prática 2 - 2015
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DESCARBOXILAÇÃO DE
AMINOÁCIDOS
Existem bactérias que possuem enzimas descarboxilasesespecíficas para determinado aminoácido:
Estas enzimas são capazes de atacar o grupo carboxilodo aminoácido originando uma amina ou diamina edióxido de carbono.
As três descarboxilases mais importantes, utilizadas naidentificação bacteriana, são as que actuam sobre osaminoácidos Arginina, Lisina e Ornitina.
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DESCARBOXILAÇÃO DE
AMINOÁCIDOS
As enzimas descarboxilase são numerosas e cada uma delas éespecífica para um determinado substrato:
São enzimas adaptativas ou indutivas, ou seja, só são formadasquando a bactéria é cultivada em meio ácido e na presença dosubstrato específico;
Os produtos resultantes da descarboxilação vão provocar umaumento de pH do meio;
O processo de descarboxilação ocorre em anaerobiose, éirreversível e não oxidativo
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DESCARBOXILAÇÃO DE
AMINOÁCIDOS
Metodologia:
Descarboxilase Base Moeller suplementado com oaminoácido em análise;
Tubos cobertos com parafina líquida estéril;
Incubação até 7 dias;
O resultado é dado por uma mudança da cor do meio.
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DESCARBOXILAÇÃO DE
AMINOÁCIDOS
Com o isolamento do conteúdo dos tubos com parafina:
Todo o oxigénio existente no seu interior é consumido
pelas bactérias para o seu crescimento inicial;
Durante a descarboxilação dos aminoácidos e, à medidaque se produz dióxido de carbono, o pH do meio
aumenta:
A mudança do pH do meio leva à mudança da cor doindicador de pH presente.
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DESCARBOXILAÇÃO DE
AMINOÁCIDOS
Após o período de incubação pode observar-se 3resultados diferentes:
Mudança da cor do meio para violeta - resultadopositivo;
Mudança da cor do meio para amarelo - resultadonegativo;
Sem mudança da cor do meio - sem reacção.
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Resultados: A - Reacção positiva;B - Reacção positiva débil;C - Reacção negativa.
A B C
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LIQUEFACÇÃO DAGELATINA
Determinar a capacidade de uma bactéria de produzir aenzima gelatinase, liquefazendo a gelatina;
As proteínas são moléculas muito grandes para entraremnas bactérias.
Têm que ser catabolizadas em compostos mais pequenos;
Enzimas exocelulares do tipo proteolítico (gelatinase) sãosecretadas por algumas bactérias.
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Prova da liquefacção da gelatina: A - Gelatinase negativa;B - Gelatinase positiva;C - Gelatinase positiva.
A
B
C
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PROVA DO VERMELHO DEMETILO
Os produtos finais da degradação da glicose dependem dosistema enzimático existente na bactéria;
A concentração de hidrogeniões (pH) depende da relaçãoentre dióxido de carbono e hidrogénio (CO2:H2) e esta, dociclo seguido no metabolismo da glicose;
Após 24 a 72 horas de incubação, as bactérias fermentativas vão produzir altas concentrações de metabolitos ácidos(ácido láctico, succínico, acético e fórmico);
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PROVA DO VERMELHO DEMETILO
O indicador de pH, vermelho de metilo, é utilizadopara determinar o pH do meio;
Inicialmente todas as bactérias fermentativas dão uma
reacção positiva:
É necessário um tempo de incubação prolongado (2a 5 dias):
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PROVA DO VERMELHO DEMETILO
Findo o período de incubação:
As bactérias MR positivas continuam a produzir metabolitos
ácidos, levando a uma diminuição de pH, mantendo-se omeio ácido (cor vermelha);
As bactérias MR negativas, descarboxilizam os metabolitosiniciais da fermentação, levando à produção de carbonatos,dióxido de carbono e acetoína, levando a um aumento do pHfinal do meio, que fica perto da neutralidade (cor amarela).
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REACÇÃO DE VOGES-PROSKAUER
Baseia-se na detecção de acetoína:
Produto final neutro da degradação da glicose;
Esta reacção “continua a reacção de vermelho de metilo”:
Muitas bactérias degradam o ácido pirúvico, dando origem a vários ácidos (ácidofórmico, acético e succínico) e ainda, álcool etílico, hidrogénio e dióxido de carbono;
Algumas bactérias são capazes de utilizar estes ácidos para produzirem 2, 3- butanodiol;
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REACÇÃO DE VOGES-PROSKAUER
A acetoína é um precursor do 2, 3-butanodiol, acumulando-se quando a bactéria é cultivada em aerobiose:
A produção de acetoína e 2, 3-butanodiol é um sistema reversível deoxidação-redução;
Na presença de oxigénio atmosférico e pH alcalino, estas duassubstâncias são oxidadas em acetileno e creatina:
A creatina é a substância necessária para o aparecimento da cor nareacção de Voges-Proskauer.
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REACÇÃO DE VOGES-PROSKAUER
Metodologia:
Utiliza-se o mesmo meio da prova de vermelho de metilo;
Após o período de incubação adiciona-se 2 reagentesdistintos:
!-naftol (intensificador da cor);
KOH (necessário para a alcalinização do meio).
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Reacção de Voges-Proskauer: A - Reacção negativa;B - Reacção positiva.
A B
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HEMÓLISE
Muitas bactérias patogénicas produzem hemolisinas,ou seja, enzimas capazes de degradar eritrócitos;
Para a detecção da hemólise utiliza-se o agar sangue(agar nutritivo suplementado com 5% (v/v) deeritrócitos de carneiro);
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HEMÓLISE
Existem 3 tipos distintos de hemólise:
!-hemólise em que se verifica uma hemólise incompleta dos eritrócitos; ascolónias surgem com um halo verde acizentado;
"-hemólise, em que se verifica uma hemólise completa dos eritrócitos; ascolónias surgem rodeadas por um halo claro;
#-hemólise, em que não se verifica qualquer tipo de hemólise doseritrócitos.
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Aeromonas salmonicida - bactéria"-hemolítica
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SENSIBILIDADE A ANTIBIÓTICOS
Os antibióticos são substâncias químicas utilizadas notratamento de doenças de etiologia bacteriana:
Interferem com o metabolismo microbiano semproduzirem um efeito semelhante no organismohospedeiro;
Importância terapêutica;
São utilizados em taxonomia bacteriana.
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SENSIBILIDADE A ANTIBIÓTICOS
Utiliza-se a técnica da difusão em placa (método de Kirby-Bauer):
Permite uma rápida determinação da sensibilidade da bactéria aosdiferentes antibióticos;
Mede-se o diâmetro do halo de inibição de crescimento bacteriano;
Compara-se o tamanho do halo de inibição com valores presentes emtabelas padronizadas.
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ANTIBIOGRAMAS
AntibióticoDiâmetro da zona de inibição (mm)
Resistente Intermédio Sensível Ampicilina (AMP-10) $ 11 12-13 % 14
Estreptomicina (S-10) $ 11 12-14 % 15
Tetraciclina (TE-30) $ 14 15-18 % 19
Oxitetraciclina (OT-30) $ 14 15-18 % 19
Florfenicol (FFC-300) $ 16 17-20 % 21
Ácido oxolinico (AO-3) $ 10 16-20 % 20
Trimetoprim-Sulfametazol (SXT-25) $ 16 17-19 % 20
Enrofloxacina (ENR-25) $ 15 16-20 % 21
Flumequina (UB-30) $ 10 16-20 % 20
Eritromicina (E-15) $ 13 14-17 % 18Principais antibióticos utilizados em aquacultura e respectivos halos de sensibilidade/inibição.
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