podmÍnky pĚstovÁnÍ kultur in vitro
DESCRIPTION
PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR IN VITRO. Potřebné látky , které je celistvá rostlina schopna syntetizovat v dostatečném množství a transportovat na místo určení , mohou být explantátem syntetizovány v nedostatečné míře nebo vůbec (je třeba dodat - heterotrofie). - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
![Page 1: PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR IN VITRO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081418/568146a0550346895db3bb07/html5/thumbnails/1.jpg)
PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR IN VITROIN VITRO
Potřebné látkyPotřebné látky, které je celistvá rostlina schopna syntetizovat v dostatečném množství a transportovat na místo určení, mohou být explantátem syntetizovány v nedostatečné míře nebo vůbec (je třeba dodat - heterotrofie).
Stresové situaceStresové situace, se kterými se celistvá rostlina vypořádá, není často explantát schopen řešit a zvládnout.
Nutnost indukce organogenních zmindukce organogenních změěnn vyžaduje zabezpečení indukčních podmínek jak fyzikálních, tak chemických.
Teplota Světlo Vlhkost Složení plynné fáze Složení médií Aseptická
kultivace Ošetření mateřských rostlin Typ explantátu
![Page 2: PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR IN VITRO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081418/568146a0550346895db3bb07/html5/thumbnails/2.jpg)
Příprava
a komponenty kultivačních médií
![Page 3: PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR IN VITRO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081418/568146a0550346895db3bb07/html5/thumbnails/3.jpg)
komponenty kultivačních médií
minerální soli • makroelementy (nad 0,5mmol/l)• mikroelementy
zdroj uhlíku a energie
vitaminy
růstové regulátory
zdroje org. dusíku (aminokyseliny apod.)
další organické doplňky
![Page 4: PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR IN VITRO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081418/568146a0550346895db3bb07/html5/thumbnails/4.jpg)
Makroelementy:
N (25-60mM) - NH4 (2-20mM) (nitrátreduktáza),
- NO3(25-40mM) (ne samotnýpH)
bílkoviny, aminokyseliny
P (1-3mM) - H2PO3, - HPO3, (- PO3)
energetický metabolismus - ATP;
DNA, RNA; fosfolipidy
K (20-30mM) - osmotická regulace, pH a iontová rovnováha
![Page 5: PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR IN VITRO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081418/568146a0550346895db3bb07/html5/thumbnails/5.jpg)
Makroelementy:
S (1-3mM) - obranné reakce (glutathion, flavonoidy)
Ca (1-3mM) - transport, signály, membrána,
iontová rovnováha, zakořenění,
buněčné dělení
Mg (1-3mM) - enzymy, syntéza DNA, fotosyntéza
![Page 6: PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR IN VITRO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081418/568146a0550346895db3bb07/html5/thumbnails/6.jpg)
Mikroelementy: Fe (0,1 mM)- (FeNaEDTA - etylendiaminotetraoctová kys.) do
pH8
přenašeče el., proteiny - nitrátreduktáza, biosyntéza chlorofylu,
Zn (5-30 M) - enz. např alkohol dehydrogenáza v meristémech, účast při syntéze proteinů
Mn (20-90 M)- metaloproteiny, Hillova reakce (rozklad vody při fotosyntéze)
Mo (1 M)- kofaktor v nitrátreduktáze
Cu (0,1 M)- redoxní reakce, fotosyntéza
B (25-100 M) stabilita membrán
![Page 7: PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR IN VITRO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081418/568146a0550346895db3bb07/html5/thumbnails/7.jpg)
• Zdroje C (sacharidy) 2-5%• sacharoza• glukoza• fruktoza (*termolabilní)• laktoza• maltoza (*)• škrob• inositol (do 0,5%)• (polyetylenglykol, manitol, sorbitol apod.)
![Page 8: PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR IN VITRO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081418/568146a0550346895db3bb07/html5/thumbnails/8.jpg)
Vitamíny (*)• hlavně skupiny B (0,1-10mg/l) (kvasniční
extrakt): B1(thiamin), k. nikotinová, B6 pyridoxin• k. pantothenová• biotin, cholin chlorid• k. listová, k. p-aminobenzoová• riboflavin• k. askorbová jako antioxidant • (myo-inositol (50-5000mg/l))
![Page 9: PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR IN VITRO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081418/568146a0550346895db3bb07/html5/thumbnails/9.jpg)
Růstové regulátory
auxiny - • IAA * • NAA(2x), IBA(2x), 2,4-D (8-12x),
Picloram (2-4x)(4-amino,3,5,6-trichloropikolinová
kys.)
(2,4,5-T(4x), pCPA)
![Page 10: PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR IN VITRO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081418/568146a0550346895db3bb07/html5/thumbnails/10.jpg)
Působení auxinů in vitro
• indukce kalusu a jeho růst • podporuje dělení buněk konc (v poměru k CK) kořeny konc (v poměru k CK) prýty konc - indukce somatické embryogeneze• inhibice axilár (apikální dominance)• indukce kořenů x inhibice prodl. růstu kořenů
![Page 11: PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR IN VITRO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081418/568146a0550346895db3bb07/html5/thumbnails/11.jpg)
cytokininy • 2iP *, zeatin*• BAP (6-benzylaminopurin) (*)
• kinetin (furfurylaminopurin) *• adenin *• TDZ thidiazuron *
![Page 12: PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR IN VITRO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081418/568146a0550346895db3bb07/html5/thumbnails/12.jpg)
Působení cytokininů in vitro konc prýty • dělení buněk• (SE indukce somatické embryogeneze)• indukce kalusu a jeho růst• stimulace růstu axilárních pupenů• inhibice tvorby kořenů• inhibice prodlužování prýtů• oddálení stárnutí listů konc - riziko hyperhydricity (vitrifikace)
![Page 13: PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR IN VITRO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081418/568146a0550346895db3bb07/html5/thumbnails/13.jpg)
Vitrifikace hyperhydricita
Fyziologický stav:
•Příčiny vitrifikacePříčiny vitrifikace vysoká relativní vlhkost etylén cytokininy
?? NH4+
Nutnost snížit R.H., zvýšit výměnu vzduchu, snížit obsah cytokininů
![Page 14: PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR IN VITRO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081418/568146a0550346895db3bb07/html5/thumbnails/14.jpg)
Vitrifikace hyperhydricita
Fyziologický stav:
ztluštělé stonky i listy, světle zelené, křehké s abnormálním sklovitým vzhledem nadměrný příjem vody narušené stomatální uzavírání změny ve složení epikutikulárních vosků defektní kutikula redukovaná vodivá pletiva velké mezibuněčné prostory v houbovém parenchymu disbalance mezi buněčným dělením a diferenciací (lignin, celulóza) změny ve stavbě buněčných stěn velké vakuoly
![Page 15: PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR IN VITRO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081418/568146a0550346895db3bb07/html5/thumbnails/15.jpg)
gibereliny GA3 GA7 *
Působení in vitro • prodlužování prýtů• vymanění z dormance:
semen, SE, apikálních pupenů, hlíz• inhibice tvorby adventivních kořenů
![Page 16: PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR IN VITRO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081418/568146a0550346895db3bb07/html5/thumbnails/16.jpg)
k. abscisová ABA*
působení in vitro • maturace SE• usnadnění aklimatizace• formování hlíz a cibulí• vstup do dormance
![Page 17: PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR IN VITRO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081418/568146a0550346895db3bb07/html5/thumbnails/17.jpg)
Další látky s růstově regulační povahouPolyaminy (spermin, spermidin a putrescin)*• indukce adventivních kořenů• indukce prýtů• podpora SE
Jasmonová kyselina *• podpora tvorby hlíz• podpoření formování meristému
Fenolické látky- k. salicylová (obranné reakce), trans-skořicová (antiauxin) apod.
![Page 18: PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR IN VITRO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081418/568146a0550346895db3bb07/html5/thumbnails/18.jpg)
Organické dusíkaté látky -
• L- aminokyseliny - glycin (2mg/l),
glutamin (*) (150-400), asparagin (100),
cystein (10)
• peptidy (*) nebo jejich ne přesně definované směsi: pepton, trypton
kazein hydrolyzát (0,2-1g/l)
![Page 19: PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR IN VITRO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081418/568146a0550346895db3bb07/html5/thumbnails/19.jpg)
Nedefinované doplňky media
• kvasniční (yeast) a sladový (malt) extrakt, • kokosové mléko, pomeranč., rajč. a mrkvový džus,
banánový homogenát, březová míza
• huminové sloučeniny
![Page 20: PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR IN VITRO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081418/568146a0550346895db3bb07/html5/thumbnails/20.jpg)
Moderátory pH pufry
Moderátory oxidace, produkce a kumulace fenolických látekaktivní uhlí (0,1 - 0,5%) pohlcuje i část RR!
PVP - polyvinil pyrolidon (250-1000 mg/l)
k. askorbová a citronová (po 100 mg/l) L-cystein (10 mg/l)thiourea, dithiothreitol
![Page 21: PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR IN VITRO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081418/568146a0550346895db3bb07/html5/thumbnails/21.jpg)
Další doplňky media
• Antibiotika *
(penicilin, ampicilin, bacitracin, gramicidin, neomycin, nystatin, cefotaxim, ticarcilin, timentin, kanamycin aj.)
• Prekurzory a elicitory
(produkce sekundárních metabolitů)
• Odpěňovací prostředky (bioreaktory)
![Page 22: PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR IN VITRO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081418/568146a0550346895db3bb07/html5/thumbnails/22.jpg)
Ztužovací látky
Agar (0,6-1%) - polymer galaktózy (agarózy) - z buněčných stěn řas (Sphaerococcus euchema, Gelidium a Gracilaria)
• teplota (snese opakované roztavení)• pH (optimum 5,5-5,8) pH<4 neztuhne• čistota
![Page 23: PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR IN VITRO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081418/568146a0550346895db3bb07/html5/thumbnails/23.jpg)
Ztužovací látky
Gelrit (0,2-0,35%) glukóza, glukuronová kyselina a rhamnóza - tetrasacharid
gel jen za přítomnosti iontů Ca2+ a Mg2+
pH 4 4.92g/L
pH 5 2.93g/L
pH 6 1.36g/L
pH 7 0.64g/L
pH 8 0.50g/L
pH 9 0.40g/L
• čirý
• nesnese opakované zahřátí!
![Page 24: PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR IN VITRO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081418/568146a0550346895db3bb07/html5/thumbnails/24.jpg)
Ztužovací látky
• Phytagel (Mg, Ca)• biogel P200 (polyacrylamidová blanka)
• agargel (směs agaru a synt. gelu)
• alginát (protoplastové kultury)
• agaróza
• rozpustný škrob
![Page 25: PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR IN VITRO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081418/568146a0550346895db3bb07/html5/thumbnails/25.jpg)
Osmotikamanitol, inositol PEG 4000 - polyetylene glycol
![Page 26: PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR IN VITRO](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022081418/568146a0550346895db3bb07/html5/thumbnails/26.jpg)
pH
• Po autoklavování pokles o cca 0,3-0,5
(pH 4,5 a 7 hranice; pH 5-6 optimum)