precipitazione frazionata di...
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PRECIPITAZIONE FRAZIONATA DI PROTEINE
Obiettivo:separare proteine sfruttando
differenze di solubilità
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SOLUBILITA’ DELLE PROTEINE
• pH• FORZA IONICA• SOLVENTI• POLIMERI ORGANICI
• TEMPERATURA
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Effetto del pH
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Precipitazione isoelettrica
• Si modifica il pH avvicinandolo al pI
• Può essere utilizzata per allontanare proteine estranee o per purificare la proteina desiderata
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Ioni in acqua• Gli ioni interferiscono con la struttura naturale
dei legami idrogeno dell’acqua• L’effetto netto è la riduzione della viscosità• Alcuni ioni si comportanoi come
• agenti chaotropi o denaturanti distruggono le interazioni intramolecolari che stabilizzano le macromolecole
• agenti cosmotropi o stabilizzanti rinforzano la struttura dell’acqua (interazioni idrogeno dell’acqua forti ) così stabilizzando le interazioni intermolecolari tra le proteine
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La relazione tra solubilità di un sale e la forza ionica è esponenziale
log S = β - kSμ
Relazione di Cohn, dove:μ = ½ Σ ci zi
2 forza ionicaβ = log S0 solubilità a μ = 0kS costante di “salting-out”
dipende dal sale e dalla proteina
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Efficacia precipitante dei sali.La serie di Hofmeister (1888)
Cationi: NH4+ > Cs + > Rb+ > K+ > Na+ > Mg++ > Ca++ > Al3+
Anioni: citrate3- > SO4-- > HPO4
-- > Cl- > I- > NO3- > ClO4
- > SCN-
Effetto chaotropico crescente(denaturanti)
Effetto cosmotropico crescente(stabilizzanti e precipitanti)
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Jonathan N. Sachs† and Thomas B. WoolfJ. AM. CHEM. SOC. 2003, 125, 8742-8743
L’effetto chaotropo è legato alla capacità di penetrare il bilayerlipidico
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O
CH2OH
OH
OH
OH
OHOH
OH
CH2OH
O
O
Il trealosio (α,α-glucosio) è un agente cosmotropo
Abbondante nell’emolinfa degli insetti
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Effetto della forza ionica
Salting-out
Salting-in
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Precipitazione frazionata con ammonio solfato
• Sale molto solubile e buon precipitante• La concentrazione si esprime in % saturazione
(soluzione satura: circa 4 M)• Si può aggiungere sale solido oppure una
soluzione satura• Si procede per aggiunte successive• La tecnica non è denaturante• La densità delle proteine è maggiore della
soluzione (non vero per sale di potassio)
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Frazionamento con solventi organici
• Si usano solventi polari (acetone, metanolo, etanolo, dimetil-solfossido…)
• Diminuisce la costante dielettrica del mezzo e aumentano le interazioni soluto-soluto
• Occorrono temperature basse (forte rischio di denaturazione)
• Pericoloso su larga scala (infiammabilità)
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Precipitazione con solventi.Acetone a 0°C e pH 6.5
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Frazionamento con polimeri organici
• Rimuovono acqua di idratazione dalle proteine
• Si utilizzano polimeri idrofili come il poli-etilenglicole (PEG) con massa molecolare 6000-20000
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Effetto della temperatura
• In un certo intervallo, parte delle proteine globulari aumentano la solubilità con T
• A T > 40° C, molte proteine tendono a denaturarsi e a precipitare
• L’aumento di temperatura può essere impiegato per precipitare proteine termo-labili, recuperando proteine termostabili
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DIALISI eULTRAFILTRAZIONE:
OBIETTIVO
Separare molecole o particelle tramite una membrana semi-permeabile,
sfruttando differenze di dimensioni
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Dialisi Passaggio di molecole (cristalloidi) secondo gradiente di concentrazione attraverso le membrane . Le membrane sono impermeabili alle macromolecole (colloidi) e sono dette MEMBRANE DA DIALISI
c c cM M
H2O
h = pressione oncotica,pressione osmotica dovuta allemacromolecole
h
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A B A B
a bd
bda bc
da bc
da Ripetere per rimuovere
completamente cEmodialisi (glucosio, NaCl, etc.)
c
Dialisi selettiva
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all’equilibrioinizio della dialisi
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RL
R-L
L L
Dialisi all’equilibrio.Si può calcolare la costante di affinità di un ligando (L)per il suo recettore (R)
equilibrio
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• Microfiltrazione 0.1 - 10 μm
• Ultrafiltrazione 103 – 106 Dalton
• Nanofiltrazione (non interessa)
FiltrazioneLe particelle più piccole si muovono attraverso la membrana assieme al fluidosotto l’azione di una forza
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DIALISI e ULTRAFILTRAZIONE:APPLICAZIONI
• Eliminazione di molecole a basso PM (desalting)• Sostituzione del tampone• Concentrazione• Studi di interazioni con ligandi (binding)• Recupero di frammenti di DNA• Rimozione di batteri (sterilizzazione)• Funzioni terapeutiche (emodialisi)
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Concentratori per ultrafiltrazione
Per far passare il solvente attraverso la membrana si possono utilizzare:
• Pressione (in genere, azoto)
• Forza centrifuga (provette Centricon)
• Sostanze igroscopiche al di là della membrana
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Ultrafiltrazione a pressione
Cella con ilcampione
Azoto
Serbatoio
Valvola
AgitatoreUltrafiltrato
Liquido di lavaggio
In
Out
Membrana filtrante
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Diafiltrazione:celle per campioni
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Dischi per ultrafiltrazionePer concentrare o desalificare soluzioni diluite, si usano membrane di cellulosa. La microstruttura idrofilica assicura la maggiore ritenzione possibile Con il minore adsorbimento di proteine, DNA o altre macromolecole.
Per campioni più ricchi in proteine (es., siero) si usano membrane in polieteresulfone (PES)
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Filtrazione a flusso tangenziale (TFF)
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Apparato per TFF
Pompa Filtrato
FiltratoMembrana
Recipiente del campionelunghezza
ingresso recuperato
valvola
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Applicazioni della TFF• Concentrare e desalificare proteine e peptidi. • Concentrare e desalificare acidi nucleici [DNA, RNA,
oligonucleotidi]. • Recuperare e purificare anticorpi o proteine recombinanti da
terreni di cellule in coltura. • Recuperare e purificare DNA plasmidici da lisati cellulari o
DNA cromosomico da sangue intero. • Frazionare miscele diluite di proteine. • Chiarificare lisati cellulari o omogenati di tessuti. • Depirogenare (rimuovere endossine) da acqua, tamponi e altre
soluzioni. • Preparare i campioni prima di una cromatografia su colonna. • Raccogliere cellule. • Ricuperare o rimuovere virus.
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Concentratore Centricon
Campione
Campione concentrato
Tappo di raccolta
Filtrato
Serbatoio di raccolta
Membrana ultrafiltranteCampo
centrifugo
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Sistema Amicon
Concentra 500 ul in 15 ulResa 90%15-30 min a 14.000 g
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Concentratore statico
Pozzetti per i campioni
Adsorbente igroscopico
di cellulosa
Membrana
campione
Setto non permeabile
Campione concentrato
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Concentratore statico: applicazioni
• Concentrazione di campioni clinici (urina, siero, CSF)
• Concentrazione di campioni per ricerca• Aumento del titolo di anticorpi• Rimozione di sali per ripetuta diluizione/
concentrazione• Concentrazione di enzimi
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Concentratore Savant SpeedVac
camera trappola refrigerata trappola per pompacentrifuga per il solvente vapori (opzionale)