PRÁCTICA 1

MICROORGANISMOS EN EL MEDIO AMBIENTE

1. Introducción

Los microorganismos (bacteria, virus, hongos, protozoarios, y algunas algas) se pueden encontrar virtualmente en todo el medio ambiente. Se encuentran en el aire, agua, suelo, alimentos, petróleo, en la materia orgánica en descomposición y en las superficies del cuerpo. Estos organismos son extremadamente importantes para la salud humana y el medio ambiente además en los avances en inmunología, virología, genética y biología molecular.

En microbiología, la esterilización se define como la destrucción o remoción de cualquier forma de vida. Un objeto que esté libre de cualquier organismo viviente, se dice que está estéril. La esterilización es uno de los mecanismos utilizados para el control de los microorganismos, existen otros métodos de control que sólo matan o inhiben una parte de la población microbiana como son: desinfección, pasteurización, quimioterapia y asepsis. Estos métodos permiten prevenir la contaminación de los materiales de laboratorio y de cultivos puros, evitan las infecciones y facilitan el tratamiento de enfermedades.

La esterilización es muy importante en los laboratorios de microbiología porque la mayoría de los experimentos son realizados con cultivos puros o axénicos (cultivos que solamente tienen un tipo de microorganismo) o con cultivos mixtos o consorcios (cultivos constituidos por más de un tipo de microorganismo) por lo que es necesario primero esterilizar los materiales y medios de cultivo.

Los métodos de esterilización, principalmente los que destruyen a los organismos, fueron diseñados para eliminar aún a los organismos más resistentes, las endosporas. Bacterianas de los géneros de Bacillus y Clostridium, por lo que éstas son utilizadas como indicadores biológicos de esterilización durante el proceso.

Existen varios métodos de esterilización para la gran variedad de materiales, medios de cultivo y sustancias que pueden ser esterilizados. Los métodos más empleados en los laboratorios son los que utilizan calor. La velocidad con la cual los microorganismos mueren cuando son expuestos a temperatura elevadas es función de la naturaleza del medio en el cual ocurre el calentamiento (pH, concentración de sales y tipo de nutrientes), la longitud del tiempo de exposición y la temperatura de calentamiento.

Por otro lado, el crecimiento microbiano sólo es posible si las condiciones físicas (temperatura de incubación, y la cantidad de oxígeno presente) y químicas (constituyentes del medio de cultivo, pH, etc.) son apropiadas.

Se utilizan varios tipos de medios de cultivo, los cuales pueden clasificarse de la siguiente forma:

1. En base a su composición química pueden ser: sintéticos o definidos (cuando se conoce la composición química cualitativa y cuantitativa exacta de todos los componentes) y complejos (cuando no se conoce la composición química cualitativa y cuantitativa exacta de alguno de los componentes).

2. En base a la presencia de factores de crecimiento pueden ser: enriquecidos (si contienen) y mínimos (si no contienen).

3. Por su función pueden ser: selectivos (para el desarrollo de un grupo o tipo de microorganismos) y diferenciales (para distinguir tipos de microorganismos)

4. Por su consistencia pueden ser líquidos (llamados caldos) con los nutrientes disueltos en agua; sólidos, a los cuales se les adiciona un agente solidificante como el agar a una concentración de 1.5% p/v (otro agente solidificante es la sílica gel); y semisólidos, a los cuales se les adiciona agar en una menor concentración.

Antes de utilizar los materiales de laboratorio y los medios de cultivo preparados a partir de ingredientes o de preparados comerciales, deben ser envasados, esterilizados y protegidos adecuadamente para conservar la esterilidad durante su uso y almacenamiento, lo cual va a asegurarnos que se trabajará exclusivamente con los microorganismos deseados.

2. Objetivos.

Aprender a preparar adecuadamente el material de laboratorio para su esterilización y almacenamiento.

Aprender a preparar, envasar y esterilizar medios de cultivo. Investigar los tipos de microorganismos que puedan estar presentes en el

aire, cuerpo y superficies.

3. Equipos, Reactivos y Materiales.

10 tubos de 16 x 150 mm con solución salina 0.85% Vasos de precipitado de 250 y 500 mlMatraces de 250 y 500 mL Probetas 10, 100 y 500 mL10 cajas Petri de vidrio estériles Cotonetes estérilesAutoclave Balanza Analítica GradillaAgar Nutritivo y Agar nutritivo con 5% sucrosa Agar Czapeck y Agar para hongos y levaduras Agar sangreAgua destilada esteril Yogurt natural

Papel para esterilizar (Kraft)Cinta indicadora de esterilizaciónIndicador de esterilización de esporasBote de aluminio para esterilizar pipetasMecheroEspátulaSuccionador para pipetasMicroscopio, Portaobjetos y cubreobjetos

4. ProcedimientoPreparación de material de vidrio para esterilizar.

a) Tubos de ensaye de 16 x 150.

1. Colocar en 10 tubos 9 mL con solución salina 0.85%, tapar cada tubo con un tapón de algodón ayudado de unas pinzas (pueden ser de disección de punta roma).

2. Colocar los tubos en una gradilla y cubrirlos con papel Kraft. Esterilizar en autoclave a 121 °C por 15 minutos.

Preparación de medios de cultivo.

1. Pesar los gramos necesarios de acuerdo a las instrucciones del fabricante para preparar 500 mL de medio Agar Nutritivo, Agar nutritivo con 5% sucrosa, Agar Czapeck y Agar para hongos y levaduras Adicionar el agua destilada y calentar a ebullición para disolver con agitación.. Medir y ajustar el pH si es necesario.

2. Esterilizar en autoclave a 121 °C por 15 min.

3. Distribuir 20 mL de medio a cada caja de Petri , dejar solidificar y someter a prueba de esterilización a 37 °C

4. Procedimiento

1. Remover la tapa de la caja petri que contiene el agar nutritivo, el agar hongos y levaduras y Czapeck. Déjelo por espacio de 1 hora abierto, una vez concluido el tiempo tápelo, inviértalo y márquelo. Incúbelo a temperatura ambiente de 3 a 4 días. Una vez transcurrido el tiempo efectúe el registro de sus observaciones de las colonias formadas.

2. Humedecer un cotonete con agua estéril y frótelo en la piel, estríelo en la caja

petri con agar nutritivo. Tápelo, inviértalo y márquelo. Incúbelo a 37 °C por 48 a

72 hrs. Una vez transcurrido el tiempo efectúe el registro de sus observaciones de las colonias formadas..

3. Humedecer un cotonete con agua estéril y frótelo dentro de su boca, estríelo en la caja petri con agar nutritivo con 5% sucrosa. Tápelo, inviértalo y márquelo. Incúbelo a 37 °C por 48 a 72 hrs. Una vez transcurrido el tiempo efectúe el registro de sus observaciones de las colonias formadas.

4. Se introduce la torunda en la boca, evitando el contacto con la lengua y otras zonas de la boca, y se frota contra la mucosa de la faringe. a).- Frotar con un hisopo estéril sobre un segmento de la placa agar sangre, haciéndolo girar a la vez para descargar toda la muestra. Extender el inóculo inicial con el asa bacteriológica. b).- Con el asa flameada y fría extender el inóculo sobre otro segmento. Flamear el asa y repetir dos veces el paso 2, sin llegar a tocar el inóculo inicial. c).- Clavar el asa dos o tres veces en el agar, al principio de la siembra, para obtener cultivo bajo la superficie. Incubar las placas 18 h a 35-37°C. Una vez transcurrido el tiempo efectúe el registro de sus observaciones de las colonias formadas y de la presencia de hemólisis.

5.- Colocar una gota de agua estéril en un portaobjetos. Flamear el asa de siembra

hasta que adopte un color rojo.a).- Tomar una muestra del líquido del yogurt intentando no tocar con el asa la parte sólida de la materia del yogurt (contiene demasiada grasa y puede dificultar la observación.b).-Hacer un frotis de la muestra en la gota de agua (extenderlo completamente). Fíjela con calor en el mechero hasta que el agua se evapore.c).- Cubrir el portaobjetos con azul de metileno, deje actuar por un minuto. Una vez transcurrido el tiempo lavar cuidadosamente la preparación con agua para eliminar el exceso de colorante. Deje un par de gotas y cubra con el portaobjetos intentando no dejar burbujas de aire. Observar en el microscopio en el mayor aumento posible y registre sus observaciones..

5. Discusión y Conclusiones.

1. Mencione con que esporas bacterianas se realiza el control biológico para el método de esterilización de:

a) calor húmedo b) calor seco c) óxido de etileno

2.- ¿Las bacterias del yogurt son autótrofas o heterótrofas? Explique porqué.

3.- ¿Que tipo de hemólisis presentaron las colonias en la placa agar sangre y

explique a que se debe la reacción hemolítica observada en el medio?

6. Bibliografía.

Claus. G. W. 1988. Understanding Microbes. A Laboratory Textbook for Microbiology. Ed. W. H. Freeman and Company, Nex York . U.S.A.

Difco Manual. Dehydrated culture Media and Reagentes for Microbiology. Difco laboratories Detroit Micg¡higan.Tenth Edition

Merck. Manual de Medios de Cultivo.