prÁcticas de microbiologÍa clÍnica

PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA

(CURSO 2012–2013)

Distribución de las prácticas por días

Análisis de unamuestra de orina

Análisis de unamuestra de faringe

Antibiograma

LunesCuantitativo: siembra de Agar CLEDCualitativo: siembra de Agar Cromogénico y Agar de MacConkey

Siembra de Agar SangreSiembra de Agar Salino Manitol

Martes

Cuantitativo: lecturaCualitativo:Identificación presuntiva de coloniasTinción de GramPrueba de la oxidasaSiembra en Agar de MacConkey

Miércoles

Observación de la aparición de halos de hemólisisTinción de Gram a colonias aisladas en Agar Sangre y Agar Salino Manitol Identificación de cocos Gram positivosSiembra de Agar Sangre

JuevesSiembra de Agar KliglerInoculación de API20E

Prueba de la catalasaInoculación de API STAPHInoculación de API STREP

Siembra de Agar Müeller-HintonColocación de los discosE-test

ViernesLectura de Agar KliglerLectura de API20E

Lectura de API STAPHLectura de API STREP

Lectura y medida de halos en discosLectura del E-test

Prácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013) Organigrama

NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DEMICROBIOLOGÍA CLÍNICA

LABORATORIO DE NIVEL DE BIOSEGURIDAD 2

Los agentes biológicos se clasifican en cuatro grupos de riesgo en función de:

Virulencia

Dosis infectiva del microorganismo

Disponibilidad de tratamiento

Modo de transmisión en el laboratorio

Riesgo de difusión en la comunidad

Viabilidad del microorganismo en el entorno

IntroducciónPrácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)

GRUPO DE RIESGO PATOGENICIDAD EJEMPLOS

1No suelen causar enfermedad en personas sanas

Escherichia coliStaphylococcus epidermidis

2

Causan infecciones moderadas o gravesLas infecciones suelen tener buen pronósticoGeneralmente no se transmiten por vía aéreaSe suelen transmitir por contacto o ingestiónEs difícil su propagación en la comunidadExisten tratamiento y profilaxis eficaces

Bordetella pertussisClostridium tetaniHaemophilus influenzaeCandidaVirus del sarampiónEntamoeba histolytica

3Causan infecciones gravesAlgunos se transmiten por vía aéreaPueden propagarse en la comunidadLa terapia es de eficacia variable

Bacillus anthracisMycobacterium tuberculosisVirus de la hepatitis BLeishmania donovani

4Causan infecciones graves o muy gravesMuchos se propagan por vía aéreaSe propagan fácilmente en la comunidadLa terapia no es muy eficaz

Virus de la viruelaVirus de MarburgVirus Ébola


MICROORGANISMOS RIESGO PROVOCADO TIPO DE LABORATORIO

GRUPO DE RIESGO1

INDIVIDUAL → BAJO

COLECTIVO → BAJO

BÁSICO(Enseñanza)

GRUPO DE RIESGO2

INDIVIDUAL → MODERADO

COLECTIVO → MODERADO

SEGURIDAD(Hospital)

GRUPO DE RIESGO3

INDIVIDUAL → ELEVADO

COLECTIVO → ELEVADO

ALTA SEGURIDAD(Diagnóstico

especializado)

GRUPO DE RIESGO4

INDIVIDUAL → ELEVADO

COLECTIVO → ELEVADO

MÁXIMA SEGURIDAD

(Servicio estatal)


MEDIOS DE CONTENCIÓN

Describen los métodos que hacen segura la manipulación de los agentes infecciosos en el laboratorio.

Objetivo: reducir al mínimo la exposición del personal y del entorno a agentes potencialmente patógenos.

Para la seguridad de los laboratorios de Microbiología Clínica son importantes tres elementos de contención:

A) Barreras primarias: primera línea de protección (bata, guantes, gafas, mascarillas, gorros, cabinas de seguridad biológica, etc.).

B) Barreras secundarias: normas que deben cumplirse para la construcción de un laboratorio de Microbiología Clínica (alicatado, paredes, grifos, interruptores, aparatos que generan ruido, aparatos que generan calor, etc.).

C) Procedimientos estándar: metodología de funcionamiento del laboratorio y de la manipulación de las muestras clínicas.


MUESTRA CLÍNICA SOSPECHOSA DE

CONTENER MICROORGANISMOS

TIPO DE LABORATORIO

RECOMENDADO PARASU ESTUDIO

NIVEL DE BIOSEGURIDAD

QUE DEBE TENER EL

LABORATORIO

GRUPO DE RIESGO 1 BÁSICO 1

GRUPO DE RIESGO 2 SEGURIDAD 2

GRUPO DE RIESGO 3 ALTA SEGURIDAD 3

GRUPO DE RIESGO 4 MÁXIMA SEGURIDAD 4

NIVELES DE BIOSEGURIDAD


GESTIÓN Y TRATAMIENTO DE LOS RESIDUOS

Objetos punzantes y cortantes

• Agujas, pipetas Pasteur, portaobjetos, vidrio roto, etc.• Constituyen un claro riesgo de inoculación accidental de microorganismos.• Se depositan en recipientes específicos resistentes a la punción y con cierre hermético.• Es muy importante cerrar correctamente estos recipientes, que deben ser esterilizados en

autoclave o incinerados antes de desecharlos.

Líquidos infecciosos

• Deben recogerse en recipientes herméticos y esterilizados, sangre incluida, en autoclave.• Esta práctica es también obligatoria cuando los residuos proceden de áreas de

micobacteriología y virología.

Residuos sólidos

• Muestras clínicas, medios de cultivo, depresores, tubos de plástico, tiras API, etc.• Deben ser esterilizados en autoclave o incinerados antes de ser desechados.

Líquido sobrante de tinciones

• Debe ser recogido en garrafas de plástico (nunca tirar al fregadero).


PRÁCTICAS A REALIZAR

ANÁLISIS CUANTITATIVO

ORINAL-1

Siembra de la muestra de orina(bote nº 2) Agar CLED

ANÁLISIS CUALITATIVO

ORINAL-2

Siembra de la muestra de orina(bote nº 1)

Agar Cromogénico Agar de MacConkey


MUCOSA FARÍNGEA

L-3 Toma de muestraMucosa faríngea

L-4 SiembraDos placas de Agar Sangre

L-5 SiembraUna placa de Agar Salino Manitol

OrganigramaPrácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)

ANÁLISIS DE UNA MUESTRA DE ORINA


Conocer el número de microorganismos presentes en la muestra.

Se toma una cantidad conocida de orina y se siembra en un medio de cultivo específico. Se incuba 24horas y se cuenta el número de colonias.


Conocer qué microorganismos están presentes en la muestra.

Se siembran muestras de orina en diferentes medios de cultivo, tratando de obtener colonias aisladas.Tras su estudio, se elegirá una colonia correspondiente a una enterobacteria.

La enterobacteria se identificará utilizando un sistema comercial: API 20E.

LunesPrácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013)


FUNDAMENTO

En función del número de microorganismos presentes por mililitro de orina se establecerán conclusiones acerca de posibles infecciones existentes enel tracto urinario.

METODOLOGÍA

Sembrar una placa de agar CLED (agar cistina, lactosa,deficiente en electrolitos).

La placa se siembra con asa estéril de plástico calibradas(1 microlitro).

El asa se introduce verticalmente en la muestra (Bote nº 2)correspondiente a la orina procedente del “chorro medio”.

Se hace una única estría diametral. Seguidamente, se realizan estrías en zig-zag perpendiculares a la primera estría, tal como se esquematiza en la siguiente imagen.


El asa se introduce y se sacaverticalmente del bote con orina

Sin agregar más orina, con la misma asase hacen estrías sobre la placa cruzandovarias veces la línea del inóculo inicial

El asa toca el centro de la placa a partir del cualel inóculo se extiende en forma de una línea

a lo largo del diámetro de la placa


AGAR CLED (CISTINA, LACTOSA, DEFICIENTE EN ELECTROLITOS)

Digerido pancreático de gelatina 4 g/LDigerido pancreático de caseína 4 g/LExtracto de carne 3 g/LLactosa 10 g/LL-cistina 0,128 g/LAzul de Bromotimol 0,02 g/LAgar en polvo 15 g/LAgua destilada 1 L

pH: 7,3

Es un medio diferencial que favorece el crecimiento de todos los microorganismos existentes en la orina. Debido a su deficiencia en electrolitos, no permite que las colonias de Proteus invadan la placa de cultivo, lo que facilita el recuento.

La lactosa es el único carbohidrato presente. La cistina facilita el crecimiento de los coliformes dependientes de ella.

El azul de bromotimol permite distinguir las colonias de bacterias fermentadoras de las que no lo son. Los microorganismos fermentadores dan lugar a colonias de color amarilllo. Los no fermentadoresdan lugar a colonias de color claro o traslúcidas. La alcalinización del medio provoca la aparición de un color azul intenso.



FUNDAMENTO

Sembrar una muestra de orina (Bote nº 1) en medios diferenciales. El tipo de colonia y su pigmentación servirán para presuponer qué microorganismos pueden estar presentes.

METODOLOGÍA

Sembrar una placa de agar Cromogénico.

Sembrar una placa de agar de MacConkey.

Se utilizarán también las placas de agar CLEDempleadas en el análisis cuantitativo.

Dada la posible escasez de microorganismos presentes en orina, debe utilizarse un método de siembra que pueda descargar un inóculo denso.

Con un asa de 10 µL se realizarán tres descargas (30 µL en total) en estrías paralelas en el sector 1. Los sectores 2 al 7 se sembrarán arrastrando inóculo del sector anterior tal como se esquematiza en la siguiente imagen.


Técnica de siembra en placa por estrías cada 45º

1

2

3

4

5

7

6


AGAR CROMOGÉNICO

El agar Cromogénico es un mediodiferencial, pero no selectivo.

El carácter diferencial se traduceen que las colonias crecidas presentandiferentes colores en función de sucapacidad para utilizar ciertos sustratos presentes en elmedio.

La presencia en las bacterias de enzimas específicas(por ejemplo, β–galactosidasa, β-glucosidasa o triptófano desaminasa) capaces de descomponer esos sustratos, provoca la aparición de un color determinado (rosa, azul turquesa, azul oscuro, verde, blanco, crema, etc.) unicamente en la colonia a la que pertenece dicha bacteria.



Técnica de siembra en placa por estrías continuas

Dirección de la siembraDirección de la siembra

Alumno A Alumno B

AGAR DE MACCONKEY

Peptona 20 g/LLactosa 10 g/LSales biliares 1,5 g/LCloruro sódico 5 g/LRojo neutro 0,030 g/LCristal violeta 0,001 g/LAgar 15 g/LAgua destilada 1L

pH: 7,1

El agar de MacConkey es un medio moderadamente selectivo y diferencial utilizado para la recuperación de enterobacterias y bacilos Gram negativos entéricos relacionados.

Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y de algunas Gram negativas exigentes. La lactosa es el único carbohidrato. Las bacterias fermentadoras de lactosa formas colonias de diferentes tonos de rojo debido al viraje del indicador rojo neutro (rojo a pH menor de 6,8) por la producción de ácidos mixtos. Las bacterias que no fermentan la lactosa forman colonias incoloras o transparentes.

No fermentador

Fermentadorde lactosa

Fermentadorfuerte de lactosa


ANÁLISIS DE UNA MUESTRA DE FARINGE

FUNDAMENTO

En el tracto respiratorio existe una abundante microbiota que se establece, normalmente, sin causar daños al hospedador.

El objetivo de la práctica consiste en tomar una muestra del tracto respiratorio superior (faringe) para tratar de identificar cocos Gram positivos.

METODOLOGÍA

Tomar una muestra de faringe con un hisopo estéril y la ayuda de un depresor también estéril.Sembrar la muestra en dos placas (nº1 y nº2) de agar sangre y en una de agar salino manitol:

Placa nº 1 de Agar Sangre: se descarga el hisopo en una zona próxima al borde (zona densa) y se siembra el resto de la placa por estrías continuas. Incubar 48 horas a 37ºC.

Placa nº 2 de Agar Sangre: con un asa estéril se toma un inóculo de la zona densa de la placa nº 1 y se siembra la placa por estrías continuas. Incubar 48 horas a 37ºC.

Placa de Agar Salino Manitol: sembrar por estrías continuas con el mismo hisopo que se ha sembrado la placa nº 1. Incubar 48 horas a 37º C.


Siembra por estrías continuas

Placa nº 1 con hisopo

Placa nº 2 con asa


AGAR SANGRE

Es una combinación de agar base, generalmente agar nutritivo, y sangre. Se puede utilizar sangre de oveja, de otros animales e incluso humana.

Es un medio rico que aporta muchos factores de crecimiento para microorganismos exigentes.

Se utiliza también para ver la capacidad hemolítica de los microorganismos patógenos, por lo que se considera un medio diferencial. Observando los halos hemolíticos alrededor de las colonias se determina el tipo de hemólisis que poseen: alfa, beta o gamma.


AGAR SANGRE (AGAR BASE DE COLUMBIA + 5% SANGRE OVEJA)

Agar base de Columbia

Peptona 5 g/LTripteína 12 g/LExtracto de levadura 3 g/LExtracto de corazón (buey) 3 g/LAlmidón soluble 1 g/LCloruro sódico 5 g/LAgar 15 g/LAgua destilada 1 L

pH: 7,3

El agar base de Columbia es uno de los muchos medios de cultivo a los que se les puede adicionar sangre para preparar agar sangre o agar chocolate.

La sangre más comúnmente utilizada es la de oveja, al 5%, estéril y desfibrinada.

Una vez preparado el medio de cultivo, se enfría hasta 45ºC y se le añade la sangre.


AGAR SALINO MANITOL (MEDIO DE CHAPMAN)

Extracto de levadura 2,5 g/LTriptona 10 g/LGelatina 30 g/LLactosa 2 g/LManitol 10 g/LCloruro sódico 75 g/LFosfato dipotásico 5 g/LRojo fenol 0,025 g/LAgar 15 g/LAgua destilada 1 L

pH: 7,0

Es un medio selectivo para el aislamiento de estafilococos.

La mayoría de los microorganismos no crecen a una concentración de cloruro sódico del 7,5%, mientras que los estafilococos patógenos sí lo hacen.

La presencia de manitol permite detectar a los estafilococos fermentadores del mismo que producen colonias amarillas debido al viraje de color del rojo fenol. Los estafilococos no patógenos no lo fermentan y producen colonias de color rosa.


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