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1
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA EQUINOCCIAL
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA INGENIERÍA
CARRERA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS
PREDICCIÓN DEL COMPORTAMIENTO DE Escherichia coli
EN LECHE CRUDA AL ELEVAR LA TEMPERATURA HASTA
LA PASTEURIZACIÓN APLICANDO MICROBIOLOGÍA
PREDICTIVA
TRABAJO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TITULO DE INGENIERA DE
ALIMENTOS
GABRIELA ALEXANDRA CÉSPEDES MOLINA
DIRECTORA: BIOQ. MARÍA JOSÉ ANDRADE CUVI
QUITO, Julio, 2012
2
© Universidad Tecnológica Equinoccial. 2012
Reservados todos los derechos de reproducción
3
DECLARACIÓN
Yo GABRIELA ALEXANDRA CÉSPEDES MOLINA, declaro que el trabajo
aquí descrito es de mi autoría; que no ha sido previamente presentado para
ningún grado o calificación profesional; y, que he consultado las referencias
bibliográficas que se incluyen en este documento.
La Universidad Tecnológica Equinoccial puede hacer uso de los derechos
correspondientes a este trabajo, según lo establecido por la Ley de
Propiedad Intelectual, por su Reglamento y por la normativa institucional
vigente.
______________________
Gabriela Céspedes Molina
C.C. 172087907-9
4
CERTIFICACIÓN
Certifico que el presente trabajo que lleva por título “PREDICCIÓN DEL
COMPORTAMIENTO DE Escherichia coli EN LECHE CRUDA AL
ELEVAR LA TEMPERATURA HASTA LA PASTEURIZACIÓN
APLICANDO MICROBIOLOGÍA PREDICTIVA”, que, para aspirar al título
de Ingeniera de Alimentos fue desarrollado por Gabriela Céspedes,
bajo mi dirección y supervisión, en la Facultad de Ciencias de la
Ingeniería; y cumple con las condiciones requeridas por el reglamento de
Trabajos de Titulación artículos 18 y 25.
_______________________
Bioq. María José Andrade
DIRECTORA DEL TRABAJO
C.C. 1712338373
5
DEDICATORIA
A mis padres y hermanos
6
AGRADECIMIENTO
Quiero expresar mi agradecimiento primero a Dios, por darme vida, fuerza
para alcanzar mis metas y una familia amorosa que supo guiarme en todo
momento.
A la Universidad Tecnológica Equinoccial, autoridades y docentes, quienes a
lo largo de la carrera supieron guiarnos e incentivarnos para salir adelante y
culminar con éxito esta etapa de nuestra vida. También agradezco a la
universidad por permitirme hacer uso de los laboratorios para llevar a cabo el
trabajo de investigación.
A mis padres, por su apoyo incondicional en cada etapa de mi vida, por su
entrega y sacrificio para darnos lo mejor a mí y mis hermanos. Gracias por
ser parte de mi vida y quererme tanto.
A mis hermanos, Cris y Diego, por estar siempre a mi lado, por cuidarme y
preocuparse tanto. Les quiero mucho.
A María José Andrade, mi directora, mil gracias por orientarme durante la
realización de este trabajo, por ser amiga, por compartir su sabiduría y por
brindarme su apoyo todo este tiempo.
A los tesistas del laboratorio, con los que compartimos tantos sueños,
alegrías, frustraciones; gracias por su amistad, por ser una compañía
constate y por la ayuda brindada.
A mis amigos y amigas que de una u otra forma siempre estuvieron
conmigo, gracias porque siempre pude contar con ustedes. Y un
agradecimiento muy especial a Tannya, Eli y Sofi, quienes me ayudaron
permanentemente en el desarrollo de este trabajo.
i
ÍNDICE DE CONTENIDOS
PÁGINA
RESUMEN…………………………………………………………………………viii
ABSTRACT…………………………………………………………………………x
1. INTRODUCCIÓN .................................................................................... 1
1.1 Objetivos........................................................................................... 5
2. MARCO TEÓRICO ................................................................................. 6
2.1. LECHE ............................................................................................. 6
2.1.2. COMPOSICIÓN QUÍMICA ......................................................... 7
2.1.3. CALIDAD HIGIÉNICA ................................................................ 8
2.1.4. PRODUCCIÓN Y CONSUMO .................................................... 9
2.1.5. BENEFICIOS ........................................................................... 11
2.1.6. MICROBIOLOGÍA DE LA LECHE ............................................ 12
2.1.7. MÉTODOS DE CONSERVACIÓN DE LA LECHE ................... 14
2.2. Escherichia coli ............................................................................... 16
2.2.1. VIRULENCIA ........................................................................... 18
2.2.2. EPIDEMIOLOGÍA ..................................................................... 20
2.2.3. CINÉTICA DE CRECIMIENTO ................................................. 20
2.2.4. FACTORES QUE AFECTAN AL CRECIMIENTO Y
SUPERVIVENCIA DE MICROORGANISMOS ......................... 24
2.3. MICROBIOLOGIA PREDICTIVA .................................................... 29
2.3.1. TIPO Y USO DE LOS MODELOS PREDICTIVOS ................... 30
ii
PÁGINA
2.3.1.1. Modelos probabilísticos…………………………………………30
2.3.1.2. Modelos cinéticos de crecimiento……………………………...30
2.3.1.3. Modelos de supervivencia/inactivación…………….…………33
2.3.2. VALIDACIÓN ........................................................................... 36
3. METODOLOGÍA .................................................................................. 38
3.1. MATERIALES ................................................................................. 38
3.1.1. LECHE CRUDA ....................................................................... 38
3.1.2. CEPA DE Escherichia coli ........................................................ 38
3.2. ACTIVACIÓN DE CULTIVO PURO DE Escherichia coli ................. 38
3.3. PREPARACIÓN DEL ESTÁNDAR MC FARLAND .......................... 40
3.4. CINÉTICA DE CRECIMIENTO Y DETERMINACIÓN DEL
TIEMPO GENERACIONAL DE Escherichia coli EN TSB ................ 41
3.5. ANÁLISIS FÌSICO QUIÍMICOS DE LA LECHE ............................... 42
3.5.1. DETERMINACIÓN DEL pH DE LA LECHE .............................. 42
3.5.2. DETERMINACIÓN DE HUMEDAD DE LA LECHE .................. 42
3.5.3. DETERMINACIÓN DE NaCl EN LECHE .................................. 43
3.6. DETERMINACIÓN DEL COMPORTAMIENTO DE Escherichia
coli EN LECHE CRUDA DURANTE EL AUMENTO DE
TEMPERATURA ............................................................................. 44
3.7. USO DEL SOFTWARE DE PREDICCIÓN ...................................... 45
4. ANÁLISIS DE RESULTADOS ............................................................. 49
4.1. CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE Escherichia coli Y
DETERMINACION DEL TIEMPO GENERACIONAL ...................... 49
4.1.1. CURVA DE CRECIMIENTO ..................................................... 49
iii
PÁGINA
4.1.2. TIEMPO GENERACIONAL ...................................................... 52
4.2. ANÁLISIS FÍSICO QUÍMICOS DE LA LECHE ................................ 54
4.3. COMPORTAMIENTO DE E. coli EN LECHE Y EN TSB ................. 55
4.4. INACTIVACIÓN DE E. coli .............................................................. 60
4.5. APLICACIÓN DE LA MICROBIOLOGÍA PREDICTIVA……………..64
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ........................................ 68
5.1. CONCLUSIONES ........................................................................... 68
5.2. RECOMENDACIONES ................................................................... 70
BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………...71
ANEXOS…………………………………………………………………………...78
iv
ÍNDICE DE TABLAS
PÁGINA
Tabla 1. Clasificación de la leche cruda de acuerdo al TRAM o al
contenido de microorganismos……………………………………9
Tabla 2.. Microorganismos más comunes en la leche cruda……………13
Tabla 3. Dosis Infecciosa de Patógenos de Origen Alimentario……….19
Tabla 4. Temperaturas en °C para el crecimiento de bacterias………..27
Tabla 5. Escala Mc Farland...………………………………………………40
Tabla 6. Análisis físico químicos de la leche cruda...……………………54
Tabla 7. Cálculo de velocidad de muerte de E. coli durante el
calentamiento de leche y TSB…………………………………...55
Tabla 8. Interpolación de los valores dentro de un rango de
temperatura de 10 – 42ºC.……………………………………….57
v
ÍNDICE DE FIGURAS
PÁGINA
Figura 1. Porcentajes de la Contribución Regional a la Producción de
Leche en el Ecuador ………..……………………………………10
Figura 2.. Curva típica de Crecimiento de una Población Bacteriana…..23
Figura 3. Representación de los modelos de inactivación microbiana
más comúnmente utilizados……………………………………..35
Figura 4. Cultivo de E. coli en TSB luego de 24 horas de incubación a
37ºC……………………………………………………….………..39
Figura 5. Cultivo de E. coli en agar nutritivo luego de 24 horas de
incubación a 37ºC…………………………………………………39
Figura 6. Procedimiento para determinar la curva de crecimiento:
diluciones sucesivas a partir de la solución stock de E. coli….41
Figura 7. Elementos del ComBase Predictor……………………………...46
Figura 8. Elementos del DMFit………………………………………..........48
Figura 9. Curva de crecimiento determinada a través de Microbiología
Clásica y Microbiología (ComBase)……………………………..49
Figura 10. Modelado del recuento de E. coli durante el calentamiento de
leche inoculada con E. coli (106 y 104 UFC/ml) y la control…..59
Figura 11. Inactivación de poblaciones 106 y 104 UFC/ml de E. coli en
leche y TSB…...……………………………………………………61
Figura 12. Inactivación de E. coli durante el calentamiento de leche
inoculada con E. coli (106 y 10
4 UFC/ml) y la control………….63
vi
PÁGINA
Figura 13. Crecimiento de E. coli en leche a diferentes temperaturas
utilizando microbiología predictiva………………………………65
vii
ÍNDICE DE ANEXOS
PÁGINA
Anexo I. Datos de la Curva de Crecimiento (Microbiología Predictiva
y Clásica)…………………………………………………………...78
Anexo II Datos de Inactivación de E. coli durante el calentamiento de
leche inoculada con E. coli (106 y 104 UFC/ml) y control……..79
viii
RESUMEN
Uno de los principales problemas que enfrenta la industria lechera es la
contaminación microbiana, ya sea procedente del interior de la ubre o del
medio externo, que alteran y modifican la composición de la leche
haciéndola impropia para el consumo o imposibilitando su aprovechamiento
industrial. Las bacterias coliformes de los géneros Escherichia,
Pseudomonas, Citrobacter, Klebsiella y Proteus son microorganismos
frecuentes en la leche cruda y representan un riesgo para la Salud Pública.
Los análisis microbiológicos en laboratorios son necesarios pero demandan
tiempo y recursos que las industrias no disponen al tratarse de un alimento
altamente perecible, por ello, en los últimos años se ha propuesto un nuevo
método, llamado microbiología predictiva que facilita los análisis y optimiza
recursos al predecir el comportamiento de microorganismos en diferentes
condiciones ambientales. El objetivo del presente trabajo de investigación
fue predecir el comportamiento de Escherichia coli en leche cruda al elevar
la temperatura hasta las condiciones estandarizadas de pasteurización
aplicando Microbiología Predictiva. Se determinó el tiempo generacional de
la bacteria Escherichia coli en condiciones óptimas de crecimiento, y por otro
lado, con el fin de simular el efecto de la pasteurización como método de
control del crecimiento de la bacteria, se utilizaron diferentes poblaciones de
E. coli (106, 104 UFC/ml según el estándar Mc Farland) sobre dos medios de
cultivo: TSB (caldo triptona de soya) y leche cruda, con el fin de estudiar el
comportamiento del microorganismo durante el calentamiento en
condiciones estándares de crecimiento bacteriano y evaluar el efecto de la
matriz (leche), respectivamente. A partir de este ensayo se obtuvieron los
datos de reducción de la población bacteriana que fueron usados
posteriormente en la modelización. Para cada medio de cultivo se realizaron
recuentos a intervalos de temperatura de 10ºC, desde 15ºC a 65ºC; en un
segundo ensayo se realizaron recuentos a 50, 53, 56, 58 y 60ºC. A partir de
los recuentos de crecimiento e inactivación microbiana obtenidos
experimentalmente se calcularon las curvas predictivas mediante el paquete
ix
informático ComBase. Se determinaron los parámetros físico químicos de la
leche (pH y % cloruros) requeridos por el programa informático para generar
la curva de inactivación térmica. En condiciones óptimas de crecimiento se
obtuvo un tiempo generacional de 22.56 minutos. No se encontraron
diferencias entre el crecimiento de la bacteria en leche y TSB sometido a
calentamiento; en ambos casos se encontró que la bacteria no presentó
crecimiento a temperaturas superiores a 58ºC. Según el modelado obtenido
del software de predicción, las curvas de inactivación bacteriana no fueron
de primer orden, sino que presentaron un “hombro” durante el período de
tratamiento térmico. La comparación de los datos experimentales y los
obtenidos en el paquete informático permitieron validar la aplicación de éste
último y los principios de la microbiología predictiva.
x
ABSTRACT
One of the main problems facing the dairy industry is microbial
contamination, either from inside the udder or the external environment,
which alter and modify the milk composition making it unfit for consumption
or preclude its industrial use. Coliform bacteria of the genus Escherichia,
Pseudomonas, Citrobacter, Klebsiella and Proteus are common
microorganisms in raw milk and pose a risk to public health. Microbiological
analysis in laboratories are necessary but require time and resources that
industries do not have in order to be a highly perishable food, therefore, in
recent years has proposed a new method, called predictive microbiology
which facilitates the analysis and optimizes resources to predict the behavior
of microorganisms in different environmental conditions. The objective of this
research work was to predict the behavior of Escherichia coli in raw milk by
raising the temperature to standard pasteurization conditions applying
Predictive Microbiology. I determined the generational time of Escherichia
coli bacteria under optimal growth conditions. On the other hand, in order to
simulate the effect of pasteurization as a method of controlling the growth of
the bacteria, using different populations of E. coli (106, 104 CFU/ml according
to the Mc Farland standard) on two culture media: TSB (tryptic soy broth) and
raw milk in order to study the behavior of the microorganism during heating in
standard conditions of bacterial growth and evaluate the effect of the matrix
(milk), respectively, from this test data I obtained the reduction data of
bacterial population, that then were used in modeling. For each culture media
counts were performed at intervals of 10 ºC from 15 ºC to 65 °C, in a second
trial, counts were performed to 50, 53, 56, 58 and 60 °C. Based on counts of
growth and microbial inactivation obtained experimentally I calculated the
predictive curves using the software package ComBase. Were determined
physicochemical parameters of milk (pH and %chlorides) required by the
computer program to generate the thermal inactivation curve. Under optimal
growth conditions was obtained a generational time of 22.56 minutes. No
differences were found between the growth of bacteria in milk and TSB
xi
subjected to heating, in both cases it was found that the bacteria do not grow
at temperatures above 58 ºC. According to the model obtained from the
prediction software, the bacterial inactivation curves were not first-order, but
had a "shoulder" during the heat treatment period. The comparison of
experimental data and those obtained in the software package, allowed me
to validate the application of the latter and the principles of predictive
microbiology.
1
1. INTRODUCCIÓN
Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs) constituyen un
importante problema de Salud Pública, según la Organización Mundial de la
Salud (2011) en América Latina y el Caribe 21 países informaron 10.400
brotes de enfermedades transmitidas por los alimentos y agua que causaron
aproximadamente 400.000 enfermedades y 500 muertes entre 1993 y 2002.
A nivel nacional no existe un control regular de las enfermedades
transmitidas por alimentos y el Sistema de Información Nacional no cumple
con el propósito de informes reales de las ETAs y la información existente
tampoco es confiable debido a que no se identifica el agente etiológico. Es
por eso que cada vez aumenta la importancia y el interés por la inocuidad de
los alimentos. Los enfoques modernos para la prevención de riesgos
microbianos incluyen la implementación de programas como el de Análisis
de Peligros y Puntos Críticos de Control (HACCP), el uso de la Evaluación
Cuantitativa de los Riesgos Microbianos y la Microbiología Predictiva.
Los alimentos involucrados con mayor frecuencia en brotes de enfermedad
son los de origen animal como la carne, mariscos, huevos, leche cruda,
entre otros; el riesgo depende del contenido nutritivo, la cantidad de agua
disponible, la temperatura (Association, 2008).
En el Ecuador y a nivel mundial, el consumo de leche es alto por ser uno de
los alimentos más completos, contiene todos los elementos necesarios para
el desarrollo del ser humano. Además, es una importante materia prima
industrial para la alimentación humana; la leche y sus derivados son
alimentos esenciales en todas las etapas de la vida, especialmente en la
lactancia, en el crecimiento (infancia y adolescencia) y en una edad
avanzada (Dapcich, 2004). Sin embargo, la leche tiene algunas desventajas:
es, por un lado, fácilmente alterable, por lo que en muchas ocasiones se
encuentra adulterada, y es, por otro lado, vehículo frecuente de gérmenes,
2
algunos pueden ser patógenos y su consumo a veces causa enfermedades
endémicas, siendo importante someterla a procesos térmicos como la
pasteurización, que consiste en calentar el alimento por un tiempo
determinado a temperaturas por debajo del punto de ebullición para no
alterar sus características físicas y químicas, con la finalidad de reducir la
carga microbiana.
La leche a su paso por la ubre, por contacto con el pezón, la piel del animal y
el equipo de ordeño, así como durante el almacenamiento y transporte, va
adquiriendo una microbiota entre la que se incluyen microorganismos
beneficiosos, saprófitos y patógenos para el hombre. Los puntos críticos de
control más significativos son recepción de la leche cruda, pasteurización y
distribución (Hernández, 2011). Durante la recepción se debe controlar la
presencia de microorganismos patógenos a través de la aplicación de
buenas prácticas de higiene en la finca. Posteriormente se debe controlar la
temperatura de refrigeración a la cual es mantenida la leche hasta llegar a la
planta procesadora, es necesario controlar que el tiempo y temperatura de
pasteurización sean adecuados para impedir la supervivencia de
microorganismos patógenos. Y en la distribución es necesario controlar y
mantener la cadena de frío para impedir el crecimiento de microorganismos
(Hernández, 2011).
Los microorganismos cuando son sometidos a temperaturas superiores a su
óptima de crecimiento mueren rápidamente, la sensibilidad al calor depende
del tipo de microorganismo. La pasteurización reduce el número de bacterias
pero no las elimina por completo, ya que algunas bacterias son más
termorresistentes (Bacillus y Pseudomonas) y forman esporas que
sobreviven a la pasteurización (Palencia, s.f.). Investigaciones controladas
diseñadas para determinar la efectividad de la pasteurización sobre
microorganismos específicos han demostrado que destruye patógenos
comunes como Mycobacterium ssp. Paratuberculosis, Salmonella spp.,
Mycoplasma spp., E. coli y Staphylococcus aureus (Stabel, 2004).
3
La muerte de microorganismos como consecuencia de un tratamiento a altas
temperaturas sigue una cinética exponencial. La recta tiene una pendiente
que permite calcular la velocidad de muerte en función del tiempo, ésta varía
para cada temperatura, microorganismos, entorno y condiciones fisiológicas
(Anónimo, s.f.).
Las principales bacterias que contaminan la leche son: Micrococcus,
Staphylococcus, Clostridium, enterobacterias, bacterias lácticas y
Pseudomonas. La E. coli, bacteria que normalmente vive en el intestino de
hombres y animales es un indicador de contaminación fecal reciente y
aunque la mayoría de las variedades de esta bacteria son inocuas, se sabe
que varias como la E. coli 0157:H7, produce grandes cantidades de una
toxina que pueden causar diarrea y daño renal en algunas personas,
especialmente en los niños menores de cinco años, la infección puede
ocasionar una complicación denominada síndrome urémico hemolítico
(SUH), una enfermedad grave, con destrucción de los glóbulos rojos e
insuficiencia renal (Michanie, 2003).
La E. coli O157:H7 tiene una baja dosis infectiva, resistencia a temperaturas
de refrigeración y tolerancia al ácido, por lo tanto, es un patógeno de
importancia en la industria láctea (Arqués, 2003).
Por otro lado, la microbiología predictiva (PM) es un área multidisciplinaria
emergente de la microbiología que permite predecir las respuestas de los
microorganismos ante diferentes cambios en las variables ambientales que
pueden ser reproducidas de forma controlada en laboratorio, de esta
forma, a través de diversos modelos matemáticos es posible predecir
cuál será el comportamiento de estos microorganismos cuando cambian
las condiciones ambientales que les rodean (Cabeza, 2011).
La microbiología predictiva se ha estado desarrollando en estos últimos años
a nivel mundial, sin embargo en el Ecuador aún no se han publicado
estudios o investigaciones que contengan esta metodología que permite el
4
aseguramiento de la inocuidad alimentaria, optimiza procesos y recursos; y
podría mejorar los sistemas de gestión de la calidad en la industria
alimentaria (Cabeza, 2011).
Dentro de la microbiología de los alimentos, la microbiología predictiva se ha
convertido en una valiosa herramienta en el control de calidad alimentaria.
Actualmente estos modelos se están empleando en los sistemas HACCP, en
el desarrollo de nuevos productos, diseño de procesos, evaluación
cuantitativa de riesgos microbianos y otras áreas que demuestran la
importancia de ésta (Espinosa, 2009).
La posible contaminación de la leche casi siempre ocurre durante el ordeño
debido a la contaminación de las ubres y por ausencia de higiene del
personal. Esto sugiere que la leche no pasteurizada es un producto con el
potencial de vehiculizar numerosos microorganismos patógenos, entre ellos
Escherichia coli. Ante esto, resulta interesante estudiar el comportamiento
del microorganismo en este tipo de producto, para determinar su capacidad
de adaptación y supervivencia en relación con distintas variables que
pudieran estar involucradas, tales como pH, temperatura y flora microbiana
presente. La detección en el laboratorio de los microorganismos patógenos
puede ser complicada, lenta, costosa y no facilita un enfoque preventivo. Por
esta razón, se aplica la microbiología predictiva, un método moderno para
optimizar análisis microbiológicos.
5
1.1 Objetivos
Objetivo General
Predecir el comportamiento de Escherichia coli en leche cruda al
elevar la temperatura hasta la pasteurización aplicando Microbiología
Predictiva.
Objetivos Específicos
Determinar el tiempo generacional de E. coli en condiciones óptimas
de crecimiento.
Determinar el comportamiento de E. coli en la leche durante el
tratamiento térmico.
Estimar la cinética de muerte de E. coli en la leche durante el
tratamiento térmico mediante Microbiología Predictiva.
6
2. MARCO TEÓRICO
2.1. LECHE
La leche de vaca cruda es un líquido de color blanco amarillento de gran
importancia en la alimentación humana. Al hablar de leche se entiende única
y exclusivamente la natural de vaca. En caso contrario, debe especificarse la
procedencia: de cabra o de oveja, entre otras (Gónzalez, s.f.).
La leche cruda no se destina de forma directa al consumo humano, se la
somete a diferentes tratamientos térmicos a través de los cuales se obtienen
las leches de consumo; además debe cumplir con ciertos requisitos como
son: organolépticos, microbiológicos, físicos y químicos establecidos en
normas específicas para cada país. En el Ecuador los requisitos para leche
se encuentran en la norma técnica NTE INEN 10:2003 para leche.
La leche y sus derivados pertenecen a un grupo de alimentos con un alto
valor nutricional pero también altamente perecedero y susceptible de
contaminación que no se puede controlar fácilmente, ya que al tener un
balance casi perfecto de sus macronutrientes se convierte en un cultivo ideal
para bacterias. Sin embargo, la leche es muy beneficiosa por el alto
contenido de calcio, que junto a la vitamina D y la lactosa favorecen una
absorción más completa. La grasa de la leche tiene importantes
proporciones de ácidos grasos que facilitan su digestibilidad y las proteínas
lácteas son de alto valor biológico, debido a que presentan todos los
aminoácidos esenciales para cubrir las necesidades de una persona (Zavala,
2005).
La composición de la leche varía de acuerdo a la raza, la época del año, la
etapa de lactancia, la alimentación, la salud del animal, entre otras.
7
2.1.2. COMPOSICIÓN QUÍMICA
La leche es un líquido de composición y estructura compleja, blanca opaca,
de sabor suave, olor característico y con un pH cercano a la neutralidad. La
materia grasa se encuentra en emulsión, las proteínas constituyen una
suspensión, mientras que los restantes componentes (lactosa, otras
sustancias nitrogenadas, minerales, entre otros) están disueltos (Taberna,
s.f.).
La composición química media de la leche de acuerdo a Caravaca et al.
(2003) es:
AGUA: Alrededor de 90%. Se puede encontrar como agua libre y
como agua ligada. La cantidad de agua en la leche es regulada por la
lactosa que se sintetiza en las células secretoras de la glándula
mamaria. El agua que va en la leche es transportada a la glándula
mamaria por la corriente circulatoria.
GLÚCIDOS: Entre 4.5 – 5.0%. El principal es la lactosa, la
concentración es similar en todas las razas lecheras y no puede
alterarse fácilmente con prácticas de alimentación.
LÍPIDOS: Normalmente, constituye desde el 3 hasta el 6% de la
leche, variando entre razas de vacas y con las prácticas de
alimentación. Se encuentran en forma de glóbulos de grasa,
principalmente triglicéridos (98%), lecitina (30%) y una porción
insaponificable (1%).
PROTEÍNAS: Varía entre 3 – 6%, donde se distinguen las caseínas
(70%) y las proteínas del suero (30%).
SALES: Se encuentran en solución (NaCl) y en estado coloidal (Ca y
P). También hay presencia de fosfatos, sulfatos e ioduros, su
porcentaje varía entre 0.8 y 1.3.
8
2.1.3. CALIDAD HIGIÉNICA
La leche de buena calidad es aquella que cumple con todas las
características higiénicas, microbiológicas y composicionales, por ende
concuerda con la definición legal y las expectativas nutricionales (Pinzón,
2006). La calidad de la leche se puede dividir en química y microbiológica; la
primera hace referencia a que no debe contener sustancias como:
antibióticos, antisépticos, hormonas, pesticidas o cualquier otra sustancia
química nociva para el hombre; tampoco se permite la adición de agua,
aunque no representa riesgo alguno para el consumidor, sí representa un
fraude. La segunda parte de la calidad de la leche se refiere al contenido o
carga microbiana, ésta debe estar dentro de los límites establecidos en las
normas técnicas (Caravaca, 2003).
La contaminación se debe a la falta de higiene, poca limpieza de las vacas,
del medio ambiente, de los sistemas de ordeño, conducciones de leche,
ollas o sistemas de refrigeración.
Para mejorar la calidad microbiológica de la leche es necesario cumplir
parámetros en todas las etapas de procesamiento, desde el ordeño hasta
que llegue al consumidor. La leche cruda después del ordeño debe ser
enfriada lo más pronto posible, almacenada y transportada hasta los centros
de acopio y/o plantas procesadoras en recipientes apropiados autorizados
por la autoridad sanitaria competente. En los centros de acopio la leche
cruda debe ser filtrada y enfriada con agitación constante hasta una
temperatura no superior a 10ºC (INEN 2003), caso contrario si la leche
permanece caliente los microorganismos trabajan muy intensivamente y
consumen la lactosa produciendo ácido láctico, degradando grasa y
proteínas, que impiden alcanzar características de sabor, aroma, textura y
apariencia deseada.
9
La calidad microbiana de la leche cruda se determina a partir del recuento de
células somáticas para determinar la aceptación o no por la industria y el
precio que se paga por ella, también se realizan recuentos de bacterias en
placa UFC/cm3 de microorganismos aerobios mesófilos; de acuerdo a los
resultados obtenidos se puede clasificar la leche como se muestra en la
tabla 1. Antes se utilizaba la prueba del azul de metileno pero no resultaba
del todo precisa para determinar la calidad de leche (Novoa, s.f.).
Tabla 1. Clasificación de la leche cruda de acuerdo al contenido de
microorganismos
(INEN 2003)
2.1.4. PRODUCCIÓN Y CONSUMO
En el Ecuador, los datos del Censo Agropecuario del año 2000 indican que
la producción lechera se ha concentrado en la región de la Sierra (figura 1),
donde se encuentran los mayores productores de leche con un 73% de la
producción nacional, siguiendo con un 19% la Costa, y un 8% la Amazonía y
las Islas Galápagos (MAGAP, 2000).
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Figura 1. Porcentajes de la Contribución Regional a la Producción de Leche
en el Ecuador (MAGAP, 2000)
De acuerdo al estudio “La calidad de la leche: un desafío en el Ecuador” de
Contero (2008) la disponibilidad de leche cruda en el país es
aproximadamente de 3,5 a 4,5 millones de litros por día, de los cuales un
75% se destina para consumo humano e industrial. El 90% de las principales
industrias procesadoras de lácteos se encuentran ubicadas en la sierra y se
dedican, principalmente, a la producción de leche pasteurizada, quesos y
crema de leche, ocupando un plano secundario los otros derivados lácteos.
En el país son seis empresas las productoras más grandes de lácteos,
destacándose a nivel regional por su producción diaria de leche, en la sierra:
Nestlé - DPA con una producción de 300.000 litros; Andina con 110.000
litros; Nutrileche con 140.000 a 160.000 litros y Pasteurizadora Quito con
160.000 a 180.000 litros, y en la costa: Rey leche y Tony con 160.000 a
180.000 litros (Contero, 2008).
El gobierno de Ecuador, a través del actual gobierno, decidió unirse a la
iniciativa mundial para incentivar el consumo de productos lácteos, ya que la
FAO recomienda un consumo de 120 litros/habitante/año y en Ecuador
apenas llega a 95.30 litros.
11
Muchos nutriólogos recomiendan medio litro diario. Sin embargo los infantes,
igual que las personas mayores deberían consumir 3/4 de litro al día y los
adolescentes cuyo crecimiento de los huesos se acelera alrededor de los 11
años, al igual que las mujeres embarazadas o en periodo de lactancia, un
litro por lo menos, esto permite cubrir sus necesidades diarias de calcio,
principal nutrimento de la leche (López, 2005).
2.1.5. BENEFICIOS
Considerando las características nutricionales de la leche y los productos
lácteos, éstos se convierten en una opción dietética óptima y su consumo es
recomendable para todas las personas de cualquier edad.
En los primeros meses de vida, la leche materna constituye el único alimento
completo, saludable, suficiente e higiénico que se debe dar al bebé para que
reciba las defensas necesarias para la protección de su salud, ya que
contiene todos los nutrimentos necesarios para su crecimiento y desarrollo
durante los primeros meses de vida.
Respecto al calcio, uno de los principales nutrientes de la leche, mineral que
no sólo forma parte del hueso, sino también que es un elemento
indispensable en los diversos procesos bioquímicos que suceden en el
organismo constituye una fuente de otro nutriente básico para la prevención
de la osteoporosis, la vitamina D. Y se ha demostrado que el calcio
proveniente de la leche presenta una mayor biodisponibilidad al estar
asociado una proteína (Sedó, 2008).
12
2.1.6. MICROBIOLOGÍA DE LA LECHE
La leche como se mencionó anteriormente, es un alimento completo y medio
de cultivo ideal para muchos microorganismos por su alto contenido de
humedad, su abundante suministro de nutrientes, su grado de acidez neutral
(pH de 6,7) y su temperatura (Pinzón, 2006). La importancia del estudio
microbiológico de la leche se basa en tres tipos de microorganismos:
Los que causan la descomposición de la leche.
Los que originan enfermedades en las personas, llamados
patógenos.
Los beneficiosos, aquellos que causan la fermentación natural de la
lactosa en ácido láctico.
Debido a la importancia epidemiológica de los microorganismos patógenos,
se describirán las principales fuentes de contaminación de la leche:
- Infección inicial: La contaminación de la ubre puede ocurrir por dos
vías. Una es a través del canal del pezón, generalmente la
contaminación es baja y por microorganismos inocuos
(Corynebacterium y Micrococcus) a menos que se trate de un animal
con mastitis donde hay proliferación de Staphylococcus y
Streptococcus. Otra vía de contaminación es la circulación sanguínea,
medio de transporte de microorganismos patógenos como
Mycobacterium tuberculosis y Brucella abortus (Alais, 1985).
- Ambiente: La leche se contamina por microorganismos procedentes
de residuos de excremento, paja, heno y alimentos que viajan a través
del aire. Los excrementos son fuente principal de enterobacterias (E.
coli). También se contamina por miles de microorganismos presentes
en las paredes de utensilios y maquinarias que no has sido lavados,
desinfectados o secados correctamente (Alais, 1985).
13
- El estado del animal: El animal debe encontrarse limpio, sano y sin
lesiones. Con la cola inmovilizada, se deben lavar las ubres con una
solución antiséptica antes de la ordeña, de esta manera se reduce la
carga bacteriana (Jones, 1998).
- El estado del ordeñador: Es un factor importante la higiene de los
operarios, ya que muchas enfermedades son transferidas por esta ruta,
son fuente de contaminación de diversos microorganismos entre ellos
patógenos de origen humano. El Staphylococcus aureus puede ser
transferido de la piel o de las fosas nasales de los manipuladores, que
con el tiempo suficiente y condiciones de temperatura puede producir
enterotoxina en el alimento (Association, 2008).
2.1.6.1. Microorganismos en la leche cruda
En la tabla 2 se presenta un resumen de las principales características y los
efectos causados por la presencia de diferentes grupos de microorganismos
en la leche.
Tabla 2. Microorganismos más comunes en la leche cruda
MICROORGANISMO DESCRIPCIÓN EFECTOS
BACTERIAS GRAM (+) (Bacterias lácticas) Lactococcus,
Leuconostoc, Pediococcus,
Streptococcus, Lactobacillus,
Carnobacterium,
Enterococcus, Vagococcus,
Aerococcus,
Tetragonococcus, Alloiococcus y Bifidobacterium.
Habitan en lugares ricos en carbohidratos, proteínas, vitaminas y poco oxígeno. Tienen forma bacilar, cocoide u ovoide. Soportan pH de 4 en leche. Son anaerobias facultativas, mesófilas y termófilas de crecimiento exigente. Pueden ser homofermentativas o heterofermentativas.
Contribuyen en la elaboración de productos lácteos: yogurt, queso. Aportan sabor y aroma por la producción de acetaldehído, diacetilo, acetoina, acetona, lactonas, ácidos volátiles, alcohol y gas.
14
Tabla 2. Microorganismos más comunes en la leche cruda (continuación)
Micrococcus
La mayoría son aerobias, no patógenas Fermentadores débiles. Flora inocua pero abundante con poca actividad enzimática.
Por su capacidad proteolítica puede llegar a alterar la leche pasteurizada mal almacenada.
Staphylococcus
Son aerobios facultativos. Fermentadores fuertes. El Staphylococcus aureus es termoresistente, soporta la pasteurización. Algunas no son patógenas (S. epidermis)
El S. aureus causa mastitis en animales. Intoxicaciones en humanos, osteomielitis.
Clostridium
Anaerobio estricto, producen gas. Su crecimiento es inhibido por bacterias lácticas. Se destruyen a temperaturas mayores a 100°C El Clostridium botulinum produce toxinas patógenas en leche cruda.
Causa botulismo, gangrena gaseosa y tétanos.
Bacterias Gram (-) (Enterobacterias) Escherichia coli,
Enterobacter aerógenes,
Klebsiella, Citrobacter,
Salmonella,
Shigella, Proteus, Serratia
Su presencia en agua y leche se debe a una contaminación fecal, ya que se encuentran en el intestino de animales y humanos. Poder patológico. Producen gas y sustancias viscosas de sabor desagradable.
Causan trastornos gastrointestinales. Alteran la leche o subproductos.
Pseudomonas Son psicrófilas. Varias especies tienen un gran poder proteolítico y lipolítico.
Alteran productos elaborados con leches pasteurizadas, ya que algunas enzimas resisten temperaturas por encima de los 80 ºC
Acromobacteriaceae No fermentan la lactosa, No son proteolíticas ni patógenas, Son bacterias psicrófilas
Algunas pueden producir sustancias viscosas y pigmentos.
(Sabena, 2009)
2.1.7. MÉTODOS DE CONSERVACIÓN DE LA LECHE
Existen varios métodos para conservar la leche pero sin duda los más
populares y utilizados en la industria lechera son los tratamientos térmicos
15
como la pasteurización, esterilización o UHT, son técnicas eficaces que
destruyen bacterias patógenas e inactivan enzimas que deterioran el
alimento y reducen su vida útil, procurando alterar lo menos posible la
composición y estructura del producto (Pinzón, 2006).
La pasteurización es el proceso térmico más conocido al que se somete la
leche, el nombre es en honor a su descubridor, Louis Pasteur, quien a
mediados del Siglo XIX comprobó que calentar ciertos alimentos y bebidas
por encima de los 60º C evitaba su alteración (Enciclopedia, 2004).
“Las condiciones mínimas de pasteurización son aquellas que producen
efectos bactericidas equivalentes a las producidas por las combinaciones de
tiempo-temperatura siguientes: 72ºC durante 15 segundos (pasteurización
de flujo continuo) o 62 – 65ºC durante 30 minutos (pasteurización en lotes)
(INEN 2003).
Este proceso destruye microorganismos patógenos de la leche pero no sus
esporas, por eso este tipo de leche no se considera de larga duración y debe
mantenerse siempre en refrigeración, conviene consumirla en el plazo de
2−3 días (ReyBanpac, 2008).
La esterilización de la leche combina altas temperaturas con un tiempo
también alto (115−130ºC durante 15 −30 minutos). El objetivo es la
destrucción total de microorganismos y esporas, para obtener un producto
estable y con un largo período de conservación. El inconveniente es que
este proceso provoca la pérdida de vitaminas B1, B2, B3, así como de
algunos aminoácidos esenciales y las industrias tienen que compensar esta
pérdida añadiendo nutrientes (Palencia, s.f.). La leche esterilizada se
conserva de 5-6 meses en empaque cerrado, a temperatura ambiente y de
4-6 días una vez abierto, en refrigeración.
La uperización o UHT, es la leche tratada a temperaturas de 150ºC durante
un tiempo que no supera los 3−4 segundos. Estas condiciones permiten
conservar las cualidades nutritivas y organolépticas del producto pero no se
16
destruyen las formas de resistencia de los microorganismos (Palencia, s.f.).
La leche UHT se conserva durante tres meses aproximadamente a
temperatura ambiente en empaque cerrado y una vez abierto debe
conservarse en refrigeración un máximo de 4-6 días (ReyBanpac, 2008).
Mediante estos procesos ha disminuido la incidencia de enfermedades
transmitidas por animales enfermos al hombre, se detiene la proliferación de
microorganismos que por contaminación originan patologías
gastrointestinales y se logra disminuir la velocidad de deterioro natural de la
leche (Zavala, 2005).
2.2. Escherichia coli
La Escherichia coli o E. coli, fue descrita por primera vez en 1885 por
Theodore von Escherich, bacteriólogo alemán, quien la denominó Bacterium
coli dado que se aislaba de las heces de individuos sanos y enfermos
(Eslava, s.f.). Posteriormente la taxonomía le adjudicó el nombre de
Escherichia coli, en honor a su descubridor.
Es un bacilo que reacciona negativamente a la tinción Gram, es anaerobio
facultativo, móvil por flagelos perítricos, no forma esporas, es capaz de
fermentar la glucosa y la lactosa.
La mayoría de las cepas son inocuas y habitan en los intestinos de los seres
humanos y animales saludables, como la Escherichia coli genérica o biotipo
1 no patógena, sin embargo existen otras como la Escherichia coli O157:H7
que produce una potente toxina y puede ocasionar enfermedades graves
como el síndrome urémico hemolítico (Michanie, 2003).
Se distinguen seis cepas según su capacidad patógena en el hombre y en
los animales:
17
E. coli enteropatógenos (ECEP): Causa diarrea aguda o persistente
en humanos y animales. Causa lesiones intestinales de tipo adherencia
y no producen toxinas tipo Shiga, pero si provocan una reordenación de
la actina en la célula hospedante, que induce una deformación
significativa. Carece de fimbrias y no produce las toxinas lábil (ST) y
estable (LT) (Varela, 2007).
E. coli enteroinvasivos (ECEI): Es una de las E. coli que causa más
daño debido a la invasión que produce en el epitelio intestinal causando
diarrea sanguinolenta y disentería en niños y adultos (Pascual 2000). Es
inmóvil, no fermenta la lactosa. Libera el calcio en grandes cantidades
impidiendo la solidificación ósea, produciendo artritis y en algunos casos
arterioesclerosis.
E. coli productoras de toxinas parecidas a las de Shigella (ECST):
Estas bacterias producen una toxina citotóxica para células Vero de
cultivo de similaridad estructural a la toxina producida por Shigella
dysenteriae. Las ECST producen verotoxinas que actúan en el colon.
Sus síntomas son: primero colitis hemorrágica, luego síndrome urémico
hemolítico (lo anterior más infección del riñón, posible entrada en coma y
muerte), y por último, púrpura trombocitopénica trombótica (lo anterior
más infección del sistema nervioso central). Esta cepa no fermenta el
sorbitol y posee un fago, donde se encuentran codificadas las
verotoxinas, también llamadas "Toxinas Shiga", no posee una fimbria
formadora de mechones, en vez de esto posee una fimbria polar larga
que usa para adherencia (Blanco, s.f.).
E. coli enterotóxicos (ECET): Se adhiere a la mucosa del intestino
delgado, no la invade, y elabora toxinas ST y LT que producen diarrea
acuosa ligera, cólicos, náuseas (Anónimo, s.f.). No hay cambios
histológicos en las células de la mucosa y muy poca inflamación.
18
E. coli de adherencia difusa (ECDA): Se adhiere a la totalidad de la
superficie de las células epiteliales y habitualmente causa enfermedad
en niños inmunológicamente no desarrollados o malnutridos. No se ha
demostrado que pueda causar diarrea en niños mayores de un año de
edad, ni en adultos y ancianos.
E. coli enteroadherentes /enteroagregativas (ECEA): Sólo encontrada
en humanos. Son llamadas enteroagregativas porque tienen fimbrias con
las que aglutinan células en los cultivos de tejidos (Fernández, 2003). Se
unen a la mucosa intestinal causando diarrea acuosa sin fiebre. No son
invasivas. Producen hemolisina y una enterotoxina ST similar a la de las
enterotoxigénicas.
La Escherichia coli es un buen indicador de contaminación fecal y su
presencia en alimentos indica contaminación reciente, ya que esta bacteria
vive poco tiempo en un ambiente extraentérico. Se destruye a temperaturas
de pasteurización y congelación, por su poca resistencia no es un buen
indicador de flora patógena (Pascual, 2000).
2.2.1. VIRULENCIA
Para que un alimento cause una enfermedad debe contener en él un
patógeno o su toxina; además el patógeno tiene que crecer hasta un nivel
suficiente para causar una infección o producir toxina y finalmente se tiene
que ingerir una cantidad suficiente del alimento. Sin embargo, algunos
organismos causantes de enfermedades, como la E. coli O157:H7, tiene una
dosis infecciosa muy baja y la simple presencia representa un peligro
(Association, 2008).
La Escherichia coli está dividida por sus propiedades virulentas, pudiendo
causar diarrea en humanos y otros animales. Otras cepas causan diarreas
hemorrágicas por virtud de su agresividad, patogenicidad y toxicidad. En
19
muchos países ya hubo casos de muerte con esta bacteria, generalmente de
niños entre 1 y 8 años. Causado casi siempre por la contaminación de
alimentos y su posterior mala cocción, es decir, a temperaturas internas y
externas menores de 70 °C.
El número de microorganismos necesario para causar enfermedad varía con
la cepa específica del microorganismo y con la susceptibilidad del huésped,
por lo tanto, la enfermedad que la Escherichia coli causa puede ser leve o
severa. Los niños menores de 5 años y los ancianos son los grupos más
vulnerables; la dosis requerida para enfermar varía entre 106 a 1010 células
(tabla 3); y se presenta entre los 8 primeros días del ingreso de la bacteria.
Se produce diarrea acuosa o usualmente con sangre, dolores abdominales
severos, náuseas, vómitos y a veces fiebre. La colitis hemorrágica puede
derivar en una falla aguda del riñón o en Síndrome Urémico Hemolítico
(SUH) en el 5 % de los infectados. Del 3 a 5 % de los que padecen SUH
sufren la muerte y los que consiguen recuperarse padecen fallas renales,
complicaciones neurológicas y otras secuelas por mucho tiempo (Michanie,
2003).
Tabla 3. Dosis Infecciosa de Patógenos de Origen Alimentario
ORGANISMO DOSIS INFECCIOSA
APROXIMADA (células)
Bacillus cereus 105-10
11
Campylobacter jejuni 500
Clostridium perfringens 106-10
10
Cryptosporidium 30
Escherichia coli (tipos patógenos) 106-10
10
E. coli O157:H7 101-10
3
Salmonella typhi 103-10
9
(Association, 2008)
20
2.2.2. EPIDEMIOLOGÍA
La bacteria E. coli se transmite por:
Consumo de alimentos insuficientemente cocidos o crudos o
temperatura inadecuada de almacenamiento.
Ingestión de agua contaminada.
Contacto persona a persona (mala higiene personal).
Contacto con materia fecal de animales.
Han habido brotes de la enfermedad por el consumo de carne picada
insuficientemente cocida, hamburguesas, roast beef, agua de pozos, agua
de piletas de natación, jugo de manzana no pasteurizado (pH 3,5), yogur,
vegetales crudos (brotes de alfalfa), salame, lechuga, quesos, leche cruda y
otros (Michanie, 2003).
La incidencia real es desconocida pero se conoce que la E. coli
enterotoxigénica (ETEC) es la causa más común de diarrea en el viajero. La
E. coli enteropatogénica (EPEC) y la E. coli enteroinvasiva (ECEI) infectan
principalmente a los niños menores de 2 años en los países en vías de
desarrollo. La ECEP se ha reportado como causa importante de diarrea en el
recién nacido (Fernández, 2003).
2.2.3. CINÉTICA DE CRECIMIENTO
La cinética describe las velocidades a la cual las bacterias se desarrollan en
diferentes condiciones. Entre las bacterias existe una amplia variación en los
requerimientos nutricionales y las condiciones físicas que ellas pueden
soportar.
Existen bacterias heterotróficas que obtienen su energía y carbono desde un
compuesto orgánico o material orgánico; y las bacterias autotróficas usan
CO2 como su fuente de carbono y obtienen su energía desde la luz solar o a
21
través de la oxidación de compuestos inorgánicos. Además el crecimiento de
las bacterias también se ve afectado por factores como temperatura,
ambiente gaseoso y el pH. De acuerdo al rango de temperatura en el cual se
desarrollan se diferencian las psicotróficas, aquellas que se desarrollan entre
-5 y 30°C; mesófilas, aquellas que se desarrollan en el rango 10 a 47°C y
termófilas que pueden soportar hasta 105°C.
La velocidad de crecimiento es el cambio en el número de células o en la
masa celular experimentando por unidad de tiempo, en este período todos
los componentes estructurales de la célula se duplican. El intervalo para la
formación de dos células a partir de una se conoce como tiempo de
generación (LEOQ, s.f.).
El tiempo de generación varía entre las bacterias, pueden ser minutos, horas
o inclusive días. El tiempo de generación de un microorganismo determinado
también está en función del medio de cultivo utilizado y de las condiciones
de incubación empleadas. Las bacterias en condiciones ideales su
crecimiento puede llegar a un tiempo de generación menor de 20 minutos
(Leyva, s.f.).
El aumento en número de células que se produce en un cultivo bacteriano
creciendo exponencialmente es una progresión geométrica de base 2, donde
existe una relación directa entre el número de células presentes inicialmente
en el cultivo (No) y el número presente tras un periodo de crecimiento
exponencial (N). Sabiendo el número inicial y final de células en una
población que está creciendo exponencialmente, es posible calcular n que
determina el número de generaciones durante el periodo de crecimiento
exponencial (ecuación 2.3.) (LEOQ s.f.).
[2.1.]
[2.2.]
22
[2.3.]
Donde:
N: número final de células
No: número inicial de células
n: número de generaciones que han ocurrido durante el periodo
de crecimiento exponencial.
El tiempo de generación (g), de la población celular se calcula como t/n
(ecuación 2.4.), donde t indica las horas o minutos de crecimiento
exponencial y n el número de generaciones; conociendo n y t, se calcula el
tiempo de generación g.
[2.4.]
La curva de crecimiento bacteriano se puede dividir en cuatro fases, en la
figura 2, se distinguen las diferentes fases: fase de latencia, fase del
crecimiento exponencial, fase estacionaria y fase de declinación.
23
Figura 2. Curva típica de Crecimiento de una Población Bacteriana
A continuación se describen las principales características de cada fase:
Fase de latencia: Hay un aumento de los componentes macromoleculares,
de la actividad metabólica y de la susceptibilidad a los agentes químicos y
físicos. Las células se ajustan a su nuevo ambiente y no hay un crecimiento
visible. La longitud de la fase depende del estado fisiológico y genético del
microorganismo al ser introducido en el medio de crecimiento. La fase de
latencia puede producirse en procesos de crecimiento y de inactivación
(Swinnen, 2004).
Según Geeraerd (2000), en caso de inactivación, la respuesta retardada
(fase de latencia) es observada como un “hombro” en la curva de
inactivación logarítmica.
Fase de crecimiento exponencial: Las células se dividen regularmente
según el tiempo de generación de cada especie. Por ejemplo, E. coli en un
24
determinado medio de cultivo puede dividirse cada 20 min durante esta fase
(Apella, s.f.).
Fase estacionaria: El número de células que son producidas es igual al
número de células que mueren, se establece un equilibrio dinámico en el
cual no existe un mayor crecimiento. En esta fase hay productos de
desecho, agotamiento de nutrientes, la variación del pH y otros factores que
ejercen un efecto nocivo sobre el cultivo, lo que produce una disminución de
la velocidad de crecimiento.
Fase de muerte celular: Se alcanza cuando la tasa de destrucción supera
la tasa de crecimiento. Las células mueren a una velocidad mayor a la que
se originan debido al agotamiento total de nutrientes y/o excesiva
acumulación de sustancias tóxicas. La velocidad de muerte y la duración de
esta fase varían en las distintas especies bacterianas. A veces la muerte va
acompañada de lisis celular y esto disminuye la absorbancia del cultivo
(LEOQ, s.f.).
2.2.4. FACTORES QUE AFECTAN AL CRECIMIENTO Y
SUPERVIVENCIA DE MICROORGANISMOS
Prácticamente todos los alimentos tienen microorganismos y el tipo y la
cantidad depende de varios factores como: propiedades del alimento,
manipulación y condiciones de almacenamiento del mismo. Estos factores
modifican la velocidad de crecimiento, provocando cambios que, a
determinados valores pueden llegar a ocasionar la muerte de los
microorganismos.
Entre los factores más importantes que influyen en el desarrollo de
microorganismos en los alimentos, están: nutrientes, pH, actividad de agua,
potencial redox (presencia de oxígeno o no en el ambiente) y temperatura.
25
2.2.4.1. Nutrientes
Muchos microorganismos utilizan a los alimentos como fuente de nutrientes
y energía para su desarrollo y en dependencia de los nutrientes que tenga
un alimento en particular, éste se considerará de mayor o menor riesgo. Si
un microorganismo no es capaz de utilizar cualquier componente mayoritario
en el alimento limitará su capacidad de crecer en él, por ejemplo, el caso de
la clara de huevo, en donde la escasez de nutrientes es utilizada como
defensa contra una infección microbiana.
En la leche, medio enriquecido para crecimiento microbiano, crecerán
mayoritariamente bacterias con capacidad de neutralizar enzimas
proteolíticas, debido a que tiene pocos aminoácidos libres y pépticos de bajo
peso molecular (Sabena, 2009).
2.2.4.2. pH
El pH del medio puede regular el transporte de protones, la degradación de
los aminoácidos, la adaptación a condiciones acídicas o básicas y aún la
virulencia.
En general, las bacterias crecen con mayor rapidez a pH comprendido entre
6,0 - 8,0; las levaduras entre 4,5 - 6,0 y los hongos filamentosos entre 3,5 -
4,0 (Leyva, s.f.). Si a un alimento se le cambia el pH los microorganismos
crecerán más lentamente.
Se conoce que un pH bajo limita el crecimiento microbiano, en los alimentos
con pH menores a 4.0, no se produce crecimiento de microorganismos
patógenos o indicadores de contaminación fecal tales como, Salmonella
spp., Escherichia coli, Staphylococcus coagulasa positiva, Clostridium
botulinum, Clostridium perfringens, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus,
Bacillus cereus (Leyva, s.f.). El pH de la leche se encuentra entre 6,5 y 6,7
(ligeramente ácido), esto favorece el crecimiento de una flora microbiana
diversa, pero las más favorecidas son las ácido lácticas.
26
2.2.4.3. Potencial redox
El potencial redox indica las relaciones de oxígeno y es utilizado para
especificar el ambiente en que un microorganismo es capaz de generar
energía y sintetizar nuevas células. De esta forma tenemos microorganismos
aerobios (presencia de oxígeno) y anaerobios (ausencia de oxígeno), pero la
mayoría de los microorganismos importantes para la salud pública en los
alimentos, son facultativos, es decir crecer en presencia y ausencia de
oxígeno.
Una forma de reducir el crecimiento microbiano es controlando la atmósfera
de los alimentos, creando condiciones de anaerobiosis.
Por lo general, en ciertos alimentos el desarrollo inicial de los
microorganismos es aeróbico y posteriormente al reducirse el potencial
redox comienza el desarrollo de los anaeróbicos. En la leche las bacterias
ácido lácticas se consiguen en abundancia y por ser varias de ellas
anaerobias facultativas, pueden desarrollarse en ambos ambientes (Pinzón,
2006).
2.2.4.4. Actividad de agua (aw)
Es el agua que se encuentra en los alimentos, disponible para el crecimiento
microbiano y para procesos químicos y enzimáticos. En los alimentos no
toda el agua se encuentra en estado libre, una parte se puede encontrar
ligada a las proteínas o formando parte de otros compuestos. La mayoría de
microorganismos, especialmente las bacterias se desarrollan a aw cercanas
a 1 (0.993-0.998) a valores inferiores, la velocidad de crecimiento o la masa
celular final disminuye y la fase de latencia aumenta, conservándose mejor
los alimentos. La aw de la leche está estimada en 0.99, ideal para bacterias
pero dificultando el crecimiento de mohos y levaduras (Pinzón, 2006).
27
2.2.4.5. Temperatura
Es uno de los parámetros más importantes que condicionan el crecimiento y
supervivencia de microorganismos; según sus características poseen
temperaturas óptimas, mínimas y máximas de crecimiento. Por encima de la
temperatura mínima la tasa de crecimiento va aumentando
proporcionalmente hasta alcanzar la temperatura óptima, debido a que las
reacciones metabólicas catalizadas por enzimas se van aproximando a su
óptimo. En dicha temperatura óptima las enzimas y reacciones se dan a su
máxima tasa posible (Caimanque, s.f). De acuerdo a la temperatura que
soportan los microorganismos se los clasifica en:
o Psicrófilos, crecen entre -5 a 30°C
o Mesófilos, presentan temperaturas entre mínimas (10-15°C),
óptimas (25-40°C) y máximas (35-47°C)
o Termófilos, presentan mínimos de 25°C, óptimos de 50-75°C y
máximos de 80-105°C.
Los valores de las temperaturas cardinales (mínima, óptima, máxima) varían
ampliamente entre las bacterias (tabla 4).
Tabla 4. Temperaturas (°C) para el crecimiento de bacterias
ESPECIE MÍNIMA ÓPTIMA MÁXIMA
Listeria monocytogenes 1 30-37 45
Pseudomonas maltophila 4 35 41
Escherichia coli 10 37 45
Clostridium kluyveri 19 35 37
Bacillus flavothermus 30 60 72
Thermus aquaticus 40 70-72 79
Pyrobacterium brockii 80 102-105 115
(Carrillo, 2003)
28
La temperatura de la leche después del ordeño favorece la rápida
multiplicación microbiana. La mayor proporción de la flora bacteriana
presente, son microorganismos mesófilos, por eso la refrigeración inmediata
a temperaturas de 4 a 5 ºC es fundamental para asegurar la calidad de la
leche. Pero su almacenamiento no debe ser prolongado (máximo 24 horas)
ya que favorecería el aumento de la flora psicrotrofa. Cuando la leche no
vaya a ser procesada el mismo día de recepción debe ser sometida a un
proceso de termización (Pinzón, 2006).
Para la determinación de microorganismos en alimentos se aplican técnicas
tradicionales que consisten en tomar una muestra del alimento e inocularla
en medios de cultivo, luego se incuban según las condiciones de tiempo y
temperatura requeridas por cada tipo de microorganismo, posteriormente se
realiza el recuento. Este procedimiento deberá realizarse por triplicado con el
fin de tener resultados estadísticamente representativos. Esto requiere el
uso de recursos económicos y es largo el tiempo que debe transcurrir para
obtener resultados.
Actualmente se han desarrollado alternativas como métodos rápidos para la
cuantificación de microorganismos, medios de cultivos listos para su uso, lo
que produce un ahorro de tiempo y recursos, sin embargo no reemplazan los
métodos tradicionales (Valero, 2006).
En los últimos años se ha venido desarrollando una ciencia dedicada a la
predicción del crecimiento microbiano con el uso de paquetes informáticos,
que permiten obtener datos inmediatos sobre el crecimiento de bacterias en
alimentos optimizando recursos que se generan con la microbiología
tradicional.
29
2.3. MICROBIOLOGIA PREDICTIVA
La microbiología predictiva (MP) consiste en la predicción a través de
modelos matemáticos y técnicas computacionales, el comportamiento de los
principales patógenos alimentarios sobre un alimento en respuesta a los
diferentes factores (pH, temperatura, actividad de agua, entre otros) que se
dan durante todas las fases de la cadena alimentaria tales como el
procesado, el almacenamiento, la distribución, entre otros. Los modelos
utilizan conocimientos acumulados en seguridad alimentaria en diferentes
alimentos, accesibles a través de bases de datos y predicen el tiempo que
tardarían los patógenos en empezar a proliferar bajo determinadas
condiciones y a qué velocidad crecerían una vez que comienzan. La MP es
una herramienta útil y económica en la investigación, la formulación de
nuevos productos, el diseño de procesos, en la implantación de los sistemas
HACCP, ya que permite la identificación de peligros microbiológicos en
alimentos, establece los puntos críticos de control y establece márgenes de
seguridad para aplicar medidas correctivas (Valero, 2006).
Para evaluar el riesgo microbiológico de un determinado producto se debe
conocer la carga microbiana en el alimento en el momento de su consumo,
esto requiere el conocimiento de la respuesta de los microorganismos frente
a factores ambientales que afectan su evolución en los alimentos y el tiempo
que tardan en alcanzar niveles de riesgo.
Esta rama científica permite simular las condiciones del alimento examinado,
cuantificando el comportamiento de los microorganismos en un producto a lo
largo del tiempo a través de parámetros de crecimiento, supervivencia o
inhibición. Asimismo, permite estudiar los procesos bioquímicos relacionados
con la producción de metabolitos (toxinas, compuestos volátiles, entre otros)
ante situaciones de combinación de factores de conservación y en distintos
niveles de aplicación (INVENTA, s.f.).
30
2.3.1. TIPO Y USO DE LOS MODELOS PREDICTIVOS
Los modelos matemáticos constituyen simplificaciones de la realidad. La
temperatura, el pH y la actividad de agua se consideran los parámetros que
más afectan al comportamiento microbiano. Sin embargo, existen casos en
los que hay que tener en cuenta otros factores intrínsecos como aditivos
conservadores (nitritos, ácidos orgánicos débiles y/o sus sales, entre otros.)
pero también extrínsecos y de procesado como atmósferas protectoras y
tecnologías de conservación como las altas presiones para tener un cuadro
completo de la realidad que se quiera reproducir.
Los modelos matemáticos son capaces de predecir la concentración
microbiana presente en el producto final, lo que determinará posteriormente
el nivel de exposición (Whiting, 1994).
La clasificación de los modelos va de acuerdo a su finalidad, tipo de bacteria
y su repercusión en la alteración del alimento o en su seguridad; estos
mismos parámetros se deben considerar antes de elegir el modelo que se
quiere aplicar. Están los modelos probabilísticos y cinéticos.
2.3.1.1. Modelos probabilísticos
Permiten estimar los límites de crecimiento/no crecimiento o producción/no
producción de toxina. Se utilizan más con microorganismos cuya sola
presencia representan un riesgo (Rodríguez, 2003).
2.3.1.2. Modelos cinéticos de crecimiento
Según Rodríguez (2003), los modelos cinéticos de crecimiento permiten
determinar el número de microorganismos en función del tiempo. Después
de ajustar la curva de crecimiento microbiana mediante funciones
matemáticas (modelos primarios) y estudiar sus parámetros según cambios
en las condiciones ambientales (modelos secundarios), es posible modelizar
31
el comportamiento microbiano en función de la temperatura, el pH, la
actividad del agua y otros factores, independientemente del alimento.
Whiting y Buchanan (1994) proponen clasificar los modelos predictivos en
tres niveles; primarios, secundarios y terciarios.
Modelos primarios
Los modelos primarios describen cómo varía el número de microorganismos
en función del tiempo a determinadas condiciones.
La representación de la evolución microbiana se suele hacer en logaritmos
decimales (Log UFC /ml) dada la naturaleza exponencial del crecimiento
microbiano. Dentro de este grupo, se encuadran los modelos de crecimiento
bacteriano como la función de Gompertz, y otros modelos mecanicistas
desarrollados por Whiting y Cygnarowicz-Provost (1992), o Baranyi y
Roberts, (1994) (Valero, 2006).
Modelos secundarios
Los modelos secundarios describen la relación entre los parámetros del
modelo primario (tasa de crecimiento específica, tiempo de adaptación,
densidad máxima de la población) y los factores ambientales tanto
intrínsecos (pH, actividad de agua) como extrínsecos (temperatura,
composición gaseosa) (García, 1995). A partir de esto se han desarrollado
varios modelos, unos para obtener un mejor ajuste de la ecuación a los
datos experimentales (empíricos) y otros que incluyen parámetros que
describen el comportamiento microbiano en un medio o alimento concreto
(mecanicistas).
Según explica Whiting (1994), los modelos más comúnmente utilizados son:
Ecuaciones de respuesta en superficie (polinomiales), Arrhenius y raíz
cuadrada (modelo de Bélehrádek).
32
Modelos terciarios
Los modelos terciarios se basan en los primarios y secundarios para
elaborar gráficos, predicciones y comparaciones deseadas. Estos modelos
usan expresiones matemáticas y programas informáticos donde se recopila
la información necesaria para la aplicación de los modelos predictivos.
Existe una gran cantidad de paquetes informáticos comerciales disponibles a
través de Internet como por ejemplo el PMP (“Pathogen Modelling
Program”), elaborado por el Departamento de Agricultura de EEUU (USDA)
en el que se incluyen modelos de crecimiento, inactivación, supervivencia y
muerte de distintos microorganismos patógenos y alterantes. El modelo
primario que utiliza es el de Gompertz.
El programae “Growth Predictor”, elaborado por el Institute of Food Research
en Norwich (Reino Unido) es parecido al PMP pero en este caso el modelo
primario que utilizan es el de Baranyi y solo se encuentran predicciones de
modelos de crecimiento.
“Seafood Spoilage Predictor”, propuesto por Dalgaard et al., (2002) para
predecir la vida media de productos de la pesca en base a su alteración
microbiológica a temperatura constante o en condiciones de fluctuación de
temperatura.
También existen bases de datos con información acerca de cómo los
microorganismos responden a diferentes ambientes como “ComBase”
(Combined Database of Microbial Responses to Food Environments). La
información en el ComBase es referida como datos “microbiológicos
cuantitativos”, ya que describe cómo los niveles de los microorganismos,
tanto deterioradores como patógenos, cambian en el transcurso del tiempo
bajo condiciones determinadas en medios de cultivo y alimentos, basado en
datos experimentales de distintos autores. Es una herramienta útil y eficaz
para la comparación y validación de modelos predictivos; además reduce la
redundancia al realizar estudios microbiológicos (RedSyCa, 2011).
Utilizando una interfase de internet, el usuario identifica los criterios que
interesan para un escenario específico, esto incluye el tipo o especie de
33
microorganismo, pH, temperatura, actividad de agua (o la concentración de
NaCl) y condiciones específicas de un alimento.
2.3.1.3. Modelos de supervivencia/inactivación
El factor principal de estos modelos es la temperatura y describen la cinética
del descenso de unidades logarítmicas de microorganismos con respecto al
tiempo.
La inactivación se puede dar por tratamientos térmicos y no térmicos. En la
inactivación no térmica generalmente se utilizan procesos de origen químico
(uso de conservantes) o físico (irradiación o técnicas de altas presiones),
pero en la inactivación térmica el calentamiento es el principal método.
Los parámetros cinéticos más representativos para estudiar la inactivación
térmica son los valores D y z, estos se basan en que las curvas de
supervivencia microbiana y de esporas bacterianas siguen una cinética de
primer orden; por lo tanto, el número de microorganismos supervivientes es
una función exponencial del tiempo de tratamiento (Huertas 2008).
Valor D (tiempo de reducción decimal), según explica Huertas (2008), “es
el tiempo que se precisa tratar a una población microbiana a la temperatura
T para reducir su recuento a la décima parte”, y se utiliza la ecuación 2.5.
[2.5.]
Donde:
= número de células al inicio del tratamiento
= número de células sobrevivientes después de un tratamientos de
t minutos a una temperatura T.
34
Valor z (ecuación 2.6.), “es el número de ºC que hay que aumentar a la
temperatura de tratamientos para reducir el valor D a la décima parte”
(Huertas, 2008)
[2.6.]
Este modelo es ampliamente aplicado pero no siempre sigue una cinética de
primer orden, en muchos casos de inactivación térmica se ha observado que
las curvas supervivencia obtenidas presentan fenómenos de hombros y/o
colas (Boekel, 2002).
Se han descrito varios modelos de inactivación en los que el descenso de la
población microbiana no es lineal, algunos manejan una teoría mecanística
(homogeneidad de la población) y otros una teoría probabilística
(heterogeneidad entre las células de la misma población aunque ésta sea
pura); la mayoría de ellos están representados en la figura 3.
35
Figura 3. Representación de los modelos de inactivación microbiana más
comúnmente utilizados.
(Valero, 2006)
Uno de los más utilizados por su simplicidad y flexibilidad es el modelo de
Weibull, útil para el análisis de datos de supervivencia en microbiología
después de aplicar un estrés. La forma acumulativa de la distribución de
Weibull, la cual fue modificada posteriormente por Mafart et al., 2002 se
indica en la ecuación 2.7.
[2.7.]
Donde:
No: número inicial de microorganismos (UFC/ml)
36
N: número de supervivientes luego de un tratamiento de
exposición en un tratamiento (UFC/ml)
t: tiempo del tratamiento (min)
: tiempo de la primera reducción decimal o factor de escala
: factor de forma
La distribución Weibull (Boekel, 2002) puede ser:
>1, significa que las células sobrevivientes al estrés se vuelven cada vez
más sensibles al calor, es decir el daño es acumulativo.
<1, significa que las células sobrevivientes al estrés tienen menos
probabilidades de morir, las células son más fuertes o tuvieron tiempo
para adaptarse al estrés.
=1, significa que la probabilidad de morir no depende del tiempo de
exposición al tratamiento, es decir no hay variación biológica y cada
célula es igualmente susceptible.
2.3.2. VALIDACIÓN
Un aspecto fundamental en la microbiología predictiva para demostrar que
predice con exactitud el comportamiento de microorganismos en los
alimentos durante el procesado, almacenamiento y distribución, es su
validación. Esta idea nace debido a que los modelos desarrollados en el
laboratorio suelen sobreestimar la inactivación o crecimiento microbiano a la
hora de aplicarlos en alimentos reales, en ocasiones los alimentos soportan
mejor el crecimiento de microorganismos que en los medios de laboratorio y
por otro lado, el nivel de contaminación del alimentos es menor que el
inoculo utilizado en el laboratorio (Valero, 2006).
Cuando un modelo matemático se construye y valida correctamente permite
la predicción del efecto del cambio de las condiciones de tratamiento sobre
37
la evolución microbiana. La precisión puede ser valorada gráficamente,
enfrentando los valores observados contra las predicciones del modelo
(Santos, 2007).
La proximidad en el valor del error cuadrático medio y los valores de R2 de
las ecuaciones ajustadas a la serie de datos, se han tomado como
indicadores de la fiabilidad de los modelos cuando se aplicaban a alimentos.
Otra medida de la exactitud de las ecuaciones predictivas fue introducida por
McClure et al., 1993 quienes compararon sus modelos basándose en el
sumatorio de los cuadrados de las diferencias del logaritmo natural de los
valores observados y predictivos para el tiempo de generación (g) (Santos,
2007).
38
3. METODOLOGÍA
3.1. MATERIALES
3.1.1. LECHE CRUDA
Se utilizó leche cruda que se adquirió en un mercado local de la parroquia de
Guayllabamba (cantón Quito), se trasladó inmediatamente al laboratorio, el
transporte se realizó a baja temperatura en un envase térmico.
3.1.2. CEPA DE Escherichia coli
Se utilizó una cepa certificada Escherichia coli ATCC 11775, adquirida en el
Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias Químicas de la
Universidad Central del Ecuador.
3.2. ACTIVACIÓN DE CULTIVO PURO DE Escherichia coli
Con el objeto de volver viable la bacteria que se encontraba congelada para
evitar el deterioro y que permanezca en su estado de latencia se tomó una
muestra de la cepa de Escherichia coli con una asa esterilizada y se la
introdujo en un tubo con 3 ml de caldo de cultivo (TSB) que se incubó a 37ºC
durante 24 horas (figura 4).
Posteriormente, se inoculó por estriado la bacteria en cajas petri con agar
nutritivo (figura 5) con el fin de obtener una población suficiente para poder
usarla en la investigación, las condiciones de incubación fueron: 37ºC por 24
horas.
El procedimiento se realizó bajo condiciones asépticas.
39
Figura 4. Cultivo de E. coli en TSB luego de 24 horas de incubación a 37ºC.
Figura 5. Cultivo de E. coli en agar nutritivo luego de 24 horas de incubación
a 37ºC
40
3.3. PREPARACIÓN DEL ESTÁNDAR MC FARLAND
Se preparó una suspensión de la bacteria usando la escala McFarland como
referencia para determinar la concentración a inocular. Esta escala está
compuesta por 10 tubos patrones usando para la investigación el tubo N°2
que corresponde a 6x108 UFC/ml.
Con un hisopo esterilizado se tomó la bacteria aislada de las cajas con agar
nutritivo y se introdujo en un tubo de ensayo que contenía 10 ml de agua
destilada estéril, hasta que la turbidez del tubo se iguale (visualmente) al
tubo Nº 2 de la escala McFarland, este tubo contiene una carga bacteriana
de 108 UFC/ml. A partir de estas concentraciones se realizaron las diluciones
sucesivas necesarias según el ensayo requerido en la investigación.
La escala Mc Farland se basa en la capacidad de precipitación de cloruro de
bario (BaCl2) en presencia del ácido sulfúrico (H2SO4), como se puede
observar en la tabla 5.
Tabla 5. Escala McFarland
(Dominguez s.f.)
41
3.4. CINÉTICA DE CRECIMIENTO Y DETERMINACIÓN DEL
TIEMPO GENERACIONAL DE Escherichia coli EN TSB
Para obtener la curva de crecimiento se redujo la carga bacteriana del tubo
patrón preparado con la ayuda de la escala McFarland de 108 a 102
mediante diluciones sucesivas (figura 6), este último tubo de ensayo se
colocó en un matraz con 90 ml de TSB designado como 100 para las
diluciones próximas. El matraz de TSB inoculado con Escherichia coli se
incubó a 37ºC, tomando muestras cada hora, realizando el número de
diluciones sucesivas convenientes considerando el ciclo de vida de la
bacteria durante 24 horas. Las tres últimas diluciones se inocularon por
vertido en cajas Petri con agar nutritivo. Las cajas se incubaron a 37ºC por
24 horas, transcurrido ese tiempo se procedió al recuento de UFC de cada
caja. El procedimiento se realizó por duplicado.
Figura 6. Procedimiento para determinar la curva de crecimiento: diluciones
sucesivas a partir de la solución stock de E. coli
42
3.5. ANÁLISIS FÍSICO QUIÍMICOS DE LA LECHE
Para introducir los datos experimentales en el software de microbiología
predictiva fue necesario realizar el análisis de los parámetros físico químicos
de la leche que se describen a continuación:
3.5.1. DETERMINACIÓN DEL pH DE LA LECHE
El pH de la leche se calculó directamente con medidor de pH. Se colocaron
25 ml de leche en un vaso de precipitación, se introdujo el bulbo y se tomó la
medida. El análisis se realizó por triplicado.
3.5.2. DETERMINACIÓN DE HUMEDAD DE LA LECHE
Se utilizó una cápsula de porcelana con arena previamente tarada en la
estufa a 103°C por 4 horas y enfriada en el desecador por 15 minutos en la
que se colocó 10 ml de muestra y se llevó nuevamente a la estufa con las
mismas condiciones de tiempo y temperatura. Transcurrido este tiempo se
pesó la muestra para calcular el porcentaje de humedad por diferencia de
peso. El análisis se realizó por triplicado.
Para calcular el contenido de humedad libre presente en la muestra se utilizó
la ecuación 3.1.:
[3.1.]
Donde:
= Masa inicial de la muestra en gramos.
= Masa final de la muestra en gramos.
43
3.5.3. DETERMINACIÓN DE NaCl EN LECHE
Los cloruros de la muestra se valoraron con una solución de AgNO3,
empleando K2CrO4 como indicador.
La plata tiene una gran afinidad por los cloruros, estos se unen formando
cloruro de plata que es incoloro. Cuando todo el cloro está en forma de
cloruro de plata, la plata reacciona con el cromato potásico formando
cromato de plata que es de color mostaza rojizo.
2AgNO3 + K2CrO4 → 2KNO3 + Ag2CrO4
Para determinar el contenido de NaCl se tomaron 10 ml de muestra en un
matraz, se añadieron dos gotas de K2CrO4 y se agitó para homogenizar la
muestra, la cual se tornó de un color amarillo claro.
En una bureta se colocó una solución de AgNO3 0,1N y gota a gota se
agregó al matraz agitando constantemente hasta llegar al viraje de color
ladrillo.
El análisis se realizó por triplicado y en cada titulación se anotó el volumen
de AgNO3 0,1N consumido para los cálculos correspondientes, según la
ecuación 3.2.
[3.2.]
Donde:
= Volumen consumido
= Normalidad
= miliequivalente
= Peso de la muestra
44
3.6. DETERMINACIÓN DEL COMPORTAMIENTO DE
Escherichia coli EN LECHE CRUDA DURANTE EL
AUMENTO DE TEMPERATURA
Para determinar el comportamiento de la E.coli en la leche se realizaron 2
tratamientos con diferentes poblaciones de la bacteria inoculadas
artificialmente en el producto y un control (leche sin inoculación artificial de
E. coli).
Para el primer tratamiento se colocaron 180 ml de leche cruda en un frasco
vacío previamente esterilizado en el que se añadieron 20 mL de una
concentración 106 UFC/mL de E. coli (definida según el estándar
MacFarland) y se homogenizó. Con el objeto de conocer la población inicial
de E. coli se realizó un primer recuento una vez inoculado el microorganismo
y se realizaron 3 diluciones sucesivas (10-2, 10-3 y 10-4), cada una de ellas se
inoculó en cajas mediante la técnica de vertido con agar Chromocult (medio
selectivo para coliformes totales y E. coli). Las cajas se incubaron a 37°C por
24 horas.
Posteriormente, el frasco fue sometido a calentamiento utilizando un baño
térmico (Thermostatic Wather Bath, modelo YCW-04M) y se realizaron
recuentos a intervalos de 10°C, iniciando en 25°C hasta llegar a 65°C. La
temperatura se controló con la ayuda de un termómetro de pincho (Multi-
Thermometer, rango -50ºC a 300ºC) introducido en el frasco durante todo el
procedimiento. Las diferentes diluciones sucesivas realizadas a cada
temperatura de muestreo se inocularon por vertido en agar Chromocult y se
incubaron a 37°C por 24 horas.
En el segundo tratamiento se utilizó una población de 104 UFC/mL de E. coli
y se repitió la metodología descrita anteriormente.
45
Se realizó un control con el fin de comprobar si la leche se encontraba
contaminada antes de la inoculación artificial.
Los recuentos se realizaron por triplicado y los ensayos se realizaron por
duplicado.
Con el fin de determinar la temperatura más cercana a la real a la que
produce la muerte de la bacteria, se repitió el ensayo a intervalos de
temperatura más cortos, estos fueron: uno inicial (inmediatamente después
de la inoculación en la leche, antes del calentamiento) y los siguientes a 50,
53, 56, 58 y 60°C. El ensayo se realizó por duplicado.
Además, para evaluar el efecto del medio de cultivo, se realizaron ensayos
paralelos, similares a los anteriores cambiando el medio de cultivo, es decir,
se reemplazó la leche cruda por caldo de cultivo (TSB).
El recuento de E. coli se realizó basado en NTE INEN 1529-13-98 “Control
Microbiológico de los Alimentos. Enterobacteriaceae. Recuento en placas
por siembra en profundidad” literal 7.3.
3.7. USO DEL SOFTWARE DE PREDICCIÓN
Para la microbiología predictiva se aplicó un software de predicción llamado
ComBase Predictor, que cuenta con una base de datos de cómo responden
ciertos microorganismos a diferentes condiciones ambientales en función del
tiempo. También cuenta con una aplicación para ajustar los datos
experimentales en función del tiempo y extraer parámetros como la tasa de
crecimiento / muerte y retraso / hombro, llamada DMFit. A continuación, las
figuras 7 y 8 muestran los elementos y parámetros necesarios para la
predicción:
46
Figura 7. Elementos de ComBase Predictor
a) Growth model / Thermal inactivaction model / Non termal survival
model: Permite elegir el tipo de modelo.
b) Temperature input: Permite seleccionar la variación o no de
temperatura.
c) Water activity: Permite escoger entre dos parámetros de crecimiento
(NaCl o aw).
d) Observation duration: Tiempo de duración del tratamiento,
expresado en horas.
e) add a row: Permite añadir otra celda de datos, realiza hasta cuatro
predicciones a la vez.
a
b c
d e f
g
h
h i j k l m
n o
47
f) Viñeta que permite seleccionar el tipo de microorganismo de un
conjunto de aproximadamente 50 tipos de bacterias de las cuales se
obtienen .curvas microbianas de crecimiento y sobrevivencia.
g) Initial level: Concentración inicial que se inoculó en la muestra.
h) Phys state: Estado fisiológico, depende de las condiciones en las que
se desarrolla en microorganismo.
i) T(ºC): Temperatura en que se realizó el tratamiento.
j) pH del medio de cultivo utilizado.
k) %NaCl del medio de cultivo utilizado.
l) %CO2 en las se aplicó el tratamiento.
m) Max.rate y Dbl. time: Tiempo generacional y Tasa máxima de
crecimiento dados por el programa con respecto a la base de datos
que maneja.
n) Pantalla de datos generados por el programa en función del tiempo
(h) y concentración de microorganismos (Log10 UFC/ml).
o) Zona donde se generan los gráficos en base a la predicción.
48
Figura 8. Elementos de DMFit
a) Choose a model: Permite seleccionar el tipo de modelo que se
aplicará.
b) Input your data in the texbox: Pantalla para introducir datos
experimentales en función del tiempo (h) y concentración de
microorganismos (Log10 UFC/ml).
c) Pantalla de los datos generados por el programa a partir de los
experimentales (ajuste de datos).
d) Zona donde se generan los gráficos en base a los datos
experimentales y del programa después del ajuste.
e) Estimated parameters and standard errors: Datos generados por el
programa de la tasa de crecimiento / muerte y retraso / hombro.
49
4. ANÁLISIS DE RESULTADOS
4.1. CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE Escherichia coli Y
DETERMINACIÓN DEL TIEMPO GENERACIONAL
4.1.1. CURVA DE CRECIMIENTO
La curva de crecimiento se realizó a temperatura constante (37 ºC) usando
como medio de cultivo TSB, este medio tiene un pH de 7,3 y de 0,45% de
NaCl. En la figura 9 se muestra la cinética de crecimiento de la bacteria E.
coli en condiciones óptimas, los datos para realizar la curva se obtuvieron
experimentalmente y fueron comparados con los datos obtenidos a través
del programa informático ComBase Predictor (Anexo 1).
Figura 9. Curva de crecimiento determinada a través de microbiología
clásica y microbiología predictiva (ComBase)
00
02
04
06
08
10
12
14
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27
Log
10 (
UFC
/ml)
Tiempo (h)
50
En una curva de crecimiento típica se identifican cuatro fases principalmente:
latencia, exponencial, adaptación y muerte. Por lo general, en la fase de
latencia, la división celular no se produce inmediatamente y no hay un
incremento neto de masa, sin embargo es un proceso activo donde la célula
está sintetizando nuevos componentes; en nuestro caso en particular, en la
curva experimental, esta fase apenas se distingue por lo que se asume que
la adaptación de la bacteria al medio fue rápida, ésta puede prolongarse si
se tratase de células viejas con cantidades reducidas de ATP o si el medio
es diferente al anterior donde crecían los microorganismos; mientras más
concentración de nutrientes se presente en el medio, más rápido será el
crecimiento caso contrario no solo el crecimiento será más lento sino que no
se manifestará ni alcanzará un desarrollo de manera plena; por lo tanto, la
duración de la fase de latencia varía considerablemente según el estado de
los microorganismos y la naturaleza del medio (Prescott, 2002). En cuanto a
la predicción, no se observa la fase de latencia porque el modelo predictivo
se concentra mayormente en la tasa de crecimiento. De acuerdo con el
paquete informático ComBase, es más difícil el modelado de la fase de
latencia, debido a que no solo depende de las condiciones actuales sino
también de la historia o estado fisiológico de las células.
En la fase exponencial tanto en la curva experimental (color rojo) como en la
predicción (color azul) se observa un crecimiento rápido, cada célula se
divide en un momento ligeramente diferente del resto, por eso la curva
aumenta suavemente en lugar de hacer saltos discretos. El cultivo se
comporta como una reacción autocatalítica (donde hay un aumento de
componentes y constituyentes por un mismo factor en la unidad de tiempo)
hasta que los nutrientes disponibles se agotan (Vélez, 2003). En esta fase se
puede determinar la velocidad de crecimiento bacteriano y el tiempo
generacional, ya que la velocidad se mantiene constante y los
microorganismos se duplican en número a intervalos regulares. Además los
cultivos en fase exponencial se utilizan en estudios bioquímicos y
fisiológicos, ya que la población es más uniforme, química y equilibrada. Se
51
origina un crecimiento desequilibrado cuando la velocidad de síntesis de los
componentes celulares varían entre sí, esto ocurre al modificar las
concentraciones de nutrientes o cambiar las condiciones ambientales
(Prescott, 2002).
Los valores de la curva experimental varían, haciendo que la recta no sea
completamente continua como ocurre en la curva de la predicción, esto se
debe a que la E. coli no es la única bacteria presente en la leche, por lo tanto
su crecimiento se ve afectado por la accesibilidad que tiene a los nutrientes.
En cambio, los modelos de predicción asumen que el alimento es ideal, que
la única bacteria presente es la E. coli y el crecimiento es bajo condiciones
de laboratorio perfectamente controladas. Además, el ComBase menciona
que la variación de la concentración celular se describe por una curva
matemática (crecimiento o la supervivencia) llamado modelo primario.
Modelos secundarios describen cómo los parámetros de los modelos
primarios dependen de factores ambientales como la actividad de la
temperatura, el pH y el agua. Estos se describen por funciones matemáticas,
y, por interpolación, la concentración celular contra el tiempo.
Los microorganismos alcanzan la fase estacionaria por varias razones:
limitación de nutrientes, disponibilidad de O2, acumulación de residuos
tóxicos o cuando alcanza un nivel crítico poblacional. La fase estacionaria de
la curva experimental (color rojo) no está claramente definida y difiere a la
predicción (color azul), sin embargo la microbiología tradicional justifica esta
irregularidad considerando que en esta fase ocurren cambios dramáticos en
la estructura y fisiología no solo de la E. coli sino en la mayoría de bacterias;
disminuye el volumen celular y las bacterias se redondean, disminuye la tasa
global de síntesis de ADN, ARN y proteínas, aumenta la degradación de
proteínas, se reorganiza el metabolismo general y se acumulan compuestos
de reserva (polifosfato y glucógeno) y osmoprotección (trehalosa y glicina
betaina), según Apella, (s.f.) la transición entre la fase de latencia y
estacionaria, implica una etapa de crecimiento desequilibrado (crecimiento
52
no balanceado) durante el cual los componentes celulares son sintetizados a
diferentes velocidades por la acumulación de productos tóxicos y hay un
aumento del tiempo generacional (Prescott, 2002).
El tiempo de estudio fue de 24 horas, tiempo en el que aparentemente la
bacteria no alcanza su fase de muerte. La muerte de una población
microbiana al igual que el crecimiento en la fase exponencial es de forma
logarítmica. Este modelo se mantiene aunque se observe que el número de
células permanece constante, ya que las células no se lisan inmediatamente
después de morir (Prescott, 2002).
4.1.2. TIEMPO GENERACIONAL
Se calculó el tiempo generacional según las ecuaciones 2.3. y 2.4., luego de
la incubación del medio (TSB) inoculado con E. coli a 37ºC por 24 horas, se
obtuvo el número de generaciones que han ocurrido durante el periodo de
crecimiento exponencial (n = 31,89), a partir de este dato y el tiempo del
tratamiento se obtuvo como tiempo generacional de la bacteria que fue de
22,56 min; es decir, la bacteria E. coli tarda 22,56 minutos en duplicar su
población, valor que concuerda con la literatura donde se menciona que el
crecimiento microbiano ocurre por fisión binaria, y en el caso de la E. coli
bajo las mejores condiciones puede completar su ciclo en 20 minutos (Leyva
s.f.), según se explica con los siguientes cálculos:
53
Se ha encontrado que los factores que afectan el desarrollo de la bacteria y
por lo tanto influyen en el tiempo generacional como: temperatura, toxicidad,
nutrientes, pH, humedad, entre otros; no son independientes sino que se
encuentran interrelacionados por lo que al evaluar el efecto individual de
cada factor no se puede elucidar por separado el efecto de los demás
(Knaysi, 1948).
El tiempo de generación varía en función de las condiciones del medio: se
observa que al aumentar la temperatura o el pH, se produce un aumento
significativo de este indicador (Beldarraín et al. 2009). Determinar el tiempo
generacional es importante para saber el tiempo que tarda la célula en
duplicarse y por ende para determinar cuando un alimento alcanza un
número de microorganismos necesario para causar enfermedad.
Cualquier modificación del medio que prolongue el tiempo de generación
prolongará el tiempo de conservación del alimento, ya que retarda el inicio
de la multiplicación bacteriana. Se ha comprobado que para crecer, las
bacterias o sus esporas que han sido sometidas a tratamientos térmicos
necesitan un medio de cultivo más rico que el que necesitan los
microorganismos que no han estado sometidos a temperaturas elevadas.
Tratamientos térmicos como la pasteurización permiten la destrucción de
parte de la población microbiana y aunque no la destruye por completo, bajo
las condiciones adecuadas retarda el crecimiento y reproducción de
bacterias y confiere al alimento la vida útil deseada (Solanes, s.f).
54
4.2. ANÁLISIS FÍSICO QUÍMICOS DE LA LECHE
Los análisis físicos químicos que se realizaron en la leche fueron: pH,
humedad y %NaCl. Los resultados se indican en la tabla 6
Tabla 6. Análisis físico químicos de la leche cruda
Ensayo
pH Humedad
(%) NaCl (%)
6.60 89.80 0.22
La norma técnica ecuatoriana para leche cruda NTE INEN 9:2003 no
establece estándares para estos análisis, por lo tanto los resultados
obtenidos no se pueden comparar con dicha norma, sin embargo, la muestra
presentó valores permitidos para su comercialización.
La leche para una gran variedad de bacterias es considerada como un
ambiente favorable debido a su actividad de agua, ya que a partir de su
disponibilidad en el medio, las bacterias desarrollan diferentes capacidades
para multiplicarse; además si la bacteria crece en un medio líquido, las
células que se producen en cada división continúan su vida
independientemente en la mayoría de los casos, formando una suspensión
de células libres (Valderrama, 2008).
Con respecto al pH, su valor es idóneo para la proliferación de bacterias, ya
que la mayoría crecen en un pH cercano a la neutralidad. Además el valor
concuerda con el medio de cultivo utilizado (TSB) para la determinación de
la curva de crecimiento y tiempo generacional.
La función del NaCl en un medio de cultivo es equilibrar la presión osmótica
del medio extracelular, es decir, que la concentración de soluto del exterior
55
se equipare con la concentración del interior de la célula para detener el flujo
neto de disolvente a través de la membrana. El sodio es requerido por
bacterias halofílicas, por ejemplo se precisa una concentración elevada de
ion sodio para mantener la integridad de la membrana de muchas bacterias
halófilas como Halobacterium. Es por eso que a concentraciones muy altas
actúa como inhibidor de otras bacterias.
4.3. COMPORTAMIENTO DE E. coli EN LECHE Y EN TSB
Se realizaron por separado los análisis utilizando como medio de cultivo
leche cruda y TSB, inoculados con diferentes poblaciones de E. coli (106, 104
UFC/mL) además se comparó el recuento con una muestra de leche sin
inoculación artificial (denominada control) y las muestras se sometieron a
calentamiento hasta alcanzar una temperatura de 65ºC en un tiempo
aproximado de 20 minutos. La tabla 7 muestra los resultados promedio que
se obtuvo de los ensayos realizados tanto en leche como en TSB. A partir de
los resultados obtenidos se calculó la pendiente de la recta con la que se
estableció la velocidad de muerte.
Tabla 7. Cálculo de velocidad de muerte de E. coli durante el calentamiento
de leche y TSB
TEMPERATURA (ºC)
TIEMPO (h)
Población de E. coli inoculada artificialmente
(106) (10
4) Control
Log10 (UFC/ml)
TSB LECHE TSB LECHE LECHE
15 0 -- 6.01 -- 4.09 3,33
25 0.03 6.03 5.98 3.78 4.22 3.34
35 0.06 6.05 6.04 3.80 4.20 3.24
45 0.11 6.02 6.03 3.75 4.09 3.50
55 0.17 5.84 5.96 3.66 4.11 2.93
65 0.33 -- -- -- -- --
Velocidad muerte (Log10 UFC/ml/h)
-36.52 -37.28 -22.87 -25.71 -18.36
56
Como se puede observar en la tabla 7, no se encontró población viable al
alcanzar la máxima temperatura del tratamiento (65ºC); lo que significa que
entre 55 – 65ºC se produjo la muerte de la bacteria. La velocidad de muerte
(Log10 UFC/ml/h) de la bacteria inoculada artificialmente en leche fueron:
-37.28 y -25.71 para una población de 106 y 104, respectivamente; mientras
que en la leche sin inoculación artificial (control) fue de -18.26. Cuando se
inoculó la bacteria en TSB los resultados fueron: -36.52 y -22.87 para una
población de 106 y 104, respectivamente.
Al comparar la velocidad de muerte en leche y TSB para cada población se
puede observar que es ligeramente mayor en la leche, lo que significa que a
pesar de estar bajo las mismas condiciones de tiempo y temperatura, la E.
coli tiene un grado de resistencia mayor en el medio de cultivo TSB. Sin
embargo, se puede decir, que el medio de cultivo no influyó en la muerte de
la bacteria, ya que la diferencia es relativamente baja. Además los dos
medios (leche y TSB) tienen propiedades nutritivas ideales para la
proliferación de una amplia variedad de microorganismos. De acuerdo a
Wang (1997) los componentes nutricionales que convierten a la leche en
parte fundamental de la dieta humana son los mismos componentes que
permiten el crecimiento de muchas bacterias patógenas asociadas con leche
o productos lácteos.
Para validar los resultados experimentales anteriores se utilizó el programa
informático ComBase Predictor, en el que se utilizó un modelo de
crecimiento con cambio de temperatura. Para obtener el modelado de la
curva se ingresaron los siguientes datos:
- El nivel inicial (Initial level), que es la concentración inicial que se
inoculó en la leche, en este caso se utilizaron 2 concentraciones 106 y
104.
- El estado fisiológico (Phys. State) varía entre 0 y 1 y el valor que se
adopte depende de las condiciones en las que se desarrolla el
microorganismo, para este estudio se estableció un estado fisiológico
de 0,75 considerando que el pH, el %NaCl, la aw y los nutrientes de la
57
leche son ideales para el crecimiento bacteriano, no obstante no
puede ser 1 debido a que el rango de temperatura en el que se
trabajó tiene temperaturas superiores e inferiores a la óptima.
- El rango de temperatura para este modelo se contempló entre 10 y 42
ºC.
- pH fue de 6.59, según se indica en la sección 4.2.1.
- % NaCl fue de 0.2217, según se indica en la sección 4.2.3
- CO2 con un valor de 0 %CO2, puesto que es un elemento que se lo
utiliza en alimentos envasados con atmósferas modificadas.
A pesar de que el estudio se realizó hasta alcanzar una temperatura de
65ºC, el programa ComBase Predictor solo permite temperaturas entre 10 y
42ºC, es por esto que se realizó una interpolación de los valores contenidos
entre esas temperaturas. En la tabla 10 se incluyen los valores interpolados
obtenidos por la microbiología clásica y microbiología predictiva, para la
inoculación artificial de E. coli en leche.
Tabla 8. Interpolación de los valores dentro de un rango de temperatura de
10 – 42ºC
TIEMPO (min)
TEMPERATURA
(°C)
Microbiología clásica Microbiología predictiva
106 10
4 Control 10
6 10
4 Control
Log10 (UFC/ml) Log10 (UFC/ml)
0 15.0 6.00 4.09 3.33 6.00 4.10 3.30
0.6 18.3 6.00 4.14 3.33 6.00 4.10 3.30
1.2 20.1 5.99 4.18 3.33 6.00 4.10 3.30
1.8 26.2 5.98 4.22 3.34 6.01 4.11 3.31
2.4 28.3 6.00 4.21 3.31 6.01 4.11 3.31
3.0 32.8 6.02 4.21 3.28 6.02 4.12 3.32
3.6 35.0 6.04 4.20 3.24 6.03 4.13 3.33
4.2 36.1 6.04 4.18 3.30 6.03 4.13 3.33
4.8 38.1 6.03 4.16 3.36 6.04 4.14 3.34
5.4 40.6 6.03 4.14 3.41 6.05 4.15 3.35
58
En la figura 8, se muestra la comparación de los recuentos durante el
calentamiento de leche de dos diferentes poblaciones (106 y 104 UFC/mL) de
E. coli inoculados artificialmente, obtenidos mediante microbiología clásica
(línea continua) y microbiología predictiva (línea punteada), se puede
observar que el crecimiento bacteriano aplicando microbiología predictiva es
más uniforme y equilibrado que con la microbiología clásica, sin embargo, el
rango en el que oscilan las bacterias es menor a 0.5 log10 (UFC/ml),
permitiendo la validación de los resultados mediante el paquete informático
Combase. Además los resultados se compararon con una muestra sin
inoculación artificial denominada control.
59
Figura 10. Modelado del recuento de E. coli durante el calentamiento de
leche inoculada con E. coli (106 y 10
4 UFC/ml) y la control
006 006 006 006 006 006 006 006 006 006 006 006 006 006 006 006 006 006 006 006 006
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6
Log 1
0 (
UFC
/ml)
004 004 004 004 004 004 004 004 004 004 004 004 004 004 004 004 004 004 004
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6
Log 1
0 (
UFC
/ml)
003 003 003 003 003 003 003 003 003 003 003 003 003 003 003 003 003 003
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6
Log 1
0 (
UFC
/ml)
Tiempo de calentamiento (min)
60
4.4. INACTIVACIÓN DE E. coli
Como se mencionó anteriormente la bacteria E. coli utilizada en el presente
estudio muere en un rango de temperatura de 55 a 65ºC. Con estos
antecedentes, se determinó la temperatura de muerte usando intervalos más
cortos de temperatura.
En la figura 11, se puede observar que para la población de 104 UFC/mL a
partir de 7 minutos (que corresponden a 50°C) disminuyó tanto en TSB
como en leche. Mientras que la población de 106 UFC/mL disminuyó a partir
de 12 minutos (que corresponden a 56°C).
Estas observaciones indicarían, por un lado, que el medio de cultivo (TSB y
leche) no influyó sobre el comportamiento de la bacteria, ya que, los
resultados de los recuentos de cada medio son similares y por otra parte,
que a mayor cantidad de microorganismos se requiere de mayor
temperatura para su inactivación. Una vez que el medio ha alcanzado una
temperatura de 58°C no se detectó población de la bacteria lo que
aseguraría la eliminación completa de este microorganismo.
61
Figura 11. Inactivación de poblaciones de 104 y 106 UFC/ml de E. coli en
leche y TSB
00 01 01 02 02 03 03 04 04 05 05 06 06 07 07
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
Log
10 (
UFC
/ml)
00
01
01
02
02
03
03
04
04
05
05
06
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
Log
10 (
UFC
/ml)
Tiempo de calentamiento (min)
62
Con el fin de determinar qué cambios ocurren en la población de la bacteria
durante la inactivación térmica se hizo una interpolación de los datos
experimentales y se los comparó con los datos obtenidos a través del
programa de predicción ComBase, se utilizó una nueva herramienta del
ComBase llamada DMFit, que es una aplicación para ajustar los datos
experimentales en función del tiempo y extraer parámetros como la tasa de
crecimiento / muerte y retraso / hombro. Los datos obtenidos se muestran en
el anexo 2.
Los datos obtenidos en el programa de predicción se compararon con los
resultados experimentales (figura 12), las curvas presentan cierta similitud
entre ellas, sin embargo en todas las curvas experimentales hay un
descenso brusco de 1.56; 0.68 y 1.56 unidades logarítmicas después de
15.6; 10.2 y 10.2 min para las poblaciones de 106; 104 y control,
respectivamente; se observó que experimentalmente la E. coli muere entre
los 55 y 58°C, teóricamente la E. coli soportaría una temperatura máxima de
45°C
63
Figura 12. Inactivación de E. coli durante el calentamiento de leche
inoculada con E. coli (106 y 10
4 UFC/ml) y la control
00 00 01 01 02 02 02 03 03 04 04 04 05 05 06 06 06
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27
log
10 (
UFC
/ml)
00 00 01 01 01 02 02 02 02 03 03 03 04 04 04 05
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27
log
10 (
UFC
/ml)
00 00 01 01 01 02 02 02 02 03 03 03 04 04 04
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27
log
10 (
UFC
/ml)
Tiempo de calentamiento (min)
64
Las curvas experimentales de la población 104 y del control presentaron una
característica peculiar llamada “hombro”, ocurre cuando hay un incremento
inicial de la población antes de que las células empiecen a morir, esto se
debe a que la población microbiana tiene varias subpoblaciones, cada una
con su propia inactivación cinética; es poco probable que todas las células
se comporten de la misma manera y que la muerte de una sola célula se
deba a un solo evento. Aunque la población sea pura, el tiempo de
inactivación varía para cada microorganismo debido a la variación biológica,
por lo tanto la curva es el resultado de varios patrones de inactivación
(Boekel, 2002).
De acuerdo a Corradini, (2009) las células de E. coli producen proteínas de
choque térmico que les ayudan a sobrevivir a tratamientos suaves de
temperatura, ya que su metabolismo se ajusta en respuesta a una tensión y
aumenta su capacidad de supervivencia, sin embargo necesitan tiempo para
activar su sistema de protección y sintetizar elementos químicos por lo que,
la velocidad de calentamiento debe ser baja.
4.5. APLICACIÓN DE LA MICROBIOLOGÍA PREDICTIVA
Una aplicación de la microbiología predictiva podría ser la predicción del
crecimiento de E. coli en leche a diferentes temperaturas. Para este ejemplo
en particular se utilizó dos temperaturas: 37ºC (temperatura óptima de
crecimiento) y 10ºC (temperatura máxima de refrigeración).
Los resultados se muestran en la figura 13, donde la curva (A) corresponde
al crecimiento de E. coli a 37ºC y (B) corresponde al crecimiento de E. coli a
10ºC. La figura muestra claramente que la temperatura juega un papel
importante en el crecimiento de la bacteria, ya que a pesar de que el resto
de parámetros (pH, %NaCl, estado fisiológico, entre otros) son los mismos
en las dos curvas, son completamente diferentes; en la curva (B) se observa
un crecimiento lento, tanto que no alcanza la fase exponencial sino que se
65
mantiene en latencia, mientras que en la curva (A) se distingue fácilmente
las fases exponencial y estacionaria.
A 37ºC el tiempo generacional de la bacteria es de 0.27h mientras que a
10ºC tarda 7.62h en duplicar el número de células.
Figura 13. Crecimiento de E. coli en leche a diferentes temperaturas
utilizando microbiología predictiva
Esta misma aplicación se puede hacer bajo las condiciones y factores
requeridos y a pesar de que el modelado matemático es realizado
generalmente, asumiendo condiciones constantes para determinar los
valores de los parámetros cinéticos de crecimiento; actualmente está
orientado a la obtención de modelos dinámicos, que permitan predecir la
seguridad o vida útil de los alimentos bajo condiciones fluctuantes, ya que
factores como temperatura, pH o composición de la atmósfera gaseosa no
se mantienen constantes durante el procesado y almacenamiento de los
alimentos (Labuza y Taoukis, 1992). Uno de los factores que más fluctúa es
(A)
(B)
66
la temperatura de almacenamiento y es el más investigado (Roos y
McMeekin, 1994).
Los modelos predictivos son una manera muy eficaz rápida, eficiente y de
bajo costo para evaluar el potencial de crecimiento de los microorganismos
bajo condiciones específicas sin necesidad de estudios prácticos, por
ejemplo, durante el desarrollo de productos, una formulación puede cambiar
varias veces antes de obtener la adecuada y no siempre es posible evaluar
experimentalmente la vida útil de todas las posibles formulaciones, mediante
esta herramienta es trabajo se vuelve más rápido y económico además,
permite evaluar el crecimiento microbiano cuando las condiciones del
producto cambian durante cualquier etapa en la producción.
Otra aplicación importante es la determinación de la vida útil en una gran
variedad de alimentos (por ejemplo en productos cárnicos: Vankerschaver y
col., 1996; Kant-Muermans y col., 1997; Neumeyer y col., 1997a, b;
Devlieghere y col., 1999). Los sistemas de predicción pueden ser utilizados
para predecir el tiempo necesario para que organismos patógenos u
organismos que producen toxinas alcancen niveles perjudiciales para la
salud.
En la actualidad, existen modelos predictivos que abarcan productos
alimenticios específicos que se basan en organismos de descomposición
que ataca dicho producto. Hay modelos para pescado, carne, productos
frescos y levaduras en frutas y bebidas, además de una amplia gama de
modelos para alimentos acidificados.
Se debe tener en cuenta que al igual que ocurre con el análisis de riesgos y
el HACCP, la predicción debe considerar todas las etapas en la producción
de un alimento. Deben obtenerse datos exactos acerca de las materias
primas utilizadas, la formulación de productos, montaje de productos,
técnicas de procesamiento, condiciones de higiene, tipo de empacado
67
empleado, almacenamiento, procesos de distribución y el manejo final del
consumidor para obtener una predicción fiable (Santos, 2007).
En la actualidad, la contaminación ambiental, los alérgenos, la aparición de
nuevas enfermedades transmitidas por alimentos, etc. son elementos de
riesgo para la salud de los consumidores, que requieren avances científicos,
tecnológicos y desarrollos legales en el campo de la Seguridad Alimentaria.
Es importante adoptar nuevas tecnologías y sistemas para la gestión de la
seguridad alimentaria como la microbiología predictiva, un campo aún
desconocido en el Ecuador, que tiene grandes proyecciones a nivel
internacional, ya que, no solo permite un control rigurosos del
comportamiento microbiológico en diferentes ambientes sino que también
mejorar e implementar un plan HACCP para prevenir el riesgo de
contaminación alimentaria, además representa una ventaja competitiva para
la empresa.
68
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1. CONCLUSIONES
El crecimiento de las bacterias en un medio de cultivo puede
determinarse midiendo experimentalmente el incremento del número
de células en su fase exponencial, donde alcanzan su velocidad
máxima de crecimiento. De acuerdo con los resultados
experimentales obtenidos la E. coli puede duplicar el número de
células (tiempo generacional) en 22.56 minutos si se encuentra bajo
condiciones óptimas de crecimiento. Este valor puede variar si las
condiciones cambian.
La velocidad máxima de crecimiento está influenciada principalmente
por condiciones ambientales (temperatura y composición del medio),
mientras mayores sean las condiciones favorables, mayor será el
crecimiento. A través del programa informático ComBase Predictor, se
obtuvo una velocidad máxima de 0.81 conc./g/h, es decir que la
disposición de nutrientes fue máxima y los metabolitos tóxicos
liberados fueron mínimos.
Los valores de tiempo generacional y la predicción del ComBase son
similares, 22.56 y 22.2 minutos respectivamente, indicando que el
programa ComBase Predictor, es una herramienta efectiva y útil en el
campo de la microbiología de alimentos, además, es económica y
fácil de usar.
De acuerdo a los resultados, el comportamiento de la E. coli no se vió
afectado por el medio de cultivo, la bacteria presentó un
comportamiento similar tanto en leche como en TSB durante el
tratamiento térmico. Este resultado era de esperarse considerando
69
que los medios de cultivo como el TSB están diseñados para proveer
los nutrientes esenciales a los microorganismos, nutrientes que
también son parte de la composición de la leche. Ambos medios
favorecieron las posibilidades fisiológicas de los microorganismos.
Los resultados experimentales demuestran que la E. coli muere entre
55 – 58ºC y por lo tanto, habría sido ya inactivada a temperaturas de
pasteurización (62 – 65ºC) no obstante este proceso es muy
importante en la industria lechera porque la E. coli no es la única
bacteria presente en la leche sino que hay una gran variedad y
cantidad de microorganismos y cada uno de éstos presentará
diferente comportamiento de inactivación por temperatura.
La adaptación de microorganismos a diferentes condiciones tiene un
impacto directo sobre la seguridad alimentaria, por eso es importante
la cuantificación de este efecto, en el presente trabajo de
investigación, durante la inactivación de E. coli se observó en dos de
las tres curvas un ligero incremento en la cantidad de células
(hombro) antes de que empiecen a morir, se puede decir que la
bacteria inicialmente se estaba adaptando al calor. Aunque la
interpretación de los llamados “hombros” en la curva es muy
compleja, ya que es difícil conocer las causas reales de este
fenómeno y una sola curva no es suficiente para saber si el
crecimiento inicial es debido al calor.
La microbiología predictiva, es una herramienta que permite la
optimización de recursos, principalmente tiempo, ya que los
resultados microbiológicos derivados de cambios en la composición,
cambios ambientales, entre otros, pueden ser evaluados rápidamente
y conocer la repercusión de microorganismos sobre los alimentos.
70
5.2. RECOMENDACIONES
Es recomendable realizar un estudio del comportamiento de E. coli a
temperaturas constantes de inactivación, puede ser a 56 y 58ºC para
determinar el grado de resistencia que tiene la bacteria a dichas
temperaturas en un tiempo determinado y saber si a temperaturas
constantes también se forman “hombros” en la curva de
supervivencia, ya que en el presente trabajo la inactivación se realizó
en un rango de temperatura bastante amplio y es difícil interpretar los
resultados y saber si efectivamente hubo cierta adaptación al
tratamiento térmico.
Independientemente de aplicar un tratamiento térmico para
determinar el comportamiento de E. coli es recomendable el estudio
de la influencia de otros factores como el pH, ya que la leche tiene
una amplia variedad de productos lácteos en los que el pH tiene un
papel muy importante.
Se recomienda aplicar la microbiología predictiva en otros alimentos,
ya que ofrece distintos tipos de predicción para microorganismos
patógenos y alterantes, en diferentes escenarios y es de gran utilidad
para establecer la vida comercial de productos alimenticios.
La microbiología predictiva es una alternativa viable para estimar la
calidad y seguridad microbiológica de los alimentos con perspectiva
para convertirse en línea de investigación en el país al tratarse de una
herramienta moderna; además su uso servirá de apoyo al sistema de
gestión de calidad en el sector alimentario para implementar y evaluar
innovaciones de los procesos productivos.
71
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78
ANEXO I
DATOS DE LA CURVA DE CRECIMIENTO
(MICROBIOLOGÍA PREDICTIVA Y CLÁSICA)
Tiempo (h)
Microbiología Predictiva
Microbiología Clásica
log 10 (UFC/ml)
0 2 2.24
0.96 2.76 2.51
1.44 3.15 2.29
2.4 3.93 3.74
3.36 4.7 4.12
4.32 5.48 3.98
5.28 6.25 4.77
6.24 6.99 5.57
7.2 7.66 6.22
8.16 8.18 7.29
9.12 8.49 7.45
10.08 8.62 8.22
11.04 8.67 8.53
12 8.69 9.07
12.96 8.69 10.18
13.44 8.69 10.88
14.4 8.7 10.18
15.36 8.7 11.85
16.32 8.7 11.73
17.28 8.7 11.19
18.24 8.7 11.59
19.2 8.7 12.54
20.16 8.7 11.54
21.12 8.7 11.84
22.08 8.7 11.88
23.04 8.7 11.16
23.52 8.7 --
79
ANEXO II
DATOS DE INACTIVACIÓN DE E. coli DURANTE EL
CALENTAMIENTO DE LECHE INOCULADA CON E.
COLI (106 Y 10
4 UFC/ML) Y LA CONTROL
TIEMPO (min)
Microbiología Predictiva Microbiología Clásica
106 10
4 Control 10
6 10
4 Control
Log10 (UFC/ml) Log10 (UFC/ml)
0 6.05 4.04 3.39 5.99 4.12 3.65
0.6 6.04 4.06 3.44 5.99 4.12 3.65
1.2 6.03 4.07 3.48 5.99 4.12 3.65
1.8 6.02 4.09 3.53 5.99 4.12 3.65
2.4 6.01 4.10 3.56 5.99 4.12 3.65
3 6.00 4.12 3.60 5.99 4.12 3.65
3.6 5.99 4.13 3.63 5.99 4.12 3.65
4.2 5.98 4.15 3.66 5.99 4.12 3.65
4.8 5.97 4.16 3.69 5.99 4.12 3.65
5.4 5.96 4.17 3.71 5.98 4.12 3.65
6 5.95 4.18 3.74 5.98 4.12 3.65
6.6 5.93 4.20 3.76 5.98 4.12 3.64
7.2 5.92 4.21 3.78 5.97 4.11 3.63
7.8 5.90 4.14 3.75 5.96 4.1 3.6
8.4 5.87 4.07 3.71 5.94 4.07 3.55
9 5.84 3.97 3.66 5.92 4.04 3.5
9.6 5.82 3.86 3.62 5.9 3.95 3.38
10.2 5.78 3.69 3.56 5.82 3.79 3.19
10.8 5.63 3.10 3.39 5.75 3.55 2.94
11.4 5.59 3.06 3.11 5.68 3.4 2.8
12 5.54 3.02 2.00 5.58 3.07 2.5
12.6 5.49 2.97 1.94 5.46 2.71 2.19
13.2 5.43 2.91 1.89 5.17 2.33 1.87
13.8 5.37 2.84 1.82 4.99 2.14 1.7
14.4 5.29 2.76 1.74 4.81 1.76 1.38
15 5.19 2.66 1.64 4.61 1.37 1.05
15.6 5.07 2.54 1.52 4.18 1.17 0.88
16.2 4.90 2.36 1.34 3.96 0.79 0.55
16.8 4.61 2.06 1.04 3.74 0.4 0.22
17.4 3.43 0.00 0.00 3.51 0.01 -0.11
80
DATOS DE INACTIVACIÓN DE E. coli DURANTE EL
CALENTAMIENTO DE LECHE INOCULADA CON E.
COLI (106 Y 10
4 UFC/ML) Y LA CONTROL
(CONTINUACIÓN)
18 3.39 -- -- 3.28 -- --
18.6 3.35 -- -- 2.82 -- --
19.2 3.31 -- -- 2.58 -- --
19.8 3.25 -- -- 2.35 -- --
20.4 3.20 -- -- 2.12 -- --
21 3.13 -- -- 1.65 -- --
21.6 3.05 -- -- 1.41 -- --
22.2 2.95 -- -- 1.18 -- --
22.8 2.83 -- -- 0.94 -- --
23.4 2.65 -- -- 0.71 -- --
24 2.35 -- -- 0.01 -- --
24.6 0.00 -- -- 0 -- --