ASSALAMUALIKUM

WR. WB

ISOLASI RNA PADA SEL PROKARIOTIK

OLEH :TRI UTAMI

RIA OKTAMIWIKA PUTRIANATITIEN YULIASTI

FERLY TRINOVELDISRI WULANDARI

PUSPA AGUSTINAAHMAD FAHZAL

LAMTIAR

PENGERTIAN RNA

RNA merupakan singkatan dari Ribonukleatid Acid atau Asam ribonukleat. RNA merupakan substansi genetik yang berperan sebagai perantara dalam proses pengkodean protein dari gen yang terdapat di dalam DNA.

STRUKTUR RNA

Hal yang perlu diperhatikan dala memahami struktur RNA :

Gula RibosaUrasil dan Timin Polinukleotida

JENIS RNA

1. mRNA2. tRNA

4. RNA Genom

3. rRNA

Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau PROTEIN dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel.

ELEKTROFORESIS GEL

Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya.

Sel ProkariotikBerdasarkan keadaan intinya, sel dibedakan dalam dua macam, yaitu: sel

prokariotik dan sel eukariotik. Sel prokariotik adalah sel yang belum mempunyai inti sejati. Ciri-ciri sel prokariotik adalah bahan genetik (DNA) tidak terstruktur dalam bentuk nucleus, DNA terdapat pada nukleoid yang tidak

diselubungi oleh membran.

Pada sel prokariotik, materi inti (DNA) terdapat dalam nukleoid yang tidak dibatasi oleh membran inti. Contoh sel prokariotik ialah bakteri, dan gangang biru yang termasuk Monera.

PRINSIP ISOLASI RNA

•Isolasi RNA yang harus diperhatikan adakah aktivitas RNAase dan struktur RNA yang utas tunggal. RNAase merupakan enzim yang mempunyai kemampuan untuk mendegradasi RNA.

•Secara umum penanganan isolasi RNA adalah dalam segala aktivitasnya menggunakan sarung tangan karena RNAase terdapat dimana-mana dan jumlahnya banyak.

•Untuk memperoleh kualitas tinggi, RNA utuh merupakan hal utama dan paling penting dalam percobaan biologi molekuler, termasuk tes perlindungan nukleus, RT-PCR, pemetaan RNA, translasi in vitro dan konstruksi cDNA. Untuk itu, dilakukan serangkaian prosedur isolasi RNA sampai tahap pemurnian RNA.

Ekstraksi RNA Prokariot (1)mRNA merupakan materi genetik yang mengkode

suatu protein. Jumlah populasi mRNA akan lebih banyak dibanding dengan DNA. mRNA prokariot dapat dipisahkan dari DNA dengan menggunakan oligonukleotida dT. Atau RNA total juga dapat di isolasi dari sel dengan menambahkan enzim DNase yang berfungsi untuk mendegradasi DNA.

Kecepatan dalam pemurnian RNA bakteri sangat

penting karena waktu paruh mRNA bakteri pendek dan membutuhkan waktu yang cepat dalam proses pembekuan. Beberapa bakteri diisolasi sebelum ditambahkan enzim lytic. Jika tidak ditambahkan enzim lytic tersebut akan terjadi penundaan isolasi.

Ekstraksi RNA dari organisme prokariot dilakukan melalui proses penghancuran dinding selpenghilangan protein dan DNA dan pengendapan RNA dan pemanenan.

Ekstraksi RNA Prokariot (2)

Kotoran akibat lisis sel dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Kemudian molekul nuleotida (DNA dan RNA) yang telah dipisahkan dibersihkan dari protein yang masih ada dengan menggunakan phenol. Dalam proses ini sebagian kecil RNA juga dapat dibersihkan. Sedangkan choloform digunakan untuk membersihkan sisa-sisa protein dan polisakarida dari larutan.

Enzim DNAase digunakan untuk menghancurkan DNA sehingga RNA dapat diisolasi secara utuh. Pemurnian atau purifikasi RNA dapat dilakukan dengan mencampur larutan DNA tersebut dengan PCl yang berfungsi memekatkan, memisahkan RNA dari larutan, dan mengendapkan

ISOLASI RNA DENGAN METODE GTC (1)

•Sampel yang berasal dari lapangan harus dicuci bersih dulu dan ekstrak RNA disimpan dalam freser -80. Ektraksi RNA dengan menggunakan nitrogen cair atau secara langsung menggunakan larutan ektraksi. Selalu bekerja didalam es untuk mencegah degradasi RNA dan mengurangi aktivitas RNAse. Tahapan isolasi RNA dengan menggunakan GTC metod. Secara umum metode isolasi RNA menggunakan metode GTC . GTC adalah satu dari yang paling efektiv untuk mendenaturasi protein untuk efisisensi denaturasi RNAse endogenus. Modifikasi GTC menggunakan trizol, satu tahap RNA isolasi dan RNase kit.

ISOLASI RNA DENGAN METODE GTC (2)

Tahapan isolasi metode GTC terdiri dari lisis, pemisahan, pencucian RNA dan presiptasi dan pemurnian. Lisis tahapan menjerapan dan penggangguan sel. Larutan denaturasi pada GTC mengguakan trizol, lisis buffer. Separasi adalah tahapan pemisahan substansi hidrofobik dari subatansi  hidrofilik seperti DNA dan RNA dan dipisahkan RNA dan DNA. Larutan yang digunakan seperti phenol, chloroform dan isoamil alcohol. Pencucian RNA dan perispitasi menggunakan NaAc atau LiCl.

Tahapan secara umum:

a.Chloroform ditambahkan untuk memisahkan RNA dengan pengkotornya

b.RNA dipresipitasi dengan penambahan isopropyl (1x volume) atau 100 perse etanol (2,5 x volume) dan larutan garam (1/10 volem dari 3 M NaAc pH 5,2).

c.RNA presipitasi adalah sering tidak terlihat sebelum sentrifugasi tetapi banyak bentuk yang berhubugan gen di bagaian bawah tube.

d.Dicuci dengan etanol (70% EtOH) RNA pelet e.Pemurnian RNA adalah terlihat endapan yang berwarna putih

diperhatikan terdapat kontaminan proteinf.Pelet dikeringkan selama 5-10’ (dikering anginkan, jangan

meggunakan vacuum dry).g.Bagamanapun juga Etoh harus dihilangkanh.Penggunaan RNAse dan diinkubasikan selama 1 hari. i.Divortek atau ditaping untuk menghomogenkan dengan larutan. j.RNA quantifikasi dan qualitas pengecekan

ISOLASI RNA DENGAN METODE REVERSE TRANSCRIPTASE POLIMERASE CHAIN REACTION (RT PCR) Teknik ini merupakan pengembangan dari teknik PCR yang awal mulanya ditemukan oleh Karry B. Mullis pada tahun 1985. Metode PCR adalah suatu metode enzimatis untuk melipatgandakan secara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu dengan cara in-vitro. Teknik RT PCR merupakan suatu pengembangan dari teknik PCR untuk melakukan analisis terhadap RNA hasil transkripsi yang hanya terdapat dalam jumlah yang sedikit di dalam sel. Teknik RT PCR yang dikembangkan sangat spesifik, sehingga dapat digunakan walaupun jumlah RNA yang akan dianalisis sedikit (Yowono 2006). Bahan yang digunakan ialah daun tembakau, nitrogen cair, buffer CTAB, laruran LI, larutan LiCI, TE, larutan PCI, DEPC, MOPS, primer SOD, primer Oligo (dt), dNTP, ddH2O, RNA, enzim superskrip Reverse Transkiptase, dan DDT.

Metode kerja, antara lain :

1. Isolasi RNA Total

2. Kuantifikasi dengan Elektroforesis

3. Isolasi gen dengan RT-PCR

4. Pengukuran Kuantitas RNA

WASSALAMUALIKUM

WR. WB