practica nº 1 quimica biologica

8/8/2019 PRACTICA N 1 quimica biologica

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UNIVERSIDAD NACIONAL SAN LUIS GONZAGA DE ICA

PRACTICA N 1

ANTIGENOS FEBRILES

1.- REACTIVOS:

Tifico O Somatico

Tifoidea

Tifico H flagelar

Paratifico A Paratifoidea

Paratifico B

Brucella abortus Brucelosis

2.- MATERIALES:

Micro pipeta automtica

Suero

Lamina excavada Reactivos

3.- PROCEDIMIENTO:

Determinacin cualitativa y cuantitativa

QUIMICA BIOLOGICA II 1


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Cualitativacuando se observa la aglutinacin (obs. Macroscpica)

Cuantitativa cuando se hacen diluciones: 1/20; 1/40; 1/80; 1/160;

1/320

4.- LECTURA:

Donde se desarrolle la mayor dilucin o ms alta que se

observe.

En el caso de tifoidea los valores para un cuadro

infeccioso son: O 1/80

H 1/160

ul ml Dilucin80 0.08 1/20

40 0.04 1/40

20 0.02 1/80

10 0.01 1/160

5 0.005 1/320


Nota:

siempre se realiza

en primer lugar la

determinacin

cualitativa y

despus la

cuantitativa


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Figura 1: Toma de muestra con la

micropipeta.



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Figura 2: Colocando muestra en laminas excavadas.

PRACTICA N 02

METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS

1.- OBJETIVOS:

Demostrar el catabolismo de la glucosa mediante

al obtencin de alcohol

Determinar la cantidad de alcohol producido en la

muestra

Comprender el fundamento de combitest

2.- PROCEDIMIENTO:

Conectar el matraz de coccin al matraz colector y someter a

ebullicin el contenido del matraz de coccin por 5 minutos.

Si el contenido del matraz colector se torna medio verdoso,

suspender la ebullicin aunque no hayan transcurrido los 5

minutos.

Enfriar el contenido del matraz colector con chorro de agua

Agregarle 10,0 ml.de IK y mezclar.

Titular con Na3S2O3 hasta viraje a color verdoso, agregar 1.0

ml de solucin de almidon a 1% agotar .segn agregando

tiosulfato de sodio hasta que el contenido se torne de colorceleste transparente .Detener la titilacin



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Anotar el gasto de tiosulfato de sodio

Aparte realizar los clculos para determinar la cantidad dealcohol producido

Verificar en el matraz de coccin la formacin de precipitado

rojo ladrillo que indica la presencia de un azcar reductor

(dextrosa)

FUNDAMENTO:

Se produce oxidacin del alcohol (etanol) hasta acido

acetico por accion del dicromato de potasio: el exceso dedicromato al actuar sobre ioduro potasico deja el iodo en

libertad el cual se valora con una solucin de tiosulfato

sodico, empleando al solucin de almidn como indicador



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CUESTIONARIO

1.- Determinacin de lpidos totales en suelo

En la determinacin de Grasas y Aceites, estn incluidos no solo

los hidrocarburos del petrleo (HTP) sino tambin compuestos

orgnicos de otras fuentes (vegetales, animales). A los fines del

trabajo, estos hidrocarburos son interferencias, dado que los analitos

de inters son los hidrocarburos del petrleo (HTP).

Estas interferencias fueron eliminadas aplicndoles a cada una de las

muestras el tratamiento que establece el mtodo 418.1 de la EPA.

El tratamiento consiste en agregarle a una alcuota de extracto una

cantidad determinada de Silica Gel particulada (Merck),

posteriormente agitarla durante 15 minutos (con agitadores

magnticos); luego filtrar para retener la Silica Gel, colocar unaalcuota del filtrado en la celda y realizar la lectura en el equipo IR a

la misma frecuencia que para G&A (2939,7cm-1).

Previamente la Silica debi ser activada y luego desactivada, para

que contenga una humedad comprendida entre un 1 a 2% de su

peso. Para ello, se la dispuso inicialmente en estufa a 130C, y luego

se le agreg una cantidad de agua igual al 2% de su peso.



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De acuerdo con el mtodo, para una alcuota de 10 mL de extracto

corresponde agregar 3 gr de Silica Gel, agitar y filtrar con papeles de

filtro banda negra (Whatman N 40).

La celda utilizada para la lectura fue la misma que en el punto

anterior.

La medida de HTP corresponde a la lectura del extracto en el equipo

IR una vez eliminadas las interferencias; para ello se tomo una

alcuota de aproximadamente 5 mL del extracto, se la coloc en la

celda de 10 mm y se realiz la lectura en el equipo IR a la misma

frecuencia de lectura utilizada para G&A. Posteriormente, se debiintroducir el valor en la curva de calibracin. El valor obtenido se llev

a unidades de concentracin referidas al suelo (mg HTP/ Kg de suelo

seco).

2. Determinacin del contenido de carotenoides totales en el

alimento:

- Pesar aproximadamente 1g de muestra fresca de zanahoria

previamente pelada y cortada en trozos pequeos.

- Homogenizar en una licuadora con 60 ml de acetona por unos 3

minutos.

- Decantar y agregar ms acetona para realizar una extraccin.

Repetir el proceso hasta extraer completamente los pigmentos.

- Filtrar y lavar el residuo que queda en el papel de filtro con

unos 20-30 ml de acetona.

- Concentrar en campana con un bao de Mara (o en plancha

elctrica) hasta pequeo volumen.



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FUNDAMENTOS DEL MTODO:

El cido rico presente en la muestra es oxidado

enzimaticamente por accin de la uricasa y transformado en

alantoina y perxido de hidrogeno. El perxido de hidrogeno formado

reacciona con el cido 3-5-dicloro-2 hidroxibenceno sulfnico y la 4-

Aminofenazona, formando un complejo de quinoneimina de color rojo.

La intensidad de color medida fotocolorimetricamente a 510 nm

permite cuantificar el cido rico presente en las muestras.

REACTIVOS PROVISTOS:

Estos reactivos son para USO IN VITRO.

Reactivo 4AF : Solucin de 4AF 15 mmol/l . Buffer fosfato 1

mol/l , pH 7.50

Reactivo 3-5-DC-2HBS: Solucin de 3-5-DC-2HBS 10 mmol/l

Enzima 1: Solucin de UOD (5 U/ml),

Enzima 2: Solucin de POD (100 U/ml), Standard : Solucin de cido rico 100 mg/l (595 mmol/l)

ESTABILIDAD:

Los reactivos son estables hasta la fecha de vencimiento indicada en

la caja, cuando se guardan a 2-8 C. Se recomienda no exponer los

mismos a temperaturas elevadas durante tiempos prolongados.

PREPARACIN DE LA SOLUCIN DE TRABAJO:



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1. En una probeta de capacidad adecuada colocar agua destilada

(aproximadamente la mitad del volumen final a preparar).

2. Agregar la cantidad correspondiente de reactivo

4-AF y reactivo 3-5 DC-2HBS.

3. Llevar con agua destilada a volumen final.

4. Agregar la cantidad correspondiente de reactivo de enzima 1 y

enzima 2, homogeneizando suavemente los mismos.

5. Mezclar.

6. Guardar inmediatamente en frasco color caramelo, en heladera (2-

10 C), debiendo

Desecharse si presenta coloracin rosada muy intensa

(contaminacin con oxidantes).

Este reactivo de trabajo tiene una estabilidad de 4 semanas, y debe

prepararse respetando las siguientes proporciones en volumen:

Estas cantidades se modifican de acuerdo al volumen final que se

desea preparar, respetando la proporcin entre las partes.

MUESTRA:

Suero fresco libre de hemlisis. El mismo debe obtenerse separando

el cogulo lo antes posible (Dentro de las dos (2) horas de la

recoleccin). El suero puede conservarse hasta cinco (5) das en

Refrigerador (2-8 C) y hasta seis (6) meses en congelador.

Tambin se puede usar plasma heparinizado o plasma EDTA. La

determinacin tambin puede realizarse en orina, debiendo diluirse la

misma 1:10 ( 1+10), con solucin de hidrxido de sodio 0,01 mol/l. Si

el test se realiza en orina de 24 hs es conveniente calentar

brevemente a 60 C para redisolver los cristales de urato.



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TCNICA OPERATORIA :

Dejar que el reactivo tome temperatura ambiente y pipetear:

Despus del tiempo de incubacin recomendado el color de la

reaccin es estable al menos durante veinte (20) minutos ms.

CALCULO DE RESULTADOS :

VALORES DE REFERENCIA:

En suero:

Hombres 35-60 mg/l

Mujeres 25-50 mg/l



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En orina:

240-570 mg/l

En orina de 24 horas:

250-750 mg

4. Prueba de tolerancia a la vitamina A y absorcin de

carotenos.

La vitamina A pertenece al grupo de las vitaminas liposolubles

(A, D, E y K) y existe en tres formas metablicas activas: retinol,

retinal y cido retinoico, adems de sus precursores provitamnicos

conocidos como carotenoides. La deficiencia de vitamina A (DVA)ocasiona serios trastornos en el organismo, principalmente en la

vista, piel, huesos y el sistema inmune, siendo la poblacin ms

vulnerables los nios, mujeres y ancianos.

Los mtodos ms comnmente empleados para determinacin

de vitamina A (retinol) es el espectrofotomtrico de inactivacin con

radiacin UV y la cromatografa lquida de alta resolucin en fase

reversa (CLAR).

Determinacin de Alfa-Tocoferol y Retinol

Se determin a travs de cromatografa lquida de alta

eficiencia, conocida como cromatografa lquida de fase reversa

(HPLC), y estandarizado para vitamina A y vitamina E .Este mtodo

consiste en la particin de la muestra de suero en una faseestacionaria hidrofbica (frecuentemente cadena C-18 enlazadas

covalentemente a partculas de slice) y una fase mvil polar. El

tiempo en el cual los compuestos de la muestra fluyen dependen de

su polaridad. La deteccin de los componentes separados por HPLC

se realiz espectrofotomtricamente, (rango UV para retinol y retinil

acetato). La cuantificacin de los componentes se logr por

comparacin de las alturas de los picos con las de los estndares de

las curvas (analtico y estndar interno). La adicin de un estndar



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interno (all trans retinil acetato) ayuda a la correccin por prdidas

durante la extraccin y anlisis.

Los carotenoides son el grupo de pigmentos vegetales

responsables de la gama de coloracin de frutas, verduras y flores

que va del amarillo al rojo. El organismo humano transforma uno de

ellos, el -caroteno, en vitamina A, que constituye un nutriente clave.

A la carencia de esta vitamina se atribuyen los trastornos coronarios,

ciertos tipos de cncer y una afeccin degenerativa de la mcula

ltea del ojo que puede conducir a la ceguera. Las investigaciones

tambin indican que la ingesta regular de -caroteno puede ser

beneficiosa para el sistema inmunolgico y es susceptible de reducir

el deterioro de la piel producido por los rayos solares.

Los mecanismos de absorcin de las vitaminas liposolubles no se

conocen, el intestino puede cambiar el beta caroteno a vitamina A,

que luego se transporta por quilomicrones y se almacena en el

hgado.

Pigmentos Naturales: Carotenoides Totales.

A. Fundamento:

El mtodo se fundamenta en la medicin de la absorbancia de un

extracto de los carotenoides presentes en el alimento y luego

mediante el uso de una curva de calibracin o la aplicacin secalcula el contenido de carotenoides en la muestra.

B. Reactivos:

- ter de petrleo

- Sulfato de sodio anhidro (Na2SO4)

- Solucin concentrada de beta-caroteno en alcohol isopropilico



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- Solucin diluida de beta-caroteno (10 ml de solucin

concentrada + ter de petrleo en cantidad suficiente para 100

ml)

- Acetona.

C. PROCEDIMIENTO:

1. Curva patrn:

- Tomar 5 tubos de ensayo y enumerar del 1 al 5. Colocar en

cada uno de ellos las cantidades de reactivos que se especifican

a continuacin:

- Agitar con cuidado los tubos y determinar la absorbancia de

cada solucin a la longitud de onda mxima.

- Construir la curva de calibracin trazando un grafico de la

absorbancia correspondiente contra la concentracin de beta-

caroteno contenida en cada una de las soluciones patrn.


practica nº 1 quimica biologica

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