potensi ekstrak daun pranajiwa (euchresta horsfieldii ... · dalam meningkatkan aktivitas enzim...
TRANSCRIPT
i
TESIS
POTENSI EKSTRAK DAUN PRANAJIWA (Euchresta
horsfieldii Lesch Benn.) DALAM MENINGKATKAN
AKTIVITAS ENZIM SUPEROKSIDA DISMUTASE
DAN GLUTATION PEROKSIDASE PADA TIKUS
WISTAR (Rattus norvegivus) DENGAN AKTIVITAS
FISIK MAKSIMAL
NI WAYAN RIKA KUMARA DEWI
NIM 1492061009
PROGRAM MAGISTER
PROGRAM STUDI KIMIA TERAPAN FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS UDAYANA
DENPASAR
2017
ii
POTENSI EKSTRAK DAUN PRANAJIWA (Euchresta
horsfieldii Lesch Benn.) DALAM MENINGKATKAN
AKTIVITAS ENZIM SUPEROKSIDA DISMUTASE
DAN GLUTATION PEROKSIDASE PADA TIKUS
WISTAR (Rattus norvegivus) DENGAN AKTIVITAS
FISIK MAKSIMAL
Tesis untuk Memperoleh Gelar Magister
pada Program Magister, Program Studi Kimia Terapan,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana
NI WAYAN RIKA KUMARA DEWI
NIM 1492061009
PROGRAM MAGISTER
PROGRAM STUDI KIMIA TERAPAN FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS UDAYANA
DENPASAR
2017
iii
iv
PENETAPAN PANITIA PENGUJI TESIS
Tesis Ini Telah Diuji pada
Tanggal 30 Januari 2017
Panitia Penguji Tesis Berdasarkan SK Rektor
Universitas Udayana, No : 532/UN14.1.28/EP/2017, Tanggal 24 Januari 2017
Ketua : Dr. I Wayan Gunawan, S.Si., M.Si.
Anggota :
1. Dra. Ni Made Puspawati, M.Phil., Ph.D.
2. Prof. Dr. Drs. I Made Dira Swantara, M.Si.
3. Dr. Drs. I Made Oka Adi Parwata, M.Si.
4. Dr. Dra. Wiwik Susanah Rita, M.Si.
v
vi
UCAPAN TERIMAKASIH
Om Swastyastu
Puji syukur penulis panjatkan ke hadapan Ida Sang Hyang Widhi
Wasa/Tuhan Yang Maha Esa, karena atas Asung Kertha Wara Nugraha-Nya tesis
ini dapat terselesaikan.
Bantuan serta bimbingan dari berbagai pihak telah membantu penyusunan
tesis ini. Dalam kesempatan ini, penulis menyampaikan terimakasih yang sebesar-
besarnya kepada Dr. I Wayan Gunawan, S.Si., M.Si. selaku pembimbing I yang
telah memberikan semangat, bimbingan, masukan, dan saran dalam penyelesaian
tesis ini. Terimakasih yang setulus-tulusnya juga penulis sampaikan kepada Dra.
Ni Made Puspawati, M.Phil., Ph.D. yang dengan penuh perhatian telah banyak
membantu penulis, memberikan bimbingan, masukan, dan sarannya kepada
penulis.
Ucapan yang sama juga penulis sampaikan kepada Prof. Dr. dr. Ketut
Suastika, Sp.PD (K) selaku Rektor Universitas Udayana atas kesempatan dan
fasilitas yang diberikan kepada penulis untuk mengikuti dan menyelesaikan
pendidikan Program Magister di Universitas Udayana. Ucapan terimakasih ini
juga ditujukan kepada Drs. Ida Bagus Made Suaskara, M.Si selaku Dekan
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana atas
kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk menjadi mahasiswa Program
Magister pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas
Udayana. Ucapan terimakasih penulis sampaikan kepada Ketua Program Studi
Kimia Terapan Universitas Udayana, Prof. Dr. Drs. I Made Dira Swantara, M.Si
atas kesempatan yang telah diberikan kepada penulis untuk menjadi mahasiswa
dan mengikuti Program Magister. Ungkapan terimakasih penulis sampaikan
kepada para penguji tesis ini, yaitu Prof. Dr. Drs. I Made Dira Swantara, M.Si, Dr.
Drs. I Made Oka Adi Parwata, M.Si., Dr. Dra. Wiwik Susanah Rita, M.Si yang
telah memberikan saran, masukan, sanggahan, dan koreksi untuk
menyempurnakan tesis ini.
Ucapan terimakasih yang sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada para
pengajar dan pengampu mata kuliah selama penulis mengenyam pendidikan
vii
Program Magister di Universitas Udayana. Ucapan terimakasih penulis sampaikan
kepada Dr. Ir. I Komang Agusjaya Mataram, M.Kes dan Ni Putu Agustini, SKM.,
M.Si. atas bantuan, bimbingan, saran, dan semangat selama penelitian.
Pada kesempatan ini, penulis juga menyampaikan penghargaan yang tulus
kepada Ketua Jurusan Gizi Poltekkes Denpasar beserta staf dan rekan sekerja
yang memberikan dorongan dan semangat. Ucapan terimakasih penulis
sampaikan kepada Ni Made Dewantari, SKM, M.FOr, G.A. Dewi Kusumayanti,
DCN, M.Kes, Ketut Lilik Arwati, S.Gz., M.Biomed yang memberikan dukungan,
semangat, pengertian, dan perhatian kepada penulis. Ucapan terimakasih yang
sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada bapak tercinta Drs. I Made Karda,
M.Si dan ibu tercinta Ni Made Rustini, S.Sos yang telah mengasuh, mendidik,
membesarkan, dan memberikan dukungan kepada penulis dengan kasih sayang
dan doa. Ucapan terimakasih yang setulus-tulusnya penulis sampaikan kepada
suami tercinta Putu Pratama Jaya Denria, S.Si yang tidak pernah lelah
memberikan semangat, dorongan, perhatian, pengertian, dan kasih sayang kepada
penulis. Ucapan terimakasih juga kepada adik-adik tersayang beserta keluarga
besar atas kasih sayang, dukungan dan doa yang diberikan kepada penulis. Penulis
juga menyampaikan terimakasih kepada bapak mertua tercinta Drs. Ketut
Sulenden, ibu mertua tercinta Ni Luh Nyoman Seriasih, S.Pd dan adik ipar
tercinta yang telah memberikan dukungan, kasih sayang, dan doa kepada penulis.
Akhirnya penulis sampaikan terimakasih kepada rekan seperjuangan Program
Studi Magister Kimia Terapan angkatan 2014 atas dukungan, semangat, dan
bantuannya dalam penyusunan tesis ini.
Semoga Ida Sang Hyang Widhi Wasa/Tuhan Yang Maha Esa selalu
melimpahkan anugerah-Nya kepada semua pihak yang telah membantu
pelaksanaan dan penyelesaian tesis ini, serta kepada penulis sekeluarga.
Om Santhi Santhi Santhi Om
Denpasar, 30 Januari 2017
Penulis
viii
ABSTRAK
POTENSI EKSTRAK DAUN PRANAJIWA
(Euchresta horsfieldii Lesch Benn.) DALAM MENINGKATKAN
AKTIVITAS ENZIM SUPEROKSIDA DISMUTASE DAN GLUTATION
PEROKSIDASE PADA TIKUS WISTAR (Rattus norvegivus) DENGAN
AKTIVITAS FISIK MAKSIMAL
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antioksidan ekstrak etil
asetat daun pranajiwa (Euchresta horsfieldii Lesch Benn.) terhadap superoksida
dismutase (SOD) dan glutation peroksidase (GPx) dalam menghambat peroksidasi
lipid pada plasma darah tikus Wistar serta menentukan golongan flavonoid yang
aktif sebagai antioksidan.
Penentuan aktivitas antioksidan secara in vitro dilakukan dengan metode
DPPH (1,1-diphenyl-2-pycrylhidrazyl) dan secara in vivo dengan tikus Wistar
menggunakan lima kelompok perlakuan. Kelompok kontrol negatif (aquadest 10
mL/200 g BB/hari), kelompok ekstrak etil asetat 10, 20, 30 mg/200 g BB/hari, dan
kelompok kontrol positif (vitamin C 10 mg/200 g BB/hari). Masing-masing
perlakuan diberikan selama 21 hari. Perlakuan aktivitas fisik maksimal yang
diberikan dengan cara merenangkan tikus Wistar sampai hampir tenggelam
selama 60 menit. Semua kelompok dilakukan pemeriksaan aktivitas SOD dan
kadar GPx darah di awal dan akhir perlakuan. Pemisahan ekstrak etil asetat
dilakukan dengan kromatografi kolom, kemudian diidentifikasi dengan
spektrofotometer FTIR dan UV-Vis.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat memiliki aktivitas
antioksidan dengan nilai IC50 sebesar 393,95 µg/mL dan kadar total flavonoid
sebesar 6619,72 mg QE/100g ekstrak atau 6,62 % (b/b). Pemberian ekstrak etil
asetat 20 mg/200 g BB/hari memberikan hasil yang terbaik yaitu dapat
meningkatkan aktivitas SOD sebanyak 34,93 kali, sedangkan pemberian
ekstraketil asetat 30 mg/200 g BB/hari mampu meningkatkan kadar GPx sebanyak
9,76 kali. Pemisahan dan pemurnian ekstrak etil asetat menghasilkan isolat aktif
yang positif flavonoid (isolat FE) yang diduga merupakan senyawa flavonoid
golongan flavonol yaitu 3,5,7,3’,4’-pentahidroksi flavonol (kuersetin).
Kata kunci : Eucresta horsfieldii (Lesch.) Benn, superoksida dismutase, glutation
peroksidase, flavonol, kuersetin.
ix
ABSTRACT
THE POTENCY OF PRANAJIWA LEAF
(Euchresta horsfieldii Lesch Benn.) EXTRACT IN INCREASING THE
ACTIVITY OF SUPEROXIDE DISMUTASE AND GLUTHATION
PEROXIDASE IN RATS (Rattusnorvegivus) WITH
MAXIMUM PHYSICAL ACTIVITY
The present study was conducted to determine antioxidant activity of
Pranajiwa leaves ethyl acetate extracts in inhibiting lipid peroxidation through
increasing of superoxide dismutase (SOD) and gluthation (GPx) enzymes activity
in rats with maximum physical activity and to identify the flavonoid active
compounds.
In vitro antioxidant activity was d using DPPH (1,1-diphenyl-2-
pycrylhidrazyl) method and in vivo test was used five groups of rats. A negative
control group (received vehicle only), three treatment groups received ethyl
acetate extracts with a dose of 10, 20, 30 mg/200 g BB/day respectively, and a
positive control group which received vitamin C 10 mg/200 g BB/day. The
maximal physical activity condition of rats was achieved by swimming the rats for
60 minutes. All groups were given treatment for 21 days. The bloods were taken
before and after treatment to measure SOD and GPx activity. The separation of
the ethyl acetate extract was conducted by column chromatography and then
identified by using FTIR and UV-Vis spectrophotometer.
The results showed that ethyl acetate extract had antioxidant activity with
IC50 value of 393,95 µg/mL and total flavonoid content of 6619,72 mg EQ/100g
or 6,62% (w/w). The ethyl acetate extract at a dose of 20 mg/200 g BB/day
increased of SOD activity by 34,93 times, while at a dose of 30 mg/200 g BB/day
increased of GPx activity by 9,76 times. Based on UV-Vis and Infrared spectra
analysis, isolate which positive flavonoid (isolates FE) was tentaviey identified as
3,5,7,3',4'-penthadihydroxi flavonols (quercetin).
Keywords: Eucresta horsfieldii (Lesch.) Benn, superoxide dismutase, glutathione
peroxidase, flavonols, quercetin.
x
RINGKASAN
Pemberian aktivitas fisik maksimal dengan cara merenangkan tikus sampai
hampir tenggelam ternyata memicu peningkatan metabolisme dan konsumsi
oksigen sehingga dapat meningkatkan terbentuknya ROS. Hal tersebut dapat
diketahui dengan mengukur kadar MDA, karena MDA digunakan sebagai
biomarker penanda terjadinya stres oksidatif. Superoksida dismutase (SOD) dan
glutatión peroksidase (GPx) merupakan antioksidan endogen. Superoksida
dismutase berfungsi mengkatalisis reaksi dismutasi radikal bebas anion
superoksida menjadi hidrogen peroksida dan molekul oksigen. Sedangkan
glutatión peroksidase berfungsi mengkatalisis reduksi hidrogen peroksida dan
peroksida lipid oleh glutation. Pembentukan radikal bebas yang terus menerus
terjadi dapat mengakibatkan terjadinya penurunan aktivitas SOD dan GPx
sehingga diperlukan peranan antioksidan eksogen seperti vitamin, polifenol, dan
flavonoid untuk membantu kerja enzim SOD dan GPx dalam mencegah kerusakan
sel. Dengan demikian, pada penelitian ini dilakukan penentuan aktivitas
antioksidan ekstrak etil asetat daun pranajiwa terhadap kenaikan aktivitas SOD
dan kadar GPx pada tikus Wistar dengan pemberian aktivitas fisik maksimal.
Selanjutnya dilakukan penentuan senyawa golongan flavonoid yang terkandung
dalam ekstrak etil asetat daun pranajiwa.
Penelitian ini terdiri dari beberapa tahapan yaitu maserasi, uji fitokimia,
penentuan kandungan total flavonoid, uji aktivitas antioksidan secara in vitro
dengan metode DPPH, dan secara in vivo dengan mengukur aktivitas SOD dan
kadar GPx pada tikus Wistar menggunakan lima kelompok perlakuan yang terdiri
dari kelompok kontrol negatif (pemberian aquades), kelompok perlakuan
pemberian ekstrak daun pranajiwa 10 mg/200 g BB/hari, kelompok perlakuan
pemberian ekstrak daun pranajiwa 20 mg/200 g BB/hari, kelompok perlakuan
permberian ekstrak daun pranajiwa 30 mg/200 g BB/hari, dan kelompok kontrol
positif (pemberian vitamin C 10 mg/200 g BB/hari). Semua perlakuan diberikan
selama 21 hari. Perlakuan aktivitas fisik maksimal yang berikan dengan cara
merenangkan tikus wistar sampai hampir tenggelam selama 60 menit. Semua
kelompok dilakukan pemeriksaan aktivitas SOD dan kadar GPx darah di awal dan
akhir perlakuan.
Pemisahan dan pemurnian ekstrak etil asetat daun pranajiwa dilakukan
dengan kromatografi kolom konvensional dan kromatografi lapis tipis sedangkan
proses identifikasi dilakukan dengan spektrofotometer UV-Vis dan FTIR. Hasil
uji fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat daun pranajiwa mengandung
senyawa flavonoid dengan kandungan total flavonoid sebesar 6,62% b/b EQ.
Hasil uji aktivitas antioksidan secara in vitro dengan metode DPPH menunjukkan
bahwa ekstrak etil asetat memiliki aktivitas antioksidan lemah dengan nilai IC50
sebesar 393,95 µg/mL. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh senyawa tersebut
masih dalam keadaan tidak murni, sehingga perlu dilakukan fraksinasi dengan
harapan agar didapat nilai IC50 dari senyawa spesifik yang memiliki aktivitas
antioksidan yang lebih kuat bila dibandingkan dengan ekstrak yang tidak murni.
Adanya kandungan metabolit sekunder selain flavonoid kemungkin tidak
memberikan respon sinergis sehingga aktivitas antioksidan yang dihasilkan
lemah.
xi
Hasil uji one way anova terhadap rerata aktivitas SOD dan kadar GPx
setelah pemberian ekstrak etil asetat menunjukkan nilai p sebesar 0,000 (p<0,05),
sehingga nilai tersebut mengindikasikan bahwa kelima perlakuan yang diberikan
terhadap tikus wistar memberikan pengaruh yang berbeda nyata. Hasil uji beda
Duncan terhadap rerata aktivitas SOD dan kadar GPx setelah pemberian ekstrak
etil asetat menunjukkan perlakuan antara kelompok di dalam subset tidak berbeda
nyata, akan tetapi antara subset terdapat perbedaan yang nyata. Jika dilihat dari
aktivitas SOD dan kadar GPx sebelum dan setelah pemberian ekstrak etil asetat
menunjukkan terjadinya peningkatan aktivitas SOD dan kadar GPx. Pemberian
ekstrak etil asetat 20 mg/200 g BB/hari memberikan hasil yang terbaik yaitu dapat
meningkatkan aktivitas SOD sebanyak 34,93 kali yaitu 171,44%. Peningkatan
tersebut terjadi karena pada pemberian ekstrak dengan konsentrasi 20 mg/200 g
BB/ hari sudah menunjukkan aktivitas SOD telah berada pada kisaran normal atau
terjadi kondisi homeostasis. Selain itu meningkatnya aktivitas enzim SOD setelah
pemberian ekstrak etil asetat juga diduga karena induksi gen yang bertanggung
jawab pada sintesis enzim antioksidan melalui translokasi Nrf2 ke inti sehingga
meningkatkan ekspresi gen penyandi antioksidan. Selanjutnya Nrf2 akan
mengikat ARE (Antioxidant Response Element) pada daerah target gen dan akan
menginduksi gen antioksidan. Sedangkan pemberian ekstrak etil asetat 30 mg/200
g BB/hari mampu meningkatkan kadar GPx sebanyak 9,76 kali yaitu 41,80%.
Peningkatan kadar GPx karena pada konsentrasi tersebut ekstrak sudah mampu
meningkatkan transkripsi gen antioksidan GPx yang dimediasi oleh Nrf2.
Pemisahan dan pemurnian ekstrak etil asetat dengan teknik kromatografi
kolom menggunakan fase gerak n-heksan:kloroform:etanol (20:1:1). Pemisahan
menghasilkan isolat aktif yang positif flavonoid yaitu isolat FE dengan hasil
identifikasi pada spektrofotometer FTIR diduga memiliki gugus fungsi –OH, C-H
aromatik, C=C, C=O, C-O, dan C-H alifatik. Hasil análisis dengan
spektrofotometer UV-Vis mengindikasikan bahwa ekstrak etil asetat diduga
mengandung senyawa flavonoid golongan flavonol yaitu 3,5,7,3’,4’-pentahidroksi
flavonol (kuersetin) yang berkontribusi sebagai antioksidan.
xii
DAFTAR ISI
Halaman
SAMPUL DALAM ………………………………………………….. i
PRASYARAT GELAR ……………………………………………… ii
LEMBAR PERSETUJUAN …………………………………………. iii
PENETAPAN PANITIA PENGUJI …………………………………. iv
SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT ………………………. v
UCAPAN TERIMAKASIH …………………………………………. vi
ABSTRAK …………………………………………………………… viii
ABSTRACT …………………………………………………………. ix
RINGKASAN ……………………………………………………….. x
DAFTAR ISI …………………………………………………………. xii
DAFTAR TABEL ……………………………………………………. xv
DAFTAR GAMBAR ………………………………………………… xvi
DAFTAR ARTI LAMBANG, SINGKATAN, DAN ISTILAH……… xvii
DAFTAR LAMPIRAN ……………………………………………… xviii
BAB I PENDAHULUAN ……………………………………………. 1
1.1. Latar Belakang …………………………………………. 1
1.2. Rumusan Masalah ……………………………………… 5
1.3. Tujuan Penelitian ………………………………………. 6
1.4. Manfaat Penelitian ……………………………………... 6
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ……………………………………... 7
2.1. Tumbuhan Pranajiwa (Euchresta horsfieldii Lesch Benn.) 7
2.2. Antioksidan …………………………………………….. 13
2.2.1. Superoksida Dismutase …………………………. 16
2.2.2. Glutation Peroksidase …………………………… 16
2.2.3. Malondialdehida (MDA)………………………… 17
2.3. Flavonoid ………………………………………………. 20
2.4. Vitamin C ………………………………………………. 25
2.5. Stres Oksidatif ………………………………………….. 27
2.6. Radikal Bebas dan Oksidan ……………………………. 28
2.7. Produksi Radikal Bebas Akibat Aktivitas Fisik ……….. 29
2.8. Isolasi dan Identifikasi Senyawa Flavonoid …………… 30
2.8.1. Ekstraksi ………………………………………… 30
2.8.2. Pemisahan dan pemurnian ……………………… 31
2.8.3. Spektrofotometri UV-Vis ……………………….. 33
2.8.3.1. Pereaksi diagnostik untuk identifikasi
Flavonoid ………………………………. 34
2.8.4. Spektrofotometri Inframerah …………………… 39
BAB III KERANGKA BERPIKIR, KONSEP DAN HIPOTESIS ….. 41
3.1. Kerangka Berpikir ……………………………………… 41
3.2. Kerangka Konsep ………………………………………. 44
xiii
3.3. Hipotesis Penelitian ……………………………………. 44
BAB IV METODELOGI PENELITIAN ……………………………. 45
4.1. Rancangan Penelitian ………………………………….. 45
4.2. Tempat Penelitian ……………………………………… 47
4.3. Ruang Lingkup Penelitian ……………………………... 47
4.4. Penentuan Sumber Data ……………………………….. 47
4.4.1. Populasi ………………………………………... 47
4.4.2. Kriteria sampel ………………………………… 48
4.4.3. Besar sampel …………………………………... 48
4.5. Variabel Penelitian …………………………………….. 48
4.6. Bahan Penelitian ………………………………………. 49
4.7. Alat Penelitian …………………………………………. 49
4.8. Prosedur Penelitian …………………………………… 50
4.8.1. Penyiapan sampel …………………………….. 50
4.8.2. Maserasi ………………………………………. 50
4.8.3. Penentuan kandungan total flavonoid ………… 50
4.8.4. Penentuan aktivitas antioksidan secara in vitro . 52
4.8.5. Penentuan aktivitas antioksidan secara in vivo .. 52
4.8.5.1. Penetapan dosis ekstrak etil asetat daun
pranajiwa ……………………………… 52
4.8.5.2. Hewan percobaan dan pengambilan
sampel ………………………………… 53
4.8.5.3. Pengukuran kadar malondialdehide (MDA) 54
4.8.5.4. Pengukuran kadar superoksida dismutase
(SOD) …………………………………. 54
4.8.5.5. Pengukuran kadar glutatión peroksidase
(GPx) ………………………………….. 55
4.8.6. Pemisahan dan pemurnian ekstrak kental etil
asetat ……………………………………………. 55
4.8.6.1. Kromatografi lapis tipis ………………. 55
4.8.6.2. Kromatografi kolom ………………….. 56
4.8.7. Uji golongan senyawa flavonoid ………………. 57
4.8.8. Identifikasi isolat flavonoid pada fraksi aktif ….. 58
4.8.8.1. Pengukuran dengan spektrofotometer
UV-Vis ……………………………….. 58
4.8.8.2. Pengukuran dengan spektrofotometer
FTIR ………………………………….. 59
4.9. Alur Penelitian ………………………………………… 60
4.9.1. Ekstraksi, pemisahan, dan pemurnian daun
Pranajiwa ……………………………………… 60
4.9.2. Penentuan aktivitas antioksidan secara in vivo .. 61
4.10. Analisis Data ………………………………………….. 61
BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN ………………………………. 62
5.1. Uji Fitokimia terhadap Ekstrak Etil Asetat Daun Pranajiwa 62
5.2. Total Flavonoid ………………………………………….. 68
5.3. Penentuan Aktivitas Antioksidan Secara In Vitro
dengan metode DPPH……………………………………. 70
xiv
5.4. Penentuan Aktivitas Antioksidan Secara In Vivo ………. 75
5.4.1 Analisis Kadar MDA, Aktivitas SOD, dan GPx
Sebelum Pemberian Ekstrak Etil Asetat………….. 76
5.4.2 Analisis Aktivitas Superoksida dismutase (SOD)… 78
5.4.3 Analisis Kadar Glutation peroksidase (GPx) …….. 87
5.5. Pemisahan dan Pemurnian Ekstrak Etil Asetat Daun
Pranajiwa ……………………………………………….. 96
5.6. Identifikasi Isolat Flavonoid ……………………………. 101
5.6.1 Identifikasi dengan spektrofotometri UV-Vis ……. 101
5.6.2 Identifikasi dengan spektrofotometri FTIR ………. 104
5.6.3 Hasil penambahan pereaksi geser ………………… 107
BAB VI SIMPULAN DAN SARAN ………………………………... 112
6.1. Simpulan ………………………………………………… 112
6.2. Saran …………………………………………………….. 113
DAFTAR PUSTAKA ………………………………………………… 114
LAMPIRAN ………………………………………………………….. 124
xv
DAFTAR TABEL
Halaman
2.1. Rentangan serapan spektrum UV-Vis flavonoid ……..…………... 34
2.2. Analisis spektrum inframerah senyawa golongan flavonoid ……... 40
5.1. Hasil uji fitokimia terhadap ekstrak etil asetat daun pranajiwa ….. 62
5.2. Nilai % inhibisi dan nilai IC50 ekstrak etil asetat daun pranajiwa
terhadap radikal bebas DPPH ……….…………………………….. 73
5.3. Hasil pengukuran kadar MDA, aktivitas SOD, dan GPx sebelum
pemberian ekstrak etil asetat ……………………………………… 76
5.4. Hasil uji normalitas kadar SOD setelah pemberian ekstrak etil
asetat …………………………………………………………….… 79
5.5. Rerata kadar SOD antar kelompok perlakuan setelah pemberian
ekstrak etil asetat …………………………………………….……. 79
5.6. Analisis aji Post Hoc Aktivitas SOD perlakuan antar kelompok
setelah pemberian ekstrak etil asetat ……………………………… 83
5.7. Hasil analisis uji beda Duncan terhadap aktivitas SOD setelah
pemberian ekstrak etil asetat ……………………………………… 84
5.8. Kenaikan aktivitas SOD ………………………………………….. 85
5.9. Hasil analisis peningkatan aktivitas SOD sebelum dan setelah
pemberian ekstrak etil asetat …………………………………...… 86
5.10. Hasil uji normalitas kadar GPx setelah pemberian ekstrak etil
asetat ……………………………………………………………… 88
5.11. Rerata kadar GPx antar kelompok perlakuan setelah pemberian
ekstrak etil asetat …………………………………………………. 89
5.12. Analisis uji Post Hoc LSD kadar GPx perlakuan antar kelompok
setelah pemberian ekstrak etil asetat ……………………………... 92
5.13. Hasil analisis uji beda Duncan terhadap kadar GPx setelah
pemberian ekstrak etil asetat ……………………………………... 93
5.14. Kenaikan kadar GPx …………………………………………..… 94
5.15. Hasil analisis peningkatan kadar GPx sebelum dan setelah
pemberian ekstrak etil asetat ………………………………….…. 96
5.16. Hasil KLT dengan menggunakan beberapa fase gerak ……….... 97
5.17. Data KLT penggabungan fraksi dari hasil kromatografi kolom… 99
5.18. Hasil uji flavonoid dengan fraksi noda tunggal dari hasil
kromatografi kolom ……………………………………………… 100
5.19. Hasil uji kemurnian secara KLT terhadap isolat FE …………….. 101
5.20. Analisis spektra FTIR isolat FE …………………………………. 106
5.21. Pergeseran panjang gelombang spektra UV-Vis isolat FE ……… 109
xvi
DAFTAR GAMBAR
Halaman
2.1. Karakteristik tumbuhan pranajiwa (Euchresta horsfieldii Lesch Benn.) 8
2.2. Senyawa prenylflavanon pada akar dan batang Euchresta horsfieldii
Lesch Benn. di daerah Yunnan China …………………………… 10
2.3. Senyawa golongan flavonoid pada akar tumbuhan pranajiwa
(Euchresta horsfieldii Lesch Benn.) di daerah Thailand ……….... 11
2.4. Mekanisme reaksi flavonoid dengan DPPH ……………………... 15
2.5. Reaksi kondensasi antara satu molekul MDA dengan dua molekul
TBA pada kondisi asam …………………………………………... 18
2.6. Peroksidasi lipid asam lemak tak jenuh rantai panjang ………..…. 19
2.7. Tiga struktur dasar senyawa flavonoid ………………………….... 21
2.8. Flavonoid berdasarkan struktur molekul …………………………. 22
2.9. Struktur 3,5,7,3’,4’-pentahidroksi flavonol …………..………...... 25
2.10. Struktur asam askorbat ………..………………………………….. 26
2.11. Pembentukan elektron di sitokrom oksidase mitokondria ……..… 30
3.1. Kerangka konsep penelitian …………………………………..….. 44
4.1. Rancangan penelitian …………………………………………….. 46
4.2. Ekstraksi, pemisahan dan pemurnian daun pranajiwa …………… 60
4.3. Penentuan aktivitas antioksidan secara in vivo …………………... 61
5.1. Reaksi yang terjadi pada uji Meyer ……………………………… 63
5.2. Reaksi yang terjadi pada uji Wagner …………………………….. 64
5.3. Reaksi yang terjadi pada uji Liebermann Burchard ……………… 64
5.4. Reaksi yang terjadi pada uji FeCl3 ……………………………….. 65
5.5. Reaksi yang terjadi dengan uji NaOH ……………………………. 66
5.6. Mekanisme reaksi pembentukan garam flavilium ……………….. 67
5.7. Mekanisme reaksi kuersetin dengan AlCl3 ………………………. 69
5.8. Mekanisme reaksi flavonoid dengan DPPH ……………………... 70
5.9. Struktur flavonoid dengan aktivitas antiradikal bebas yang tinggi.. 71
5.10. Aktivitas enzim SOD setelah pemberian ekstrak etil asetat……… 80
5.11. Mekanisme peredaman radikal oleh flavonoid …………………... 81
5.12. Aktivitas SOD sebelum dan setelah pemberian ekstrak etil asetat. 84
5.13. Reaksi GPx mengubah hidrogen peroksida menjadi air ……….... 87
5.14. Kadar GPx pada plasma darah tikus wistar perlakuan setelah
pemberian ekstrak etil asetat ……………………………………... 90
5.15. Kadar GPx sebelum dan setelah pemberian ekstrak etil asetat ….. 93
5.16. Spektrum UV-Vis isolat FE ………………………………………. 102
5.17. Senyawa flavonoid golongan flavonol …………………………… 104
5.18. Spektra FTIR isolat FE ………………………………………….... 105
5.19. Pergeseran spektrum UV-Vis pada isolat FE dengan penambahan
pereaksi geser …………………………………………………… 108
xvii
DAFTAR SINGKATAN
AGEs : Advanced Glycation End Product
ARE : Antioxidant Response Element
ATP : Adenosine Triphospate
BSA : Bovine Serum Albumin
DPPH : 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl
DNA : Deoxyribonucleic acid
EDTA : Ethylene Diamine Tetra Acid
FTIR : Fourier Transform Infra Red
GAEAC : Gallic Acid Equivalent Antioxidant Capacity
GPx : Gluthation Peroksidase
GSH : Glutation tereduksi
HED : Human Equivalen Dose
IC50 : Inhibitory Concentration 50
KLT : Kromatografi Lapis Tipis
Km : Faktor Konversi
MDA : Malondialdehide
NADPH : Nicotinamid adenine dinukleotida fosfat
NBT : Nitro Blue Tetrazolium
Nrf2 : Nuclear factor erythroid 2 related factor 2
8-OHdG : 8-hidroksi-2-dioksiguanosin
ROS : Reactive oxygen spesies
Rf : Retention factor
SOD : Superoxide dismutase
HAT : Hydrogen atom transfer
ET : electron transfer
SPLET : sequential proton loss electron transfer
AITD : autoinmune thyroiditis
TBAR : Thiobarbituric Acid Reactive
xviii
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1. Skema kerja penelitian ………………........................................... 124
1.1.Skema kerja tahap ekstraksi …………………………………… 124
1.2.Skema kerja tahap pemisahan, pemurnian, dan identifikasi ….. 125
1.3.Penentuan aktivitas antioksidan secara in vivo ………………... 126
1.4.Pengukuran kadar malondialdehida (MDA) …………………... 126
1.5.Pengukuran aktivitas superoksida dismutase ………………….. 127
1.6.Pengukuran kadar glutation peroksidase (GPx) ………………. 127
2. Pembuatan larutan ………………………………………………… 128
2.1.Larutan uji fitokimia …………………………………………... 128
2.2.Larutan uji total flavonoid …………………………………….. 128
2.3.Larutan uji antioksidan metode DPPH ………………………... 129
2.4.Perhitungan pembuatan larutan sampel ……………………….. 129
2.5.Pembuatan pereaksi geser ……………………………………... 130
3. Perhitungan konsentrasi dan kandungan total flavonoid ………….. 131
4. Pengukuran aktivitas antioksidan ………………………………….. 133
4.1.Nilai IC50 ………………………………………………………. 133
4.2.Kapasitas antioksidan …………………………………………. 134
5. Hasil pengukuran kadar MDA plasma darah tikus yang diberi
Aktivitas fisik maksimal …………………………………………… 136
6. Hasil pengukuran aktivitas SOD dan kadar GPx yang diberi
Aktivitas fisik maksimal …………………………………………… 137
6.1.Data pengukuran aktivitas SOD ……………………………….. 137
6.2.Data pengukuran kadar GPx …………………………………… 138
7. Hasil uji statistik masing-masing perlakuan terhadap aktivitas
SOD tikus setelah pemberian ekstrak etil asetat …………………… 139
8. Hasil uji statistik masing-masing perlakuan terhadap kadar GPx
tikus setelah pemberian ekstrak etil asetat………………………….. 142
9. Hasil pengukuran aktivitas SOD dan GPx rata-rata sebelum dan
setelah pemberian ekstrak etil asetat ……………………………….. 145
10. Persentase kenaikan SOD dan GPx ………………………………… 147
10.1. Persentase kenaikan superoksida dismutase …………………. 147
10.2. Persentase kenaikan kadar glutation peroksidase ……………. 147
11. Profil hasil kromatografi lapis tipis ………………………………… 149
11.1. Profil hasil KLT pemilihan eluen ……………………............. 149
11.2. Profil hasil KLT penggabungan ……………………………… 150
11.3. Profil hasil KLT uji kemurnian ………………………………. 151
12. Perhitungan Rf ……………………………………………………… 152
13. Penafsiran warna bercak dari segi struktur flavonoid ……………… 156
14. Penafsiran spektrum dengan penambahan pereaksi geser …………. 158
15. Hasil determinasi tumbuhan pranajiwa (Euchresta horsfieldii Lesch
Benn.) ………………………………………………………………. 161
16. Foto-foto penelitian ………………………………………………… 161
16.1. Persiapan sampel ………..…………………………………… 163
xix
16.2. Persiapan sampel dan ekstraksi ……………………………… 164
16.3. Uji total flavonoid dan uji antioksidan dengan DPPH …..….. 165
16.4. Uji antioksidan secara in vivo ……………………………….. 166
xx
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Stres oksidatif adalah meningkatnya radikal bebas di dalam tubuh, serta
menurunnya kemampuan tubuh untuk menetralisir radikal bebas sehingga dapat
terjadi gangguan fungsi sel. Faktor internal utama yang menimbulkan stres
oksidatif adalah oksidasi fosforilasi akibat melakukan aktivitas fisik maksimal.
Selama aktivitas fisik akan terbentuk radikal bebas bersamaan dengan reaksi
oksidasi fosforilasi untuk membentuk Adenosine Triphospate (ATP) dalam
mitokondria. Pada reaksi tersebut dibutuhkan oksigen yang mana oksigen akan
bereaksi dengan hidrogen untuk membentuk air, tetapi sejumlah oksigen dapat
berubah menjadi radikal bebas. Dengan demikian semakin berat aktivitas fisik
maka dibutuhkan semakin banyak ATP, juga semakin banyak radikal bebas yang
dihasilkan sebagai produk samping (Pangkahila, 2007).
Radikal bebas dapat merusak membran sel, protein, dan DNA yang berakibat
fatal bagi kelangsungan hidup sel/jaringan. Radikal bebas dapat diredam baik
secara enzimatik maupun non-enzimatik oleh senyawa-senyawa yang termasuk
antioksidan. Antioksidan enzimatik seperti Superoxide dismutase (SOD),
Gluthation peroksidase (GPx), dan Catalase (CAT). Untuk antioksidan non
enzimatik dapat berupa mikronutrien pada buah, sayur-sayuran, dan tanaman lain
seperti vitamin A, C, E, asam folat, antosianin, senyawa fenol, dan flavonoid
(Edyson, 2003).
xxi
Tubuh sebenarnya telah mempunyai kemampuan untuk menetralisir radikal
bebas dengan adanya antioksidan endogen seperti Superoxide dismutase (SOD)
dan Gluthation Peroksidase (GPx). Antioksidan tersebut akan menangkal atau
meredam dampak negatif radikal bebas dalam tubuh dengan cara mendonorkan
elektronnya kepada radikal bebas sehingga aktivitas radikal bebas tersebut dapat
dihambat. Akan tetapi jika aktivitas fisik dilakukan secara maksimal maka
dihasilkan radikal bebas yang lebih banyak. Dalam kondisi demikian antioksidan
endogen tidak mampu lagi mengimbangi pembentukan radikal bebas sehingga
akan menyebabkan terjadinya stres oksidatif (Bagiada, 2001).
Untuk meningkatkan aktivitas antioksidan endogen dalam mencegah
terjadinya stres oksidatif maka diperlukan tambahan antioksidan dari luar tubuh
(antioksidan eksogen) yang dapat diperoleh dari asupan makanan dan minuman
yang dikonsumsi tiap hari. Antioksidan tersebut akan meredam radikal bebas
dengan cara mendonorkan elektronnya baik pada tahap inisiasi, propagasi maupun
tahap terminasi. Antioksidan eksogen merupakan jenis antioksidan alami yang
berasal dari kandungan mikronutrien, salah satunya adalah senyawa golongan
flavonoid. Keberadaan flavonoid tersebut dapat membantu kerja superoksida
dismutase dalam tubuh dengan menangkal radikal bebas yang terbentuk akibat
aktivitas fisik maksimal tersebut. Flavonoid berpotensi sebagai antioksidan karena
mampu menyumbangkan ion H+ pada senyawa radikal bebas. (Kandaswami dan
Midelton, 1997).
Hal ini di dukung oleh hasil penelitian yang dilakukan oleh Widayanti (2015)
menyatakan bahwa fraksi n-butanol terong belanda memiliki aktivitas antioksidan
yang kuat dengan nilai IC50 sebesar 69,89 mg/L dan dapat meningkatkan aktivitas
xxii
SOD dan menurunkan kadar MDA. Fraksi n-butanol tersebut diduga mengandung
senyawa flavonoid golongan flavon, flavonol, dan isoflavon yang mungkin
berkontribusi sebagai antioksidan alami. Penelitian Sugianto (2011) menyebutkan
bahwa pemberian jus delima merah dapat meningkatkan kadar GPx pada darah
mencit dengan aktivitas fisik maksimal. Hasil penelitian Wresdiyanti et al. (2013)
menyatakan bahwa α-tokoferol dapat meningkatkan SOD dan menurunkan MDA
jaringan hati tikus di bawah kondisi stres. Menurut Gunawan et al. (2015)
pemberian ekstrak biji pranajiwa dengan dosis 0,5; 2; dan 5 mg/kg bb/ hari dapat
memperbaiki laju kerusakan sel-β pankreas dengan indikasi menurunnya kadar
glukosa darah, AGEs (Advanced Glycation End Product), MDA
(Malondialdehid), dan 8-OHdG (8-hidroksi-2-dioksiguanosin) pada tikus Wistar
hiperglikemia.
Menurut Heyne (1987), tumbuhan Pranajiwa (Euchresta horsfieldii Lesch
Benn.) merupakan salah satu tumbuhan tradisional yang digunakan untuk obat
kencing manis, obat asma, obat batuk, afrodisiak, dan merangsang muntah akibat
keracunan makanan. Akar dan batang tumbuhan pranajiwa mengandung
flavonoid, isoflavon, pterocarpan, caumaronochromon dan flavonon. Jenis
flavonoid yang terdapat pada daun adalah apigenin. Bijinya mengandung alkaloid
berupa cytosine (1,5%), matrine dan matrine-N-oxide (Ardaka et al., 2011 dan
Matsuura, et al., 1994).
Menurut penelitian Mizuno et al. (1990a,b,c) pada akar dan batang tumbuhan
pranajiwa mengandung senyawa golongan flavonoid. Di Yunnan (Cina), pada
bagian akar dan batang tumbuhan pranajiwa ditemukan flavanon (glabrol),
pterocarpan (maackiain), ester asam firulat, dan dua prenilflavanon (euchrenon a7
xxiii
dan a8). Sedangkan di Thailand ditemukan empat isoflavon (warangalone, osajin,
6,8-di(3-metil-2-butenil) genistein dan 8-O-methylretusin) dan dua pterocarpans
(maackiain dan sophoracarpan B).
Menurut Sari, dkk. (2015), isolat aktif ekstrak n-heksana daun pranajiwa pada
konsentrasi 8000 ppm memiliki aktivitas antiradikal bebas dengan persentase
peredaman sebesar 94,67%. Sedangkan menurut penelitian Tirta et al. (2010)
menyatakan bahwa kapasitas antioksidan pada ekstrak n-heksana daun pranajiwa
yaitu sebesar 126,94 ppm GAEAC (Gallic Acid Equivalent Antioxidant Capacity).
Berdasarkan hasil penelitian mengenai tumbuhan pranajiwa tersebut, maka
dilakukan uji pendahuluan fitokimia untuk daun pranajiwa. Uji pendahuluan
fitokimia menunjukkan bahwa daun pranajiwa mengandung senyawa fenol,
alkaloid, steroid/terpenoid, saponin, dan flavonoid. Senyawa golongan flavonoid
kemungkinan berperan penting dalam aktivitas antioksidan pada daun pranajiwa.
Menurut Nijveidt et al. (2001), senyawa flavonoid diketahui memiliki sejumlah
kemampuan yaitu dapat menghambat pembentukan radikal bebas hidroksil, anion
superoksida, radikal peroksil, radikal alkoksil, singlet oksigen, hidrogen
peroksida. Mekanisme kerja antioksidan flavonoid yaitu menekan pembentukan
radikal bebas atau ROS (Reactive Oxygen Spesies) dengan cara menghambat
enzim, pengkelatan ion logam (metal ion chelating) yang terlibat produksi radikal
bebas dan meredam radikal bebas (free radical scavengers).
Analisis senyawa golongan flavonoid lebih baik dilakukan dengan
memeriksa aglikon flavonoid yang terdapat dalam ekstrak tumbuhan tersebut.
Karena senyawa flavonoid glikosida yang mengikat gugus gula cenderung lebih
mudah larut dalam air sehingga lebih rumit dalam proses pemisahannya. Aglikon
xxiv
flavonoid yang tidak mengikat gugus gula dan bersifat kurang polar yang
cenderung larut dalam pelarut semipolar seperti etil asetat. Senyawa golongan
aglikon flavonoid diantaranya isoflavon, flavonon, flavon serta flavonol yang
termetoksi (Harborne,1987 dan Markham, 1988). Oleh sebab itu dilakukan
analisis aglikon flavonoid pada ekstrak etil asetat daun pranajiwa.
Berdasarkan beberapa penelitian tersebut, dapat dinyatakan daun pranajiwa
merupakan salah satu sumber antioksidan, akan tetapi belum ada penelitian yang
melaporkan tentang peranan ekstrak etil asetat daun pranajiwa dalam
meningkatkan aktivitas superoksida dismutase (SOD) dan kadar glutation
peroksidase (GPx) pada tikus Wistar yang mengalami stres oksidatif setelah
aktivitas fisik maksimal. Dengan dasar pemikiran tersebut maka pemberian
ekstrak etil asetat daun pranajiwa pada tikus Wistar setelah mengalami aktivitas
fisik maksimal masih perlu diteliti lebih lanjut.
1.2 Rumusan Masalah
Berdasarkan uraian di atas, maka permasalahan yang dapat dirumuskan adalah
sebagai berikut :
1. Apakah pemberian ekstrak etil asetat daun pranajiwa (Euchresta horsfieldii
Lesch Benn.) dapat meningkatkan aktivitas Enzim Superoksida Dismutase
(SOD) dan kadar Glutation Peroksidase (GPx) pada darah tikus Wistar (Rattus
norvegivus) dengan aktivitas fisik maksimal?
2. Senyawa flavonoid golongan apakah yang aktif memberikan aktivitas
antioksidan yang terkandung dalam ekstrak etil asetat daun pranajiwa ?
xxv
1.3 Tujuan Penelitian
Berdasarkan rumusan masalah yang dipaparkan, maka tujuan dalam penelitian
ini sebagai berikut :
1. Mengetahui aktivitas ekstrak etil asetat daun pranajiwa (Euchresta horsfieldii
Lesch Benn.) dalam meningkatkan enzim superoksida dismutase dan glutation
peroksidase pada darah tikus Wistar (Rattus norvegivus) dengan aktivitas fisik
maksimal.
2. Menentukan golongan flavonoid yang aktif sebagai antioksidan yang
terkandung dalam ekstrak etil asetat daun pranajiwa (Euchresta horsfieldii
Lesch Benn.).
1.4 Manfaat Penelitian
Manfaat yang dapat diperoleh dari penelitian ini untuk perkembangan ilmu
pengetahuan dan teknologi adalah menambah informasi mengenai aktivitas
antioksidan ekstrak etil asetat daun pranajiwa (Euchresta horsfieldii Lesch Benn.)
terhadap superokside dismutase dan glutation peroksidase pada darah tikus Wistar
(Rattus norvegivus) dengan aktivitas fisik maksimal. Selain itu, penelitian ini
memperkaya informasi mengenai golongan flavonoid yang aktif sebagai
antioksidan yang bersumber dari ekstrak etil asetat daun pranajiwa. Manfaat
praktis dalam penelitian ini adalah menambah pengetahuan dan informasi bagi
masyarakat tentang khasiat daun pranajiwa bagi kesehatan yaitu sebagai salah satu
sumber antioksidan alternatif serta untuk mencegah penuaan.
xxvi