UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS E INGENIERIASDEPARTAMENTO DE QUÍMICA

LABORATORIO DE BIOQUIMICAPRACTICA Nº 7

TRANSPORTE DE CARGAS EN SISTEMAS BIOLOGICOS

OBJETIVOS:1- Obtener un extracto de succinato deshidrogenada a partir de tejido hepático.2- Identificar cualitativamente la actividad del succinato deshidrogenada mediante el uso de un

aceptor electrónico.3- Observar el efecto inhibitorio del malonato sobre la actividad de la enzima succinato

deshidrogenada.

TEORIA RELACIONADA.

Las células de la gran mayorías de los organismos vivos llevan a cabo un conjunto de reacciones de oxido reducción mediante la cual la gran cantidad de energía liberada a través de la degradación de moléculas orgánicas es almacenada en moléculas de alto nivel energético (ATP). La succinato deshidrogenasa una enzima clasificada dentro del grupo de las oxidorreductasas cataliza una reacción muy importante en el metabolismo oxidativo de la célula: la conversión del succinato en fumarato.

La succinato deshidrogenada remueve 2H+ y 2 electrones del succinato para formar fumarato y la coenzima reducida (FADH2). La enzima esta sujeta a una poderosa inhibición competitiva por parte de reactivos como el malonato lo cual constituye una manera de inhibir la actividad de la enzima a nivel de laboratorio. Para estudiar el transporte de cargas en la reacción se empleara un aceptor artificial de electrones (azul de metileno), cuya decoloración permite diferenciar la actividad enzimatica en los ensayos a realizar en la presente práctica.

MATERIALES Y REACTIVOS.

Vasos de precipitado de 25y 400 ml Tubos de centrifugaMortero con maso Buffer fosfato 0.1M pH 7.4Termómetro Succinato de sodio 0.1MPipetas de 5 ml (2) Malonato de sodio 0.1MPipeta de 1 ml (1) Azul de metileno 0.1%Gradilla para tubos de ensayo Aceite vegetal (traer)Tubos de ensayo (3) Hígado y Hielo (traer de la casa)

PROCEDIMIENTO.

1- OBTENCIOPN DEL EXTRACTO ENZIMÀTICO

Tomar una muestra de aproximadamente 5g de hígado hepático libre de sangre y colocarlos en un mortero con arena lavada, macere cuidadosamente hasta formar una mezcla suave adicionando poco a poco tres porciones (cada una de 5ml) de buffer fosfato0.1M Y pH 7.4. Transfiera la mezcla a un vaso de 25ml y manténgalo en un baño con hielo durante 15min, mezclando ocasionalme. Pase la mezcla a tubos de centrifuga y centrifugue a 1600rpm durante 10min. Transfiera el sobranadante a un vaso de 25ml y marquelo como extracto enzimático, manténgalo en baño de hielo hasta su posterior uso.

2- SEGUIMIENTO DE LA REACCIÒN.

Preparar una serie de 3 tubos de ensayo debidamente rotulados, adicionar a cada tubo (1,2 y 3) 0.5ml de azul de metileno al 0.1%, luego a los tubos 2 y 3 agregar 1 ml de succinato de sodio 0.1M y solo al tubo 3 agréguele 1ml de malonato de sodio 0.1M. Dejar los tubos en incubación a 37ºC durante 10 min. (Manteniendo la temperatura constante). Sin retirarlos del baño, agregar 1.5ml de extracto enzimático a cada uno de los tubos (1,2y 3), agite bien adicione 2ml de aceite vegetal a cada uno de los tubos.

Al cabo de 40 min observe el color de cada tubo, tenga en cuenta que el tubo 1 es el control.

PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS.

1- Escriba la reacción mediante la cual el succinato se transforma en fumarato.2- Que papel desempeña el aceite vegetal en el experimento.3- Que efecto tendría un exceso de succinato sobre la reacción.4- Que sustancias pueden inhibir la conversión de succinato en fumarato, en adición al malonato.5- En que rutas esta metabólicas esta involucrado el succinato.

 BIBLIOGRAFÍA:

PLUMER, D.T. Introducción a la bioquímica práctica. México. MaGraw- Hill Latinoamericana, S.A.

CONN, E. y Stumpf, P.K. Bioquímica F.

LÓPEZ, E y ANZOLA, C. Guías de laboratorio de Bioquímica. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional sede Bogotá.