methylenového píku - sousední methylenové protony

1:2:1

integrální intenzita signálu:odpovídá počtu protonů

NMR - aplikace

• 1H-NMR, 13C-NMR, 19F-NMR• strukturní analýza

– spolu s MS nejsilnější nástroj vůbec !!!

• kvantitativní analýza• studium rotace skupin v molekule, vodíkových vazeb

Separační techniky

• klasické techniky – destilace, extrakce, filtrace, centrifugace ..

Chromatografie• dělení podle mobilní fáze

plyn – plynová chromatografie (GC)

kapalina – kapalinová chromatografie (HPLC, TLC)

Elektromigrační techniky• kapilární elektroforéza, isoelektrické fokusace ...

Chromatografie

Plynová chromatografie

1-tlaková láhev (nebo generátor plynu), 2-regulace tlaku, 3-regulace průtoku, 4-dávkovací zařízení, 5-detektor, 6-termostat, 7-kolona, 8-zesilovač, 9,10-počítač

Plynová chromatografie• nosný plyn – N2, H2, He, Ar• dávkování vzorku – vyhřívaná nástřiková hlava

plynové vzorky (10-1000 l)kapalné vzorky (1-100 l)pevné vzorky (příprava roztoků)

split/splitless:nosnýplyn

kolona

odpad

Plynová chromatografie• kolony

dnes prakticky výhradně kapilární kolony (průměr 0,1 – 0,5 mm, délka 10 – 100 m)

W C O T S C O T P L O T

n o s ič as ta c io n á rn ífá ze

s ta c io n á rn ífá ze

so rb e n t

• sorbenty – silikagel, aktivní uhlí, molekulová síta, porézní polymery

• kapalné stacionární fáze – Carbowax (polyethylenglykol), polysiloxany, polyestery

Plynová chromatografie• detektory

- tepelně vodivostní detektor plamenový ionizační detektor

nedestruktivní, méně citlivý,univerzální

v z d u c h v o d ík

e lu á t

z a p a lo v á n í e le k tro d y+

-

destruktivní, citlivýselektivní - uhlovodíky

Plynová chromatografie• detektory

- detektor elektronového záchytu

nedestruktivní, citlivý, selektivní – halogenderiváty, nitrolátky

an o d a+

z ářičk a to d a

e lu á t

N i6 32 8

- hmotnostní spektrometr – vysoce specifický, destruktivní, velmi citlivý

Plynová chromatografie- analýza těkavých látek- netěkavé látky – derivatizace, pyrolýza- vysoká účinnost- identifikace - retenční data- kvantifikace – plocha (výška) píku- výhodná kombinace s MS

0 5 10 15 20 25 30 350.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

161514

1312

11

10

9

8

7

6

5

4

3

1

2

sign

al d

etek

toru

, mV

retenční čas, min

1. 2-chlorbifenyl, 2. 4-chlorbifenyl, 3. 2,2'-dichlorbifenyl,4. 2,4-dichlorbifenyl, 5. 4,4'-dichlorbifenyl, 6. 3,5,3'-trichlorbifenyl, 7. 2,4,4'-trichlobifenyl, 8. 2,5,2',5'-tetrachlorbifenyl, 9. 2,4,6,4'-tetrachlorbifenyl, 10. 3,4,4'-trichlorbifenyl, 11. 2,3,4,6,2'-pentachlorbifenyl, 12. 2,3,4,4'-tetrachlorbifenyl, 13. 2,3,4,5,2'-pentachlorbifenyl, 14. 2,4,5,2',4',5'-hexachlorbifenyl, 15. 2,3,4,2',4',5'- hexachlorbifenyl, 16. 2,3,4,5,2',3'-hexachlorbifenyl

GC analýza PCB

Kapalinová chromatografie1,2 – zásobníky mobilní fáze3 – programování gradientu4 – směšovač5 – odplyňovač6 – vysokotlaké čerpadlo7 – tlumič tlakových pulsů8 – trojcestný ventil9 – saturační předkolona10 – dávkovací zařízení11 – kolona12 – detektor13 – jímač frakcí14 – zesilovač15, 16 – vyhodnocování - počítač

Vysokotlaká čerpadla1. Elektromotor s krokovým motorem2. Převodovka3. Závit na táhle pístu4. Píst5. Válec naplněný MF6. Ke koloně7. Ventil umožňující plnění čerpadla MF8. Zásobník MF

velkoobjemová stříkačka

pístová čerpadla – malý objem činné části1. Elektromotor2. Převodový mechanismus3. Píst4. Pracovní prostor válce5. Výtlačný ventil6. Nasávací ventil7. Ke koloně8. Zásobník mobilní fáze9. Těsnění pístu

Dávkovací ventilySchéma dávkováníSchéma dávkování

b) vnitřní dutina a) smyčka

KolonyOvlivňování účinnosti• homogenní a rovnoměrné plnění kolony sorbentem• použití náplní s tenkou aktivní vrstvou na povrchu• zmenšování částeček sorbentu• monolity

A – pórovitý silikagel (>25m)B – povrch film stac. fázeC –povrchová pórovitostD – mikropartikulární náplně (3 - 20m)

Typy stacionární fáze• chemická modifikace silikagelu

- sorbenty C-18, C-8 (reverzní fáze), C-2• polymerní sorbenty (inertnost, menší mechanická stabilita)• iontoměniče• afinitní chromatografie

Detektory

Typy detektorů• Spektrofotometrický (UV-VIS) – absorpce

záření• Refraktometrický - index lomu• Fluorescenční - fluorescence• Elektrochemický - potenciál,

proud • Vodivostní - vodivost• Light scattering - rozptyl světla• Spojení s MS (MSn), IČ, NMR

Spektrofotometrický detektor

1–zdroj UV záření, 2-měrná cela, 3-referentní1–zdroj UV záření, 2-měrná cela, 3-referentnícela, 4 – fotočlánky, 5-optický systém cela, 4 – fotočlánky, 5-optický systém detektoru,detektoru,6-přítok a odtok MF z kolony, 7-čistá MF6-přítok a odtok MF z kolony, 7-čistá MF

cdIIlogA

0

Detektor diodového pole

Fluorescenční detektor

1-excitační zář.; 1-excitační zář.; 2-emisní fluorescenční zář.;2-emisní fluorescenční zář.;3-křemenná cela; 3-křemenná cela; 4-štěrbina; 4-štěrbina; 5-maska s počerněným povrchem;5-maska s počerněným povrchem;6-konkávní zrcadla6-konkávní zrcadla7-fotonásobič 7-fotonásobič

Schéma fluorimetrického detektoruSchéma fluorimetrického detektoru • nutnost derivatizovat nutnost derivatizovat (nebo fluoreskující (nebo fluoreskující

látky)látky)• vyšší cena detektoruvyšší cena detektoru• vysoká citlivostvysoká citlivost

Vodivostní detektorPrincipem je měření vodivosti během HPLC analýzy. Průchod vodivých analytů způsobí změnu vodivosti.

• malý objem detekční cely (dvouelektrodové uspořádání)

• často v bezkontaktním provedení

• nejvíce využíván tam kde se analyzují ionty:iontoměničová chromatografieion párová chromatografiekapilární elektroforéza

Spojení s hmotnostní spektrometriíProč spojení HPLCProč spojení HPLC//MS – co obě metody nabízí ?MS – co obě metody nabízí ?

• HPLC je základní technika pro separaci netěkavých látek HPLC je základní technika pro separaci netěkavých látek

(od malých molekul léčiv až po proteiny)(od malých molekul léčiv až po proteiny)• hmotnostní spektrometr poskytuje informace pro identifikaci hmotnostní spektrometr poskytuje informace pro identifikaci

(molekulová hmotnost, struktura) při zachování ostatních (molekulová hmotnost, struktura) při zachování ostatních

vlastností detektoru (kvantifikace, sledování čistoty vzorku)vlastností detektoru (kvantifikace, sledování čistoty vzorku)• umožňuje analyzovat látky bez chromoforuumožňuje analyzovat látky bez chromoforu• další rozměr selektivity separace (SIM, MS-MS pro izobarické další rozměr selektivity separace (SIM, MS-MS pro izobarické

látky)látky)

Chromatogram

-0.1

0.4

0.9

1.4

1.9

0 5 10 15 20čas

sign

ál

wAwB

tA

tB

t=tB- tA

Základní parametr chromatografie- Rozlišení

BA

AB

wwttR

2

Analyticky významné parametry-identifikace – retenční časy-kvantifikace – plocha pod píkem

– výška píku

Kapilární elektroforéza

Fe ………….. elektrická sílaFf ………….. odporová síla

Fe=zi.e.E

Ff=k.h.vi pro kulové ionty k=6..ri

Pro rovnost obou sil:

zi.e.E = 6. ri .vi

EuEr

ezv ii

i .....6

.

++ -FeFf

vi

Kapilární elektroforéza

Elektroosmotický tok

Sternova vrstva(pevná)

difuzní vrstva

-SiOH –SiO- + H+ (pKa 6)

Stěn

a ka

pilá

ry s

diso

ciova

ným

i sku

pina

mi

A1

inj detEOF

A2N K2 K1

+ -

.

EOFu

Detekce• používají se kapiláry o velmi malém průměru

(snadná disipace Jouleova ohřevu, kapilární síly převládají nad gravitací)

365 um

75 um

Detekce• UV/VIS – adaptované cely z kapalinové chromatografie• LIF – laserem indukovaná fluorescence• spojení s ESI-MS

Využití kapilární elektroforézy• vysoká účinnost• pružnost při optimalizaci selektivity• tolerance ke složitým matricím• rychlost (high throughput)

• klinické a biochemické aplikace• farmacie ( problémy s QC)• životní prostředí• průmysl

Hmotnostní spektrometrie• ovlivňování pohybu iontů ve vakuu působením

elektrického a magnetického pole• určení poměru hmotnosti ku náboji• měření intenzity iontů• hmotnostní spektrum

• určení molekulové hmotnosti• přítomnost a poměr izotopů• přesné měření m/z – elementární složení iontu• fragmentace iontů – informace o struktuře látky• nejúčinnější identifikační nástroj v analytické chemii

Hmotnostní spektrometrie

m/z=94

m/z=28

Hmotnostní spektrometrie

izotop chloru

molekulární pík

fragmenty

Hmotnostní spektrometrie – blokové schéma

vzorek

ionizační komora

elektrostatické prvky

disperzní prvek

svazky iontů

zaostřovací plocha

detektor

registrace

analyzátor

Způsoby ionizace vzorku

• náraz elektronu – electron impact EI

• chemická ionizace - CI

• bombardování rychlými elektrony - FAB

• elektrosprej - ESI

• chemická ionizace za atmosférického tlaku - APCI

• fotoionizace - APPI

• MALDI – matrix asisted laser desorption ionization

Způsoby ionizace vzorkuElectron impact

•paprsek vysokoenergetických elektronů (70 eV) vyrazí elektron z

molekuly a vzniká kladně nabitý radikál-kation (molekulární ion)

•pokud je molekulární ion nestabilní, dochází k fragmentaci.

Způsoby ionizace vzorkuChemická ionizace

v iontovém zdroji je přítomen plyn, který je ionizován elektronovým paprskem. Tento plyn se ionizuje. Srážkami s molekulami analytu se na analyt přenáší náboj – vzniká kation, který má málo energie na to, aby dále fragmentoval

šetrný způsob ionizace, hlavním produktem je molekulární ion

IH+ + M MH+ + I

nebo

I+ + M M+ + I

Fast atom bombardment• vzorek se ionizuje bombardováním paprsky urychlených atomů vzorek se ionizuje bombardováním paprsky urychlených atomů

vhodných prvků – zpravidla Ar, Xe, Cs (energie 5-10 keV)vhodných prvků – zpravidla Ar, Xe, Cs (energie 5-10 keV)

• vzorky se umisťují do polární viskozní a netěkavé kapaliny - vzorky se umisťují do polární viskozní a netěkavé kapaliny - glycerolglycerol• užívá se pro určování sekvence v glykozidech a apetidechužívá se pro určování sekvence v glykozidech a apetidech

Ionizace elektrosprejem• LC eluent je sprejován v komoře za LC eluent je sprejován v komoře za přítomnosti silného elektrostatického polepřítomnosti silného elektrostatického pole

(za atmosférického tlaku) – vznikají nabité kapičky(za atmosférického tlaku) – vznikají nabité kapičky• ohřívaný zmlžující plyn (nebo vyhřívaná kapilára) urychluje desolvataci ohřívaný zmlžující plyn (nebo vyhřívaná kapilára) urychluje desolvataci

kapiček aerosolu, velikost kapiček se zmenšuje, náboj rostekapiček aerosolu, velikost kapiček se zmenšuje, náboj roste• při určité velikosti a náboji kapiček převládnou odpudivé elektrostatické síly při určité velikosti a náboji kapiček převládnou odpudivé elektrostatické síly

nad silami kohezními – coulombická exploze – vznik volných iontůnad silami kohezními – coulombická exploze – vznik volných iontů• volné ionty jsou přitahovány a posléze prochází vzorkovací ústí do MSvolné ionty jsou přitahovány a posléze prochází vzorkovací ústí do MS

Chemická ionizace za atmosférického tlaku• eluent je sprejován vyhřívaným eluent je sprejován vyhřívaným

odpařovákem (250 – 400 °C)odpařovákem (250 – 400 °C)• dochází k odpaření eluentudochází k odpaření eluentu• plynný plynný solventsolvent je ionizován elektrony je ionizován elektrony

v koronovém výboji (výbojová jehla)v koronovém výboji (výbojová jehla)• ionty solventu předávají náboj ionty solventu předávají náboj

chemickou reakcí analytům chemickou reakcí analytům

(chemická ionizace)(chemická ionizace)• APCI se používá pro méně polární APCI se používá pro méně polární

analyty než elektrosprej – je k analyty než elektrosprej – je k

elektrospreji komplementárníelektrospreji komplementární• u většiny přístrojů je výměna APCI za u většiny přístrojů je výměna APCI za

ESI snadnáESI snadná• někdy se oba mody i kombinujíněkdy se oba mody i kombinují

Fotoionizace - APPI

                                                        

• eluent je sprejován vyhřívaným eluent je sprejován vyhřívaným

odpařovákem stejně jako APCIodpařovákem stejně jako APCI

• výbojka generuje fotony v úzkém výbojka generuje fotony v úzkém

rozsahu ionizačních energií rozsahu ionizačních energií

• ionizační energie jsou voleny tak, aby ionizační energie jsou voleny tak, aby

ionizovaly analyt a nedocházelo k ionizovaly analyt a nedocházelo k

ionizaci solventuionizaci solventu

• podobné použití jako APCIpodobné použití jako APCI

• význam:význam:

1. analýza velmi málo polárních látek1. analýza velmi málo polárních látek

2. malé průtoky (2. malé průtoky (<<100 100 ll//min)min)

• APPI je nejmladší technikaAPPI je nejmladší technika

MALDI Matrix Assisted Laser Desorption Ionization

                                                        

• zvláště šetrný způsob ionizace, vhodný pro makromolekulyzvláště šetrný způsob ionizace, vhodný pro makromolekuly

• vzorek je spole s matricí (např. hydroxykyseliny) nasesen na terčíku vzorek je spole s matricí (např. hydroxykyseliny) nasesen na terčíku

• na terčík se namíří laserový paprsek – dojde k excitaci matrice a přenesení na terčík se namíří laserový paprsek – dojde k excitaci matrice a přenesení

energie na analyt -energie na analyt ->> vznikají ionty, které jsou urychleny do analyzátoru vznikají ionty, které jsou urychleny do analyzátoru

Analyzátory• separace analytů podle různých hodnot m/zseparace analytů podle různých hodnot m/z

• určité nastavení analyzátoru odpovídá určité hodnotě m/z (kalibrace)určité nastavení analyzátoru odpovídá určité hodnotě m/z (kalibrace)

1. Sektorové analyzátory1. Sektorové analyzátory

Kvadrupóly

Detektor doby letu – time of flight (TOF)

rychlost

měření přesných hmot

analýza velkých molekul

Iontová past – možnost MSn

Iontová cyklotronová rezonance

mqB

rv

cyklotronová frekvence

převrácená hodnota m/z

při excitaci iontu oscilátorem s frakvencí stejnou jako je cyklotronová frekvence dochází ke spirálovitému pohybu (m/z(A)<m/z(B):

Iontová cyklotronová rezonance

před excitací

při excitaci

po excitaci

změna oscilace se měří jako střídavý proud.Jeho amplituda odpovídá počtu iontů – kvantitaFrekvence odpovídá cyklotronové frekvenci iontu

Rf excitace

detegovaný proud

Fourierova transformace

běžné spektrum