Linköping University Medical Dissertations No. 1176 

    

Platelets in inflammation  

Role of complement protein C1q, C­reactive protein and toll­like receptors 

   

Caroline Skoglund      

  

  

Division of Drug Research Department of Medical and Health Sciences 

Faculty of Health Sciences Linköping University, SWEDEN 

 Linköping 2010 

1

                    © Caroline Skoglund 2010  ISBN 978­91­7393­418­3 ISSN 0345­0082   over:  Adhering platelets stained for F‐actin and visualized Cwith fluorescence microscopy  During the course of research underlying this thesis, Caroline Skoglund was enrolled in Forum Scientium. A multidisciplinary doctoral program at Linköping University, Sweden    Printed by LiU­tryck, Linköping, Sweden, 2010 

2

                

  

 

“I find that a great part of the information I have wfas acquired by looking up something and inding something else on the way”   (Franklin P. Adams 1881‐1960) 

          

   

3

 

4

ABSTRACT  Platelets  are  proven  essential  in  haemostasis,  however,  they  are  now  also increasingly  recognized  as  cells  with  important  immunomodulatory properties,  e.g.  through  interaction  with  leukocytes  and  several  species  of bacteria and by  release  inflammatory mediators upon activation. Moreover, platelets  express  receptors  involved  in  immunity  and  inflammation  such as Fcγ‐receptor  IIa,  complement  protein  C1q‐receptors  (gC1qR,  cC1qR,  CD93 and  α2β1)  and  toll‐like  receptors  (TLR‐1,  ‐2,  ‐4,  ‐6  and  ‐9).  C1q,  C‐reactive protein  (CRP)  and  TLRs  are  all  pattern  recognition  molecules  able  to recognize non‐self structures and initiate an immune response. Uncontrolled or misdirected activation of platelets and the immune response is involved in the  onset  and  progress  of  several  conditions  with  an  inflammatory component, such as coronary artery disease and autoimmune diseases.  Hence,  the  aims  of  the  present  thesis  were  to  investigate  the  effects  and 

q mechanisms  of  C1 and  CRP  on  platelet  activation,  and  to  clarify  the intracellular signaling events provoked by TLR‐2 stimulation of platelets.  Platelet  interaction with  immune complexes  is poorly understood, however by  utilizing  well‐characterized  model  surfaces  with  adsorbed  IgG  and microscopy,  we  show  that  both  C1q  and  CRP  are  able  to  inhibit  FcγR‐mediated  platelet  adhesion  and  spreading.  Using  isolated  platelets  in suspension  and  flow  cytometry,  we  also  found  that  C1q  triggers  a  rapid, moderate  and  transient  up‐regulation  of  P‐selectin  that  is  sensitive  to blockade  of  gC1qR  and  protein  kinase  C  (PKC),  but  not  blockade  of  α2β1. Additionally,  subsequent  platelet  activation  by  collagen  or  collagen‐related peptide (GPVI specific) is inhibited by C1q, suggesting a role for GPVI in C1q‐mediated  regulation  of  collagen‐induced  platelet  activation.  Whole  blood studies revealed that C1q inhibits total cell aggregation, formation of platelet‐leukocyte  aggregates,  and  potentiates  the  production  of  reactive  oxygen species  (ROS),  all  in  a  platelet‐dependent  manner.  Furthermore,  using  the TLR‐2/1 agonist Pam3CSK4 we  found  that TLR‐2/1‐activation of platelets  is mediated via a P2X1‐dependent  increase  in  intracellular  free Ca2+, P2Y1 and P2Y12 –receptor ligation, and activation of cyclooxygenase. We also found that platelets  express  IRAK‐1,  however,  without  being  rapidly  phosphorylated upon  Pam3CSK4  stimulation  and  thus  probably  not  involved  in  the  early aggregation/secretion response. Furthermore, TLR‐2/6 stimulation does not lead to platelet activation but  instead  inhibits TLR‐2/1‐provoked activation. 

i

Taken together, these findings further strengthen the role of platelets as key layers in inflammatory processes.    p  

ii

iii 

POPULÄRVETENSKAPLIG SAMMANFATTNING  Blodplättarna  (trombocyterna)  har  en  viktig  roll  i  hemostasen,  d.v.s.  den process som hjälper till att stoppa en blödning som uppstått då ett blodkärl skadats. När blodplättarna aktiveras blir de större, ändrar form och klumpar ihop sig (aggregerar), allt för att täppa till och förhindra blodförlust. Förutom denna  uppgift,  så  har  det  på  senare  år  även  visat  sig  att  blodplättarna  har andra viktiga egenskaper, till exempel så medverkar de i den inflammatoriska processen. Inflammation är en viktig del i kroppens försvar mot framför allt bakterieinfektioner,  då  immunförsvaret  jobbar  hårt  för  att  bekämpa  de skadliga  inkräktarna.  Blodplättarna  kan  bland  annat  samverka  med             vita  blodkroppar  och  frisätter  ämnen  som  påverkar  såväl  dom  själva           som  andra  typer  av  celler.  På  sin  yta  uttrycker  blodplättarna  olika igenkänningsmolekyler, så kallade receptorer, som binder in och reagerar på specifika  ämnen,  vilket  ofta  leder  till  aktivering.  Under  den  tidiga  fasen  av inflammationen ökar blodets nivåer  av C‐reaktivt protein  (CRP)  snabbt och komplementsystemet, som är en viktig del av vårt medfödda immunförsvar, aktiveras. C1q är ett av proteinerna som ingår i komplementsystemet. Det har också  visat  sig  att  blodplättar  kan  aktiveras  av  vissa  bakterier,  t.ex.  via receptorer på blodplättarna som kallas toll‐lika receptorer (TLR:er), och som reagerar  på  olika  bakteriestrukturer.  Idag  vet  vi  att  en  okontrollerad  eller felriktad aktivering av blodplättar och ett immunförsvar i obalans kan bidra till  inflammatoriska  sjukdomar  som  hjärt‐kärlsjukdom  och  autoimmuna sjukdomar. Det är därför viktigt att förstå de bakomliggande mekanismerna.  Syftet  med  studierna  som  ingår  i  den  här  avhandlingen  var  således  att studera hur C1q och CRP påverkar aktivering av blodplättar samt att klargöra hur aktivering via TLR‐2/1 går  till,  genom att undersöka vilka  signaler som skickas inuti cellen. Resultaten visar att CRP och C1q minskar blodplättarnas förmåga att binda in till  och  sprida  ut  sig  på  en  IgG‐yta,  som  normalt  är  en  kraftigt blodplättsaktiverande  yta.  Vidare  fann  vi  att  C1q  som  ges  till  blodplättar  i lösning, ökar uttrycket av P‐selektin på ytan av blodplättarna, och att detta beror  på  aktivering  av  receptorn  gC1qR  och  enzymet  proteinkinas  C. Dessutom  så  såg  vi  att  C1q  hämmar  den  fortsatta  aktiveringen  av blodplättarna  som  uppkommer  om man  tillsätter  kollagen.  Kollagen  är  ett protein  som  finns  rikligt  i  kärlväggen  och  som  vid  en  kärlskada  exponeras och har  aktiverande verkan på blodplättar. Därför  är det mycket  intressant 

iv 

om C1q kan  fungera  som en naturlig  regulator  för denna process.  I helblod fann vi också att C1q hämmar aggregatbildningen mellan blodplättar och vita blodkroppar,  och  samtidigt  ökar  produktionen  av  reaktiva  syremetaboliter. Reaktiva  syremetaboliter  är  viktiga  för  att  bekämpa  bakterier  vid  en infektion. Genom att använda Pam3CSK4, en molekyl som specifikt aktiverar blodplättarna via TLR‐2/1‐receptorn, såg vi att aktiveringen är beroende av en  ATP‐receptorförmedlad  frisättning  av  kalcium  inuti  cellen.  Dessutom  är aktivering  av  enzymet  cyklooxygenas  och  de  båda  receptorerna  för  ADP (P2Y1 and P2Y12) inblandade.  Sammantaget så visar resultaten att C1q, CRP och TLR:er, som alla medverkar i  vårt  immunförsvar,  också har  förmåga att  reglera blodplättarnas aktivitet. Dessa rön bidrar till en bättre förståelse av blodplättarnas roll och beteende id inflammation och kan i framtiden leda till utveckling av nya läkemedel för tt reglera blodplättarnas aktivitet vid kroniska inflammatoriska sjukdomar.  va                        

v 

                                   

vi 

TABLE OF CONTENTS    ABSTRACT............................................................................................................................i  POPULÄRVETENSKAPLIG SAMMANFATTNING.................................................... iii  TABLE OF CONTENTS.................................................................................................... vi  ABBREVIATIONS...............................................................................................................8  LIST OF PAPERS ................................................................................................................9  

....on ............................................................................ 11

INTRODUCTION .......................spects of inflammatiecognition receptors ................................................................................ 11

..................................................................................11 General aPattern rPlatelets .................................................................................................................... 12

Biology, structure and function ......................................................................... 12 Platelet granules..............

................................................................................ 16

................................................................................... 13 Platelet receptors ...............

...ction ................................................................................ 17

................................................................................ 14 Platelet‐bacteria interaction

........................................................................................ 17 Platelet‐leukocyte intera

........................................................................................ 18 Neutrophils ......................The complement‐system.Complement protein C1q ........................................................................................ 20

Structure and synthesis ...................................................................................... 20 C1q receptors ..Cellular effects

C‐reactive protein .................................................................................................... 22

.................................................................................................... 21

.................................................................................................... 21

Historical background........................................................................................ 22 Structure, synthesis and ligands ........................................................................ 22 Complement acCellular effects and

Toll‐like receptors ................................................................................................... 25

tivation and regulation by CRP ................................................ 23  role in inflammation .......................................................... 24

Structure, ligands and function ......................................................................... 25 TLR signaling ...................................................................................................... 25 TLR­2 .......TLR expres

Fcγ receptors............................................................................................................ 27

............................................................................................................ 26 sion and function in platelets .......................................................... 27

 AIMS...................................................................................................................................29  COMMENTS ON METHIsolation of blood cells ............................................................................................ 31

ODS..........................................................................................31

vii 

Platelets (Paper I, II and IV)............................................................................... 31 Neutrophils (Paper II) ................................

ear cells (PaperIV) .....................sorption ........................................................ 32

........................................................ 31 Mononucl

......................................................................... 33

........................................................ 32 Surface methylation and protein adEllipsometry ....................................Platelet adhesion and morphology ........................................................................ 33

Platelet adhesion to coverslips with adsorbed IgG and HSA ............................ 34 Fluorescence microscopy an

te................................................ 35

d image analysis................................................... 34 Enzymatic detection of pla

................................................ 35

let adhesion to collagen­coated microplates ..... 35 Phosphatidylserine expression ..............................

roduction ..................................selectin expression................................................ 35

Thromboxane B2 pt

......................... 36 Flow cytome ry analysis of P‐

......................... 36 Soluble P‐selectin............................................................................

.................. secretion ........................ 37

Cytosolic Ca2+ measurements ......................................gometry and dense granule

 whole blood .......................................... 38 Light‐transmission aggre

................................................................. 38 Luminol‐dependent ROS‐production in

.....................te formation ................................................................ 38

Whole blood aggregation ..eukocyte aggregablot experiments ...................................................................................... 39

Platelet‐lWestern Statistics ................................................................................................................... 39  SUMMARY OF PAPERS .................................................................................................41  RESULTS & DISCUSSION..............................................................................................43

a‐mediated platelet adhesion                      3

Inhibitory effects of C1q and CRP in FcγRII

6 and activation........................................................................................................... 4Adhesion of platelets to ligand‐bound CRP ........................................................... 4

gulates collagen and                                 . 48

C1q induces P‐selectin expression and re

. 51 collagen‐related peptide activation in washed platelets in suspension ............Regulatory effects of C1q in whole blood .............................................................TLR‐2/1‐activation of platelets is mediated by ATP‐dependent                           Ca2+ increases, ADP receptors and activation of cyclooxygenase ....................... 54  CONCLUSIONS.................................................................................................................57  ACKNOWLEDGEMENTS ...............................................................................................59  REFERENCES ...................................................................................................................63     

8 

ABBREVIATIONS  ACD  acid‐citrate dextrose solution ADP  adenosine diphosphate 

sphate n 1q 

ATP  adenosine triphoC1q   complement proteiCOX  cyclooxygenase 

 CRP C‐reactive protein HSA   human serum albumin 

1  ciated kinase‐1 IgG  immunoglobulin G IRAK‐ interleukin‐1 receptor assoKRG  Krebs‐Ringers glucose 

ex 2  crophage‐activating lipopeptide‐2 

MAC  membrane attack complived maMALP‐ mycoplasma‐der

MBL  mannose binding lectin mCRP  monomeric CRP 

 SK

MyD88 myeloid differentiation factor 88 Pam3C 4  s)triacylated lipopeptide Pam3Cys‐Ser‐(Ly

rn 4 

PAMP  pathogen associated molecular patter 

C  lear cells PAR  protease activated recepto

nonuc saline 

PBM peripheral blood moPBS  phosphate bufferedPCh  phosphorylcholine 

e   ‐3‐kinase 

PFA  paraformaldehydPI3‐K phosphoinositidePKC  protein kinase C 

   PLC  phospholipase C PRM pattern recognition molecule

 PRP platelet rich plasma PRR  pattern recognition receptor 

‐1  igand‐1 PS  phosphatidylserine 

otein lPSGL P‐selectin glycoprROS  reactive oxygen species 

r   r activating peptide 

TLR  toll‐like receptoP toTRA thrombin recep

e ATXA2  thromboxanXB

2 e BT

  

2  thromboxan 

2 

 

9 

LIST OF PAPERS   This thesis is based on the following Papers, which will be referred to by their roman numerals:    I  Caroline Skoglund, Jonas Wetterö, Thomas Skogh, Christopher 

Sjöwall, Pentti Tengvall and Torbjörn Bengtsson.  C‐reactive protein and C1q regulate platelet adhesion and activation on adsorbed immunoglobulin G and albumin. Immunology and Cell Biology 2008; 86: 466­474 

II  Caroline Skoglund, Jonas Wetterö, Pentti Tengvall and Torbjörn Bengtsson. C1q induces a rapid up‐regulation of P‐selectin and modulates collagen‐ and collagen‐related peptide‐triggered activation in human platelets. Immunobiology In Press 2010;  doi:10.1016/j.imbio.

 

2009.11.004 

III  Caroline Skoglund, Jonas Wetterö and Torbjörn Bengtsson. C1q regulates collagen‐dependent production of reactive oxygen species, formation of platelet‐leukocyte aggregates and levels of 

n whole blood.  201

 

soluble P‐selectin i 0; Manuscript 

IV  Hanna Kälvegren, Caroline Skoglund, Christian Helldahl, Maria Lerm, Magnus Grenegård and Torbjörn Bengtsson. Toll‐like receptor 2 stimulation of platelets is mediated by purinergic P2X

 

1‐dependent Ca2+ mobilisation, cyclooxygenase and purinergic P2Y1 and P2Y12 receptor activation. Thrombosis and Haemostasis 2010; 103: 398­407 

   Papers are reprinted with permission from Nature Publishing Group (Paper I), Elsevier (Paper II) and Schattauer (Paper IV)

10 

11 

INTRODUCTION 

General aspects of inflammation The  skin and epithelial mucosa constitute a  first  line of defence  in order  to protect  our  bodies  from  injury  and  infection.  However,  if  a  foreign particle/organism  e.g.  a  bacteria,  fungus  or  virus  in  some  way  pass  these barriers the inflammatory reaction is crucial  in order to uphold our defence against infection and tissue injury [1]. The inflammatory response, described already  5000  years  ago  by  Celcus  and  Galen,  is  characterized  by  the  five classical cardinal signs: robur (redness), calor (heat), tumor (swelling), dolor (pain)  and  finally  functio  laesa  (loss  of  function)  [1,  2].  In  the  acute inflammatory state, e.g. upon intrusion of a pathogen cells present at the site of  infection such as macrophages, and neutrophils recruited  from the blood stream,  quickly  react  and  try  to  fight  off  the  infection with  the  help  of  the complement system. This process is a part of our innate (unspecific/natural) immunity.  Later  on,  the  acquired  (specific/adaptive)  immunity,  mainly involving  dendritic  cells,  T‐cells  and  antibodies  produced  from  B‐cells responds  to  the  ongoing  inflammation.  During  the  whole  process, inflammatory  mediators  such  as  prostaglandins,  leukotriens  and  cytokines are  released.  Moreover  a  systemic  acute‐phase  response  which  alters  the synthesis of certain proteins, e.g. C‐reactive protein (CRP) and serum‐amyloid A  is initiated [1, 3, 4]. Today it is known that an inappropriate or misdirected inflammatory  reaction  is  involved  in  the  onset  and  progression  of  many different  disorders,  such  as  coronary  artery  disease  and  autoimmune diseases.   

Pattern recognition receptors  Pattern‐recognition  molecules  (PRMs)  or  pattern‐recognition  receptors (PRRs)  as  they  are  denoted  when  performing  as  receptors,  are  molecules involved in innate immunity that recognize foreign structures and initiate an immune‐response. PRMs/PRRs can be cell‐associated, as well as found in the fluid phase, and recognize specific molecular structures known  as pathogen associated molecular patterns  (PAMPs). Toll‐like receptors  (TLRs), CRP and complement  protein  C1q,  are  all  PRMs/PRRs  able  to  bind  to  foreign structures.  Other  PRMs/PRRs  include  mannose‐binding  lectin  (MBL), surfactant‐protein A and D (SP‐A and SP‐D), L‐ficolin/P35 (Ficolin‐2) and H‐ficolin  (Ficolin‐3). Apart  from TLRs, nod‐like  receptors  (NODs) and  retinoic 

acid‐inducible gene‐I like receptors (RLRs) and scavenger receptors are cell‐associated  PRRs.  Several  recent  reviews  describing  PRMs/PRRs  and  their role  in  innate  immunity  as  well  as  regulators  of  adaptive  immunity  are available [4‐7].  Apart from the traditional inflammatory cells, e.g. neutrophils and macrophages, platelets have emerged as potent actors  in  inflammation. In  the  present  thesis  we  have  examined  the  effects  and  mechanisms  of platelet interaction with C1q and CRP and clarified some intracellular events upon TLR‐2/1 activation.   

Platelets 

Biology, structure and function 

Small undefined particles in blood were first observed and described already  1780 by Hewson and later in the middle of the 19in

byMplde

th century also reported  several other researches, e.g. Donné, Beale and Zimmermann, [8]. In 1865,  ax Schultze was the first to publish a convincing report on the presence of atelets  in blood  and  in 1882 Giulio Bizzozero described platelets  in more tail and also started to elucidate their role in hemostasis [9, 10].   

           

B A 

Figure 1. A) Differential interference contrast (DIC) microscopy image showing unstimulated isolated blood platelets in suspension. B) Fluorescence microscopy mage  showing  activated  platelets  adhered  to  a  protein  (fibrinogen)  coated 

 i

12 

surface.  Scale bars: 10 µm.  Platelets  are  non‐nucleated  cell  fragments  derived  from  megakaryocytes, most  often  present  in  the  bone marrow.  Since megakaryocytes  are  able  to migrate  to other  tissues,  formation of platelets may also occur  in  the blood stream  and  in  the  lungs  [11‐13].  However,  the  exact mechanism  by which platelets  are  formed  is  still  incompletely  understood  [11].  Interestingly,  it 

13 

was recently shown that exposure of megakaryocytes to high shear rates lead to  increased  formation  of  platelets,  possibly  indicating  that  platelets produced from megakaryocytes present in the microvasculature is governed by circulatory forces [14].  The resting platelet (Figure 1A) has a discoid shape, an average size of 2 to 5 µm in diameter and a thickness of about 0.5 µm [15]. Non‐activated platelets circulate for 7 to 10 days at a concentration of 150‐400 x 109 cells/L  blood before being degraded in the liver or spleen [16]. The main known function of platelets  is  to  participate  in  haemostasis.  If  exposed  to  subendothelial structures  (e.g.  collagen)  in  an  injured  vessel,  circulating  platelets  respond quickly  (within  seconds),  become  activated,  adhere  and  start  to  form  a hemostatic  plug,  with  the  purpose  to  form  a  temporary  shield  to  stop  an ongoing bleeding  (reviewed  in  [17, 18]).  In order  to  get  a more permanent repair  of  the  injured  vessel,  the  coagulation‐cascade  is  activated  e.g.  by negatively  charged  phosphatidylserine  (PS)  expressed  on  the  activated platelet  and  tissue  factor  present  on  damaged  cells  in  the  vessel  wall. 

c iActivation of the  oagualat on cascade leads to formation of a fibrin network and a more stabile plug [19].  Upon  activation  platelets  change  shape,  going  from  discoid  to  a  spread morphology, and increase their size considerably (Figure 1B). Their ability to do so  is dependent upon rapid reorganization of  the actin‐cytoskeleton [20, 21].  

Platelet granules 

Apart  from  their  important  role  in haemostasis,  it  has become evident  that platelets  also  are  active  players  involved  in  inflammation  and  immunity. Platelets contain granules of at least three different types, α‐granules, dense granules and  lysosomes. The granules store a variety of substances that are secreted when platelets are activated. Released granule components regulate further  platelet  activation  and  recruitment  of  inflammatory  cells.  The  α‐granules are the most abundant ranging from 40‐100 per platelet [15]. They contain proteins that upon secretion are expressed on the platelet surface e.g. adhesion molecules such as P‐selectin (CD62P) as well as soluble factors that are  released  into  the  extracellular  space,  for  example  the  chemokines CCL5 (RANTES) and CXCL8 (IL‐8). Moreover, they also hold substances involved in growth, angiogenesis and coagulation [22]. It has recently been reported that α‐granules contain 284 different proteins [23] and that the α‐granules are not 

14 

as  homogenous  as  was  previously  considered.  The  release  of  granule contents may be differently regulated depending on the stimulus [24].  Platelets contain almost a 10‐fold fewer dense granules than α‐granules, and these contain e.g.  adenine nucleotides  (ATP, GTP, ADP and GDP),  serotonin, divalent  cations  (Ca2+,  Mg2+)  and  lysosomal  membrane  proteins  (LAMPs). Lysosomes  in  platelets  contain  similar  substances  as  lysosomes  in  other types  of  cells  e.g.  LAMPs,  hydrolases  and  cathepsins  [22].  Furthermore, despite  not  having  a  nucleus,  platelets  are  indeed  capable  of  synthesizing proteins [25]. The ability of platelets to not only release immunomodulatory mediators such as IL‐1β from pre‐loaded granules but also to synthesize this cytokine further support the importance of platelets in inflammation [26].   

Platelet receptors 

Platelet  adhesion  to  structures  revealed  in  the  subendothelial  matix  upon vessel  injury  is  crucial  in  order  to  prevent  blood  loss  [17].  However, uncontrolled  platelet  activation  may  cause  fatal  complications,  such  as thrombosis.  Thrombus  formation  in  coronary  arteries  due  to  rupture  of  an atherosclerotic  plaque may  lead  to myocardial  infarction, which  is  a major cause of death in the western world [27]. The activity of platelets is mediated and regulated via receptors present on the platelet surface. Platelets express many types of  receptors,  those  that are essential  for haemostasis as well as receptors  implicated  in  other  activities,  e.g.  inflammation  and  antimicrobial defence,  reviewed  in  [17,  28,  29].  The  following  section  highlights  some selected  platelet  receptors,  including  a  few  that  are  highly  relevant  for  the present  thesis  (ADP‐,  ATP‐  and  collagen‐receptors).  Platelet  toll‐like 

 

receptors, C1q receptors and Fcγ‐receptors are  further discussed  in specific sections below. The  vonWillebrand  receptor  complex  (GPIb‐IX‐V)  is  involved  in  the  initial adhesion  of  platelets  to  the  injured  vessel  and  belongs  to  the  leucine‐rich repeat  family  of  receptors.  GPIb‐IX‐V  binds  to  vonWillebrand  factor  (vWF) adsorbed  from  plasma  to  exposed  collagen  or  endogenous  vWF  from  the endothelium  at  high  shear  stress  [17,  28,  30].  Firm  adhesion  of  platelets  is then  initiated  due  to  interaction  between  platelet  integrin  α2β1  (GPIa/IIa, originally  described  as  very‐late‐activation  antigen  VLA‐2)  and  collagen  in the vessel wall. There are around 2000‐4000 α2β1 per platelet [29]. However, there  are  still  some  controversies  in  the  current  model  of  α2β1  dependent platelet  activation.  Initially,  it  was  considered  that  α2β1  was  constitutively expressed  on  the  platelet  surface  in  a  high‐affinity  state  and  upon  collagen 

15 

ligation  interaction with  some other  receptor  resulted  in platelet  activation [17].  However,  Jung  and Moroi  have  shown  that  the  ability  of  α2β1  to  bind soluble  collagen  increases  if  platelets  are  first  pre‐stimulated with  another agonist [31, 32].  As for many integrins, α2β1 is thus also thought to require a conformational  change  in  order  to  transform  to  a  high‐affinity  state  and efficiently bind collagen. However, the complete signaling events (“inside‐out signaling”)  leading  to  this  conformational  change  are  insufficiently understood [17]. It has also been suggested that there exist an intermediate form of  the  α2β1, where  collagen may  bind without  the  receptor  being  in  a high‐affinity  state  [33].  The  other  collagen  receptor  on  platelets  is  the immunoglobulin  superfamily  receptor  GPVI.  GPVI  is  non‐covalently associated  to  the  FcR‐γ  chain  of  the  FcγRIIa  (CD32)  receptor  and  thus coupled to the associated ITAM‐signaling [34, 35]. GPVI‐mediated activation leads  to  an  abundant  secretion  of  granule  contents  and  induces  integrin activation  [17].  Other  receptors  involved  in  platelet  adhesion  are  the 

ptor)   integrins  αvβ3  (vitronectin  receptor),  α5β1  (fibronectin  rece and  α6β1(laminin receptor)[29].  Platelet  aggregation  is  dependent  upon  fibrinogen  binding  to  the  αIIbβ3‐integrin (GPIIb/IIIa). This  fibrinogen receptor  is abundantly expressed with approximately  50000‐80000  receptors  per  platelet.  The  main  ligand  is fibrinogen,  however,  the  receptor  also  recognizes  several  other  ligands containing an RGD sequence (arginine‐glycine‐aspartic acid), e.g. fibronectin, vWf  and  thrombospondin.  Before  ligand‐binding  the  αIIbβ3‐integrin  also requires  “inside‐out”  signaling  leading  to  a  conformational  switch  exposing the RGD‐binding sequence  [17, 27].  Platelets express several receptors belonging to the G‐protein coupled family of receptors (7‐transmembrane receptors) e.g. thrombin receptors (protease‐activated  receptors PAR‐1,  PAR‐4),  thromboxane A2  receptor  (TX)  and ADP receptors  (P2Y1  and  P2Y12).  Thrombin  is  formed  during  the  coagulation cascade  and  binds  to  PAR‐1  and  PAR‐4  leading  to  a  massive  platelet activation  [36].  PAR  activation  is  unique  in  that  thrombin  cleaves  the receptor,  thus exposing a new N‐terminal  that serves as the receptor  ligand [37].  Interestingly,  other  proteases  are  also  able  to  cleave  PARs,  inducing activation.  For  example,  proteases  from  the  periodontal  pathogen 

e 3Porphyromonas  gingivalis  are  shown  to  activate  plat lets  in  this  way  [ 8]. Both PARs couple to Gαq and Gα12/13 [29].  ATP  is  not  only  released  from  dense  granules  upon  platelet  activation  but also  from  erythrocytes  [39].  Platelets  express  two  types  of  ADP  receptors 

16 

P2Y1 and P2Y12 [40, 41]. P2Y1 induces activation via Gαq and  P2Y12 is linked to  Gαi  [27].  By  analyzing mRNA  levels Wang  et  al.  confirmed  the  two  ADP receptors to be present on platelets, and also found that P2Y12 mRNA levels were  higher  than  levels  for  P2Y1  [42].  However,  P2Y1  is  shown  to  display higher affinity  for ADP compared  to P2Y12  [43]. The  receptor  for adenosine triphosphate  (ATP)  is  denoted  P2X1  and  is  also  a  ligand‐gated  calcium channel  [44].  Interestingly,  when  examining mRNA  levels  at  different  time points, Wang et al.  found markedly reduced levels of P2X1 mRNA over time, whereas the mRNA levels for the ADP receptors remained unchanged or only slightly reduced, indicating that the ATP‐receptor has a much shorter halflife [42].  Both  ADP  and  ATP  receptors  are  important  amplifiers  of  responses provoked  by  other  receptor  agonists  [45,  46].  They  are  also  easily esensitized,  however  the  mechanism  of  desensitation  is  incompletely nderstood [47].   du 

Platelet­bacteria interaction Direct  interaction  between  platelets  and  bacteria  leading  to  platelet activation has been reported  in several  studies  in vitro  and  in vivo,  recently reviewed  by  Fitzgerald  et  al.  [48].  Bacteria‐induced  platelet  activation may cause  serious  conditions  such  as  endocarditis  [49]  and  immune thrombocytopenic purpura [50]. In the case of Staphylococcus aureus induced 

  interest g    b et   a e tendocarditis, in reports y Nguyen    al.  [51] nd  P erschke  e   al. [52] show involvement of gC1qR (C1q‐receptor) on the platelet surface. Among  the  bacterial  species  known  to  interact  with  platelets  are Staphylococccus  aureus  [53],  Staphylococccus  epidermis  [54],  Enterococcus spp.  [55],  Helicobacter  pylori  [56]  and  Porphyromonas  gingivalis  [38]. Moreover,  our  group  have  previously  shown  that  Chlamydia pneumoniae,  a common  respiratory  pathogen,  binds  to  platelets  and  triggers  aggregation,   P‐selectin  expression  and  lipoxygenase‐dependent  production  of  reactive oxygen  species  (ROS)  [57,  58].  In  addition,  several  species  of  bacteria  are found in atherosclerotic plaques and it is plausible that they are released into the  bloodstream  during  plaque  rupture  or  during  angioplasty,  thereby activating circulating platelets [59‐61]. However, platelets also possess anti‐bacterial  properties  as  they  hold  platelet  microbicidal  proteins  (PMPs) including  chemokines,  platelet  factor  4  and  fibrinopeptide  B,  which  are released upon platelet activation [48]. 

17 

Platelet­leukocyte interaction Interaction  between  platelets  and  leukocytes  and  subsequent  formation  of aggregates  is  considered  to  be  clinically  relevant  [62‐64].  The  initial interaction involves P‐selectin, that is abundantly expressed on the surface of activated  platelets,  and  its  ligand  on  leukocytes,  P‐selectin  glycoprotein ligand  1  (PGSL‐1).  Blockade  of  P‐selectin‐PSGL‐1  interaction  inhibits  IgG mediated  platelet‐neutrophil  binding  and  associated  ROS‐production  [65]. However,  several  other  adhesion mechanisms  are  also  described  including firm adhesion accomplished via fibrinogen binding to GPIIb/IIIa on platelets and Mac‐1 (CD11b/CD18) on leukocytes [66] as well as interaction between platelet  intracellular adhesion molecule‐2  (ICAM‐2) and CD11a/CD18  (LFA‐1) on neutrophils  [67]. Our group and others have reported several cellular consequences  upon  platelet‐leukocyte  interaction  e.g.  tyrosine phosphorylation  and  modified  production  of  ROS,  chemotaxis  and phagocytosis [65, 68‐72].   

Neutrophils Neutrophils,  discovered  by  Schultze  in  the  1860s  [73],  belong  to  the polymorphonuclear  granulocytes  together  with  basophils  and  eosinophils. Mature neutrophils are around 10 µm in diameter and are produced daily in a number of 1.6 x 109/ kg bodyweight from stem cells in the red bone marrow. In healthy individuals, neutrophils have a lifespan in circulation of 10 hours before  they migrate  into  surrounding  tissues where  they  survive  for 1  to 2 days [74‐76]. The main function of neutrophils is to participate in our defence against  invading microbes. Very  simplified, neutrophils  in  the  blood  stream are captured and activated by molecules and receptors up‐regulated on  the endothelium  upon  tissue  injury  and  infection.  Neutrophils  then  migrate towards the site of  inflammation in response to  increased concentrations of released  pro‐inflammatory  molecules  (chemotaxis),  whereafter  they phagocytose  and  kill  intruding  microbes.  An  important  part  of  the microbicidal  mechanism  in  neutrophils  is  the  oxidative  burst,  leading  to formation  of  ROS.  The  production  of  ROS  is  accomplished  via  a multicomponent  nicotinamide‐adenine‐dinucleotide‐phosphate  (NADPH) oxidase enzyme system. Since the NADPH‐oxidase may be located both in the plasma  membrane  and  in  membranes  of  granules/phagosomes  ROS‐production  may  be  extracellular  as  well  as  intracellular  (reviewed  in  [75, 77]).  Recently  described,  neutrophils  may  also  form  microbe‐capturing 

18 

neutrophil  extracellular  traps  (NETs),  i.e.  extracellular  fibers  of  chromatin and granule proteins [78]. 

 

The complement­system  The  complement‐system,  outlined  in  Figure  2,  is  an  important  defence  and clearance system and a major part of our innate immunity. It is comprised of approximately 30 soluble or membrane‐bound proteins and activation of the complement‐cascade  is  today  known  to  occur  via  at  least  three  different pathways,  the  classical  pathway,  mannose‐binding  lectin  pathway  and alternative pathway [79, 80].  Most proteins in the cascade are named with a “C” followed by a number (the number in the order in which the respective proteins were discovered) and a letter  indicating  the  fragment. Classical pathway activation  is  initiated upon binding of C1q to antibody (IgG or IgM)‐antigen complexes. Or, alternatively by  gram‐negative  bacterial  walls,  viral  envelopes,  cytoskeletal  filaments, myelin or CRP [80]. Together with serine proteases C1r and C1s, C1q forms the C1‐complex that cleaves C4 and C2, leading to generation of the classical C3‐convertase. The mannose‐binding lectin pathway is activated as mannan‐binding  protein  (MBP)  recognizes  and  binds  to  carbohydrate  structures found  on  a  variety  of  microorganisms.  MBP‐associated  serine  proteases (MASPs)  then  form  a  complex  with  MBP  and  cleave  C4.  The  alternative pathway is an important amplification loop that is activated by C3b deposited on surfaces on e.g. pathogens, cells or biomaterials/adsorbed proteins upon activation  of  classical  and MBL‐pathways.  Furthermore,  there  is  a  constant ongoing hydrolysis (“tickover”) of native C3 in plasma leading to formation of C3b  that  will  react  and  bind  to  amino‐  or  hydroxyl‐groups  on  surfaces,  if present close enough. Together with factor B and the help of factor D, surface bound  C3b  forms  the  alternative‐C3  convertase  [79,  80].  Even  though  the three pathways are initiated differently they all lead to cleavage of C3 and C5 followed by formation of a membrane‐attack‐complex (MAC) responsible for making pores  in  the membrane of  an  intruding pathogen, often  resulting  in lysis. However, classical pathway activation by phosphorylcholine‐bound CRP is an exception, where the cascade is halted at the C3 level (further discussed below) [81]. Moreover, all pathways are tightly regulated by several proteins (e.g  properdin,  C1‐inhibitor,  factor  I,  factor  H  and  DAF  (decay  accelerating factor)),  especially  the  more  “unspecific”  alternative  pathway  where  C3b bound to host cells is  quickly inhibited by regulatory proteins [79, 82]. 

19 

           

 

 

 

 

 

Figure 2. Schematic illustration of the three different activation pathways of  complement.  The  classical  pathway  is  initiated  upon  binding  of  C1q  to immunoglobulin  G  or  M,  or  by  phosphorylcholine­bound  C­reactive  protein (CRP). Mannose­binding  lectin (MBL) recognizes sugar residues (mannose) on intruding  pathogens,  leading  to  activation  of  the  cascade.  The  alternative pathway  is  initiated by  surface  binding  of C3b.  Indifferent  of which pathway that  serves as  initiator,  the  cascade  leads  to  cleavage of C3, C5,  formation of membrane  attack­complex  (MAC)  and  formation  of  inflammatory mediators. All  pathways  are  tightly  regulated  by  several  proteins  (in  italic)  of  which properdin is the only known positive regulator.  

Classical pathway

Antibody-antigen complexesC-reactive protein

Mannose-binding lectinpathway

Sugar residues

Alternative pathway

Surface of e.g. a bacteriaor a biomaterial

C3-convertasesC3-convertases

MBLMASPsC4C2

C3C3b

C3a

C5-convertasesC5-convertases

C5C5bC6C7C8C9

C5a

C1q C1r C1s

C4

C2

C3b

Factor B

Factor D

Properdin

C5b-9 (MAC)C5b-9 (MAC)

Lysis

Regulators:

C1-INHfactor Ifactor HCR1MCPC4bpDAF

Classical pathway

Antibody-antigen complexesC-reactive protein

Classical pathway

Antibody-antigen complexesC-reactive protein

Mannose-binding lectinpathway

Sugar residues

Mannose-binding lectinpathway

Sugar residues

Alternative pathway

Surface of e.g. a bacteriaor a biomaterial

Alternative pathway

Surface of e.g. a bacteriaor a biomaterial

C3-convertasesC3-convertases

MBLMASPsC4C2

C3C3b

C3aC3C3b

C3a

C5-convertasesC5-convertases

C5C5bC6C7C8C9

C5aC5C5bC6C7C8C9

C5a

C1q C1r C1s

C4

C2

C3b

Factor B

Factor D

Properdin

C5b-9 (MAC)C5b-9 (MAC)

Lysis

Regulators:

C1-INHfactor Ifactor HCR1MCPC4bpDAF

Regulators:

C1-INHfactor Ifactor HCR1MCPC4bpDAF

 Several protein fragments formed during cleavage of proteins throughout the cascade  do  not  participate  in  the  subsequent  steps  of  the  cascade.  These fragments  are  instead  involved  in  other  parts  of  the  inflammatory  process, for  example  C3a  and  C5a  which  are  called  anaphylatoxins  and  are  potent chemotactic  substances,  and  iC3b  that  is  an  important  opsonin.  Many celltypes  also  express  receptors  for  complement  proteins  and  cleavage products,  e.g.  complement  receptor  1  (CR1,  CD35)  which  binds  C3b. Complement is also considered to bridge the innate and the adaptive immune 

systems.  For  example,  C3  degradation  products  (C3d  and  C3dg)  enhances antigen presentation by dendritic cells and the production of antibodies from B‐cells [80]. 

 

Complement protein C1q   

Structure and synthesis                                                         

C1q is the target recognition molecule of the classical pathway, as described above. C1q has a hexameric structure and consists of 18 polypeptide chains (called A, B and C‐chains) with an amino‐terminal collagen‐like region and a carboxyl‐rich  terminal  globular  region  [83,  84].  The  protein  structure  has been described as a “bundle of tulips”, schematically shown in Figure 3. The collagenous part of the C1q molecule resembles collagen molecules which are haracterized by repeating sequences with Glycine‐X‐Y, where X and Y often re proline, hydroxyproline or hydroxyllysine residues [84, 85].  ca          

20 

  Structurally,  C1q  is  also  closely  related  to  the  proteins  in  a  family  called collectins (collagen‐like  lectins),  to which MBP, conglutinin, collectin‐43 and SP‐A,  and SP‐D belong. However,  in  contrast  to  the  collectins,  C1q does not have  a  carbohydrate  recognition  domain  [79].  Whereas  most  complement proteins  are  produced  in  the  liver,  C1q  is  continuously  synthesized  by macrophages and dendritic cells [79, 86, 87] and the production is regulated by  e.g.  lipopolysaccharide  (LPS),  interleukin‐6  (IL‐6),  interferon‐γ  (IFN‐γ) and  anti‐inflammatory  steroids  (dexamethasone  and  prednisone)  [85,  88, 89]. C1q circulates  in plasma at  concentrations of 80‐180 µg/mL but  is also present in tissues [79, 85].  

Collagen­like part 

Globular  

heads 

Figure  3.  Schematic  structure  of  C1q with  the  globular  heads  and  the collagen­like stalk.  

 

21 

C1q receptors 

Many  cell  types  are  reported  to  bind  C1q,  including  endothelial  cells  [90], monocytes  and  granulocytes  [91],  fibroblasts  [92],  epithelial  and  smooth muscle  cells  [93],  platelets  [94],  dendritic  cells  [95]  and  lymphocytes  [96]. However,  the  literature  regarding  receptors  responsible  for  C1q  binding  is still  somewhat  inconclusive.  For  example  Steinberger  et  al.  [97]  recognized CD93  to  be  identical  to  the previously  described C1qRp,  shown  to  enhance phagocytosis  in  monocytes.  In  contradiction,  McGreal  et  al.  [98]  have demonstrated that CD93 is indeed equal to C1qRp, however they found that it does not bind C1q. There are also conflicting results regarding the described receptor for the globular heads of the C1q molecule, gC1qR/p33. As reviewed by  Ghebrehiwet  et  al.  [99],  gC1qR/p33  is  expressed  on  the  cell  surface leading to cellular responses upon C1q binding. On the other hand, van den Berg et al. [100] did not detect any gC1qR/p33 on the surface of monocytes, neutrophils  or  Raji  cells  unless  cells  were  first  treated  with  saponin indicating  that  gC1qR/p33  is  an  intracellular  protein,  and  apparently  not expressed  on  the  extracellular  surface  of  cells.  One  receptor  that  several authors agree on as capable of binding C1q as well  as  to be present on cell surfaces  is  the  cC1qR  (also  denoted  calreticulin  in  the  literature).  cC1qR binds the collagenous part of C1q [94, 101]. Interestingly, Edelson et al. [102] reported  that  the α2β1‐integrin  is  a C1q binding  receptor  on mast  cells  and  ligation with C1q  induced mast cell activation and cytokine secretion. Other receptors suggested to bind C1q are CD91 (low‐density lipoprotein receptor‐

 related  protein  1 or  alfa‐2‐macroglobulin  receptor)  [103]  and  CD35  (CR1) [104]. Platelets  express  both  gC1qR  and  cC1qR  [94,  105,  106].  In  agreement with the findings by van den Berg et al., where gC1qR is found as an intracellular protein, gC1qR‐expression on platelets  is shown to be activation dependent [107]. The  somewhat  controversial CD93  is  also present on platelets  [108]. Moreover,  the  α2β1‐integrin  is  one  of  the  collagen  binding  receptors  on platelets  [29].  Receptor‐independent  binding  of  C1q  to  the  platelet  surface (via chondroitin sulphate) has also been reported recently [109]. 

Cellular effects 

The most apparent function of C1q is to recognize and mediate clearance of potential harmful pathogens by initiation of the classical complement cascade via binding to antigen‐bound IgG or PCh‐bound CRP. However, several direct cellular effects are also attributed to C1q. For example C1q induces cytokine 

22 

release  from  mast  cells  [102],  increases  chemotaxis  of  dendritic  cells  [95] stimulates  IgG production  from Staphylococcus aureus activated B‐cells  [96] and  enhances  Fcγ‐receptor  mediated  phagocytosis  in  macrophages  and monocytes [110].  Direct effects of C1q on platelets include massive P‐selectin expression  accompanied  with  increase  in  cytosolic  inositol‐1,4,5‐triphosphate  (IP3)  [111],  enhancement  of  aggregation  in  response  to  sub‐optimal  concentrations  of  IgG‐aggregates  [112],  and  inhibition  of mmunecomplex‐induced  aggregation  [113,  114].  Moreover,  platelet ggregation induced by collagen is inhibited by C1q [115, 116].   ia 

C­reactive protein 

Historical background 

C‐reactive protein (CRP) was discovered in 1930 by Tillet and Francis as they studied  sera  from  patients  suffering  from  pneumonia.  They  found  a  non‐antibody  serum component  in  sera  from acute  ill  patients  that  precipitated with  a  “fraction  C”  derived  from  pneumococcus  bacteria.  When  patients recovered,  the  “C‐reaction”  was  diminished  [117,  118].  Bacterial  C‐polysaccharide was  later  shown  to be  responsible  for  the C‐reaction, hence the name C‐reactive protein [118, 119].   

Structure, synthesis and ligands 

CRP  is  a  part  of  the  evolutionary  conserved  family  of  proteins  called pentraxins  and  is  together  with  serum  amyloid  P  (SAP)  denoted  a  short pentraxin,  whereas  pentraxin  3  is  regarded  as  a  long  pentraxin.  CRP  is  an acute phase protein, meaning that the plasma concentration increases rapidly (within  48  hours)  and  potently  (up  to  a  1000  times  in  the  case  of  CRP)  in response  to  infection  and  inflammation,  and  is  normalized  again  as  the infection is cleared [4, 120].  The CRP molecule is made up of 5 identical non‐covalently  associated  23  kDa  subunits  that  are  symmetrically  arranged around  a  central  pore  [121].  CRP  has  affinity  for  phosphorylcholine  (PCh), present  on  microorgansims,  damaged  cells  and  oxidized  low‐density lipoproteins to which it binds in a Ca2+ dependent manner [122‐124]. On the opposite  side of  the molecule, CRP displays binding sites  for C1q  [125] and Fcγ‐receptors  [126].  Moreover,  CRP  is  described  to  bind  nuclear  antigens [127].  The  pentameric  CRP  molecule  may  irreversibly  dissociate  into monomers called mCRP (sometimes also denoted modified CRP or neo‐CRP). Dissociation  occurs  when  CRP  encounters  an  acidic  environment  and  in 

23 

absence of Ca2+  and also  if  exposed  to high urea  concentrations  [128, 129]. However, other alternative mechanisms  for mCRP generation may certainly be involved in vivo e.g. in the inflammatory environment of an atherosclerotic plaque.  Most  CRP‐production  takes  place  in  the  liver  in  response  to  IL‐6 [130],  but  extrahepatic  production  is  also  described  [3,  131,  132]. Furthermore,  regarding  the  regulation  of  CRP‐production,  Enocsson  et  al. recently  showed  that  CRP  synthesis  induced  by  IL‐6  is  inhibited  by  IFN‐α. Possibly,  this  is  an  important  clue  to  why  the  concentration  of  CRP  is  not raised  during  viral  infections  or  in  systemus  lupus  erythrematosus  (SLE) patients,  where  IFN‐α  levels  are  increased  [133].  Indeed,  the  fact  that  the plasma level of CRP is not elevated upon a viral infection is used clinically to distinguish between bacterial and viral infections.  

Complement activation and regulation by CRP 

CRP bound to PCh on microorgansims or damaged cells activates the classical complement cascade via binding to C1q. However, the cascade does not yield much  complement  activity  past  the  C3  level,  indicating  that  activation  is mainly restricted to the first part of the cascade and does not give rise to an abundant MAC formation [81, 134]. The restricted complement activation by CRP is suggested to be due to interaction between CRP and factor H, of which the  latter  is  an  important  regulator  of  the  alternative  pathway.  Thus, interaction between  factor H and CRP  inhibits  the  amplification  loop of  the alternative pathway leading to less activation past the C3 level [134‐136]. A binding motif  for native CRP on  complement  factor H‐related protein 4 has also been reported [137]. Recently mCRP was also shown to bind factor H in the fluid‐phase, leading to increased inactivation of C3b [138]. Furthermore,  interaction  between  C4‐binding  protein,  which  is  another  complement regulatory protein,  and CRP has also been described  [139].  In addition, our group  has  previously  shown  that  complement  activation  at  PCh  model surfaces is down‐regulated by fluid‐phase interaction between CRP and C1q at  high  CRP‐levels  (>150  mg/mL)  [140].  The  CRP  mediated  complement activation leads to sufficient opsonization, but yields no complement induced lysis, suggesting that CRP has both host defence and anti‐inflammatory roles [134]. 

 

 

24 

Cellular effects   role in inflammation  

Elevated  levels  of  CRP  have  been  implicated  in  conditions  with  a  chronic inflammatory component, such as coronary artery disease. A minor, but still elevated  level  of  CRP  is  shown  to  predict  cardiovascular  and  thrombotic events,  initially  described  by  Ridker  et  al.  [141]  and  then  confirmed  in 

tu h   d

and

numerous  s dies  [142,  143].  This  as  lead  to the  evelopment  of  high sensitive‐assays to accurately detect moderate increases in CRP.   Apart  from  mediating  complement  activation,  CRP  also  affects  various cellular responses in many different cell types. Recent reviews summarizing these effects and role the of CRP in inflammation are available [122, 134, 144‐147]. Both pro‐ and anti‐inflammatory effects are described, for example, CRP promotes  proliferation  of  smooth  muscle  and  endothelial  cells  [148], formation  of  monocyte‐platelet  aggregates  [149]  as  well  as  inhibits neutrophil ROS‐production and chemotactic response [150, 151]. To further complicate  the  scenario,  native  and  mCRP  elicit  different  and  sometimes opposite responses [152‐154]. Only a few studies have investigated the effect of  CRP  on  platelets.  Monomeric  CRP  is  shown  to  induce  an  aggregatory response whereas the native CRP molecule does not [155]. On the contrary, enzymatically digested CRP inhibits platelet aggregation [156].  Pentameric CRP binds to immunoglobulin G receptors FcγRIIa (CD32) [157]  and  FcγRI  (CD64)  [158]  and  monomeric  but  not  native  CRP  is  capable  of binding  to FcγRIII  (CD16)  [153]. CRP  ligation of FcγRs  is presumed  to have the same effects as the binding of IgG, thus leading to activation upon ligation to the stimulatory FcγRI and FcγRIIa‐receptors and inhibition when binding to FcγRIIIa [122]. CRP interaction with FcγRs is thus considered to contribute to the opsonizing effects of CRP. Indeed, binding of CRP to FcγRIIa results in increased  phagocytosis  [159].  Despite  numerous  studies  during  the  past decades,  the  question  is  still  if  CRP  is  an  innocent  bystander,  a  protective olecule,  a  risk  marker  and/or  an  active  contributor  to  the  inflammatory rocess. mp      

25 

Toll­like receptors 

Structure, ligands and function 

Initially, toll‐protein was discovered in the Drosophila  fly (fruit  fly) where it participates  in  the  protection  against  fungal  infection  [160].  Later,  a whole family of receptors that resembled the toll‐protein were found  in mammals, hence  the name  toll‐like receptors  (TLRs)  [6, 161].  In 1998,  the  findings by Poltorak  et  al.  [162]  lead  to  the  conclusion  that  TLRs  serve  as  recognition molecules and inducers of intracellular signaling. These authors showed that signal transduction was inhibited in mice with a mutation in the TLR‐4 gene, making them resistant to LPS but still sensitive to infection by gram‐negative bacteria. TLRs are expressed in cells participating in the immune response as well  as  in  cells  considered  as  non‐immune,  e.g.  B‐cells,  natural  killer  (NK) cells, macrophages, dendritic cells, platelets, fibroblasts, endothelial cells and epithelial cells [6]. So far 12 TLRs have been discovered [163]. They are found both on the cell surface (TLR‐1, 2, 4, 5, 6, 11) and as  intracellular receptors (TLR‐3, 7, 8, 9) and are responsible for recognizing a diverse range of PAMPs, (Figure  4)  thus  triggering  an  inflammatory  response.  Recognized  PAMPs include bacterial cell wall components, LPS, single and double stranded‐RNA and DNA, viral envelope proteins and  flagellin  [163]. During  the past years, TLRs  have  attracted  a  lot  of  interest  and  several  extensive  reviews  are available [6, 163‐166]. 

TLR  signaling  

Upon  binding  of  PAMPs  to  TLRs,  various  TIR‐domain  containing  adaptor‐proteins are recruited  i.e. MyD88 (myeloid differentiation  factor 88), TIRAP (TIR‐containing  adaptor  protein),  TRIF  (TIR‐containing  adaptor  including IFN‐β) and TRAM (TRIF‐related adaptor protein). Different TLRs recruit one or a combination of adaptors, and the signaling can be divided  into MyD88‐dependent and TRIF‐dependent pathways [6, 163]. In the MyD88‐dependent pathway  IRAKs  (interleukin‐1  receptor‐associated  kinases)  1,  2  and  4  are recruited  leading  to  a  signal‐cascade  including  IRAK‐phosphorylation  and MAP kinases (mitogen‐activated protein kinase). Finally, transcription factors NFκB  (nuclear  factor  kappa‐light‐chain‐enhancer  of  activated  B  cells)  and IRFs  (interferon  regulatory  factors)  are  activated  leading  to  production  of inflammatory cytokines, chemokines and  interferons [6, 163, 164]. Relevant to the present thesis, C1q (possibly via both gC1qR and cC1qR) was recently shown to down‐regulate TLR‐4 induced production of IL‐12, but not IL‐6 or 

TNF [167, 168]. Furthermore, in a study by Fraser et al. [169] C1q and MBL inhibited  IL‐1α  and  IL‐1β,  and  enhanced  IL‐10,  IL‐1  receptor  antagonist, monocyte  chemoattractant  protein‐1,  and  IL‐6  secretion.  Additionally,  in  a recent  study  by  Lood  et  al.  [170],  C1q  inhibited  IFN‐α  secretion  from immune‐complex,  herpes  simplex  virus  and  CpG‐DNA  stimulated  PBMC peripheral  blood  mononuclear  cells)  and  immune‐complex,  CpG‐DNA  timulated plasmacytoid dendritic cells.   (s      

26 

          

TLR-2

TLR-4TLR-2/1 TLR-2/6 TLR-5

TLR-11

HemaglutininPeptidoglycan

LAMospholipomannan

poarabinomannanPorins

Glycosylphosphophatidyl-Inositol Mucin

LPSMannan

GlycoinositolphospholipidsVirial envelope proteins

Triacyl lipopeptides

ZymosanLipoteichoic acid

Diacyl Lipopeptides

Figure  4.  Toll­like  receptors  (TLRs)  are  expressed  on  the  membrane  and intracellularly  on  a  wide  range  of  cells  where  they  recognize  conserved microbial  molecules,  collectively  named  pathogen­associated  molecular patterns  (PAMPs). Recognition of PAMPs by TLRs  is an  important part of  the innate  immune  system.  In  the  present  thesis  we  have  investigated  the intracellular signaling upon TLR2/1 stimulation of platelets, using a triacylated lipopeptide as ligand.  

 

TLR­2 

Of  all  TLRs,  TLR‐2  is  able  to  recognize  the  highest  number  of  PAMPs,  e.g. bacterial  lipoproteins  [171,  172],  peptidoglycans  [173]  whole  Chlamydia pneumoniae  bacteria  [174],  and  LPS  from  certain  bacteria  such  as Porphyromonas  gingivalis  [175].  TLR‐2  forms  heterodimers  with  TLR‐1  or TLR‐6  and  the  dimerization  is  crucial  for  ligand‐binding  and  further 

PhLi

CD36

Flagellin

CD14MD2LBP

Uropathogenic bacteriaProfillin like molecule

TLR-3TLR-9TRL-7 TLR-8

EndosomedsRNAssRNA

CpG-DNAHemozonin

ds-DNA virusesssRNA virus ssRNA virus

TLR-2

TLR-4TLR-2/1 TLR-2/6 TLR-5

TLR-11

HemaglutininPeptidoglycan

LAMospholipomannan

poarabinomannanPorins

Glycosylphosphophatidyl-Inositol Mucin

LPSMannan

GlycoinositolphospholipidsVirial envelope proteins

Triacyl lipopeptides

ZymosanLipoteichoic acid

Diacyl LipopeptidesPhLi

CD36

Flagellin

CD14MD2LBP

Uropathogenic bacteriaProfillin like molecule

TLR-3TLR-9TRL-7 TLR-8

EndosomedsRNAssRNA

CpG-DNAHemozonin

ds-DNA virusesssRNA virus ssRNA virus

TLR-3TLR-9TRL-7 TLR-8

EndosomedsRNAssRNA

CpG-DNAHemozonin

ds-DNA virusesssRNA virus ssRNA virus

27 

intracellular  signaling  [163,  176,  177].  TLR‐2/TLR‐1  recognizes  triacylated lipopeptides  (e.g.  Pam3Cys‐Ser‐(Lys)4,  Pam3CSK4),  whereas  TLR‐2/TLR‐6 binds  diacylated  lipopeptides  (e.g.  Mycoplasma‐derived  macrophage‐activating lipopeptide 2, MALP‐2) [178]. Furthermore, CD36 is found to be a co‐receptor  for  TLR‐2/TLR‐6  [179,  180].  CD36  is  a  scavenger  receptor present on platelets, monocytes, adipocytes, hepatocytes and epithelial cells  that  for  example  oxidized  low  density  lipoproteins  and  thrombospondin‐1 [181]. 

TLR expression and function in platelets 

Using flow cytometry, Cognasse et al [182] identified TLR‐2, 4 and 9 on platelets and megakaryocytes and by analysis of mRNA and protein levels, Shiraki et al. [183] also demonstrated TLR‐1 and 6 in platelets. The functional consequences of TLR activation in platelets are at the moment under intense investigation. It has previously been shown that stimulation of TLR‐4 increases platelet adhesion to fibrinogen under flow and that it causes thrombocytopenia in TLR‐4 deficient mice, whereas wild type mice remain unaffected [184]. Activation of TLR‐2/TLR‐6 with the synthetic lipopeptide Pam3CSK4 induces platelet aggregation, secretion and mobilization of Ca2+ in washed platelets [185, 186], however, has no detectable stimulatory effects on platelets in plasma [187].   

Fcγ receptors Fcγ  receptors  recognize  the  constant part  of  the  immunoglobulin molecule, mediating  cellular  effects  such  as  immune  complex  elimination,  cytokine production  and phagocytosis. At  present  four  types of  FcγRs  are described, FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII (CD16) and FcγRIV. FcγRII and FcγRIII are also further divided into subclasses denoted a and b. All receptors, except for  FcγRIIb  mediate  a  cellular  activating  signal,  reviewed  in  [188‐190]. Platelets express FcγRIIa and ligation induces platelet activation mediated via phospholipase C and increased levels of intracellular free Ca2+ [191].         

28 

                                

 

29 

AIMS  The role of platelets  in  inflammation and  immunity  is an expanding  field of research. The overall  aim of  this  thesis was  to  investigate  the effects of  the attern‐recognition molecules/receptors  C1q,  CRP  and  TLR‐2/1  on  platelet pactivation.   

he sp T 

ecific aims of the enclosed studies were to: 

• elucidate the effects of C1q and C‐reactive protein on platelet adhesion and  activation  utilizing  well‐characterized  model  surfaces  with adsorbed  human  immunoglobulin  G  and  human  serum  albumin  (Paper I). 

• clarify the role of C1q in platelet activation including the involvement  

of receptors and intracellular signaling events (Paper II). 

• investigate  the  regulatory  role  of  C1q  on  collagen‐induced  platelet activation  on  isolated  platelets  and  in  whole  blood,  respectively 

 

(Papers II‐III). 

• study the effects of C1q on production of reactive‐oxygen species and  

formation of platelet‐leukocyte aggregates in whole blood. (Paper III). 

• reveal the intracellular signaling events provoked by toll‐like receptor‐2 stimulation of platelets (Paper VI). 

 

            

30 

                                    

31 

COMMENTS ON METHODS  Fm 

or  further  experimental  details  and  source  of  chemicals  and  buffers,  see aterials and methods sections of Paper I‐IV, respectively. 

Isolation of blood cells The blood used in the present thesis was heparinized whole blood collected from  apparently  healthy,  non‐medicating  consenting  donors  at  the  blood bank, University Hospital, Linköping, Sweden. 

Platelets (P per I, II and IV) 

There  are  several  methods  available  for  isolating  platelets  involving centrifugation [192] and gel  filtration [193].  In  the present studies platelets were  isolated by  centrifugation  and  several washing  steps  according  to  the protocol by Bengtsson and Grenegård  [194]. To avoid activation  during  the isolation procedure all buffers were prepared without Ca

a  

2+  and only plastic utensils were used. Briefly, 5 parts of whole blood was mixed with 1 part of an  acid‐dextrose  solution  (ACD)  pH  4.6  and  centrifuged  at  220  x  g  for  20 minutes. Platelet rich plasma (PRP) was collected and centrifuged at 480 x g for 20 minutes. In order to investigate changes in cytosolic Ca2+ (Paper II and IV)  platelets  in  PRP  were  loaded  with  4  µM  Fura‐2‐acetoxymethylester (FURA‐2‐AM)  during  45  minutes  of  incubation  before  centrifugation. Furthermore,  in  Paper  VI,  some  platelets  were  isolated  in  the  presence  of platelet  inhibitors  apyrase  (0.5  U/ml)  and  aspirin  (100  µM).  The  platelet pellet was washed three times by careful replacement of the buffer in direct contact with the pellet using Krebs Ringers Phosphate buffer (KRG, pH 7.4). Platelets  were  then  carefully  re‐suspended  in  KRG  and  the  cell  count determined  using  a  Bürker  chamber.  Morphological  examination  by  light microscopy  showed  that  the  isolated  platelets  were  solitary  and  appeared non‐activated. Platelets were diluted  in KRG and kept at  room  temperature for up to 2 hours until experiments. Immediately before each experiment, the extracellular concentration of Ca2+ was restored to 1 mM. 

Neutrophils (Paper II) 

Neutrophils  were  isolated  according  to  Böyum  and  others  [195,  196].    In short, whole  blood was  layered  onto  Lymphoprep  and  Polymorphprep  and centrifuged  at  480  x  g  for  40  minutes  at  room  temperature.  The  fraction 

32 

containing neutrophils was collected and washed in PBS (pH 7.4) at 480 x g for  10  minutes.  Any  remaining  red  blood  cells  were  removed  by  brief hypotonic lysis at 4° C followed by washing in calcium free KRG at 200 x g at 4° C. Isolated neutrophils were counted and kept on ice until experiments.  

Mononuclear cells (Paper IV) 

Peripheral  blood  mononuclear  cells  (PBMCs)  were  isolated  according  to Welin  et  al.  [197].  Briefly,  whole  blood was  layered  onto  Lymphoprep  and centrifuged  at  480  x  g  for  40 minutes  before washing  in  calcium  free KRG. Prior to Western Blot experiments, isolated PBMCs were lysed in RIPA buffer and any remaining cellular debris was removed by centrifugation at 17500 x g for 10 minutes at 4 °C.     

Surface  thylation and protein  on In  Paper  I  cell‐adhesion  experiments  were  performed  on  custom  made hydrophobic,  highly  protein  adsorptive,  glass  cover  slips.  Similarly  treated silicon wafers were produced for protein adsorption studies by ellipsometry, a method that require a suitable reflective substratum. Any potential organic and  inorganic contaminations were  first  removed by sequential  incubations of  wafers  and  cover  slips  in  a  mixture  of  distilled  water  and  hydrogen peroxide  combined  with  NH

me adsorpti

4OH  followed  by  hydrogen  peroxide  together with  hydrochloric  acid,  respectively,  for  5 minutes  at  80°C.  After  extensive rinsing  in  distilled  water,  ethanol  and  finally  xylene,  surfaces  were methylated  (made  hydrophobic)  by  wet  silanization  (1%  (v/v) dichlorodimethylsilane  (Cl2(CH3)2Si)  in  xylene  for  5  minutes).  Excessive 

  w   r y  o ethylasilane as emoved  b rinsing  in  xylene  and  ethan l  and  the  m ted surfaces were kept in ethanol until experiments within 2 weeks. Prior  to  adhesion  experiments,  monolayers  of  normal  human immunoglobulin G (IgG) or human serum albumin (HSA) were spontaneously adsorbed onto  the  surfaces by  incubation with  1 mg/mL protein  in  PBS,  at room temperature  for one hour. Previous studies have shown that proteins adsorbed to methylated surfaces are retained at the surfaces upon incubation with blood plasma and cells, with neglible non‐specific bias from cell‐material interactions.  Thus,  these  surfaces  are  very  suitable when  studying  protein‐protein and protein‐cell interactions [198].  

33 

Ellipsometry In the 1960s Leo Vroman performed the first ellipsometry studies on plasma protein  adsorption  onto  model  surfaces  [199].  The  use  of  ellipsometry  to detect protein adsorption in biomaterial research is extensively reviewed in [200,  201].  This  optical  technique  is  based on  changes  in polarization‐state and  intensity  of  monochromatic  light  upon  reflection  on  a  surface.  When proteins adsorb onto the surface and form an organic film, the ellipsometric angels (∆ and Ψ) become changed. The thickness (d) and refractive index (N) of the protein film can be iterated from these changes (d is often expressed in Ångström) [200]. Compared to more conventional methods used to quantify and identify adsorbed proteins, such as ELISA and RIA, ellipsometry does not require  any  labelling  of  proteins  or  detection  antibodies.  Ellipsometry  is  a very  convenient  and  rapid  technique  that  also  allows  for  evaluation  of adsorption  kinetics.  Furthermore,  polyclonal  antibodies  may  be  used  to identify adsorbed proteins [200‐202]. It was also shown in a previous study, that  ellipsometric  quantification  agree  well  with  quantitative  RIA  [203]. However,  the  main  disadvantages  of  the  method  are  that  monoclonal antibodies  are  not  well  suited  for  ellipsometric  measurements  and  the surfaces  need  to  be  flat  and  optically  reflecting  without  too  much  light scattering [200]. In Paper  I,  ellipsometry was used  to  characterize  the adsorption of  IgG and HSA onto hydrophobic silicon, and to investigate the monolayer  interactions with CRP and C1q.  IgG and HSA surfaces were prepared as described above and  incubated  with  C1q  and  CRP  (alone  or  in  combination)  in  KRG  for  3 minutes  before  rinsing.  Total  protein  deposition was  determined  and  after incubation  in  antibody  solutions  (polyclonal  anti‐C1q  or  anti‐CRP  for  30 minutes)  the  absolute  amounts  of  C1q  and  CRP  on  the  surfaces  were determined.   

  

Platelet adhesion and morphology Platelet  adhesion,  spreading  and  overall  ability  to  increase  the  available surface area are crucial events  in haemostasis. Several different approaches to study platelet adhesion and the mechanisms involved have been employed over  the  years,  for  example  microscopic  analysis  [204,  205],  radioisotope‐labelling of adhering platelets [206], measurement of total P‐selectin in lyzed platelets  [207]  and  enzymatic  detection  [208].  In  this  thesis,  two  different setups were  used;  i)  Adhesion  to  protein  coated  coverslips  combined with 

 

fluorescence‐microscopy  and  image  analysis,  and  ii)  enzymatic  detection (acid‐phosphatase) of platelet adhesion to collagen in microtiter wells.   

Platelet adhesion to coverslips with adsorbed IgG and HSA    

In Paper  I,  the methylated cover slips with adsorbed  IgG or HSA (described above)  were  deployed  in  24‐well  plates.  Physiological  concentrations  (80 mg/mL)  of  isolated  C1q  and  CRP  were  co‐incubated  for  3  minutes  before addition to the wells and subjected to another 3‐minute incubation. Isolated platelets  (1  x  108  /mL) were  added  and  allowed  to  adhere  for  30 minutes. Supernatants were  collected  for  TXB2  analysis,  and  adhered  platelets were fixed  in 4 % paraformaldehyde (PFA)  in PBS.  In order  to visualize adhering platelets and  their morphology,  cells were permeabilized and stained  for F‐actin using lysophosphatidylcholine (100 µg/mL) and bodipy‐phallacidin (0.6 µg/mL). 

Fluorescence microscopy and image analysis 

The number of platelets adhering to IgG and HSA coated cover slips and their morphology  after  exposure  to  C1q  and  CRP  were  evaluated  using fluorescence microscopy. Platelets on a total of 10 images per treatment were counted and morphologically evaluated using  four morphological  categories adapted from Allan et al. and Frank et al. [209, 210].  The categories were: A) round or discoid, B) dendritic or early pseudopodial, C) intermediate or late pseudopodial  and  D)  fully  spread.    Representative  images  of  the  different categories  are  shown  in  Figure  5.  To  enable  subsequent  image  analysis, acquisitions  were  carried  out  at  identical  settings.  Image  analysis  was performed  with  the  open  source  freeware  Image  J.  Color  images  were converted  to  black  and  white  images  (8‐bit)  and  by  applying  a  threshold platelet  adhesion was  then  quantified  by means  of  average  cellular  area  of adhering platelets and total area covered by platelets.   

  

34 

                   

          Figure 5. Morphological cathegories: A) round or discoid,  

D C B A 

          B) dendritic or  early pseudopodial, C) intermediate or late            pseudopodial, D) fully spread 

35 

Enzymatic detection of platelet adhesion to collagen­coated microplates 

In Paper II, the impact of C1q on platelet adhesion to collagen was evaluated using a method previously described by Eriksson and Whiss [211]. In short, wells  in  a  96‐well  plate  were  coated  with  collagen  by  incubation  with  0.1 mg/mL bovine collagen over night. Excess protein was removed by washing in physiological saline, before addition of PRP in absence or presence of C1q (80  µg/mL).  After  1  hour,  non‐adhering  cells were  removed  by washing  in saline  followed  by  enzymatic  detection  of  acid‐phosphatase  in  adherent platelets using p‐nitrophenyl‐phosphate in a citrate buffer. The reaction was topped after 1 hour by addition of NaOH and absorbance was  read at 405 m.    sn 

Phosphatidylserine expression Upon  activation  and  adhesion,  platelets  express  negatively  charged phosphatidylserine (PS) on their membrane which may serve as an enhancer of coagulation [212].   In Paper I, expression of PS on the surface of platelets adhering  to  protein  coated  cover  slips  was  evaluated.  Platelet  adhesion experiments were carried out as described above. A commercially available kit  comprising annexin‐V‐FITC was used and  samples were analysed  for PS expression  by fluorescence microscopy. 

 

 

Thromboxane B2 producti nThromboxane  B

o  2  (TXB2)  is  a  more  stable  metabolite  of  TXA2,  a 

cyclooxygenase product and a potent potentiator of platelet activation.  Using a  commercially  available  ELISA  kit,  levels  of  TXB2  were  evaluated  in supernatants from the adhesion experiments in Paper I, and in Paper IV from latelets in suspension stimulated with a TLR‐2 receptor agonist in presence r absence of several inhibitors. po 

Flow cytometry analysis of P­selectin expression P‐selectin  is  a widely used marker of  activated platelets  since  it  is  released from α‐granules upon activation [22]. In Paper II, up‐regulation of P‐selectin on the platelet surface was measured with flow cytometry. Isolated platelets were  pre‐incubated  in  a  24‐well  plate  at  37°C  for  5 minutes,  in  absence  or presence of gC1qR and α2β1‐integrin blocking antibodies or a PKC‐inhibitor (GF109203X), before addition of C1q or TRAP. Samples were collected after 

36 

15‐120 seconds of stimulation.  To evaluate the effect of C1q on collagen and collagen‐related  peptide  induced  up‐regulation  of  P‐selectin,  platelets were pre‐incubated with C1q for 5 minutes prior to addition of collagen, collagen‐related  peptide  or  TRAP  and  samples  were  taken  after  15‐120  seconds. Immunofluorescense  staining was  performed using  an  anti‐P‐selectin  FITC‐conjugated  antibody.  Before  flow  cytometry  analysis  samples were  fixed  in    1 % PFA  and  diluted  in  PBS. A  total  of  10000  events were  collected  in  the platelet gate  for each sample and data was analysed using  the CellQuestPro software.  

Soluble P­selectin Previous  studies  have  shown  that  P‐selectin  may  be  cleaved  off  from  the platelet surface and circulate as soluble P‐selectin in plasma  [213]. In Paper III,  the  levels  of  soluble  P‐selectin  were  investigated  using  an  ELISA, according  to  the  manufacturer’s  instructions.  Whole  blood  was  incubated with C1q, Reopro and/or collagen, under stirring conditions at 37°C. Samples were  removed  after  15  and  45  minutes  of  incubation  and  plasma  was collected by centrifugation at 1000 x g for 10 minutes.   

Cytosolic Ca2+ measurements Ca2+  ions  are  involved  in  numerous  signal  transduction  pathways  and regulate many cellular processes (for example comprehensively reviewed in [214]). In Paper II and IV, changes in cytosolic Ca2+ concentration in platelets upon  C1q  or  toll‐like  receptor  stimulation  were  monitored  using  the fluorescent  ratiometric  probe  FURA‐2.  During  the  isolation  procedure, platelets  were  loaded  with  an  acetoxymethylester‐derivate  of  the  FURA‐2 molecule  (FURA‐2‐AM).  FURA‐2‐AM  is  lipophilic  and  thus  able  to  pass through the membrane into the cytosol, where the AM‐part is cleaved off by esterases, trapping the rest of the polar and calcium‐sensitive FURA‐2 inside the  cell.  The  use  of  FURA‐2  and  other  calcium  indicators  is  reviewed  by Paredes  et  al.  [215].  An  advantage  of  the  FURA‐2  dye  is  that  it  is  exited  at different  wavelengths,  depending  on  if  it  has  Ca2+  bound  or  not.  Thus,  the fluorescence emission was registered at 510 nm upon continuous excitation at  340  and  380  nm,  respectively.  Experiments  were  carried  out  in  1.5  mL aliquots  of  FURA‐2  loaded  platelets  under  constant  stirring  and  at  37°C. Addition  of  Triton‐X‐100  (0.1%)  followed  by  EGTA  (25  mM)  revealed  the minimal and maximal ratios necessary for calculation of the relative changes 

37 

and  absolute  concentrations  in  free  cytosolic  Ca2+  with  the  formula  by Grynkiewicz  et  al.  [216].    In  Paper  IV  the  release  of  Ca2+  from  intracellular stores was separated from the store‐operated influx of Ca2+ via addition of 0.5 M EGTA prior to stimulation with TLR‐2/‐1 agonist Pam3CSK4.  

Light­transmission aggregometry and dense granule secretion In 1962, G.V. Born was the first to report that aggregation of platelets could be monitored using light‐transmission [217]. Today, this methodology is still one of the most frequently used to study platelet aggregation. Over the years, instruments  have  been  further  developed  e.g.  making  it  possible  to  also measure  aggregation  in  whole  blood  and  to  combine  the  aggregation measurements  with  bioluminescence  detection  of  platelet  dense‐granule secretion,  measured  as  ATP  release  (reviewed  in  [218]).  Furthermore, production  of  ROS may  also  be  quantified  in  the  very  same  setup,  through luminol‐dependent  chemiluminescence  [219].  The  light‐transmission technique also to some extent allows detection of changes in platelet shape‐change [220]. The method is based on the transmittance of light (infrared), passing through a  sample  in  a  cuvette,  to  a  detector.  When  platelets  in  PRP  or  in  buffer suspension start to aggregate, e.g. upon stimulation with a receptor agonist, the  amount  of  light  that  pass  the  cuvette  to  the  detector  is  increased.  Via calibrating  towards  plasma  without  platelets  or  buffer,  the  extent  of aggregation  is  quantified,  and  most  often  expressed  as  %  aggregation.  In order  to  simultaneously  measure  dense‐granule  secretion  a  mixture  of luciferine/luciferase  is  added  to  the  sample.  Dense  granule  ATP  that  is released  from  platelets  upon  activation  is  hydrolyzed  as  the  luciferase enzyme oxidizes the luciferine molecule and light (luminescence) is emitted.  By registering the luminescence signal provoked from addition of a fixed dose of  external  ATP,  the  absolute  concentration  of  ATP  is  easily  calculated. Detection of aggregation and ATP‐secretion was performed in Paper VI, using a  lumi‐aggregometer. Briefly,  isolated platelets  in KRG supplemented with a luciferin‐luciferase mixture were pre‐incubated at 37 °C at stirring conditions (800rpm),  for  5  minutes  in  presence  or  absence  of  antagonist  prior  to addition of agonist.   

38 

Platelet leukocyte aggregate formation In  Paper  II  platelet‐neutrophil  aggregate  formation  was  investigated  using isolated platelets and neutrophils from the same donor. Both cell types were pre‐warmed for 5 minutes in absence or presence of C1q (80 mg/mL) prior to mixing and subsequent stimulation with collagen. Samples were collected after  30‐150  seconds  of  stimulation  and  fixed  in  PFA  before  analys.  The interaction between platelets and leukocytes in whole blood was evaluated in Paper  III,  where  samples  from  the  aggregation  (impedance)  experiments described  above  were  fixed  in  PFA,  stained  for  F‐actin  using  bodipy‐

Luminol­dependent ROS­production in whole blood In  Paper  III,  production  of  ROS  in whole  blood was  studied  using  luminol‐dependent  chemiluminescence.  The  technique  was  described  by  Allen  and Loos in the 70´s [221] and detection of ROS during the respiratory burst from neutrophils  using  luminol  is  reviewed  in  [219].  When  luminol  comes  in contact with  ROS  it  is  exited  and  as  the molecule  returns  to  its  non‐exited state  light  (chemiluminescense)  is  emitted  which  can  be  recorded  in  a luminometer. Luminol is a very sensitive indicator of ROS and also allows for detection of the kinetics of ROS production. However, the chemiluminescense reaction is dependent upon peroxidase [219], and in order to avoid that the amount of peroxidase is a limiting factor, experiments are usually performed in  presence  of  extra  horseradish  peroxidase.  Briefly,  ROS‐production  was analyzed  in  the  lumi‐aggregometer,  combined  with  the  impedance measurements  described  above.  Whole  blood  was  diluted  in  physiological saline  containing  luminol  (100 mM)  and  horseradish  peroxidase  (4 U/mL). Some  samples were pre‐incubated with C1q  and Reopro before  addition  of collagen and ROS‐production was monitored for 45 minutes.   

Whole blood aggregation  In Paper III we used the lumi‐aggregometer to measure aggregation in whole blood  induced by collagen  in absence or presence of C1q. This was done by inserting platinum‐electrodes into the cuvette with diluted (1:1) whole blood. As  the  electrodes  become  coated  with  aggregating  cells  (most  presumably both  platelets  and  leukocytes),  the  impedance  increases  [218].  Thus, calibaration  was  performed  so  that  a  40  mm  change  in  the  original  trace, orresponded  to  a  20  ohm  increase  in  impedance  between  the  two lectrodes.  ce 

­

39 

phallacidin  and  for  platelet  CD42b  using  an  anti‐CD42b  RPE‐conjugated antibody.  Aggregates  in  a  total  of  100  fields  of  vision  were  examined  and aggregates were classified as small size aggregates (one to  three  leukocytes with  a  few bound platelets), medium size  aggregates  (4‐10  leukocytes with bound  platelets)  and  large  size  aggregates  (more  than  10  leukocytes  with ound  platelets).  Furthermore,  solitary  platelets  and  leukocytes  were ounted.   bc 

Western blot experiments To  investigate  the  intracellular  signaling  system  associated  with  TLR‐2 activation of platelets we used western blot  to  elucidate  the  role of MyD88 and  IRAK‐1.  Briefly,  isolated  platelets were  stimulated with  Pam3CSK4  (10‐100  µg/mL)  for  10  to  600  seconds  before  lysis  upon  addition  of  Laemmli buffer and incubation at 98°C for 5 minutes. Isolated PBMC served as positive contol.  Proteins  were  separated  on  a  SDS‐PAGE  (sodium  dodecylsulphate‐polyacrylamide) gel and transfered to PVDF membranes using a Mini Trans‐Blot  Electrophoresis  Transfer  Cell.    After  blocking with  dry milk  or  bovine serum albumin and several washing steps, membranes were incubated with anti‐MyD88  antibody  for  1  hour  or  anti‐IRAK‐1  or  anti‐phospho‐IRAK‐1 antibodies  over  night  followed  by  incubation  with  a  secondary  goat  anti‐rabbit HRP conjugated antibody for 1 hour. To control for protein loading, an anti‐β‐tubulin  antibody  was  used.  Proteins  on  membranes  were  visualized sing  an  acridan‐based  chemiluminescence  reaction  (ECL‐plus)  and  images ere taken using a CCD‐camera.   

uw 

Statistics Results are presented as arithmetic averages ± standard error of  the means (SEM).  The  number  of  individual  experiments  (individual  blood  donors)  is indicated  by  n.  Statistical  significance  was  evaluated  using  or  one‐way analysis  of  variance  (ANOVA)  or  Student´s  t‐test  and  paired measurements were  used  when  applicable.  All  statistical  analyses  were  performed  with GraphPad Prism 4.      

40 

SUMMARY OF PAPERS   Paper I  Pre‐incubation of C1q and CRP in the fluid phase leads to deposition of both proteins on adsorbed  IgG. Surface bound C1q, alone or  in combination with CRP,  and  fluid‐phase  CRP  inhibits  platelet  adhesion  and  activation.  The results  suggest  that  C1q  and  CRP  both  have  the  ability  to  inhibit  FcγRIIa‐ mediated platelet activation, especially if combined together.    

IgG IgG IgG IgG IgG IgG IgG IgG

Fluid-phase

Reduced platelet adhesion, shape change, PS expression and TXA2 production

Reduced platelet adhesion, shape change andPS expression

IgG IgG IgG IgG IgG IgG IgG IgGIgG IgG IgG IgG IgG IgG IgG IgG

Fluid-phase

Reduced platelet adhesion, shape change, PS expression and TXA2 production

Reduced platelet adhesion, shape change andPS expression

               

41 

           

Paper II  C1q  induces  a  rapid  but moderate  and  transient  up‐regulation  of  P‐selectin mediated via gC1qR and protein kinase  C.  Further  platelet activation  induced  by  collagen and  collagen‐related  peptideand  formation  of  platelet‐neutrophil  aggregates  is diminished by C1q. 

α2β1

GPVIgC1qR

P-selectin

PKC

Platelet

Neutrophil

Collagen

P-selectin

α

PSGL-1

α

Collagen-relatedpeptide

α2β1

GPVIgC1qR

P-selectin

PKC

Platelet

Neutrophil

Collagen

P-selectin

α

PSGL-1

α

Collagen-relatedpeptide

               

Platelets

Leukocytes

Collagen

ROS

ROS

Platelets

Leukocytes

Platelets

Leukocytes

Collagen

ROS

ROS

Paper III  Incubation of C1q with whole blood  inhibits collagen‐induced aggregation, release of  soluble P‐selectin  and  formation of  large  size platelet‐leukocyte aggregates, whereas the production of ROS is potentiated. Inhibition of the platelet fibrinogen receptor suggests that the effects are platelet‐dependent. 

            

Paper IV TLR‐2/1  stimulation  of  platelets  with  Pam3CSK4  induces  aggregation  and granule  secretion  via  P2X1‐mediated  Ca2+  mobilization,  production  of thromboxane  metabolites  and  ADP  receptor  activation.  TLR‐2/6  agonist MALP‐2  inhibits  Pam3CSK4‐induced  activation.  Moreover,  platelets  also express MyD88 and IRAK‐1, however, they appear not to be involved in the early signaling events provoked by Pam3CSK4. 

42 

[Ca2+]i

ATP

P2X1

ADP

P2Y12 P2Y1

TXA2

TLR-2/1

TLR-2/6

Pam3CSK4

MALP-2

-

PI3-

kina

se, P

LC

AggregationSecretion

IRAK-1MyD88

P2X1

COX

Late response?

granule

PLC

ATP

TX

Ca2+

[Ca2+]i

ATP

P2X1

ADP

P2Y12 P2Y1

TXA2

TLR-2/1

TLR-2/6

Pam3CSK4

MALP-2

-

PI3-

kina

se, P

LC

AggregationSecretion

IRAK-1MyD88

P2X1

COX

Late response?

granule

PLC

ATP

TX[Ca2+]i

ATP

P2X1

ADP

P2Y12 P2Y1

TXA2

TLR-2/1

TLR-2/6

Pam3CSK4

MALP-2

-

PI3-

kina

se, P

LC

AggregationSecretion

IRAK-1MyD88

P2X1

COX

Late response?

granule

PLC

ATP

TX

Ca2+

          

43 

RESULTS & DISCUSSION  Platelets are well known for their important role in haemostasis, where they are activated, adhere and form aggregates in order to keep up the integrity of an injured vessel. However, we also appreciate that platelet activation is not always  entirely  beneficial.  Thrombotic  complications,  initiated  for  example by the rupture of an atherosclerotic plaque, may  lead to complications such as myocardial  infarction and stroke, resulting  in significant suffering, and in the worst case death. Besides the crucial role of platelets in haemostasis and thrombosis,  they  are  also  shown  to  play  an  active  part  in  immunity.  For example,  they  interact  with  certain  bacteria  such  as  P.  gingivalis  and  C. pneumoniae, express toll‐like receptors (TLRs) and receptors for complement (C1q‐receptors)  and  immunoglobulin  G  (FcγRIIa).  Furthermore,  platelet granules contain numerous inflammatory mediators which are released upon platelet  activation.  Clearly,  platelets  are  potent  cells  active  in  various inflammatory processes and an increased depth in knowledge regarding the mechanisms  involved  is  needed.  Thus,  the  studies  included  in  the  present hesis  aim  to  elucidate  the  effects  and  mechanisms  of  C1q  and  CRP  on latelets, and the intracellular signaling induced by TLR‐2/1 activation.  tp 

Inhibitory effects of C1q and CRP in FcγRIIa­mediated platelet adhesion and activation Platelet activation may be evaluated by measuring aggregation with a  light‐transmission  technique  or  surface  expression  of  activation markers  (e.g.  P‐selectin) with flow cytometry. These techniques are utilized in Paper II‐IV. In Paper  I,  we  instead  set  out  to  use  a well  characterized model  system with adsorbed plasma proteins (IgG and HSA) to study the adhesion and activation of  isolated platelets  in presence of C1q and/or CRP. Adsorbed IgG  is  indeed relevant  in  this  case  as  it  may  be  considered  as  a  large  immune  complex, previously shown to activate complement, platelets and neutrophils [65, 222‐225]. Adsorbed plasma proteins are also involved in the recognition of non‐self  materials  and  the  associated  inflammatory  reaction,  reviewed  in  [226, 227]. Moreover, immune complexes also play an active part in several clinical disorders  with  an  inflammatory  component  such  as  autoimmune  diseases, recently  reviewed  in  [228].  Several  bacterial  species  induce  platelet aggregation  via  FcγRIIa,  the  IgG  receptor  present  on  platelets.  The aggregation  is  dependent  on  co‐stimulation  via  another  receptor,  such  as 

44 

GPIIb/IIIa  or  GP1b  [229,  230].  Activation  via  FcγRIIa  induces  intracellular signaling  mediated  via  phospholipase  C  leading  to  increased  levels  of  Ca2+  [191].  In many experimental setups,  the presence of FcγRIIa on  the platelet surface therefore makes  it difficult  to utilize antibodies as blocking tools, as the  Fc‐part  of  the  so  called  “blocking  antibody”  may  instead  initiate activation.  This  is  actually  the  case  in  Paper  II,  where  the  antibodies described to block the gC1qR also initiates a potent Ca2+ response, even when used  at  relatively  low  concentrations  (>3µg/mL).  Despite  all  the  effects described  above,  the mechanisms  and  role  of  FcγRIIa  ligataion  on  platelets are still insufficiently understood. In  the  adhesion  experiments performed  in Paper  I,  C1q  and CRP were pre‐incubated  for  3  minutes  prior  to  addition  to  the  IgG  or  HSA  coated  cover glasses. Protein adsorption was evaluated with ellipsometry and  the results showed  that C1q binds  to  the  IgG surface, as might be expected, and only a minimal deposition of CRP was detected. However, when C1q and CRP were pre‐incubated both proteins could be detected at the surfaces. Thus, it seems as  though C1q  facilitates  the  binding  of  CRP  to  adsorbed  IgG.  Interestingly, C1q and CRP are shown to interact in the fluid‐phase [140, 231]. In a previous study  by  our  group  fluid‐phase  interaction  between  C1q  and  CRP  was responsible  for  down‐regulation  of  complement  activation  at  high  CRP concentrations (above 150 mg/L) [140]. As the concentration used in Paper I 

p e  (80µg/mL)  is  physiologically  relevant,  a  fluid‐ has   interaction is  plausible also in this setup.  Platelets  were  allowed  to  adhere  to  the  IgG  and  HSA  coated  surfaces,  in absence  or  presence  of  C1q  and/or  CRP.  When  analyzing  the  number  of adhering platelets, an  inhibitiory effect was seen both by C1q  and CRP. The combination of both proteins  seemed most effective,  inhibiting  adhesion by 25% compared  to  IgG control, although not  statistically  significant, Table 1. However, since adsorbed IgG is a very potent activation ligand for platelets as ell  as  other  cells  [65,  222],  even  seemingly  moderate  effects  may  be  of mportance.  wi       

  

45 

        Previous  studies  have  shown  that  genetic  polymorphisms  influence  the function of FcγRs, leading to differences in for example the amount of IgG that is bound  [232, 233].  Such polymorphisms  could  to  some extent  explain  the quite  broad  variation  among  donors  in  the  platelet  response  to  IgG‐coated surfaces.  This  is  in  line  with  the  findings  by  Peerschke  and  Ghebrehiwet, reporting  that  the  regulatory  effects  of  C1q  on  immune  complex‐induced aggregation are donor dependent [112].  As  another  activation  parameter  we  classified  the  adhesion  behaviour  of platelets  according  to  four  different morphological  categories,  described  in detail in the comments on methods section. On an IgG reference surface, most platelets were extensively spread, and exposed numerous pseudopodia. Upon ddition of C1q cells instead showed a much smaller and discoid shape. CRP lone also shifted the morphology towards less spreading, (Figure 6).  aa              

  control  C1q  CRP  C1q + CRP 

IgG  4144 ± 826  3641 ± 899  3403 ± 533  3100 ± 445 

HSA  3309 ± 823  1847 ±  466  2464 ± 657  1912  ± 522 

Hydrophobic  8066 ± 937  4538 ± 1075 6937 ± 781  6552 ± 1351 

Table 1. Number of adhering platelets. Number  of  platelets  adhering  to  IgG  or  HSA  spontaneously adsorbed to a hydrophobic glass surface. Expressed as number of platelets/ mm2 ± SEM. 

Morphological distribution of platelets  adhering  to adsorbed  IgG.  Platelets  were classified  into  four  different categories  where  I  is  the  least and  IV  the  most  spread morphology.  The  different morphological  types  are expressed  as  %  of  the  total number of cells on a total of 10 images per treatment ± SEM. 

Figure 6.  

pes

I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV0

10

20

30

40

50

60

70

control C1q CRP C1qCRP

IgG

gica

l ty

% o

f the

mor

phol

o

46 

Adhesion of platelets to ligand­bound CRP In  a  previous  report  from  our  group,  a model  surface  expressing  PCh was developed and used to capture CRP from serum and to characterize the role of CRP in classical complement activation [140]. Briefly, this model surface is comprised  of  3  layers  of  cross  linked  fibrinogen  coupled  to  PCh  bound  to keyhole  limpet hemocyanin  (PCh‐KLH).  In addition  to  the results  in Paper  I showing  inhibitory effects of CRP on platelet  adhesion  to  IgG, we also have unpublished results on the effects on platelet adhesion to ligand‐bound CRP, using the PCh‐KLH surface described above. With ellipsometry we found that 

The inhibitory effects were also reflected in the expression of PS, where C1q and CRP, alone or in combination, reduced the PS expression compared to the IgG control. On the other hand, CRP per se did not affect platelet production of TXA2 whereas C1q alone or in combination with CRP reduced the production ith 60% and 84%, respectively, compared to IgG control after 15 minutes of w

incubation.  Interaction between platelets and immune complexes and the role of C1q has previously  been  evaluated  in  a  few  studies,  although  with  contradictory results.  In  a  study  by  Peerschke  and  Ghebrehiwet  [112],  C1q  enhanced platelet  aggregation  in  response  to  a  dose  of  aggregated  IgG  that  did  not induce a  response on  its own. The same group have also  reported  that C1q amplifys the binding of immune complexes to platelets in whole blood [234]. On the other hand, using C1q concentrations similar to those used in Paper I, Sloand et al. [113] and Vollertsen et al. [114] found that C1q inhibits platelet aggregation induced by IgG immune complexes.  The  effects  of  CRP  on  platelets  are  poorly  studied  and  as  far  as  we  know, prior  to  this  study,  CRP  interaction with  C1q  has  not  been  evaluated  in  an experimental  model  that  specifically  targets  IgG‐mediated  stimulation  of platelets. However, some studies are published regarding  the effects of CRP on  platelet  aggregation.  Enzymatically  modified  CRP  is  reported  to  inhibit platelet aggregation [156]. Since CRP showed inhibitory effects  in our study (Paper I), this may suggest that a significant portion of the CRP present in our experimental  system  is  monomeric.  Indeed,  dissociation  of  the  pentameric CRP  molecule  is  shown  to  occur  at  cell  membranes  [235].  Possibly, dissociation  of  CRP  may  also  occur  upon  encountering  adsorbed  plasma roteins.  Yet,  in  a  study  by  Potempa  et  al.  [155]  monomeric  CRP  instead nduced platelet activation whereas the pentameric CRP had no effects.  pi 

incubation  of  a  PCh‐expressing  surface  with  pentameric  CRP  for  2  hours yields an approximately 28 ± 9 Å thick CRP layer on top of the PCh. Addition of  platelets  to  immobilized  CRP  revealed  that  ligand‐bound  CRP  only moderately  induces platelet adhesion, as compared to  fibrinogen which  is a otent adhesive agent. The adhesion pattern was more similar to that on the SA surface. Representative images are shown in Figure 7.  

pH 

  

FIB

RIN

OG

ENPC

-KLH

CR

PH

SA

5 min 10 min 30 min

FIB

RIN

OG

ENPC

-KLH

CR

PH

SA

5 min 10 min 30 min

                   Figure 7. Platelets adhere only moderatly to ligand­bound CRP. PCh­KLH surfaces were prepared as described in Sjöwall et al. [140]. Essentially, 3 layers of cross­ linked fibrinogen were coupled to phosphorylcholine attached to  keyhole  limpet  hemocyanin  (denoted  PCh­KLH).  After  two  hours  of incubation  with  CRP  (0.1 mg/mL),  surfaces  were  rinsed  and  platelets  were added and  left  to adhere  for 5­30 minutes. Non­adhering platelets were  then washed  off,  whereas  attached  cells  were  stained  for  F­actin  using  bodipy­hallacidin  and  visualized  using  fluorescence  microscopy.  Representative mages from one of three individual experiments.  Scale bars indicate 10 µm.  pi 

47 

48 

Albumin  is  often  regarded  as  biologically  “inert”  when  it  comes  to  platelet adhesion  and  activation,  relative  to  other  surfaces.  Yet,  on  the  contrary, platelet adhesion to albumin  in vitro may  involve RGD‐binding receptors on the  platelet,  depending  on  the  conformational  state  of  adsorbed  albumin [236].  CRP  ligation  to  FcγRs  is  presumed  to  account  for  the  opsonizing properties  of  CRP  [122,  145].  The  adhesion  results  presented  here  are  in agreement as they show that ligand bound CRP does not lead to a direct and specific  platelet  activation  via  FcγRIIa.  Combined  with  the  observations  in Paper I, we draw the conclusion that CRP does not induce massive activation of  platelets,  despite  the  expression  of  FcγRIIa  on  the  platelet  surface,  but instead blocks further FcγRIIa‐mediated platelet activation. 

 

C1q induces P­selectin expression and regulates collagen­ and collagen­related peptide activation in washed platelets in s osu pensi n 

In  Paper  I,  C1q  had  even  more  pronounced  inhibitory  effects  when spontaneously adsorbed to a hydrophobic surface compared to when bound to  IgG.  Speculatively,  the  orientation  of  the  C1q  molecule  is  displayed differently,  as  C1q  is  known  to  bind  IgG with  its  globular  heads  [231],  the collagenous  part  will  be more  readily  available  for  interactions  with  other molecules and cells. On a C1q‐coated hydrophobic it is instead likely that both the collagen‐like part and globular heads are exposed for further interaction with platelets. This would enable  interaction with  any of  the C1q  receptors previously  described  on  platelets.  At  present,  we  do  not  know  the contribution,  if  any,  of  the  C1q  receptors  in  the  inhibitory  effects  seen  in Paper  I.  To  date,  several  receptors  for  C1q  are  reported  on  platelets  e.g. gC1qR, cC1qR and CD93 [106, 108]. Furthermore, the α2β1‐integrin on mast cells  binds  C1q  [102]  and  α2β1  is  one  of  the  collagen  binding  rece torsexpressed in platelets [29].  In  Paper  II  we  investigated  the  effects  of  C1q  on  platelet  expression  of  P‐selectin  using  flow  cytometry.  We  also  evaluated  the  role  of  gC1qR,  α

p  

2β1, intracellular Ca  changes and protein kinase C. Furthermore, we studied the regulatory  role  of  C1q  in  collagen  receptor‐mediated  activation  of  platelets and  formation  of  platelet‐neutrophil  aggregates.  As  shown  in  Figure  8, addition of C1q at a physiological concentration (80 µg/mL) induced a rapid but  moderate  and  transient  up‐regulation  of  P‐selectin.  The  up‐regulation was  dose‐dependent  up  to  80  µg/mL  and  seen  already  5  seconds  after 

2+

addition of  C1q. A higher  concentration of  C1q did not  yield  any  additional effects and the increased P‐selectin level was normalized again within 3 to 5 minutes.  We  speculate  that  this  may  be  due  to  shedding  of  the  P‐selectin olecule. Indeed, increased circulating levels of soluble P‐selectin are found n several conditions, such as cardiovascular disease and stroke [213, 237].  mi                

contr

ol 15

s

C1q 15

s

TRAP 15

s

contr

ol 45

s

C1q 4

5s

TRAP 45

s0

10

20

30

40150

200

250

300

350

*****

CD

62P

FITC

(MFI

, geo

met

ric

mea

n)

control C1q 5s0

102030405060

CD

62P

FITC

(MFI

)

contr

ol

C1q 8

µg/m

L

C1q 40

µg/m

L

C1q 80

µg/m

L 0

10

20

30

40

50 **

CD

62P

expr

essi

on (g

eom

etric

mea

n)

B A 

Figure 8. C1q  induces a moderate but rapid (A) and dose­dependent (B) up­regulation  of  P­selectin  on  the  surface  of washed  platelets.  Platelets were pre­warmed  for 5 minutes before addition of C1q  (80 µg/mL).  Samples were taken in duplicates after 5 (insert) to 45 seconds and P­selectin expression as  evaluated  with  flow  cytometry.  TRAP,  known  to  induce  an  abundant 

a  w

49 

expression of P­selectin, served  s positive control.    Peerschke  et  al.  [111]  have  reported  increased  P‐selectin  expression  on platelets  stimulated  with  multimeric/aggregated  C1q  using  fluorescence microscopy.  In contradiction to our results,  the C1q‐provoked up‐regulation of P‐selectin  in  their experiments was of a magnitude equal  to  that  induced by  thrombin  and  furthermore,  the  aggregated  C1q  used  in  their  study  also induced platelet aggregation. This group also found that the expression of P‐selectin  was  accompanied  by  a  raise  in  IP3,  which  releases  Ca2+  from intracellular  stores  via  binding  to  specific  receptors  [238].  Addition  of  the C1q used  in Paper  II  to  isolated platelets  in  suspension does not  induce  an aggregatory response (unpublished results), nor any changes  in  the  level of 

50 

cytosolic  intracellular Ca2+, measured with FURA‐2. However, we found that an  inhibitor  for  protein  kinase  C  (PKC)  diminished  the  C1q‐induced  up‐egulation  of  P‐selectin.  PKC  is  an  important  mediator  participating  in  the rintracellular response triggered by various agonsists [239].  Next, using antibodies directed towards two different epitopes of the gC1qR (clones 60.11 and 74.5.2) and an anti‐α2β1 antibody (AK7), we confirmed that the up‐regulation of P‐selectin was dependent upon gC1qR whereas the anti‐α2β1 antibody showed no effect. C1q binding to gC1qR has been reported to induce  various  cellular  responses  e.g.  regulation  of  monocyte‐derived dendritic  cell  differentiation  and  chemotaxis  [95,  240]  and  activation  of complement on the platelet membrane [241]. Several bacteria also utilize the C1qR in order to bind to cells and regulate cellular responses e.g. S. aureus gwhich bind to platelets via gC1qR [51, 52].   As  one  part  of  the  C1q  molecule  is  structurally  similar  to  collagen,  we proceeded  by  evaluating  the  effects  of  C1q  on  collagen‐induced  platelet activation.  Figure  9  shows  that  pre‐incubation  of  platelets  with  C1q  for  5 minutes inhibited a subsequent collagen‐ as well as collagen‐related peptide‐ induced up‐regulation of P‐selectin. This is  in agreement with other authors that  have  reported  that  C1q  may  blunt  a  collagen‐provoked  aggregatory response [115, 116]. A novel finding in Paper II is that C1q also modulates the collagen related‐peptide‐induced response, which is GPVI specific [242].   The  α2β1‐integrin  is  considered  to  be  the  collagen  receptor  responsible  for platelet adhesion to collagen, whereas GPVI is regarded to mediate activation [29, 243]. Our finding that C1q also regulates GPVI‐triggered activation may shed some light on the effects of C1q on adhesion to collagen in Paper II and in  a  previous  study  where  C1q  does  show  inhibitory  effects  on  platelet adhesion to collagen [244]. Our study, as well as previous results by Eriksson and Whiss  [211, 245]  show clearly  that platelet  adhesion  to  collagen  in  the adhesion  assay  used  in  Paper  II  is  mediated  via  α2β1.  Thus,  the  inhibitory effects  of  C1q  on  platelet  aggregation  in  suspension  previously  described [115, 116] may entirely or  in part be due  to C1q  interaction with GPVI and not  α2β1.  Regardless,  the  regulatory  effects  of  C1q  on  collagen‐induced platelet  activation  are  highly  interesting  since  collagen  is  exposed  in  the injured  vessel  wall,  recruiting  and  activating  platelets.  Our  results  indicate that C1q is a potent endogenous regulator of this process.   

0102030405060708090

100110

Collagen

Collagen-related peptideC1q + Collagen-related peptide

15 sec 45 sec 90 sec

**

*** *** ******

***

C1q + Collagen

CD

62P

expr

essi

on (%

of C

olla

gen/

Col

lage

n-re

late

d pe

ptid

e co

ntol

)

              Figure  9.  C1q  inhibits  collagen­  and  collagen­related  peptide­induced platelet  activation.  Platelets  were  incubated  with  C1q  (80  µg/mL)  for  5 minutes prior to addition of collagen or collagen­related peptide. Samples were ollected after 15  to 90  seconds and P­selectin  expression was analysed with low cytometry. cf  The physiological relevance of C1q mediated inhibition was further explored by analysis of platelet‐neutrophil aggregates. Formation of such aggregates is observed  in  several  inflammatory  disorders  [63]. Moreover, we  and  others have  previously  shown  the  importance  of  P‐selectin  interaction  with  its ligand PSGL‐1  in  the  formation of  aggregates  [63,  65].  In Paper  II,  platelets incubated  with  C1q  for  5  minutes  showed  reduced  collagen  activation ependent  binding  to  neutrophils  (isolated  from  the  same  donor).  This urther strengthens the anti‐inflammatory capacity of C1q. df 

51 

Regulatory effects of C1q in whole blood In  Paper  III  we  continued  to  study  the  effects  of  C1q  on  collagen‐induced activation in a whole blood experimental setup. In agreement with previous findings  by  others  using  washed  cells  or  platelets  in  PRP  [115,  116],  C1q dose‐dependently  inhibited  collagen‐induced  aggregation  also  in  whole blood.  Blockade  of  the  GPIIb/IIIa  receptor  with  Reopro  showed  that  the whole  blood  aggregation  response  was  mainly  platelet  dependent. Furthermore, microscopic  analysis  showed  that  collagen‐induced  formation 

of large‐ and medium‐sized platelet‐leukocyte aggregates was inhibited if the blood was first treated with C1q, Figure 10. This finding is in good agreement with the results in Paper II, indicating that the C1q‐mediated effects are thus ikely  physiologically  relevant  since  they  are  also  detectable  in  a  more omplex system such as whole blood. lc     

Unstim

ulated

Collag

en

C1q +

Collagen

Unstim

ulated

Collag

en

C1q +

Collagen

Unstimulat

ed

Collag

en

C1q +

Collag

en0

10

2020

40

60

80

100Small size aggregates

Large size aggregatesMedium size aggregates

Num

ber

of a

ggre

gate

s

            Figure 10. C1q regulates  the  formation of platelet­leukocyte aggregates in whole blood upon collagen stimulation. Whole blood  incubated with 80 µg/mL  C1q  for  5  minutes  before  addition  of  2  µg/mL  collagen.  Cells  were stained for F­actin and CD42b and platelet­leukocyte aggregate formation was evaluated in a fluorescence microscope. A small size aggregate was defined as one to three leukocytes with a few bound platelets, medium size aggregates as ­10  leukocytes with  bound  platelets  and  large  aggregates  as more  then  10 eukocytes (often indistinguishable from each other) with bound platelets.  4l

52 

  An  interesting  finding  is  that  C1q  potentiated  the  production  of  ROS, measured with luminol‐dependent chemiluminescense (Figure 11), whereas the  aggregation  was  inhibited  as  described  above.  Platelet‐neutrophil crosstalk  has  been  shown  to  increase  ROS‐production  in  several  studies, dependent upon both soluble  factors and membrane  receptors  [65, 69, 70]. Furthermore, platelet aggregation is inhibited by scavengers such as catalase 

[65]. Thus,  in Paper  III we speculate  that  the  formation of  small  aggregates instead  of  large  ones  upon  pre‐incubation with  C1q may  lead  to  facilitated nd more effective cross‐talk between platelets and leukocytes and therefore n increased formation of ROS.  aa    

53 

            Figure 11. C1q potentiates ROS­production in whole blood. The production of ROS was measured for 45 minutes upon collagen stimulation of whole blood, in absence or presence of 80 µg/µL C1q and/or Reopro.   A) Time traces of the chemiluminescence  response,  black  trace  is  collagen  control  and  red  trace  is C1q  +  collagen.    B)  Total  ROS­production  during  the  first  15  minutes  of incubation     In  previous  studies,  immobilized  C1q  induces  ROS‐production  from neutrophils [246, 247]. On the other hand, monomeric C1q does not trigger a respiratory  burst  on  its  own,  but  it  increases  the  ROS‐production  from neutrophils  in  response  to  aggregated  IgG  [246].  Since  C1q  receptors  are present  on  many  different  celltypes,  including  leukocytes,  the  potentiated ROS‐production  seen  in  Paper  III  may  also  be  due  to  C1q  stimulation  of receptors  on  other  cells.  However,  addition  of  Reopro  showed  that  the roduction of ROS was platelet dependent, indicating that platelet‐leukocyte nteraction has a crucial role.  pi 

Control

C1q

Reopro

+ C1q

Reopro

0250050007500

1000012500150001750020000 **

**

Che

mim

ulin

esce

nce

(Tot

al R

OS

prod

uctio

n)

A  B 

0 10 20 30 400

500

1000

1500

2000

Collagen controlC1q 80 µg/ml

Time (min)

Che

milu

min

esce

nce

(CPM

)

Collagen

54 

TLR­2/1­activation of platelets is mediated by ATP­dependent Ca2+ increases, ADP receptors and activation of cyclooxygenase  Previous  investigations  from our  group have  shown  that platelets bind and become activated by the respiratory pathogen C. pneumoniae and periodontal bacteria  P.  gingivalis  [58,  248].  Platelet  interaction  with  various  species  of  bacteria has been shown to be of importance in numerous studies, reviewed in  [48,  249].  Platelets  express  several  TLRs,  which  recognize  conserved molecular  patterns  present  on  pathogens  [182,  183]).  In  Paper  VI we  have investigated  the mechanisms  of  platelet  activation  upon  TLR‐2‐stimulation. 

  T in TLR‐2 forms heterodimers with TLR‐1 or  LR‐6, and are  the present study activated by the lipopeptide Pam3CSK4 and MALP‐2, respectively. By measuring  aggregation  and  secretion we  found  that  ligation  of  TLR‐2/1 leads  to  a  dose‐dependent  platelet  aggregation  accompanied  by  dense granule secretion. This is  in agreement with previous findings by Berg et al. [186]  and  Blair  et  al.  [250].  However,  in  a  study  by Ward  et  al.  Pam3CSK4 failed to induce aggregation in PRP [187], possibly indicating the presence of  inhibitory factor(s) in plasma. Utilizing several inhibitors of platelet receptors and  proteins  involved  in  intracellular  signaling,  we  found  that  the aggregation was dependent upon both ADP receptors P2Y1 and P2Y12 as well as the ATP receptor P2X1. Moreover, the Pam3CSK4 induced aggregation was inhibited  by  aspirin,  U73122  and  BAPT‐AM  indicating  important  roles  for cyclooxygenase  (COX)  metabolites  (e.g  TXA2),  phospholipase  C  (PLC)  and cytosolic free Ca2+, respectively.  Since the calcium chelator BAPT‐AM showed significant inhibitory effects, we next evaluated changes in  intracellular free Ca2+ after Pam3CSK4‐stimulation of  FURA‐2  loaded  platelets.  TLR‐2/1‐stimulation  gave  rise  to  a  massive increase  in  the  level  of  intracellular  free Ca2+. However,  as  for many  of  the receptors and mediators discussed in previous sections, there are conflicting results  also  in  the  published  reports  on  the  ability  of  Pam3CSK4  to  induce changes  in  intracellular  Ca2+  [186,  187].  In  harmony  with  aggregation experiments,  we  found  that  the  Ca2+  increase  was  sensitive  to  blockade  of COX, PLC and P2X1, however inhibitors towards P2Y1 and P2Y12 were without effect.  Moreover,  the  Pam3CSK4‐induced  Ca2+  increase  was  PI3‐kinase dependent.  In  correlation,  Blair  et  al  [250]  have  reported  that  Pam3 SKC ‐4induced activation is associated with increased PI3‐kinase activity.  In accordance with the inhibitory effects by aspirin, we found that Pam

 

3CSK4 induces  formation  of  TXA2.  This  response  was  also  sensitive  to  the  ATP‐

receptor  antagonist,  whereas  the  ADP  receptor  antagonists  were  without effects. Table 2  summarizes  the effects of  the  signal  transduction  inhibitors on the different parameters assayed in Paper VI.   Table  2.  The  effect  of  receptor  antagonists  and  signal  transduction inhibitors on Pam3CSK4­ induced platelet activation. 

   Aggregation  Secr ion et Intracellular Ca2+ TXA2 production Aspirin (COX‐inhibitor)  X  X  X  X Cangrelor   (P2Y12‐antagonist) X  X  O   O  MRS2179 (P2Y1‐antagonist)  X  X  O   O  MRS215 t) 9 (P2X  is1‐antagon X  X  X  X U73122 (PLC‐inhibitor)  X  n.d  X  n.d BAPT­AM (Ca  chelator)  2+   X  n  .d n  .d X LY2940 itor) 2 (PI3‐kinase inhib n  .d n  .d X  n  .dMALP­2 (TLR2/6 agonist)  X  X  X  X          

55 

 The TLR‐2/6 agonist MALP‐2 did not stimulate platelet activation. However, an  interesting  finding  is  that pre‐incubation of platelets with MALP‐2 dose‐dependently  diminished  the  Pam3CSK4‐induced  response. We  propose  that ALP‐2 competes with Pam

X indicates inhibition O indicates no inhibition n.d denotes not determined 

  

  

  

  

3CSK4 in the binding to TLR‐2, thus impeding the Mformation of TLR‐2/1 dimers   As  described  in  the  introduction,  TLR‐stimulation  often  leads  to  cytokine release  via  activation  of  the  adaptor  protein  MyD88  and  IRAKs.  In  TLR‐2‐ mediated  signaling, MyD88 recruits  IRAK‐4 which  leads  to phosphorylation of  IRAK‐1  [163,  164].  During  our  studies  in  identifying MyD88  in  platelets, the article by Zang et al. [251] was published, showing platelet expression of MyD88.  In  Paper  IV,  we  demonstrate  using  Western  blot  that  platelets  in addition  express  IRAK‐1.  However,  IRAK‐1  was  not  phosphorylated  upon Pam3CSK4‐stimulation indicating that the early signaling response from TLR‐2/1  in  platelets  is  MyD88‐independent.  We  speculate  that  TLR‐2/1‐ activation in later phases of the signaling transduction machinery engages the MyD88  pathway  leading  to  protein  translation,  cytokine  release  and  an inflammatory response in platelets.   

56 

57 

CONCLUSIONS  The general conclusion from the present thesis is that C1q and CRP are able o regulate platelet activation. Furthermore, TLR‐2/1‐activation of platelets is ependent upon purinergic receptor activation and cyclooxygenase activity.  td 

ore s M pecifically we have found that: 

•  

 C1q facilitates the binding of CRP to adsorbed IgG. 

• Physiological concentrations of C1q and CRP, in combination or alone, inhibit  FcγRIIa‐mediated  platelet  adhesion  and  spreading.  C1q  in absence or presence of CRP also inhibits the formation of TXA2.  

• C1q  induces a  rapid and dose‐dependent but moderate and  transient Ca

 

2+‐independent  up‐regulation  of  P‐selectin  that  is  sensitive  to blockade of gC1qR and PKC, but not to blockade of α2β1. 

• C1q inhibits collagen‐ and collagen‐related peptide‐induced P‐selectin expression,  as  well  as  collagen‐provoked  formation  of  platelet‐

 

neutrophil aggregates.  

• C1q  inhibits  aggregation  in  whole  blood  and  formation  of  platelet‐leukocyte  aggregates,  and  potentiates  the  production  of  ROS,  all  in  a 

 

platelet‐dependent manner. 

• TLR‐2/1‐activation  of  platelets  is  mediated  via  P2X 

1‐dependent increase  in  intracellular  free  Ca2+,  P2Y1  and  P2Y12‐receptors  and 

genase  activation of cyclooxy .

• TLR‐2/6‐stimulation  per  se  does  not  yield  platelet  activation  but  it  

inhibits subsequent TLR‐2/1‐induced platelet activation. 

• Platelets express IRAK‐1, however TLR‐2/1 ligation does not lead to a rapid phosphorylation of IRAK‐1. 

 

 

58 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

59 

ACKNOWLEDGEMENTS  Jag har många att tack  för att avhandlingen na u är tryckt. Ett STORT tack till:  Torbjörn Bengtsson, min huvudhandledare,  för  att  du  gav mig  chansen  att börja forska, för ditt stöd och engagemang under doktorandtiden och för allt du lärt mig om forskning och undervisning. Din goda egenskap, att lyfta fram det positiva, kan verkligen vända en vid  första anblicken usel  dag på  labbet till  något  bra,  vilket  ger  ny  energi  att  kämpa  vidare!  Tack  också  för  alla ikastunder  där  vi  avhandlat  allt  från  försöksplanering  till  bilproblem  och enaste OS‐result ten.    fs a Jonas  Wetterö,  min  biträdande  handledare,  för  att  du  är  den  mest omtänksamma och hjälpsamma handledare man som doktorand kan ha. Inget r  för  stort  eller  för  smått,  du  är  verkligen  en  god  förebild  och  mentor. oreover, tack fö  att du lärt mig hitta i kulve

äM r rten, det är balett!   Pentti Tengvall, min biträdande handledare, för att du entusiastiskt tagit dig id för mina frågor och kommit med goda synpunkter som hjälpt mig framåt. ack också för ditt arbete med strategiområdet Material i Medicin. tT   essutom vill jag tacka de som på ett eller annat sätt varit inblandade i mitt rojekt och som   med under min tid soDp funnits m doktorand, TACK:  homas  Skogh  och  Christopher  Sjöwall  för  alla  CRP‐möten,  givande amarbete, god hjälp aTs  och gl da hejarop!  agnus  Grenegård,  som  lärt  mig  mycket  om  undervisning  och  forskning ch om hur man b

M(o äst och snabbast denaturerar protein).   gneta  Askendal  för  ovärderling  hjälp  i  labbet  på  IFM,  för  alla  trevliga A

samtal och ”tjänstekakor”.  mina nuvarande som ”gamla” doktorandkollegor som delat dalar och toppar med mig, Ann­Charlotte Svensson Holm, Therese Eriksson, Anna Asplund Persson, Peter Garvin, Louise Levander, Ida Bergström, Simon  Jönsson, 

60 

JMohanna  Lönn,  Sofia  Pettersson,  Helena  Enocsson,  Paula  Linderbäck, artina Nylander. 

 anna Kälvegren, handledare, arbetskamrat, samarbetspartner och god vän. ack för att du drar med mig på upptåg på östgötska landsbHT ygden!  Peter Gunnarsson och Andreas ”the mentor” Eriksson  för att ni  lärt mig allt  jag  kan  om  ultimate  fighting…..  Tack  Peter  för  trevliga  fikastunder  och diskussioner kring  trombocyter,  filmer och allt möjligt  annat.  Tack Andreas för kloka råd om em mina skor. statistik och för att du fraktar h    Liza Ljungberg,  en mästare  i  tapetsering och Hanna Björck,  festfixare och rt  director,  för  att  ni  tog  med  mig  på  storstadsäventyr  när  jag  som mest ehövde en paus! ab lla medarbetare vid avdelningen, speciellt tack till Anita Thunberg, du är 

lippa! aen k alla  studenter,  examensarbetare  och  stipendiater  som  funnits  på  labbet ör  en  kortare  eller  längre  tid.  Speciellt  tack  till Christian Helldahl  för  din 

‐arbetet. fgedigna insats med TLR ina  kontorskamrater  Iréne Rydberg  och  Ingrid Hurtig  för  att  vi  har  så revligt på vå ntor! mt 

rt ko

Kajsa Uvda  Natalia Abrikossoval och  för vårt goda samarbete. 

blodgivare och personal på blodtappen som alla bidragit till min forskning.  

 Forskarskolan Forum Scientium med Stefan Klintstöm i spetsen.   Tack också till mina vänner utanför labbet, Veronica,  Peter  &  Nils  som  bjuder  på  goda  middagar,  många  skratt  och trevligt  sällskap. Cicci & Lotta, mycket goda vänner,  även om vi  ses allt  för llan! Sarah, trots att vi inte träffas lika ofta numera så känns det ändå som m det var igår, när vi väl ses!     sä

 o    

61 

Sist men igen in verkl te minst, ett STORT tack till min familj:  Mamma och Pappa som givit mig de allra bästa av förutsättningar och som lltid ser till att jag har det bra. Mina syskon Peter och Josefine, tack för att i är doman  ni är.  

ormo  du är b M r, eundransvärd. När jag blir stor vill jag bli som du!  isbeth, Anders och Hans för att ni får mig att känna att jag är en del av er amilj!Lf  

allt.   eter, för att du finns vid min sida, det betyder mest av en här boken är både ”en slutarbit” och ”en börjarbit”. 

PD           Finansiärerna av denna avhandling är:  

 Materials in Medicine (MiM) och flammation Centre (CIRC) 

StrategiområdenaCardiovascular Research InVetenskapsrådet Landstinget i Östergötland Hjärt‐Lungfonden Fonden för forskning utan djurförsök Trygg Hansas forskningsfond Svenska sällskapet för Medicinsk forskning tiftelserna Goljes minne, Lars Hiertas minne,  anna Svartz, Magnus Bergvall and Eleonora Demoroutis 

SN   

62 

63 

REFERENCES  

1.  Janeway, C.A., Jr., Travers, P., Walport, M., and Shlomchik, M., J., ogy. The immune system in health and disease. 6th ed. 2005, arland Science Publishing. 

ImmunobiolNew York: G

2.  Rather, L.J., Disturbance of function (functio laesa): the legendary fifth alen to the four cardinal signs of . 303‐22. 

cardinal sign of inflammation, added by GCelsus. Bull N Y Acad Med, 1971. 47(3): p

3.  Calabro, P., Willerson, J.T., and Yeh, E.T., Inflammatory cytokines stimulated ry smooth muscle cells. C­reactive protein production by human coronary arte

Circulation, 2003. 108(16): p. 1930‐2. 4.  Bottazzi, B., Doni, A., Garlanda, C., and Mantovani, A., An Integrated View of 

traxins as a Paradigm. Annu Rev Immunol, Humoral Innate Immunity: Pen2009. 28: p. 157‐83. 

rn recognition receptors and control of 21‐33. 

5.  Palm, N.W. and Medzhitov, R., Patteadaptive immunity. Immunol Rev, 2009. 227(1): p. 2

Pathogen recognition in the innate 0(1): p. 1‐16. 

6.  Kumar, H., Kawai, T., and Akira, S., immune response. Biochem J, 2009. 42

n, G.K., Innate immune signals in atherosclerosis.  5‐24. 

7.  Lundberg, A.M. and HanssoClin Immunol, 2010. 134(1): p.

he discovery of platelets and their function. 8.  Gazzaniga, V. and Ottini, L., TVesalius VII, 2001. 1: p. 22‐26. 

 Crivellato, E., Giulio Bizzozero and the discovery of platelets. 9.  Ribatti, D. andLeuk Res, 2007. 31(10): p. 1339‐41. 

65), G. Bizzozero (1882) and the discovery of 10.  Brewer, D.B., Max Schultze (18the platelet. Br J Haematol, 2006. 133(3): p. 251‐8. 

11.  Italiano, J.E. and Hartwig, J.H., Megacaryocyte Development and Platelet sevier Science. p. 23‐Function, in Platelets, A.D. Michelson, Editor. 2007, El

44. 12.  Kaufman, R.M., Airo, R., Pollack, S., and Crosby, W.H., Circulating 

let release in the lung. Blood, 1965. 26(6): p. 720‐megakaryocytes and plate31. 

13.  Behnke, O. and Forer, A., From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream. Eur J Haematol Suppl, 1998. 61: p. 3‐23. 

14.  Dunois‐Larde, C., Capron, C., Fichelson, S., Bauer, T., Cramer‐Borde, E., and Exposure of humaBaruch, D.,  n megakaryocytes to high shear rates 

accelerates platelet production. Blood, 2009. 114(9): p. 1875‐83. t Structure, in Platelet .D. Michelson, Editor. 2007, 15.  White, J.G., Platele s, A

Elsevier Science. p. 45‐74. 16.  Cramer, A.D.A.E., Production of platelets, in Platelets in thrombotic and non­

thrombotic disorders, C.P.P. Cresele, V. Fuster, and J. Vermylen, Editors. 2002, Cambridge University Press: Cambridge. p. 25. 

64 

17.  Varga‐Szabo,  echanisms inplatelets. Arterioscler ‐12. 

lexity of platelet aggregation. Blood, 2007  

D., Pleines, I., and Nieswandt, B., Cell adhesion m   Thromb Vasc Biol, 2008. 28(3): p. 403

18.  Jackson, S.P., The growing comp .109(12): p. 5087‐95. 

 take to make the perfect clot? : p. 41‐8. 

19.  Monroe, D.M. and Hoffman, M., What does itArterioscler Thromb Vasc Biol, 2006. 26(1)

20.  Escolar, G., Krumwiede, M., and White, J.G., Organization of the actin esting and activated platelets in suspension. Am J Pathol, cytoskeleton of r

1986. 123(1): p. 86‐94. V.T., Cytoskeleton uman p ing. J 

2. 21.  Nachmias,   of h latelets at rest and after spread

Cell Biol, 1980. 86(3): p. 795‐80, 22.  Reed, G.L., Platelet Secretion, in Platelets, A.D. Michelson, Editor. 2007

Elsevier Science. p. 309‐318. 23.  Maynard, D.M., Heijnen, H.F., Horne, M.K., White, J.G., and Gahl, W.A., 

Proteomic analysis of platelet alpha­granules using mass spectrometry. J Thromb Haemost, 2007. 5(9): p. 1945‐55. 

24.  Italiano, J.E., Jr., Richardson, J.L., Patel‐Hett, S., Battinelli, E., Zaslavsky, A., Short, S., Ryeom, S., Folkman, J., and Klement, G.L., Angiogenesis is regulated by a novel mechanism: pro­ and antiangiogenic proteins are organized into 

ially released. Blood, 2008. separate platelet alpha granules and different111(3): p. 1227‐33. 

n 25.  Warshaw, A.L., Laster, L., and Shulman, N.R., Protein synthesis by humaplatelets. J Biol Chem, 1967. 242(9): p. 2094‐7. 

26.  Lindemann, S., Tolley, N.D., Dixon, D.A., McIntyre, T.M., Prescott, S.M., Zimmerman, G.A., and Weyrich, A.S., Activated platelets mediate 

ignaling by regulated interleukin 1be ol, inflammatory s ta synthesis. J Cell Bi2001. 154(3): p. 485‐90. 

rothrombosis. Am J Cardiol, 2009. 27.  Jennings, L.K., Role of platelets in athe103(3 Suppl): p. 4A‐10A. 

esion mechanism platelet 28.  Ruggeri, Z.M. and Mendolicchio, G.L., Adh s in function. Circ Res, 2007. 100(12): p. 1673‐85. 

t receptors, in Platelets, A.D. 7‐144. 

29.  Clementson, K., J. and Clementson, J., M., PlateleMichelson, Editor. 2007, Elsevier Science. p. 11

30.  Savage, B., Almus‐Jacobs, F., and Ruggeri, Z.M., Specific synergy of multiple ctions in platelet thrombus formation under flow. 66. 

substrate­receptor interaCell, 1998. 94(5): p. 657‐

31.  Jung, S.M. and Moroi, M., Signal­transducing mechanisms involved in  receptor integrin alpha(2)beta(1). J Biol 

8016‐26. activation of the platelet collagenChem, 2000. 275(11): p. 

32.  Jung, S.M. and Moroi, M., Platelet collagen receptor integrin alpha2beta1 activation involves differential participation of ADP­receptor subtypes P2Y1 and P2Y12 but not intracellular calcium change. Eur J Biochem, 2001. 268(12): p. 3513‐22. 

33.  Van de Walle, G.R., Vanhoorelbeke, K., Majer, Z., Illyes, E., Baert, J., Pareyn, I., and Deckmyn, H., Two functional active conformations of the integrin 

65 

{alpha}2{beta}1, depending Chem, 2005. 280(44): p. 36873‐82. 

gnalling in platelets:  1998. 19(6): p. 260‐4. 

on activation condition and cell type. J Biol 

34.  Watson, S.P. and Gibbins, J., Collagen receptor siextending the role of the ITAM. Immunol Today,

35.  Tsuji, M., Ezumi, Y., Arai, M., and Takayama, H., A novel association of Fc receptor gamma­chain with glycoprotein VI and their co­expression as a 

‐collagen receptor in human platelets. J Biol Chem, 1997. 272(38): p. 2352831. 

36.  Kahn, M.L., Nakanishi‐Matsui, M., Shapiro, M.J., Ishihara, H., and Coughlin, vation of human 9‐87. 

S.R., Protease­activated receptors 1 and 4 mediate actiplatelets by thrombin. J Clin Invest, 1999. 103(6): p. 87

37.  Vu, T.K., Hung, D.T., Wheaton, V.I., and Coughlin, S.R., Molecular cloning of a functional thrombin receptor reveals a novel proteolytic mechanism of receptor activation. Cell, 1991. 64(6): p. 1057‐68. 

38.  Lourbakos, A., Yuan, Y.P., Jenkins, A.L., Travis, J., Andrade‐Gordon, P., Santulli, R., Potempa, J., and Pike, R.N., Activation of protease­activated receptors by gingipains from Porphyromonas gingivalis leads to platelet 

icity. Blood, 2001. 97(12): p. aggregation: a new trait in microbial pathogen3790‐7. 

39.  Gonzalez‐Alonso, J., Olsen, D.B., and Saltin, B., Erythrocyte and the regulation of human skeletal muscle blood flow and oxygen delivery: role of circulating ATP. Circ Res, 2002. 91(11): p. 1046‐55. 

40.  Daniel, J.L., Dangelmaier, C., Jin, J., Ashby, B., Smith, J.B., and Kunapuli, S.P., Molecular basis for ADP­induced platelet activation. I. Evidence for three 

ceptors on human platelets. J Biol Chem, 1998. 273(4): p. distinct ADP re2024‐9. 

41.  Kunapuli, S.P., Multiple P2 receptor subtypes on platelets: a new 1‐interpretation of their function. Trends Pharmacol Sci, 1998. 19(10): p. 39

4. 42.  Wang, L., Östberg, O., Wihlborg, A.K., Brogren, H., Jern, S., and Erlinge, D., 

Quantification of ADP and ATP receptor expression in human platelets. J Thromb Haemost, 2003. 1(2): p. 330‐6. 

43.  Takasaki, J., Kamohara, M., Saito, T., Matsumoto, M., Matsumoto, S., Ohishi, T., Soga, T., Matsushime, H., and Furuichi, K., Molecular cloning of the 

n with another (3): p. 432‐9. 

platelet P2T(AC) ADP receptor: pharmacological comparisoADP receptor, the P2Y(1) receptor. Mol Pharmacol, 2001. 60

44.  Mahaut‐Smith, M.P., Ennion, S.J., Rolf, M.G., and Evans, R.J., ADP is not an agonist at P2X(1) receptors: evidence for separate receptors stimulated by ATP and ADP on human platelets. Br J Pharmacol, 2000. 131(1): p. 108‐14. 

45.  Grenegård, M., Vretenbrant‐Öberg, K., Nylander, M., Desilets, S., Lindström, E.G., Larsson, A., Ramström, I., Ramström, S., and Lindahl, T.L., The ATP­gated P2X1 receptor plays a pivotal role in activation of aspirin­treated platelets by thrombin and epinephrine. J Biol Chem, 2008. 283(27): p. 18493‐504. 

66 

46.  Storey, R.F., Newby, L.J., and Heptinstall, S., Effects of P2Y(1) and P2Y(12) gonists on platelet aggregation induce  receptor anta d by different agonists in

human whole blood. Platelets, 2001. 12(7): p. 443‐7.  in Platelets, A.D. Michelson, Editor. 47.  Cattaneo, M., The Platelet P2 Receptors,

2007, Elsevier Science. p. 201‐220. 48.  Fitzgerald, J.R., Foster, T.J., and Cox, D., The interaction of bacterial 

pathogens with platelets. Nat Rev Microbiol, 2006. 4(6): p. 445‐57. 49.  Fowler, V.G., Jr., Sanders, L.L., Kong, L.K., McClelland, R.S., Gottlieb, G.S., Li, J., 

Ryan, T., Sexton, D.J., Roussakis, G., Harrell, L.J., and Corey, G.R., Infective occus aureus: 59 prospectively identified cases endocarditis due to Staphyloc

with follow­up. Clin Infect Dis, 1999. 28(1): p. 106‐14. nfection and immune ter, 2004. 9(4): p. 342‐6. 

50.  Franchini, M. and Veneri, D., Helicobacter pylori ithrombocytopenic purpura: an update. Helicobac

51.  Nguyen, T., Ghebrehiwet, B., and Peerschke, E.I., Staphylococcus aureus protein A recognizes platelet gC1qR/p33: a novel mechanism for 

0. 68(4): p. staphylococcal interactions with platelets. Infect Immun, 2002061‐8. 

52.  Peerschke, E.I., Bayer, A.S., Ghebrehiwet, B., and Xiong, Y.Q., gC1qR/p33 blockade reduces Staphylococcus aureus colonization of target tissues in an 

‐animal model of infective endocarditis. Infect Immun, 2006. 74(8): p. 441823. 

53.  Hawiger, J., Steckley, S., Hammond, D., Cheng, C., Timmons, S., Glick, A.D., and Des Prez, R.M., Staphylococci­induced human platelet injury mediated by protein A and immunoglobulin G Fc fragment receptor. J Clin Invest, 1979. 64(4): p. 931‐7. 

54.  Usui, Y., Ohshima, Y., Ichiman, Y., Ohtomo, T., Suganuma, M., and Yoshida,  species of coagulase­K., Platelet aggregation induced by strains of various

negative staphylococci. Microbiol Immunol, 1991. 35(1): p. 15‐26. n by 55.  Usui, Y., Ichiman, Y., Suganuma, M., and Yoshida, K., Platelet aggregatio

strains of enterococci. Microbiol Immunol, 1991. 35(11): p. 933‐42. 56.  Byrne, M.F., Kerrigan, S.W., Corcoran, P.A., Atherton, J.C., Murray, F.E., 

Fitzgerald, D.J., and Cox, D.M., Helicobacter pylori binds von Willebrand factor and interacts with GPIb to induce platelet aggregation. Gastroenterology, 2003. 124(7): p. 1846‐54. 

57.  Kälvegren, H., Bylin, H., Leanderson, P., Richter, A., Grenegård, M., and Bengtsson, T., Chlamydia pneumoniae induces nitric oxide synthase and lipoxygenase­dependent production of reactive oxygen species in platelets. 

s. Thromb Haemost, 2005. Effects on oxidation of low density lipoprotein94(2): p. 327‐35. 

58.  Kälvegren, H., Majeed, M., and Bengtsson, T., Chlamydia pneumoniae binds to platelets and triggers P­selectin expression and aggregation: a causal role in cardiovascular disease? Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2003. 23(9): p. 1677‐83. 

59.  Kälvegren, H., Fridfeldt, J., Garvin, P., Wind, L., Leanderson, P., Kristenson, M., Kihlstrom, E., Bengtsson, T., and Richter, A., Correlation between rises in 

67 

Chlamydia pneumoniae­specific antibodies, platelet activation and lipid onary intervention. Eur J Clin Microbiol peroxidation after percutaneous cor

Infect Dis, 2008. 27(7): p. 503‐11. 60.  Shor, A., Kuo, C.C., and Patton, D.L., Detection of Chlamydia pneumoniae in 

2. coronary arterial fatty streaks and atheromatous plaques. S Afr Med J, 19982(3): p. 158‐61. 

61.  Gaetti‐Jardim, E., Jr., Marcelino, S.L., Feitosa, A.C., Romito, G.A., and Avila‐Campos, M.J., Quantitative detection of periodontopathic bacteria in 

2009. 58(Pt atherosclerotic plaques from coronary arteries. J Med Microbiol, 12): p. 1568‐75. 

62.  Ståhl, A.L., Sartz, L., Nelsson, A., Bekassy, Z.D., and Karpman, D., Shiga toxin and lipopolysaccharide induce platelet­leukocyte aggregates and tissue 

S factor release, a thrombotic mechanism in hemolytic uremic syndrome. PLoOne, 2009. 4(9): p. e6990. 

63.  May, A.E., Langer, H., Seizer, P., Bigalke, B., Lindemann, S., and Gawaz, M., Platelet­leukocyte interactions in inflammation and atherothrombosis. Semin Thromb Hemost, 2007. 33(2): p. 123‐7. 

64.  Irving, P.M., Macey, M.G., Shah, U., Webb, L., Langmead, L., and Rampton, ates in inflammatory bowel . 361‐72. 

D.S., Formation of platelet­leukocyte aggregdisease. Inflamm Bowel Dis, 2004. 10(4): p

65.  Wetterö, J., Tengvall, P., and Bengtsson, T., Platelets stimulated by IgG­ate neutrophils through a selectin­dependent  24(9): p. 1559‐73. 

coated surfaces bind and activpathway. Biomaterials, 2003.

66.  Weber, C. and Springer, T.A., Neutrophil accumulation on activated, surface­adherent platelets in flow is mediated by interaction of Mac­1 with 

ting fibrinogen bound to alphaIIbbeta3 and stimulated by platelet­activafactor. J Clin Invest, 1997. 100(8): p. 2085‐93. 

67.  Diacovo, T.G., deFougerolles, A.R., Bainton, D.F., and Springer, T.A., A  functional integrin ligand on the surface of platelets: intercellular adhesion

molecule­2. J Clin Invest, 1994. 94(3): p. 1243‐51. 68.  Evangelista, V., Manarini, S., Sideri, R., Rotondo, S., Martelli, N., Piccoli, A., 

Totani, L., Piccardoni, P., Vestweber, D., de Gaetano, G., and Cerletti, C., Platelet/polymorphonuclear leukocyte interaction: P­selectin triggers 

dependent CD11b/CD18 adhesion: role of protein­tyrosine phosphorylation­PSGL­1 as a signaling molecule. Blood, 1999. 93(3): p. 876‐85. 

69.  Bengtsson, T. and Grenegård, M., Leucocyte activation by collagen­(6): p. stimulated platelets in whole blood. Scand J Clin Lab Invest, 2002. 62

451‐61. 70.  Li, N., Hu, H., Lindqvist, M., Wikstrom‐Jonsson, E., Goodall, A.H., and 

terioscler Hjemdahl, P., Platelet­leukocyte cross talk in whole blood. ArThromb Vasc Biol, 2000. 20(12): p. 2702‐8. 

71.  Bengtsson, T., Zalavary, S., Stendahl, O., and Grenegård, M., Release of oxygen metabolites from chemoattractant­stimulated neutrophils is inhibited by resting platelets: role of extracellular adenosine and actin polymerization. Blood, 1996. 87(10): p. 4411‐23. 

68 

72.  Zalavary, S., Grenegård, M., Stendahl, O., and Bengtsson, T., Platelets enhance Fc(gamma) receptor­mediated phagocytosis and respiratory burst 

: the role of purinergic modulation and actin polymerization. J in neutrophilsLeukoc Biol, 1996. 60(1): p. 58‐68. 

hagocytosing leucocytes: 73.  Brewer, D.B., Max Schultze and the living, moving, p1865. Med Hist, 1994. 38(1): p. 91‐101. 

introbe, M.M., The Kinetics of  24: p. 780‐803. 

74.  Cartwright, G.E., Athens, J.W., and WGranulopoiesis in Normal Man. Blood, 1964.

ocytes: neutrophils and 75.  Dale, D.C., Boxer, L., and Liles, W.C., The phagmonocytes. Blood, 2008. 112(4): p. 935‐45. 

76.  Bainton, D.F., Ullyot, J.L., and Farquhar, M.G., The development of ymorphonuclear leukocytes in human bone marrow. J Exp neutrophilic pol

Med, 1971. 134(4): p. 907‐34. 77.  Nauseef, W.M., How human neutrophils kill and degrade microbes: an 

integrated view. Immunol Rev, 2007. 219: p. 88‐102. 78.  Brinkmann, V., Reichard, U., Goosmann, C., Fauler, B., Uhlemann, Y., Weiss, 

linsky, A., Ne5663): p. 15

D.S., Weinrauch, Y., and Zych utrophil extracellular traps kill bacteria. Science, 2004. 303( 32‐5. 

ent. 2 ed. 1995: Oxford University 79.  Law, S.K.A. and Ried, K.B.M., ComplemPress. 

The role of the complement system in . 33(2): p. 103‐12. 

80.  Rus, H., Cudrici, C., and Niculescu, F., innate immunity. Immunol Res, 2005

81.  Berman, S., Gewurz, H., and Mold, C., Binding of C­reactive protein to is. J Immunol, nucleated cells leads to complement activation without cytolys

1986. 136(4): p. 1354‐9. 82.  Kang, Y.H., Tan, L.A., Carroll, M.V., Gentle, M.E., and Sim, R.B., Target pattern 

 classical and alternative recognition by complement proteins of thepathways. Adv Exp Med Biol, 2009. 653: p. 117‐28. 

lickstein, L.B., C1q­binding proteins and C1q nol, 1999. 11(1): p. 42‐6. 

83.  Nicholson‐Weller, A. and Kreceptors. Curr Opin Immu

84.  Reid, K.B. and Porter, R.R., Subunit composition and structure of  J, subcomponent C1q of the first component of human complement. Biochem

1976. 155(1): p. 19‐23. 85.  Lu, J.H., Teh, B.K., Wang, L., Wang, Y.N., Tan, Y.S., Lai, M.C., and Reid, K.B., 

ity. The classical and regulatory functions of C1q in immunity and autoimmunCell Mol Immunol, 2008. 5(1): p. 9‐21. 

86.  Schwaeble, W., Schafer, M.K., Petry, F., Fink, T., Knebel, D., Weihe, E., and Loos, M., Follicular dendritic cells, interdigitating cells, and cells of the monocyte­macrophage lineage are the C1q­producing sources in the spleen. 

ybridization and 95. 155(10): p. 4971‐8. 

Identification of specific cell types by in situ himmunohistochemical analysis. J Immunol, 19

87.  Muller, W., Hanauske‐Abel, H., and Loos, M., Biosynthesis of the first component of complement by human and guinea pig peritoneal macrophages: evidence for an independent production of the C1 subunits. J Immunol, 1978. 121(4): p. 1578‐84. 

69 

88.  Armbrust, T., Nordmann, B., Kreissig, M., and Ramadori, G., C1Q synthesis by tissue mononuclear phagocytes from normal and from damaged rat liver: up­

dexamethasone, down­regulation by interferon gamma, and aride. Hep

regulation by lipopolysacch atology, 1997. 26(1): p. 98‐106. 

 THP­: p. 197‐21  

89.  Walker, D.G., Expression and regulation of complement C1q by human1­derived macrophages. Mol Chem Neuropathol, 1998. 34(2‐3) 8.

90.  Andrews, B.S., Shadforth, M., Cunningham, P., and Davis, J.S.t., face of human endothelial cells. J Demonstration of a C1q receptor on the sur

Immunol, 1981. 127(3): p. 1075‐80. 91.  Bobak, D.A., Frank, M.M., and Tenner, A.J., Characterization of C1q receptor 

: effects of PDBu and fMLP. J Immunol, expression on human phagocytic cells1986. 136(12): p. 4604‐10. 

92.  Bordin, S., Kolb, W.P., and Page, R.C., C1Q receptors on cultured human  1983. 130(4): gingival fibroblasts: analysis of binding properties. J Immunol,

p. 1871‐5. 93.  Bordin, S., Smith, M., Ghebrehiwet, B., Oda, D., and Page, R.C., Smooth muscle 

nding sites for the C1q component of 51‐7. 

and epithelial cells express specific bicomplement. Clin Immunol Immunopathol, 1992. 63(1): p. 

elets possess specific ‐41. 

94.  Peerschke, E.I. and Ghebrehiwet, B., Human blood platbinding sites for C1q. J Immunol, 1987. 138(5): p. 1537

95.  Vegh, Z., Kew, R.R., Gruber, B.L., and Ghebrehiwet, B., Chemotaxis of human ed  

monocyte­derived dendritic cells to complement component C1q is mediatby the receptors gC1qR and cC1qR. Mol Immunol, 2006. 43(9): p. 1402‐7.

96.  Young, K.R., Jr., Ambrus, J.L., Jr., Malbran, A., Fauci, A.S., and Tenner, A.J., Complement subcomponent C1q stimulates Ig production by human B lymphocytes. J Immunol, 1991. 146(10): p. 3356‐64. 

97.  Steinberger, P., Szekeres, A., Wille, S., Stockl, J., Selenko, N., Prager, E., Staffler, G., Madic, O., Stockinger, H., and Knapp, W., Identification of human 

 J Leukoc CD93 as the phagocytic C1q receptor (C1qRp) by expression cloning.Biol, 2002. 71(1): p. 133‐40. 

98.  McGreal, E.P., Ikewaki, N., Akatsu, H., Morgan, B.P., and Gasque, P., Human ind C1q. J C1qRp is identical with CD93 and the mNI­11 antigen but does not b

Immunol, 2002. 168(10): p. 5222‐32. 99.  Ghebrehiwet, B., Lim, B.L., Kumar, R., Feng, X., and Peerschke, E.I., gC1q­

R/p33, a member of a new class of multifunctional and multicompartmental cellular proteins, is involved in inflammation and infection. Immunol Rev, 2001. 180: p. 65‐77. 

100.  van den Berg, R.H., Prins, F., Faber‐Krol, M.C., Lynch, N.J., Schwaeble, W., ular localization of the human receptor unol, 1997. 158(8): p. 3909‐16. 

van Es, L.A., and Daha, M.R., Intracellfor the globular domains of C1q. J Imm

101.  Ghebrehiwet, B. and Peerschke, E.I., cC1q­R (calreticulin) and gC1q­R/p33: ubiquitously expressed multi­ligand binding cellular proteins involved in inflammation and infection. Mol Immunol, 2004. 41(2‐3): p. 173‐83. 

70 

102.  Edelson, B.T., Stricker, T.P., Li, Z., Dickeson, S.K., Shepherd, V.L., Santoro, S.A., and Zutter, M.M., Novel collectin/C1q receptor mediates mast cell activation and innate immunity. Blood, 2006. 107(1): p. 143‐50. 

103.  Ogden, C.A., deCathelineau, A., Hoffmann, P.R., Bratton, D., Ghebrehiwet, B., Fadok, V.A., and Henson, P.M., C1q and mannose binding lectin engagement 

 of cell surface calreticulin and CD91 initiates macropinocytosis and uptake ofapoptotic cells. J Exp Med, 2001. 194(6): p. 781‐95. 

104.  Klickstein, L.B., Barbashov, S.F., Liu, T., Jack, R.M., and Nicholson‐Weller, A., 35) is a receptor for C1q. Immunity, Complement receptor type 1 (CR1, CD

1997. 7(3): p. 345‐55. Platelet membrane receptors for the ematol, 1994. 31(4): p. 320‐8. 

105.  Peerschke, E.I. and Ghebrehiwet, B., complement component C1q. Semin H

106.  Peerschke, E.I. and Ghebrehiwet, B., Platelet receptors for the complement ombosis. component C1q: implications for hemostasis and thr

Immunobiology, 1998. 199(2): p. 239‐49. 107.  Peerschke, E.I., Murphy, T.K., and Ghebrehiwet, B., Activation­dependent 

human blood platelets. Thromb surface expression of gC1qR/p33 on Haemost, 2003. 89(2): p. 331‐9. 

108.  Nepomuceno, R.R. and Tenner, A.J., C1qRP, the C1q receptor that enhances phagocytosis, is detected specifically in human cells of myeloid lineage, endothelial cells, and platelets. J Immunol, 1998. 160(4): p. 1929‐35. 

109.  Hamad, O.A., Ekdahl, K.N., Nilsson, P.H., Andersson, J., Magotti, P., Lambris, J.D., and Nilsson, B., Complement activation triggered by chondroitin sulfate 

mb Haemost, 2008. released by thrombin receptor­activated platelets. J Thro6(8): p. 1413‐21. 

110.  Bobak, D.A., Gaither, T.A., Frank, M.M., and Tenner, A.J., Modulation of FcR function by complement: subcomponent C1q enhances the phagocytosis of 

culture­derived ‐6. 

IgG­opsonized targets by human monocytes and macrophages. J Immunol, 1987. 138(4): p. 1150

111.  Peerschke, E.I., Reid, K.B., and Ghebrehiwet, B., Platelet activation by C1q results in the induction of alpha IIb/beta 3 integrins (GPIIb­IIIa) and the 

lant activity. J Exp Med, 1993. 178(2): expression of P­selectin and procoagup. 579‐87. 

let activation in . 5594‐8. 

112.  Peerschke, E.I. and Ghebrehiwet, B., C1q augments plateresponse to aggregated Ig. J Immunol, 1997. 159(11): p

113.  Sloand, J.A., Mehta, R.L., Schmer, G., and Rosenfeld, S.I., Influence of C1q on h human platelets. Clin 4. 

the interaction of model immune complexes witImmunol Immunopathol, 1995. 76(2): p. 127‐3

114.  Vollertsen, R.S., McDuffie, F.C., and Bowie, E.J., Interaction of human platelets with particle­adherent aggregated IgG: description of the experimental system and role of C1q and monomeric IgG. Clin Exp Immunol, 1983. 52(2): p. 423‐9. 

115.  Cazenave, J.P., Assimeh, S.N., Painter, R.H., Pachham, M.A., and Mustard, J.F., Clq inhibition of the interaction of collagen with human platelets. J Immunol, 1976. 116(1): p. 162‐3. 

71 

116.  Csako, G. and Suba, E.A., A phaggregation: inhibition by Cl emost, 1981. 45(2): p. 110‐5. 

117.  Tillet, W.S. and Francis, T.J., Serological reactions in pneumonia with non­tic fraction of pneumococcus. J Exp Med, 19

ysiologic regulator of collagen­induced platelet q. Thromb Ha

protein soma 30. 52(4): p. 561‐571. 

 C­reactive protein. Ann N Y Acad Sci, 118.  McCarty, M., Historical perspective on1982. 389: p. 1‐10. 

ific and Non­Specific Polysaccharides 31. 53(5): p. 625‐639. 

119.  Heidelberger, M. and Kendall, F.E., Specof Type Iv Pneumococcus. J Exp Med, 19

120.  Kushner, I., Broder, M.L., and Karp, D., Control of the acute phase response.  J Clin Serum C­reactive protein kinetics after acute myocardial infarction.

Invest, 1978. 61(2): p. 235‐42. 121.  Shrive, A.K., Cheetham, G.M., Holden, D., Myles, D.A., Turnell, W.G., 

Volanakis, J.E., Pepys, M.B., Bloomer, A.C., and Greenhough, T.J., Three ive protein. Nat Struct Biol, 1996. dimensional structure of human C­react

3(4): p. 346‐54. , T.W., C­reactive protein: ligands, receptors 122.  Marnell, L., Mold, C., and Du Clos

and role in inflammation. Clin Immunol, 2005. 117(2): p. 104‐11. 123.  Volanakis, J.E. and Kaplan, M.H., Specificity of C­reactive protein for choline 

c Soc Exp Biol phosphate residues of pneumococcal C­polysaccharide. ProMed, 1971. 136(2): p. 612‐4. 

124.  Chang, M.K., Binder, C.J., Torzewski, M., and Witztum, J.L., C­reactive protein binds to both oxidized LDL and apoptotic cells through recognition of a 

e of oxidized phospholipids. Proc Natl Acad ‐8. 

common ligand: PhosphorylcholinSci U S A, 2002. 99(20): p. 13043

125.  Volanakis, J.E. and Kaplan, M.H., Interaction of C­reactive protein complexes with the complement system. II. Consumption of guinea pig complement by 

(1): p. 9‐CRP complexes: requirement for human C1q. J Immunol, 1974. 11317. 

126.  Crowell, R.E., Du Clos, T.W., Montoya, G., Heaphy, E., and Mold, C., C­reactive e U­937. Evidence for 91. 147(10): p. 3445‐51. 

protein receptors on the human monocytic cell linadditional binding to Fc gamma RI. J Immunol, 19

127.  Robey, F.A., Jones, K.D., Tanaka, T., and Liu, T.Y., Binding of C­reactive gical protein to chromatin and nucleosome core particles. A possible physiolo

role of C­reactive protein. J Biol Chem, 1984. 259(11): p. 7311‐6. 128.  Potempa, L.A., Siegel, J.N., Fiedel, B.A., Potempa, R.T., and Gewurz, H., 

Expression, detection and assay of a neoantigen (Neo­CRP) associated with a 4(5): p. 531‐free, human C­reactive protein subunit. Mol Immunol, 1987. 2

41. 129.  Rees, R.F., Gewurz, H., Siegel, J.N., Coon, J., and Potempa, L.A., Expression of a 

 rabbit liver and muscle. C­reactive protein neoantigen (neo­CRP) in inflamedClin Immunol Immunopathol, 1988. 48(1): p. 95‐107. 

130.  Hurlimann, J., Thorbecke, G.J., and Hochwald, G.M., The liver as the site of C­reactive protein formation. J Exp Med, 1966. 123(2): p. 365‐78. 

72 

131.  Wilson, A.M., Swan, J.D., Ding, H., Zhang, Y., Whitbourn, R.J., Gurry, J., Yii, M., Wilson, A.C., Hill, M., Triggle, C., Best, J.D., and Jenkins, A.J., Widespread vascular production of C­reactive protein (CRP) and a relationship between 

d intimal hypertrophy. Atherosclerosis, 2007. serum CRP, plaque CRP an191(1): p. 175‐81. 

132.  Kuta, A.E. and Baum, L.L., C­reactive protein is produced by a small number (1): p. of normal human peripheral blood lymphocytes. J Exp Med, 1986. 164

321‐6. 133.  Enocsson, H., Sjöwall, C., Skogh, T., Eloranta, M.L., Rönnblom, L., and 

Wetterö, J., Interferon­alpha mediates suppression of C­reactive protein:  response in lupus flares? Arthritis explanation for muted C­reactive protein

Rheum, 2009. 60(12): p. 3755‐60. ation 134.  Mold, C., Gewurz, H., and Du Clos, T.W., Regulation of complement activ

by C­reactive protein. Immunopharmacology, 1999. 42(1‐3): p. 23‐30. 135.  Giannakis, E., Jokiranta, T.S., Male, D.A., Ranganathan, S., Ormsby, R.J., 

Fischetti, V.A., Mold, C., and Gordon, D.L., A common site within factor H SCR tococcal M 7 responsible for binding heparin, C­reactive protein and strep

protein. Eur J Immunol, 2003. 33(4): p. 962‐9. 136.  Jarva, H., Jokiranta, T.S., Hellwage, J., Zipfel, P.F., and Meri, S., Regulation of 

complement activation by C­reactive protein: targeting the complement inhibitory activity of factor H by an interaction with short consensus repeat domains 7 and 8­11. J Immunol, 1999. 163(7): p. 3957‐62. 

137.  Mihlan, M., Hebecker, M., Dahse, H.M., Halbich, S., Huber‐Lang, M., Dahse, R., Zipfel, P.F., and Jozsi, M., Human complement factor H­related protein 4 

 protein to necrotic cells. Mol binds and recruits native pentameric C­reactiveImmunol, 2009. 46(3): p. 335‐44. 

138.  Mihlan, M., Stippa, S., Jozsi, M., and Zipfel, P.F., Monomeric CRP contributes to complement control in fluid phase and on cellular surfaces and increases 

 p. 1630‐phagocytosis by recruiting factor H. Cell Death Differ, 2009. 16(12):40. 

139.  Sjöberg, A.P., Trouw, L.A., McGrath, F.D., Hack, C.E., and Blom, A.M., Regulation of complement activation by C­reactive protein: targeting of the inhibitory activity of C4b­binding protein. J Immunol, 2006. 176(12): p. 7612‐20. 

140.  Sjöwall, C., Wetterö, J., Bengtsson, T., Askendal, A., Almroth, G., Skogh, T., and Tengvall, P., Solid­phase classical complement activation by C­reactive protein (CRP) is inhibited by fluid­phase CRP­C1q interaction. Biochem Biophys Res Commun, 2007. 352(1): p. 251‐8. 

141.  Ridker, P.M., Cushman, M., Stampfer, M.J., Tracy, R.P., and Hennekens, C.H., Inflammation, aspirin, and the risk of cardiovascular disease in apparently healthy men. N Engl J Med, 1997. 336(14): p. 973‐9. 

142.  Curb, J.D., Abbott, R.D., Rodriguez, B.L., Sakkinen, P., Popper, J.S., Yano, K., and Tracy, R.P., C­reactive protein and the future risk of thromboembolic stroke in healthy men. Circulation, 2003. 107(15): p. 2016‐20. 

73 

143.  Blake, G.J., Rifai, N., Buring, J.E., and Ridker, P.M., Blood pressure, C­reactive ardiovascular events. Circulation, 2003. 108(24): protein, and risk of future c

p. 2993‐9. 144.  Sjöwall, C. and Wetterö, J., Pathogenic implications for autoantibodies 

ive protein and other acute phase proteins. Clin Chim Acta, against C­react2007. 378(1‐2): p. 13‐23. 

ctive protein: expression, structure, and function. ): p. 189‐97. 

145.  Volanakis, J.E., Human C­reaMol Immunol, 2001. 38(2‐3

146.  Du Clos, T.W. and Mold, C., C­reactive protein: an activator of innate d a modulator o 4. immunity an f adaptive immunity. Immunol Res, 200

30(3): p. 261‐77. 147.  Agrawal, A., CRP after 2004. Mol Immunol, 2005. 42(8): p. 927‐30. 148.  Cirillo, P., Golino, P., Calabro, P., Cali, G., Ragni, M., De Rosa, S., Cimmino, G., 

Pacileo, M., De Palma, R., Forte, L., Gargiulo, A., Corigliano, F.G., Angri, V., Spagnuolo, R., Nitsch, L., and Chiariello, M., C­reactive protein induces tissue factor expression and promotes smooth muscle and endothelial cell proliferation. Cardiovasc Res, 2005. 68(1): p. 47‐55. 

149.  Danenberg, H.D., Kantak, N., Grad, E., Swaminathan, R.V., Lotan, C., and Edelman, E.R., C­reactive protein promotes monocyte­platelet aggregation: an additional link to the inflammatory­thrombotic intricacy. Eur J Haematol, 2007. 78(3): p. 246‐52. 

150.  Zhong, W., Zen, Q., Tebo, J., Schlottmann, K., Coggeshall, M., and Mortensen, R.F., Effect of human C­reactive protein on chemokine and chemotactic 

taxis and signaling. J Immunol, 1998. factor­induced neutrophil chemo161(5): p. 2533‐40. 

ion of phagocytic leukocyte activities 0. 67(4): p. 495‐500. 

151.  Mortensen, R.F. and Zhong, W., Regulatby C­reactive protein. J Leukoc Biol, 200

152.  Devaraj, S., Venugopal, S., and Jialal, I., Native pentameric C­reactive protein displays more potent pro­atherogenic activities in human aortic endothelial 

(1): p. 48‐cells than modified C­reactive protein. Atherosclerosis, 2006. 18452. 

153.  Heuertz, R.M., Schneider, G.P., Potempa, L.A., and Webster, R.O., Native and  on human neutrophils. modified C­reactive protein bind different receptors

Int J Biochem Cell Biol, 2005. 37(2): p. 320‐35. 154.  Khreiss, T., Jozsef, L., Potempa, L.A., and Filep, J.G., Opposing effects of C­

reactive protein isoforms on shear­induced neutrophil­platelet adhesion and 713‐neutrophil aggregation in whole blood. Circulation, 2004. 110(17): p. 2

20. 155.  Potempa, L.A., Zeller, J.M., Fiedel, B.A., Kinoshita, C.M., and Gewurz, H., 

Stimulation of human neutrophils, monocytes, and platelets by modified C­ssing a neoantigenic specificity. Inflammation, reactive protein (CRP) expre

1988. 12(4): p. 391‐405. 156.  Fiedel, B.A. and Gewurz, H., Cleaved forms of C­reactive protein are 

associated with platelet inhibition. J Immunol, 1986. 136(7): p. 2551‐5. 

74 

157.  Bharadwaj, D., Stein, M.P., Volzer, M., Mold, C., and Du Clos, T.W., The major  receptor for C­reactive protein on leukocytes is fcgamma receptor II. J Exp

Med, 1999. 190(4): p. 585‐90. 158.  Marnell, L.L., Mold, C., Volzer, M.A., Burlingame, R.W., and Du Clos, T.W., C­

unol, reactive protein binds to Fc gamma RI in transfected COS cells. J Imm1995. 155(4): p. 2185‐93. 

159.  Bodman‐Smith, K.B., Gregory, R.E., Harrison, P.T., and Raynes, J.G., and FcgammaRIIa expression with FcgammaRI results in C­reactive protein­ 

IgG­mediated phagocytosis. J Leukoc Biol, 2004. 75(6): p. 1029‐35. 160.  Lemaitre, B., Nicolas, E., Michaut, L., Reichhart, J.M., and Hoffmann, J.A., The 

ontrols the  86(6): p. 973‐83. 

dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus cpotent antifungal response in Drosophila adults. Cell, 1996.

161.  Medzhitov, R., Preston‐Hurlburt, P., and Janeway, C.A., Jr., A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity. Nature, 1997. 388(6640): p. 394‐7. 

162.  Poltorak, A., He, X., Smirnova, I., Liu, M.Y., Van Huffel, C., Du, X., Birdwell, D., Alejos, E., Silva, M., Galanos, C., Freudenberg, M., Ricciardi‐Castagnoli, P., Layton, B., and Beutler, B., Defective LPS signaling in C3H/HeJ and 

lr4 gene. Science, 1998. 282(5396): p. C57BL/10ScCr mice: mutations in T2085‐8. 

ke receptors and innate immunity. 163.  Kumar, H., Kawai, T., and Akira, S., Toll­liBiochem Biophys Res Commun, 2009. 388(4): p. 621‐5. 

, K., Role of adapters in Toll­164.  Akira, S., Yamamoto, M., and Takeda like receptor signalling. Biochem Soc Trans, 2003. 31(Pt 3): p. 637‐42. 

edzhitov, R., Innate immune recognition. Annu Rev 97‐216. 

165.  Janeway, C.A., Jr. and MImmunol, 2002. 20: p. 1

166.  Lee, M.S. and Kim, Y.J., Signaling pathways downstream of pattern­recognition receptors and their cross talk. Annu Rev Biochem, 2007. 76: p. 447‐80. 

167.  Waggoner, S.N., Cruise, M.W., Kassel, R., and Hahn, Y.S., gC1q receptor ligation selectively down­regulates human IL­12 production through activation of the phosphoinositide 3­kinase pathway. J Immunol, 2005. 175(7): p. 4706‐14. 

168.  Yamada, M., Oritani, K., Kaisho, T., Ishikawa, J., Yoshida, H., Takahashi, I., Kawamoto, S., Ishida, N., Ujiie, H., Masaie, H., Botto, M., Tomiyama, Y., and Matsuzawa, Y., Complement C1q regulates LPS­induced cytokine production 

‐in bone marrow­derived dendritic cells. Eur J Immunol, 2004. 34(1): p. 22130. 

169.  Fraser, D.A., Bohlson, S.S., Jasinskiene, N., Rawal, N., Palmarini, G., Ruiz, S., Rochford, R., and Tenner, A.J., C1q and MBL, components of the innate 

06. immune system, influence monocyte cytokine expression. J Leukoc Biol, 2080(1): p. 107‐16. 

170.  Lood, C., Gullstrand, B., Truedsson, L., Olin, A.I., Alm, G.V., Rönnblom, L., Sturfelt, G., Eloranta, M.L., and Bengtsson, A.A., C1q inhibits immune complex­induced interferon­alpha production in plasmacytoid dendritic cells: 

75 

a novel link between C1q deficiency and systemic lupus erythematosus pathogenesis. Arthritis Rheum, 2009. 60(10): p. 3081‐90. 

171.  Aliprantis, A.O., Yang, R.B., Mark, M.R., Suggett, S., Devaux, B., Radolf, J.D., Klimpel, G.R., Godowski, P., and Zychlinsky, A., Cell activation and apoptosis by bacterial lipoproteins through toll­like receptor­2. Science, 1999. 285(5428): p. 736‐9. 

172.  Takeuchi, O., Kaufmann, A., Grote, K., Kawai, T., Hoshino, K., Morr, M., Muhlradt, P.F., and Akira, S., Cutting edge: preferentially the R­stereoisomer of the mycoplasmal lipopeptide macrophage­activating lipopeptide­2 

ent activates immune cells through a toll­like receptor 2­ and MyD88­dependsignaling pathway. J Immunol, 2000. 164(2): p. 554‐7. 

173.  Schwandner, R., Dziarski, R., Wesche, H., Rothe, M., and Kirschning, C.J., Peptidoglycan­ and lipoteichoic acid­induced cell activation is mediated by toll­like receptor 2. J Biol Chem, 1999. 274(25): p. 17406‐9. 

174.  Netea, M.G., Kullberg, B.J., Galama, J.M., Stalenhoef, A.F., Dinarello, C.A., and Van der Meer, J.W., Non­LPS components of Chlamydia pneumoniae stimulate cytokine production through Toll­like receptor 2­dependent pathways. Eur J Immunol, 2002. 32(4): p. 1188‐95. 

175.  Hirschfeld, M., Weis, J.J., Toshchakov, V., Salkowski, C.A., Cody, M.J., Ward, D.C., Qureshi, N., Michalek, S.M., and Vogel, S.N., Signaling by toll­like receptor 2 and 4 agonists results in differential gene expression in murine macrophages. Infect Immun, 2001. 69(3): p. 1477‐82. 

176.  Jin, M.S., Kim, S.E., Heo, J.Y., Lee, M.E., Kim, H.M., Paik, S.G., Lee, H., and Lee, J.O., Crystal structure of the TLR1­TLR2 heterodimer induced by binding of a tri­acylated lipopeptide. Cell, 2007. 130(6): p. 1071‐82. 

177.  Takeuchi, O., Sato, S., Horiuchi, T., Hoshino, K., Takeda, K., Dong, Z., Modlin, R.L., and Akira, S., Cutting edge: role of Toll­like receptor 1 in mediating 

eins. J Immunol, 2002. 169(1): p. 10‐immune response to microbial lipoprot4. 

178.  Takeda, K., Takeuchi, O., and Akira, S., Recognition of lipopeptides by Toll­like receptors. J Endotoxin Res, 2002. 8(6): p. 459‐63. 

179.  Hoebe, K., Georgel, P., Rutschmann, S., Du, X., Mudd, S., Crozat, K., Sovath, S., f Shamel, L., Hartung, T., Zahringer, U., and Beutler, B., CD36 is a sensor o

diacylglycerides. Nature, 2005. 433(7025): p. 523‐7. 180.  Jimenez‐Dalmaroni, M.J., Xiao, N., Corper, A.L., Verdino, P., Ainge, G.D., 

Larsen, D.S., Painter, G.F., Rudd, P.M., Dwek, R.A., Hoebe, K., Beutler, B., and Wilson, I.A., Soluble CD36 ectodomain binds negatively charged 

 co­receptor for TLR2. PLoS One, 2009. diacylglycerol ligands and acts as a4(10): p. e7411. 

181.  Silverstein, R.L. and Febbraio, M., CD36, a scavenger receptor involved in  immunity, metabolism, angiogenesis, and behavior. Sci Signal, 2009. 2(72):

p. re3. 182.  Cognasse, F., Hamzeh, H., Chavarin, P., Acquart, S., Genin, C., and Garraud, 

O., Evidence of Toll­like receptor molecules on human platelets. Immunol Cell Biol, 2005. 83(2): p. 196‐8. 

76 

183.  Shiraki, R., Inoue, N., Kawasaki, S., Takei, A., Kadotani, M., Ohnishi, Y., Ejiri, J., Kobayashi, S., Hirata, K., Kawashima, S., and Yokoyama, M., Expression of 

9‐Toll­like receptors on human platelets. Thromb Res, 2004. 113(6): p. 3785. 

184.  Andonegui, G., Kerfoot, S.M., McNagny, K., Ebbert, K.V., Patel, K.D., and Kubes, P., Platelets express functional Toll­like receptor­4. Blood, 2005. 106(7): p. 2417‐23. 

185.  Rex, S., Beaulieu, L.M., Perlman, D.H., Vitseva, O., Blair, P.S., McComb, M.E., Costello, C.E., and Freedman, J.E., Immune versus thrombotic stimulation of platelets differentially regulates signalling pathways, intracellular protein­

omb Haemost, 2009. protein interactions, and alpha­granule release. Thr102(1): p. 97‐110. 

186.  Berg, M., Offermanns, S., Seifert, R., and Schultz, G., Synthetic lipopeptide iol, Pam3CysSer(Lys)4 is an effective activator of human platelets. Am J Phys

1994. 266(6 Pt 1): p. C1684‐91. 187.  Ward, J.R., Bingle, L., Judge, H.M., Brown, S.B., Storey, R.F., Whyte, M.K., 

Dower, S.K., Buttle, D.J., and Sabroe, I., Agonists of toll­like receptor (TLR)2 and TLR4 are unable to modulate platelet activation by adenosine 

4(4): diphosphate and platelet activating factor. Thromb Haemost, 2005. 9p. 831‐8. 

Fridman, W.H., aett, 2004. 92(3)

188.  Cohen‐Solal, J.F., Cassard, L.,  nd Sautes‐Fridman, C., Fc gamma receptors. Immunol L : p. 199‐205. 

c receptors. Annu Rev Immunol, 2001. 19: 189.  Ravetch, J.V. and Bolland, S., IgG Fp. 275‐90. 

cgamma receptors as regulators of 8. 8(1): p. 34‐47. 

190.  Nimmerjahn, F. and Ravetch, J.V., Fimmune responses. Nat Rev Immunol, 200

e platelet Fc 191.  Anderson, G.P. and Anderson, C.L., Signal transduction by threceptor. Blood, 1990. 76(6): p. 1165‐72. 

192.  Mustard, J.F., Kinlough‐Rathbone, R.L., and Packham, M.A., Isolation of  by centrifugation and washing. Methods human platelets from plasma

Enzymol, 1989. 169: p. 3‐11. tion of human platelets by albumin s Enzymol, 1989. 169: p. 1

193.  Timmons, S. and Hawiger, J., Isolagradient and gel filtration. Method 1‐21. 

194.  Bengtsson, T. and Grenegård, M., Platelets amplify chemotactic peptide­nges in F­actin and calcium in human neutrophils. Eur J Cell Biol, : p. 345‐9. 

induced cha1994. 63(2)

195.  Boyum, A., Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes 

nd sedimentation at 1 g. Scand J Clin Lab 89. 

by combining centrifugation aInvest Suppl, 1968. 97: p. 77‐

196.  Ferrante, A. and Thong, Y.H., Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human blood by the Hypaque­Ficoll method. J Immunol Methods, 1980. 36(2): p. 109‐17. 

77 

197.  Welin, A., Winberg, M.E., Abdalla, H., Särndahl, E., Rasmusson, B., Stendahl, O., and Lerm, M., Incorporation of Mycobacterium tuberculosis 

 prerequisite for lipoarabinomannan into macrophage membrane rafts is athe phagosomal maturation block. Infect Immun, 2008. 76(7): p. 2882‐7. 

198.  Wetterö, J., Askendal, A., Bengtsson, T., and Tengvall, P., On the binding of  to solid artificial surfaces in vitro. Biomaterials, 2002. 23(4): p. complement

981‐91. 199.  Vroman, L., blood coagulation studies with the recording ellipsometer. 

iscellaneous Publication, Washington:National Bureau of Standards M1964. 256: p. 335‐348. 

200.  Tengvall, P., Lundström, I., and Liedberg, B., Protein adsorption studies on nic surfaces: an ellipsometric and infrared spectroscopic 

 407‐22. model orgaapproach. Biomaterials, 1998. 19(4‐5): p.

 in biomaterial research. 201.  Elwing, H., Protein absorption and ellipsometryBiomaterials, 1998. 19(4‐5): p. 397‐406. 

202.  Tengvall, P., Askendal, A., and Lundström, I.I., Ellipsometric in vitro studies on the activation of complement by human immunoglobulins M and G after 

urf B Biointerfaces, 2001. 20(1): adsorption to methylated silicon. Colloids Sp. 51‐62. 

203.  Benesch, J., Askendal, A., and Tengvall, P., Quantification of adsorbed human serum albumin at solid interfaces: a comparison between radioimmunoassay (RIA) and simple null ellipsometry. Colloids Surf B Interfaces, 2000(18): p. 71‐81. 

204.  Calaminus, S.D., Thomas, S., McCarty, O.J., Machesky, L.M., and Watson, S.P., h structure, the actin nodule, in the early 

944‐52. Identification of a novel, actin­ricstages of platelet spreading. J Thromb Haemost, 2008. 6(11): p. 1

haracterization of surface­205.  Park, K., Mao, F.W., and Park, H., Morphological cinduced platelet activation. Biomaterials, 1990. 11(1): p. 24‐31. 

206.  Cazenave, J.P., Packham, M.A., and Mustard, J.F., Adherence of platelets to a tative method. J Lab Clin collagen­coated surface: development of a quanti

Med, 1973. 82(6): p. 978‐90. 207.  Nadar, S.K., Caine, G.J., Blann, A.D., and Lip, G.Y., Platelet adhesion in 

hypertension: application of a novel assay of platelet adhesion. Ann Med, 2005. 37(1): p. 55‐60. 

208.  Bellavite, P., Andrioli, G., Guzzo, P., Arigliano, P., Chirumbolo, S., Manzato, F.,  and Santonastaso, C., A colorimetric method for the measurement of platelet

adhesion in microtiter plates. Anal Biochem, 1994. 216(2): p. 444‐50. 209.  Allen, R.D., Zacharski, L.R., Widirstky, S.T., Rosenstein, R., Zaitlin, L.M., and 

Burgess, D.R., Transformation and motility of human platelets: details of the d electron shape change and release reaction observed by optical an

microscopy. J Cell Biol, 1979. 83(1): p. 126‐42. 210.  Frank, R.D., Dresbach, H., Thelen, H., and Sieberth, H.G., Glutardialdehyde 

induced fluorescence technique (GIFT): a new method for the imaging of platelet adhesion on biomaterials. J Biomed Mater Res, 2000. 52(2): p. 374‐81. 

78 

211.  Eriksson, A.C. and Whiss, P.A., Measurement of adhesion of human platelets icol Methods, in plasma to protein surfaces in microplates. J Pharmacol Tox

2005. 52(3): p. 356‐65. 212.  Briede, J.J., Heemskerk, J.W., Hemker, H.C., and Lindhout, T., Heterogeneity 

in microparticle formation and exposure of anionic phospholipids at the . plasma membrane of single adherent platelets. Biochim Biophys Acta, 1999

1451(1): p. 163‐72. 213.  Kappelmayer, J., Nagy, B., Jr., Miszti‐Blasius, K., Hevessy, Z., and Setiadi, H., 

alue of P­selectin a ab Med, The emerging v s a disease marker. Clin Chem L2004. 42(5): p. 475‐86. 

214.  Clapham, D.E., Calcium signaling. Cell, 2007. 131(6): p. 1047‐58. , W., and Lechleiter, J.D., 215.  Paredes, R.M., Etzler, J.C., Watts, L.T., Zheng

Chemical calcium indicators. Methods, 2008. 46(3): p. 143‐51. 216.  Grynkiewicz, G., Poenie, M., and Tsien, R.Y., A new generation of Ca2+ 

ith greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem, 1985. indicators w260(6): p. 3440‐50. 

telets by adenosine diphosphate and its 217.  Born, G.V., Aggregation of blood plareversal. Nature, 1962. 194: p. 927‐929. 

.A., Whole blood platelet aggregometry nd ost, 2009. 35(2): p. 168‐80. 

218.  McGlasson, D.L. and Fritsma, G  aplatelet function testing. Semin Thromb Hem

rophils. J 219.  Dahlgren, C. and Karlsson, A., Respiratory burst in human neutImmunol Methods, 1999. 232(1‐2): p. 3‐14. 

220.  Gunnarsson, P., Levander, L., Påhlsson, P., and Grenegård, M., alpha(1)­acid  platelet shape change involves the Rho/Rho Thromb Haemost, 2009. 102(4): p. 694

glycoprotein (AGP)­inducedkinase signalling pathway.  ‐703. 

221.  Allen, R.C. and Loose, L.D., Phagocytic activation of a luminol­dependent it alveolar and peritoneal macrophages. Biochem chemiluminescence in rabb

Biophys Res Commun, 1976. 69(1): p. 245‐52. n by isolated and aggregated 222.  Palosuo, T. and Leikola, J., Platelet aggregatio

human IgG. Clin Exp Immunol, 1975. 20(2): p. 371‐4. 223.  Tengvall, P., Askendal, A., and Lundström, I., Complement activation by IgG 

 Mater Res, 1996. 31(3): p. 305‐immobilized on methylated silicon. J Biomed12. 

224.  Wetterö, J., Bengtsson, T., and Tengvall, P., Complement activation on immunoglobulin G­coated hydrophobic surfaces enhances the release of 

chanism. J oxygen radicals from neutrophils through an actin­dependent meBiomed Mater Res, 2000. 51(4): p. 742‐51. 

225.  Nimeri, G., Öhman, L., Elwing, H., Wetterö, J., and Bengtsson, T., The influence of plasma proteins and platelets on oxygen radical production and 

utrophils adhering to polymer surfaces. 5‐95. 

F­actin distribution in neBiomaterials, 2002. 23(8): p. 178

226.  Tang, L. and Eaton, J.W., Inflammatory responses to biomaterials. Am J Clin Pathol, 1995. 103(4): p. 466‐71. 

79 

227.  Nilsson, B., Ekdahl, K.N., Mollnes, T.E., and Lambris, J.D., The role of  inflammation. Mol Immunol, 2007. complement in biomaterial­induced

44(1‐3): p. 82‐94. 228.  Jancar, S. and Sanchez Crespo, M., Immune complex­mediated tissue injury: a 

multistep paradigm. Trends Immunol, 2005. 26(1): p. 48‐55. 229.  Kerrigan, S.W., Douglas, I., Wray, A., Heath, J., Byrne, M.F., Fitzgerald, D., and 

Cox, D., A role for glycoprotein Ib in Streptococcus sanguis­induced platelet aggregation. Blood, 2002. 100(2): p. 509‐16. 

230.  Fitzgerald, J.R., Loughman, A., Keane, F., Brennan, M., Knobel, M., Higgins, J., Visai, L., Speziale, P., Cox, D., and Foster, T.J., Fibronectin­binding proteins of Staphylococcus aureus mediate activation of human platelets via fibrinogen and fibronectin bridges to integrin GPIIb/IIIa and IgG binding to the FcgammaRIIa receptor. Mol Microbiol, 2006. 59(1): p. 212‐30. 

231.  McGrath, F.D., Brouwer, M.C., Arlaud, G.J., Daha, M.R., Hack, C.E., and Roos, tein A., Evidence that complement protein C1q interacts with C­reactive pro

through its globular head region. J Immunol, 2006. 176(5): p. 2950‐7. 232.  Wu, J., Edberg, J.C., Redecha, P.B., Bansal, V., Guyre, P.M., Coleman, K., 

Salmon, J.E., and Kimberly, R.P., A novel polymorphism of FcgammaRIIIa ase. J (CD16) alters receptor function and predisposes to autoimmune dise

Clin Invest, 1997. 100(5): p. 1059‐70. 233.  Carcao, M.D., Blanchette, V.S., Wakefield, C.D., Stephens, D., Ellis, J., 

Matheson, K., and Denomme, G.A., Fcgamma receptor IIa and IIIa  thrombocytopenic purpura. Br J polymorphisms in childhood immune

Haematol, 2003. 120(1): p. 135‐41. 234.  Peerschke, E.I. and Ghebrehiwet, B., Platelet interactions with C1q in whole 

 of immune complexes or aggregated IgG. Clin  1992. 63(1): p. 45‐

blood and in the presenceImmunol Immunopathol, 50. 

235.  Wang, H.W. and Sui, S.F., Dissociation and subunit rearrangement of tive proteins. Biochem Biophys Res . 

membrane­bound human C­reacCommun, 2001. 288(1): p. 75‐9

236.  Sivaraman, B. and Latour, R.A., The adherence of platelets to adsorbed ition of binding sites exposed by 

. albumin by receptor­mediated recognadsorption­induced unfolding. Biomaterials. 31(6): p. 1036‐44

hesion molecule P­selectin and 4(24): p. 2166‐79. 

237.  Blann, A.D., Nadar, S.K., and Lip, G.Y., The adcardiovascular disease. Eur Heart J, 2003. 2

238.  Brass, L.F., Shaller, C.C., and Belmonte, E.J., Inositol 1,4,5­triphosphate­induced granule secretion in platelets. Evidence that the activation of phospholipase C mediated by platelet thromboxane receptors involves a guanine nucleotide binding protein­dependent mechanism distinct from that of thrombin. J Clin Invest, 1987. 79(4): p. 1269‐75. 

239.  Cohen, S., Braiman, A., Shubinsky, G., Ohayon, A., Altman, A., and Isakov, N., PKCtheta is required for hemostasis and positive regulation of thrombin­induced platelet aggregation and alpha­granule secretion. Biochem Biophys Res Commun, 2009. 385(1): p. 22‐7. 

80 

240.  Hosszu, K.K., Santiago‐Schwarz, F., Peerschke, E.I., and Ghebrehiwet, B., Evidence that a C1q/C1qR system regulates monocyte­derived dendritic cell 

unity. Innate differentiation at the interface of innate and acquired immImmun, 2009. 

241.  Peerschke, E.I., Yin, W., Grigg, S.E., and Ghebrehiwet, B., Blood platelets activate the classical pathway of human complement. J Thromb Haemost, 2006. 4(9): p. 2035‐42. 

242.  Morton, L.F., Hargreaves, P.G., Farndale, R.W., Young, R.D., and Barnes, M.J., Integrin alpha 2 beta 1­independent activation of platelets by simple collagen­like peptides: collagen tertiary (triple­helical) and quaternary 

r alpha 2 beta 1­independent  2): p. 337‐44. 

(polymeric) structures are sufficient alone foplatelet reactivity. Biochem J, 1995. 306 ( Pt

243.  Surin, W.R., Barthwal, M.K., and Dikshit, M., Platelet collagen receptors, approaches for the prevention of 

03. signaling and antagonism: emerging intravascular thrombosis. Thromb Res, 2008. 122(6): p. 786‐8

et, B., Modulation of platelet responses to 244.  Peerschke, E.I. and Ghebrehiwcollagen by Clq receptors. J Immunol, 1990. 144(1): p. 221‐5. 

245.  Eriksson, A.C. and Whiss, P.A., Characterization of static adhesion of human faces in microplates. Blood Coagul 

97‐206. platelets in plasma to protein surFibrinolysis, 2009. 20(3): p. 1

246.  Tenner, A.J. and Cooper, N.R., Stimulation of a human polymorphonuclear he C1q subunit of the first complement 8(6): p. 2547‐52. 

leukocyte oxidative response by tcomponent. J Immunol, 1982. 12

247.  Goodman, E.B. and Tenner, A.J., Signal transduction mechanisms of C1q­mediated superoxide production. Evidence for the involvement of temporally 

munol, 1992. distinct staurosporine­insensitive and sensitive pathways. J Im148(12): p. 3920‐8. 

248.  Nylander, M., Lindahl, T.L., Bengtsson, T., and Grenegård, M., The yromonas gingivalis sensitisestelets, 2008. 19(5): p. 352‐8. 

periodontal pathogen Porph  human blood platelets to epinephrine. Pla

ci, 249.  Kerrigan, S.W. and Cox, D., Platelet­bacterial interactions. Cell Mol Life S2010. 67(4): p. 513‐23. 

250.  Blair, P., Rex, S., Vitseva, O., Beaulieu, L., Tanriverdi, K., Chakrabarti, S., Hayashi, C., Genco, C.A., Iafrati, M., and Freedman, J.E., Stimulation of Toll­like receptor 2 in human platelets induces a thromboinflammatory response through activation of phosphoinositide 3­kinase. Circ Res, 2009. 104(3): p. 346‐54. 

251.  Zhang, G., Han, J., Welch, E.J., Ye, R.D., Voyno‐Yasenetskaya, T.A., Malik, A.B., Du, X., and Li, Z., Lipopolysaccharide stimulates platelet secretion and potentiates platelet aggregation via TLR4/MyD88 and the cGMP­dependent protein kinase pathway. J Immunol, 2009. 182(12): p. 7997‐8004.