powerplex® fusion system - プロメガƒ—ロメガ株式会社 1 powerplex® fusion system...

PROMEGA CORP

PowerPlex® Fusion

System テクニカルマニュアル

プロメガ株式会社

2015/02/12

すべての技術文献はインターネットで www.promega.com/protocols/から入手いただけます。本テ

クニカルマニュアルの最新版は上記ウェブサイトにてご確認ください。本製品の技術的なお問い

合わせはプロメガテクニカルサービス部までお寄せください。

テクニカルサービス Tel. 03-3669-7980 / Fax. 03-3669-7982 E-mail:[email protected]

PowerPlex® Fusion

System

プロメガ株式会社 www.promega.co.jp

1 PowerPlex® Fusion System

目次

1. はじめに ............................................................................................................................. 3

2. キットの構成品および保存条件 ......................................................................................... 5

3. ご使用いただく前に ........................................................................................................... 7

3.A. 使用上の注意 ................................................................................................................. 7

3.B. スペクトルキャリブレーション .................................................................................... 8

4. PowerPlex® Fusion System を用いた DNA 増幅のプロトコール.... 10

4.A. 抽出 DNA の増幅 ......................................................................................................... 11

4.B. 保存カードパンチを用いた DNA の直接増幅 ............................................................. 15

4.C. スワブを用いた DNA の直接増幅 ............................................................................... 21

5. 装置の装備およびサンプルの調製 ................................................................................... 25

5.A. Applied Biosystems® 3500または 3500xL Genetic Analyzerを用いた増幅フラグメン

トの検出 ............................................................................................................................... 25

5.B. Applied Biosystems® 3100 または 3100-Avant Genetic Analyzer と Data Collection

ソフトウェア Version 2.0、あるいは Applied Biosystems® 3130 または 3130xl Genetic

Analyzer と Data Collection ソフトウェア Version 3.0 を用いた増幅フラグメントの検出

.............................................................................................................................................. 39

6. データの解析 .................................................................................................................... 43

6.A. GeneMapper® ID-X ソフトウェア Version 1.2 への PowerPlex® Fusion 用 Panel、Bin

および Stutter テキストファイルのインポート .................................................................. 43

6.B. GeneMapper® ID-X ソフトウェア Version 1.2 への CC5 ILS 500 IDX サイズスタンダ

ードのインポート ................................................................................................................. 45

6.C. GeneMapper® ID-X ソフトウェア Version 1.2 でのサイズスタンダードの作成 ....... 47

6.D. GeneMapper® ID-X ソフトウェア Version 1.2 での現場試料分析用の Analysis

Method の作成 ..................................................................................................................... 49

6.E. GeneMapper® ID-X ソフトウェア Version 1.2 でのデータベース登録または父性評価

分析用の Analysis Method の作成 ...................................................................................... 55

6.F. GeneMapper® ID ソフトウェア Version 3.2 への PowerPlex® Fusion 用 Panel および

Bin テキストファイルのインポート .................................................................................... 60

6.G. GeneMapper® ID ソフトウェア Version 3.2 への CC5 ILS 500 IDX サイズ標準のイン

ポート ................................................................................................................................... 62

6.H. GeneMapper® ID ソフトウェア Version 3.2 でのサイズスタンダードの作成 .......... 63

6.I. GeneMapper® ID ソフトウェア Version 3.2 での現場試料分析用の Analysis Method

の作成 ................................................................................................................................... 65


2 はじめに

6.J. GeneMapper® ID ソフトウェア Version 3.2 でのデータベース登録または父性評価分

析用の Analysis Method の作成.......................................................................................... 71

6.K. コントロール ............................................................................................................... 75

6.L. 結果 .............................................................................................................................. 76

7. トラブルシューティング.................................................................................................. 80

7.A. 増幅およびフラグメントの検出 .................................................................................. 80

7.B. 抽出 DNA の増幅 ......................................................................................................... 83

7.C. 保存カードパンチを用いた DNA の直接増幅 ............................................................. 85

7.D. スワブを用いた DNA の直接増幅 ............................................................................... 87

7.E. GeneMapper® ID-X ソフトウェア .............................................................................. 89

7.F. GeneMapper® ID ソフトウェア ................................................................................... 91

8. 参考文献 ........................................................................................................................... 95

9. 付録 .................................................................................................................................. 97

9.A. PowerPlex® Fusion System のローカスを使用する利点 ............................................ 97

9.B. DNA の抽出および定量方法、ならびに自動化支援 .................................................. 101

9.C. CC5 Internal Lane Standard 500 ............................................................................ 102

9.D. バッファーと溶液の組成 ........................................................................................... 103

9.E. 関連製品のご紹介 ...................................................................................................... 104



1. はじめに

短鎖縦列反復配列（STR）ローカスは、3～7 塩基対の短い配列を基本単位とする短い反復配列

からなります（1–4）。このような反復配列はヒトゲノム全体に散在しており、高多型性マーカー

として利用できるものが多く、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて検出することができます

（5–9）。STR ローカスのアレルは、PCR により増幅させた領域内に含まれる反復配列のコピー数

により識別され、電気泳動による分離後、蛍光検出により相違を確認することができます。

PowerPlex® Fusion System

(a-g)は、法医学的分析、親子（親族）鑑定、研究用途におけるヒト個人

識別のアプリケーションに使用するための 24ローカスで構成されたマルチプレックスシステムで

す。この 5 色蛍光システムにより、13 種の CODIS（米国）コアローカス（CSF1PO、FGA、TH01、

TPOX、vWA、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51 および D21S11）、

12 種の European Standard Set（ESS）コアローカス（TH01、vWA、FGA、D21S11、D3S1358、D8S1179、

D18S51、D10S1248、D22S1045、D2S441、D1S1656 および D12S391）、および性判別マーカーであ

るアメロゲニンを一度に増幅し、蛍光検出を行なうことができます。さらに、Y 染色体でアメロ

ゲニンが検出不能であった場合に対処するため、男性特異的な DYS391 ローカスも加えられてい

ます。Penta D および Penta E ローカスの追加により識別能力が向上し、これらの Penta ローカスの

入ったプロファイルを含むデータベースの検索が可能です。最後に、識別能力をさらに高めるた

め、多くのデータベースに含まれる汎用的なローカスである D2S1338 および D19S433 ローカスを

含んでいます。この広範囲の STR マーカーパネルは、CODIS および ESS の推奨ローカスを同時に

満たすことを目的としています。

PowerPlex® Fusion System は、ABI PRISM

® 3100、3100-Avant Genetic Analyzer、Applied Biosystems

®

3130、3130xl、3500、3500xL Genetic Analyzer でご使用いただけます。増幅および検出装置の操作

プロトコールは、装置により異なる場合があります。お使いの装置に合わせて、プロトコール（テ

ンプレート DNA の量、サイクル数、インジェクション条件、ローディング量など）を適宜最適化

する必要があります。研究室内でバリデーションを実施してください。


4 はじめに

PowerPlex® Fusion System は、ホットスタートの熱安定性 DNA ポリメラーゼ（PowerPlex

® Fusion

5X Master Mix の構成品）を含む、ヒトゲノム DNA の STR 領域の増幅に必要な試薬を提供いたし

ます。本マニュアルには、増幅産物の分離および分離した物質の検出に関するプロトコールに加

えて、PowerPlex® Fusion System を GeneAmp

® PCR System 9700 サーマルサイクラーで使用する場

合のプロトコールを掲載しています（図 1）。電気泳動装置の操作プロトコールについては、装置

の製造業者から入手していただく必要があります。

プロメガの他の蛍光 STR システムの詳細は、インターネットで www.promega.com から入手い

ただけます。また、ご請求に応じてプロメガよりご送付いたします。

図 1. PowerPlex® Fusion System のプロトコールの概要

増幅の準備（セクション 4）

PCR（セクション 4）

GeneAmp® PCR System 9700

機器の準備とサンプル調製（セクション 5）

Applied Biosystems® 3500 または

3500xL Genetic Analyzer（セクション 5.A.）

Applied Biosystems® 3130 または ABI PRISM® 3100 または

3130xl Genetic Analyzer、Data Collection 3100- Avant Genetic Analyzer、

Software Version 3.0（セクション 5.B.） Data Collection Software Version 2.0（セクション 5.B.）

データ解析（セクション 6）

GeneMapper® ID-X Software, GeneMapper® ID Software,

Version 1.2 Version 3.2



2. キットの構成品および保存条件

製品名サイズカタログ番号

PowerPlex® Fusion System 200 反応 DC2402

本製品は研究用であり、診断用ではありません。本製品は 25 µl の反応系で 200 回分の反応に十分な量の試

薬を含みます。

Pre-amplification Components Box

1 ml PowerPlex® Fusion 5X Master Mix

1 ml PowerPlex® Fusion 5X Primer Pair Mix

25 µl 2800M Control DNA, 10 ng/µl

5 x 1,250 µl Water, Amplification Grade

Post-amplification Components Box

100 µl PowerPlex® Fusion Allelic Ladder Mix

2 x 300 µl CC5 Internal Lane Standard 500


PowerPlex® Fusion System 800 反応 DC2408

本製品は研究用であり、診断用ではありません。本製品は 25 µl の反応系で 800 回分の反応に十分な量の試

薬を含みます。

Pre-amplification Components Box

4 x 1 ml PowerPlex® Fusion 5X Master Mix

4 x 1 ml PowerPlex® Fusion 5X Primer Pair Mix

25 µl 2800M Control DNA, 10 ng/µl

10 x 1,250 µl Water, Amplification Grade

Post-amplification Components Box

4 x 100 µl PowerPlex® Fusion Allelic Ladder Mix

8 x 300 µl CC5 Internal Lane Standard 500

PowerPlex® Fusion Allelic Ladder Mix は、輸送の際、別の密封された包装で届けられます。この

構成品は、開封後、増幅後用の箱に入れてください。増幅グレードの水は、輸送の際、別の密封

された包装で届けられます。この構成品は、開封後、増幅前用の箱に入れてください。

！


6 キットの構成品および保存条件

保存条件

長期保存される場合、2800M Control DNA 以外のすべての構成品は、自動的に霜取りをしない冷

凍装置にて-30～-10℃で保存してください。2800M Control DNA は 2～10℃で保存してください。

連日使用される場合、PowerPlex® Fusion System の構成品は 2～10℃で最長 1 週間保存できます。

PowerPlex® Fusion 5X Primer Pair Mix、PowerPlex

® Fusion Allelic Ladder Mix および CC5 Internal Lane

Standard 500（CC5 ILS 500）は光感受性ですので、暗所で保存してください。

増幅前用の試薬と増幅後用の試薬は、別々のピペット、チューブラックなどを使用して別々に保

存・使用されるよう強く推奨します。

別途提供品

GeneMapper® ID および ID-X ソフトウェアとともにご使用いただく Panel、Bin および Stutter テ

キストファイルは、以下のサイトからダウンロードしてご利用いただけます：

www.promega.com/resources/tools/genemapper-id-software-panels-and-bin-sets/

蛍光色素の重なりの補正のためには、マトリックススタンダードが必要です。マトリックスス

タンダードは別売りで、ABI PRISM® 3100 および 3100-Avant Genetic Analyzer、Applied Biosystems

®

3130、3130xl、3500 および 3500xL Genetic Analyzer 用の製品（PowerPlex® 5-Dye Matrix Standards、

3100/3130、カタログ番号 DG4700）をご用意しています。



3. ご使用いただく前に

3.A. 使用上の注意

PCR によるタイピングを法医学または父性に関する現場試料に用いる場合

には、バリデーション試験および品質管理法が必要となりますが、これらにつ

いては本マニュアルには記載されていません（10,11）。バリデーションプロセ

スの指針は、Internal Validation of STR Systems Reference Manual（12）として発

行しています。

精製 DNA サンプルまたは直接増幅サンプルの品質や、バッファー、イオン

強度、プライマー濃度、反応液量、使用するサーマルサイクラー、サーマルサ

イクリングの条件のわずかな変化が、PCR の成否に影響することがあります。

増幅および蛍光検出に関する推奨手順を遵守されるよう強くお薦めいたしま

す。推奨プロトコールに修正を加える場合には、追試およびバリデーションが

必要です。

PCR による STR 解析には、きわめて微量のヒト DNA が混入することがあり

ます。テンプレート DNA の調製、プライマーペアの取り扱い、増幅反応液の

混和、および増幅産物の解析の際には、クロスコンタミネーションを生じない

よう、厳重に注意する必要があります。増幅前に使用する試薬および材料

（PowerPlex® Fusion 5X Master Mix、PowerPlex

® Fusion 5X Primer Pair Mix、

2800M Control DNA および増幅グレードの水）は、増幅後に使用する試薬およ

び材料（PowerPlex® Fusion Allelic Ladder Mix および CC5 Internal Lane Standard

500）とは別の箱で提供されます。これらは別々に保存してください。試薬に

コンタミネーションがあった場合に検出できるよう、必ず陰性コントロール反

応（テンプレートなし）を試験に加えてください。手袋およびエアロゾールバ

リアーピペットチップのご使用を強く推奨いたします。

STR 産物の解析に使用する試薬のなかには有害性が疑われるものも含まれ

ており、それぞれ適切に取り扱う必要があります。ホルムアミドは刺激物質お

よび催奇物質であるため、吸入したり皮膚に付着したりしないように十分注意

してください。ホルムアミドを取り扱う際は、警告表示をよく読み、必要な予

防措置を講じてください。ホルムアミドの使用時には必ず手袋を装着し、安全

メガネをかけてください。


8 ご使用いただく前に

3.B. スペクトルキャリブレーション

ABI PRISM® 3100 および 3100-Avant Genetic Analyzer、Applied Biosystems

®

3130、3130xl、3500 および 3500xL Genetic Analyzer を用いたマルチカラーシス

テムの評価では、適切なスペクトルキャリブレーションがきわめて重要です。

各装置用のマトリックスを作成する必要があります。

これらの装置のスペクトルキャリブレーションに関するプロトコールおよ

び追加情報については、PowerPlex® 5-Dye Matrix Standards、3100/3130、Technical

Bulletin #TBD024 をご覧ください。このマニュアルは

www.promega.com/protocols/からオンラインで入手いただけます。


10 PowerPlex® Fusion System を用いた

DNA 増幅のプロトコール

4. PowerPlex® Fusion Systemを用いた

DNA増幅のプロトコール

PowerPlex® Fusion System は、抽出 DNA サンプルの増幅および直接増幅サンプル用に開発され

た製品です。各テンプレートソースに最適な性能を得るため、プロトコールを微調整されること

を推奨します。抽出 DNA（セクション 4.A）、FTA®保存カードおよび FTA 以外の保存カードから

くり抜いたパンチ（セクション 4.B）、ならびにスワブ（セクション 4.C）を用いた DNA 増幅プロ

トコールを、以降の増幅に関するセクションに示します。

PowerPlex® Fusion System は GeneAmp

® PCR System 9700 サーマルサイクラー用に最適化されて

います。

クロスコンタミネーションを防止するため、手袋とエアロゾールバリアーピペットチップの使

用を強く推奨します。増幅前用の試薬と増幅後用の試薬は、完全に別々の部屋に分けて保管して

ください。増幅反応液は、反応準備専用の実験室で調製してください。装置や備品は、増幅準備

専用のものを使用してください。

増幅を成功させるためには細心の注意が必要です。増幅のトラブルシューティングのためのガ

イドをセクション 7 に示します。

2800M Control DNA の濃度は、260nm における吸光度測定により決定しました。他の方法（qPCR

など）によりこのコントロール DNA を定量すると、異なる値が得られる可能性があります。DNA

希釈液は 1 回の増幅ごとに用時調製してください。DNA 希釈液（例：0.25 ng/µl 以下）は保存しな

いでください。

！



4.A. 抽出 DNA の増幅

準備するもの

GeneAmp® PCR System 9700 サーマルサイクラー（Applied Biosystems）

微量高速遠心機

MicroAmp® Optical 96 ウェル反応プレートまたは 0.2 ml MicroAmp

®反応チ

ューブ（Applied Biosystems）

エアロゾールバリアーピペットチップ

下記のプロトコールにより、通常は 25 µl の反応液で 0.25～0.5 ng のテンプレー

ト DNA を増幅します。

増幅反応の準備

1. PowerPlex® Fusion 5X Master Mix、PowerPlex

® Fusion 5X Primer Pair Mix お

よび増幅グレードの水を完全に解凍します。

注：内容物を底に集めるためチューブを短時間遠心した後、各使用前に試

薬を 15 秒間ボルテックスします。5X Primer Pair Mix および 5X Master Mix

をボルテックス後に遠心しないでください。試薬がチューブの底に濃縮す

るおそれがあります。

2. 準備すべき反応の数を決めます。この反応の数には、陽性コントロールお

よび陰性コントロールも含めます。ピペッティングの誤差を加味して、こ

の数に 1～2 反応分を加えます。こうすることで各試薬に微量の無駄は生

じますが、全サンプルに対して十分な量の PCR 増幅反応液を確保するこ

とができます。また、これにより、各反応液に必ず同じ PCR 増幅反応液

が含まれるようになります。

3. 反応混合液にはきれいな MicroAmp®プレートを使用し、適切にラベル表示

します。あるいは、きれいな 0.2 ml 反応チューブの必要数を確認し、適切

にラベル表示します。

4. 表 1 に示した各試薬の最終量を滅菌チューブに添加します。




表 1. 抽出 DNA の増幅に用いる PCR 増幅反応液

PCR Amplification Mix の構成品サンプルあたりの液量 × 反応数最終液量（µl）

Water, Amplification Grade1 µl × ＝

PowerPlex® Fusion 5X Master Mix 5.0 µl × ＝

PowerPlex® Fusion 5X Primer Pair Mix 5.0 µl × ＝

鋳型 DNA（0.25 – 0.5 ng）2,3 15 µl まで

合計反応液量 25 µl

1 最初に、増幅グレードの水をチューブに添加し、その後、PowerPlex® Fusion 5X Master Mix および PowerPlex®

Fusion 5X Primer Pair Mix を添加します。テンプレート DNA はステップ 6 で添加します。

2 DNA テンプレートは、TE-4バッファー（10 mM Tris-HCl［pH 8.0］、0.1 mM EDTA）または 20 μg/ml グリコ

ーゲンを添加した TE-4 バッファー中で保存します。DNA テンプレートを、pH 8.0 でない、もしくは EDTA

濃度が高い TE バッファー中で保存する場合には、添加する DNA サンプル量が最終反応液量の 20％を上回ら

ないようにしてください。PCR の増幅効率や増幅の質は、pH の変化（Tris-HCl が添加されることに起因）、

利用可能なマグネシウム濃度（EDTA によるキレート作用に起因）、あるいはテンプレート DNA の由来や使

用した抽出手順に依存して低濃度で存在する可能性のある他の PCR 阻害物質により大きな影響を受けます。

3 使用する DNA 定量法によって、みかけの DNA 濃度に差が生じる可能性があります（13）。本マニュアルで

推奨する DNA テンプレート量は、260 nm における吸光度測定により決定した DNA 濃度に基づくものです。

ご使用になる DNA 定量法に基づき、最適な DNA 量を決定するための実験を実施されることを強く推奨しま

す。

5. PCR 増幅反応液を 5～10 秒間ボルテックスして混和した後、各反応ウェル

に添加します。

PCR 増幅反応液を十分にボルテックスしないと、増幅不良やローカス間の

不均衡が生じる可能性があります。

6. PCR 増幅反応液を添加した各ウェルに、各サンプルのテンプレート DNA

（0.25～0.5 ng）を添加します。

7. 陽性増幅コントロール用として、2800M Control DNA のチューブをボルテ

ックスして混和した後、0.5 ng を分取し、テンプレート DNA と同容量に

希釈します。PCR増幅反応液を添加した反応ウェルに、希釈したDNA0.5 ng

を添加します。

！

次ページへ続く



8. 陰性増幅コントロール用として、PCR 増幅反応液を添加した反応ウェルに、

テンプレート DNA の代わりに増幅グレードの水または TE-4バッファーを

ピペットで添加します。

9. プレートをシールするか、チューブのキャップを閉じます。

オプション：内容物をウェルの底に集め気泡を完全に除去するため、プレ

ートを短時間遠心します。

前ページより




サーマルサイクリング

増幅用および検出用装置には様々な種類があります。プロトコールは、テン

プレート DNA 量、サイクル数、インジェクション条件、ロードする容量を含

め、各研究室の装置ごとに適宜最適化する必要があります。プロメガでの試験

では、精製 DNA テンプレート 0.5 ng に適したサイクル数は 30 サイクルである

ことが確認されています。

1. MicroAmp®プレートまたは反応チューブをサーマルサイクラーにセット

します。

2. 推奨プロトコールを選択して実行します。ランプ速度の設定が Max モード

になっていることを確認してください。下記に、GeneAmp® PCR System

9700 サーマルサイクラーでの実行に適したプロトコールをご紹介します。

サイクリングの推定所要時間は合計 1.5 時間です。

サーマルサイクリングプロトコール 1

96℃ 1 分

94℃ 10 秒

59℃ 1 分 30 サイクル繰り返す

72℃ 30 秒

60℃ 10 分

4℃ 冷却

1 GeneAmp® PCR System 9700 サーマルサイクラーをご使用の場合、ランプ速度の設定を

Max モードとして、プログラムを実行する必要があります。（Max モードに対応してい

るのは、シルバーまたは金メッキをしたシルバーサンプルブロックのみです。）ランプ

速度は、サーマルサイクリングの実行を開始した後に設定します。「Select Method

Options」画面が現れます。ランプ速度を「Max」に設定し、反応液量を入力します。

3. サーマルサイクリングプロトコールの完了後、増幅サンプルは遮光ボック

スに入れ、-20℃で保存します。

注：増幅サンプルを 4℃以上で長時間保存すると、アーティファクトが発

生するおそれがあります。



4.B. 保存カードパンチを用いた DNA の直接増幅

準備するもの




®反応チ



PunchSolutionTM

Kit（カタログ番号 DC9271）（FTA 以外のカードからのパ

ンチを用いる場合）

Harris Micro-Punch（直径 1.2 mm）または同等品（手動パンチ）およびカッ

ティングマット、または自動パンチシステム

このセクションでは、PowerPlex® Fusion System および GeneAmp

® PCR System

9700 サーマルサイクラーによる、保存カードパンチを用いた DNA の直接増幅

プロトコールについてご説明します。

下記のプロトコールを使用される場合、口腔内サンプルを含む保存カードパ

ンチ（1.2 mm 径）であれば 1 または 2 枚、全血を含む保存カードパンチ（1.2 mm

径）であれば 1 枚を、25 µl の反応液で増幅することを推奨します。PowerPlex®

Fusion System は GeneAmp®

PCR System 9700 サーマルサイクラー用に最適化さ

れています。

注：反応 1 回あたりの保存カードパンチの枚数については、研究室内で最適化

およびバリデーションを実施していただく必要があります。このセクションの

最後に示す推奨される PCR 条件の最適化方法をご覧ください。

FTA®カードサンプルには次の種類があります：

Whatman EasiCollect™または Fitzco Sampact™採取器具を用いて FTA®カー

ドに採取された口腔細胞

滅菌スワブによる採取後に FTA®または Indicating FTA

®カードに移された

口腔細胞

FTA®カードにスポットされた液体の血液（Vacutainer

®採血または保存用チ

ューブに採取したか、指穿刺により採取した血液）




FTA 以外のカードサンプルには次の種類があります：

Bode Buccal DNA Collector™に採取した口腔内サンプル

FTA 以外のカード（例：S&S 903）に採取した血液および口腔内サンプルのパ

ンチ

FTA カード以外の種類のサンプルをご使用になる場合には、PCR 増幅反応液

を添加する前に、PunchSolution™ Kit（カタログ番号 DC9271）で前処理し、サ

ンプルを溶解させます。詳しい情報は、PunchSolution™ Kit のテクニカルマニ

ュアル#TMD038 をご覧ください。これらのサンプルの前処理を怠ると、完全

なプロファイルが得られない可能性があります。

先端直径 1.2 mm の手動パンチツールを用いて、保存カードからサンプルデ

ィスクを作製します。サンプルスポットの中心付近に先端を置き、回転または

プレスすることにより、1.2 mm 径のサンプルディスクをくり抜きます。プラン

ジャーを用いて、反応プレートの対応するウェルにディスクを排出します。

サンプルディスクの作製には、自動パンチャーを用いることもできます。

1.2 mm 径のディスク作製に関する支援、技術面での助言およびトラブルシュー

ティングについては、お使いになる装置のユーザー・ガイドをご参照ください。

注：ウェルにパンチを添加する際、静電気が問題となる可能性があります。FTA®

カードパンチを使用される場合、パンチを添加する前に PCR 増幅反応液をウェ

ルに添加しておくことは、静電気の問題を軽減するのに役立ちます。

FTA 以外のカードパンチを使用される場合には、前処理プロセスでパンチを添

加前に、PunchSolution® Reagent をウェルに添加しておくことは、静電気の問題

を軽減するのに役立ちます。


















します。あるいは、きれいな 0.2 ml 反応チューブの必要数を確認し、適切

にラベル表示します。


表 2 保存カードパンチを用いた DNA 直接増幅用の PCR 増幅反応液

PCR Amplification Mix の構成品 1 サンプルあたりの液量 × 反応数最終液量（µl）

Water, Amplification Grade 15 µl × ＝





Fusion 5X Primer Pair Mix を添加します。FTA®カードパンチを使用される場合、テンプレート DNA はステッ

プ 6 で添加します。

5. PCR 増幅反応液を 5～10 秒間ボルテックスして混和した後、25 µl ずつピ

ペットで各反応ウェルに添加します。



！




6. FTA®保存カードをご使用の場合、口腔内サンプルを含むカードパンチ（1.2

mm 径）であれば 1 または 2 枚、全血を含むカードパンチ（1.2 mm 径）で

あれば 1 枚を、反応プレートの対応するウェルに添加します。FTA 以外の

カードパンチをご使用の場合、PunchSolution™でパンチを前処理した後に

PCR 増幅反応液を添加してください。

注：FTA®カードパンチを最初に添加し、続いて PCR 増幅反応液を添加し

ても問題ありません。

7. 陽性増幅コントロール用として、PCR 増幅反応液 25 µl を添加した反応ウ

ェルに 2800M Control DNA 1 µl（10 ng）を添加します。

注：

1. 陽性対照反応ウェルに、ブランクの保存カードパンチを添加しないで

ください。

2. サイクリング条件および研究室の方針によっては、コントロール DNA

量の最適化が必要となる場合があります。

8. 陰性増幅コントロール用として、PCR 増幅反応液を添加したウェルを用意

します。

注：これに追加して、ブランクパンチを添加した陰性コントロールを設け

ることにより、保存カードまたはパンチ器具由来の汚染を検出することが

できます。

9. プレートをシールした後、保存カードパンチをウェルの底に集めるため、

短時間遠心します。




増幅用および検出用装置には様々な種類があります。プロトコールは、保存

カードパンチの枚数、サイクル数（25～28 サイクル）、インジェクション時間、

ロードする容量を含め、各研究室の装置ごとに最適化する必要があります。プ

ロメガでの試験では、各種サンプルに適したサイクル数が 27 サイクルである

ことが確認されています。口腔内サンプルは、血液サンプルより多くの増幅サ

イクルを必要とする可能性があります。サイクル数は、増幅するサンプルの種

類ごとに各研究室で最適化する必要があります。

1. MicroAmp®プレートをサーマルサイクラーにセットします。






96℃ 1 分

94℃ 10 秒


72℃ 30 秒

60℃ 20 分

4℃ 冷却




速度は、サーマルサイクリングの実行を開始した後に設定します。「Select Method Options」

画面が現れます。ランプ速度を「Max」に設定し、反応液量を入力します。

注：直接増幅の場合、多量の増幅産物のアデニン付加に十分な時間を設けるた

め、最終伸長ステップを抽出 DNA のプロトコール（10 分間）より延長し 20

分間としました。








PCR 条件の最適化

ご使用になる採取方法、サンプルの種類、パンチ枚数および装置での感度評

価実験を最初に実施し、その結果に基づき、サイクル数を最適化する必要があ

ります。

1. 研究室で使用されている代表的な種類のサンプルをいくつか選択します。

通常のワークフローを用いてサンプルを調製します。

2. 使用されるプロトコールに応じて、口腔内サンプルを含む保存カードパン

チ（1.2 mm 径）1 または 2 枚、あるいは全血を含む保存カードパンチ（1.2

mm 径）1 枚を反応プレートの各ウェルに添加します。FTA 以外のカード

に保存したサンプルを使用される場合には、PunchSolution™ Kit（カタロ

グ番号 DC9271）で必ず前処理してください。

3. 同じサンプル由来のパンチを添加した同一の反応プレートを 4枚用意しま

す。

4. 上記のサーマルサイクリングプロトコールを用いて、サンプルを増幅しま

すが、プレートによってサイクリング数（25～28 サイクル）を変えます。

5. 増幅後、各研究室でバリデーションされた分離および検出プロトコールを

用いて、サンプルの種類に最適なサイクル数および保存カードパンチの枚

数を決定します。



4.C. スワブを用いた DNA の直接増幅

準備するもの




®反応チ



SwabSolution™ Kit（カタログ番号 DC8271）

このセクションでは、PowerPlex® Fusion System および GeneAmp

® PCR System

9700 サーマルサイクラーによる、スワブ抽出液からの DNA の増幅プロトコー

ルについてご説明します。

SwabSolution™ Kit（カタログ番号 DC8271）のテクニカルマニュアル#TMD037

に記載されている手順により、OmniSwab™（GE Healthcare）または綿棒を

SwabSolution™ Kit で前処理し、スワブ抽出液を調製します。
















します。





表 3 スワブを用いた DNA 直接増幅用の PCR 増幅反応液

PCR Amplification Mix の構成品 1 サンプルあたりの液量 × 反応数最終液量（µl）

Water, Amplification Grade 13 µl × ＝



スワブ抽出物 2.0 µl



Fusion 5X Primer Pair Mix を添加します。スワブ抽出液はステップ 6 で添加します。

5. PCR 増幅反応液を 5～10 秒間ボルテックスして混和した後、各反応ウェル

に 23 µl ずつピペットで添加します。



6. 反応プレートの対応するウェルに、各サンプルのスワブ抽出液 2.0 µl をピ

ペットで添加します。

7. 陽性増幅コントロール用として、2800M Control DNA のチューブをボルテ

ックスして混和した後、分取し、濃度 5.0 ng/µl に希釈します。PCR 増幅反

応液 23 µl の入った反応ウェルに、2 µl（10 ng）を添加します。

8. 陰性増幅コントロール用として、PCR 増幅反応液の入った反応ウェルに、

スワブ抽出液の代わりに増幅グレードの水または TE-4バッファー2.0 µl を

ピペットで添加します。

9. プレートをシールします。

オプション：内容物をウェルの底に集め気泡を完全に除去するため、プレ

ートを短時間遠心します。

！




増幅用および検出用装置には様々な種類があります。プロトコールは、テン

プレート DNA 量、サイクル数（25～28 サイクル）、インジェクション時間、

ロードする容量を含め、各研究室の装置ごとに最適化する必要があります。プ

ロメガでの試験では、各種サンプルに適したサイクル数が 27 サイクルである

ことが確認されています。サイクル数は、増幅するサンプルの種類ごとに各研

究室で最適化する必要があります。

1. MicroAmp®プレートをサーマルサイクラーにセットします。






96℃ 1 分

94℃ 10 秒


72℃ 30 秒

60℃ 20 分

4℃ 冷却




速度は、サーマルサイクリングの実行を開始した後に設定します。「Select Method Options」

画面が現れます。ランプ速度を「Max」に設定し、反応液量を入力します。

注：直接増幅の場合、多量のアンプリコンのアデニル化に十分な時間を設ける

ため、最終伸長ステップを抽出 DNA のプロトコール（10 分間）より延長し 20

分間としました。








PCR 条件の最適化

ご使用になる採取方法、サンプルの種類および装置での感度評価実験を最初

に実施し、その結果に基づき、サイクル数を最適化する必要があります。

1. 研究室で使用されている代表的な種類のサンプルをいくつか選択します。

通常のワークフローを用いてサンプルを調製します。

2. 同じスワブ抽出液を分注した同一の反応プレートを 4 枚用意します。

3. 上記のサーマルサイクリングプロトコールを用いて、サンプルを増幅しま

すが、プレートによってサイクリング数（25～28 サイクル）を変えます。

4. 増幅後、各研究室でバリデーションされた分離および検出プロトコールを

用いて、サンプルの種類に最適なサイクル数を決定します。



5. 装置の装備およびサンプルの調製

5.A. Applied Biosystems® 3500 または 3500xL Genetic Analyzer を用いた増幅フラグメ

ントの検出

準備するもの

95℃のヒートブロック、恒温槽、またはサーマルサイクラー

砕いた氷または氷水

96 ウェルプレートと互換性のある高速遠心機


3500/3500xL キャピラリーアレイ（36 cm）

96-Well Retainer & Base Set（Standard）（Applied Biosystems カタログ番号

4410228）

Applied Biosystems® 3500または 3500xL Genetic Analyzer用のPOP-4

®ポリマ

ーパウチ

陽極バッファーコンテナ

陰極バッファーコンテナ

MicroAmp® Optical 96 ウェルプレートおよびセプタム（中ブタ）または同

等品

Hi-Di™ホルムアミド（Applied Biosystems カタログ番号 4311320）

ホルムアミドの品質は、検出結果に非常に大きな影響を及ぼします。Hi-Di™

ホルムアミドを使用してください。ホルムアミドは、小分けにして-20℃で凍結

保存してください。凍結融解を繰り返したり、4℃で長期間保存すると、ホル

ムアミドが分解するおそれがあります。低品質のホルムアミドはイオン化して

いる可能性があり、インジェクション時に DNA と競合します。このような競

合が起こると、ピーク高が低くなり、感度も低下します。インジェクション時

間を延長しても、シグナルは上がりません。

ホルムアミドは刺激物質および催奇物質であるため、吸入したり皮膚に付着

しないように十分注意してください。ホルムアミドを取り扱う際は、警告表示

をよく読み、必要な予防措置を講じてください。ホルムアミドの使用時には必

ず手袋を装着し、安全メガネをかけてください。

！

！


26 装置の装備およびサンプルの調製

サンプルの調製

1. CC5 Internal Lane Standard 500 を解凍します。

注：内容物を底に集めるためチューブを短時間遠心した後、使用前に各試

薬を 15 秒間ボルテックスします。ボルテックス後に遠心しないでくださ

い。サイズスタンダードがチューブの底に濃縮するおそれがあります。

2. CC5 Internal Lane Standard 500 と Hi-Di™ホルムアミドを下記に従って混合

して混和し、ローディングカクテルを調製します。

［（1.0 µl CC5 ILS 500）×（サンプル数）］+［（10.0 µl Hi-Di™ホルムアミド）

×（サンプル数）］

注：サイズスタンダードのピーク強度を調整するため、ローディングカク

テルの調製に用いる CC5 Internal Lane Standard 500 の量は、各研究室で適宜

増減できます。ホルムアミドの量は常に 1 ウェルあたり 10.0 µl とし、ステ

ップ 4におけるウェル添加量はCC5 Internal Lane Standard 500の量に応じて

調整します。

3. 10～15 秒間ボルテックスし混合します。

4. 各ウェルにホルムアミド／CC5 Internal Lane Standard 500 の混合液を 11 µl

ずつピペットで分注します。

5. 増幅サンプル 1 µl（または PowerPlex® Fusion Allelic Ladder Mix 1 µl）を添

加します。ウェルを適切なセプタでカバーします。

注：検出限界は装置ごとに異なります。したがって、インジェクション時

間、インジェクション電圧や、ローディングカクテルと混和するサンプル

量は、適宜増減する必要があります。ランモジュールのインジェクション

時間またはインジェクション電圧を変更するには、Data Collection ソフトウ

ェアの Library メニューから「Instrument Protocol」を選択してください。ピ

ーク高が目的とする高さを上回る場合には、目的とするシグナル強度が得

られるよう、増幅反応に用いる DNA テンプレート量を減らすか、増幅プ

ログラムのサイクル数を減らしてください。インジェクション時間または

電圧を減少させる場合には、サイジングを正しく行うため、橙色チャンネ

ルのピーク検出閾値を適宜低く変更する必要があります。

6. ウェルから気泡を除去するためプレートを短時間遠心します。

7. サンプルを 95℃で 3 分間加熱して変性し、氷中に移して 3 分間急冷します。

サンプルの変性は、装置にロードする直前に行ってください。



装置の準備

装置の保守点検スケジュール、キャピラリーアレイ、バッファーおよびポリ

マーパウチの設置、スペーシャルキャリブレーションの実施に関する説明は、

Applied Biosystems 3500/3500xL Genetic Analyzer の User Guide をご覧ください。

サンプルは、Applied Biosystems 3500/3500xL Genetic Analyzer の User Guide に記

載されている方法により解析します。

1. 3500 Data Collection ソフトウェアを開きます。Dashboard 画面が起動しま

す（図 2）。Consumables Information および Maintenance Notifications に問題

がないことを確認します。

オーブン温度を 60℃に設定した後、電気泳動を開始する 30 分以上前に

「Start Pre-Heat」を選択してオーブンを予熱します。

図 2. Dashboard 画面



2. Instrument Protocol を新規作成するには、Library に移動し、「Instrument

Protocol」→「Create」を選択します。以前作成した Instrument Protocol を

使用することもできます。

図 3 に、プロメガで使用している Applied Biosystems® 3500xL Genetic

Analyzer の設定（アプリケーションのタイプ、Dye Set、キャピラリー長、

ポリマー、ランモジュール、適切なプロトコール情報）を示します。初期

設定から変更したのは、Dye Set の設定のみです。

図 3. Create New Instrument Protocol ウィンドウ




推奨される設定を以下に示します：

Application Type HID

Capillary Length 36cm

Polymer POP-4®

Dye Set G5 (Promega G5 spectral)

Run Module HID36_POP2(xl)

Injection Time1 24 seconds

Injection Voltage 1.2 kV

Run Time 1,210 – 1,5000 seconds

1 ピーク高を増減するため、インジェクション時間を変更できます（2～24 秒）。

Instrument Protocol を作成する際には、プロメガの蛍光色素 5 種類のスペクト

ルキャリブレーションを実行するのに使用したのと同じ Dye Set を必ず選択し

てください。ランタイムは 1,210～1,500 秒、インジェクション条件は初期設定

のままとすることを推奨します。

ランタイムおよびその他の装置設定は、研究室内で最適化・バリデーション

する必要があります。

研究室内でインジェクション条件を最適化する場合には、試験条件ごとに

Instrument Protocol を作成することもできます。1 種類の Instrument Protocol を

使用する場合には、Applied Biosystems 3500/3500xL Genetic Analyzers の User

Guide に従って、ライブラリのエントリを編集してください。

わかりやすいプロトコール名を指定します。

注：詳細は、Applied Biosystems 3500/3500xL Genetic Analyzers の User Guide を

ご覧ください。

！

前ページより



3. QC プロトコール用の Size Standard を新規作成する際には、Library に移動

します。「Size Standards」→「Create」を選択します。以前作成した Size

Standard を使用することもできます。

サイズスタンダードに「ILS500」または別の適切な名前を付けます。色素

の色は「橙色」を選択します。サイズスタンダードには、60、65、80、100、

120、140、160、180、200、225、250、275、300、325、350、375、400、

425、450、475 および 500 塩基長のフラグメントが含まれています。図 4

をご覧ください。

図 4. Create New Size Standard ウィンドウ




4. QC プロトコールを新規作成するには、Library に移動します。「QC Protocols」

→「Create」を選択します。以前作成した QC プロトコールを使用するこ

ともできます。

わかりやすいプロトコール名を付けます。ステップ 3 で作成したサイズス

タンダードを選択します。QC プロトコールは、Applied Biosystems®

3500

または3500xL Genetic AnalyzerでのPowerPlex® Fusion Systemの使用に際し

て研究室内でバリデーションした条件を基に設定する必要があります。図

5 にこれらの設定の一例を示します。

注：CC5 ILS 500 のピーク高は、他の色素のピーク高より低いのが通例で

す。したがって、橙色色素の閾値は他の色素より適宜低値に設定します。

図 5. Create New QC Protocol ウィンドウ

前ページより



5. Assay を新規作成するには、Library に移動します。「Assays」→「Create」

を選択します。以前作成した Assay を使用することもできます。

Create New Assay ウィンドウ（図 6）にて、ステップ 2 で作成した Instrument

Protocol およびステップ 4 で作成した QC Protocol を選択します。わかりや

すいアッセイ名を付けます。アプリケーションのタイプは「HID」を選択

します。サンプル名を指定したプレート内の全サンプルについて、Assay

を指定する必要があります。

図 6. Create New Assay ウィンドウ




6. File Name Convention（図 7）を新規作成するには、Library に移動します。

「File Name Conventions」→「Create」を選択します。以前作成した File Name

Convention を使用することもできます。

研究室の慣行に従って File Name Attributes を選択し、わかりやすい名前を

付けて保存します。

図 7. Create New File Name Convention ウィンドウ

前ページより



7. Results Group（図 8）を新規作成するには、Library に移動します。「Results

Group」→「Create」を選択します。以前作成した Results Group を使用する

こともできます。

研究室の慣行に従って Results Group Attributes を選択し、わかりやすい名前

を付けて保存します。

図 8. Create New Results Group ウィンドウ




8. New Plate を作成するには、Libraryに移動し、Manage メニューから「Plates」

→「Create」を選択します。

9. わかりやすいプレート名を付けます。プレートの種類は、ドロップダウン

メニューから「HID」を選択します（図 9）。

図 9. プレートプロパティの定義

前ページより



10. 「Assign Plate Contents」を選択します（図 10）。

11. ウェル内のサンプル名を指定します。

12. ステップ 5 で作成した Assay または以前作成した Assay を選択する場合に

は、画面左下の「Assays」の下にある「Add from Library」オプションを使

用します。「Add to Plate」ボタンをクリックし、ウィンドウを閉じます。

図 10. プレート構成の指定




13. ステップ 6 で作成した、あるいは以前作成した File Name Convention を選

択する場合には、「File Name Convention」の下の「Add from Library」オプ

ションを使用します。「Add to Plate」ボタンをクリックし、ウィンドウを

閉じます。

14. ステップ 7 で作成した、あるいは以前作成した Results Group を選択する場

合には、「Results Groups」の下の「Add from Library」オプションを使用し

ます。「Add to Plate」ボタンをクリックし、ウィンドウを閉じます。

15. サンプルウェルを強調表示した後、Assays、File Name Conventions および

Results Groups ボックス内で各サンプルに対応する Assays、File Name

Conventions および Results Groups をそれぞれ選択します。

16. 「Link Plate for Run」を選択します。

17. Load Plate ウィンドウが現れます。「Yes」を選択します。

18. Run Information ウィンドウ（図 11）で、Run Name を付けます、「Start Run」

を選択します（図には示さず）。

図 11. Run Name の指定

前ページより



5.B. Applied Biosystems® 3100 または 3100-Avant Genetic Analyzer と Data

Collection ソフトウェア Version 2.0、あるいは Applied Biosystems® 3130 または 3130xl

Genetic Analyzer と Data Collection ソフトウェア Version 3.0 を用いた増幅フラグメントの

検出

準備するもの

95℃のヒーティングブロック、恒温槽、またはサーマルサイクラー

氷浴または氷水浴

96 ウェルプレートと互換性のある高速遠心機


3100 または 3130 キャピラリーアレイ（36 cm）

3100 または 3130 用の Performance Optimized Polymer 4（POP-4®）

10×Genetic Analyzer Buffer with EDTA

MicroAmp® Optical 96 ウェルプレートおよびセプタム（中ブタ）または同

等品

Hi-Di™ホルムアミド（Applied Biosystems カタログ番号 4311320）

ホルムアミドの品質は、検出結果に非常に大きな影響を及ぼします。Hi-Di™

ホルムアミドを使用してください。ホルムアミドは、小分けにして-20℃で凍結

保存してください。凍結融解を繰り返したり、4℃で長期間保存したりすると、

ホルムアミドが分解するおそれがあります。低品質のホルムアミドはイオン化

している可能性があり、インジェクション時に DNA と競合します。このよう

な競合が起こると、ピーク高が低くなり、感度も低下します。インジェクショ

ン時間を延長しても、シグナルは上がりません。

ホルムアミドは刺激物質および催奇物質であるため、吸入したり皮膚に付着

したりしないように十分注意してください。ホルムアミドを取り扱う際は、警

告表示をよく読み、必要な予防措置を講じてください。ホルムアミドの使用時

には必ず手袋を装着し、安全メガネをかけてください。

！

！



サンプルの調製

1. CC5 Internal Lane Standard 500 を解凍します。

注：内容物を底に集めるためチューブを短時間遠心した後、使用前に各試

薬を 15 秒間ボルテックスします。ボルテックス後に遠心しないでくださ

い。サイズスタンダードがチューブの底に濃縮するおそれがあります。

2. CC5 Internal Lane Standard 500 と Hi-Di™ホルムアミドを下記に従って混合

して混和し、ローディングカクテルを調製します。

［（1.0 µl CC5 ILS 500）×（サンプル数）］+［（10.0 µl Hi-Di™ホルムアミド）

×（サンプル数）］

注：サイズスタンダードのピーク強度を調整するため、ローディングカク

テルの調製に用いる CC5 Internal Lane Standard 500 の量は各研究室で適宜

増減できます。ホルムアミドの量は常に 1 ウェルあたり 10.0 µl とし、ス

テップ 4 におけるウェル添加量は CC5 Internal Lane Standard 500 の量に応

じて調整します。

3. 10～15 秒間ボルテックスし混合します。

4. 各ウェルにホルムアミド／CC5 Internal Lane Standard 500 の混合液を 11 µl

ずつピペットで分注します。

5. 増幅サンプル 1 µl（または PowerPlex® Fusion Allelic Ladder Mix 1 µl）を添

加します。ウェルを適切なセプタでカバーします。

注：検出限界は装置ごとに異なります。したがって、インジェクション時

間、インジェクション電圧や、ローディングカクテルと混和するサンプル

量は、適宜調整する必要があります。ランモジュールのインジェクション

時間またはインジェクション電圧を変更するには、Data Collection ソフト

ウェアの Module Manager を使用してください（下記の「装置の準備」を

参照）。インジェクション時間または電圧を減少させる場合には、サイジ

ングを正しく行うため、橙色チャンネルの peak amplitude threshold を適宜

低く変更する必要があります。

6. ウェルから気泡を除去するためプレートを短時間遠心します。

7. サンプルを 95℃で 3 分間加熱して変性し、氷浴または氷水浴に移して 3

分間急冷します。サンプルの変性は、装置にロードする直前に行なってく

ださい。



装置の準備

クリーニング、キャピラリーアレイの設置、スペーシャルキャリブレーショ

ンの実施およびポリマー充填に関する説明は、各装置のユーザーズマニュアル


以下の例外を除き、サンプルの解析は、ABI PRISM® 3100 または 3100-Avant

Genetic Analyzer と Data Collection ソフトウェア Version 2.0、および Applied

Biosystems® 3130 または 3130xl Genetic Analyzer と Data Collection ソフトウェア

Version 3.0 のユーザーズマニュアルに記載されている方法どおりに行います。

1. Module Manager で「New」を選択します。Type ドロップダウンリストで

「 Regular 」を選択し、 Template ドロップダウンリストで

「HIDFragmentAnalysis36_POP4」を選択します。インジェクション時間が

5 秒、インジェクション電圧が 3 kV、泳動時間が 1,500 秒になっているこ

とを確認します。ランモジュールにわかりやすい名前を付け、「OK」を選

択します。

注：装置の感度は装置ごとに異なります。Module Manager でインジェクシ

ョン時間および電圧を調整できます。インジェクション時間およびインジ

ェクション電圧の推奨範囲はそれぞれ 3～22 秒および 1～3 kV です。

2. Protocol Manager で「New」を選択します。プロトコールの名前を入力しま

す。Type ドロップダウンリストで「Regular」を選択し、Run Module ドロ

ップダウンリストで、ステップ 1で作成したランモジュールを選択します。

最後に、Dye-Set ドロップダウンリストで「G5」を選択し、「OK」を選択

します。

3. 各装置のユーザーズマニュアルに記載されている方法により、Plate

Manager でプレートレコードを新規作成します。開いたダイアログボック

スの Application ドロップダウンリストで「GeneMapper-Generic」を選択し、

適切なプレートの種類（96-well）を選択します。オーナーおよびオペレー

タウィンドウにオーナーおよびオペレータの名前をそれぞれ入力し、「OK」

を選択します。

注：サンプルデータの自動解析をご希望の場合には、各装置のユーザーズ

マニュアルの記載をご覧ください。



4. GeneMapper プレートレコードで、対応するセルにサンプル名を入力しま

す。右にスクロールします。Results Group 1 カラムで、任意の Results Group

を選択します。Instrument Protocol 1 カラムで、ステップ 2 で作成したプロ

トコールを選択します。サンプル名を含む各列にこの情報が表示されてい

ることを確認してください。「OK」を選択します。

注：Results Group を新規作成するには、Results Group カラムのドロップダ

ウンメニューで「New」を選択します。General タブを選択し、名前を入力

します。Analysis を選択し、Analysis Type ドロップダウンリストで

「GeneMapper.Generic」を選択します。

5. 装置にサンプルをセットし、装置の扉を閉じます。

6. Spectral Viewer で Dye Set G5 を選択し、アクティブな Dye Set が PowerPlex®

5-dye ケミストリ用に作成したファイルであることを確認します。

PowerPlex® 5-dye ケミストリに適合する G5 スペクトルを選択することが

きわめて重要です。

PowerPlex® 5-dye ケミストリがアクティブな Dye Set になっていない場合

には、List of Calibrations for Dye Set G5 で PowerPlex® 5-dye spectral を指定

し、「Set」を選択します。

7. Run Scheduler で、ステップ 3 および 4 にて作成したプレートレコードを指

定し、名前を 1 回クリックして強調表示させます。

8. プレートレコードが強調表示されたら、増幅サンプルの入ったオートサン

プラー上のプレートに対応するプレート図をクリックします。

9. プレートレコードとプレートがリンクされたら、プレート図が黄色から緑

色に変わり、緑色の矢印ボタン「Run Instrument」をクリックできるように

なります。

10. ツールバー上の緑色の矢印ボタン「Run Instrument」をクリックし、サンプ

ルのランを開始します。

11. Data Collection ソフトウェアの Run、View、Array または Capillaries Viewer

ウィンドウを観察することにより、電気泳動をモニターします。各泳動の

所要時間は約 40 分です。

！



6. データの解析

6.A. GeneMapper® ID-X ソフトウェア Version 1.2 への PowerPlex® Fusion 用 Panel、Bin

および Stutter テキストファイルのインポート

PowerPlex® Fusion System で生成したデータの解析を容易にするため、プロメ

ガでは、GeneMapper®

ID-X ソフトウェアで遺伝子型の自動割り当てを可能とす

る Panel および Bin テキストファイルを作成しました。GeneMapper® ID-X ソフ

トウェアのユーザーには、ソフトウェアの正しい操作に習熟するため、Applied

Biosystems 提供のトレーニングを受けることを推奨します。

注：本セクションに示す Panel、Bin および Stutter テキストファイルは、旧バー

ジョンの GeneMapper® ID-X ソフトウェアと互換性を示します。

作業を開始する前に

1. PowerPlex® Fusion System 用 Panel、Bin および Stutter テキストファイルは、

以下のサイトから入手してください：


2. ご使用になる PowerPlex® System を選択します。「GeneMapper ID-X」を選

択し、ご使用になるコントロール DNA を選択します。連絡先を入力し、

「Submit」を選択します。

3. コンピュータ上の所定の場所に、PowerPlex_Fusion_Panels_IDX_vX.x.txt、

PowerPlex_Fusion_Bins_IDX_vX.x.txt および PowerPlex_Fusion_Stutter_IDX_vX.x.txt

ファイルを保存します（ただし、「X.x」は Panel、Bin および Stutter テキス

トファイルの最新バージョンを表します）。


44 データの解析

Panel、Bin および Stutter テキストファイルのインポート

1. GeneMapper® ID-X ソフトウェアを開きます。

2. 「Tools」→「Panel Manager」を選択します。

3. 左上のナビゲーションペインにある Panel Manager アイコンを強調表示さ

せます。

4. 「File」→「Import Panels」を選択します。

5. 「作業を開始する前に」セクションでインポートした Panel テキストファ

イルに移動します。ファイルを選択した後、「Import」を選択します。

6. ナビゲーションペインで、ステップ 5 でインポートした PowerPlex Fusion

用の Panel フォルダを強調表示させます。

7. 「File」→「Import Bin Set」を選択します。

8. 「作業を開始する前に」セクションでインポートした Bin テキストファイ

ルに移動します。ファイルを選択した後、「Import」を選択します。



10. 「File」→「Import Marker Stutter」を選択します。既存値に上書きするど

うかを尋ねる警告ボックスが現れます。「Yes」を選択します。

11. 「作業を開始する前に」セクションでインポートした Stutter テキストファ

イルに移動します。ファイルを選択した後、「Import」を選択します。

12. Panel Manager ウィンドウ下部にある「OK」を選択します。これにより

Panel、Bin および Stutter テキストファイルが保存されます。ウィンドウを

閉じます。



6.B. GeneMapper® ID-X ソフトウェア Version 1.2 への CC5 ILS 500 IDX サイズスタンダー

ドのインポート

サイズスタンダードの作成時には、2 つの方法があります。以下のプロトコ

ール、またはセクション 6.C に示すもう一つのプロトコールをご使用ください。

CC5_ILS_500_IDX.xml ファイルは以下のサイトからダウンロードできます：


コンピュータ上の所定の場所に、CC5_ILS_500_IDX.xml ファイルを保存しま

す。

1. 「Tools」→「GeneMapper ID-X Manager」を選択します。

2. Size Standard タブを選択します。

3. 「Import」を選択します。

4. コンピュータ上の CC5_ILS_500_IDX.xml ファイルの保存場所に移動しま

す。

5. ファイルを強調表示させた後、「Import」を選択します。

6. 「Done」を選択して変更を保存し、GeneMapper ID-X Manager を閉じます。



6.C. GeneMapper® ID-X ソフトウェア Version 1.2 でのサイズスタンダードの作成



3. 「New」を選択します。

4. Size Standard Editor ウィンドウ（図 12）において、Security Group とし

て「GeneMapper ID-X Security Group」を選択します。これにより、ソ

フトウェアの全ユーザーがアクセス可能となります。他の Security

Group を使用することもできます。

5. 「CC5_ILS_500_IDX」などの具体的な名前を入力します。

6. Size Standard Dye で「Orange」を選択します。

7. サイズスタンダードフラグメントのサイズ値（60、65、80、100、120、

140、160、180、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、

450、475 および 500 塩基長）を入力します。セクション 9.C の図 24


8. 「OK」を選択します。



図 12. GeneMapper® ID-X Size Standard Editor



6.D. GeneMapper® ID-Xソフトウェア Version 1.2での現場試料分析用の Analysis Method

の作成

以下の説明は、GeneMapper® ID-X ソフトウェアでデータ解析を始めるにあた

ってのガイドとして示します。GeneMapper® ID-X ソフトウェアのご使用に関す

る総合的ガイドとして示すものではありません。ソフトウェアのトレーニング

については、Applied Biosystems にお問い合わせになることを推奨します。


2. Analysis Methods タブを選択します。

3. 「New」を選択すると、「New Analysis Method」ダイアログボックスが開き

ます。

4. Analysis Method Editor ウィンドウにおいて、Security Group として

「GeneMapper ID-X Security Group」を選択します。ソフトウェアの全ユー

ザーがアクセス可能となります。他の Security Group を使用することもで

きます。

5. Analysis Method 名として、わかりやすい名前（「PowerPlex Fusion」など）

を入力します。

6. Allele タブを選択します（図 13）。

7. セクション 6.A でインポートした Bin テキストファイルを選択します。

8. 「Use marker-specific Stutter ratio and distance if available」ボックスにチェッ

クが入っていることを確認します。

9. PowerPlex® Fusion System をご使用になる場合には、スタッターピークを適

切にフィルタリングするため、図 13 に示す設定値を推奨します。これら

の設定値は適宜最適化する必要があります。研究室内でバリデーションを

実施する必要があります。



図 13. GeneMapper® ID-X Allele タブ




10. Peak Detector タブを選択します。図 14 に、プロメガで使用している設定

値の一例を示します。これらの設定値は適宜最適化する必要があります。

研究室内でバリデーションを実施する必要があります。

注 1：Range として、Full Range または Partial Range を選択します。Partial

Range を使用される場合には、データに基づき適切な Range を選択してく

ださい。サイズスタンダードの適切なサイジングを確保するため、Start

Point はプライマーピークより後、かつ最初のサイズスタンダードのピー

クより前の値に設定します。

注 2：peak amplitude threshold は、ソフトウェアがピークとみなすことので

きる最低のピーク高です。ABI PRISM® 3100 および 3100-Avant Genetic

Analyzer や、Applied Biosystems® 3130 および 3130xl Genetic Analyzer で作

成したデータの場合、peak amplitude threshold は通常 50～150 RFU です。

Applied Biosystems® 3500 および 3500xL Genetic Analyzers の場合、Life

Technologies は初期設定の泳動条件下での解析閾値を 175 RFU とすること

を推奨しています。しかし、研究室内のバリデーション試験に基づき、研

究室ごとに peak amplitude threshold を決定する必要があります。CC5 ILS

500 のピーク高は、他の色素のピーク高より低いのが通例です。したがっ

て、橙色色素の閾値は他の色素より適宜低値に設定します。

注 3：データ収集時に Normalization（標準化）を適用したか否かにかかわ

らず、Normalization ボックスにチェックを入れることができますが、

PowerPlex Fusion System で用いている ILS500 では、Normalization は機能し

ません。

11. Peak Quality タブを選択します。Peak Quality の設定を変更できます。

注：ステップ 11 および 12 の詳細については、GeneMapper® ID-X のユーザ

ーズマニュアルをご覧ください。

12. SQ & GQ Settings タブを選択します。これらの設定は変更することができ

ます。

13. 「Save」を選択し、新規の Analysis Method を保存します。

14. 「Done」を選択し、GeneMapper ID-X Manager を終了します。

前ページより



図 14. GeneMapper® ID-X ソフトウェアの Peak Detector タブ



現場試料のデータ処理

1. 「File」→「New Project」を選択します。

2. 「Edit」→「Add Samples to Project」を選択します。

3. ランファイルの場所を確認します。目的のファイルを強調表示した後、

「Add to list」→「Add」を選択します。

4. Sample Type カラムのドロップダウンメニューを用いて、各サンプルにつ

いて「Allelic Ladder」、「Sample」、「Positive Control」、「Negative Control」を

適宜選択します。適切な遺伝子型決定を行うためには、プロジェクトの全

フォルダに、アレリックラダー（Sample Type カラムで「Allelic Ladder」と

指定）が 1 個以上含まれている必要があります。

注：GeneMapper® ID-X Panel ファイルで定義されている DNA 陽性コント

ロールは 2800M Control DNA です。別の DNA 陽性コントロールをご使用

になる場合には、Panel ファイルで遺伝子型を定義し直してください。

5. Analysis Method カラムで、上記にて作成した Analysis Method を選択しま

す。

6. Panel カラムで、セクション 6.A でインポートした Panel テキストファイル


7. Size Standard カラムで、セクション 6.B でインポートしたかセクション 6.C

で作成したサイズ標準を選択します。

8. 「Analyze」（緑色の矢印ボタン）を選択し、データ解析を開始します。

注：初期設定では、ソフトウェアによる品質評価後、Analysis Requirement

Summary、Allelic Ladder Analysis Summary および Analysis Summary ウィン

ドウが表示されます。各ウィンドウが現れた際、すべての解析条件に適合

していることを確認します。Analysis Requirement Summary ウィンドウがア

クティブにならない場合には、手動で問題解決を適宜行う必要があります。

9. すべての解析条件に適合している場合には、Save Project ウィンドウが開き

ます（図 15）。



図 15. Save Project ウィンドウ

10. プロジェクト名を入力します。

11. ドロップダウンメニューから該当する Security Group を選択した後、「OK」


注：Penta E および DYS391 における 475 塩基以上のアレルのサイジングには、

Local Southern Method を使用しません。Penta E については、24 塩基を超えるア

レルは「OL」と標識されます。

解析が終了すると、Analysis Summary 画面が現れます。プロットビューでマ

ーカーのヘッダーバーが黄色または赤色に表示された場合には確認し、研究室

の標準操作手順書に従って対処することを推奨します。Genotype タブまたは

Samples タブに移動します。低品質サンプルの評価を支援するため、Data

Interpretation の Plot Setting の初期設定値を用い、Quality Value Details 表の内容

を確認します。

Analysis Method Peak Quality および SQ & GQ Settings タブに表示される値は

初期設定値であり、プロット設定で表示される Quality Value に影響を与えます。

研究室のデータ解析プロトコールに適合するよう、これらのタブに表示される

値を変更することを推奨します。



6.E. GeneMapper® ID-X ソフトウェア Version 1.2 でのデータベース登録または父性評価分

析用の Analysis Method の作成

以下の説明は、GeneMapper® ID-X ソフトウェアでデータ解析を始めるにあた

ってのガイドとして示します。GeneMapper® ID-X ソフトウェアのご使用に関す

る総合的ガイドとして示すものではありません。ソフトウェアのトレーニング

については、Applied Biosystems にお問い合わせになることを推奨します。




ます。

4. Analysis Method Editor ウィンドウにおいて、Security Group として

「GeneMapper ID-X Security Group」を選択します。ソフトウェアの全ユー

ザーがアクセス可能となります。他の Security Group を使用することもで

きます。

5. Analysis Method名として、わかりやすい名前（「PowerPlex Fusion 20% Filter」

など）を入力します。


7. セクション 6.A でインポートした Bin テキストファイルを選択します。


切にフィルタリングするため、図 16 に示す設定値を推奨します。これら

の設定値は適宜最適化する必要があります。研究室内でバリデーションを

実施する必要があります。

注：3、4および5塩基対のSTRマーカーの場合、Global Cut-off Valueに「0.20」

と入力することにより、Analysis Method に適切なフィルター（20%）をか

けてください。



図 16. GeneMapper® ID-X の Allele タブ




9. Peak Detector タブを選択します。図 14 に、プロメガで使用している設定

値の一例を示します。これらの設定値は適宜最適化する必要があります。

研究室内でバリデーションを実施する必要があります。







きる最低のピーク高です。ABI PRISM® 3100 および 3100-Avant Genetic

Analyzer や、Applied Biosystems® 3130 および 3130xl Genetic Analyzer の場

合、peak amplitude threshold は通常 50～150 RFU です。Applied Biosystems®

3500 および 3500xL Genetic Analyzers の場合、Life Technologies は初期設定

の泳動条件下での解析閾値を 175 RFU とすることを推奨しています。しか

し、研究室内のバリデーション試験に基づき、研究室ごとに peak amplitude

threshold を決定する必要があります。CC5 ILS 500 のピーク高は、他の色

素のピーク高より低いのが通例です。したがって、橙色色素の閾値は他の

色素より適宜低値に設定します。

注 3：データ収集時に Normalization（標準化）を適用したか否かにかかわ

らず、Normalization ボックスにチェックを入れることができます。


注：ステップ 10 および 11 の詳細については、GeneMapper® ID-X のユーザ


11. SQ & GQ Settings タブを選択します。これらの設定を変更することができ

ます。

12. 「Save」を選択し、新規の Analysis Method を保存します。

13. 「Done」を選択し、GeneMapper ID-X Manager を終了します。

前ページより



データベース登録または父性評価分析用サンプルのデータ処理






いて「Allelic Ladder」、「Sample」、「Positive Control」、「Negative Control」を

適宜選択します。適切な遺伝子型決定を行うためには、プロジェクトの全

フォルダに、アレリックラダー（Sample Type カラムで「Allelic Ladder」と

指定）が 1 個以上含まれている必要があります。

注：GeneMapper® ID-X Panel ファイルで定義されている DNA 陽性コント

ロールは 2800M Control DNA です。別の DNA 陽性コントロールをご使用

になる場合には、Panel ファイルで遺伝子型を定義し直してください。

Analysis Method カラムで、上記にて作成した Analysis Method を選択しま

す。

5. Panel カラムで、セクション 6.A でインポートした Panel テキストファイル


6. Size Standard カラムで、セクション 6.B でインポートしたかセクション 6.C

で作成したサイズ標準を選択します。


注：初期設定では、ソフトウェアによる品質評価後、Analysis Requirement

Summary、Allelic Ladder Analysis Summary および Analysis Summary ウィン

ドウが表示されます。各ウィンドウが現れた際、すべての解析条件に適合

していることを確認します。Analysis Requirement Summary ウィンドウがア

クティブにならない場合には、手動で問題解決を適宜行う必要がありま

す。




8. すべての解析条件に適合している場合には、Save Project ウィンドウが開き

ます（図 15）。

9. プロジェクト名を入力します。

10. ドロップダウンメニューから該当するSecurity Groupを選択した後、「OK」


注：475 塩基以上の Penta E および DYS391 アレルのサイジングには、Local

Southern Method は使用しません。Penta E については、24 塩基を超えるア

レルは「OL」と標識されます。

解析が終了すると、Analysis Summary 画面が現れます。プロットビューでマ

ーカーのヘッダーバーが黄色または赤色に表示された場合には確認し、研究室

の標準操作手順書に従って対処することを推奨します。Genotype タブまたは

Samples タブに移動します。低品質サンプルの評価を支援するため、Data

Interpretation の Plot Setting の初期設定値を用い、Quality Value Details 表の内容

を確認します。

Analysis Method Peak Quality および SQ & GQ Settings タブに表示される値は

初期設定値であり、プロット設定で表示される Quality Value に影響を与えます。

研究室のデータ解析プロトコールに適合するよう、これらのタブに表示される

値を変更することを推奨します。

前ページより



6.F. GeneMapper® ID ソフトウェア Version 3.2 への PowerPlex® Fusion 用 Panel および

Bin テキストファイルのインポート

PowerPlex® Fusion System で生成したデータの解析を容易にするため、プロメ

ガでは、GeneMapper®

ID ソフトウェア Version 3.2 で遺伝子型の自動割り当てを

可能とする Panelおよび Binテキストファイルを作成しました。GeneMapper® ID

ソフトウェア Version 3.2 のユーザーには、ソフトウェアの正しい操作に習熟す

るため、Applied Biosystems が提供する GeneMapper® ID Software Human

Identification Analysis Tutorial を一読されることを推奨します。GeneMapper® ID

ソフトウェア Version 3.1 のユーザーには、Version 3.2 へのアップグレードを推

奨します。

GeneMapper®

ID ソフトウェア Version 3.2 による解析には、適切な Panel およ

び Bin テキストファイル（ PowerPlex_Fusion_Panels_vX.x.txt および

PowerPlex_Fusion_Bins_vX.x.txt ファイル、ただし、「X.x」は Panel および Bin

テキストファイルの最新バージョンを表します）が必要です。

作業を開始する前に

1. PowerPlex® Fusion System 用 Panel および Bin テキストファイルは、以下の

サイトから入手してください：


2. ご使用になる PowerPlex® System を選択します。「GeneMapper ID」を選択

し、ご使用になるコントロール DNA を選択します。連絡先を入力し、

「Submit」を選択します。

3. コンピュータ上の所定の場所に、PowerPlex_Fusion_Panels_IDX_vX.x.txt お

よび PowerPlex_Fusion_Bins_IDX_vX.x.txt ファイルを保存します（ただし、

「X.x」は Panel および Bin テキストファイルの最新バージョンを表しま

す）。



Panel および Bin テキストファイルのインポート

以下の説明は、Applied Biosystems GeneMapper® ID ソフトウェアの Tutorial（1

～4 ページ）の記述とほぼ同様です。

1. GeneMapper® ID ソフトウェア Version 3.2 を開きます。

2. 「Tools」→「Panel Manager」を選択します。

3. 左上のナビゲーションペインにある Panel Manager アイコンを強調表示さ

せます。

4. 「File」→「Import Panels」を選択します。

5. 上記の「作業を開始する前に」セクションでインポートした Panel テキス

トファイルに移動します。ファイルを選択した後、「Import」を選択します。



7. 「File」→「Import Bin Set」を選択します。

8. 上記の「作業を開始する前に」セクションでインポートした Bin テキスト

ファイルに移動します。ファイルを選択した後、「Import」を選択します。

9. Panel Manager ウィンドウ下部にある「OK」を選択します。Panel Manager

ウィンドウが自動的に閉じます。



6.G. GeneMapper® ID ソフトウェア Version 3.2 への CC5 ILS 500 IDX サイズ標準のインポ

ート

サイズスタンダードの作成時には、2 つの方法があります。以下のプロトコ

ール、またはセクション 6.H に示すもう一つのプロトコールをご使用ください。

CC5_ILS_500.xml ファイルは以下のサイトからダウンロードできます：


コンピュータ上の所定の場所に、CC5_ILS_500.xml ファイルを保存します。

1. 「Tools」→「GeneMapper Manager」を選択します。


3. 「Import」を選択します。

4. CC5_ILS_500.xml ファイルの場所を確認します。

5. ファイルを強調表示させた後、「Import」を選択します。

6. 「Done」を選択して変更を保存し、GeneMapper Manager を閉じます。



6.H. GeneMapper® ID ソフトウェア Version 3.2 でのサイズスタンダードの作成



3. 「New」を選択します。

4. 「Basic or Advanced」を選択します（図 17）。選択した Analysis Method の

種類は、以前作成した Analysis Method の種類と一致する必要があります。

「OK」を選択します。

図 17. Select Dye and Analysis Method ウィンドウ

5. Size Standard Editor ウィンドウで「CC5 ILS 60 to 500」などの具体的な名前

を入力します（図 18）。

6. Size Standard Dye で「Orange」を選択します。

7. サイズスタンダードフラグメントのサイズ値（60、65、80、100、120、140、

160、180、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、

475 および 500 塩基長）を入力します。セクション 9.C の図 24 をご覧くだ

さい。

8. 「OK」を選択します。



図 18. Size Standard Editor



6.I. GeneMapper® ID ソフトウェア Version 3.2 での現場試料分析用の Analysis Method の

作成

以下の説明は、Applied Biosystems GeneMapper® ID ソフトウェアの Tutorial（5

～11 ページ）の記述とほぼ同様です。




ます。

4. 「HID」→「OK」を選択します。

注：HID オプションが現れない場合には、GeneMapper® ID ソフトウェアが

インストールされていません。Applied Biosystems にお問い合わせください。

5. Analysis Method 名としてわかりやすい名前（「PowerPlex Fusion」など）を

入力します。


7. セクション 6.F でインポートした Bin テキストファイルを選択します。

8. 「Use marker-specific Stutter ratio if available」ボックスにチェックが入って

いることを確認します。


切にフィルタリングするため、図 19 に示す設定値を入力します。これら

の設定値の適切な使用法および影響に関する説明は、Applied Biosystems

のユーザーブリテン「 Installation Procedures and New Features for

GeneMapper ID Software 3.2」をご覧ください。

注：これらの設定値の一部は最適化されており、ユーザーブリテンで推奨

されている設定値とは異なります。



図 19. The GeneMapper® ID ソフトウェアの Allele タブ




10. Peak Detector タブを選択します。プロメガでは、図 20 に示す設定値を推

奨します。







きる最低のピーク高です。peak amplitude threshold は通常 50～150 RFU で

すが、研究室ごとに決定する必要があります。CC5 ILS 500 のピーク高は、

他の色素のピーク高より低いのが通例です。したがって、橙色色素の閾値

は他の色素より適宜低値に設定します。

図 20. GeneMapper® ID ソフトウェアの Peak Detector タブ

前ページより




注：ステップ 11 および 12 の詳細については、GeneMapper® ID のユーザー

ズマニュアルをご覧ください。

12. Quality Flags タグを選択します。これらの設定は変更することができます。

13. 「OK」を選択し、設定を保存します。



現場試料のデータ処理






いて「Ladder」、「Sample」、「Positive Control」、「Negative Control」を適宜選

択します。適切な遺伝子型決定を行うためには、プロジェクトの全フォル

ダに、アレリックラダー（Sample Type カラムで「Ladder」と指定）が 1

個以上含まれている必要があります。

注：GeneMapper® ID Panel ファイルで定義されている DNA 陽性コントロ

ールは 2800M Control DNA です。別の DNA 陽性コントロールをご使用に

なる場合には、Panel ファイルで遺伝子型を定義し直してください。


す。

6. Panel カラムで、セクション 6.F でインポートした Panel テキストファイル


7. Size Standard カラムで、セクション 6.G でインポートしたかセクション 6.H

で作成したサイズスタンダードを選択します。



Southern Method は使用されません。Penta E については、24 塩基を超える

アレルは「OL」と標識されます。



6.J. GeneMapper® ID ソフトウェア Version 3.2 でのデータベース登録または父性評価分析

用の Analysis Method の作成




ます。

4. 「HID」→「OK」を選択します。

注：HID オプションが現れない場合、GeneMapper® ID ソフトウェアがイン

ストールされていません。Applied Biosystems にお問い合わせください。

5. Analysis Method名としてわかりやすい名前（「PowerPlex_Fusion_20%filter」

など）を入力します。


7. セクション 6.F でインポートした Bin テキストファイルを選択します。

8. 「Use marker-specific Stutter ratio if available」ボックスにチェックが入って

いることを確認します。


切にフィルタリングするため、図 21 に示す設定値を入力します。これら

の設定値の適切な使用法および影響に関する説明は、Applied Biosystems

のユーザーブリテン「 Installation Procedures and New Features for

GeneMapper ID Software 3.2」をご覧ください。

注：3、4および5塩基対のSTRマーカーの場合、Global Cut-off Valueに「0.20」

と入力することにより、Analysis Method に適切なフィルター（20%）をか

けてください。



図 21. ピークフィルターを 20%に設定した GeneMapper® ID ソフトウェアの Allele タブ




10. Peak Detector タブを選択します。図 20 に示す設定値を推奨します。







きる最低のピーク高です。peak amplitude threshold は通常 50～150 RFU で

すが、研究室ごとに決定する必要があります。CC5 ILS 500 のピーク高は、

他の色素のピーク高より低いのが通例です。したがって、橙色色素の閾値

は他の色素より適宜低値に設定します。


注：ステップ 11 および 12 の詳細については、GeneMapper® ID のユーザ


12. Quality Flags タグを選択します。これらの設定は変更することができます。

13. 「OK」を選択し、設定を保存します。

前ページより



データベース登録または父性評価分析用サンプルのデータ処理






いて「Ladder」、「Sample」、「Positive Control」、「Negative Control」を適宜選

択します。適切な遺伝子型決定を行うためには、プロジェクトの全フォル

ダに、アレリックラダー（Sample Type カラムで「Ladder」と指定）が 1

個以上含まれている必要があります。

注：GeneMapper® ID Panel ファイルで定義されている DNA 陽性コントロ

ールは 2800M Control DNA です。別の DNA 陽性コントロールをご使用に

なる場合には、Panel ファイルで遺伝子型を定義し直してください。


す。

6. Panel カラムで、セクション 6.F.でインポートした Panel テキストファイル


7. Size Standard カラムで、セクション 6.G でインポートしたかセクション 6.H

で作成したサイズスタンダードを選択します。



Southern Method は使用されないことがあります。Penta E については、24

塩基を超えるアレルは「OL」と標識されることがあります。



6.K. コントロール

1. 陰性コントロールの結果を確認します。本マニュアルで定義したプロトコ

ールを使用する場合、陰性コントロールには増幅産物は存在しないはずで

す。

2. 2800M Control DNA の結果を確認します。2800M DNA アレルの反復サイ

ズを、ローカス特異的なアレリックラダーと比較します。2800M DNA を

使用した場合に予想される各ローカスのアレル位置を表 6 に示します（セ

クション 9.A）。



6.L. 結果

PowerPlex® Fusion System の代表的な結果を図 22 に示します。PowerPlex

®

Fusion Allelic Ladder Mix を図 23 に示します。

アーティファクトおよびスタッター

スタッター産物は、STR 解析で一般に認められる増幅アーティファクトで

す。スタッター産物は、真のアレルピークよりも反復単位が 1 つ少ないことが

多く、真のアレルピークよりも反復単位が 2 つ小さい場合や 1 つ大きい場合も

あります。反復単位が大きいアレルほど、高いスタター比率をしめす傾向にあ

ります。D22S1045 のようなトリヌクレオチドの STR ローカスは、典型的なテ

トラヌクレオチドの STR ローカスと比較して、n-3 位置および n+3 位置の両方

でスタッターの形成比率が高い傾向にあります。各ローカスで生じるスタッタ

ーのパターンおよび強度は、プライマーセット間でわずかに異なります。

GeneMapper® ID ソフトウェア Version 3.2 用の PowerPlex

® Fusion Panel テキス

トファイル、GeneMapper® ID-X ソフトウェア用の PowerPlex

® Fusion Stutter テ

キストファイルでは、ローカス特異的なフィルタリングとして、ローカスごと

の平均値に標準偏差の 3 倍を加えた値を用いています。

PowerPlex® Fusion System の一部のローカスでは、スタッターピーク以外のア

ーティファクトピークが出現する場合があります。一部のローカス（D1S1656、

D13S317、D18S51、D21S11、D7S820、D5S818、D12S391、D19S433 など）で、

n-2 位置および n+2 位置に低レベルの産物がみられる可能性があります。アメ

ロゲニンおよび D2S441 で、n-1 ピークが出現することがあります。また、

D12S391 で、n-3 ピークが出現することがあります。テンプレートおよび非テ

ンプレートサンプルでは、フルオレセインチャンネルに 64～65、69～71 およ

び 88～90 塩基長、JOE チャンネルに 74～76 塩基長の増幅非依存性のアーティ

ファクトが出現する場合があります。ローカス Panel で定義された範囲外にア

ーティファクトピークが出現する場合があります（フルオレセインチャンネル

では 70～74 塩基、TMR-ET チャンネルでは 66～68 塩基、CXR-ET チャンネル

では 58～65 塩基）。ローカス Panel で定義された範囲内にアーティファクトピ

ークが出現する場合もあります［D16S539 では allele 5（84 塩基）、TH01 では

71～73 塩基および 75～77 塩基、D18S51 では 214 塩基、D2S1338 では 247 塩基

のピーク］。これらのアーティファクトは通常、一般的な検出閾値を下回りま

す。




PowerPlex® Fusion System は、POP-4

®ポリマー用に最適化されており、POP-7

ポリマー用には開発されていません。POP-7™ポリマーを使用される場合には、

最適化および研究室内でのバリデーションが必要です。PowerPlex® Fusion

System を POP-7™ポリマーとともに使用すると、特有の DNA 非依存性アーテ

ィチファクトが出現するとの報告があります。データベース解析用のグローバ

ルフィルタを使用すれば、通常これらのアーティファクトピークはフィルタリ

ングされます。アーティファクトピークは、フルオレセインチャンネルでは、

74～76 塩基、85～87 塩基、99～101 塩基に出現する場合があります。JOE チャ

ンネルでは、アーティファクトが 88～90 塩基に出現する場合があります。JOE

チャンネルに出現するアーティファクトのシグナル強度は、増幅プレートを

4℃で保存した場合（一般に 4℃で数日間保存した場合）に増強します。増幅産

物は-20℃で保存することを推奨します。

前ページより



図22. P

ow

erP

lex®

Fusi

on S

yste

m 男性

1名由来のテンプレート

DN

A（

0.5

ng）を、

Pow

erP

lex

® F

usi

on

Syst

emを使用して

30サイクル増幅しました。増幅産物を

CC

5 I

nte

rnal

Lan

e S

tand

ard 5

00と混和し、

Appli

ed

Bio

syst

ems®

31

30

Gen

etic

A

nal

yze

rを使用して、インジェクション電圧

3 k

V、インジェクション時間

5秒で解析しました。結果を

Gen

eMap

per

® I

Dソフトウェア

Ver

sion 3

.2で解析しました。パネル

A. フルオレセイン標識ローカス（アメロゲニン、

D3

S135

8、

D1

S1

656、

D2

S44

1、

D10

S1

248、

D13

S3

17お

よび

Pen

ta E）のピークを示す電気泳動図

パネル

B. JO

E標識ローカス（

D16

S53

9、

D1

8S

51、

D2

S1

338、

CS

F1

POおよび

Pen

ta D）のピークを示す電気泳動図

パネル

C.

TM

R-E

T

標識ローカス（

TH

01、

vW

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D2

1S

11、

D7

S820、

D5

S818、

TP

OXおよび

DY

S3

91）のピークを示す電気泳動図

パネル

D. C

XR

-ET標識ローカス（

D8

S1179、

D1

2S

39

1、

D19

S4

33、

FG

Aおよび

D2

2S

10

45）のピークを示す電気泳動図

パネル

E. C

C5 I

nte

rnal

Lan

e S

tand

ard 5

00の

60～

50

0bpフラグメントを示す電気泳動図



図23. P

ow

erP

lex®

Fusi

on A

llelic

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ix

Pow

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lex

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All

elic

Lad

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Ap

pli

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iosy

stem

s® 3

130

Gen

etic

An

alyze

rを使用して、インジェクション電圧

3 k

V、インジ

ェクション時間

3秒で解析しました。

Gen

eMap

per

® I

Dソフトウェア

Ver

sion

3.2と、

Pow

erP

lex

® F

usi

onの

Pan

elおよび

Binテキストファイルを用いて、サンプルファイルを解析し

ました。パネル

A. フルオレセイン標識アレリックラダーの構成とアレルコールパネル

B.

JOE標識アレリックラダーの構成とアレルコールパネル

C. T

MR

-ET標識アレ

リックラダーの構成とアレルコール

パネル

D. C

XR

-ET標識アレリックラダーの構成とアレルコール


80 トラブルシューティング

7. トラブルシューティング

ここに記載のない疑問点については、プロメガテクニカルサービスまでお問い合わせください。

お問い合わせ先は www.promega.com をご覧ください。

プロメガテクニカルサービス E-Mail: [email protected]

7.A. 増幅およびフラグメントの検出

本セクションには、増幅および検出全般に関する情報を示します。抽出 DNA の増幅に関する疑

問点は、セクション 7.B をご覧ください。直接増幅に関する疑問点は、セクション 7.C および 7.D


トラブルの症状原因およびコメント

アレルピークが微弱、またはまったく認

められない

PowerPlex® Fusion 5X Master Mix の使用前のボルテックスが不

十分であった。

5×Master Mix は、PCR 増幅反応液への分注前に 15 秒間ボルテ

ックスしてください。

反応チューブの底に気泡が発生した。

ピペットで気泡を除くか、サーマルサイクリング前に反応液を

短時間遠心してください。

サーマルサイクラー、プレートまたはチューブの問題。

セクション 4 のサーマルサイクリングプロトコールを再度ご確

認ください。プロトコールに記載されていない反応チューブ、

プレートやサーマルサイクラーについては、プロメガでは試験

を行なっておりません。必要に応じて、サーマルサイクラーの

ヒーティングブロックのキャリブレーションを行ってくださ

い。

プライマー濃度が低すぎた。

推奨するプライマー濃度を使用してください。PowerPlex®

Fusion 5×Primer Pair Mix は使用前に 15 秒間ボルテックスして

ください。

キャピラリー電気泳動のインジェクションが不良（CC5 ILS 500

のピークにも影響が及んでいる）。

サンプルを再インジェクションしてください。シリンジポンプ

システムに液漏れがないか確認してください。レーザーの出力

を確認してください。

サンプルの変性が不完全であった。

キャピラリー電気泳動の直前に、推奨時間どおりにサンプルを

熱変性処理した後、氷浴または氷水浴に移して冷却してくださ

い。DNA の再アニーリングによりアーティファクトが生じるお

それがあるため、4℃に設定したサーマルサイクラー内でサンプ

ルを冷却しないでください。





められない（続き）

品質の低いホルムアミドを使用した。

サンプルの解析には、Hi-Di™ホルムアミドのみを使用してくだ

さい。

1 つまたはすべてのカラーチャンネルに

おいて余計なピークが検出される

他のテンプレート DNA や過去に増幅した DNA が混入してい

た。

クロスコンタミネーションが問題となる場合があります。エア

ロゾールバリアーピペットチップを使用し、手袋は定期的に交

換してください。

サンプルの変性が不完全であった。

キャピラリーへのローディング直前に、推奨時間どおりにサン

プルを熱変性処理した後、氷浴または氷水浴に移して冷却して

ください。

キャピラリー電気泳動中、二本鎖 DNA は一本鎖 DNA より速く

移動します。主要ピークの前に「シャドー」ピークが出現する

こと（特にヘテロ接合体においてシャドーピークが主要ピーク

と等距離で分離される場合）は、不完全な変性処理またはイン

ジェクション後の再アニーリングによる二本鎖 DNA の存在を

意味する可能性があります。

STR 増幅のアーティファクト。

STR 増幅によるアーティファクトとして、3’末端の A 残基の不

完全な付加により、アレルより 1 塩基小さいピークが出現する

可能性があります。サーマルサイクリングの後、60℃で伸長ス

テップ（精製 DNA サンプルの場合、10 分間）を実行してくだ

さい（セクション 4）。

キャピラリー電気泳動（CE）に関係するアーティファクト（「ス

パイク」）

電圧がわずかに変化したり、尿素の結晶がレーザーを通過した

りすると、「スパイク」や予期せぬピークが現われることがあり

ます。スパイクは 1 つの色素で現われることもありますが、多

くの場合は 2 つ以上の色素で現われるので、容易に検出するこ

とができます。サンプルを再インジェクションして確認してく

ださい。

誤った G5 スペクトルがアクティブになっていた。

サンプルを再泳動し、G5 が PowerPlex® 5-dye G5 スペクトルに

設定されていることを確認してください。装置の準備に関する

説明は、セクション 5 をご覧ください。

プルアップピーク高が高すぎる場合や、サンプルに不正確また

は不適切なマトリックスを適用した場合にはプルアップが生じ

ることがあります。

新たなスペクトルキャリブレーションを実行し、サンプル

を再泳動してください。

装置によって感度が異なる可能性があります。インジェク

ション条件を最適化してください。セクション 5 をご覧く

ださい。





おいて余計なピークが検出される（続

き）

CE に関係するアーティファクト（汚染物質）。

装置で使用する水、あるいは 10×Genetic Analyzer Buffer の希釈

に使用する水に汚染物質があると、フルオレセインおよび JOE

チャンネルにピークが出現することがあります。オートクレー

ブ済みの脱イオン水（または超純水など、きれいな水）を使用

し、バイアルを交換して、バッファーリザーバーを洗浄してく

ださい。

ホルムアミドでサンプルを用時調製してください。ホルムアミ

ド中で増幅サンプルを長期間保存すると、分解する可能性があ

ります。

CE ポリマーが使用期限をすぎていたか、1 週間以上室温で保存

された。

製造者の推奨どおり、1 日 1 回または週 1 回、装置を保守点検

してください。

POP-7™に関係するアーティファクト。

本製品は POP-7 ポリマー用に開発されていません。POP-7™ポ

リマーを使用する場合には、最適化および研究室内でのバリデ

ーションが必要です。POP-7™ CE ポリマーを使用すると、移動

およびアーティファクトのサイズ位置が、POP-4®ポリマー使用

時と比較して変化する可能性があります。POP-7™ポリマーを使

用すると、JOE チャンネルでは 88～90 bp、フルオレセインチャ

ンネルで 74～76 bp、85～87 bp、99～101bp にアーティファクト

が出現する場合があります。

アレリックラダーが、サンプルと同様に

泳動されない

アレリックラダーと Primer Pair Mix が不適合。

アレリックラダーが Primer Pair Mix と同じキットに添付されて

いたものであることを確認してください。

品質の低いホルムアミドを使用した。

サンプル解析時には、Hi-Di™ホルムアミドのみを使用してくだ

さい。

アレリックラダーとサンプルが同じランで泳動されたことを確

認してください。

多数のサンプルを泳動すると、キャピラリー電気泳動（CE）中

にサンプルの移動がわずかに変動することがあります。このよ

うな変動は、時間経過に伴う温度または CE カラムの変化に起

因すると考えられます。別途インジェクションしたアレリック

ラダーを使用して、サイズを決定してください。

アレリックラダーのインジェクションが不十分であった。

1 回のランにつきアレリックラダーを 2 回以上インジェクショ

ンしてください。

サイズスタンダードのサイズが正しく指定されなかった。

CC5 ILS 500 のサイズ表示を確認し、必要に応じて訂正してくだ

さい。

ピーク高が不均衡反応液量が少なすぎた。

本製品は、DNA サンプル中に存在する阻害物質の影響をなくす

ため、最終反応液量 25 µl に最適化されています。反応液量がこ

れより少ないと、十分な性能が得られない可能性があります。



7.B. 抽出 DNA の増幅

以下の情報は、抽出 DNA の増幅に関するものです。増幅および検出全般に関する情報は、セク

ション 7.A をご覧ください。



められない

テンプレート DNA が不純物を含有する。

使用するテンプレート DNA はごく微量なので、このような不純

物が問題となることは非常にまれです。用いる DNA 抽出法およ

びサンプルソースによっては、DNA サンプル中に阻害物質が混

入することがあります。

テンプレート DNA 量が不十分。

可能な場合、推奨量のテンプレート DNA を使用してください。

塩濃度が高い、または pH が変化している。

pH が 8.0 でないか EDTA 濃度が高い TE バッファー中で DNA テ

ンプレートを保存する場合、DNA 量は、反応液の総量の 20％以

下とする必要があります。DNA サンプルからの K+、Na+、Mg2+、

または EDTA のキャリーオーバーは、PCR に悪影響を及ぼす可能

性があります。pHの変化もPCRに影響することがあります。DNA

は、TE-4バッファー（10 mM Tris-HCl［pH 8.0］、0.1 mM EDTA）

または 20 μg/ml グリコーゲンを添加した TE-4バッファー中で保

存してください。

反応液量が少なすぎた。

本製品は最終反応液量 25 µl に最適化されています。反応液量が

これより少ないと、十分な性能が得られない可能性があります。




増幅に用いる精製 DNA 量が多すぎると、アーティファクトピー

クが増加する可能性があります。推奨量のテンプレート DNA を

使用してください。スタッターおよびアーティファクトに関する

その他の情報は、セクション 6.L をご覧ください。

ピーク高が不均衡 DNA 量が多すぎた。

0.5 ng を超える量のテンプレートを増幅すると、不均衡が起こり、

小さなローカスは大きなローカスより多くの PCR 産物を生じま

す。サイクル数を減らしてください。


ピーク高が不均衡（続き）何らかのバランスの問題。

使用前に 5×Primer Pair Mix および 5×Master Mix を完全に解凍

し、15 秒間ボルテックスします。5×Master Mix の解凍には、5

×Primer Pair Mix の解凍より時間がかかることにご注意くださ

い。混和後は、5×Primer Pair Mix および 5×Master Mix を遠心

しないでください。サーマルサイクラーおよびピペットは定期

的にキャリブレーションしてください。

セクション 4 で調製した PCR 増幅反応液の混和が不十分であっ

た。

PCR 増幅反応液は反応チューブまたはプレートへの分注前に 5

～10 秒間ボルテックスしてください。




ピーク高が不均衡（続き） DNA サンプルが分解していた。

DNA サンプルが分解していると、大きなローカスの増幅量が減

少し、ピーク高が低下します。

テンプレート DNA 量が不十分。

可能な場合、推奨量のテンプレート DNA を使用してください。

増幅するテンプレートが少ないと、確率論的な影響(Stochastic

effect)が発生する可能性があります。

テンプレート DNA に不純物が含有していた。

法医学的サンプル中に阻害物質が存在すると、アレルドロップア

ウトまたは不均衡を生じる可能性があります。



7.C. 保存カードパンチを用いた DNA の直接増幅

以下の情報は、保存カードパンチを用いた DNA の直接増幅に関するものです。増幅および検出

全般に関する情報は、セクション 7.A をご覧ください。



められない


本製品は、FTA®カードおよび DNA サンプル中に存在する阻害

物質の影響をなくすため、最終反応液量 25 µl に最適化されてい

ます。反応液量がこれより少ないと、十分な性能が得られない

可能性があります。

保存カードにサンプルを移す際の手順の不良、あるいは保存カ

ードからのサンプリングのばらつき。

カードの別の部分からパンチをくり抜いてください。サイクル

数を増やすことにより、低いピーク高を改善できます。

カードが溶解しておらず、DNA が遊離されなかった。

FTA 以外のカードを使用する場合には、DNA を細胞タンパク質

から遊離させるため、PunchSolution™ Reagent で前処理してくだ

さい。

反応に用いたサンプル量が多すぎた。

保存カードパンチ（1.2 mm 径）1 または 2 枚を使用してくださ

い。サンプルを保存カードに保存する際には、製造者の推奨に

従ってください。FTA®カードをご使用の場合、反応液量を 25 µl

未満に減らすと、十分に増幅されない可能性があります。

陽性コントロールが増幅されなかった。

陽性コントロール反応に、ブランクパンチを添加しないでくだ

さい。ブランクパンチを添加すると、2800M Control DNA の増

幅が阻害される可能性があります。



パンチが汚染されている可能性がある。

サンプルとサンプルの間で、ブランクペーパーからくり抜いた

パンチを用いてください。


20 ng を超える量のテンプレートを直接増幅すると、アーティフ

ァクトピークが増加する可能性があります。推奨されるサイズ

および数のパンチを使用してください。スタッターおよびアー

ティファクトに関するその他の情報は、セクション 6.L をご覧

ください。


STR の増幅によるアーティファクトとして、3’末端の A 残基の

不完全な付加により、アレルより 1 塩基小さいピークが出現す

る可能性があります。

サーマルサイクリング後の伸長ステップを 60℃、20 分の

条件で実施してください（セクション 4.B）。

サイクル数を減らしてください。

最終伸長ステップの時間を延長してください。




ピーク高が不均衡 DNA 量が多すぎた。

20 ng を超える量のテンプレートを増幅すると、不均衡が起こ

り、小さなローカスは、大きなローカスより多くの PCR 産物を

生じます。

口腔内サンプルを含む保存カードパンチ（1.2 mm 径）1 ま

たは 2 枚、あるいは全血を含む保存カードパンチ（1.2 mm

径）1 枚を使用してください。

サンプルをカードに保存する際には、製造者の推奨に従っ

てください。



本製品は、FTA®カードおよび PunchSolution™ Reagent 中に存在

する阻害物質の影響をなくすため、最終反応液量 25 µl に最適化

されています。反応液量がこれより少ないと、十分な性能が得

られない可能性があります。

血液を採取した保存カードパンチを 2 枚以上使用したとき、増

幅が阻害された。

血液を採取した保存カードをご使用の場合には、パンチ（1.2 mm

径）を 1 枚のみ使用してください。


小さなローカスが選択的に増幅され、大きなローカスがドロッ

プアウトする可能性があります。FTA 以外のカードを使用する

場合には、DNA を細胞タンパク質から遊離させるため、

PunchSolution™ Reagent で前処理してください。



7.D. スワブを用いた DNA の直接増幅

以下の情報は、SwabSolution™ Kit による前処理後のスワブを用いた DNA の直接増幅に関する

ものです。増幅および検出全般に関する情報は、セクション 7.A をご覧ください。



められない

サンプル採取が不十分であった。ドナー細胞の採取にばらつき

があった。

サイクル数を増やしてください。

SwabSolution™ Reagent が不活性であった。

SwabSolution™ Reagent は 37℃の恒温槽で完全に解凍した後、穏

やかに転倒混和します。SwabSolution™ Reagent は 2～10℃で保

存してください。冷蔵庫の扉は温度が変動しやすいため、試薬

の保存に使用しないでください。再凍結させないでください。

凍結融解を繰り返すと活性が低下するため、凍結融解を繰り返

さないでください。

活性のある SwabSolution™ Reagent が増幅反応液にキャリーオ

ーバーされた。

ヒートブロックを 70℃に加熱し（2.2 ml の Square-Well Deep Well

Plate を使用される場合には、90℃）、サンプルを 30 分間インキ

ュベーションしてください。インキュベーション時間がこれよ

り短いと、試薬が完全に不活性化されない可能性があります。

チューブまたはプレートのインキュベーションには、70℃に設

定したインキュベーターを使用しないでください。熱伝導が不

十分であるため、十分な性能が得られない可能性があります。

効率的な熱伝導を確保するため、必ずヒートブロックを使用し

てください。プロメガで、60 分間のインキュベーション時間を

試験したところ、30 分間インキュベーションした条件と性能に

差はみられませんでした。


FTA 以外のカードを使用する場合には、DNA を細胞タンパク質

から遊離させるため、SwabSolution™ Reagent で前処理してくだ

さい。

陽性コントロール反応のピークが微弱、

またはまったく認められない

陽性コントロール反応液が増幅されなかった場合には、適正量

の 2800M Control DNA が反応液に添加されたことを確認してく

ださい。スワブ抽出液を用いる場合にはサイクル数が少ないた

め、2800M Control DNA 量を増やす必要があります。増幅反応

液 25 µl あたりの 2800M Control DNA 量を 10 ng とすることを推

奨します。サイクル数を増加させる場合には、2800M Control

DNA 量を減らし、サイクル数を減少させる場合には、2800M

Control DNA 量を増加させる必要があります。1 サイクル減少ま

たは増加につき、2800M Control DNA 量を 2 倍増減させてくだ

さい。

2800M Control DNA の保存状態が不適切であった。



スワブ抽出液が汚染されていた。

ブランクスワブから調製したスワブ抽出液を用いた反応混合液

を用意するか、スワブなしのブランクとして、スワブ無添加で

処理・インキュベーションした SwabSolution™ Reagent を用いた

反応混合液を用意してください。





おいて余計なピークが検出される（続

き）


DNA 濃度の高いスワブ抽出液を増幅すると、増幅過剰によるア

ーティファクトピークが発生し、電気泳動（CE）装置のシグナ

ルが飽和する可能性があります。反応液 25 µl あたりのスワブ抽

出液の添加量を 2 µl とすることを推奨します。反応液 25 µl あた

りのスワブ抽出液量が 2 µl を超える場合や、スワブ抽出液量が

2 µl でも反応液量が 25 µl 未満の場合には、増幅過剰およびシグ

ナルの飽和が生じる可能性があります。シグナルが飽和した場

合には、スワブ抽出液の添加量またはサイクル数を減らした条

件で再度増幅を行ってください。


STR の増幅によるアーティファクトとして、3’末端の A 残基の

不完全な付加により、アレルより 1 塩基小さいピークが出現す

る可能性があります。

サーマルサイクリング後の伸長ステップを 60℃、20 分の

条件で実施してください（セクション 4.C）。

PowerPlex® Fusion 反応液 25 µl あたりのスワブ抽出液量を

2 µl としてください。2 µl を超えるスワブ抽出液中には推

奨量を超える DNA テンプレートが含まれるため、アデニ

ン付加が不完全になる可能性があります。


最終伸長ステップの時間を延長してください。

ピーク高が不均衡増幅反応に用いる DNA 量が多すぎると、1 つの色素チャンネル

内でローカス間に不均衡が引き起こされ、小さなローカスのピ

ーク高が大きなローカスと比べて高くなることがあります

（ski-slope effect）。スワブ抽出液の使用量を減らすか、サイクル

数を減らしてください。

活性のある SwabSolution™ Reagent が、スワブ抽出液から増幅反

応液にキャリーオーバーされた。

試薬のキャリーオーバーの影響を特に受けやすいのは大きいロ

ーカスであり、小さなローカスより前にドロップアウトが生じ

ます。ヒートブロックを 70℃に加熱し（2.2 ml の Square-Well

Deep Well Plate を使用される場合には、90℃）、サンプルを 30

分間インキュベーションしてください。インキュベーション時

間がこれより短いと、試薬が完全に不活性化されない可能性が

あります。チューブまたはプレートのインキュベーションには、

70℃に設定したインキュベーターを使用しないでください。熱

伝導が不十分であるため、十分な性能が得られない可能性があ

ります。効率的な熱伝導を確保するため、必ずヒートブロック

を使用してください。

SwabSolution™ Reagent が不活性であった。

SwabSolution™ Reagent は 37℃の恒温槽で完全に解凍した後、穏

やかに転倒混和します。SwabSolution™ Reagent は 2～10℃で保

存してください。冷蔵庫の扉は温度が変動しやすいため、試薬

の保存に使用しないでください。再凍結させないでください。

凍結融解を繰り返すと活性が低下するため、凍結融解を繰り返

さないでください。


小さなローカスが選択的に増幅され、大きなローカスがドロッ

プアウトする可能性があります。FTA 以外のカードを使用する

場合には、DNA を細胞タンパク質から遊離させるため、

PunchSolution™ Reagent で前処理してください。



7.E. GeneMapper® ID-X ソフトウェア


スタッターピークがフィルタリングさ

れない

Panel Manager に Panel および Bin テキストファイルをインポー

トした際、Stutter テキストファイルがインポートされなかった。

「Use marker-specific stutter ratio and distance if available」ボック

スにチェックが入っていることを確認してください。

Analysis Method の Allele タブでスタッターの距離が定義されて

いなかった。

プロジェクトのサンプルが解析されな

い

Analysis Requirement Summaryウィンドウがアクティブになって

おらず、適合していない解析条件があった。

Options メニューで Analysis Requirement Summary を表示させ、

解析続行のため、必要な解析条件を訂正します。

Label Edit Viewer の Edit を表示できない

プロジェクト用に作成した Edit を表示させるためには、最初に

プロジェクトを保存する必要があります。プロットビューウィ

ンドウを閉じた後、GeneMapper® ID-X のメインページに戻り、

プロジェクトを保存してください。再びプロットウィンドウを

表示させ、Label Edit テーブルを表示させます。

一部のローカスについてマーカーのヘ

ッダーバーが灰色で表示される

各ローカスの Edit を作成すると、Quality Flag およびマーカーの

ヘッダーバーが自動的に灰色に変化します。各ローカスの GQ

およびマーカーのヘッダーバーを緑色に変更するためには、プ

ロットウィンドウ内で GQ を無効化してください。

アレルが認識されない GeneMapper® ID-X ソフトウェアでサンプルを解析するために

は、1 つ以上のアレリックラダーが定義されている必要があり

ます。

十分な数の CC5 ILS 500 のフラグメントが定義されなかった。

CC5 ILS 500 について、サンプルの最小ピークより小さいフラグ

メントが 2 つ以上、サンプルの最大ピークより大きいフラグメ

ントが 2 つ以上定義されていることを確認してください。この

ようになっていてもアレルが認識されなかった場合には、アレ

リックラダーがアレリックラダーの品質評価に不合格であった

と考えられます。

泳動時間が短すぎ、サイズスタンダード（インターナルレーン

スタンダード、ILS）の大きなピークが記録されなかった。

サイズスタンダードで定義したすべての CC5 ILS 500 ピークが、

1 回のランで検出されるとは限りません。

サンプル中の ILS フラグメントを用いて、新しいサイズス

タンダードを作成します。

泳動時間を延長した条件で、サンプルを再泳動します。

解析時に使用したアレリックラダーが低品質であった。

解析には、必ず高品質のアレリックラダーを使用してください。

オフラダー・アレルサンプルとは異なるランで泳動したアレリックラダーを使用した。

同一ランで泳動したアレリックラダーを用いて、サンプルを再

解析してください。

GeneMapper® ID-X ソフトウェアでは、アレリックラダーがサン

プルと同じフォルダからインポートされる必要があります。ア

レリックラダーがサンプルと同じフォルダに入っていることを

確認してください。セクション 6.D または 6.E の説明に従って、

新たなプロジェクトを作成し再解析してください。




オフラダー・アレル（続き）解析用に選択した Panel テキストファイルが、使用する STR シ

ステムに適していなかった。

増幅に用いた STR システムに対応する適切な Panel テキストフ

ァイルを指定してください。

Sample Type カラムで、アレリックラダーがアレリックラダーと

して検出されなかった。

サンプル中のサイズスタンダードが適切に検出されなかった。

サンプル中のサイズスタンダードフラグメントのサイズを手動

で定義し直してください。



サンプルとは異なるランで泳動したアレリックラダーを使用し

た。



サイズスタンダードが認識されないセクション 6.E に示した手順で Partial Range と適切に選択され

たが、Start Point が誤っていた。

Analysis Method でデータの Start Point を調整するか、Range とし

て Full Range を選択してください。

サイズスタンダードで余計なピークが検出された。

Size Match Editor を開いてください。余計なピークを強調表示

し、「Edit」→「Delete Size Label」を選択します。「Auto Adjust

Sizes」を選択します。

泳動時間が短すぎ、サイズスタンダード（ILS）の大きなピーク

が記録されなかった。






サイズスタンダードのピークが検出さ

れない

ピークが閾値を下回る場合には、ピークを検出するため、

Analysis Method で橙色チャンネルの peak amplitude threshold を

下げてください。

ピークが低品質であった場合には、低品質のピークをスキップ

するため、サンプルのサイズスタンダードを定義し直してくだ

さい。

ベースラインが非常に高いスペクトルキャリブレーションが不十分であった。

スペクトルキャリブレーションを新たに実施し、サンプルを再

泳動してください。







7.F. GeneMapper® ID ソフトウェア


アレルが認識されない GeneMapper® ID ソフトウェアでサンプルを解析するためには、

解析パラメータおよびサイズスタンダードの両方で Analysis

Type が「Basic or Advanced」と選択されている必要があります。

そのように設定されていないと、エラーが表示されます。

GeneMapper® ID ソフトウェアでサンプルを解析するためには、

1 つ以上のアレリックラダーが定義されている必要があります。

十分な数の CC5 ILS 500 のフラグメントが定義されなかった。

CC5 ILS 500 について、サンプルの最小ピークより小さいフラグ

メントが 2 つ以上、サンプルの最大ピークより大きいフラグメ

ントが 2 つ以上定義されていることを確認してください。










オフラダー・アレルサンプルとは異なるランで泳動したアレリックラダーを使用し

た。



GeneMapper® ID ソフトウェアでは、アレリックラダーがサンプ

ルと同じフォルダからインポートされる必要があります。アレ

リックラダーがサンプルと同じフォルダに入っていることを確

認してください。セクション 6.I または 6.J の説明に従って、新

たなプロジェクトを作成し再解析してください。

解析用に選択した Panel テキストファイルが、使用する STR シ

ステムに適していなかった。

増幅に用いた STR システムに対応する適切な Panel テキストフ

ァイルを指定してください。

Sample Type カラムで、アレリックラダーがアレリックラダーと

して検出されなかった。

Analysis Method で誤った Analysis Type が選択されていた。

Analysis Type で HID を使用していることを確認してください。

サンプル中のサイズスタンダードが適切に検出されなかった。

サンプル中のサイズスタンダードフラグメントのサイズを手動

で定義し直してください。






サイズスタンダードが正しく認識され

ない

セクション 6.Iに示した手順で Partial Rangeと適切に選択された

が、Start Point が誤っていた。

Analysis Method でデータの Start Point を調整するか、Range とし

て Full Range を選択してください。

Advance モードにおいて、サイズスタンダードに余計なピーク

が検出された。

Size Match Editor を開いてください。余計なピークを強調表示

し、「Edit」→「Delete Size Label」を選択します。「Auto Adjust Sizes」









サイズスタンダードのピークが検出さ

れない

ピークが閾値を下回る場合には、ピークを検出するため、

Analysis Method で橙色チャンネルの peak amplitude threshold を

下げてください。

ピークが低品質であった場合には、低品質のピークをスキップ

するため、サンプルのサイズスタンダードを定義し直してくだ

さい。

エラーメッセージ

「Either panel, size standard, or analysis

method is invalid」

Size Standard と Analysis Method が同じモードに設定されていな

かった（「Classic」または「Basic or Advanced」）。

両ファイルが同じモード（Classic または Basic or Advanced モー

ド）に設定されていることを確認してください。

アレルが認識されないが、エラーメッセ

ージが現れない

サンプルの Panel テキストファイルが選択されていなかった。

Panel カラムで、使用する STR システムに対応する Panel テキス

トファイルを選択してください。

サイズスタンダードが選択されていなかった。

Size Standard カラムで、適切なサイズスタンダードが選択され

ていることを確認してください。

サイズスタンダードが正しく定義されていなかったか、検出さ

れなかったサイズピークがあった。

サイズスタンダードを定義し直し、サンプルに含まれるピーク

のみを入力してください。解析を早期に終了させたり泳動時間

が短かったりすると、大きなラダーピークが検出されません。

このような場合、Sizing Quality が「赤色」で表示され、アレル

サイズが認識されません。

エラーメッセージ

「Both the Bin Set used in the Analysis

Method and the Panel must belong to the

same Chemistry Kit」

Analysis Methodに指定したBinテキストファイルが削除された。

GeneMapper Manager で、Analysis Methods タブを選択し、目的

の Analysis Method を開きます。Allele タブを選択し、適切な Bin

テキストファイルを選択してください。

Analysis Method の Allele タブで誤った Bin テキストファイルが

選択された。

図 19 に示すように、適切な Bin テキストファイルが選択されて

いることを確認してください。




ベースラインが非常に高いスペクトルキャリブレーションが不十分であった。

スペクトルキャリブレーションを新たに実施し、サンプルを再

泳動してください。

Analysis Method に Classic モードを使用した。

サンプルの解析に Classisモードを使用すると、Basic or Advanced

モードの Analysis Method を使用して解析するより、ベースライ

ンのノイズが大きくなります。Analysis Method および Size

Standard を Advanced モードに設定することを推奨します。





Panel および Bin テキストファイルをイ

ンポートしようとすると、次のエラーメ

ッセージが現れる：

「 Unable to save panel data:

java.SQLEException:

ORA-00001: unique constraint

(IFA.CKP_NNN) violated」

Panel および Bin テキストファイルのセットに不一致があった。

Bin が正しくインストールされていることを確認してください。

正しくインストールされていない場合には、すべての Panel およ

び Bin テキストファイルを削除し、異なる順序でファイルを再

度インポートしてください。

アレリックラダーのピークがオフラダ

ーと表示される

GeneMapper® ID ソフトウェアが使用されなかったか、HID 解析

でなくマイクロサテライト解析の設定が使用された。

GeneMapper®ソフトウェアは GeneMapper® ID ソフトウェアと

同じアルゴリズムを使用しないため、アレリックラダーを用い

てサイズの差を補正することはできません。プロメガでは、

PowerPlex®の反応の解析に GeneMapper® ID ソフトウェアを使

用することを推奨します。GeneMapper® ID ソフトウェア Version

3.2 を使用される場合には、選択した Analysis Method が HID で

あることを確認してください。これは GeneMapper Manager を用

いて Analysis Method を開いた後、General タブを選択すること

により確認できます。Analysis Type は変更できません。Analysis

Method が HID でなかった場合には、一旦削除し、新たな Analysis

Method を作成する必要があります。



8. 参考文献

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16. Smith, J.R. et al. (1995) Approach to genotyping errors caused by nontemplated nucleotide addition by Taq DNA polymerase.

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17. Magnuson, V.L. et al. (1996) Substrate nucleotide-determined non-templated addition of adenine by Taq DNA polymerase:

Implications for PCR-based genotyping. BioTechniques 21, 700–9.

18. Walsh, P.S., Fildes, N.J. and Reynolds, R. (1996) Sequence analysis and characterization of stutter products at the

tetranucleotide repeat locus vWA. Nucleic Acids Res. 24, 2807–12.

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20. Butler, J.M. (2006) Genetics and genomics of core STR loci used in human identity testing. J. Forensic Sci. 51, 253–65.

21. Hill, C.R. et al. (2008) Characterization of 26 miniSTR loci for improved analysis of degraded DNA samples. J. Forensic Sci.

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22. Lu, D.J., Liu, Q.L and Zhao, H. (2011) Genetic data of nine non-CODIS STRs in Chinese Han population from Guangdong

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23. Bar, W. et al. (1997) DNA recommendations. Further report of the DNA Commission of the ISFH regarding the use of short

tandem repeat systems. Int. J. Legal Med. 110, 175–6.

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26. Mandrekar, P.V., Krenke, B.E. and Tereba, A. (2001) DNA IQ™: The intelligent way to purify DNA. Profiles in DNA 4(3), 16.

27. Krenke, B.E. et al. (2005) Development of a novel, fluorescent, two-primer approach to quantitative PCR. Profiles in DNA 8(1),

3–5.


96 参考文献



9. 付録

9.A. PowerPlex® Fusion System のローカスを使用する利点

PowerPlex® Fusion System は 1 回の反応で、米国の CODIS および欧州のデータベースを用いた検

索および登録に必要なすべてのコアローカス（表 4 および表 5）を増幅できます。表 6 は、一般的

に入手可能な標準的な DNA テンプレートで明らかになった PowerPlex® Fusion System のアレルを

示したものです。さらに、Y 染色体でアメロゲニンが検出不能であった場合に対処するため、男

性特異的な DYS391 ローカスも加えられています。

DNA ポリメラーゼの使用に起因するものを含む反復数のずれ（repeat slippage）、末端一塩基付

加といったアーティファクトを回避あるいは最小限に抑えるため、プロメガではプライマーを慎

重に選択しました（14, 15）。反復数のずれ（repeat slippage）は「n-4 バンド」、「スタッター」、

あるいは「シャドーバンド（shadow bands）などとも呼ばれ、DNA 増幅中の反復単位の損失や、

体細胞性の DNA のばらつき、もしくはその両方に起因して生じます。このようなアーティファク

トの量は、主としてローカスや、増幅する DNA シークエンスによって異なります。

末端一塩基付加（16,17）は、増幅した DNA フラグメントの 3’末端に、校正活性を持たない熱

安定性のポリメラーゼが、ヌクレオチド（通常はアデニン）をテンプレート非依存的に付加する

ことによって起こります。このような末端一塩基付加の発生効率は、プライマーの配列によって

異なります。そのため、予想より 1 塩基短いアーティファクトピーク（すなわちターミナル付加

の欠如）がみられることがあります。プロメガではプライマー配列を改変し、60℃での最終伸長

ステップを増幅プロトコールに追加することにより（18）、推奨量の DNA テンプレートが使用さ

れていれば実質的に完全な末端一塩基付加が得られるようにしました。


98 付録

表 4. PowerPlex® Fusion System のローカス別の情報

STRローカス標識染色体位置1 反復配列2 5´3´

Amelogenin3 Fluorescein Xp22.1–22.3 and Y ---

D3S1358 Fluorescein 3p21.31 (45.557Mb) TCTA Complex

D1S1656 Fluorescein 1q42 (228.972Mb) TAGA Complex

D2S441 Fluorescein 2p14 (68.214Mb) TCTA

D10S1248 Fluorescein 10q26.3 (130.567Mb) GGAA

D13S317 Fluorescein 13q31.1 (81.62Mb) TATC

Penta E Fluorescein 15q26.2 (95.175Mb) AAAGA

D16S539 JOE 16q24.1 (84.944Mb) GATA

D18S51 JOE 18q21.33 (59.1Mb) AGAA (19)

D2S1338 JOE 2q35 (218.705Mb) TGCC/TTCC

CSF1PO JOE 5q33.1 (149.436Mb) AGAT

Penta D JOE 21q22.3 (43.88Mb) AAAGA

TH01 TMR-ET 11p15.5 (2.149Mb) AATG (19)

vWA TMR-ET 12p13.31 (5.963Mb) TCTA Complex (19)

D21S11 TMR-ET 21q21.1 (19.476Mb) TCTA Complex (19)

D7S820 TMR-ET 7q21.11 (83.433Mb) GATA

D5S818 TMR-ET 5q23.2 (123.139Mb) AGAT

TPOX TMR-ET 2p25.3 (1.472Mb) AATG

DYS391 TMR-ET Y TCTA

D8S1179 CXR-ET 8q24.13 (125.976Mb) TCTA Complex (19)

D12S391 CXR-ET 12p12 (12.341Mb) AGAT/AGAC Complex

D19S433 CXR-ET 19q12 (35.109Mb) AAGG Complex

FGA CXR-ET 4q28 (155.866Mb) TTTC Complex (19)

D22S1045 CXR-ET 22q12.3 (35.779Mb) ATT

1 これらのローカスの染色体位置に関する情報は、参考文献 20、21 および 22、ならびにウェブサイト

www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/chrom.htm をご覧ください。

2 International Society for Forensic Haemogenetics (ISFH)の DNA Commission の 1997 年 8 月の報告書（23,24）に

は、次のように明記されています。1) コード遺伝子中の STR ローカスに関しては、コード鎖を使用し、反

復モチーフの最初の可能な 5’ヌクレオチド配列を用いて反復配列モチーフを定義すること。2）コード遺伝子

と関係のない STR ローカスに関しては、最初のデータベース収載または原著論文の記載を使用すること。』

3 アメロゲニンは STR ではありませんが、89 塩基長の X 特異的バンドと 95 塩基長の Y 特異的バンドを示し

ます。



表 5. PowerPlex® Fusion System のアレリックラダーに関する情報

STRローカス標識アレリックラダーの

サイズ範囲1,2（塩基）アレリックラダーの構成3

Amelogenin4 Fluorescein 89, 95 X, Y

D3S1358 Fluorescein 103–147 9–20

D1S1656 Fluorescein 161–208 9–14, 14.3, 15, 15.3, 16, 16.3, 17, 17.3, 18,

18.3, 19, 19.3, 20.3

D2S441 Fluorescein 214–250 8–11, 11.3, 12–17

D10S1248 Fluorescein 256–280 8–19

D13S317 Fluorescein 302–350 5–17

Penta E Fluorescein 371–466 5–24

D16S539 JOE 84–132 4–16

D18S51 JOE 134–214 7–10, 10.2, 11–13, 13.2, 14–27

D2S1338 JOE 224–296 10, 12, 14–28

CSF1PO JOE 318–362 5–16

Penta D JOE 377–450 2.2, 3.2, 5–17

TH01 TMR-ET 72–115 3–9, 9.3, 10–11, 13.3

vWA TMR-ET 127–183 10–24

D21S11 TMR-ET 203–259 24, 24.2, 25, 25.2, 26–28, 28.2, 29, 29.2,30,

30.2, 31, 31.2, 32, 32.2, 33, 33.2, 34, 34.2,

35, 35.2, 36–38

D7S820 TMR-ET 269–313 5–16

D5S818 TMR-ET 321–369 6–18

TPOX TMR-ET 393–441 4–16

DYS391 TMR-ET 442–486 5–16

D8S1179 CXR-ET 76–124 7–19

D12S391 CXR-ET 133–185 14–17, 17.3, 18, 18.3, 19–27

D19S433 CXR-ET 193–245 5.2, 6.2, 8–12, 12.2, 13, 13.2, 14, 14.2, 15,

15.2, 16, 16.2, 17, 17.2, 18, 18.2

FGA CXR-ET 265–411 14–18, 18.2, 19, 19.2, 20, 20.2, 21, 21.2, 22,

22.2, 23, 23.2, 24, 24.2, 25, 25.2, 26–30,

31.2, 32.2, 33.2, 42.2, 43.2, 44.2, 45.2, 46.2,

48.2, 50.2

D22S1045 CXR-ET 425–464 7–20

1 アレリックラダー中の各アレルの長さは、シークエンス解析により確認しています。

2 CC5 Internal Lane Standard 500 などのサイズスタンダードを使用した場合、アレリックラダーの算出された

サイズは、記載されているサイズと異なることがあります。このような相違が生じるのは、アレリックラダ

ーと ILS ではシークエンスが異なるため、泳動速度に差が生じるからです。色素標識およびリンカーもアレ


100 付録

ルの泳動に影響を及ぼします。

3 マイクロバリアントの最新のリストは、米国国立標準技術研究所（National Institute of Standards and

Technology：NIST）のウェブサイト www.cstl.nist.gov/div831/strbase/で公開されている Variant Allele Report を

ご覧ください。

4 アメロゲニンは STRではありませんが、89塩基のX特異的バンドと 95塩基のY特異的バンドを示します。

表 6. 一般的に利用可能な標準鋳型 DNA における PowerPlex® Fusion System によるアレルの決定

標準鋳型DNA1

STRローカス 2800M 9947A 9948

Amelogenin X, Y X, X X, Y

D3S1358 17, 18 14, 15 15, 17

D1S1656 12, 13 18.3, 18.3 14, 17

D2S441 10, 14 10, 14 11, 12

D10S1248 13, 15 13, 15 12, 15

D13S317 9, 11 11, 11 11, 11

Penta E 7, 14 12, 13 11, 11

D16S539 9, 13 11, 12 11, 11

D18S51 16, 18 15, 19 15, 18

D2S1338 22, 25 19, 23 23, 23

CSF1PO 12, 12 10, 12 10, 11

Penta D 12, 13 12, 12 8, 12

TH01 6, 9.3 8, 9.3 6, 9.3

vWA 16, 19 17, 18 17, 17

D21S11 29, 31.2 30, 30 29, 30

D7S820 8, 11 10, 11 11, 11

D5S818 12, 12 11, 11 11, 13

TPOX 11, 11 8, 8 8, 9

DYS391 10 – 10

D8S1179 14, 15 13, 13 12, 13

D12S391 18, 23 18, 20 18, 24

D19S433 13, 14 14, 15 13, 14

FGA 20, 23 23, 24 24, 26

D22S1045 16, 16 11, 14 16, 18

1 細胞株 9947A および 9948 に関する情報は、以下のサイトから入手できます：

http://ccr.coriell.org/Sections/Search/Sample_Detail.aspx?Ref=GM09947 および

http://ccr.coriell.org/Sections/Search/Sample_Detail.aspx?Ref=GM09948

標準鋳型DNAとしての 9947Aおよび 9948のDNAの使用に関する情報は、参考文献 25に記載されています。



9.B. DNA の抽出および定量方法、ならびに自動化支援

プロメガでは、サンプル調製、DNA 精製および STR 増幅前の DNA 定量にご使用いただける多様

な試薬や自動化法をご用意しています。

データベース用、対照試料用およびその他のシングルソースのサンプルの解析については、FTA®

パンチからの直接増幅、あるいは SwabSolution™ Kit または PunchSolution™ Kit を用いたスワブお

よび FTA 以外のカードパンチの前処理を推奨します。SwabSolution™ Kit（カタログ番号 DC8271）

には、増幅前に口腔内スワブから DNA を短時間で調製するための試薬が含まれています。その手

順としては、スワブヘッドに採取された細胞を溶解し、STR 増幅に十分な量の DNA を溶液中に遊

離させます。スワブの最終抽出液を少量分取し、PowerPlex®反応液に添加します。PunchSolution™

Kit は、血液または口腔内サンプルを採取した FTA 以外の保存カードパンチを直接増幅する前の

処理に使用します。

DNA 精製を必要とする現場試料またはサンプルには、法医学的サンプル用にデザインされた

DNA 単離システムである DNA IQ™ System（カタログ番号 DC6700）を推奨します（26）。この製

品は、不純物を含まない STR 解析用サンプルを簡単かつ効率的に調製するため、常磁性粒子を使

用しているほか、凝固血液や液状サンプル（血液、溶液など）からの DNA 抽出にご使用いただけ

ます。DNA IQ™ Resin は、現場試料に含まれていることが多い PCR 阻害物質や汚染物質を除去し

ます。DNA を豊富に含むサンプルを用いる場合には、DNA IQ™ System により一定量の総 DNA

が得られます。本製品は、口腔内スワブ、FTA®ペーパー上の凝固血液サンプル、液状血液といっ

た通常の種類のサンプルからの DNA 単離に使用されてきました。その他に、現場試料（組織、個

別に分離された性的暴行犯罪サンプル、支持材料上の血痕など）からの DNA の単離にも使用され

ています。DNA IQ™ System は PowerPlex® System でテストしており、作業手順が能率化されてい

ます。

ヒト特異的 DNA の定量を必要とするアプリケーション向きには、Plexor® HY System（カタログ

番号 DC1000）を開発しました（27）。この qPCR ベースの方法は、ヒト総 DNA 量および男性 DNA

量を 1 回の反応で同時に定量できます。さらに、Plexor® HY System には、陽性結果を確認するた

めの増幅後の融解曲線解析機能と、陰性結果を確認するための Internal PCR Control（IPC）が付属

しています。その他の製品のご案内はセクション 9.E をご覧ください。

Identity Automation™ソリューションを用いた自動ワークステーションによるプロメガ製品の自

動化については、プロメガテクニカルサービスまでお問い合わせください。

E-Mail: [email protected]

ウェブサイト：www.promega.co.jp/tech/


102 付録

9.C. CC5 Internal Lane Standard 500

CC5 Internal Lane Standard 500 には、60、65、80、100、120、140、160、180、200、225、250、

275、300、325、350、375、400、425、450、475 および 500 塩基長の 21 の DNA フラグメントが

含まれています（図 24）。各フラグメントは CC5 色素で標識されており、PowerPlex® Fusion で増

幅した産物の存在下で別個に（5 種類目の色素で）検出することができます。CC5 ILS 500 は、

PowerPlex® Fusion System を使用する際の解析精度を向上させるために、キャピラリー電気泳動

（CE）へのインジェクションの都度使用するようにデザインされています。このサイズスタンダ

ードの調製および使用に関するプロトコールは、セクション 5 に示します。

注：475 塩基以上の Penta E および DYS391 アレルのサイジングには、Local Southern Method は使

用されません。Penta E については、24 塩基を超えるアレルは「OL」と標識されます。

図24. CC5 Internal Lane Standard 500

CC5 Internal Lane Standard 500のフラグメントを示す電気泳動図



9.D. バッファーと溶液の組成

TE-4 バッファー（10 mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA [pH 8.0])

1.21 g Tris base

0.037 g EDTA

(Na2EDTA・2H2O)

Tris base と EDTA を 900 ml の脱イオン水に溶解します。HCl で pH を 8.0 に調整します。

脱イオン水で 1 リットルにメスアップします。

20 μg/ml グリコーゲンを添加した TE-4 バッファー

1.21 g Tris base

0.037 g EDTA

(Na2EDTA・2H2O)

20 μg/ml グリコーゲン

Tris base と EDTA を 900 ml の脱イオン水に溶解します。

HCl で pH を 8.0 に調整します。グリコーゲンを添加します。

脱イオン水で 1 リットルにメスアップします。

a)U.S. Pat. No. 6,242,235, Australian Pat. No. 761757, Canadian Pat. No. 2,335,153, Chinese Pat. No.

ZL99808861.7, Hong Kong Pat. No. HK 1040262, Japanese Pat. No. 3673175, European Pat. No. 1088060 and

other patents pending.

(b)U.S. Pat. Nos. 5,843,660, 6,479,235, 6,221,598 and 7,008,771, Australian Pat. No. 724531, Canadian Pat. No.

2,118,048 and 2,251,793, Korean Pat. No. 290332, Singapore Pat. No. 57050, Japanese Pat. Nos. 3602142 and

4034293, Chinese Pat. Nos. ZL99813729.4 and ZL97194967.0, European Pat. No. 0960207 and other patents

pending.

(c)U.S. Pat. No 6,238,863, European Pat. No. 1058727, Chinese Pat. No. ZL99802696.4, Japanese Pat. No.

4494630 and other patents pending.

(d)STR loci are the subject of U.S. Pat. No. RE 37,984, German Pat. No. DE 38 34 636 C2 and other patents issued

to the Max-Planck-Gesellschaft zur Forderung der Wissenschaften, e.V., Germany.

(e)Allele sequences for one or more of the loci vWA, FGA, D8S1179, D21S11 and D18S51 in allelic ladder mixtures

is licensed under U.S. Pat. Nos. 7,087,380, 7,645,580, Australia Pat. No. 2003200444 and corresponding patent

claims outside the US.

(f)TMR-ET, CXR-ET and CC5 dyes are proprietary.

(g)This product or portions thereof is manufactured and sold under license from GE Healthcare under Australia Pat.

No. 692230, Austria Pat. No. E236994, Belgium Pat. No. 0743987, Canada Pat. No. 2231475, EP Pat. Nos.

0743987 and 0851867, France Pat. Nos. 0743987 and 0851867, Germany Pat. Nos. 19581489, 69530286.8 and

0851867, Italy Pat. Nos. 0743987 and 0851867, Japan Pat. No. 3066984, Liechtenstein Pat. Nos. 0743987 and

0851867, Netherlands Pat. Nos. 0743987 and 0851867, Spain Pat. Nos. 2197193 and 2173310, Sweden Pat. Nos.

0743987 and 0851867, Switzerland Pat. Nos. 0743987 and 0851867, United Kingdom Pat. Nos. 0743987 and

0851867, U.S. Pat. Nos. 5,654,419, 5,688,648, 5,869,255, 6,177,247, 5,707,804, 6,028,190, 6,544,744, 7,015,000

and 5,728,528 and other pending and foreign patent applications.


104 付録

9.E. 関連製品のご紹介

STRシステム


PowerPlexR Y23 System 50 reactions DC2305

200 reactions DC2320

PowerPlexR 21 System 200 reactions DC8902

4 × 200 reactions DC8942

PowerPlexR 18D System 200 reactions DC1802


PowerPlexR ESX 16 System 100 reactions DC6711


PowerPlexR ESX 17 System 100 reactions DC6721


PowerPlexR ESI 16 System 100 reactions DC6771


PowerPlexR ESI 17 Pro System 100 reactions DC7781


PowerPlexR 16 HS System 100 reactions DC2101


PowerPlexR CS7 System 100 reactions DC6613

Not for Medical Diagnostic Use.

付属品


PowerPlexR 5-Dye Matrix Standards, 3100/3130* 25μl (each dye) DG4700

PunchSolution™ Kit* 100 preparations DC9271

SwabSolution™ Kit* 100 preparations DC8271

CC5 Internal Lane Standard 500 300μl DG1521

2800M Control DNA (10ng/μl)* 25μl DD7101

2800M Control DNA (0.25ng/μl)* 500μl DD7251

Water, Amplification Grade 6,250μl (5 × 1,250μl) DW0991

Not for Medical Diagnostic Use.

サンプル調製・DNA定量システム


DNA IQ™ System 100 reactions DC6701


PlexorR HY System* 200 reactions DC1001




エンドユーザー使用許諾条件

使用権の許諾

以下の使用許諾条件は、注文書、見積り書または送り状に記載された製品の購入、使用、譲渡

および受納に対して適用されます。注文書、見積り書または送り状とは、プロメガが製品購入者

／譲受者（「エンドユーザー」）への製品の販売・配布に際して発行する文書をいいます。エンド

ユーザーが以下の使用許諾条件を受諾することを条件として、エンドユーザーに製品を譲渡／販

売いたします。

使用上の制限

エンドユーザーは、スタンドアロンの製品または別の製品の一部として、製品を転売、譲渡ま

たは配布する権限を明示的に有さず、またそのような行為を明示的に禁止されています。製品の

使用権は、本契約に明示する以外の GE Healthcare Bio-Sciences Corp のいかなる技術または知的所

有権に対するエンドユーザーの権利もそれ自体に含まず、また、そのような権利を付与するもの

でもありません。GE Healthcare Bio-Sciences Corp が登録商標権を有するいかなる製品またはサー

ビスについても、エンドユーザーに対し、リバースエンジニアリングを目的とする一連の行為を

禁止します。

保証の免責

GE Healthcare Bio-Sciences Corp は、エンドユーザーに対し、製品の品質、状態、性能、商品性、

特定の用途における適合性について、（黙示的にも明示的にも）一切の補償を行わないものとし、

本契約にて、これらのあらゆる保証を明示的に放棄します。GE Healthcare Bio-Sciences Corp は、

本契約にて、製品の使用により得られた結果（不正確、無効または不完全な結果が得られたとい

う申し立てを例外なく含む）に関するあらゆる保証を明示的に放棄します。

免責条項

GE Healthcare Bio-Sciences Corp とその系列会社は、エンドユーザーに対し、原因にかかわらず、

また、契約、不法行為、厳密な製造物責任またはその他の行為の形態にかかわらず、いかなる使

用または利益の喪失、業務中断、または直接的、偶発的、個別的または間接的ないかなる種類の

損害に関しても一切の責任を負いません。

版権 2012 年、2014 年 Promega Corporation 版権所有

Plexor および PowerPlex は Promega Corporation の登録商標です。DNA IQ、Identity Automation、

PunchSolution および SwabSolution は Promega Corporation の商標です。

ABI PRISM、Applied Biosystems、GeneMapper および MicroAmp は Applied Biosystems の登録商

標です。Bode Buccal DNA Collector は Bode Technology Group, Inc の商標です。EasiCollect および

OmniSwabはWhatmanの商標です。FTAはFlinders Technologies, Pty, Ltdの登録商標であり、Whatman

にライセンス供与されています。GeneAmp は Roche Molecular Systems, Inc の登録商標です。Hi-Di

およびPOP-7はApplera Corporationの商標です。POP-4はLife Technologiesの登録商標です。Sampact

は Fitzco の商標です。Vacutainer は Becton, Dickinson and Company の登録商標です。


106 付録

製品は特許出願中または特許取得済であるか、一定の制限条項を設けている場合があります。

詳細は弊社ウェブサイトでご確認ください。

価格および仕様はすべて、事前通知なしで変更する場合があります。

製品クレームを変更する場合があります。プロメガ製品の最新情報は、プロメガテクニカルサ

ービスまでお問い合わせいただくか、プロメガのオンラインカタログをご確認ください。

プロメガ株式会社

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