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ISSN 1808-9909 Volume 2 Nuacutemero 2 2006
Publicaccedilatildeo Cientiacutefica da Associaccedilatildeo Brasileira de Cultura de Tecidos de Plantas
Plant Cell Cult Micropropag Lavras MG v
2 n
2 p 53-106 2006
PLANT CELL CULTURE amp
MICROPROPAGATION
Cultura de Ceacutelulas amp
Micropropagaccedilatildeo de Plantas
A revista ldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquo editada semestralmente pela Editora daUniversidade Federal de Lavras (Editora UFLA) publica artigos cientiacuteficos da aacuterea de cultura de tecidos deplantas por membros da comunidade cientiacutefica nacional e internacional Com uma tiragem de 600 exemplareseacute distribuiacuteda aos membros da ASSOCIACcedilAtildeO BRASILEIRA DE CULTURA DE TECIDOS DEPLANTAS (ABCTP) em dia com a anuidade
Para se associar agrave ABCTP consulte o site ltwwwabctpuflabrgt
PERMUTA
A revista ldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquo deseja fazer permuta com revistas de aacutereas afins
ABCTP
Universidade Federal de Lavras - Departamento de BiologiaSetor de Fisiologia Vegetal - Caixa Postal 3037 - Lavras ndash MG - CEP 37200-000
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FICHA CATALOGRAacuteFICA
Plant Cell Culture amp Micropropagation = Cultura de Ceacutelulas amp Micropropagaccedilatildeo de Plantas ndash v 1 n 1 (janjun 2005)- ndash Lavras Ed UFLA 2005- v il
Semestral (junho e dezembro) Publicaccedilatildeo Cientiacutefica da Associaccedilatildeo Brasileira de Cultura de Tecidosde Plantas (ABCTP) ISSN 1808-9909
1 Cultura de Tecidos de Plantas I Associaccedilatildeo Brasileira de Culturade Tecidos de Plantas II Universidade Federal de Lavras Departamen-
to de Biologia Setor de Fisiologia Vegetal
INDEXADO porAGRISAGROBASE
CDD (22ordf ed) 58072405
DIRETORIA
Presidente ndash Renato Paiva ndash UFLA Secretaacuterio ndash Moacir Pasqual ndash UFLA
Secretaacuterio Adjunto ndash Antocircnio Carlos Torres ndash EMBRAPA Hortaliccedilas Tesoureiro ndash Guilherme Augusto Canella Gomes ndash Benger do Brasil
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EDITOR CHEFE Renato Paiva ndash UFLA
CONSELHO EDITORIAL Antocircnio Carlos Torres ndash EMBRAPA Hortaliccedilas
Moacir Pasqual ndash UFLA Renato Paiva ndash UFLA
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NOMENCLATURA CIENTIacuteFICA Manuel Losada Gavilanes ndash UFLA
EDITORACcedilAtildeO Christyane Aparecida Caetano ndash Editora UFLA
Aleacutezia Conceiccedilatildeo Modesto Ribeiro ndash Editora UFLA Luciana Carvalho Costa ndash Editora UFLA
REVISAtildeO DE PORTUGUEcircS Amanda Jackeline Santos Silva
REVISAtildeO DE INGLEcircS Renato Paiva
ndash UFLA
SECRETARIACr ist iano Mar t inot t o ndash UFLA
Daiane Peixot o Var gas ndash UFLA
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Fr ancisco de Assis Paiva Campos - UFCGilber t o Bar bant e Ker bauy - USP
J oatildeo Bat ist a Teixeir a - EMBRAPA Recur sos Geneacutet icos e Biot ecnologiaJ oseacute Ant ocircnio Pet er s - UFPEL
Kasumit su Mat sumot o- EMBRAPA Recur sos Geneacutet icos e Biot ecnologiaLilia Gomes Willadino - UFRPE
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Magdi Ahmed I br ahim Alouf a - UFRNMar guer it e Ger maine Ghislaine Quoir in- UFPR
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Otto Jesu Crocomo ndash ESALQ - USPRenat o de Oliveir a Resende - UNB
Schuyler Kor ban ndash Univer sidade de I llinois - Est ados UnidosSilvio Lopes Teixeira - UENF
Ter ezinha Rangel Camar a ndash UFRPEWagner Apar ecido Vendr ame ndash Univer sidade da Floacuter ida ndash Est ados Unidos
Wagner Campos Ot oni ndash UFV
CONSULTORI A CI ENTIacute FI CA (Vol 2 N 2)Alexandr e Hof f mann ndash EMBRAPA Uva e VinhoAlexandr e Mor ais do Amar al ndash EMBRAPA-I AC
Aloisio Xavier ndash UFVAnt ocircnio Chalf un J unior ndash UFLA
Eur ico Eduar do Pint o de Lemos ndash UFALEvar ist o Maur o de Cast r o ndash UFLAGilber t o Bar bant e Ker bauy ndash USP
J oatildeo Bat ist a Teixeir a ndash EMBRAPA Cenar gemJoseacute Raniere F Santana ndash UEFS
Luiz Ant ocircnio Biasi ndash UFPRMiguel Pedr o Guer r a ndash UFSC
Osmar Alves Lameir a ndash EMBRAPA Amazocircnia Or ient alOt t o J esu Cr ocomo ndash ESALQ USP
Ricar do Tadeu de Far ia ndash UELWagner Campos Ot oni ndash UFV
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-106 2006
Plant Cell Culture amp Micropropagation
ISSN 1808-9909
CONTEUacuteDO
01 In vitro propagation of Melissa officinalis L and production of essential oil In vitro propagation of Melissa officinalis L and production of essential oil Simone da Silva Celso Luiz Salgueiro Lage Maria Apparecida Esquibel Rosane Aguiar da Silva San Gil Alice Sato
53
02 Crescimento in vitro de Laelia tenebrosa (ORCHIDACEAE) em diferentes concentraccedilotildees de sais de Knudson C e carvatildeo ativado In vitro growth of Laelia tenebrosa (ORCHIDACEAE) in different concentrations of Knudson C salts and activated charcoal Aparecida Gomes de Araujo Moacir Pasqual Alba Regina Pereira Herminio Souza Rocha 61
03 Propagaccedilatildeo in vitro de placircntulas de orquiacutedea em diferentes meios de cultura e concentraccedilotildees de citocinina In vitro propagation of orchid plantlets cultivated in different culture media and cytokinin concentrations Aparecida Gomes de Araujo Moacir Pasqual Adriano Bortolotti da Silva Fabiacuteola Villa Hermiacutenio Souza Rocha Fernanda Carvalho Costa 68
04 Efeito do viacuterus das estrias da bananeira na micropropagaccedilatildeo e no crescimento das plantas da cultivar caipira durante a aclimatizaccedilatildeo Effect of banana streak virus on micropropagation and plant growth of cultivar caipira during acclimatization Daniela Garcia Silveira Antocircnio da Silva Souza Paulo Ernesto Meissner Filho Tales Miler Soares Ranulfo Correa Caldas Kaacutetia Regina Barbosa Leatildeo 74
05 Caracteriacutesticas morfofisioloacutegicas de brotaccedilotildees de Agapanthus umbellatus var minor multiplicadas em biorreator de imersatildeo temporaacuteria Morphological and physiological characteristics Agapanthus umbellatus var minor of shoots propagated in bioreactor of temporary immersion Luciana Alves Fogaccedila Denilson Dortzbach Antonio Carlos Alves Enio Luiz Pedrotti 80 06 Capacidade de regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro cultivar Santa Clara In vitro regeneration capacity of tomato plant cultivar Santa Clara Glaucia de Fatima Moreira Vieira e Souza Joseacute Magno Queiroz Luz Alcione Silva Arruda Denise Garcia Santana Mariana de Souza e Silva da Costa Teixeira Luciana Londe Adelaide Siqueira Silva Elisacircngela Rodrigues Figueira 88
07 Induccedilatildeo de calos a partir de cultura de anteras de cafeeiro (Coffea arabica L) cv Catuaiacute Vermelho 99 e 44 Callus induction from anther culture of coffee plant (Coffea arabica L) cv Catuaiacute Vermelho 99 and 44 Adelaide Siqueira Silva Joseacute Magno Queiroz Luz Denise Garcia Santana Patriacutecia Crystie Vieira Mustafa Moacir Pasqual Glaucia de Fatima Moreira Vieira e Souza 94
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Plant Cell Culture amp Micropropagation
ISSN 1808-9909
COMUNICACcedilAtildeO CIENTIacuteFICA
08 Proliferaccedilatildeo in vitro de brotos de Curauaacute utilizando diferentes volumes de meio de cultura In vitro shoot proliferation of Ananas erectifolius using different volumes of culture medium Flaacutevia Dioniacutesio Pereira Joseacute Eduardo Brasil Pereira Pinto Helen Cristina de Arruda Rodrigues Luciana Domiciano Silva Rosado Luiz Alberto Beijo Osmar Alves Lameira 102
In vitro propagation of Melissa officinalis L and production 53
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IN VITRO PROPAGATION OF Melissa officinalis L AND PRODUCTIONOF ESSENTIAL OIL
IN VITRO PROPAGATION OF Melissa officinalis L AND PRODUCTION OFESSENTIAL OIL
SIMONE DA SILVA1 CELSO LUIZ SALGUEIRO LAGE2 MARIA APPARECIDA ESQUIBEL3ROSANE AGUIAR DA SILVA SAN GIL4 ALICE SATO5
1Doutoranda em Biotecnologia Vegetal ndashUFRJIBC Chagas Filho ndash Av Brigadeiro Trompowsky SN Ccs ndash Bloco G ndash Sala G2-050 ndash Cidade Universitaacuteria ndash Laboratoacuterio de Fisiologia Vegetal ndash Ilha do Fundatildeo ndash 21949-900 ndash Rio de Janeiro RJ ndash monybiofufrjbr
2Dr em Biofiacutesica ndashUFRJ ndash Instituto de Biofiacutesica Carlos Chagas Filho ndash Laboratoacuterio de Fisiologia Vegetal ndash Ilha do Fundatildeo ndash 21949-900 ndash Rio de Janeiro RJ ndash clslagebiofufrjbr3Poacutes-Doutorado em Bioeletrogecircnese ndash UFRJ ndash Instituto de Biofiacutesica Carlos Chagas Filho ndash Laboratoacuterio de Fisiologia Vegetal ndash Ilha do Fundatildeo ndash 21949-900 ndash Rio de Janeiro RJ ndash esquibelbiofufrjbr4Dra em Quiacutemica Orgacircnica ndash Ufrj DQO ndash Edifiacutecio do Centro de Tecnologia ndash Bloco A ndash Sala 605 ndash Ilha do Fundatildeo ndash Cidade Universitaacuteria ndash Caixa Postal 068556 ndash 21941-972 ndash Rio de Janeiro RJ ndash rsangilIqufrjbr5Dra em Biotecnologia Vegetal ndash UNIRIODCN ndash Centro de Ciecircncias Bioloacutegicas e da Sauacutede ndash Av Pasteur 458 Preacutedio da ECB ndash 4ordmandar Sala 415 URCA ndash 22290-240 ndash Rio de Janeiro RJ ndash alicesatouniriobr
ABSTRACTThis work presents an efficient protocol for micropropagation
of Melissa officinalis L through axillary bud proliferation obtainedfrom in vitro germinated seeds on basal Murashige amp Skoog medium(MS) The explants were grown on MS supplemented with differentgrowth regulators NAA (05 mM) KIN (05 mM) BA (05 mM)GA
3 (28 microM) and IAA (05 mM) Higher shoot proliferation and
rooting rates were obtained on MS supplemented with 05 microM IAAMicropropagated plants were acclimatized and transferred to soilwith success The essential oil composition in shoots of in vitro andfield-grown (ex vitro) plants was determined by gas chromatographymass spectrometry The major components of essential oils detectedin both plant materials were pujone neral geraniol and geranial Mofficinalis in vitro plantlets developed on MS media showed 14higher proportions of nerol and 41 of geraniol when compared withfield grown plants
Index terms Growth regulators medicinal plant tissue culture
RESUMOEste trabalho apresenta um protocolo raacutepido e eficiente
para propagaccedilatildeo in vitro de Melissa officinalis L atraveacutes daproliferaccedilatildeo de gemas axilares de plantas obtidas de sementesgerminadas em meio basal de Murashige amp Skoog (MS) Os explantesforam cultivados em meio de Murashige amp Skoog (MS) 1962com adiccedilatildeo de diferentes reguladores de crescimento Aacutecido alfa-naftaleno-aceacutetico (ANA ndash 05 mM) Cinetina (KIN ndash 05 mM)Benziladenina (BA ndash 05 mM) Aacutecido Gibereacutelico (GA
3 ndash 28 microM)
e Aacutecido Indolaceacutetico (AIA ndash 05 mM) O alongamento e formaccedilatildeode segmentos nodais maacuteximos foram obtidos com AIA Explantesdesenvolveram 5 novos brotos com 10 cm em meacutedia e 100 deenraizamento em 30 dias de cultura Plantas micropropagadasforam aclimatadas e transferidas para o solo com sucesso Acomposiccedilatildeo do oacuteleo essencial de partes aeacutereas de plantas produzidasin vitro e plantas crescidas em campo (ex vitro) foi determinadapor cromatografia gasosa acoplada agrave espectrometria de massas Os
principais componentes do oacuteleo essencial encontrados em ambosos materiais vegetais foram a pujona neral geraniol e geranial Asplantas de Melissa officinalis desenvolvidas in vitro em MSapresentaram aumento de 14 vezes na proporccedilatildeo do nerol e de 41na de geraniol quando comparadas agraves plantas ex vitro
Termos para indexaccedilatildeo Reguladores de crescimento plantamedicinal cultura de tecidos
INTRODUCTION
Melissa officinalis L (Lamiaceae) is a well-known
herb used to give fragrance to different food and beverage
products It has also been used as a medicinal plant for
treatment of headaches gastrointestinal disorders
nervousness and rheumatism The essential oil is a well-
known antibacterial and antifungal agent and it is also
responsible for the mild depressive and spasmolytic
properties of the plant Literature data pointed out antioxidant
properties of methanolic extracts of Melissa officinalis which
are mostly due to high portion of phenolic acids revealing
significant antimicrobial particularly antibacterial activity of
this essential oil (MIMICA-DUKIC et al 2004)
The chemical composition of the essential oil of
Melissa officinalis leaf (02-1 on dry weight) has been
studied The major compounds (10-40) are citral (neral
and geranial) and these are accompanied by limonene
cineole geraniol szlig-caryophyllene and spathulenol The
(Recebido em 06 de setembro de 2005 e aprovado em 21 de junho de 2006)
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leaf also contains polyphenolic compounds
hydroxycinnamic derivatives with verbascoside (53)
flavonoids such as luteolin 7-glucoside and luteolin 7-
diglucuronide (08) These compounds probably
intervene in the antispasmodic activity Iridoid glucosides
were also reported and the infusion contains potassium
(CARNAT et al 1999)
Cultivation of medicinal plants for the purpose of
extraction of active constituents may face certain limitations
such as climate season water availability diseases and
pests and scarcity of naturally growing plants Such
limitations led to the use of tissue culture techniques for
production of the active constituents Tissue culture
provides means of rapid propagation of a large number of
uniform plants while maintaining their genotype Beneficial
uses of tissue culture for the purpose of extraction of
secondary metabolites include avoidance of collection of
endangered wild species production of secondary
metabolites due to rapid growth of cultures in vitro
(ARIKAT et al 2004)
Due to the importance of this plant for multiple
purposes and the difficulty to produce active compounds
in vitro the application of methods that provide higher
number of cloned plants of M officinalis is justified aiming
to select high quality plant lines to extensive culture and
extraction of pharmaceutical products In Brazil M
officinalis is used in phytomedicine by pharmaceutical
industries One of the most critical problems of
phytomedicine is the natural variation of plants chemical
constituents (CURRIER et al 2000) This variation could
be originated from genetical factors or under influence of
environmental characteristics
The use of in vitro systems have been reported as
an effective tool for obtaining genetically uniform plants
which can be the source for less variable pharmaceutical
preparations Plant regeneration of M officinalis has been
achieved using as explants cotyledonary nodes of 10-day-
old Melissa officinalis seedlings (TAVARES et al 1996)
shoot tips from plants cultivated at greenhouse
(MEacuteSZAacuteROS et al 1999) using various types and
concentrations of cytokinins auxins and triacontanol
(TANTOS et al 1999)
The aim of this work is to develop a
micropropagation method in order to obtain a significant
number of monoclonal plants for further field cultivation
comparing the essential oil content and composition
between micropropagated and field-grown plants
MATERIALS AND METHODS
Plant material
Representative specimens from field grown plants
of M officinalis were selected and submitted to Erika Von
Sohsten Medeiros and Angela Vaz (Rio de Janeiro
Botanical Garden) for the taxonomic confirmation A
voucher nordm RB ndash 365926 is deposited at the Herbarium of
Rio de Janeiro Botanic Garden
Melissa officinalis seeds were obtained from
commercial market ISLAR batch Nordm 8250 The seeds were
germinated and grown to the seedling stage in vitro Seeds
were pre-treated by immersion into 2 commercial bleach
solution (Globoacirc) for 20 min and then rinsed thoroughly
in running tap water After that the seeds were surface
sterilized in 70 ethanol for 20 min followed by 15 min in a
20 commercial bleach solution containing 2-3 drops of
Tween 20 under aseptic conditions and rinsed three times
with sterile distilled water The seeds were cultured on MS
(MURASHIGE amp SKOOG 1962) solid medium
supplemented with 30 gL-1 sucrose 148 mM thiamine-
HCl 243 mM pyridoxine-HCl 41 mM nicotinic acid and
06 mM myo-inositol The pH value was adjusted at 58 plusmn
01 before addition of 8 gL-1 of agar and the media were
sterilized in autoclave (120 degC during 15 min) The cultures
were incubed at 25 plusmn 1 degC under a 16 h light 8 h dark
regime at an irradiance of 230 mmolm-sup2s-1 (white light
illumination Sylvaniaacirc fluorescent tubes)
Establishment of in vitro shoot cultures
From in vitro 8-day-old germinated seeds plants
(20-30 cm in length) of three different clones designated
In vitro propagation of Melissa officinalis L and production 55
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
as clones 1 2 e 3 were selected and axillary shoot induction
takes place from nodal segments (1 cm in length)
subcultivated on MS hormone-free media (MS0) These
materials were used as donors of explants to be tested
with different culture media 05mM a-naphthaleneacetic
acid (NAA) 05mM kinetin (KIN) 05mM benzyladenine
(BA) 28 mM gibberellic acid (GA3) and 05mM indole-3-
acetic acid (IAA) Cultures were grown in 300 mL glass
flasks containing 40 ml of media each
Shoot proliferation rate length of both shoots and
roots and calli formation were monitored as growth
parameters Each treatment was replicated 3 times using
100 explants per repetition Subcultures were performed at
30 days intervals
Acclimatization
A total of 60 in vitro rooted microshoots (those grown
on MS + IAA during 30 days with average height of 10 cm
were removed from the medium and the agar washed gently
with tap water They were transferred to 60 cm diameter
plastic pots containing soil and humus (31 vv) and kept at
a greenhouse High humidity environment was provide by
covering the plants with a plastic foil and watering them
one time per day during the first 2 weeks Then plants were
gradually exposed to greenhouse conditions for 1 month
and finally transferred to the field where they were cultivated
during one year until complete life cycle
Extraction
Field-grown and fresh in vitro plantlets aerial parts
(100 g each) were submitted to hydro distillation for 140 h
in a Clevenger type apparatus as recommended by the
Brazilian Pharmacopoeia (1988) in replicate (n = 2) The
time between the isolation and analysis was the same in all
experiments to preclude differences in composition due to
external factors (SILVA et al 2003)
Gas chromatographic and gas chromatography-massspectrometric analysis
Gas chromatography with flame ionization
detection (GCFID) was carried out on a Varian Star Model
3350 instrument using a capillary column coated with DB-
5 (30 m x 025 mm i d 025 mm film thickness J amp W
Scientific Folsom CA USA) The GC oven was heated
using the following program 40 oC to 220 oC at 4 oC min-1
with an initial isothermal period of 1 min splitless The
detector and injector temperatures were held at 280 oC
Hydrogen was used as carrier gas The injection consisted
of 10 microL of distilled oil diluted with hexane The GCMS
analyses were carried out on a Hewlett-Packard (Agilent
Technologies Avondale USA) Model 5972 MSD coupled
to a HP 5890 GC The GC conditions were the same as
above except for the fact that helium was used as carrier
gas The mass spectrometer was operated on electron
impact mode at 70 eV Molecular assignments were
performed with the help of the Wiley 275 standard library
of mass spectra literature data (ADAMS 1995) authentic
geraniol standard (Sigma Part Number G5135) and mass
spectra interpretation besides the comparison with
previously published elution order (KREIS amp MOSAND
1994) Quantification was performed from GC profiles using
area percent since in the literature the FID response factor
for most of monoterpenes is determined as 1 (CARNAT et
al 1999)
Statistical analysis
Data for each experiment were subjected to analysis
of variance (ANOVA) and means were compared using the
Tukey-Kramer test Percent data were submitted to
significance test ndash difference between two percentages
using the Statistica for WindowsTM 50 version A
significance level of 5 was used for all statistical analysis
RESULTS AND DISCUSSION
In vitro multiplication of Melissa officinalis was
followed during four developing cycles Micropropagation
papers usually present an efficient protocol evaluated in
only one developing cycle This kind of protocol however
may fail when the cultures have to be kept during long
time many successive subcultures being necessary in
order to produce large number of clonal plants
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In vitro establishment
In this work three different clones of M officinalis
were used and they had shown similar development
responses on in vitro cultures
The clones 1 and 2 had in vitro multiplication rate
lower than the clone 3 which means a decrease in the
absolute number of nodal segments (Fig 1A and B) From
these results the clone 3 was selected to run the tests
The average number of four new nodes was
produced by explant on MS0 after 30 days and this value
was used as a control to evaluate effects of the presence
of growth regulators in the media (Tab 1)
FIGURE 1 ndash Nodal segments development of three clones of Melissa officinalis on MS+ 05 M IAA during 30 daysA) Multiplication rate of in vitro culture from 2nd to 4th subcultures B) Number of nodal segments developed per clone
TABLE 1 ndash Effect of growth regulators in Melissa officinalis axillary segments culture after four weeks of culture
Culture Media
Shoot Explant
xplusmnse
Shoot Length (CM)
Multiplication Rate (ndeg of
Nodal Segment Explant)
Node Plantlet
xplusmnse
Root Frequency
()
Root Number
Explant xplusmnse
Root Length
(CM) xplusmnse
MS0 171B 403 08B 68C 41 B 50 105 11B 30 06B
05 M KIN 111C 349 11C 33D 31 C 50 073 09C 27 07C
28 M GA3 111C 100 03D 22E 21 D 50 071 09C 25 07C
05 M IAA 191B 1000 09A 95B 51 A 100 897 08A 137 08A
05 M NAA
301A 333 16C 90A 31 C 0 0 - 05 M BA 111C 385 54C 33D 31 C 0 0 -
Value are means (x) plusmn standard error (se) n=100 Values in the same column followed by the same letter do not differstatistically at Pdrdquo005
The influence of plant growth regulators and their
interactions on micropropagation of different plant species
have been discussed in detail by Lameira et al (2005) Rout
et al (1989) Rout amp Das (1997ab) Skirvin et al (1990) and
Zieslin et al (1989)
In this work addition of IAA to MS presented the
best results among all tested growth regulators in all
evaluated parameters However to shoot production there
is no statistical difference to the control The analysis of
effects of the other growth regulators shows that only
05mM NAA was able to improve shoot production
although it is not able to promote rhizogenesis
In vitro propagation of Melissa officinalis L and production 57
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The use of MS plus 05mM Kinetin or 05mM BA
or 05mM NAA promoted the development of three nodal
segments per elongated plant in 30 days culture (Tab
1) However when BA was used these new shoots
exhibited apical necrosis When GA3 (28 mM) was added
to medium there was induction of only one shoot per
explant and after 30 days there were 2 nodes per
elongated shoot
There was no rooting in explants placed on MS
added of NAA and BA In MS medium containing KIN or
GA3
and in basic MS 50 of the shoots developed new
roots in 30 days of culture
The best result of rhizogenesis was presented
by explants cultured in MS plus IAA where 100 of
shoots rooted with more than 8 new roots per explant
(Tab 1) In terms of root length the cultures in MS
supplemented with IAA presented longer roots when
compared with the other media compositions used at
the present work
In short the addition of 05mM of IAA was chosen
as that presenting the best results in all evaluated
parameters (Fig 2A)
The action of IAA on the in vitro plant
development was in accordance to the known effects of
such hormone (CLELAND 1995) Shoot elongation was
obtained concomitantly with rooting in media MS plus
05 mM IAA That is specially interesting once it may
reduce the micropropagation process through nodal
segments explants to only three steps germination
shoot elongation and multiplication concomitant to
rooting this represents gain of time culture medium
and constitutes a quick micropropagation process
Tavares et al (1996) reported a micropropagation
utilizing cotyledonary nodes as explants The highest
average number of shoots in the two inoculations was
obtained with 2 mgL-1 of BA 24 axillary shoots per
explant 7 in the first inoculation and 17 in the second
one Shoots of the two inoculations were excised after
30 and 60 days respectively
Acclimatization
Melissa officinalis leaves are very sensitive to
water loss and this process is irreversible it was necessary
to provide a high humidity environment during the first
acclimatization period plants were covered with a plastic
foil during 2 weeks before being gradually exposed to
greenhouse conditions The acclimatization procedure
used for in vitro plants was successful and a total of 100
survival rate (n=60) was obtained Acclimatized plants
appeared normal and did not exhibit any morphological
abnormalities or variations These results permitted the
soil cultivation (Fig 2B) without chemical defensives
during one year up to the complete vegetative cycle
(flowering)
Essential oils content
Comparative analysis of the chromatographic
profiles showed high percentage of neral and geranial in
relation to nerol and geraniol in field grown (ex vitro)
plantlets and in MS0 (in vitro)
The relative content of the principal components
of essential oil of the aerial parts of M officinalis are
presented as mean peaks area () on Fig 2C geranial
(3813 and 4364) neral (2674 and 317) geraniol (329 and
153) and nerol (116 and 187) in plants cultured ex vitro
and in vitro respectively Plantlets developed in vitro on
MS0 media showed an increase of 14 times in the
proportion of nerol and 41 times of geraniol when
compared with ex vitro cultured plants
Field plants are exposed to considerable more
stressful conditions such as lower relative humidity higher
light levels and herbivory those are the more stressful
The latter conditions tend to favor a greater essential oil
accumulation (TAVARES et al 2004) On other hand
plantlets grown in vitro have been continuously exposed
to a unique microenvironment that has been selected to
provide minimal stress and nearly optimal conditions for
plant multiplication
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FIGURE 2 ndash A) In vitro culture of Melissa officinalis on MS + IAA in 30 days of culture B) Ex vitro culture six monthsafter transference to soil maximum height 60 cm C) Composition and percentage of the most abundant essential oilcomponents of Melissa officinalis from aerial parts (100 g Fresh Weight) from in vitro e ex vitro culture
In vitro propagation of Melissa officinalis L and production 59
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CONCLUSIONS
Melissa officinalis micropropagation can be made
using nodal segments from in vitro plants during 5 weeks
in MS media without growth regulators and posterior
subculture in MS media with 05 mM IAA for a better
development Multiplication rates of 44 and 40 were
obtained at the 3rd and 4th subcultures respectively
It was observed a significant difference between
the effects of auxins IAA and NAA The latter exerted an
unsatisfactory influence on the nodal segment formation
shoot length and rooting when compared with the results
obtained with IAA
The plants produced in vitro were vigorous and
after acclimatization they were well adapted After 1 month
at the greenhouse the survival rate was 100
Considering that the main objective of this work is
to produce monoclonal plants to be used by phytomedicine
industries it is important that the method presents a large
number of buds per explant This result plus an efficient
acclimatization stage can save time and produce
monoclonal plants in sufficient number to be used in
commercial field culture Our results showed a change in
the essential oil composition in the proportion of active
compounds However the characteristics of the oil of in
vitro and ex vitro M officinalis plants were not altered
The manipulation of the culture media composition
is an important biotechnological tool for the optimization
of the essential oils production With this technique this
work developed a protocol for highly production of plants
and productivity in the components (geraniol geranial and
neral) of the oil
ACKNOWLEDGMENTS
This work was supported by ICUNIRIO FAPERJ
and CNPq
REFERENCES
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Crescimento in vitro de Laelia tenebrosa (Orchidaceae) 61
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
CRESCIMENTO IN VITRO DE Laelia tenebrosa (ORCHIDACEAE)EM DIFERENTES CONCENTRACcedilOtildeES DE SAIS DE KNUDSON C
E CARVAtildeO ATIVADO
IN VITRO GROWTH OF Laelia tenebrosa (ORCHIDACEAE) IN DIFFERENTCONCENTRATIONS OF KNUDSON C SALTS AND ACTIVATED CHARCOAL
APARECIDA GOMES DE ARAUJO1 MOACIR PASQUAL2 ALBA REGINA PEREIRA3HERMINIO SOUZA ROCHA4
1Doutoranda em AgronomiaFitotecnia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash agaraujo2003yahoocombr2Dr Professor Titular do Departamento de Agricultura ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash LavrasMG ndash mpasqualuflabr3Doutoranda no Jardim Botacircnico do Rio de Janeiro ndash ENBTJBRJ ndash Pacheco Leatildeo 915 ndash 22460-030 ndash Rio de Janeiro RJ4Doutorando em AgronomiaFitopatologia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash herminiouflanetcombr
RESUMOObjetivou-se testar diferentes concentraccedilotildees de carvatildeo
ativado adicionado ao meio Knudson C no crescimento in vitrode orquiacutedeas Placircntulas de Laelia tenebrosa (LA Rolfe) LARolfe com 1 a 15 cm de comprimento e contendo raiacutezes foraminoculadas em frascos contendo 40 mL de meio de cultura Ostratamentos consistiram na combinaccedilatildeo de concentraccedilotildees de carvatildeoativado (0 05 10 20 e 40 g L-1) e sais minerais de Knudson C(0 50 100 150 e 200) acrescidos de sacarose (20 g L-1) Omeio foi solidificado com 6 g L-1de aacutegar e o pH ajustado para58plusmn01 antes da autoclavagem a 121degC e 11 atm por 20 minutosApoacutes a inoculaccedilatildeo os frascos foram mantidos sob 25 plusmn 1degCfotoperiacuteodo de 16 horas e 32 mM m-2 s-1 de irradiacircncia Apoacutes 150dias verificou-se que a adiccedilatildeo de 2g L-1 de carvatildeo ativado ao meiocom metade dos sais de Knudson C promoveu melhor crescimentoin vitro das placircntulas de Laelia tenebrosa
Termos para indexaccedilatildeo Orquiacutedea meio de cultura cultura detecidos
ABSTRACTThe objective of this work was to test the effect of
Knudson C medium supplemented with different concentrationsof activated charcoal on the in vitro growth of orchids Plantletsof the Laelia tenebrosa (LA Rolfe) LA Rolfe measuring 1-15cm in length containing roots were inoculated in flasks containing40 mL of culture medium The treatments consisted of differentconcentrations of activated charcoal (0 05 10 20 and 40 g L-
1) combined with Knudson C salts (0 50 100 150 and 200)supplemented with sucrose (20 g L-1) The medium was solidifiedwith agar (6 g L-1) and pH adjusted to 58plusmn01 before autoclavingat 121ordmC and 11 atm during 20 minutes After inoculation theexplants were transferred to culture rooms with temperaturemaintained at 25plusmn1ordmC during a 16 hours photoperiod with a lightintensity of 32 microM m-2s-1 The best in vitro growth rates of
Laelia tenebrosa plantlets were obtained using Knudson C 50supplemented with 2 g L-1 activated charcoal after 150 days ofculture
Index terms Orchid culture medium tissue culture
INTRODUCcedilAtildeO
A produccedilatildeo de orquiacutedeas a partir germinaccedilatildeo
assimbioacutetica eacute uma alternativa viaacutevel para obtenccedilatildeo de
grande nuacutemero de plantas em curto espaccedilo de tempo
suprindo assim a necessidade dos produtores de
orquiacutedeas na aquisiccedilatildeo de mudas
Na cultura de tecidos os meios de cultura
geralmente satildeo compostos de uma fonte de carboidratos
macro e micronutrientes e outras substacircncias como
vitaminas aminoaacutecidos accediluacutecares agente solidificante
reguladores de crescimento (GEORGE amp SHERRINGTON
1984) e eventualmente aditivos como antibioacuteticos carvatildeo
ativado e componentes complexos
Knudson (1922) observou que era possiacutevel o
cultivo de sementes em meio artificial contendo minerais e
accediluacutecar sem a presenccedila de fungos micorriacutezicos
Posteriormente em 1946 ele aperfeiccediloou esse meio de
cultura sendo atualmente o mais utilizado comercialmente
na germinaccedilatildeo e desenvolvimento de orquiacutedeas (ARDITTI
amp ERNST 1992) No entanto satildeo necessaacuterios estudos
(Recebido em 23 de fevereiro de 2006 e aprovado em 10 de julho de 2006)
supplemented with
ARAUJO A G de et al62
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
pois satildeo descritos vaacuterios meios de cultura para muitos
gecircneros e espeacutecies diferentes
No cultivo e subcultivo de placircntulas do gecircnero
Cattleya George et al (1987) sugerem o meio Knudson C
(1946) ou Reinert amp Mohr (1967) Segundo Arditti amp Ernst
(1992) os meios de propagaccedilatildeo para Cattleya Laelia
Laeliocattleya e Brassocattleya podem ser os mesmos
citados anteriormente Villalobos et al (1994) sugerem o
meio Vacin amp Went (1949) para Cattleya Encyclia e
Oncidium suplementado com 25 de aacutegua de coco e o
meio Knudson C suplementado com 60 g L-1 de polpa de
banana para orquiacutedeas do gecircnero Stanhopea
O carvatildeo ativado normalmente eacute adicionado ao meio
de cultura em concentraccedilotildees que variam de 02 a 3
(BEYL 2000) O seu efeito natildeo-seletivo pode proporcionar
resultados negativos na micropropagaccedilatildeo Pesquisas
relatam a adsorccedilatildeo de tiamina aacutecido nicotiacutenico
(WEATHERHEAD et al 1978) piridoxina aacutecido foacutelico
reguladores de crescimento e quelatos de ferro
(JOHANSSON et al 1990) Entre os efeitos proporcionados
pela adiccedilatildeo do carvatildeo ativado ao meio de cultura
principalmente agrave organogecircnese e agrave embriogecircnese estatildeo
escurecimento do meio de cultura favorecendo o
enraizamento adsorccedilatildeo de substacircncias inibitoacuterias
produzidas pelo proacuteprio meio ou explante adsorccedilatildeo de
reguladores de crescimento e outros compostos orgacircnicos
e liberaccedilatildeo de substacircncias naturalmente presentes no
carvatildeo que beneficiariam o crescimento in vitro das culturas
(PAN amp STADEN 1998)
Arena amp Pastur (2001) citam que a adiccedilatildeo de carvatildeo
ativado ao meio de cultura promoveu alongamento das
brotaccedilotildees de Berberis buxifolia mas reduziu o iacutendice de
multiplicaccedilatildeo Hazra et al (2002) relataram o efeito
sinergiacutestico do carvatildeo ativado na multiplicaccedilatildeo e
enraizamento de brotaccedilotildees de algodoeiro Amin amp Jaiswal
(1987) Anderson (1980) e Damiano (1978) relataram o efeito
favoraacutevel do carvatildeo quando utilizado em baixas
concentraccedilotildees no enraizamento de brotaccedilotildees de
morangueiro framboeseira e goiabeira respectivamente
A diversidade de resultados obtidos com a utilizaccedilatildeo de
carvatildeo ativado deve-se principalmente ao genoacutetipo da
espeacutecie em questatildeo agrave adsorccedilatildeo de algumas substacircncias
quiacutemicas e compostos orgacircnicos aleacutem de metaboacutelitos
toacutexicos liberados no cultivo in vitro (Wang amp Huang 1976)
Este trabalho teve como objetivo verificar efeito de
diferentes concentraccedilotildees de sais de Knudson C e carvatildeo
ativado sobre o crescimento in vitro de placircntulas de
orquiacutedea da espeacutecie Laelia tenebrosa (LA Rolfe) LA Rolfe
MATERIAL E MEacuteTODOS
Placircntulas da espeacutecie Laelia tenebrosa com 1 a 15
cm de comprimento oriundas de sementes germinadas in
vitro e contendo raiacutezes foram inoculadas em frascos
contendo 40 mL do meio de cultura Knudson C nas
concentraccedilotildees de 0 (apenas aacutegua destilada e aacutegar) 50 100
(concentraccedilatildeo da formulaccedilatildeo original) 150 e 200 de sais
minerais combinado com carvatildeo ativado (0 05 1 2 e 4
mg L-1) suplementado com sacarose (20 g L-1)
O pH do meio foi ajustado para 58 plusmn 01 antes da
adiccedilatildeo de aacutegar (6 g L-1) O meio foi vertido em frascos de
vidro com capacidade para 250 cm3 vedados com tampas
plaacutesticas transluacutecidas natildeo perfuradas e autoclavados agrave
pressatildeo de 11 atm e agrave temperatura do 121degC durante 20
minutos Apoacutes a inoculaccedilatildeo os frascos contendo os
explantes foram mantidos em sala de crescimento com
irradiacircncia em torno de 32 mmol m-2 s-1 temperatura de 25 plusmn
1degC e fotoperiacuteodo de 16 horas
O delineamento experimental utilizado foi
inteiramente casualizado em esquema fatorial 5 x 5 com
quatro repeticcedilotildees de cinco placircntulas cada uma Decorridos
150 dias avaliou-se a meacutedia do nuacutemero de folhas nuacutemero
de raiacutezes comprimento da maior raiz comprimento da parte
aeacuterea e massa fresca de placircntulas Os dados foram
comparados por meio de regressatildeo polinomial empregando-
se o programa Sisvar (FERREIRA 2000)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Apenas para a variaacutevel nuacutemero de folhas houve
interaccedilatildeo entre os niacuteveis de sais e carvatildeo ativado Poreacutem
Crescimento in vitro de Laelia tenebrosa (Orchidaceae) 63
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
por meio do teste F somente as concentraccedilotildees de 50 e
100 de sais do meio Knudson C foram significativas em
relaccedilatildeo agraves concentraccedilotildees de carvatildeo ativado
Os melhores resultados (65 e 585) foram
verificados com 50 (metade) dos sais de Knudson C
combinado com 275 g L-1 de carvatildeo ativado e 100 de
sais com 4 g L-1 de carvatildeo respectivamente (Figura 1)
Com o aumento da concentraccedilatildeo do meio de cultura haacute
necessidade de maior concentraccedilatildeo de carvatildeo Sendo
assim o meio com 50 de sais aleacutem de proporcionar
melhores resultados eacute menos oneroso
Estes resultados contradizem os de Silva et al
(2003) que verificaram que a adiccedilatildeo de carvatildeo ativado ao
FIGURA 1 ndash Nuacutemero de folhas em placircntulas de Laeliatenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees de saisde Knudson C e carvatildeo ativado
meio de cultura inibe a formaccedilatildeo de folhas em placircntulas de
Brassocattleya lsquoPastoralrsquo x Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo
O efeito natildeo seletivo do carvatildeo ativado pode proporcionar
resultados negativos na micropropagaccedilatildeo (PAN amp
STADEN 1998)
Agrave medida em que aumentaram as concentraccedilotildees de
sais de Knudson C maiores quantidades de raiacutezes foram
formadas (Figura 2A) Observou-se maior nuacutemero de raiz
(43) com 965 de sais Para o fator carvatildeo ativado as
melhores respostas (395 raiacutezes) foram verificadas com a
utilizaccedilatildeo de 304 g L-1 adicionadas ao meio de cultura
(Figura 2B)
Para muitas espeacutecies o enraizamento eacute favorecido
pela adiccedilatildeo de carvatildeo ativado ao meio de cultura Hazra et
al (2002) relataram o efeito sinergiacutestico do carvatildeo ativado
na multiplicaccedilatildeo e enraizamento de brotaccedilotildees de
algodoeiro O meio MS com metade dos sais minerais
acrescido de 20 g L-1 de sacarose 7 g L-1 de aacutegar e 1 g L-1 de
carvatildeo ativado promoveu maior quantidade de raiacutezes em
placircntulas de Cattleya nobilior Rchb f (REIS et al 2003)
Segundo Paiva et al (2005) aleacutem de um equiliacutebrio
hormonal favoraacutevel agrave formaccedilatildeo de raiacutezes outros fatores
internos tecircm sido relacionados com a iniciaccedilatildeo do processo
de enraizamento como presenccedila de sacarose alta relaccedilatildeo
CN e nutrientes minerais (foacutesforo caacutelcio zinco e boro) O
meio Knudson C natildeo possui micronutrientes apresenta
uma concentraccedilatildeo maior de caacutelcio e tem baixas
FIGURA 2 ndash Nuacutemero de raiacutezes em placircntulas de Laelia tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees de sais deKnudson C (A) e concentraccedilotildees de carvatildeo ativado (B)
ARAUJO A G de et al64
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
concentraccedilotildees de N e K em relaccedilatildeo ao MS e WPM o que
provavelmente favoreceu tanto o nuacutemero quanto o
comprimento de raiacutezes (PASQUAL 2001)
O maior comprimento de raiz (331 cm) foi verificado
com a utilizaccedilatildeo de 100 de sais de Knudson C A partir do
ponto maacuteximo (100) houve diminuiccedilatildeo do comprimento
radicular provavelmente devido ao desbalanccedilo nutricional
(Figura 3A) Com o aumento das concentraccedilotildees de carvatildeo
ativado houve um incremento linear no comprimento de
raiacutezes Melhores resultados foram observados com a
utilizaccedilatildeo de 4 g Lndash1 de carvatildeo ativado (Figura 3B) Como a
relaccedilatildeo foi direta pode-se inferir que o efeito estimulante
do carvatildeo ativado no comprimento da maior raiz continuaria
para concentraccedilotildees superiores a 4 g L-1
A adiccedilatildeo de carvatildeo ativado no meio de cultura foi
beneacutefica promovendo tanto o nuacutemero quanto o
crescimento de raiacutezes O carvatildeo conteacutem impurezas que
podem favorecer o crescimento de raiacutezes jaacute existentes e
induzir emissatildeo de novas raiacutezes (PASQUAL 2001)
Melhores resultados para comprimento da parte
aeacuterea (18 cm) foram observados quando se utilizou o
meio Knudson C na concentraccedilatildeo de 121 de sais (Figura
4A) poreacutem na concentraccedilatildeo de 50 obtiveram-se
explantes com 17 cm de comprimento Essa diferenccedila
observada (01 cm) eacute muito pequena o que natildeo justifica a
utilizaccedilatildeo de um meio mais concentrado mas a reduccedilatildeo
do mesmo agrave sua metade
O enraizamento in vitro pode ser favorecido com o
uso de meio de cultura com a metade ou 75 da
concentraccedilatildeo normal de sais Em algumas espeacutecies altas
concentraccedilotildees de sais principalmente a presenccedila de iacuteons
amocircnio favorecem o desenvolvimento de raiacutezes enquanto
que em outras podem ser inibidoras (PASQUAL et al
2001)
O maior comprimento da parte aeacuterea (19 cm) foi
obtido na presenccedila de 4 g Lndash1 de carvatildeo ativado (Figura
4B) a concentraccedilatildeo de 2 g Lndash1 proporcionou um
comprimento de 18 cm Comparando-se os niacuteveis 4 e 2 g Lndash1
de carvatildeo ativado nota-se pequena diferenccedila (01 cm) o
que justifica a utilizaccedilatildeo de 2 g Lndash1
O carvatildeo ativado conteacutem impurezas que quando
liberadas no meio de cultura podem beneficiar ou natildeo o
crescimento in vitro Simotildees et al (1999) verificaram que a
concentraccedilatildeo de 1 g L-1 de carvatildeo ativado acrescida ao
meio Knudson C proporciona o melhor desenvolvimento
de brotos de Epidendrum sp e Dendrobium sp
Maior massa fresca de placircntulas (0144g) foi
verificada com a utilizaccedilatildeo de 50 de sais de Knudson C
ponto a partir do qual houve diminuiccedilatildeo no peso (Figura
5A) Provavelmente essa reduccedilatildeo ocorreu devido agrave
toxidez
A utilizaccedilatildeo de 4 g L-1 de carvatildeo ativado
proporcionou uma massa de 0185 g nas placircntulas frescas
(Figura 5B)
FIGURA 3 ndash Comprimento da maior raiz em placircntulas de Laelia tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees desais de Knudson C (A) e carvatildeo ativado (B)
Crescimento in vitro de Laelia tenebrosa (Orchidaceae) 65
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
FIGURA 4 ndash Comprimento da parte aeacuterea em placircntulas de Laelia tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees desais de Knudson C (A) e carvatildeo ativado (B)
FIGURA 5 ndash Massa fresca de placircntulas de L tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees de sais de Knudson C(A) e carvatildeo ativado (B)
O carvatildeo ativado eacute comumente utilizado na cultura
de tecidos de plantas Seu efeito eacute atribuiacutedo agrave adsorccedilatildeo de
substacircncias toacutexicas produzidas pelas plantas adsorccedilatildeo
de fitorreguladores do meio e escurecimento do meio onde
se desenvolvem as raiacutezes das plantas (GEORGE 1993)
O melhor desenvolvimento de Phalaenopsis in
vitro ocorreu na presenccedila de carvatildeo ativado na
concentraccedilatildeo de 2 g L-1 indicando que este possa ser um
elemento importante no processo (BRESSAN et al 1999)
Apesar do carvatildeo ativado na concentraccedilatildeo de 4 g
L-1 ter proporcionado melhores resultados verificou-se que
na concentraccedilatildeo de 2 g L-1 os efeitos apresentam uma
diferenccedila miacutenima Embora o carvatildeo ativado natildeo seja o
componente de maior custo no preparo de meio de cultura
a sua reduccedilatildeo juntamente com os sais minerais eacute
economicamente favoraacutevel especialmente para a produccedilatildeo
comercial de mudas
CONCLUSAtildeO
A adiccedilatildeo de 2 g L-1 de carvatildeo ativado ao meio de
cultura Knudson C com metade (50) de sais minerais
promoveu melhor crescimento em placircntulas de Laelia
tenebrosa cultivadas in vitro
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Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 68-73 2006
PROPAGACcedilAtildeO IN VITRO DE PLAcircNTULAS DE ORQUIacuteDEA EMDIFERENTES MEIOS DE CULTURA E CONCENTRACcedilOtildeES
DE CITOCININA
IN VITRO PROPAGATION OF ORCHID PLANTLETS CULTIVATED IN DIFFERENTCULTURE MEDIA AND CYTOKININ CONCENTRATIONS
APARECIDA GOMES DE ARAUJO1 MOACIR PASQUAL2 ADRIANO BORTOLOTTI DA SILVA3 FABIacuteOLA VILLA3 HERMIacuteNIO SOUZA ROCHA3 FERNANDA CARVALHO COSTA4
1Doutoranda em AgronomiaFitotecnia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash agaraujo2003yahoocombr2Professor Titular Departamento AgriculturaDAG ndash Universidade Federal de Lavras UFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200000 ndash Lavras MG ndash mpasqualuflabr3Doutorando em Agronomia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200000 ndash Lavras MG4Departamento de AgriculturaDAG ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash fecostapuryahoocombr
RESUMOA taxa de multiplicaccedilatildeo de orquiacutedeas a partir de meacutetodos
convencionais eacute bastante baixa natildeo atendendo as necessidadescomerciais A cultura de tecidos permite maiores taxas demultiplicaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de plantas uniformes e sadiasObjetivou-se estudar a influecircncia da citocinina BAP (6-benzilaminopurina) em diferentes meios de cultura napropagaccedilatildeo in vitro de placircntulas hiacutebridas de BrassocattleyalsquoPastoralrsquox Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo Placircntulas comaproximadamente 15plusmn05 cm de comprimento obtidasassimbioticamente foram transferidas para frascos comcapacidade de 250 cm3 contendo 40 mL das formulaccedilotildees salinasde MS WPM e Knudson C combinados com 0 05 10 20 e40 mg L-1 de BAP acrescidos de 2 g L-1 de carvatildeo ativadosolidificado com 6 g L-1 de aacutegar e pH ajustado para 58plusmn01Apoacutes a inoculaccedilatildeo os frascos foram incubados a 25plusmn2oC 35igravemolm-2s-1 de intensidade luminosa e sob fotoperiacuteodo de 16horas Apoacutes 90 dias observou-se que melhores resultados parapropagaccedilatildeo in vitro em placircntulas de orquiacutedea Bc lsquoPastoralrsquo x LclsquoAmber Glowrsquo satildeo obtidos com o meio WPM A suplementaccedilatildeode 4 mg L-1 de BAP no meio WPM favorece o crescimento invitro Para a multiplicaccedilatildeo maior quantidade de brotos eacuteconseguida em meio MS na ausecircncia de BAP
Termos para indexaccedilatildeo Orquiacutedea crescimento in vitrocitocinina
ABSTRACTThe multiplication rate of orchids by conventional
methods is considerably low and does not attend its commercialneeds Tissue culture results in larger multiplication rates andproduces uniform and healthy orchid plantlets The objective ofthis work was to study the influence of the cytokinin BAP (6-benzilaminopurine) in different culture media for ther in vitropropagation of Brassocattleya lsquoPastoralrsquox Laeliocattleya lsquoAmberGlowrsquo hybrid plantlets Plantlets measuring approximately 15plusmn 05 cm length deriving from in vitro germination were inoculated
in flasks of 250 cm3 volume containing 40 mL MS WPM andKnudson C salt formulations combined with BAP (0 05 1 2and 4 mg L-1) supplemented with 2 g L-1 activated charcoalsolidified with 6 g L-1 agar and pH adjusted for 58 plusmn 01 Afterthe inoculation the plantlets maintained in a growth room at25plusmn2ordmC 35 mMol m-2 s-1 light intensity and 16 hoursphotoperiod After 90 days the best results for the in vitropropagation of orchid plantlets Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquowere obtained with half strength WPM The supplementation of4 mg L-1 BAP to the WPM medium favors in vitro growth Forthe multiplication phase the largest number of sprouts is achievedwith full strength MS medium in the absence of BAP
Index terms Orchid in vitro growth cytokinin
INTRODUCcedilAtildeO
As orquiacutedeas satildeo consideradas as plantas
ornamentais haacute mais tempo cultivadas pelo homem
Pertencem agrave famiacutelia Orchidaceae a maior entre as
monocotiledocircneas e tambeacutem entre as plantas ornamentais
com 600 - 800 gecircneros e 25000-35000 espeacutecies (SHEEHAN
1983) totalizando 7 das plantas ornamentais do mundo
(Van Der PIJL amp DODSON 1966)
A propagaccedilatildeo de orquiacutedeas pode ser tanto
vegetativa quanto por meio de sementes Estas embora
produzidas em grande quantidade natildeo possuem
endosperma funcional prescindindo para tanto da
associaccedilatildeo simbioacutetica com fungos micorriacutezicos dentre os
quais a Rhizoctonia que eacute um dos gecircneros mais importante
(PIERIK 1987 SHEEHAN 1983)
(Recebido em 08 de dezembro de 2005 e aprovado em 10 de julho de 2006)
Propagaccedilatildeo in vitro de placircntulas de orquiacutedea 69
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 68-73 2006
Knudson (1922) observou que era possiacutevel o cultivo
de sementes em meio artificial contendo apenas sais
nutritivos e accediluacutecar na ausecircncia de fungos Posteriormente
em 1946 o mesmo autor aperfeiccediloou este meio de cultura
sendo atualmente um dos mais utilizados comercialmente
na germinaccedilatildeo e desenvolvimento de orquiacutedeas (ARDITTI
amp ERNST 1992) No entanto satildeo necessaacuterios estudos
pois satildeo descritos vaacuterios meios de cultura para muitos
gecircneros e espeacutecies diferentes O meio de cultura mais
utilizado na cultura de tecidos em geral eacute o MS (Murashige
amp Skoog 1962) podendo-se encontrar o uso de outros
meios como Knudson C (1946) e WPM (Wood Plant
Medium) de Loyd amp McCown (1980)
Reguladores de crescimento em diferentes
concentraccedilotildees tecircm sido usados conforme a espeacutecie e a
metodologia utilizada Podem ser necessaacuterios para a
germinaccedilatildeo de sementes formaccedilatildeo de calos e brotaccedilotildees
adventiacutecias (GRATTAPAGLIA amp MACHADO 1998
PASQUAL 2001)
O regulador de crescimento BAP (6-
benzilaminopurina) eacute uma citocinina largamente utilizada
para estimular a induccedilatildeo de brotos em plantas ornamentais
Para o cultivo in vitro de orquiacutedeas do grupo Cattleya a
citocinina BAP geralmente eacute utilizada nas concentraccedilotildees
que variam entre 005 e 10 mg L-1 (CARVALHO 2002)
Martini et al (2001) trabalhando com a orquiacutedea
Gongora quinquenervis observaram que a presenccedila do
BAP inibe a multiplicaccedilatildeo de calos e o potencial
organogecircnico Silva (2003) concluiu que para o estaacutedio de
subcultivo de Brassocattleya lsquoPastoralrsquo x Laeliocattleya
lsquoAmber Glowrsquo natildeo haacute necessidade da adiccedilatildeo de BAP como
estiacutemulo ao desenvolvimento geral do explante Melhor
proliferaccedilatildeo de brotos formaccedilatildeo de raiacutezes nuacutemero de
folhas e comprimento de brotos em Dendrobium foram
obtidos com 25 mg L-1 de BAP + 05 mg L-1 de ANA
adicionados ao meio MS (TALUKDER et al 2003)
Aleacutem do tipo de meio outro aspecto importante na
multiplicaccedilatildeo in vitro estaacute relacionado com o tipo de
citocinina e sua concentraccedilatildeo sendo ambos determinantes
no sucesso da micropropagaccedilatildeo (GRATTAPAGLIA amp
MACHADO 1998)
O maior entrave no processo de micropropagaccedilatildeo
de orquiacutedeas estaacute relacionado ao tempo necessaacuterio para a
produccedilatildeo de mudas a partir de plantas hiacutebridas
selecionadas e a utilizaccedilatildeo de meio de cultura adequado
para cada espeacutecie Assim objetivou-se estudar o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de BAP e formulaccedilotildees de minerais
nutritivos em meios de cultura na propagaccedilatildeo in vitro de
placircntulas de orquiacutedea oriundas do hiacutebrido Brassocattleya
lsquoPastoralrsquo x Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo
MATERIAL E MEacuteTODOS
Placircntulas hiacutebridas oriundas de sementes
germinadas assimbioticamente em meio Knudson C
obtidas do cruzamento entre Brassocattleya lsquoPastoralrsquo x
Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo com aproximadamente
15plusmn05 cm de comprimento foram transferidas para frascos
de 250 cm3 de capacidade contendo 40 mL de meio de
cultura e vedados com tampas plaacutesticas transluacutecidas Os
tratamentos consistiram de diferentes formulaccedilotildees salinas
(MS WPM e Knudson C em suas formulaccedilotildees originais)
combinadas com 0 05 10 20 e 40 mg L-1 de BAP
acrescidos de 2 g L-1 de carvatildeo ativado solidificado com
6 g L-1 de aacutegar e pH ajustado para 58plusmn01 antes da
autoclavagem obtida a 121ordmC e 1 atm por 20 minutos
Posteriormente agrave inoculaccedilatildeo os frascos foram
transferidos para sala de crescimento com temperatura
de 25plusmn2ordmC fotoperiacuteodo de 16 horas e 35 mmolm-2s-1 de
intensidade luminosa fornecida por lacircmpadas do tipo
(Grow-lux) e luz do dia especial O delineamento
experimental utilizado foi inteiramente casualizado no
esquema fatorial 3 x 5 com cinco repeticcedilotildees de quatro
placircntulas cada sendo cada repeticcedilatildeo composta por um
frasco
Apoacutes 90 dias da instalaccedilatildeo do experimento foram
avaliados nuacutemero meacutedio de brotos comprimento meacutedio
da parte aeacuterea nuacutemero meacutedio de raiacutezes nuacutemero meacutedio de
folhas e meacutedia da massa fresca total de placircntulas
ARAUJO A G de et al70
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 68-73 2006
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Para a variaacutevel nuacutemero de folhas natildeo houve
significacircncia dos fatores isolados nem da interaccedilatildeo entre
eles O nuacutemero de raiacutezes e massa fresca total de placircntulas
apresentaram significacircncia apenas para o fator meio de
cultura enquanto que para nuacutemero de brotos e
comprimento da parte aeacuterea a interaccedilatildeo dos fatores foi
significativa (Tabela 1)
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de brotos observou-se
interaccedilatildeo entre os fatores BAP e os meios de cultura
utilizados (Tabela 1) Poreacutem pelo teste F verificou-se que
apenas o meio MS foi significativo em relaccedilatildeo agraves
concentraccedilotildees de BAP (Figura 1)
O maior nuacutemero de brotos (334) foi registrado na
formulaccedilatildeo de MS adicionado de 40 mg L-1 de BAP
Entretanto na ausecircncia dessa citocinina foi observada a
formaccedilatildeo de 304 brotosplanta (Figura 1) Diante da
pequena diferenccedila na quantidade meacutedia de brotos
formados entre a maior concentraccedilatildeo e o tratamento sem
o regulador de crescimento justifica-se a utilizaccedilatildeo do
meio de cultura sem o BAP Estes resultados concordam
com Silva (2003) que obteve maior nuacutemero de brotos (2
brotos) na ausecircncia de BAP para esse mesmo hiacutebrido
poreacutem em meio Knudson C
A natildeo utilizaccedilatildeo de reguladores de crescimento
adicionados ao meio de cultura vai influenciar na
reduccedilatildeo dos custos de produccedilatildeo de mudas jaacute que esse
eacute um dos componentes mais onerosos Isso eacute
extremamente importante principalmente para
laboratoacuterios comerciais
TABELA 1 ndash Resumo da anaacutelise de variacircncia para as caracteriacutesticas meacutedias de nuacutemero de folhas (NF) nuacutemero de raiacutezes(NR) nuacutemero de brotos (NB) comprimento da parte aeacuterea (CPA) e massa fresca total de placircntulas (MFP) e respectivoscoeficientes de variaccedilatildeo (CV)
significativo a 1 e 5 de probabilidade respectivamente pelo teste F
FIGURA 1 ndash Efeito do meio de cultura MS e concentraccedilotildees de BAP no nuacutemero meacutedio de brotos em placircntulas hiacutebridasde Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo apoacutes 90 dias da incubaccedilatildeo
Fontes de variaccedilatildeo GL Quadrados meacutedios
NF NR NB CPA MFP Meios 2 125683 ns 162740 01483 ns 53139 02372 BAP 4 186198 ns 44693 ns 04408 ns 03373 ns 00075 ns
Meio x BAP 8 243984 ns 13417 ns 17417 13579 00459 ns
Resiacuteduo 45 124475 21329 05055 05961 00662 CV () 3467 3081 2801 2443 5100
Propagaccedilatildeo in vitro de placircntulas de orquiacutedea 71
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O estiacutemulo agrave brotaccedilatildeo em placircntulas de Spathoglottis
plicata Griff ocorreu em meio MS suplementado com 10
mg L-1 de BAP e 25 mg L-1 de ANA tendo o enraizamento
estimulado com 20 mg L-1 de AIB (NAYAK et al 1999)
TDZ tambeacutem eacute utilizado em associaccedilatildeo com BAP para
regeneraccedilatildeo de brotos de Rhynchostylis (BUI Le al 1999)
e de Anoectochilus (LI et al 1999) todas orquidaceaes
Observou-se interaccedilatildeo entre o tipo de meio de
cultura e o BAP no que diz respeito ao comprimento de
parte aeacuterea das placircntulas (Tabela 1) Pelo teste de F apenas
o meio WPM foi significativo em relaccedilatildeo agraves concentraccedilotildees
de BAP (Figura 2)
O maior comprimento da parte aeacuterea (47 cm) foi
observado quando se utilizou o meio WPM combinado
com 40 mg L-1 de BAP (Figura 2) Como a relaccedilatildeo foi direta
pode-se inferir que o efeito estimulatoacuterio do BAP sobre o
crescimento da parte aeacuterea continuaria mesmo em
concentraccedilotildees maiores que 40 mg L-1 Talukder et al (2003)
obtiveram melhor comprimento de brotos (0472 cm) em
placircntulas de Dendrobium com utilizaccedilatildeo de 25 mg L-1 de
BAP + 05 mg L-1 de ANA adicionados ao meio MS
Relativo ao nuacutemero meacutedio de raiacutezes houve
significacircncia apenas para o fator meio de cultura (Tabela 1)
Na Tabela 2 verifica-se que os maiores valores foram obtidos
com os meios WPM (557) seguido do MS (487) sendo os
menores valores verificados no meio Knudson C (378) A
emissatildeo de novas raiacutezes eacute favorecida pelo caacutelcio e pelo boro
O meio Knudson C apresenta uma concentraccedilatildeo maior de
caacutelcio e menor de boro em relaccedilatildeo aos meios MS e WPM
que possuem concentraccedilotildees semelhantes de ambos
Segundo Pierik (1987) em concentraccedilotildees mais elevadas
(1 a 10 mg L-1) as citocininas podem induzir a formaccedilatildeo de
gemas adventiacutecias quebrando a dominacircncia apical e retardando
a formaccedilatildeo de raiacutezes Talukder et al (2003) encontraram maior
nuacutemero de raiacutezes (193explante) em placircntulas de Dendrobium
com utilizaccedilatildeo de 25 mg L-1 de BAP + 05 mg L-1 de ANA
adicionados ao meio MS O estiacutemulo ao enraizamento em
Spathoglottis plicata ocorreu em meio MS suplementado com
20 mg L-1 de AIB (NAYAK et al 1999)
FIGURA 2 ndash Comprimento meacutedio da parte aeacuterea em placircntulas hiacutebridas Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo cultivadas emmeio de cultura WPM e diferentes concentraccedilotildees de BAP
TABELA 2 ndash Efeito de diferentes meios de cultura sobreo nuacutemero meacutedio de raiacutezes em placircntulas hiacutebridas de BclsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo
Meios de Cultura Nuacutemero meacutedio de raiacutezes
WPM 557 a MS 487 a KC 378 b
Meacutedias seguidas pela mesma letra natildeo diferem entre sipelo teste de Scott-Knott a 5
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O efeito ora inibitoacuterio ora estimulatoacuterio dos
fitorreguladores na formaccedilatildeo de brotos e raiacutezes em
diferentes plantas pode estar associado agrave proacutepria
concentraccedilatildeo bem como a absorccedilatildeo dos reguladores de
crescimento pelo substrato (GEORGE 1996) agrave habituaccedilatildeo
(SANTANA amp PAIVA 2001) ou agrave deficiecircncia de proteiacutena
ligante promotora da atuaccedilatildeo das citocininas (TAIZ amp
ZEIGER 1998)
O nuacutemero de folhas natildeo apresentou diferenccedilas
significativas para os tratamentos estudados
isoladamente nem houve interaccedilatildeo entre eles (Tabela 1)
Talukder et al (2003) obtiveram maior nuacutemero de folhas
(425placircntula) em Dendrobium com utilizaccedilatildeo de 25 mg L-
1 de BAP + 05 mg L-1 de ANA adicionados ao meio MS
Para massa fresca de placircntulas houve significacircncia
apenas para o fator meio de cultura isoladamente (Tabela
1) Atraveacutes do teste de meacutedias constatou-se maior massa
de placircntulas frescas nos meios WPM e MS com 0524 e
0503g respectivamente Resultado inferior (0326g) foi
registrado em meio Knudson C (Tabela 3)
TABELA 3 ndash Efeito do meio de cultura na massa frescatotal de placircntulas do hiacutebrido Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmberGlowrsquo
Meios de Cultura Massa fresca total de placircntulas (g)
WPM 0524 a MS 0503 a KC 0326 b
Meacutedias seguidas pela mesma letra natildeo diferem entre sipelo teste de Scott-Knott a 5
Dignart (2003) estudando a germinaccedilatildeo in vitro
de sementes de Cattleya nobilior Rchbf em diferentes
meios de cultura (MS WPM Knudson C e B5 de
GAMBORG et al 1968) observou que natildeo houve
diferenccedilas entre os meios utilizados O BAP adicionado
ao meio de cultura provocou aumento da taxa de brotaccedilatildeo
a partir de 1 igravemolL
Segundo (PASQUAL 2001) os meios MS e WPM
possuem concentraccedilotildees similares de micronutrientes e satildeo
ricos em nitrogecircnio (N) e potaacutessio (K) Jaacute o meio Knudson C
natildeo possui micronutrientes e tem baixas concentraccedilotildees de
N e K em relaccedilatildeo ao MS e WPM Os melhores resultados
para as variaacuteveis analisadas foram observados em meio WPM
e MS Essa resposta provavelmente deveu-se ao fato de
que o meio Knudson C possui diferentes sais minerais e
embora seja muito utilizado na germinaccedilatildeo de sementes de
orquiacutedeas parece natildeo propiciar condiccedilotildees satisfatoacuterias para
o desenvolvimento de placircntulas de algumas espeacutecies de
orquiacutedeas
Sabe-se que existe uma relaccedilatildeo entre o nuacutemero de
brotos e seu tamanho e nessa relaccedilatildeo quanto maior for o
nuacutemero de brotos menor o tamanho dos mesmos
(GEORGE 1996) Essa relaccedilatildeo fez-se presente ateacute a
concentraccedilatildeo de 20 mg L-1 de BAP em Bc lsquoPastoralrsquo x Lc
lsquoAmber Glowrsquo No entanto em concentraccedilotildees superiores
tanto o nuacutemero quanto o comprimento dos brotos
aumentaram Tal diversidade de resultados estaacute
relacionada principalmente ao genoacutetipo da espeacutecie meio
de cultura e possivelmente agrave interferecircncia na accedilatildeo dos
reguladores de crescimento
Segundo Malaure et al (1991) diferentes efeitos
dos reguladores de crescimento podem ocorrer para
diferentes espeacutecies inclusive variaccedilotildees dentro de uma
mesma espeacutecie Em orquiacutedeas o efeito dos reguladores de
crescimento e de meios de cultura satildeo diversificados
principalmente quando se utiliza um hiacutebrido trigeneacuterico
com alto grau de heterozigose
CONCLUSOtildeES
Melhores resultados para propagaccedilatildeo in vitro de
placircntulas de orquiacutedea Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo satildeo
obtidos com o meio WPM A suplementaccedilatildeo de 4 mg L-1 de
BAP no meio WPM favorece o crescimento in vitro Para
a multiplicaccedilatildeo maior quantidade de brotos eacute conseguida
em meio MS na ausecircncia de BAP
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EFEITO DO VIacuteRUS DAS ESTRIAS DA BANANEIRA NAMICROPROPAGACcedilAtildeO E NO CRESCIMENTO DAS PLANTAS DA
CULTIVAR CAIPIRA DURANTE A ACLIMATIZACcedilAtildeO1
EFFECT OF BANANA STREAK VIRUS ON MICROPROPAGATION AND PLANTGROWTH OF CULTIVAR CAIPIRA DURING ACLIMATIZATION
DANIELA GARCIA SILVEIRA2 ANTOcircNIO DA SILVA SOUZA3 PAULO ERNESTO MEISSNER FILHO3TALES MILER SOARES4 RANULFO CORREA CALDAS3 KAacuteTIA REGINA BARBOSA LEAtildeO5
1Parte da Dissertaccedilatildeo de Mestrado apresentada pelo primeiro autor ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias Agraacuterias da Escola de AgronomiaUFBA ndash Cruz das Almas BA2Doutoranda em Botacircnica ndash Universidade Estadual de Feira de SantanaUEFS ndash Feira de Santana BA ndash danielagsigcombr3Pesquisador da Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical ndash Caixa Postal 007 ndash 44380-000 ndash Cruz das Almas BA4Doutorando da Escola Superior Luis de QueirozEsalq ndash Piracicaba SP ndash tmsoaresesalquspbr5Engenheira Agrocircnoma MSc EBDA ndash Cruz das Almas BA ndash 44380-000 ndash krbleaohotmailcom
(Recebido em 12 de abril de 2006 e aprovado em 28 de agosto de 2006)
RESUMOAvaliaram-se os efeitos da infecccedilatildeo pelo viacuterus das estrias
de bananeira (Banana Streak Virus BSV) no desenvolvimento invitro e no crescimento das plantas da cultivar Caipira durante aaclimatizaccedilatildeo Utilizou-se o delineamento experimentalinteiramente casualizado com dois tratamentos plantas sadias eplantas infectadas pelo BSV com respectivamente 24 e 28repeticcedilotildees Os explantes foram desinfestados e estabelecidos emmeio MS baacutesico suplementado com 30 gL de sacarose solidificadocom 2 gL de lsquoPhytagelrsquo e pH ajustado em 58 Foram efetuadoscinco subcultivos em meio com 4 mgL de BAP (6-benzilaminopurina) e as plantas obtidas foram enraizadas nessemesmo meio de cultura sem reguladores de crescimento Apoacutesessa etapa transferiram-se as plantas para a aclimatizaccedilatildeo emcacircmara uacutemida onde permaneceram por 30 dias Avaliaram-se astaxas de multiplicaccedilatildeo a presenccedila in vitro dos sintomas do BSVnos explantes provenientes das plantas infectadas durante amicropropagaccedilatildeo e aclimatizaccedilatildeo as perdas por contaminaccedilatildeoenvolvendo fungos e bacteacuterias nas fases da micropropagaccedilatildeo e aaltura das plantas na fase da aclimatizaccedilatildeo A infecccedilatildeo pelo BSVnatildeo afetou significativamente a multiplicaccedilatildeo e o crescimento invitro das plantas sendo os sintomas do viacuterus visiacuteveis em todasas fases da micropropagaccedilatildeo e na aclimatizaccedilatildeo das plantasinfectadas A maior porcentagem de contaminaccedilatildeo ocorreu nafase de estabelecimento in vitro dos explantes independentementedos tipos de plantas utilizadas Apoacutes 30 dias de aclimatizaccedilatildeo asplantas com BSV apresentaram altura inferior agraves plantas sadiasA presenccedila do viacuterus natildeo influenciou a taxa de multiplicaccedilatildeo dosexplantes poreacutem afetou o crescimento das plantas infectadas
Termos para indexaccedilatildeo Musa BSV cultura de tecidospropagaccedilatildeo in vitro
ABSTRACTThe effects of the banana streak virus (BSV) infection on
in vitro development of the cultivar Caipira were evaluated The
used experimental design was a completely randomized withtwo treatments healthy plants and plants infected by BSV with24 and 28 replications respectively The explants weredisinfected and established in a basic MS medium supplementedwith 30 gL sucrose solidified with 2 gL lsquoPhytagelrsquo and pHadjusted to 58 Five subcultures were carried out in a mediumcontaining 4 mgL BAP (6-benzylaminopurine) and the plantletswere rooted in the same culture medium without growthregulators Afterwards the plantlets were transferred to a humidchamber for acclimatization during a 30-day periodMultiplication rates presence of BSV symptoms on in vitroexplants obtained from plants infected during themicropropagation and acclimatization periods losses caused byfungal and bacterial contamination and plantlet height at theacclimatization stage were evaluated The infection by BSVpresented no significant effect on the multiplication rate and invitro plant growth although the virus symptoms were visible inall the micropropagation phases and during the acclimatizationof infected plants The highest percentage of contaminationoccurred during the in vitro establishment phase regardless theused plants After 30 days of acclimatization the plants withBSV presented a lower height compared to the healthy plantsAlthough the presence of the virus had no influence on the explantmultiplication rate it affected the growth of infected plants
Index terms Musa BSV tissue culture in vitro propagation
INTRODUCcedilAtildeO
As bananeiras estatildeo sujeitas as vaacuterias doenccedilas
causadas por fungos bacteacuterias nematoacuteides e viacuterus que
satildeo limitantes agrave sua capacidade de produccedilatildeo Entre as
viroses que ocorrem no Brasil destaca-se a causada pelo
viacuterus das estrias da bananeira (Banana streak virus BSV)
Efeito do viacuterus das estrias da bananeira 75
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
que eacute particularmente importante para os programas de
melhoramento geneacutetico e de multiplicaccedilatildeo comercial de
cultivares uma vez que pode ser incorporada ao genoma e
transmitida pelas sementes de plantas infectadas
(DANIELLS et al 1995) aleacutem de natildeo existir um meacutetodo
eficiente para limpar uma planta infectada com BSV
(LOCKHART 1994)
Esse viacuterus natildeo eacute transmitido mecanicamente sendo as
mudas infectadas sua principal forma de disseminaccedilatildeo
(LOCKHART amp AUSTREY 1988 LOCKHART 1994) A
transmissatildeo eacute feita de maneira semi-persistente pela cochonilha-
dos-citros Planococcus citri Risso e pela cochonilha-da-cana-
de-accediluacutecar Saccharicoccus sacchari cocherell (LOCKHART
1993 LOCKHART amp AUSTREY 1988)
O BSV inicialmente causa na bananeira um estriado
cloroacutetico de linhas descontiacutenuas dispersas e concentradas
em partes da lacircmina foliar Com o envelhecimento das
folhas o estriado causa necrose de coloraccedilatildeo marrom-cafeacute
a negro (RAMIREZ amp RIVERA 1994) As plantas
infectadas geralmente natildeo mostram sintomas em todas as
folhas (CORDEIRO amp KIMATI 1997 LOCKHART 1986)
Outros sintomas do BSV satildeo a reduccedilatildeo do vigor da planta
e a diminuiccedilatildeo do tamanho dos frutos que tambeacutem ficam
deformados (RAMIREZ amp RIVERA 1994)
Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos
da infecccedilatildeo pelo BSV na multiplicaccedilatildeo in vitro e no
crescimento durante a aclimatizaccedilatildeo das plantas de
bananeira da cultivar Caipira Aleacutem disso avaliou-se a taxa
de contaminaccedilatildeo por fungos e bacteacuterias na etapas da
micropropagaccedilatildeo devido a importacircncia dessa variaacutevel na
multiplicaccedilatildeo in vitro das plantas
MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo dos efeitos do BSV na micropropagaccedilatildeo
da cultivar Caipira (grupo AAA) foi conduzido no
Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos da Embrapa Mandioca
e Fruticultura Tropical Utilizou-se o delineamento
experimental inteiramente casualizado com dois
tratamentos plantas sadias com 24 repeticcedilotildees coletadas
no Banco de Germoplasma de Bananeira da Embrapa
Mandioca e Fruticultura Tropical e plantas infectadas com
BSV com 28 repeticcedilotildees Foram usadas mudas do tipo
chifrinho sendo que as matrizes infectadas com BSV com
altura meacutedia de 12 cm foram infestadas pela cochonilha
vetora Planacoccus citri Risso alimentadas em folhas de
banana lsquoMysorersquo com sintomas de BSV em casa-de-
vegetaccedilatildeo Aproximadamente 15 dias apoacutes a infestaccedilatildeo
todas as 28 plantas estavam com os sintomas da virose
Para o estabelecimento in vitro realizou-se a limpeza
das matrizes por meio de uma seacuterie de cortes removendo-
se parte do rizoma e do pseudocaule ateacute o tamanho
aproximado de 50 cm de altura por 15 cm de diacircmetro
lavando-se com detergente e aacutegua deionizada A
desinfestaccedilatildeo foi feita em cacircmara de fluxo laminar
imergindo os explantes em soluccedilatildeo de aacutelcool 70 por
cinco minutos e em soluccedilatildeo 11 de aacutegua sanitaacuteria comercial
(2 de cloro ativo) com aacutegua deionizada por 30 minutos
Em seguida foram realizadas trecircs lavagens com aacutegua
deionizada esterilizada e reduzidos os explantes ateacute o
tamanho final de 06 cm de altura por 04 cm de diacircmetro
As etapas de estabelecimento multiplicaccedilatildeo e
enraizamento foram realizadas em meio nutritivo MS baacutesico
(MURASHIGE amp SKOOG 1962) suplementado com 30 g
L de sacarose solidificado com 2 gL de ldquoPhytagelrdquo e pH
ajustado para 58 Apenas na fase de multiplicaccedilatildeo o meio
MS foi suplementado com 4 mgL de 6-benzilaminopurina
(BAP) Em todas as etapas os explantes foram dispostos
sobre 25 mL de meio de cultura em frascos com 12 cm de
altura por 5 cm de diacircmetro
A multiplicaccedilatildeo foi realizada em cinco subcultivos
das gemas e brotos sendo efetuada a subdivisatildeo
longitudinal dos explantes sempre que possiacutevel O
estabelecimento e os cinco subcultivos foram realizados
com intervalos de 30 dias Apoacutes os subcultivos as
plantas permaneceram 30 dias em enraizamento O
estudo foi desenvolvido sob condiccedilotildees de temperatura
de 27 plusmn 1ordmC fotoperiacuteodo de 16 horas e intensidade
luminosa de 22 microEm2s
SILVEIRA D G et al76
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Apoacutes o enraizamento in vitro 47 plantas sadias e 40
plantas infectadas com BSV foram transferidas para copos
plaacutesticos de 300 cm3 contendo o Plantmaxreg e vermiculita
(21) permanecendo 30 dias sob condiccedilotildees de 85 de umidade
relativa do ar e 60 de sombreamento em casa-de-vegetaccedilatildeo
Na fase de estabelecimento e em cada subcultivo
foram avaliadas as taxas de multiplicaccedilatildeo e a presenccedila dos
sintomas do BSV nos explantes provenientes das plantas
infectadas Na fase de aclimatizaccedilatildeo avaliaram-se a
presenccedila de sintomas nas plantas infectadas e as suas
respectivas alturas As medidas foram tomadas do coleto
ateacute a extremidade apical da folha mais alta
Os dados referentes ao nuacutemero de gemas obtidas
nos cinco subcultivos foram transformados em raiz
quadrada Foi estabelecida uma regressatildeo linear para cada
tratamento em funccedilatildeo dos subcultivos
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
A infecccedilatildeo pelo BSV natildeo afetou significativamente
o crescimento e a multiplicaccedilatildeo das plantas sendo que o
nuacutemero de gemas cresceu linearmente em funccedilatildeo dos
subcultivos em ambos os tratamentos Trabalhando com
plantas micropropagadas de bananeira sadias e infectadas
com o viacuterus do topo em leque (Banana bunchy top virus
BBTV) Thomas et al (1995) observaram que aquela virose
tambeacutem natildeo afetou a capacidade das plantas em crescer e
multiplicar Nas anaacutelises de regressatildeo realizadas para os
dois tratamentos (plantas sadias e plantas com BSV) o
acreacutescimo no nuacutemero de gemas em funccedilatildeo dos subcultivos
pode ser explicado por um modelo de regressatildeo linear
(Figura 1) As estimativas da regressatildeo linear para plantas
com BSV e plantas sadias foram altamente significativas e
os coeficientes de determinaccedilatildeo (R2) proacuteximos de 1 Foi
observado que as linhas determinadas a partir das
equaccedilotildees obtidas satildeo quase superpostas evidenciando
um comportamento semelhante entre os dois tratamentos
com relaccedilatildeo ao nuacutemero de gemas por subcultivo
Em todas as fases da micropropagaccedilatildeo os sintomas
do BSV foram visiacuteveis ocorrendo nas folhas das plantas
infectadas estriados cloroacuteticos com linhas descontiacutenuas e
FIGURA 1 ndash Curvas de regressatildeo linear obtidas a partir dosdados de gemas em cada subcultivo da cultivar de bananeiraCaipira sadias e infectadas com BSV Cruz das Almas (BA)Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical 2006Dados transformados por x
dispersas (Figura 2) Esses mesmos sintomas foram
observados em plantas de bananeira infectadas com BSV
mantidas a campo (RAMIREZ amp RIVERA 1994)
As contaminaccedilotildees que ocorreram nos materiais
in vitro foram tambeacutem avaliadas As maiores taxas de
contaminaccedilatildeo aconteceram na fase de estabelecimento
in vitro dos explantes obtendo-se niacuteveis de 21 e 32
para as plantas sadias e infectadas com BSV
respectivamente (Figura 3) Os elevados iacutendices de perdas
nesta etapa foram causados principalmente por
contaminaccedilatildeo bacteriana Segundo Oliveira amp Silva
(1997) as maiores contaminaccedilotildees bacterianas dos
explantes de bananeira ocorrem na fase de
estabelecimento in vitro do que nos demais subcultivos
Oliveira et al (2000) trabalhando com plantas livres de
viacuterus obtiveram taxas de contaminaccedilatildeo nesta fase entre
10 e 45 as quais estatildeo proacuteximas agraves obtidas neste
trabalho Durante a fase de multiplicaccedilatildeo as perdas por
contaminaccedilatildeo foram menores variando de 14 a 74
para as plantas sadias e de 0 a 121 no caso das plantas
infectadas com BSV sendo que a maior parte do material
foi contaminada por fungos natildeo-patogecircnicos Estes
valores foram bem inferiores agravequeles obtidos por Oliveira
et al (1999) (131) que utilizaram genoacutetipos diploacuteides
triploacuteides e tetraploacuteides de bananeiras sadias
Efeito do viacuterus das estrias da bananeira 77
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
FIGURA 2 ndash Planta de bananeira lsquoCaipirarsquo infectada com BSV na fase de enraizamento in vitro apresentando estriadoscloroacuteticos com linhas descontiacutenuas e dispersas nas folhas Cruz das Almas (BA) Embrapa Mandioca e FruticulturaTropical 2006
FIGURA 3 ndash Taxas por contaminaccedilatildeo () de explantes dacultivar Caipira na fase de estabelecimento (Est) e ao longode cinco subcultivos (Sub) Cruz das Almas (BA)Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical 2006
Durante o enraizamento in vitro natildeo houve
diferenccedila significativa na altura das plantas Poreacutem com
30 dias de aclimatizaccedilatildeo as plantas com BSV apresentaram
altura significativamente inferior agraves plantas sadias (Tabela 1)
Soares et al (2000) cultivaram mudas de bananeira lsquoCaipirarsquo
sadias e infectadas com BSV durante 141 dias em casa-de-
vegetaccedilatildeo e observaram que a infecccedilatildeo pelo viacuterus implicou
em significativa reduccedilatildeo no crescimento inicial afetando
o porte o desenvolvimento do sistema radicular e a aacuterea
fotossintetizante das plantas Verifica-se assim que a
infecccedilatildeo pelo BSV prejudicou o crescimento inicial das
plantas afetando a altura daquelas infectadas mesmo em
um periacuteodo relativamente curto indicando que em periacuteodos
mais longos o prejuiacutezo com relaccedilatildeo ao crescimento pode
ser ainda maior aconteceu no estudo desenvolvido por
Soares et al (2000)
Os sintomas do BSV permaneceram visiacuteveis em
todas as plantas infectadas durante e apoacutes a fase de
aclimatizaccedilatildeo Esse resultado foi diferente ao obtido por
Dahal et al (1999) quando micropropagaram hiacutebridos de
Musa pois os sintomas soacute foram visiacuteveis em plantas com
trecircs meses apoacutes o enraizamento Provavelmente essa
diferenccedila foi devido agraves condiccedilotildees onde os trabalhos foram
conduzidos casa-de-vegetaccedilatildeo e campo respectivamante
bem como aos genoacutetipos estudados Observaccedilotildees
semelhantes foram tambeacutem efetuadas por Gauhl amp Pasberg-
Gauhl (1995) e Ortiz (1996) ao estudarem a incidecircncia de
viroses em diferentes genoacutetipos de bananeira
SILVEIRA D G et al78
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
Alturas (cm) Plantas de bananeira lsquoCaipirarsquo
Enraizamento
in vitro 30 dias de
aclimatizaccedilatildeo
Sadias 637 a 2690 a BSV 728 a 2192 b
TABELA 1 ndash Meacutedias das alturas das plantas apoacutes oenraizamento in vitro e 30 dias de aclimatizaccedilatildeo em casa-de-vegetaccedilatildeo Cruz das Almas (BA) Embrapa Mandiocae Fruticultura Tropical 2006
Meacutedias seguidas pelas mesmas letras nas colunas natildeodiferem estatisticamente entre si pelo teste F ao niacutevel de 5 de significacircncia
CONCLUSOtildeES
A infecccedilatildeo pelo BSV natildeo influenciou a taxa de
multiplicaccedilatildeo dos explantes embora os sintomas do viacuterus
tenham sido visiacuteveis em todas as fases da micropropagaccedilatildeo
e durante os primeiros 30 dias da aclimatizaccedilatildeo das plantas
infectadas Todavia o crescimento das plantas infectadas
foi afetado pela presenccedila do viacuterus
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FOGACcedilA L A et al80
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
CARACTERIacuteSTICAS MORFOFISIOLOacuteGICAS DE BROTACcedilOtildeES DEAgapanthus umbellatus var minor MULTIPLICADAS EM
BIORREATOR DE IMERSAtildeO TEMPORAacuteRIA1
MORPHOLOGICAL AND PHYSIOLOGICAL CHARACTERISTICS Agapanthus umbellatus varminor OF SHOOTS PROPAGATED IN BIOREACTOR OF TEMPORARY IMMERSION
LUCIANA ALVES FOGACcedilA2 DENILSON DORTZBACH3 ANTONIO CARLOS ALVES4 ENIO LUIZ PEDROTTI5
1Parte da dissertaccedilatildeo de mestrado do primeiro autor junto ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Recursos Geneacuteticos vegetais CCA UFSC ndash Florianoacutepolis SC2Engenheira Agrocircnoma Mestre em Recursos Geneacuteticos Vegetais ndash CCAUFSC ndash UFSC Trindade ndash Florianoacutepolis SC ndash 88040-900 ndash lufogacapopcombr3Empresa Catarinense de Pesquisa Agropecuaacuteria ndash Rodovia Admar Gonzaga 1340 ndash Bairro Itacorubi Florianoacutepolis SC ndash denilsondtbolcombr4Engenheiro Agrocircnomo Professor Dr Departamento Fitotecnia ndash CCAUFSC ndash UFSC ndash alvesccaufscbr5Engenheiro Agrocircnomo Professor Dr Departamento Fitotecnia ndash CCAUFSC ndash UFSC ndashRodovia Admar Gonzaga 1346 ndash 88 040 900 ndash Florianoacutepolis- SC ndash pedrotticcaufscbr
RESUMOCom o presente trabalho objetivou-se estudar alguns
aspectos morfoloacutegicos e fisioloacutegicos de placircntulas de Agapanthusumbellatus LrsquoHeacuter var minor multiplicadas em biorreatores deimersatildeo temporaacuteria (BIT) Foram testadas quatro concentraccedilotildeesde sacarose no meio de cultura e duas intensidades luminosasem um total de oito tratamentos formando um fatorial 2 x 4 Odelineamento experimental utilizado foi inteiramentecasualizado Os resultados obtidos indicaram que as condiccedilotildeesambientais principalmente luz e concentraccedilatildeo de sacarose domeio de cultura influenciaram o desenvolvimento e o crescimentodas placircntulas quando multiplicadas Observou-se que a ausecircnciade sacarose mesmo no niacutevel mais elevado de intensidadeluminosa natildeo estimulou a fotossiacutentese das placircntulas Acombinaccedilatildeo de 30 gL-1 de sacarose e 70 mMm-2s-1 de luzproporcionou maior numero de folhas massa fresca e secaconcentraccedilatildeo de clorofila a b e total fatores estes que tecircmgrande influecircncia na fase de aclimatizaccedilatildeo
Termos para indexaccedilatildeo Plantas ornamentaismicropropagaccedilatildeo sacarose intensidade luminosa
ABSTRACTThe objective of the present work was to study
morphological and physiological characteristics of Agapanthusumbellatus LrsquoHeacuter var minor plantlets propagated in bioreactorof temporary immersion (BIT) Four sucrose concentrationsand two light intensities were analyzed totalizing eighttreatments The experimental design used was a completelyrandomized with a 2 x 4factorial The results indicated that theenvironment conditions mainly light and sucrose concentrationsof the culture medium influenced plantlets development andgrowth It was observed that the absence of sucrose even inthe highest level of light intensity had no stimuli on plantletphotosynthesis The combination of 30 g L-1 sucrose and 70mM m-2 s-1 light had promoted higher leaf number fresh anddry weight concentration of chlorophyll a b and total
parameters that present high influence during theacclimatizationrsquos phase
Index terms Ornamental plants micropropagation sucroselight intensity
INTRODUCcedilAtildeO
Agapanthus umbellatus var minor tambeacutem
conhecida como Agapantho ou Liacuterio do Nilo eacute uma
angiosperma da famiacutelia Amaryllidaceae pertencente agrave
ordem Liliales (BOTANY 2003) eacute uma espeacutecie ornamental
muito utilizada como flor de corte devido agrave sua durabilidade
No entanto o maior interesse econocircmico nesta espeacutecie
decorre do seu uso como forraccedilatildeo em jardins e praccedilas
(LORENZI amp SOUZA 1995)
Sua propagaccedilatildeo eacute tradicionalmente efetuada
atraveacutes da divisatildeo de touceiras No entanto esta teacutecnica
apresenta uma seacuterie de desvantagens visto que a taxa de
propagaccedilatildeo eacute baixa cerca de dez mudas por planta ao ano
aleacutem de possibilitar a dispersatildeo de pragas e doenccedilas que
poderatildeo ocorrer no viveiro de produccedilatildeo Sendo assim a
micropropagaccedilatildeo pode ser uma ferramenta muito
promissora para esta espeacutecie
O processo de micropropagaccedilatildeo induz a um grande
nuacutemero de mudanccedilas anatocircmicas morfoloacutegicas e
fisioloacutegicas que muitas vezes tem limitado o cultivo in vitro
de algumas espeacutecies (DESJARDINS 1993) A
(Recebido em 18 de julho de 2005 e aprovado em 25 de agosto de 2006)
Caracteriacutesticas morfofisioloacutegicas de brotaccedilotildees 81
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
heterogeneidade de respostas agraves placircntulas que ocorrem
na cultura de tecidos eacute promovida natildeo soacute por fatores
inerentes ao tecido vegetal (geneacuteticos e fisioloacutegicos) mas
tambeacutem por modificaccedilotildees do ambiente in vitro
As modificaccedilotildees do ambiente in vitro envolvem a
qualidade e intensidade de luz fotoperiacuteodo temperatura
umidade reguladores de crescimento exoacutegenos fonte de
carbono e estresse mecacircnico Estes satildeo determinantes na
morfogecircnese no crescimento e no desenvolvimento de
placircntulas in vitro (GEORGE 1996 KOZAI et al 1990
SALISBURY 1981) Aleacutem disso interferem no nuacutemero de
folhas teor de clorofila densidade estomaacutetica (LIAN et
al 2002 PREECE amp SUTTER 1991) na fotossiacutentese e na
fase de aclimatizaccedilatildeo (DESJARDINS et al 1995)
Um dos principais fatores que causam grande
influecircncia na fotossiacutentese de placircntulas cultivadas in vitro
eacute a intensidade luminosa (GALZY amp COMPAN 1992) A
quantidade e a qualidade da luz bem como o fotoperiacuteodo
podem afetar o crescimento e o desenvolvimento de
placircntulas in vivo (SMITH 1982) e placircntulas in vitro
(ECONOMOU amp READ 1987 VLAHOS et al 1992) Esta
influecircncia se deve ao grande impacto sobre o acuacutemulo de
pigmentos biossiacutentese de clorofila diferenciaccedilatildeo de
cloroplastos e anatomia da folha (DESJARDINS et al 1995)
Outro fator que vem sendo estudado e que pode
determinar um papel importante no controle da atividade
fotossinteacutetica de placircntulas in vitro eacute a utilizaccedilatildeo de
carboidratos exoacutegenos pois o crescimento da maioria das
culturas in vitro eacute sustentado pela sacarose ou outros
accediluacutecares adicionados ao meio de cultura (PREECE amp
SUTTER 1991) Estes podem ser utilizados pelas placircntulas
quando a taxa de fotossiacutentese natildeo permite assegurar um
balanccedilo positivo em carbono definindo assim uma nutriccedilatildeo
mixotroacutefica ou heterotroacutefica (GALZY amp COMPAN 1992)
Baseado na hipoacutetese de que a composiccedilatildeo do meio
de cultura e a intensidade luminosa influenciam a
morfologia e a fisiologia de placircntulas micropropagadas o
presente trabalho teve como objetivo estudar aspectos
morfoloacutegicos e fisioloacutegicos de placircntulas de Agapanthus
umbellatus LrsquoHeacuter var minor multiplicadas em biorreator de
imersatildeo temporaacuteria (BIT) Para tanto foi avaliado o
desenvolvimento e o crescimento desta espeacutecie durante a
fase de multiplicaccedilatildeo em funccedilatildeo da variaccedilatildeo de niacuteveis de
sacarose e intensidade luminosa
MATERIAIS E MEacuteTODOS
Este trabalho foi realizado no Laboratoacuterio de
Morfogecircnese e Bioquiacutemica Vegetal localizado no Centro
de Ciecircncias Agraacuterias da Universidade Federal de Santa
Catarina em Florianoacutepolis - SC
O trabalho consistiu de um ensaio onde foram
utilizadas brotaccedilotildees de Agapanthus umbellatus var minor
obtidas da terceira repicagem mantidas em meio geleificado
MS + 178 mM de BAP Apoacutes serem individualizadas e
padronizadas tendo o seu tamanho variando entre 25 e
30 cm de comprimento as brotaccedilotildees foram transferidas
para o BIT (ETIENNE amp BERTHOULY 2002) contendo 500
mL de meio liacutequido e sais de MS (MURASHIGE amp SKOOG
1962) em condiccedilotildees asseacutepticas suplementado com
concentraccedilatildeo de 89 mM de BAP O pH foi ajustado com
NAOH (1N) em 59 antes da autoclavagem (durante 15
minutos sob 121ordmC e 15 atm de pressatildeo) O delineamento
experimental utilizado no ensaio foi o inteiramente
casualizado Foram testados quatro concentraccedilotildees de
sacarose no meio de cultura (0 15 30 e 45) e duas
intensidades luminosas (70 e 140 mmolm-2s-1) providas
por lacircmpadas brancas fluorescentes (PHILIPS ndash TLT 40W)
em um total de oito tratamentos formando um fatorial 2 x 4
Cada tratamento foi composto por trecircs frascos (repeticcedilatildeo)
contendo 50 plantas cada um
Os frascos foram mantidos em sala de crescimento
com fotoperiacuteodo de 16 horas e temperatura meacutedia de 22ordmC
com variaccedilatildeo de plusmn 2ordmC por um periacuteodo de 60 dias
Apoacutes 60 dias de cultivo foram avaliadas as
seguintes caracteriacutesticas dos explantes nuacutemero e tamanho
das brotaccedilotildees (cm) nuacutemero de folhasbrotaccedilatildeo massa
fresca e seca (g) da parte aeacuterea e raiz utilizando-se amostras
de 25 placircntulas por repeticcedilatildeo escolhidas ao acaso
FOGACcedilA L A et al82
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
A determinaccedilatildeo do conteuacutedo de clorofila ldquoa b e
totalrdquo consistiu na coleta de amostras de 100 mg de massa
fresca As amostras foram incubadas com 70 mL de DMSO
(dimetilsulfoacutexido) sem maceraccedilatildeo por 30 minutos a 65degC
Apoacutes filtragem seu volume foi completado para 10 mL com
DMSO Desses extratos 2 mL foram analisados em
espectrofotocircmetro (UV - visiacutevel SHIMADZU) para os
valores de absorbacircncia entre 645 e 663 nm Os valores obtidos
foram submetidos agrave foacutermula de Arnon (1949) conforme
descrito por Hiscox amp Israelstam (1979) Chl a = (00127 X
D663) ndash (000269 X D645) e Chl b = (00229 X D645) ndash (000468
X D663) A clorofila total foi a soma da ldquoChl a e Chl brdquo de
cada tratamento foram utilizadas 25 amostras
A determinaccedilatildeo da densidade estomaacutetica (nuacutemero
de estocircmatos por mm2 de superfiacutecie foliar) foi realizada nas
amostras das quais extraiu-se a clorofila Apoacutes a extraccedilatildeo
da clorofila as folhas foram cortadas e somente o terccedilo
meacutedio das folhas foi usado para anaacutelise Em seguida foram
fixadas sobre lacircminas histoloacutegicas com a ajuda de uma
lamiacutenula e de algumas gotas de aacutegua esterilizada A
observaccedilatildeo foi realizada na epiderme das faces adaxial e
abaxial da folha com o auxiacutelio de um microscoacutepio oacutetico
(OLYMPUS CH30 ocular WH10 X 22) com um aumento
de 400 vezes e com um campo conhecido de 024 mm2 Para
cada lacircmina foram feitas leituras em cinco campos
Os dados obtidos foram avaliados por meio da
anaacutelise de variacircncia (ANOVA) seguindo o modelo para
experimento bifatorial inteiramente casualizado O nuacutemero
de brotaccedilotildees o nuacutemero de folhas e a densidade estomaacutetica
foram transformados em Oumlx+1 para a anaacutelise As meacutedias
dos tratamentos foram separadas pelo teste de comparaccedilatildeo
de meacutedias de Duncan a 5 de probabilidade conforme
recomendaccedilotildees de Stell amp Torrie (1980)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
A concentraccedilatildeo de sacarose no meio de cultura
apresentou uma accedilatildeo positiva e interativa com a intensidade
luminosa na proliferaccedilatildeo de brotaccedilotildees (Tabela 1) visto
que a ausecircncia de sacarose no meio de cultura resultou
em insucesso no crescimento das placircntulas de Agapantho
principalmente nos primeiros dias Apoacutes o
desenvolvimento inicial (aproximadamente 10 dias) foi
constatada estagnaccedilatildeo no crescimento das placircntulas
seguido de atrofia e necrose das brotaccedilotildees Apoacutes 20 dias
de cultivo ocorreu a morte das brotaccedilotildees Isso mostrou
que folhas de placircntulas de Agapantho natildeo fixaram
carbono suficiente para sustentar seu crescimento na
ausecircncia de sacarose Portanto para a espeacutecie em estudo
foi necessaacuteria a adiccedilatildeo de uma fonte de carbono no meio
de cultura para o seu desenvolvimento in vitro Segundo
Capellades et al (1991) e Desjardins et al (1995) a total
remoccedilatildeo de carboidratos no meio de cultura para algumas
espeacutecies frequumlentemente torna-se prejudicial para o
crescimento das placircntulas o que pode prejudicar o
processo de micropropagaccedilatildeo e aclimatizaccedilatildeo pois
durante o cultivo in vitro as placircntulas perdem
parcialmente o autotrofismo e consequumlentemente
necessitam de uma fonte de carbono
O maior nuacutemero de brotaccedilotildees foi obtido com a
intensidade luminosa de 70 mmolm-2s-1 e a concentraccedilatildeo
de 45 gL-1 de sacarose (Tabela 1) Enquanto que com a
intensidade luminosa de 140 mmolm-2s-1 o maior nuacutemero
de brotaccedilotildees foi obtido com a concentraccedilatildeo de 30 gL-1 de
TABELA 1 ndash Nuacutemero de brotaccedilotildeesexplante de placircntulasde Agapanthus umbellatus var minor multiplicadasbiorreator de imersatildeo temporaacuteria suplementado comdiferentes concentraccedilotildees de sacarose e intensidadesluminosas no periacuteodo de 60 dias
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1)
Concentraccedilatildeo Sacarose (gL-1) 70 1 140 1
0 000 dA 00 dA 15 370 cB 544 cA 30 553 bB 651 aA 45 745 aA 585 bB
CV 67
Meacutedias seguidas pela mesma letra minuacutescula nas colunase maiuacutescula nas linhas natildeo diferem significativamente peloteste de Duncan a 5 de probabilidade1 Observaccedilotildees transformadas segundo ( x+1)
Caracteriacutesticas morfofisioloacutegicas de brotaccedilotildees 83
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
sacarose Isso demonstrou um alto grau de mixotrofia dessa
espeacutecie
O tamanho das brotaccedilotildees e o nuacutemero de folhas
(Tabela 2) foram afetados apenas pelo efeito simples dos
fatores natildeo havendo interaccedilatildeo entre sacarose e luz O
maior tamanho das brotaccedilotildees foi alcanccedilada quando os
explantes foram submetidos a 15 gL-1 de sacarose e 140
mmolm-2s-1 de intensidade luminosa (Tabela 2) Verificou-
se tambeacutem que o aumento da concentraccedilatildeo desse
carboidrato no meio de cultura natildeo favoreceu o
alongamento das brotaccedilotildees Provavelmente o aumento
da intensidade luminosa favoreceu a taxa de fotossiacutentese
das placircntulas permitindo um balanccedilo positivo de carbono
afetando o crescimento e o desenvolvimento de placircntulas
in vitro (LEE et al 1995)
Por outro lado o maior nuacutemero de folhas de
Agapantho foi obtido na concentraccedilatildeo de 30 gL-1 de
sacarose (Tabela 2) A intensidade luminosa natildeo teve
influecircncia sobre essa variaacutevel Contrastando com os dados
obtidos no presente trabalho Konow amp Wang (2001)
determinaram que a intensidade luminosa de 40 mmolm-
2s-1 promoveu um aumento no nuacutemero de folhas de
Phalaenopsis enquanto placircntulas que se desenvolveram
em ambiente com intensidade de 10 e 80 molm-2s-1
apresentaram um menor nuacutemero de folhas Segundo os
autores o aumento no nuacutemero de folhas pode indicar que
TABELA 2 ndash Tamanho de brotaccedilotildees e nuacutemero de folhasbrotaccedilatildeo de placircntulas de Agapanthus umbellatus var minormultiplicadas em biorreator de imersatildeo temporaacuteria suplementado com diferentes concentraccedilotildees de sacarose eintensidades luminosas no periacuteodo de 60 dias
Meacutedias seguidas pela mesma letra nas linhas e colunas natildeo diferem significativamente pelo teste de Duncan a 5 deprobabilidade
houve estiacutemulo da fotossiacutentese in vitro Outro efeito
observado em placircntulas de Agapantho neste trabalho foi
a presenccedila de folhas mais claras e vitrificadas (folhas com
aspecto viacutetreo pouco desenvolvidas aparecircncia suculenta
e translucente) na grande maioria das placircntulas
multiplicadas em meio suplementado com 15 gL-1 de
sacarose e intensidade luminosa de 70 mmolm-2s-1 Estes
resultados podem indicar que o aparato fotossinteacutetico natildeo
tenha se desenvolvido adequadamente (CAPPELADES et
al 1991 DESJARDINS et al 1995) afetando a acumulaccedilatildeo
de massa fresca Possivelmente a presenccedila de folhas
vitrificadas foi influenciada pelo uso de meio liacutequido pois
de acordo com George (1996) e Etienne amp Berthouly (2002)
o meio liacutequido favorece a produccedilatildeo de folhas vitrificadas
quando comparado com meio geleificado No entanto
observou-se que para os demais tratamentos em
concentraccedilotildees maiores de sacarose (30 e 45 gL-1) a
presenccedila de brotaccedilotildees vitrificadas foi rara ou nenhuma
Neste sentido o desenvolvimento de brotaccedilotildees com esta
caracteriacutestica pode estar relacionado agrave concentraccedilatildeo de
sacarose no meio e agrave diferenccedila osmoacutetica entre as brotaccedilotildees
e o meio de cultura (DEBERGH et al 1981) Este resultado
tambeacutem foi obtido na multiplicaccedilatildeo de rosas na qual onde
a reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo de sacarose para 10 gL-1 na
fase de multiplicaccedilatildeo promoveu um aumento significativo
na presenccedila de plantas vitrificadas e quando submetidas
Tamanho de brotaccedilotildees (cm)
Nuacutemero de folhasbrotaccedilatildeo
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1) Concentraccedilatildeo Sacarose
(gL-1) 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia
0 000 000 000 d 000 000 000 d 15 275 396 335 a 407 408 408 b 30 295 295 295 b 414 404 409 a 45 245 220 233 c 400 408 404 c
Meacutedia 204 b 228 a 276 a 275 a
CV 2595 467
FOGACcedilA L A et al84
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
a concentraccedilotildees de 30 e 40 gL-1 a presenccedila de placircntulas
vitrificadas foi rara (LANGFORD amp WAINWRIGHT 1987)
Outro fator que possivelmente pode ter
influenciado a presenccedila de placircntulas vitrificadas in vitro
foi a baixa intensidade luminosa (GEORGE 1996) pois
placircntulas de Agapantho multiplicadas sob intensidade de
140 mmolm-2s-1 e 15 gL-1 de sacarose natildeo apresentaram
caracteriacutestica de vitrificaccedilatildeo Estes dados indicaram que o
aumento da intensidade luminosa evitou a presenccedila de
plantas vitrificadas aleacutem de proporcionar um incremento e
estiacutemulo na atividade fotossinteacutetica (GEORGE 1996)
A produccedilatildeo de massa fresca e seca das brotaccedilotildees
foram influenciadas pela interaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo
de sacarose e a intensidade luminosa (Tabela 3) Placircntulas
de Agapantho multiplicadas sob intensidade de 70
mmolm-2s-1 apresentaram a maior produccedilatildeo de massa
fresca e seca dentro das concentraccedilotildees de 30 gL-1 Nas
concentraccedilotildees de 15 e 45 gL-1 os resultados obtidos
foram inferiores (Tabela 3) Por outro lado quando se
aumentou a intensidade para 140 mmolm-2s-1 a melhor
produccedilatildeo de massa fresca e seca ocorreu dentro da
concentraccedilatildeo de 15 gL-1 de sacarose (Tabela 3) Verificou-
se assim que o aumento da concentraccedilatildeo de sacarose no
meio de cultura proporcionou efeitos negativos na
produccedilatildeo de massa fresca e seca quando as placircntulas
foram submetidas agrave intensidade luminosa mais elevada
TABELA 3 ndash Massa fresca e seca de brotaccedilotildees de Agapanthus umbellatus var minor multiplicadas em biorreator de imersatildeotemporaacuteria suplementado com diferentes concentraccedilotildees de sacarose e intensidades luminosas no periacuteodo de 60 dias
Tais resultados corroboram as afirmaccedilotildees feitas referentes
agrave variaacutevel nuacutemero de brotaccedilotildees em que demonstrou-se
que foi possiacutevel reduzir a concentraccedilatildeo de sacarose em
maiores intensidade luminosas confirmando o grau de
mixotrofia
Ao analisar a concentraccedilatildeo de clorofila em
folhas de Agapantho verificou-se que natildeo houve
interaccedilatildeo significativa entre as concentraccedilotildees de
sacarose e intensidade luminosa Os teores de clorofila
a b e total (Tabela 4) foram maiores nas concentraccedilotildees
de 30 gL-1 sacarose Serret et al (1995) mostraram que
o aumento da concentraccedilatildeo de accediluacutecares (30 gL-1) no
meio de cultura promoveu maior produccedilatildeo de clorofila
impedindo a fotoinibiccedilatildeo realizaccedilatildeo de fotossiacutentese e
aumento do ganho de massa em plantas de Gardecircnia
cultivadas in vitro
Em relaccedilatildeo ao efeito da intensidade luminosa natildeo
houve efeito deste fator sobre essas variaacuteveis ainda que
Economou amp Read (1987) Galzy amp Compan (1992) Vlahos
et al (1992) George (1996) tenham observado que a
intensidade luminosa eacute um fator que estaacute estreitamente
relacionado agrave siacutentese de clorofila No entanto no presente
trabalho sugere-se a menor intensidade 70 mmolm-2s-1 com
o objetivo de que natildeo ocorra um aumento na velocidade
de decomposiccedilatildeo da clorofila com intensidade mais
elevada
Meacutedias seguidas pela mesma letra minuacutescula nas colunas e maiuacutescula nas linhas natildeo diferem significativamente peloteste de Duncan a 5 de probabilidade
Massa fresca (g)
Massa seca (g)
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1) Concentraccedilatildeo
Sacarose (gL-1) 70 140 70 140
0 000 dA 00 dA 000 dA 000 dA 15 067 cB 106 aA 0069 cB 0109 aA 30 082 aA 076 bB 0085 aA 0081 bB 45 075 bA 049 cB 0078 bA 0051 cB
CV 2873 2655
Caracteriacutesticas morfofisioloacutegicas de brotaccedilotildees 85
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
TABELA 4 ndash Concentraccedilotildees de clorofila a b e total (mgg massa fresca) em folhas de Agapanthus umbellatus varminor multiplicadas em biorreator de imersatildeo temporaacuteria por um periacuteodo de 60 dias submetidas a 4 concentraccedilotildees desacarose e dois niacuteveis de intensidade luminosa
Clrofila a (mgg massa fresca)
Clrofila b (mgg massa fresca)
Clrofila total (mgg massa fresca)
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1) Concentraccedilatildeo
Sacarose (gL-1) 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia
0 000 000 000 d 000 000 000 d 000 000 000 d 15 211 248 295 c 089 076 083 c 301 325 313 c 30 502 509 505 a 200 211 205 a 703 721 710 a 45 486 420 453 b 195 179 187 b 682 633 658 b
Meacutedia 299 a 294 a 121 a 116 a 421 a 420 a
CV 740 820 850
Meacutedias seguidas pela mesma letra nas linhas e colunas natildeo diferem significativamente pelo teste de Duncan a 5 deprobabilidade
Em relaccedilatildeo aos estocircmatos atraveacutes de
observaccedilatildeo microscoacutepica foi possiacutevel verificar que o
Agapantho possui folhas com caracteriacutest ica
anfiestomaacutetica caracterizada pela presenccedila de
estocircmatos em ambas as faces (face abaxial e adaxial)
Esta caracteriacutestica tem sido considerada como um
mecanismo adaptativo para maximizar a condutacircncia
de CO2 quando luz e aacutegua satildeo fatores limitantes
(KRAMER 1969)
Atraveacutes da anaacutelise estatiacutestica para densidade
estomaacutetica da face adaxial verificou-se que natildeo houve
interaccedilatildeo entre os fatores sacarose e intensidade
luminosa havendo portanto efeito isolado dos fatores A
maior densidade estomaacutetica da face abaxial foi obtida na
concentraccedilatildeo de 45 gL-1 (Tabela 5) Natildeo houve efeito da
intensidade luminosa para essa variaacutevel Por outro lado
a maior densidade estomaacutetica na face adaxial foi obtida
na concentraccedilatildeo de 45 gL-1 de sacarose e 140 mmolm-2s-1
de intensidade luminosa (Tabela 5) verificando a
influecircncia positiva da intensidade luminosa para essa
variaacutevel
As folhas de placircntulas multiplicadas na
concentraccedilatildeo de 15 gL-1 de sacarose apresentaram menor
densidade estomaacutetica em ambas as faces (Tabela 5) com
formato anormal largos e salientes caracteriacutesticas estas
natildeo desejaacuteveis pois segundo Preece amp Sutter (1991)
uma alteraccedilatildeo a niacutevel estrutural eou morfoloacutegico podem
impedir o funcionamento do aparelho estomaacutetico e grande
parte dos estocircmatos assim formados satildeo incapazes de se
fechar
Possivelmente este resultado se deve agraves
caracteriacutesticas de vitrificaccedilatildeo que as folhas do
tratamento 15 gL-1 de sacarose e 70 mmol m-2s-1 de
intensidade luminosa apresentaram (BLANKE amp
BELCHERL 1989) e a falta de energia armazenada no
explante com a falta de carbono que eacute proveniente da
sacarose adicionada ao meio de cultura (DESJARDINS
et al 1995) Estes resultados corroboram os obtidos
por Vintildea et al (2001) que demonstraram que folhas
vitrificadas de abacateiro apresentaram estocircmatos
grandes com saliecircncia ceacutelulas subsidiaacuterias assimeacutetricas
e deformadas e seu ostiacuteolo completamente aberto Tal
anomalia pode ser atribuiacuteda agrave perda da elasticidade das
paredes das ceacutelulas-guarda o que impediria o seu
movimento de abertura e fechamento que
consequumlentemente afeta o desenvolvimento das
placircntulas ao serem transferidas para condiccedilotildees ex vitro
atraveacutes da excessiva perda de aacutegua
FOGACcedilA L A et al86
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
TABELA 5 ndash Densidade estocircmatica (estocircmatosmm2) da face adaxial e abaxial de folhas de Agapanthus umbellatus varminor multiplicadas em biorreator de imersatildeo temporaacuteria suplementado com diferentes concentraccedilotildees de sacarose eintensidade luminosa por um periacuteodo de 60 dias
Densidade estomaacutetica (estocircmatosmm2) Epiderme da face Adaxial Epiderme da face Abaxial
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1)
Concentraccedilatildeo Sacarose(gL1) 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia
0 000 000 000 d 000 000 000 d 15 2587 3026 2802 c 3408 4752 4053 c 30 6524 5628 6064 b 9977 8584 9268 b 45 5412 7016 6188 a 8809 10807 9783 a
Meacutedia 2856 b 3089 a 4256 a 4705 a CV 1474 1206
Meacutedias seguidas pela mesma letra nas linhas e colunas natildeo diferem significativamente pelo teste de Duncan a 5 deprobabilidade
CONCLUSAtildeO
Condiccedilotildees ambientais tais como intensidade
luminosa e concentraccedilatildeo de sacarose adicionada ao meio
de cultura influenciaram no desenvolvimento e
crescimento das placircntulas de Agapanthus umbellatus
var minor quando multiplicadas em meio liacutequido no BIT
Placircntulas de Agapantho foram incapazes de se
desenvolver em meio sem sacarose sendo portanto
necessaacuteria a adiccedilatildeo de uma fonte de carbono visto que a
espeacutecie em estudo apresentou uma taxa de fotossiacutentese
incapaz de assegurar um balanccedilo positivo em carbono
Houve uma grande variaccedilatildeo nas respostas obtidas
no entanto fazendo uma avaliaccedilatildeo em conjunto das
variaacuteveis recomenda-se 30 gL-1 de sacarose e intensidade
luminosa de 70 mmolm-2s-1 No entanto deve-se ressaltar
que estudos mais aprofundados devem ser conduzidos
para verificar o efeito destas combinaccedilotildees sobre o
desempenho de placircntulas durante a fase de aclimatizaccedilatildeo
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Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
CAPACIDADE DE REGENERACcedilAtildeO IN VITRO DE TOMATEIROCULTIVAR SANTA CLARA
IN VITRO REGENERATION CAPACITY OF TOMATOPLANT CULTIVAR SANTA CLARA
GLAUCIA DE FATIMA MOREIRA VIEIRA E SOUZA1 JOSEacute MAGNO QUEIROZ LUZ2 ALCIONE SILVA ARRUDA3DENISE GARCIA SANTANA2 MARIANA DE SOUZA E SILVA DA COSTA TEIXEIRA4
LUCIANA LONDE5 ADELAIDE SIQUEIRA SILVA6 ELISAcircNGELA RODRIGUES FIGUEIRA7
1Mestranda em Fitotecnia ndash UFU ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash gfmvsyahoocombr2Professor Dr Instituto de Ciecircncias Agraacuterias ndash UFUICIAG ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash jmagnoumuaramaufubr3Dra em Geneacutetica e Bioquiacutemica Professora contratada da UEG ndash Unidade Universitaacuteria de Ipameri ndash Rodovia GO 330 Km 24 ndash Anel Viaacuterio SN ndash 75780-000 ndash Ipameri GO ndash asarrudahotmailcom4Engenheira Agrocircnoma ndash UFU ndash Conab Sede - SGAS 901 Bloco ldquoArdquo Lote 69 - Asa Sul ndash 70390-010 ndash Brasiacutelia DF ndash marisouza81yahoocombr5Dra em Geneacutetica e Bioquiacutemica ndash IGBUFU ndash Av Paraacute 1720 ndash Campus Umuarama ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash llondebolcombr6Mestranda em AgronomiaFitotecnia ndash UFUICIAG ndash Bolsista FAPEMIG ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash adelaidebioyahoocombr7Mestre em AgronomiaFitotecnia ndash UFUICIAG ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash Elis_figueirayahoocombr
RESUMOA cultivar de tomateiro Santa Clara (Lycopersicon
esculentum Mill) foi avaliada quanto ao seu potencial deregeneraccedilatildeo in vitro a partir de trecircs tipos de explantes e trecircsmeios de cultura seguidos de trecircs repicagens Os explantes foramcotileacutedone decapitado cotileacutedone fendido e cotileacutedone aparadonas extremidades Os meios de cultura foram MI macro emicronutrientes do MS vitaminas B5 de Gamborg et al (1968)suplementado com 30 gL de sacarose e de 8 gL de aacutegar pH 58MII meio MI suplementado com 1 mgL de BAP e 30 gL deglicose MIII meio MI suplementado com 25 mgL de BAP e02 mgL de AIA Para as repicagens foi utilizado o meio MIsuplementado com 05 mgL 08 mgL e 10 mgL de BAP paraa primeira segunda e terceira repicagens respectivamente Noenraizamento foi usado o meio MI suplementado com 05 mgL de AIA e as placircntulas enraizadas foram transferidas parasubstrato comercial Plantimax esterilizado e aclimatadas emlaboratoacuterio A maior induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo tanto de calosquanto de brotos foi observada nos meacutetodos cotileacutedone fendidoe cotileacutedone aparado quando colocados no meio MIII no entantoa induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo foi mais raacutepida quando usado cotileacutedonedecapitado indicando um alto potencial de organogecircneseespontacircnea sendo que o meio MI foi o melhor Os resultadosobtidos com as diferentes concentraccedilotildees de BAP nos trecircs ciclosde repicagem natildeo diferiram entre si e 82 das plantas enraizadasaclimataram-se com sucesso
Termos para indexaccedilatildeo Lycopersicon esculentummelhoramento do tomateiro cultura de tecidos
ABSTRACTThe tomato plant cultivar lsquoSanta Clararsquo (Lycopersicon
esculentum Mill) was evaluated as for its in vitro potential ofregeneration using three types of explants and three culture media
following three pricking-outs The explants were as followsdecapitated cotyledon split cotyledon and rim-trimmedcotyledon The culture media were MI MS macro andmicronutrients vitamins B5 of Gamborg et al (1968)supplemented with 30gL sucrose and 8gL agar pH 58 MIImedium MI supplemented with 1 mgL BAP and 30 gL glucoseMIII medium MI supplemented with 25 mgL BAP and 02mgL IAA For the pricking-outs the media MI wassupplemented with 05 mgL 08 mgL and 10 mgL BAP forthe first second and third pricking out respectively As forrooting the MI medium was supplemented with 05 mgL IAAand the rooted seedlings were transplanted to the sterilizedcommercial substrate Plantimax and then acclimatized inlaboratory Higher callus induction and sprout regeneration wasobserved for the methods of split and rim-trimmed cotyledonplaced into medium MIII Nevertheless the induction forregeneration was much faster when the decapitated cotyledonmethod was used indicating a high potential of spontaneousorganogenesis in which the media MI was the best The resultsobtained with the different concentrations of BAP in the threecycles of pricking-out did not differ among themselves and 82of the rooted plants were acclimatized successfully
Index terms Lycopersicon esculentum tomato breeding tissueculture
INTRODUCcedilAtildeO
O tomate pertence ao gecircnero Lycopersicon e a
espeacutecie cultivada cosmopolita eacute botanicamente
denominada de Lycopersicon esculentum (FILGUEIRA
2000) As cultivares atualmente plantadas podem ser
(Recebido em 03 de outubro de 2003 e aprovado em 04 de setembro de 2006)
Capacidade de regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro 89
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
reunidas em cinco grupos Santa Cruz Salada Cereja
Italiano Agroindustrial No presente trabalho foi utilizada
a cultivar Santa Clara do grupo Santa Cruz pois ela continua
sendo a cultivar mais plantada no Brasil
A tomaticultura estaacute associada a seacuterios problemas
fitossanitaacuterios sobretudo viroses aleacutem do ataque de
fungos bacteacuterias e insetos praga Cria-se com isto a
necessidade de se pesquisar novas alternativas ou
obtenccedilatildeo de novos genoacutetipos com resistecircncia muacuteltipla a
doenccedilas e pragas entre essas os estudos sobre
regeneraccedilatildeo e transformaccedilatildeo geneacutetica (FAacuteRI et al 2000)
A engenharia geneacutetica abriu uma nova perspectiva
para o melhoramento geneacutetico do tomateiro a partir do
final da deacutecada de 80 (WIJBRANDI amp BOTH 1993)
visando aumentar a produtividade e melhorar a qualidade
por meio da obtenccedilatildeo de resistecircncia a estresses bioacuteticos e
abioacuteticos A cultura de tecidos destaca-se durante o
processo de realizaccedilatildeo das teacutecnicas de transformaccedilatildeo
geneacutetica pois eacute necessaacuterio induzir gemas vegetativas e
em seguida regenerar brotos alongados e plantas
completas a partir de ceacutelulas ou tecidos geneticamente
modificados
Para a otimizaccedilatildeo de protocolos para o tomateiro
alguns fatores que afetam a eficiecircncia de transformaccedilatildeo
tecircm sido examinados dentre eles o tamanho do explante e
o tipo de explante hipocoacutetilo ou cotileacutedone (FRARY amp
EARLE 1996)
No Brasil haacute poucos trabalhos na aacuterea de
regeneraccedilatildeo in vitro e de transformaccedilatildeo geneacutetica de
cultivares de tomateiro e pouco se conhece sobre a
capacidade de regeneraccedilatildeo das principais cultivares
brasileiras (FAacuteRI et al 2000) Alguns pesquisadores como
Faria amp Illg (1993) analisaram a regeneraccedilatildeo in vitro de
algumas espeacutecies e cultivares de tomateiro observando
uma baixa capacidade morfogecircnica das cultivares se
comparadas com a espeacutecie selvagem Lycopersicon
pimpinellifolium (L) P Miller
Com este trabalho objetivou-se teve como objetivo
avaliar o potencial de regeneraccedilatildeo in vitro da cultivar Santa
Clara do grupo Santa Cruz a partir de diferentes tipos de
explantes e meios de cultura criando e otimizando
protocolos para sua regeneraccedilatildeo in vitro
MATERIAL E MEacuteTODOS
No Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos Vegetais do
Instituto de Geneacutetica e Bioquiacutemica da Universidade Federal
de Uberlacircndia foi avaliada a capacidade de regeneraccedilatildeo
in vitro do tomateiro cultivar Santa Clara usando trecircs
tipos de explantes e trecircs meios de cultura seguido de trecircs
repicagens O experimento foi realizado em delineamento
em blocos casualizados em esquema fatorial (3x3) com trecircs
repeticcedilotildees As plantas regeneradas foram enraizadas e
aclimatadas em laboratoacuterio
Sementes comerciais da cultivar Santa Clara apoacutes
serem desinfestadas por um minuto em aacutelcool etiacutelico a 96
e em hipoclorito de soacutedio comercial a 20 (vv) com duas
gotas de detergente comercial durante 25 minutos foram
enxaguumladas 5 vezes em aacutegua bidestilada esterilizada e
inoculadas em meio MS 100 (MURASHIGE amp SKOOG
1962) solidificado com 7 g L-1 de aacutegarndashaacutegar por sem
reguladores de crescimento O meio foi distribuiacutedo em
frascos de vidro esteacutereis utilizados para cultura de tecidos
com 30 mL de meio MS As culturas foram mantidas em
sala de crescimento com temperatura de 25+2 ordmC
fotoperiacuteodo de 16 horas e luminosidade de 50 mmol m-2s-
1 As placircntulas obtidas aos 14 15 e 20 dias apoacutes a semeadura
foram usadas como fonte de explantes para os blocos 1 2
e 3 respectivamente Os explantes foram inoculados de
acordo com os meacutetodos descritos a seguir em placas de
Petri devidamente esterilizadas e autoclavadas contendo
30 mL de meio de cultura com 16 unidades por tipo de
explante por meio de cultura utilizado Cada 16 explantes
constituiu uma parcela do experimento sendo composta
por duas placas de Petri cada uma com 8 explantes
Os tipos de explantes foram os seguintes
A - que consistiu na decapitaccedilatildeo de placircntulas onde
essa decapitaccedilatildeo ocorreu diretamente abaixo do noacute do
cotileacutedone ficando o hipocoacutetilo com as radiacuteculas
SOUZA G de F M V e et al90
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
B - meacutetodo de cotileacutedones fendidos os cotileacutedones
foram fendidos ao longo da nervura central da extremidade
ateacute sua metade de acordo com o protocolo de Faacuteri et al
(2000)
C - cotileacutedones foram aparados e seguiu-se o
protocolo descrito por Redenbaugh et al (1992) Os
cotileacutedones aparados nas extremidades distal e proximal
(aacutepice e peciacuteolo) foram inoculados com a face abaxial em
contato com o meio
Foram realizadas trecircs repicagens para alongar os
brotos Cerca de 30 dias apoacutes a inoculaccedilatildeo dos explantes
foi realizada a primeira repicagem Os intervalos entre as
repicagens foram em torno de 5 semanas
Os tratamentos consistiram na inoculaccedilatildeo dos trecircs
tipos de explantes descritos nos trecircs meios de cultura
abaixo com trecircs repeticcedilotildees por tratamento
Meio MI macro e micronutrientes de Murashige amp
Skoog (1962) e vitaminas B5 de Gamborg et al (1968)
suplementado com 30 gL de sacarose e de 8 gL de aacutegar-
aacutegar pH 58 meio MII meio de cultura MI suplementado
com 1 mgL de zeatina e 30 gL de glicose conforme
McCormick (1991) meio MIII meio de cultura MI
suplementado com 25 mgL de BAP e 02 mgL de AIA
segundo Rhim et al (1995)
Para as repicagens foi utilizado o meio MI
suplementado com 05 mgL 08 mgL e 10 mgL de BAP
para a primeira segunda e terceira repicagens
respectivamente
Para enraizamento foi usado o meio MI
suplementado com 05 mgL de AIA As placircntulas
enraizadas foram transferidas para substrato comercial
Plantimax esterilizado e aclimatadas em laboratoacuterio
Os brotos com 2 cm de comprimento foram
transferidos para o meio de enraizamento citado e
permaneciam nesse meio durante 15 dias Apoacutes esse periacuteodo
os brotos eram transplantados para substrato comercial
Plantimax autoclavado irrigados com aacutegua uma a duas
vezes por dia ateacute a aclimataccedilatildeo A aclimataccedilatildeo ocorreu em
torno de 20 dias em condiccedilotildees de laboratoacuterio
Avaliou-se a induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo o
alongamento de brotos e o enraizamento e aclimataccedilatildeo
das plantas regeneradas
Os dados de contagem foram transformados para
50x As anaacutelises de normalidade e homogeneidade
foram realizadas pelo software Prophet Os dados obtidos
foram submetidos agrave anaacutelise de variacircncia e as meacutedias
comparadas pelo teste de Tukey ao niacutevel de 5 de
probabilidade pelo software SANEST (ZONTA amp
MACHADO 1989)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Para cotileacutedone decapitado ocorreu um iniacutecio de
formaccedilatildeo de calosidade por volta de 10 dias apoacutes inoculaccedilatildeo
e o surgimento de brotos ocorreu cerca de 12 dias depois da
inoculaccedilatildeo sem a formaccedilatildeo de calos propriamente ditos A
induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo foi mais raacutepida quando usado esse
tipo de explante indicando um alto potencial de
organogecircnese espontacircnea sendo que o meio MI foi o melhor
para a induccedilatildeo e nuacutemero total de brotos (Tabela 1)
No cotileacutedone fendido o iniacutecio de formaccedilatildeo de
calosidade aconteceu com aproximadamente 10 dias apoacutes
inoculaccedilatildeo Por volta de 18 dias depois da inoculaccedilatildeo
iniciou-se o surgimento de brotos e jaacute existiam calos
formados Para esse tipo de explante nos meios MI e MII
ocorreu apenas a formaccedilatildeo de calos enquanto no meio
MIII ocorreu a formaccedilatildeo de calos e calos com brotos sendo
alto o nuacutemero total de brotos (Tabela 1) Supotildee-se que a
maior superfiacutecie de corte tenha influecircncia significativa
sobre esse fenocircmeno onde a maior superfiacutecie de corte do
cotileacutedone resulta em maior capacidade de regeneraccedilatildeo
(FAacuteRI et al 1995b)
No cotileacutedone aparado com cerca de 10 dias apoacutes
inoculaccedilatildeo ocorreu o iniacutecio de formaccedilatildeo de calos e 20 dias
depois da inoculaccedilatildeo ocorreu o surgimento de brotos e jaacute
existiam calos formados Para esse tipo de explante nos
meios MI MII e MIII ocorreu a formaccedilatildeo de calos no
entanto apenas no meio MIII ocorreu a formaccedilatildeo de calos
com brotos (Tabela 1)
Capacidade de regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro 91
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
TABELA 1 ndash Frequumlecircncia de induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo in vitro da cultivar Santa Clara do grupo Santa Cruz UberlacircndiaUFU 2001
Dados seguidos de mesma letra nas colunas (abc) e nas linhas (AB) natildeo diferem entre si a 5 de probabilidade peloteste de TukeyA diferenccedila entre o nordm de explantes de um meacutetodo para outro eacute devida a parcelas (ou parte delas) perdidas
Nos trecircs ciclos de repicagens a capacidade de
alongamento dos brotos foi igual indicando que as
concentraccedilotildees de BAP natildeo diferiram estatisticamente entre
si dentro de cada tipo de explante Em relaccedilatildeo ao nuacutemero
de brotos alongados na primeira e terceira repicagens o
cotileacutedone decapitado apresentou maior nuacutemero jaacute na
segunda repicagem natildeo houve diferenccedila entre os tipos de
explantes (Tabela 2)
As plantas apoacutes serem enraizadas foram
transferidas para aclimataccedilatildeo obtendo-se 82 de plantas
aclimatadas Cerca de 20 dias apoacutes transplantio para o
substrato as plantas jaacute estavam aclimatadas
Apoacutes a terceira repicagem ainda existiam cerca de
334 brotos para serem novamente repicados e 51 brotos
prontos para serem enraizados perfazendo um total geral
de 549 brotos obtidos ateacute a fase estudada
Para o tipo de explante cotileacutedone decapitado foram
obtidos 181 brotos equivalentes a 174 brotos por explante
Para o explante cotileacutedone fendido o nuacutemero de brotos por
Tipos de Explantes Variaacuteveis Meios Cotileacutedone decapitado Cotileacutedone fendido Cotileacutedone aparado
I 396 aA 050 cB 142 bB II 000 bB 632 bA 672 aA Nordm de explantes
com calos III 000 bB 1599 aA 597 bB I 1095 aA 000 bB 000bB II 050 bA 000 bA 000 bA Nordm de explantes
com brotos III 130 bB 1217 aA 850 aA I 396 aA 050 cB 169 cB II 000 bB 632 bA 645 bA Nordm total de
calos III 000 bB 3630 aA 2655 aA I 1850 aA 000 bB 000 bB II 050 bA 000 bA 000 bA Nordm total de
brotos III 130 bB 2760 aA 2934 aA I 48 32 40 II 32 40 32 Nordm de
explantes III 24 40 48 Total de explantes 104 112 120
explante foi igual a 145 e para o cotileacutedone aparado foram
obtidos 170 brotos por explante Esses resultados foram
semelhantes aos obtidos por Faacuteri et al (2000) para as
cultivares IPA-5 e IPA-6 os quais concluiacuteram que a
utilizaccedilatildeo de cotileacutedones fendidos e cotileacutedones aparados
produziram uma regeneraccedilatildeo alta e onde a maior induccedilatildeo
foi conseguida utilizando-se um meio igual ao MIII utilizado
nesse experimento A induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo tambeacutem foi
mais raacutepida quando usado cotileacutedone decapitado indicando
um alto potencial de organogecircnese espontacircnea A cultivar
Santa Clara mostrou-se mais eficiente na formaccedilatildeo de
brotos alongados observados na primeira repicagem
enquanto as cultivares utilizadas por Faacuteri et al (2000) IPA-
5 e IPA-6 necessitaram de duas repicagens para o
alongamento dos brotos no entanto a cultivar IPA-5
mostrou-se mais eficiente na produccedilatildeo de brotos por
explante Faacuteri et al (2000) utilizaram zeatina durante os trecircs
ciclos de repicagem enquanto nesse experimento foi
utilizado BAP
SOUZA G de F M V e et al92
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
TABELA 2 ndash Capacidade de alongamento e enraizamento de brotos da cultivar Santa Clara durante os trecircs ciclos derepicagem Uberlacircndia UFU 2001
Dados seguidos de mesma letra nas colunas (ab) e nas linhas (AB) natildeo diferem entre si a 5 de probabilidade peloteste de TukeyTipos de explantes A - cotileacutedone decapitado B - cotileacutedone fendido C - cotileacutedone aparado
Os resultados aqui obtidos tambeacutem foram
semelhantes aos de Faacuteri et al (1995b) que trabalhando
com transformaccedilatildeo geneacutetica da berinjela (Solanum
melongena L) observaram que a maior superfiacutecie de corte
do cotileacutedone resultou em maior capacidade de
regeneraccedilatildeo Tambeacutem foram obtidos resultados
semelhantes aos de Nogueira et al (2001) que estudando
a regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro Santa Clara utilizando
como explantes cotileacutedones concluiacuteram que o meio com
uma combinaccedilatildeo adequada de auxina e citocinina (10 mg L-
1 de zeatina e 01 mg L-1 de AIA) promoveu uma maior
meacutedia de regeneraccedilatildeo e um maior nuacutemero meacutedio de brotaccedilotildees
por explante Costa et al (2000) trabalhando com as
cultivares IPA-5 e IPA-6 chegaram a uma conclusatildeo
semelhante onde meio suplementado com 10 mg L-1 de
zeatina + 01 mg L-1 de AIA e meio suplementado com 25
mg L-1 de BAP + 02 mg L-1 de AIA determinaram a maior
frequumlecircncia de regeneraccedilatildeo de explantes cotiledonares e
tambeacutem um maior nuacutemero de brotos alongados por explante
McCormick et al (1986) pesquisando a morfogecircnese
in vitro de L esculentum observaram que a presenccedila de 25
mg L-1 de BAP e 10 mg L-1 de AIA ou 10 mg L-1 de BAP e
02 mg L-1 de AIA produziu um maior nuacutemero de ramos por
explante a partir de explantes de cotileacutedones e hipocoacutetilos
Ohki et al (1978) utilizando segmentos de hipocoacutetilos de L
esculentum sugeriram que o efeito positivo da combinaccedilatildeo
de auxinas e citocininas na regeneraccedilatildeo in vitro pode ser
causado por uma maior capacidade das ceacutelulas dessa espeacutecie
em utilizar e adaptar-se agrave combinaccedilatildeo de auxinas e citocininas
de que somente citocininas Para os mesmos autores a
variabilidade observada nas respostas morfogecircnicas in vitro
para diferentes citocininas pode ser causada pela variaccedilatildeo
na razatildeo de degradaccedilatildeo dessas substacircncias nos tecidos
vegetais ou no meio de cultivo Segundo Caldas et al (1999)
uma alta relaccedilatildeo citocininaauxina normalmente leva a maior
induccedilatildeo de parte aeacuterea (brotos) em explantes in vitro
principalmente quando a citocinina usada eacute o BAP que induz
a formaccedilatildeo de grande nuacutemero de brotos e alta taxa de
multiplicaccedilatildeo em muitos sistemas de micropropagaccedilatildeo
Tanto no presente trabalho quanto nos trabalhos acima
citados foram utilizados meios com pelo menos uma
combinaccedilatildeo com alta relaccedilatildeo citocininaauxina e meios
contendo apenas citocinina
CONCLUSOtildeES
A maior induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo tanto de calos
quanto de brotos foi observada nos meacutetodos cotileacutedone
fendido e cotileacutedone aparado quando colocados no meio
com BAP (25 mgL) e AIA (02 mgL) (MIII) Um ciclo de
repicagem foi suficiente para obtenccedilatildeo de brotos
alongados A maior regeneraccedilatildeo de brotos alongados
ocorreu com o meacutetodo cotileacutedone decapitado
Meios M1 + 05 mgL BAP M1 + 08 mgL BAP M1 + 10 mgL BAP
Repicagem 1 Repicagem 2 Repicagem 3
M1+ 05 mgl AIA
Tipos de Explante
s
Nordm total de brotos
Nordm de brotos
alongados
Nordm total de brotos
Nordm de brotos
alongados
Nordm total de brotos
Nordm de brotos
alongados
Nordm total de placircntulas
enraizadas
Nordm total de
plantas aclimatadas
Nordm total geral de brotos
A 3117 bA 899 aA 3684 bA
866 aA 3174 bA
81 aA 80 67 181 B 536 aA 466 bA 6244 aA 633 aA 5158 aA 450 bA 41 33 163 C 3527 bA 400 bA 4368 bA
566 aA 3928 bA
312 bA 43 35 205
Total 164 135 549
Capacidade de regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro 93
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
AGRADECIMENTOS
Ao Instituto de Geneacutetica e Bioquiacutemica e ao Instituto
de Ciecircncias Agraacuterias da Universidade Federal de
Uberlacircndia pelo financiamento deste projeto e a todos
que auxiliaram direta eou indiretamente
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1Mestranda do Curso de Agronomia ndash Universidade Federal de UberlacircndiaUFU ndash Av Engenheiro Diniz 1178 ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash adelaidebioyahoocombr2Professor Dr ndash Universidade Federal de UberlacircndiaUFU ndash Instituto de Ciecircncias Agraacuterias ndash Curso de Agronomia ndash AV Paraacute Bloco 2E SALA 14campus Umuarana ndash Caixa-Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG3Bioacuteloga Universidade Federal de UberlacircndiaUFU ndash Centro de Ciecircncias Biomeacutedicas ndash Departamento de Agronomia ndash Rua Amazonas snordm - Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos sala 2E-14 ndash Umuarama ndash 38400920 ndash Uberlandia MG ndash patriciacrystiezipmailcombr
4Doutor Departamento de Adgricultura DAG ndash Universidade Federal de Lavras UFLA ndash Campus universitaacuterio ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash mpasqualuflabr
RESUMONo Brasil o cafeacute ainda apresenta poucos progressos com
relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo da cultura de tecidos vegetais tornando-se degrande importacircncia o conhecimento sobre a atuaccedilatildeo dosreguladores de crescimento Com este trabalho avaliou-se ocomportamento de duas cultivares de Coffea arabica L CatuaiacuteVermelho LCH-2077-2-5-99 e LCH-2077-2-5-44 denominadasrespectivamente de Catuaiacute Vermelho 99 e Catuaiacute Vermelho 44quanto agrave ausecircncia e presenccedila de luz e quantificou-se a interaccedilatildeoentre os reguladores de crescimento 24-D e BAP O experimentofoi realizado no Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos Vegetais daUniversidade Federal de Uberlacircndia As anteras das cultivaresCatuaiacute Vermelho 99 e 44 foram inoculadas em meio basal MSsuplementado com quatro concentraccedilotildees de 24-D (905 181271 e 362 mM) e duas concentraccedilotildees de BAP (0 e 89 mM) napresenccedila de luz e ausecircncia de luz As avaliaccedilotildees para a oxidaccedilatildeointumescimento e calosidade foram realizadas aos 30 dias apoacutes ainoculaccedilatildeo no meio de cultura e o diacircmetro dos calos aos 45 diasApoacutes 30 dias de cultivo os calos obtidos foram classificados emfriaacuteveis esverdeados esbranquiccedilados e cinza Os resultadosmostraram que para ocorrer intumescimento das anterasformaccedilatildeo e aumento do tamanho dos calos de ambas cultivares eacutenecessaacuterio que haja interaccedilatildeo entre a auxina (24-D) e a citocinina(BAP) Dentre os tipos de calos os de coloraccedilatildeo cinza foram osque apresentaram maior frequumlecircncia para as duas cultivares
Termos para indexaccedilatildeo Melhoramento calos reguladores decrescimento cafeeiro
ABSTRACTIn Brazil coffee still presents little progress regarding
the application of plant tissue culture which turns important theunderstanding of the action of growth regulators This workevaluated the in vitro performance of two Coffea arabica Lcultivars Catuaiacute Vermelho LCH-2077-2-5-99 and LCH-2077-2-5-44 known as Catuaiacute Vermelho 99 and Catuaiacute Vermelho 44respectively in the presence and absence of light and theinteraction of 24-D and BAP The experiment was carried out at
the Plant Tissue Culture Laboratory of the Universidade Federalde Uberlacircndia Anthers from both cultivars were inoculated inMS basal medium supplemented with four concentrations of24-D (905 181 271 and 362 mM) and two concentrations ofBAP (0 or 89 mM) in the presence and absence of lightOxidation intumescences and callus formation evaluations wereobtained 30 days after inoculation and callus diameter measuredat 45 days of inoculation The observed callus was classified asfriable greenish whitish or gray The results showed that antherintumescences callus formation and growth of both cultivarsdemand the interaction between the auxin (24-D) and thecytokinin (BAP) Callus presenting gray color were the mostfrequent for both cultivars
Index terms Plant breeding callus growth regulators coffee plant
INTRODUCcedilAtildeO
O cafeeiro pertence agrave famiacutelia Rubiaceae na qual o
gecircnero Coffea abrange cerca de 60 espeacutecies sendo as mais
comuns no mercado Coffea araacutebica L e Coffea canephora
Pierre ex Froehn Os programas de melhoramento do cafeacute
demandam aproximadamente 25 anos desde a hibridaccedilatildeo
ateacute a obtenccedilatildeo de uma nova cultivar (PASQUAL et al
2002) A cultura de anteras eacute considerada uma ferramenta
importante pois possibilita a obtenccedilatildeo de linhas
homozigoacuteticas em uma uacutenica etapa (ANDRADE 1998)
acelerando drasticamente o processo de obtenccedilatildeo de novas
cultivares Sendo assim a teacutecnica de cultura de anteras
vem auxiliar no melhoramento da cultura pois permite a
obtenccedilatildeo de haploacuteides em geraccedilotildees segregantes o que
leva agrave raacutepida produccedilatildeo de plantas homozigotas por meio
(Recebido em 14 de outubro de 2003 e aprovado em 29 de outubro de 2006)
Induccedilatildeo de calos a partir de cultura 95
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
da duplicaccedilatildeo do nuacutemero de cromossomos numa uacutenica
etapa substituindo as geraccedilotildees de auto fecundaccedilatildeo
Acrescenta-se a isso o fato de os haploacuteides serem livres
dos problemas de dominacircncia e recessividade por possuir
apenas um alelo em cada loco gecircnico
No Brasil Coffea arabica ainda apresenta poucos
progressos com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo da cultura de anteras
Daiacute a importacircncia de se produzir mais conhecimentos sobre
a atuaccedilatildeo dos reguladores de crescimento na expressatildeo
androgeneacutetica de Coffea arabica identificaccedilatildeo de
genoacutetipos androgecircnicos bem como a determinaccedilatildeo de
condiccedilotildees fiacutesicas mais adequadas agrave incubaccedilatildeo de anteras
nessa espeacutecie
Nos programas de melhoramento as teacutecnicas
convencionais tecircm apresentado resultados promissores
na cultura do cafeacute no que se refere ao aumento de
produtividade e obtenccedilatildeo de novas cultivares Um fator
importante para o sucesso da cultura de anteras eacute conhecer
o estaacutedio ideal de desenvolvimento dos microacutesporos com
o intuito de se obter uma melhor resposta androgeneacutetica
utilizando microacutesporos receacutem-liberados da teacutetrade meioacutetica
ateacute no maacuteximo o estaacutedio binucleado A fase uninucleada
responde positivamente ao processo embriogecircnico porque
nesta fase os microacutesporos apresentam uma parede celular
delgada o que a torna mais receptiva aos fatores externos
Em estaacutedios mais avanccedilados da microsporogecircnese ocorre
um engrossamento da parede celular sendo esta uma
caracteriacutestica do gratildeo de poacutelen maduro do cafeacute
prejudicando o processo de regeneraccedilatildeo (ASCANIO amp
ARCIA 1994) Os autores Grando amp Moraes Fernandes
(1993) sugerem que o potencial embriogecircnico do gratildeo de
poacutelen pode ser determinado tanto no periacuteodo da meiose
quanto no periacuteodo da preacute-mitose do microacutesporo pois
nestes dois momentos o microacutesporo ainda teria
metabolicamente caracteriacutesticas esporofiacuteticas o que
permite a diferenciaccedilatildeo do gratildeo de poacutelen em embriatildeo e
posterior formaccedilatildeo de uma planta
Segundo Mantell et al (1994) satildeo possiacuteveis vaacuterios
tipos de desenvolvimento do microacutesporo in vitro sendo
que tanto o nuacutecleo generativo quanto o vegetativo pode
se dividir continuamente originando um embrioacuteide
haploacuteide ou ainda a primeira mitose produziria dois nuacutecleos
semelhantes e estes se dividiriam repetidamente resultando
na formaccedilatildeo de embrioacuteides haploacuteides
A composiccedilatildeo do meio de cultura tambeacutem eacute de
grande importacircncia para o sucesso da cultura de anteras
natildeo existindo contudo uma recomendaccedilatildeo generalizada
Na maioria das espeacutecies a androgecircnese se verifica em meios
que conteacutem sais minerais sacarose vitaminas reguladores
de crescimento e aacutegar (MORAES FERNANDES 1990) A
consistecircncia do meio normalmente eacute semi-soacutelida mas os
meios liacutequidos estatildeo sendo cada vez mais usados pois
tecircm vantagens no aumento do rendimento pela maior
obtenccedilatildeo de embriotildees e calos (PIERIK 1987) O
presente trabalho teve como objetivo aplicar a teacutecnica da
cultura de anteras em diferentes cultivares de Coffea
arabica verificando os vaacuterios fatores que influenciam a
induccedilatildeo de calos
MATERIAL E MEacuteTODOS
Experimentos de Induccedilatildeo e Regeneraccedilatildeo de Calos
Esta etapa constituiu-se de dois experimentos cada
um com uma cultivar tendo sido conduzidos no laboratoacuterio
de Cultura de Tecidos Vegetais da Universidade Federal
de Uberlacircndia em Uberlacircndia - Minas Gerais no periacuteodo
de setembro de 2002 a janeiro de 2003
Foram utilizados bototildees florais de duas cultivares
de Coffea araacutebica Catuaiacute Vermelho LCH-2077-2-5-99 e
LCH-2077-2-5-44 denominadas respectivamente de Catuaiacute
Vermelho 99 e Catuaiacute Vermelho 44 plantadas na aacuterea
experimental do Campus Umuarama dessa Universidade
Os bototildees florais foram coletados no periacuteodo de 8 agraves 9
horas da manhatilde e armazenados em placas de Petri contendo
papel de filtro umedecido em aacutegua destilada e colocados
dentro de uma caixa de isopor para evitar a desidrataccedilatildeo
ateacute serem conduzidos ao laboratoacuterio
No laboratoacuterio o comprimento dos bototildees foi
medido com o auxiacutelio de um paquiacutemetro e utilizaram-se
SILVA A S et al96
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
bototildees florais entre 45 a 60 mm de comprimento em todos
os experimentos Os bototildees foram envoltos em gaze
previamente autoclavada e desinfestados em uma soluccedilatildeo
de aacutelcool 70 por alguns segundos e por 10 minutos em
soluccedilatildeo de hipoclorito de soacutedio a 02 sob agitaccedilatildeo Em
seguida na cacircmara de fluxo laminar foram lavados 3 vezes
em aacutegua destilada e autoclavada Apoacutes este processo as
anteras foram retiradas dos bototildees com o auxiacutelio de uma
lupa uma pinccedila fina e bisturi nordm 10 sendo os uacuteltimos
flambados para cada botatildeo tomando-se o cuidado para
natildeo ferir as anteras Logo apoacutes as anteras foram imersas
por 1 segundo em soluccedilatildeo de aacutecido ascoacuterbico na
concentraccedilatildeo de 600 mgL-1 hipoclorito de soacutedio 02 e
aacutegua destilada e autoclavada respectivamente
Apoacutes este processo as anteras foram inoculadas
em tubo de ensaio contendo 20 mL do meio MS
(MURASHIGE amp SKOOG 1962) suplementado com aacutecido
24-diclorofenoxiaceacutetico (24-D) e 6- benzilaminopurina
(BAP) em diferentes concentraccedilotildees com pH ajustado para
58 Este meio foi esterilizado em autoclave vertical agrave
temperatura de 121deg C sob pressatildeo de 1 atm por 20 minutos
O delineamento experimental utilizado foi o de
blocos casualizados com 10 repeticcedilotildees em esquema fatorial
4 x 2 x 2 sendo que os fatores foram compostos de quatro
concentraccedilotildees de 24-D (905 181 271 362 mM) duas
concentraccedilotildees de BAP (0 e 89 mM) perfazendo oito
tratamentos incubados na ausecircncia ou presenccedila de luz
em sala de crescimento com temperatura de 25 plusmn 2degC e 16
horas de fotoperiacuteodo Nos dois experimentos cada
tratamento teve 10 repeticcedilotildees sendo um tubo com 10
anteras considerado uma repeticcedilatildeo
Aos 30 dias apoacutes a inoculaccedilatildeo das anteras foram
avaliadas as porcentagens de oxidaccedilatildeo de intumescimento
e de formaccedilatildeo de calos (calosidade) e aos 45 dias foi medido
o diacircmetro dos calos
Os calos obtidos das duas cultivares apoacutes 45 dias
de inoculaccedilatildeo das anteras foram transferidos para o meio
MS suplementado com 30 gL-1 de sacarose 6gL-1 de agar e
de 24-DBAP nas seguintes concentraccedilotildees de 1810 181
2 2710 e 3620 mM com pH ajustado para 58 associando
a ausecircncia e presenccedila de luz
Apoacutes a permanecircncia destes calos no meio de cultura
por 30 dias aqueles provenientes da cultivar Catuaiacute
Vermelho 99 incubados na presenccedila de luz foram
transferidos para o meio de cultura contendo 271 mM de
24-D enquanto que aqueles incubados na ausecircncia de
luz foram transferidos para meio contendo 362 mM de 24-
D Jaacute os calos da cultivar Catuaiacute Vermelho 44 incubados
na presenccedila de luz foram transferidos para meio contendo
181 mM de 24-D e 89 mM de BAP e os incubados na
ausecircncia de luz transferidos para o meio contendo 181
mM de 24-D
Apoacutes 30 dias neste tratamento foram avaliadas as
caracteriacutesticas referentes ao tipo de calo (friaacuteveis
esverdeados esbranquiccedilados e cinza)
Os dados obtidos foram testados quanto agrave
normalidade e agrave homogeneidade necessitando de
transformaccedilatildeo em arco seno para os dados em
porcentagem e raiz quadrada de (x + 05) para os dados
referentes ao diacircmetro dos calos
RESULTADOS
Interaccedilatildeo entre os Reguladores de Crescimento e oFotoperiacuteodo
Para a cultivar Catuaiacute 99 em todas as concentraccedilotildees
de 24-D e independentemente da concentraccedilatildeo de BAP a
oxidaccedilatildeo foi menor na ausecircncia de luz diferindo
estatisticamente da fase em que se tinha presenccedila de luz
No entanto nos calos cultivados nas concentraccedilotildees de
905 e 271 mM de 24-D e 89 mM de BAP na ausecircncia de
luz foi observado um aumento significativo na oxidaccedilatildeo
das anteras o mesmo acontecendo na concentraccedilatildeo de
271 mM de 24-D na presenccedila de luz No entanto resultado
inverso foi observado para a concentraccedilatildeo de 362 mM de
24-D (Tabela 1)
Os resultados do percentual de intumescimento
variaram bastante em funccedilatildeo da luminosidade e
reguladores de crescimento (Tabela 1) Na presenccedila do
Induccedilatildeo de calos a partir de cultura 97
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
BAP e concentraccedilatildeo 89 mM de 24-D tanto na presenccedila
ou ausecircncia de luz o intumescimento dos calos natildeo diferiu
significativamente Jaacute na concentraccedilatildeo de 181 mM de 24-
D na presenccedila de luz se mostrou melhor promovendo um
aumento significativo do intumescimento das anteras
Quanto agraves concentraccedilotildees de 271 e 362 mM de 24-D
cultivados na presenccedila de luz se mostrou melhor ao
intumescimento quando comparado agravequeles cultivados na
ausecircncia de luz (Figura 1)
A presenccedila de calos aumentou significativamente
com a incubaccedilatildeo das anteras na ausecircncia de luz e na
TABELA 1 ndash Meacutedias do nuacutemero de anteras oxidadas intumescidas e com calos e diacircmetro dos calos (mm) em funccedilatildeode diferentes concentraccedilotildees de 24-D e ausecircncia ou presenccedila de BAP em duas condiccedilotildees de luminosidade (presenccedilaou ausecircncia de luz) para anteras do genoacutetipo cv 99
Luminosidade1
Oxidaccedilatildeo () Intumescimento ()
Calosidade () Diacircmetro (mm) 24-D M
BAP M luz Escuro Luz Escuro luz Escuro luz Escuro 0 980 b A 395 a A 000b B 434 a A 000 b A 740 a A 000 b A 309 a A 905
89 999 b A 823 a B 398 a A 327 a B 007 b A 615 a A 000 b A 300 a A 0 999 b A 524 a A 000 b B 447 a A 007 b A 750 a A 000 b B 368 a A
181 89 935 b A 511 a A 614 a A 407 b A 030 b A 720 a A 300 b A 387 a A
0 745 b A 000 a A 534 a A 000 b B 530 a A 000 b B 318 a B 000 b B 271
89 914 b B 590 a B 625 a A 634 a A 708 a A 809 a A 377 a A 298 b A 0 999 b B 440 a A 607 a A 492 b A 097 b B 815 a A 300 a B 277 a A
362 89 813 b A 426 a A 493 a B 527 a A 378 b A 758 a A 398 a A 298 b A
1Meacutedias seguidas por letras diferentes minuacutesculas na linha e maiuacutesculas na coluna dentro de cada concentraccedilatildeo de 2-4-D diferem entre si pelo teste de Tuckey a significacircncia de 5
concentraccedilatildeo de 271 mM de 24-D nas demais
concentraccedilotildees de 24-D independente da concentraccedilatildeo
do BAP a incubaccedilatildeo na ausecircncia de luz apresentou
meacutedias de calosidade significativamente maiores (Figura
2) A presenccedila do BAP promoveu aumento significativo
na calosidade das anteras na concentraccedilatildeo 271 mM de
24-D na ausecircncia de luz e na concentraccedilatildeo de 362 mM
de 24-D na presenccedila de luz Nas demais concentraccedilotildees
natildeo houve diferenccedila significativa entre presenccedila ou
ausecircncia de BAP tanto na ausecircncia ou presenccedila de luz
(Tabela 1)
FIGURA 1 ndash Anteras da cv Catuaiacute Vermelho 99 naconcentraccedilatildeo de 181 M de 24-D na presenccedila de luz
FIGURA 2 ndash Calos de anteras incubadas na ausecircncia deluz e na concentraccedilatildeo de 271 M de 24-D
SILVA A S et al98
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Quanto ao diacircmetro nas concentraccedilotildees 905 e 181 M
de 24-D a ausecircncia de luz promoveu aumento significativo
no diacircmetro dos calos diferindo-se estatisticamente do
tratamento na presenccedila de luz Somente para a concentraccedilatildeo
de 271 mM de 24-D na ausecircncia do BAP natildeo houve diferenccedila
significativa para a caracteriacutestica independentemente do
fotoperiacuteodo Nas demais concentraccedilotildees de 24-D o tratamento
na presenccedila de luz promoveu um aumento significativo no
diacircmetro dos calos No tratamento em que houve a associaccedilatildeo
da presenccedila de luz e de BAP natildeo diferiu estatisticamente do
tratamento em que houve a ausecircncia de BAP quando a
concentraccedilatildeo de 24-D foi de 905 mM nos demais
proporcionou aumento significativo no diacircmetro dos calos
Para o tratamento na ausecircncia de luz apenas na concentraccedilatildeo
de 271 mM de 24-D a ausecircncia de BAP promoveu diminuiccedilatildeo
significativa no diacircmetro de calos Nas demais concentraccedilotildees
natildeo houve diferenccedila significativa entre presenccedila ou ausecircncia
de BAP (Tabela 1)
Para as variaacuteveis intumescimento e calosidade da
cultivar cv 44 a interaccedilatildeo entre 24-D e BAP natildeo diferiram
estatisticamente quanto presenccedila e ausecircncia de luz nas
concentraccedilotildees 905 e 362 mM de 24-D e que tambeacutem natildeo
difere para o diacircmetro na concentraccedilatildeo de 181 mM de 24-
D Jaacute na concentraccedilatildeo 271 mM de 24-D haacute uma semelhanccedila
quanto ao intumescimento calosidade e diacircmetro que
diferem das demais concentraccedilotildees natildeo apresentando
portanto uma boa interaccedilatildeo
A melhor interaccedilatildeo para intumescimento calosidade
e diacircmetro encontra-se respectivamente na concentraccedilatildeo
905 mM de 24-D na presenccedila de luz na concentraccedilatildeo 181
mM de 24-D na ausecircncia de luz e na concentraccedilatildeo 905
mM de 24-D na ausecircncia de luz Jaacute as piores interaccedilotildees
estatildeo na concentraccedilatildeo 271 mM de 24-D na luz tanto para
o intumescimento quanto para o diacircmetro analisados na
Tabela 2
De acordo com a Tabela 2 observou-se que os
melhores resultados ou seja as interaccedilotildees independem
da presenccedila ou ausecircncia de BAP Na Tabela 3 notou-se
uma maior oxidaccedilatildeo das anteras quando incubadas no claro
estas apresentaram uma maior oxidaccedilatildeo em relaccedilatildeo as que
foram incubadas no escuro tornando-se mais tarde calos
previamente oxidados
TABELA 2 ndash Meacutedias do nuacutemero de anteras intumescidas e com calos diacircmetro dos calos (mm) em funccedilatildeo de diferentesconcentraccedilotildees de 24-D e ausecircncia ou presenccedila de BAP em duas condiccedilotildees de luminosidade (luz e escuro) para anterasdo genoacutetipo cv 44
Luminosidade1
Intumescimento () Calosidade () Diacircmetro (mm) 24-D ( M)
BAP ( M) Luz Escuro Luz Escuro Luz Escuro
0 907 a A 775 a A 779 bA 948 aA 609 bA 800 aA 905 89 843 a A 875 a A 889 aA 946 aA 607 aA 420 bB 0 887 a A 852 a A 939 aA 990 aA 490 aA 466 aA
181 89 906 a A 786 a A 917 aA 959 aA 420 aA 493 aA 0 600 b A 772 a A 694 bA 895 aA 000 bA 373 aA
271 89 022 b B 827 a A 294 bB 837 aA 000 bA 376 aA 0 828 a A 737 a A 928 aA 939 aA 414 bA 595 aA
362 89 866 a A 725 a A 949 aA 866 aA 329 aA 376 aA
1Meacutedias seguidas por letras diferente minuacutesculas na linha e maiuacutesculas na coluna dentro de cada concentraccedilatildeo de 2-4-D diferem entre si pelo teste de Tukey a significacircncia de 5
Induccedilatildeo de calos a partir de cultura 99
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
TABELA 3 ndash Meacutedias de oxidaccedilatildeo das anteras entre asdiferentes concentraccedilotildees de 24-D em duas condiccedilotildeesde luminosidade (luz e escuro) para anteras da cultivarCatuaiacute Vermelho 44
Concentraccedilotildees
24-D ( M ) OXIDACcedilAtildeO ()
Claro Escuro 905 749 a 269 b 181 420 a 270 b 271 999 a 221 b 362 308 a 334 a
1Meacutedias seguidas por letras diferentes minuacutesculas na linhadentro de cada concentraccedilatildeo de 2-4-D diferem entre sipelo teste de Tukey a significacircncia de 5
TABELA 4 ndash Tipos de calos obtidos apoacutes 30 dias em meioMS com 362 M de 24-D na ausecircncia de luz da cultivarCatuaiacute Vermelho 99
Tipos de Calos
Nuacutemero de Calos
Nuacutemero de Calos com diacircmetro acima
de 05 mm Friaacuteveis 03 Esverdeados 13 06 Esbranquiaccedilados
03 Cinza 26
Dados de contagem natildeo transformados O recultivo emmeio MS com 362 M de 24-D na presenccedila de luz teve100 de contaminaccedilatildeo apoacutes sua inoculaccedilatildeo
TABELA 5 ndashTipos de calos obtidos apoacutes 30 dias em meioMS com 181 M de 24D e 89 M de BAP na presenccedilade luz da cultivar Catuaiacute Vermelho 44
TABELA 6 ndash Tipos de calos obtidos apoacutes 30 dias em meioMS com 181 M de 24D na ausecircncia de luz da cultivarCatuaiacute Vermelho 44
Tipos de Calos Nuacutemero de Calos
Nuacutemero de Calos com diacircmetro
acima de 05 mm Friaacuteveis 58 Esverdeados 23 214 Esbranquiaccedilados 94 Cinza 203
Tipos de Calos
Nuacutemero de Calos
Nuacutemero de Calos com diacircmetro
acima de 05 mm Friaacuteveis 25 Esverdeados 11 69 Esbranquiaccedilados 19 Cinza 350
Dados de contagem natildeo transformados Dados de contagem natildeo transformados
Nesta etapa a maioria dos calos encontrados para
as trecircs cultivares apresentaram coloraccedilatildeo cinza (Tabelas 4
5 e 6) A perda gradativa da coloraccedilatildeo natural dos calos
passando de verdes para a cor marrom a diminuiccedilatildeo do
ritmo de crescimento dos mesmos a estagnaccedilatildeo do
processo de formaccedilatildeo de embrioacuteides seguido do
surgimento de aacutereas necrosadas na superfiacutecie satildeo sinais
que caracterizam a senescecircncia da cultura (SILVA 2002)
DISCUSSAtildeO
A resposta das anteras da cultivar Catuaiacute Vermelho 99
com relaccedilatildeo agrave oxidaccedilatildeo indica que a mesma estaacute associada agrave
combinaccedilatildeo entre auxina e citocinina promovendo os menores
iacutendices de oxidaccedilatildeo Agrave medida que se aumentou a
concentraccedilatildeo de 24-D na presenccedila de BAP houve um
aumento gradativo da oxidaccedilatildeo ateacute atingir um ponto maacuteximo
em torno de 80 na dosagem de 271 mM de 24-D Jaacute na
ausecircncia de BAP a oxidaccedilatildeo foi bem maior quando comparada
agrave porcentagem de oxidaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 905 mM de
24-D De acordo com Wang amp Huang (1976) o cultivo in
vitro por um periacuteodo longo induz a formaccedilatildeo de compostos
fenoacutelicos no meio que podem causar necrose e posteriormente
morte dos calos Maciel (2001) e Paluacute (2002) citam que pelos
resultados obtidos para a induccedilatildeo de calogecircnese em anteras
de cafeeiro observa-se que eacute necessaacuteria uma auxina
juntamente com uma citocinina Dentre as auxinas sinteacuteticas
o 24-D eacute sem duacutevida o mais adequado agrave induccedilatildeo e
manutenccedilatildeo do calo (GAMBORG et al 1976)
Para Thomas amp Ravindra (1997) o maior problema
na iniciaccedilatildeo de culturas lenhosas eacute a ocorrecircncia de
compostos fenoacutelicos que estatildeo ligados com processos de
regulaccedilatildeo de crescimento especialmente com as auxinas
que dependendo da sua concentraccedilatildeo endoacutegena no tecido
resulta na induccedilatildeo desses compostos
SILVA A S et al100
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
O fotoperiacuteodo que estas anteras foram submetidas
influenciou tambeacutem na porcentagem de oxidaccedilatildeo sendo
que no escuro e na presenccedila de 24-D (89 mM) a oxidaccedilatildeo
foi miacutenima Agrave medida que foi aumentando a concentraccedilatildeo
da auxina foi aumentando tambeacutem a oxidaccedilatildeo poreacutem este
aumento foi bem menor quando comparado ao cultivo das
anteras na presenccedila de luz
A oxidaccedilatildeo fenoacutelica tem sido controlada em
diferentes espeacutecies lenhosas pela reduccedilatildeo da intensidade
luminosa (MARKS amp SIMPSON 1990) associada com a
substituiccedilatildeo frequumlente do meio de cultura e dessa forma
as chances de se obter sucesso no estabelecimento e
cultivo de explantes de espeacutecies lenhosas satildeo bastante
elevadas (TEIXEIRA 2001)
Em muitas espeacutecies por razotildees natildeo conhecidas a
embriogecircnese direta eacute rara e as plantas tecircm que ser
diferenciadas a partir de calos Para induccedilatildeo destes
geralmente eacute necessaacuteria uma auxina (MAHESHWARI et
al 1982) Segundo Rocha (1998) para a induccedilatildeo e
manutenccedilatildeo do calo a maioria das espeacutecies parece
comportar-se diferentemente natildeo soacute quanto aos
reguladores de crescimento podendo ocorrer
independentemente de auxinas e citocininas dependente
de ambas ou dependente de uma ou de outra mas tambeacutem
quanto agrave presenccedila ou ausecircncia de luminosidade Sharp et
al (1973) obtiveram calos atraveacutes do cultivo de sementes
folhas e anteras de C arabica das cultivares Mundo Novo
e Bourbon Amarelo A induccedilatildeo de calos tambeacutem foi mais
eficiente na ausecircncia de luz Aleacutem disso Ascanio amp Arcia
(1994) citam que para o desenvolvimento do calo as
anteras devem ser mantidas no escuro jaacute para o
desenvolvimento do embriatildeo os calos devem ser mantidos
no claro
Natildeo houve a formaccedilatildeo de embriotildees e isto pode ser
devido agraves doses de reguladores ou mesmo de combinaccedilotildees
que natildeo foram apropriadas para estas cultivares
CONCLUSAtildeO
Os resultados mostraram que para ocorrer
intumescimento das anteras formaccedilatildeo e aumento do
tamanho dos calos de ambas as cultivares eacute necessaacuterio
que haja interaccedilatildeo entre a auxina (24-D) e a citocinina
(BAP) e incubaccedilatildeo no escuro
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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PEREIRA F D et al102
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COMUNICACcedilAtildeO CIENTIacuteFICA
PROLIFERACcedilAtildeO IN VITRO DE BROTOS DE CURAUAacuteUTILIZANDO DIFERENTES VOLUMES DE MEIO DE CULTURA
IN VITRO SHOOT PROLIFERATION OF Ananas erectifolius USING DIFFERENTVOLUMES OF CULTURE MEDIUM
FLAacuteVIA DIONIacuteSIO PEREIRA1 JOSEacute EDUARDO BRASIL PEREIRA PINTO2HELEN CRISTINA DE ARRUDA RODRIGUES3 LUCIANA DOMICIANO SILVA ROSADO3
LUIZ ALBERTO BEIJO4 OSMAR ALVES LAMEIRA5
1Doutoranda em Agronomia ndash Universidade Estadual de Feira de SantanaUEFS ndash Horto Florestal ndash 44055-000 ndash Feira de Santana BA ndash flavia1808hotmailcom
2Doutor em Fisiologia Vegetal ndash Departamento de AgriculturaDAG ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash jeduardouflabr
3Graduanda em Agronomia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG4Doutorado em Agronomia ndash Universidade Federal de AlfenasUNIFAL ndash Departamento de Ciecircncias Exatas ndash Rua Gabriel Monteiro da Silva n deg 714 ndash Centro ndash 37130-000 ndash Alfenas MG ndash luizbeijoyahoocombr5Doutor em Agronomia ndash EMBRAPA ndash Amazocircnia Oriental ndash Trav Dr Eneacuteas Pinheiro sn ndash Bairro Marco ndash 66095-100 ndash Beleacutem PA ndash osmarcpatuembrapabr
RESUMOCurauaacute [Ananas erectifolius LBSm ndash Bromeliaceae] eacute
uma espeacutecie com grande potencial de uso de suas fibras comorevestimento na induacutestria automobiliacutestica Aleacutem disso o poacute dosumo do curauaacute tem sido utilizado no tratamento de cicatrizaccedilatildeode lesotildees cutacircneas Neste trabalho avaliaram-se diferentes volumesde meio MS Os volumes utilizados foram de 10 15 20 25 e 30 mLO delineamento experimental foi inteiramente casualizado (DIC)e cada tratamento continha 19 repeticcedilotildees Aos 30 dias avaliaram-se o nuacutemero e o tamanho de brotaccedilotildees Segundo a anaacutelise devariacircncia houve efeito linear do volume de meio na produccedilatildeo debrotos de curauaacute Agrave medida em que se aumenta o volume domeio aumenta o nuacutemero de brotos Natildeo houve diferenccedilasignificativa nos comprimentos dos brotos
Termos para indexaccedilatildeo Ananas erectifolius fibras vegetaismicropropagaccedilatildeo
ABSTRACTAnanas erectifolius LBSm ndash Bromeliaceae is a species
that presents fibers with great potential to be used as revetmentfor the automobile industry Besides the powder obtained fromits juice has been used in the treatment of skin lesionscicatrisation In this work the effect of different volumes (1015 20 25 and 30 mL) of MS medium during the in vitro cultureof axillary buds was evaluated A completely randomized design(CDR) was used with each treatment containing 19 replicatesAfter 30 days of inoculation shoot number and size wereevaluated The analysis of variance showed a linear effect of theculture medium volume and shoot proliferation Higher shoot
number was observed with the increase of medium volume Nosignificant difference was observed on shoot lenght
Index terms Ananas erectifolius vegetable fibermicropropagation
A produccedilatildeo de fibras vegetais ocupa um papel
relevante na economia agriacutecola mundial mesmo com a
intensa produccedilatildeo de fibras sinteacuteticas Mateacuterias-primas de
origens renovaacuteveis reciclaacuteveis e biodegradaacuteveis satildeo uma
das alternativas para a produccedilatildeo de manufaturados
ecologicamente corretos em consequumlecircncia do acuacutemulo
nos descartes de materiais natildeo biodegradaacuteveis os quais
tendem a aumentar com o crescimento populacional nos
centros urbanos A substituiccedilatildeo de materiais derivados do
petroacuteleo na produccedilatildeo de compostos elastomeacutericos por
mateacuteria-prima renovaacutevel vai ao encontro desses ideais
(ROCHA et al 2003)
As fibras sinteacuteticas destacam-se pela elevada
resistecircncia baixa densidade e elevada produccedilatildeo
Entretanto as fibras animais e vegetais satildeo as de maior
importacircncia principalmente para atender aos apelos
(Recebido em 31 de agosto de 2006 e aprovado em 19 de janeiro de 2007)
Proliferaccedilatildeo in vitro de brotos de curauaacute 103
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 102-106 2006
ecoloacutegicos e pelo nuacutemero de plantas e animais produtores
de fibras (SCHREIBER1998)
As plantas produtoras de fibras utilizaacuteveis foram
quantificadas por vaacuterios autores e em diferentes eacutepocas
tendo sido enumeradas 2000 mil plantas fibrosas e o seu
total estimado em 2300 destacando-se as florestas tropicais
que encerram recursos inesgotaacuteveis em potencial
(MEDINA 1959)
O curauaacute [Ananas erectifolius LBSm ndash
Bromeliaceae] utilizado principalmente na fabricaccedilatildeo de
cordas sacos e utensiacutelios domeacutesticos surge como
sucedacircneo para o aproveitamento de fibras O curauaacute eacute
uma bromeliaacutecea distribuiacuteda nos Estados do Paraacute Acre
Mato grosso Goiaacutes e Amazonas e eacute cultivada
principalmente por pequenos produtores da regiatildeo do
Lago Grande de Curuai no municiacutepio de Santareacutem PA
Estudos recentes tecircm demonstrado o grande potencial do
uso das fibras dessa planta como revestimento na induacutestria
automobiliacutestica devido agrave sua resistecircncia maciez e peso
reduzido O grande problema eacute que natildeo haacute suprimento
suficiente de mateacuteria-prima para atender agrave induacutestria
automobiliacutestica pois o curauaacute eacute fiel agraves suas origens amazocircnicas
e soacute se desenvolve em clima quente e uacutemido criando um
problema para a aquisiccedilatildeo de mudas fora desta regiatildeo que
por tal motivo eacute escassa no mercado (SILVA 2004)
A micropropagaccedilatildeo utilizando teacutecnicas de cultura
de tecido tem sido um valioso instrumento na propagaccedilatildeo
de diversos tipos de plantas Embora este processo envolva
diferentes etapas depois de definido um protocolo de
micropropagaccedilatildeo seja qual for a espeacutecie este pode ser
otimizado no intuito de se obter placircntulas de alta qualidade
e com baixo valor de produccedilatildeo O tipo e tamanho de frasco
e a quantidade de meio satildeo variaacuteveis que tecircm recebido
pouca atenccedilatildeo embora afetem diretamente a aacuterea superficial
da interface meio de cultura-atmosfera o volume de ar sobre
o meio de cultura e a sua profundidade Tais fatores tambeacutem
afetam a composiccedilatildeo da fase gasosa do frasco e
consequumlentemente o crescimento e desenvolvimento das
culturas (GRATTAPAGLIA amp MACHADO 1998)
Rodrigues et al (2005) verificaram maior
proliferaccedilatildeo de brotos de Cattleya persivaliana Hort
em frascos contendo 50 mL de meio quando comparados
com aqueles de 25 75 e 100 mL Nicoloso amp Erig (2002)
trabalhando com Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen
verificaram que 10 mL de meio MS (MURASHIGE amp
SKOOG 1962) proporcionaram o melhor crescimento
das placircntulas em biomassa quando cultivadas em tubos
de 20 cm de altura x 2 cm diacircmetro em comparaccedilatildeo com
os de 25 cm de altura x 2 cm 15 cm de altura x 2 cm
Carvalho et al (1995) estudando a influecircncia de fatores
fiacutesicos no desenvolvimento e crescimento in vitro de
batata-doce (Ipomoea batatas L Poir) verificaram que
10 mL de meio de cultura por frasco com explantes
proporcionaram maior formaccedilatildeo de gemas em relaccedilatildeo
aos volumes de 20 e 30 mL
Sendo assim objetivou-se neste trabalho avaliar
o volume de meio apropriado para a propagaccedilatildeo in vitro
de brotaccedilotildees de curauaacute
As brotaccedilotildees utilizadas como fonte de explante
foram fornecidas pela EMBRAPACPATU situada em
Beleacutem do Paraacute Gemas axilares de curauaacute foram
inoculadas em meio MS completo suplementado com
20 mgL de BAP (6-Benzilaminopurina) Apoacutes 30 dias
estas se desenvolveram e as brotaccedilotildees obtidas foram
transferidas para o meio MS sem regulador de
crescimento por 30 dias
Apoacutes este periacuteodo quatro explantes foram
desfolhados completamente ficando apenas porccedilotildees
basais com aproximadamente 1cm de comprimento que
foram inoculadas em meio de cultura baacutesico MS sem
regulador de crescimento em frasco de 12 cm de altura por
5 cm de diacircmetro (volume interno = 300 mL) com volumes
de 10 15 20 25 30 mL Os explantes foram mantidos em
sala de crescimento a uma temperatura de 26plusmn1degC e
fotoperiacuteodo de 16 horas sob uma Irradiacircncia de foacutetons de
25mmol m-2 s-1
O delineamento experimental foi inteiramente
casualizado (DIC) Cada tratamento continha 19 repeticcedilotildees
PEREIRA F D et al104
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 102-106 2006
(um frasco por repeticcedilatildeo) Aos 30 dias avaliaram-se o
nuacutemero e o comprimento das brotaccedilotildees O programa
utilizado para anaacutelise dos dados foi o software statistica
(SISVAR) tendo sido submetidas agrave anaacutelise de variacircncia
com aplicaccedilatildeo do teste F a 5 de probabilidade
analisando-se as meacutedias por regressatildeo polinomial
O efeito linear foi o mais adequado para explicar
a evoluccedilatildeo da taxa meacutedia de regeneraccedilatildeo do curauaacute Agrave
medida que o volume do meio de cultura aumenta existe
tendecircncia de aumento do nuacutemero de brotos Com 25
mL de meio produziu-se maior nuacutemero de brotos por
frasco (2557) e com 10 mL de meio produziu-se menor
nuacutemero de brotos (1226) O tratamento com 15 mL de
meio produziu 1765 brotos o com 20 mL 1750 e o com
30 mL 2242 (Figura 1) O volume maior de meio
disponibiliza mais nutrientes e diminui tambeacutem a
competiccedilatildeo entre as placircntulas o que explica a tendecircncia
em se obter um maior nuacutemero de brotos agrave medida que
se aumenta a quantidade do meio de cultura Em todos
os tratamentos as brotaccedilotildees obtidas foram vigorosas
com a coloraccedilatildeo verde-escura caracteriacutestica das
plantas matrizes As brotaccedilotildees tinham tambeacutem rigidez
outra caracteriacutestica da espeacutecie o que eacute devido agrave
presenccedila das fibras nas folhas Observou-se maior
concentraccedilatildeo de raiacutezes nas brotaccedilotildees maiores e natildeo
FIGURA 1 ndash Nuacutemero meacutedio de brotos por frasco de curauaacute(Ananas erectifolius) cultivados em diferentes volumesde meio MS completo 10 15 20 25 e 30
foi observada a presenccedila de calos em nenhum dos
tratamentos (Figura 2)
Resultados semelhantes foram obtidos por Reis
Lameira Reis (2004) trabalhando com curauaacute utilizando
volumes de 5 75 10 e 15 mL do meio liacutequido MS suplementados
com 25 mgL-1 de BAP (6-benzilaminopurina) os melhores
resultados sendo com os tratamentos que continham 10 e
15ml produzindo em meacutedia 121 e 154 brotosexplante
respectivamente
Da mesma forma Reis et al(2003) trabalhando com
ipeca (Psychotria ipecacuanha Stokes) em meio MS
acrescido de 15 mg L-1de BAP nos volumes de 10 20 30
e 40 mL obtiveram melhor resultado com os volumes de 30
e 40 mL (7 e 8 brotosfrasco respectivamente)
Quanto ao comprimento dos brotos natildeo houve
diferenccedila significativa Os brotos t iveram um
crescimento meacutedio de 228 cm sendo que no tratamento
com 10 mL de meio foi 257 cm com 15 mL 222 cm
com 20 mL 224 cm com 25 mL 224 cm e o tratamento
com 30 mL 215 cm Embora natildeo se tenham realizado
estudos mais aprofundados uma das hipoacuteteses
sugeridas para explicar tais resultados possivelmente
estaacute relacionada a fatores nutricionais do explante
Segundo Cappelades et al (1991) e Pereira et al (2001)
porccedilotildees basais satildeo mais robustas apresentando maior
quantidade de reservas acumuladas em seus tecidos
o que poderia levar agrave utilizaccedilatildeo dessas reservas pelas
brotaccedilotildees regeneradas para sustentar seu crescimento
Esta seria uma das causas da uniformidade apresentada
no tamanho das brotaccedilotildees em todos os tratamentos
Resultados iguais foram obtidos em estudos feitos por
Rodrigues et al (2005) quando avaliaram comprimento
meacutedio de duas espeacutecies de orquiacutedeas mantidas em meio
de cultura cujos volumes testados eram de 25 50 75 e
100 mL Portanto verifica-se que eacute muito importante
selecionar material com bom estado fisioloacutegico e
tamanho homogecircneo para se obter melhores
resultados na proliferaccedilatildeo das brotaccedilotildees eou na
morfogecircnese
Proliferaccedilatildeo in vitro de brotos de curauaacute 105
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 102-106 2006
FIGURA 2 ndash Brotaccedilotildees de curauaacute (Ananas erectifolius) produzidas in vitro em diferentes volumes de meio MS 1-Repicagem dos brotos 2- 10 mL de meio MS 3- 15 mL de meio MS 4- 20 mL de meio MS 5- 25 mL de meio MS 6- 30mL de meio MS
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NORMAS PARA PUBLICACcedilAtildeO DE ARTIGOS E COMUNICACcedilOtildeES CIENTIacuteFICAS
1 Os conceitos e afirmaccedilotildees contidos nos artigos e comunicaccedilotildeesseratildeo de inteira responsabilidade do(s) autor(es)
2 A revista ldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquo editadasemestralmente pela Editora da Universidade Federal de Lavras(Editora UFLA) publica artigos cientiacuteficos e comunicaccedilotildeescientiacuteficas da aacuterea de cultura de tecidos de plantas elaboradospor membros da comunidade cientiacutefica nacional e internacionalNatildeo eacute cobrada taxa para publicaccedilatildeo de trabalhos Eacute condiccedilatildeofundamental que os artigoscomunicaccedilotildees submetidos agrave apreciaccedilatildeoda revista ldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquo natildeo forame nem seratildeo publicados simultaneamente em outro lugar Com aaceitaccedilatildeo do artigo para publicaccedilatildeo os editores adquirem amplose exclusivos direitos sobre o artigo para todas as liacutenguas e paiacutesesA publicaccedilatildeo de artigoscomunicaccedilotildees dependeraacute da observacircnciadas Normas Editoriais dos pareceres do Corpo Editorial e daComissatildeo ad hoc Todos os pareceres tecircm caraacuteter sigiloso eimparcial e tanto os autores quanto os membros do CorpoEditorial eou Comissatildeo ad hoc natildeo obtecircm informaccedilotildeesidentificadoras entre si
3 Os artigos e comunicaccedilotildees submetidos para publicaccedilatildeo deveratildeoser apresentados em CD utilizando-se o processador de textoMicrosoft Word for Windows (version 98 2000 XP ou 2003)ser escrito em liacutengua portuguesa inglesa ou espanhola e usarsomente nomenclaturas oficiais e abreviaturas consagradas natildeoempregando abreviaturas no tiacutetulo do artigo Juntamente com oCD deveratildeo ser enviadas 4 (QUATRO) vias sendo uma originale as demais coacutepias omitindo os autores e a chamada de rodapeacute daprimeira paacutegina (para serem enviadas aos consultores cientiacuteficos)impressas em papel branco tipo A4 (21cm x 297cm) ou emformulaacuterio contiacutenuo em uma soacute face espaccedilo duplo entre linhasfonte Times New Roman tamanho 12 observada uma margemde 3 cm para o lado esquerdo e de 2 cm para o direito 25 cm paramargem superior e inferior 25 cm para o cabeccedilalho e 25 cm parao rodapeacute Cada trabalho deveraacute ter no maacuteximo 14 paacuteginas ejunto do mesmo deveraacute ser encaminhado ofiacutecio dirigido ao EditorChefe da revista solicitando a publicaccedilatildeo do artigo Esse ofiacuteciodeveraacute ser assinado por todos os autores constar o endereccedilocompleto telefone e e-mail de todos Qualquer inclusatildeo exclusatildeoou alteraccedilatildeo na ordem dos autores deveraacute ser notificada medianteofiacutecio assinado por todos os autores (inclusive do autor excluiacutedo)
4 O artigo cientiacutefico deveraacute conter os seguintes toacutepicos a)TIacuteTULO suficientemente claro conciso e completo evitandopalavras supeacuterfluas Recomenda-se comeccedilar pelo termo querepresente o aspecto mais importante do trabalho com os demais
termos em ordem decrescente de importacircncia b) TIacuteTULO EMINGLEcircS c) NOME(s) DO(s) AUTOR(es) no maacuteximo 6 (seis)em letras maiuacutesculas um apoacutes o outro centralizados e no rodapeacuteda primeira paacutegina deveratildeo vir a formaccedilatildeo acadecircmica e aInstituiccedilatildeo onde trabalham d) RESUMO (de acordo comNBR6028 da ABNT) O resumo natildeo deve ultrapassar a 250(duzentos e cinquumlenta) palavras e natildeo possuir paraacutegrafos Apoacuteso Resumo devem-se incluir TERMOS PARA INDEXACcedilAtildeO(palavraschave) diferentes daqueles constantes do tiacutetulo eseparados por viacutergula Os termos para indexaccedilatildeo devem estardescritos na forma maiuacutescula e minuacutescula serem expressotildees queidentifiquem o conteuacutedo do artigo ser indicadas entre 3 e 5 e sepossiacutevel extraiacutedas do vocabulaacuterio Thesagro ndash Thesaurus AgriacutecolaNacional desenvolvido pela CENAGRI (indicaccedilatildeo da revistaldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquopara evitar o usode vaacuterios sinocircnimos como termos de indexaccedilatildeo) Se natildeo foremencontrados descritores disponiacuteveis para cobrirem a temaacutetica doartigo poderatildeo ser indicados termos ou expressotildees de usoconhecido e) ABSTRACT incluindo em seguida INDEXTERMS f) INTRODUCcedilAtildeO (incluindo a revisatildeo de literatura)g) MATERIAL E MEacuteTODOS h) RESULTADOS EDISCUSSAtildeO (podendo conter tabelas e figuras) i)CONCLUSOtildeES e j) REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
5 A comunicaccedilatildeo deveraacute conter os seguintes toacutepicos a)TIacuteTULO suficientemente claro conciso e completo evitandopalavras supeacuterfluas Recomenda-se comeccedilar pelo termo querepresente o aspecto mais importante do trabalho com os demaistermos em ordem decrescente de importacircncia Deve serapresentada a versatildeo do tiacutetulo para o idioma inglecircs b) TIacuteTULOEM INGLEcircS c) NOME(s) DO(s) AUTOR(es) no maacuteximo 6(seis) em letras maiuacutesculas um apoacutes o outro centralizados e norodapeacute da primeira paacutegina deveratildeo vir a formaccedilatildeo acadecircmica e aInstituiccedilatildeo onde trabalham d) RESUMO (de acordo comNBR6028 da ABNT) O resumo natildeo deve ultrapassar a 250(duzentos cinquumlenta) palavras e natildeo possuir paraacutegrafos Apoacutes oResumo devem-se incluir TERMOS PARA INDEXACcedilAtildeO(palavras-chave) diferentes daqueles constantes do tiacutetulo eseparados por viacutergula Os termos para indexaccedilatildeo devem estardescritos na forma maiuacutescula e minuacutescula serem expressotildees queidentifiquem o conteuacutedo do artigo ser indicadas entre 3 e 5 e)ABSTRACT incluindo em seguida INDEX TERMS f)TEXTO [sem subdivisatildeo poreacutem com introduccedilatildeo material emeacutetodos resultados e discussatildeo e conclusatildeo subtendidos(podendo conter tabelas ou figuras)] e g) REFEREcircNCIASBIBLIOGRAacuteFICAS
6 AGRADECIMENTOS ao fim do texto e antes das ReferecircnciasBibliograacuteficas poderatildeo vir os agradecimentos a pessoas ouinstituiccedilotildees O estilo tambeacutem aqui deve ser soacutebrio e claroindicando as razotildees pelas quais se fazem os agradecimentos
7 TABELAS E QUADROS deveratildeo ser inseridos apoacutes citaccedilatildeodos mesmos dentro do proacuteprio texto
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS as referecircnciasbibliograacuteficas devem ser citadas conforme a NBR60232002 daABNTA exatidatildeo das referecircncias constantes da listagem e a corretacitaccedilatildeo no texto satildeo de responsabilidade do(s) autor(es) doartigo
Orientaccedilotildees gerais- Deve-se apresentar todos os autores do documento cientiacutefico(fonte)- O nome do perioacutedico deve ser descrito por extenso natildeo deveser abreviado- Em todas as referecircncias deve-se apresentar o local de publicaccedilatildeo(cidade) a ser descrito no lugar adequado para cada tipo dedocumento- As referecircncias devem ser ordenadas alfabeticamente
EXEMPLIFICACcedilAtildeO (TIPOS MAIS COMUNS)
ARTIGO DE PERIOacuteDICO
VIEIRA R F RESENDE M A V de Eacutepocas de plantio deervilha em Patos de Minas Uberaba e Janauacuteba Minas GeraisCiecircncia e Agrotecnologia Lavras v 24 n 1 p 74-80 janmar 2000
LIVRO
a) Livro no todo
STEEL R G D TORRIE J H Principles and procedures ofstatistics New York McGraw-Hill Book l960 481 p
b) Parte de livro com autoria especiacutefica
FLEURY J A Anaacutelise ao niacutevel de empresa dos impactos daautomaccedilatildeo sobre a organizaccedilatildeo da produccedilatildeo de trabalho InSOARES R M S M Gestatildeo da empresa Brasiacutelia IPEAIPLAN 1980 p 149-159
c) Parte de livro sem autoria especiacutefica
MARTIM L C T Nutriccedilatildeo de bovino de corte em confinamentoIn ______ Confinamento de bovino de corte 2 ed Satildeo PauloNobel 1986 cap 3 p 29-89
DISSERTACcedilAtildeO E TESE
GONCcedilALVES R A Preservaccedilatildeo da qualidade tecnoloacutegicade trigo (Triticum aestivum L) e controle de Rhyzoperthadominica (F) durante o armazenamento em atmosferacontrolada com Co2 e N2 1997 52 f Dissertaccedilatildeo (Mestradoem Ciecircncia dos Alimentos) ndash Universidade Federal de LavrasLavras 1997
MATIOLI G P Influecircncia do leite proveniente de vacasmastiacuteticas no rendimento de queijo frescal 2000 55 pDissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncias dos Alimentos) - UniversidadeFederal de Lavras Lavras 2000
Nota ldquoA folha eacute composta de duas paacuteginas anverso e versoAlguns trabalhos como teses e dissertaccedilotildees satildeo impressos apenasno anverso e neste caso indica-se frdquo (ABNT NBR60232002p 18)
TRABALHOS DE CONGRESSO E OUTROS EVENTOS
SILVA J N M Possibilidades de produccedilatildeo sustentada de madeiraem floresta densa de terra firme da Amazocircnia brasileira InCONGRESSO FLORESTAL BRASILEIRO 6 1990 Campos doJordatildeo Anais Campos do Jordatildeo SBSSBEF 1990 p 39-45
DOCUMENTOS ELETROcircNICOS
As obras consultadas online satildeo referenciadas conformenormas especiacuteficas para cada tipo de documento (monografia notodo e em parte trabalho apresentado em evento artigo deperioacutedico artigo de jornal etc) acrescidas de informaccedilotildees sobreo endereccedilo eletrocircnico apresentado entre braquetes (lt gt)precedido da expressatildeo ldquoDisponiacutevel emrdquo e da data de acessoao documento precedida da expressatildeo ldquoAcesso emrdquo
Nota ldquoNatildeo se recomenda referenciar material eletrocircnico de curtaduraccedilatildeo nas redesrdquo (ABNT NBR60232000 p 4) Segundopadrotildees internacionais a divisatildeo de endereccedilo eletrocircnico no fimda linha deve ocorrer sempre apoacutes barra ()
Monografia (acesso online)
a) Livro no todo
TAKAHASHI T (Coord) Tecnologia em foco BrasiacuteliaSocinfoMCT 2000 90 p Disponiacutevel em lthttpwwwsocinfoorgbrgt Acesso em 22 ago 2000
b) parte de livro
TAKAHASHI T Mercado trabalho e oportunidades In ______Sociedade da informaccedilatildeo no Brasil livro verde BrasiacuteliaSocinfoMCT 2000 cap 2 p 13-24 Disponiacutevel em lthttpwwwsocinfogovbrgt Acesso em 22 ago 2000
c) Parte de congresso seminaacuterio etc
GIESBRECHT H O Avaliaccedilatildeo de desempenho de institutos depesquisa tecnoloacutegica a experiecircncia de projeto excelecircncia napesquisa tecnoloacutegica In CONGRESSO ABIPTI 2000Fortaleza Gestatildeo de institutos de pesquisa tecnoloacutegicaFortaleza Nutec 2000 Disponiacutevel em lthttpwwwabiptiorgbrgt Acesso em 01 dez 2000
d) Tese
SILVA E M Arbitrariedade do signo a liacutengua brasileira desinais (LIBRAS) 1997 144 p Dissertaccedilatildeo (Mestrado emLinguumliacutestica Aplicada e Estudo de Liacutengua) - Pontifiacutecia UniversidadeCatoacutelica de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 1997 Disponiacutevel em lthttpwwwterracombrvirtualbooks freebookportdid teseshtmgtAcesso em 28 nov 2000
Artigo de perioacutedico (acesso online)
RESENDE A M G Hipertexto tramas e trilhas de um conceitocontemporacircneo Informaccedilatildeo e Sociedade Recife v 10 n 12000 Seccedilatildeo Educaccedilatildeo Disponiacutevel em lthttpwwwinformaccedilatildeoesociedadeufpbbrgt Acesso em 30 nov 2000
CITACcedilAtildeO PELO SISTEMA ALFABEacuteTICO (AUTOR-DATA)(conforme ABNT NBR105202002)Dois autores - Steel amp Torrie (1960) ou (STEEL amp TORRIE1960)Trecircs ou mais autores - Valle et al (l945) ou (VALLE et al 1945)Obs Quando forem citados dois autores de uma mesma obradeve-se separaacute-los pelo sinal amp (comercial)
9 CASO O ARTIGO CONTENHA FOTOGRAFIASGRAacuteFICOS FIGURAS SIacuteMBOLOS E FOacuteRMULASESSAS DEVERAtildeO OBEDECER AgraveS SEGUINTESNORMAS
91 Fotografias deveratildeo ser apresentadas em preto e branconiacutetidas e com contraste inseridas no texto apoacutes a citaccedilatildeo dasmesmas e tambeacutem em um arquivo agrave parte salvas em extensatildeoldquoTIFFrdquo ou ldquoJPEGrdquo com resoluccedilatildeo de 300 dpi
92 Figuras deveratildeo ser apresentadas em preto e branco niacutetidase com contraste inseridas no texto apoacutes a citaccedilatildeo das mesmas etambeacutem em um arquivo agrave parte salvas em extensatildeo ldquoTIFFrdquo ouldquoJPEGrdquo com resoluccedilatildeo de 300 dpi As figuras deveratildeo serelaboradas com letra Times New Roman tamanho 10 semnegrito sem caixa de textos e agrupadas
93 Graacuteficos deveratildeo ser inseridos apoacutes citaccedilatildeo dos mesmosdentro do proacuteprio texto elaborado preferencialmente em Excelcom letra Times New Roman tamanho 10 sem negrito
94 Siacutembolos e Foacutermulas Quiacutemicas deveratildeo ser feitas emprocessador que possibilite a formataccedilatildeo para o programa PageMaker (ex MathType Equation) sem perda de suas formasoriginais
10 O Editor Chefe notificaraacute o autor do recebimento do originale posteriormente o informaraacute sobre sua publicaccedilatildeo Os artigosque necessitarem de modificaccedilotildees seratildeo devolvidos ao autor paraa devida revisatildeo
11 Os artigos natildeo aprovados seratildeo devolvidos
12 Os artigos seratildeo publicados em ordem de aprovaccedilatildeo
13 O natildeo-cumprimento dessas normas implicaraacute na devoluccedilatildeodo artigo ao autor
14 Os casos omissos seratildeo resolvidos pela Comissatildeo Editorial
15 O artigo deveraacute ser enviado para
ABCTPPlant Cell Culture amp MicropropagationUniversidade Federal de LavrasDepartamento de Biologia - Setor de Fisiologia VegetalCaixa Postal 3037Lavras ndash MGCEP 37200-000E-mail abctpuflabr
INSTRUCTIONS FOR AUTHORS
1 Concepts and affirmations included in articles andcommunications are of the entire responsibility of the authors
2 ldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquo a semestral journaledited by Editora UFLA of the Universidade Federal de Lavraspublishes scientific articles and communications in the area ofplant tissue culture elaborated by researchers of the national andinternational scientific community There are no page charges forpublication Submission of a manuscript implies that it is neitherunder consideration for publication elsewhere nor has appearedpreviously in part or in whole On acceptance for publicationauthors assign to the Editors full copyright of the manuscript inall languages and countries Publications will depend on editorialrules and on the review of experts and ad hoc commissionReviewer and editorial opinions will be anonymouslycommunicated to authors
3 The articles and communication submitted for publicationmust be presented in CD using the program Microsoft Wordfor Windows (version 98 2000 XP or 2003) written inPortuguese English or Spanish using only conventionalnomenclature At the time of submission authors are requiredto submit together with the CD 4 (four) hard copies one originaland three copies without the name(s) of the author(s) as well asthe footnote on the first page (to be used by the reviewers)printed on A4 white paper (21 cm x 297cm) or on continuousform typewritten only on one side double spaced using fontTimes New Roman size 12 with a 3 cm margin on the left handside and 20 cm margin on the right hand side 25 cm upper andlower margin 25 cm for the heading and 25 cm for the footnoteThe manuscript must present a maximum of 14 pages At thetime of submission a cover letter must be sent with themanuscript copies to the Editor requesting publication of thearticle This cover letter must be signed by all authors andalso contain the full address telephone number and e-mail ofthe authors Any inclusion exclusion or alteration in the authorsorder must be notified and signed by all authors including theone excluded
4 Each manuscript must be organized in a) TITLE sufficientlyclear conspicuous and complete without superfluous words Itis recommended to initiate with the term that represent the mostimportant aspect with other terms in decreasing of importanceb) TITLE in Portuguese c) FULL NAME(s) OF THEAUTHOR(s) maximum of 6 (six) in capital letters one after theother in the center of the page with the footnote of the first pagecontaining their professional qualification or academic training
and their work institution d) ABSTRACT written continuouslywithout paragraph It must not exceed 250 words Index termsmust be enclosed after the abstract using terms different fromthose used in the title and separated by comma The index terms(3 to 5) must be described in capital and small letters and expressthe content of the article e) ABSTRACT and INDEX TERMSin Portuguese f) INTRODUCTION (including literaturereview) g) MATERIAL AND METHODS h) RESULTS ANDDISCUSSION (it may include tables and figures) i)CONCLUSIONS and j) REFERENCES
5 Communication must have the following topics a) TITLEsufficiently clear conspicuous and complete without superfluouswords It is recommended to initiate with the term that representthe most important aspect with other terms in decreasing ofimportance The PORTUGUESE version of the title has to bepresented b) TITLE in Portuguese c) FULL NAME(s) OFTHE AUTHOR(s) maximum of 6 (six) in capital letters oneafter the other in the center of the page with the footnote of thefirst page containing their professional qualification or academictraining and their work institution d) ABSTRACT writtencontinuously without paragraph It must not exceed 250 wordsIndex terms must be enclosed after the abstract using termsdifferent from those used in the title and separated by commaThe index terms (3 to 5) must be described in capital and smallletters and express the content of the article e) ABSTRACTand INDEX TERMS in Portuguese f) TEXT (with no divisionbut must include introduction material and methods results anddiscussion and conclusion (it may include tables and figures) andg)REFERENCES
6 ACKNOWLEDGEMENTS Acknowledgements to peopleor institutions might be included at the end of the text priorReferences The written style must be serious and clear indicatingthe reasons of the acknowledgements made
7 TABLES AND FIGURES must be included right after theircitation in the text
8 REFERENCES references must be cited according toNBR60232002 of ABNT All references and their correct citationin the text are of the entire responsibility of the author(s)- Some important orientations all authors of the scientificdocument must be presented (source) the journal must be citedusing its full name all references must present the name of thecity where the journal was published all references must be citedalphabetically
9 PHOTOGRAPHS GRAPHS FIGURES SYMBOLS ORFORMULA CONTAINED IN THE ARTICLE SHOULDOBEY THE FOLLOWING RULES
91 Photographs must be presented in black and whiteclear and with contrast inserted in the text after their citationand also in a separate file (on the same diskette as the article)saved in extension ldquoTIFFrdquo or ldquoJPEGrdquo with resolution of300 dpi
92 Figures must be presented in black and white clear andwith contrast inserted in the text after their citation and also in aseparate file (on the same diskette as the article) saved inextension ldquoTIFFrdquo or ldquoJPEGrdquo with resolution of 300 dpiThey must be elaborated using Times New Roman font size10 without bold without text box and arranged
93 Graphs must be inserted in the text after their citationelaborated preferentially in Excel using Times New Romanfont size 10 without bold
94 Symbols and Chemical Formula must be presented usinga word processor that permits a format for Page Maker (exMathType Equation) without loss of its original form
10 The Brazilian Association of Plant Tissue Culture (ABCTP)will inform the author the receipt of the original manuscript andeventually it will also send information regarding its publicationManuscripts that require modifications will be returned to theauthor for the respective revision andcorrections
11 Manuscripts not approved will be returned to the author
12 Articles will be published according to the order of receiptand approval
13 If any of these rules are not attended the manuscript will bereturned to the author
14 Manuscripts should be sent to the following address
ABCTPPlant Cell Culture amp MicropropagationUniversidade Federal de LavrasDepartamento de Biologia - Setor de Fisiologia VegetalCaixa Postal 3037Lavras ndash MGCEP 37200-000BrazilE-mail abctpuflabr
A revista ldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquo editada semestralmente pela Editora daUniversidade Federal de Lavras (Editora UFLA) publica artigos cientiacuteficos da aacuterea de cultura de tecidos deplantas por membros da comunidade cientiacutefica nacional e internacional Com uma tiragem de 600 exemplareseacute distribuiacuteda aos membros da ASSOCIACcedilAtildeO BRASILEIRA DE CULTURA DE TECIDOS DEPLANTAS (ABCTP) em dia com a anuidade
Para se associar agrave ABCTP consulte o site ltwwwabctpuflabrgt
PERMUTA
A revista ldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquo deseja fazer permuta com revistas de aacutereas afins
ABCTP
Universidade Federal de Lavras - Departamento de BiologiaSetor de Fisiologia Vegetal - Caixa Postal 3037 - Lavras ndash MG - CEP 37200-000
E-mail abctpuflabr
FICHA CATALOGRAacuteFICA
Plant Cell Culture amp Micropropagation = Cultura de Ceacutelulas amp Micropropagaccedilatildeo de Plantas ndash v 1 n 1 (janjun 2005)- ndash Lavras Ed UFLA 2005- v il
Semestral (junho e dezembro) Publicaccedilatildeo Cientiacutefica da Associaccedilatildeo Brasileira de Cultura de Tecidosde Plantas (ABCTP) ISSN 1808-9909
1 Cultura de Tecidos de Plantas I Associaccedilatildeo Brasileira de Culturade Tecidos de Plantas II Universidade Federal de Lavras Departamen-
to de Biologia Setor de Fisiologia Vegetal
INDEXADO porAGRISAGROBASE
CDD (22ordf ed) 58072405
DIRETORIA
Presidente ndash Renato Paiva ndash UFLA Secretaacuterio ndash Moacir Pasqual ndash UFLA
Secretaacuterio Adjunto ndash Antocircnio Carlos Torres ndash EMBRAPA Hortaliccedilas Tesoureiro ndash Guilherme Augusto Canella Gomes ndash Benger do Brasil
COMISSAtildeO EDITORIAL
EDITOR CHEFE Renato Paiva ndash UFLA
CONSELHO EDITORIAL Antocircnio Carlos Torres ndash EMBRAPA Hortaliccedilas
Moacir Pasqual ndash UFLA Renato Paiva ndash UFLA
REVISAtildeO DE REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS Luiz Carlos de Miranda ndash UFLA
NOMENCLATURA CIENTIacuteFICA Manuel Losada Gavilanes ndash UFLA
EDITORACcedilAtildeO Christyane Aparecida Caetano ndash Editora UFLA
Aleacutezia Conceiccedilatildeo Modesto Ribeiro ndash Editora UFLA Luciana Carvalho Costa ndash Editora UFLA
REVISAtildeO DE PORTUGUEcircS Amanda Jackeline Santos Silva
REVISAtildeO DE INGLEcircS Renato Paiva
ndash UFLA
SECRETARIACr ist iano Mar t inot t o ndash UFLA
Daiane Peixot o Var gas ndash UFLA
EDI TORES ASSOCI ADOSEnio Luiz Pedrotti - UFSC
Fr ancisco de Assis Paiva Campos - UFCGilber t o Bar bant e Ker bauy - USP
J oatildeo Bat ist a Teixeir a - EMBRAPA Recur sos Geneacutet icos e Biot ecnologiaJ oseacute Ant ocircnio Pet er s - UFPEL
Kasumit su Mat sumot o- EMBRAPA Recur sos Geneacutet icos e Biot ecnologiaLilia Gomes Willadino - UFRPE
Linda St yer Caldas - UNBLuciana Ribas - UFPR
Magdi Ahmed I br ahim Alouf a - UFRNMar guer it e Ger maine Ghislaine Quoir in- UFPR
Miguel Pedr o Guer r a - UFSCMiklos Gaacutebor Faacuter i ndash Univer sidade de Debr ecen ndash Ungr ia
Otto Jesu Crocomo ndash ESALQ - USPRenat o de Oliveir a Resende - UNB
Schuyler Kor ban ndash Univer sidade de I llinois - Est ados UnidosSilvio Lopes Teixeira - UENF
Ter ezinha Rangel Camar a ndash UFRPEWagner Apar ecido Vendr ame ndash Univer sidade da Floacuter ida ndash Est ados Unidos
Wagner Campos Ot oni ndash UFV
CONSULTORI A CI ENTIacute FI CA (Vol 2 N 2)Alexandr e Hof f mann ndash EMBRAPA Uva e VinhoAlexandr e Mor ais do Amar al ndash EMBRAPA-I AC
Aloisio Xavier ndash UFVAnt ocircnio Chalf un J unior ndash UFLA
Eur ico Eduar do Pint o de Lemos ndash UFALEvar ist o Maur o de Cast r o ndash UFLAGilber t o Bar bant e Ker bauy ndash USP
J oatildeo Bat ist a Teixeir a ndash EMBRAPA Cenar gemJoseacute Raniere F Santana ndash UEFS
Luiz Ant ocircnio Biasi ndash UFPRMiguel Pedr o Guer r a ndash UFSC
Osmar Alves Lameir a ndash EMBRAPA Amazocircnia Or ient alOt t o J esu Cr ocomo ndash ESALQ USP
Ricar do Tadeu de Far ia ndash UELWagner Campos Ot oni ndash UFV
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-106 2006
Plant Cell Culture amp Micropropagation
ISSN 1808-9909
CONTEUacuteDO
01 In vitro propagation of Melissa officinalis L and production of essential oil In vitro propagation of Melissa officinalis L and production of essential oil Simone da Silva Celso Luiz Salgueiro Lage Maria Apparecida Esquibel Rosane Aguiar da Silva San Gil Alice Sato
53
02 Crescimento in vitro de Laelia tenebrosa (ORCHIDACEAE) em diferentes concentraccedilotildees de sais de Knudson C e carvatildeo ativado In vitro growth of Laelia tenebrosa (ORCHIDACEAE) in different concentrations of Knudson C salts and activated charcoal Aparecida Gomes de Araujo Moacir Pasqual Alba Regina Pereira Herminio Souza Rocha 61
03 Propagaccedilatildeo in vitro de placircntulas de orquiacutedea em diferentes meios de cultura e concentraccedilotildees de citocinina In vitro propagation of orchid plantlets cultivated in different culture media and cytokinin concentrations Aparecida Gomes de Araujo Moacir Pasqual Adriano Bortolotti da Silva Fabiacuteola Villa Hermiacutenio Souza Rocha Fernanda Carvalho Costa 68
04 Efeito do viacuterus das estrias da bananeira na micropropagaccedilatildeo e no crescimento das plantas da cultivar caipira durante a aclimatizaccedilatildeo Effect of banana streak virus on micropropagation and plant growth of cultivar caipira during acclimatization Daniela Garcia Silveira Antocircnio da Silva Souza Paulo Ernesto Meissner Filho Tales Miler Soares Ranulfo Correa Caldas Kaacutetia Regina Barbosa Leatildeo 74
05 Caracteriacutesticas morfofisioloacutegicas de brotaccedilotildees de Agapanthus umbellatus var minor multiplicadas em biorreator de imersatildeo temporaacuteria Morphological and physiological characteristics Agapanthus umbellatus var minor of shoots propagated in bioreactor of temporary immersion Luciana Alves Fogaccedila Denilson Dortzbach Antonio Carlos Alves Enio Luiz Pedrotti 80 06 Capacidade de regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro cultivar Santa Clara In vitro regeneration capacity of tomato plant cultivar Santa Clara Glaucia de Fatima Moreira Vieira e Souza Joseacute Magno Queiroz Luz Alcione Silva Arruda Denise Garcia Santana Mariana de Souza e Silva da Costa Teixeira Luciana Londe Adelaide Siqueira Silva Elisacircngela Rodrigues Figueira 88
07 Induccedilatildeo de calos a partir de cultura de anteras de cafeeiro (Coffea arabica L) cv Catuaiacute Vermelho 99 e 44 Callus induction from anther culture of coffee plant (Coffea arabica L) cv Catuaiacute Vermelho 99 and 44 Adelaide Siqueira Silva Joseacute Magno Queiroz Luz Denise Garcia Santana Patriacutecia Crystie Vieira Mustafa Moacir Pasqual Glaucia de Fatima Moreira Vieira e Souza 94
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-106 2006
Plant Cell Culture amp Micropropagation
ISSN 1808-9909
COMUNICACcedilAtildeO CIENTIacuteFICA
08 Proliferaccedilatildeo in vitro de brotos de Curauaacute utilizando diferentes volumes de meio de cultura In vitro shoot proliferation of Ananas erectifolius using different volumes of culture medium Flaacutevia Dioniacutesio Pereira Joseacute Eduardo Brasil Pereira Pinto Helen Cristina de Arruda Rodrigues Luciana Domiciano Silva Rosado Luiz Alberto Beijo Osmar Alves Lameira 102
In vitro propagation of Melissa officinalis L and production 53
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
IN VITRO PROPAGATION OF Melissa officinalis L AND PRODUCTIONOF ESSENTIAL OIL
IN VITRO PROPAGATION OF Melissa officinalis L AND PRODUCTION OFESSENTIAL OIL
SIMONE DA SILVA1 CELSO LUIZ SALGUEIRO LAGE2 MARIA APPARECIDA ESQUIBEL3ROSANE AGUIAR DA SILVA SAN GIL4 ALICE SATO5
1Doutoranda em Biotecnologia Vegetal ndashUFRJIBC Chagas Filho ndash Av Brigadeiro Trompowsky SN Ccs ndash Bloco G ndash Sala G2-050 ndash Cidade Universitaacuteria ndash Laboratoacuterio de Fisiologia Vegetal ndash Ilha do Fundatildeo ndash 21949-900 ndash Rio de Janeiro RJ ndash monybiofufrjbr
2Dr em Biofiacutesica ndashUFRJ ndash Instituto de Biofiacutesica Carlos Chagas Filho ndash Laboratoacuterio de Fisiologia Vegetal ndash Ilha do Fundatildeo ndash 21949-900 ndash Rio de Janeiro RJ ndash clslagebiofufrjbr3Poacutes-Doutorado em Bioeletrogecircnese ndash UFRJ ndash Instituto de Biofiacutesica Carlos Chagas Filho ndash Laboratoacuterio de Fisiologia Vegetal ndash Ilha do Fundatildeo ndash 21949-900 ndash Rio de Janeiro RJ ndash esquibelbiofufrjbr4Dra em Quiacutemica Orgacircnica ndash Ufrj DQO ndash Edifiacutecio do Centro de Tecnologia ndash Bloco A ndash Sala 605 ndash Ilha do Fundatildeo ndash Cidade Universitaacuteria ndash Caixa Postal 068556 ndash 21941-972 ndash Rio de Janeiro RJ ndash rsangilIqufrjbr5Dra em Biotecnologia Vegetal ndash UNIRIODCN ndash Centro de Ciecircncias Bioloacutegicas e da Sauacutede ndash Av Pasteur 458 Preacutedio da ECB ndash 4ordmandar Sala 415 URCA ndash 22290-240 ndash Rio de Janeiro RJ ndash alicesatouniriobr
ABSTRACTThis work presents an efficient protocol for micropropagation
of Melissa officinalis L through axillary bud proliferation obtainedfrom in vitro germinated seeds on basal Murashige amp Skoog medium(MS) The explants were grown on MS supplemented with differentgrowth regulators NAA (05 mM) KIN (05 mM) BA (05 mM)GA
3 (28 microM) and IAA (05 mM) Higher shoot proliferation and
rooting rates were obtained on MS supplemented with 05 microM IAAMicropropagated plants were acclimatized and transferred to soilwith success The essential oil composition in shoots of in vitro andfield-grown (ex vitro) plants was determined by gas chromatographymass spectrometry The major components of essential oils detectedin both plant materials were pujone neral geraniol and geranial Mofficinalis in vitro plantlets developed on MS media showed 14higher proportions of nerol and 41 of geraniol when compared withfield grown plants
Index terms Growth regulators medicinal plant tissue culture
RESUMOEste trabalho apresenta um protocolo raacutepido e eficiente
para propagaccedilatildeo in vitro de Melissa officinalis L atraveacutes daproliferaccedilatildeo de gemas axilares de plantas obtidas de sementesgerminadas em meio basal de Murashige amp Skoog (MS) Os explantesforam cultivados em meio de Murashige amp Skoog (MS) 1962com adiccedilatildeo de diferentes reguladores de crescimento Aacutecido alfa-naftaleno-aceacutetico (ANA ndash 05 mM) Cinetina (KIN ndash 05 mM)Benziladenina (BA ndash 05 mM) Aacutecido Gibereacutelico (GA
3 ndash 28 microM)
e Aacutecido Indolaceacutetico (AIA ndash 05 mM) O alongamento e formaccedilatildeode segmentos nodais maacuteximos foram obtidos com AIA Explantesdesenvolveram 5 novos brotos com 10 cm em meacutedia e 100 deenraizamento em 30 dias de cultura Plantas micropropagadasforam aclimatadas e transferidas para o solo com sucesso Acomposiccedilatildeo do oacuteleo essencial de partes aeacutereas de plantas produzidasin vitro e plantas crescidas em campo (ex vitro) foi determinadapor cromatografia gasosa acoplada agrave espectrometria de massas Os
principais componentes do oacuteleo essencial encontrados em ambosos materiais vegetais foram a pujona neral geraniol e geranial Asplantas de Melissa officinalis desenvolvidas in vitro em MSapresentaram aumento de 14 vezes na proporccedilatildeo do nerol e de 41na de geraniol quando comparadas agraves plantas ex vitro
Termos para indexaccedilatildeo Reguladores de crescimento plantamedicinal cultura de tecidos
INTRODUCTION
Melissa officinalis L (Lamiaceae) is a well-known
herb used to give fragrance to different food and beverage
products It has also been used as a medicinal plant for
treatment of headaches gastrointestinal disorders
nervousness and rheumatism The essential oil is a well-
known antibacterial and antifungal agent and it is also
responsible for the mild depressive and spasmolytic
properties of the plant Literature data pointed out antioxidant
properties of methanolic extracts of Melissa officinalis which
are mostly due to high portion of phenolic acids revealing
significant antimicrobial particularly antibacterial activity of
this essential oil (MIMICA-DUKIC et al 2004)
The chemical composition of the essential oil of
Melissa officinalis leaf (02-1 on dry weight) has been
studied The major compounds (10-40) are citral (neral
and geranial) and these are accompanied by limonene
cineole geraniol szlig-caryophyllene and spathulenol The
(Recebido em 06 de setembro de 2005 e aprovado em 21 de junho de 2006)
SILVA S da et al54
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
leaf also contains polyphenolic compounds
hydroxycinnamic derivatives with verbascoside (53)
flavonoids such as luteolin 7-glucoside and luteolin 7-
diglucuronide (08) These compounds probably
intervene in the antispasmodic activity Iridoid glucosides
were also reported and the infusion contains potassium
(CARNAT et al 1999)
Cultivation of medicinal plants for the purpose of
extraction of active constituents may face certain limitations
such as climate season water availability diseases and
pests and scarcity of naturally growing plants Such
limitations led to the use of tissue culture techniques for
production of the active constituents Tissue culture
provides means of rapid propagation of a large number of
uniform plants while maintaining their genotype Beneficial
uses of tissue culture for the purpose of extraction of
secondary metabolites include avoidance of collection of
endangered wild species production of secondary
metabolites due to rapid growth of cultures in vitro
(ARIKAT et al 2004)
Due to the importance of this plant for multiple
purposes and the difficulty to produce active compounds
in vitro the application of methods that provide higher
number of cloned plants of M officinalis is justified aiming
to select high quality plant lines to extensive culture and
extraction of pharmaceutical products In Brazil M
officinalis is used in phytomedicine by pharmaceutical
industries One of the most critical problems of
phytomedicine is the natural variation of plants chemical
constituents (CURRIER et al 2000) This variation could
be originated from genetical factors or under influence of
environmental characteristics
The use of in vitro systems have been reported as
an effective tool for obtaining genetically uniform plants
which can be the source for less variable pharmaceutical
preparations Plant regeneration of M officinalis has been
achieved using as explants cotyledonary nodes of 10-day-
old Melissa officinalis seedlings (TAVARES et al 1996)
shoot tips from plants cultivated at greenhouse
(MEacuteSZAacuteROS et al 1999) using various types and
concentrations of cytokinins auxins and triacontanol
(TANTOS et al 1999)
The aim of this work is to develop a
micropropagation method in order to obtain a significant
number of monoclonal plants for further field cultivation
comparing the essential oil content and composition
between micropropagated and field-grown plants
MATERIALS AND METHODS
Plant material
Representative specimens from field grown plants
of M officinalis were selected and submitted to Erika Von
Sohsten Medeiros and Angela Vaz (Rio de Janeiro
Botanical Garden) for the taxonomic confirmation A
voucher nordm RB ndash 365926 is deposited at the Herbarium of
Rio de Janeiro Botanic Garden
Melissa officinalis seeds were obtained from
commercial market ISLAR batch Nordm 8250 The seeds were
germinated and grown to the seedling stage in vitro Seeds
were pre-treated by immersion into 2 commercial bleach
solution (Globoacirc) for 20 min and then rinsed thoroughly
in running tap water After that the seeds were surface
sterilized in 70 ethanol for 20 min followed by 15 min in a
20 commercial bleach solution containing 2-3 drops of
Tween 20 under aseptic conditions and rinsed three times
with sterile distilled water The seeds were cultured on MS
(MURASHIGE amp SKOOG 1962) solid medium
supplemented with 30 gL-1 sucrose 148 mM thiamine-
HCl 243 mM pyridoxine-HCl 41 mM nicotinic acid and
06 mM myo-inositol The pH value was adjusted at 58 plusmn
01 before addition of 8 gL-1 of agar and the media were
sterilized in autoclave (120 degC during 15 min) The cultures
were incubed at 25 plusmn 1 degC under a 16 h light 8 h dark
regime at an irradiance of 230 mmolm-sup2s-1 (white light
illumination Sylvaniaacirc fluorescent tubes)
Establishment of in vitro shoot cultures
From in vitro 8-day-old germinated seeds plants
(20-30 cm in length) of three different clones designated
In vitro propagation of Melissa officinalis L and production 55
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
as clones 1 2 e 3 were selected and axillary shoot induction
takes place from nodal segments (1 cm in length)
subcultivated on MS hormone-free media (MS0) These
materials were used as donors of explants to be tested
with different culture media 05mM a-naphthaleneacetic
acid (NAA) 05mM kinetin (KIN) 05mM benzyladenine
(BA) 28 mM gibberellic acid (GA3) and 05mM indole-3-
acetic acid (IAA) Cultures were grown in 300 mL glass
flasks containing 40 ml of media each
Shoot proliferation rate length of both shoots and
roots and calli formation were monitored as growth
parameters Each treatment was replicated 3 times using
100 explants per repetition Subcultures were performed at
30 days intervals
Acclimatization
A total of 60 in vitro rooted microshoots (those grown
on MS + IAA during 30 days with average height of 10 cm
were removed from the medium and the agar washed gently
with tap water They were transferred to 60 cm diameter
plastic pots containing soil and humus (31 vv) and kept at
a greenhouse High humidity environment was provide by
covering the plants with a plastic foil and watering them
one time per day during the first 2 weeks Then plants were
gradually exposed to greenhouse conditions for 1 month
and finally transferred to the field where they were cultivated
during one year until complete life cycle
Extraction
Field-grown and fresh in vitro plantlets aerial parts
(100 g each) were submitted to hydro distillation for 140 h
in a Clevenger type apparatus as recommended by the
Brazilian Pharmacopoeia (1988) in replicate (n = 2) The
time between the isolation and analysis was the same in all
experiments to preclude differences in composition due to
external factors (SILVA et al 2003)
Gas chromatographic and gas chromatography-massspectrometric analysis
Gas chromatography with flame ionization
detection (GCFID) was carried out on a Varian Star Model
3350 instrument using a capillary column coated with DB-
5 (30 m x 025 mm i d 025 mm film thickness J amp W
Scientific Folsom CA USA) The GC oven was heated
using the following program 40 oC to 220 oC at 4 oC min-1
with an initial isothermal period of 1 min splitless The
detector and injector temperatures were held at 280 oC
Hydrogen was used as carrier gas The injection consisted
of 10 microL of distilled oil diluted with hexane The GCMS
analyses were carried out on a Hewlett-Packard (Agilent
Technologies Avondale USA) Model 5972 MSD coupled
to a HP 5890 GC The GC conditions were the same as
above except for the fact that helium was used as carrier
gas The mass spectrometer was operated on electron
impact mode at 70 eV Molecular assignments were
performed with the help of the Wiley 275 standard library
of mass spectra literature data (ADAMS 1995) authentic
geraniol standard (Sigma Part Number G5135) and mass
spectra interpretation besides the comparison with
previously published elution order (KREIS amp MOSAND
1994) Quantification was performed from GC profiles using
area percent since in the literature the FID response factor
for most of monoterpenes is determined as 1 (CARNAT et
al 1999)
Statistical analysis
Data for each experiment were subjected to analysis
of variance (ANOVA) and means were compared using the
Tukey-Kramer test Percent data were submitted to
significance test ndash difference between two percentages
using the Statistica for WindowsTM 50 version A
significance level of 5 was used for all statistical analysis
RESULTS AND DISCUSSION
In vitro multiplication of Melissa officinalis was
followed during four developing cycles Micropropagation
papers usually present an efficient protocol evaluated in
only one developing cycle This kind of protocol however
may fail when the cultures have to be kept during long
time many successive subcultures being necessary in
order to produce large number of clonal plants
SILVA S da et al56
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
In vitro establishment
In this work three different clones of M officinalis
were used and they had shown similar development
responses on in vitro cultures
The clones 1 and 2 had in vitro multiplication rate
lower than the clone 3 which means a decrease in the
absolute number of nodal segments (Fig 1A and B) From
these results the clone 3 was selected to run the tests
The average number of four new nodes was
produced by explant on MS0 after 30 days and this value
was used as a control to evaluate effects of the presence
of growth regulators in the media (Tab 1)
FIGURE 1 ndash Nodal segments development of three clones of Melissa officinalis on MS+ 05 M IAA during 30 daysA) Multiplication rate of in vitro culture from 2nd to 4th subcultures B) Number of nodal segments developed per clone
TABLE 1 ndash Effect of growth regulators in Melissa officinalis axillary segments culture after four weeks of culture
Culture Media
Shoot Explant
xplusmnse
Shoot Length (CM)
Multiplication Rate (ndeg of
Nodal Segment Explant)
Node Plantlet
xplusmnse
Root Frequency
()
Root Number
Explant xplusmnse
Root Length
(CM) xplusmnse
MS0 171B 403 08B 68C 41 B 50 105 11B 30 06B
05 M KIN 111C 349 11C 33D 31 C 50 073 09C 27 07C
28 M GA3 111C 100 03D 22E 21 D 50 071 09C 25 07C
05 M IAA 191B 1000 09A 95B 51 A 100 897 08A 137 08A
05 M NAA
301A 333 16C 90A 31 C 0 0 - 05 M BA 111C 385 54C 33D 31 C 0 0 -
Value are means (x) plusmn standard error (se) n=100 Values in the same column followed by the same letter do not differstatistically at Pdrdquo005
The influence of plant growth regulators and their
interactions on micropropagation of different plant species
have been discussed in detail by Lameira et al (2005) Rout
et al (1989) Rout amp Das (1997ab) Skirvin et al (1990) and
Zieslin et al (1989)
In this work addition of IAA to MS presented the
best results among all tested growth regulators in all
evaluated parameters However to shoot production there
is no statistical difference to the control The analysis of
effects of the other growth regulators shows that only
05mM NAA was able to improve shoot production
although it is not able to promote rhizogenesis
In vitro propagation of Melissa officinalis L and production 57
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
The use of MS plus 05mM Kinetin or 05mM BA
or 05mM NAA promoted the development of three nodal
segments per elongated plant in 30 days culture (Tab
1) However when BA was used these new shoots
exhibited apical necrosis When GA3 (28 mM) was added
to medium there was induction of only one shoot per
explant and after 30 days there were 2 nodes per
elongated shoot
There was no rooting in explants placed on MS
added of NAA and BA In MS medium containing KIN or
GA3
and in basic MS 50 of the shoots developed new
roots in 30 days of culture
The best result of rhizogenesis was presented
by explants cultured in MS plus IAA where 100 of
shoots rooted with more than 8 new roots per explant
(Tab 1) In terms of root length the cultures in MS
supplemented with IAA presented longer roots when
compared with the other media compositions used at
the present work
In short the addition of 05mM of IAA was chosen
as that presenting the best results in all evaluated
parameters (Fig 2A)
The action of IAA on the in vitro plant
development was in accordance to the known effects of
such hormone (CLELAND 1995) Shoot elongation was
obtained concomitantly with rooting in media MS plus
05 mM IAA That is specially interesting once it may
reduce the micropropagation process through nodal
segments explants to only three steps germination
shoot elongation and multiplication concomitant to
rooting this represents gain of time culture medium
and constitutes a quick micropropagation process
Tavares et al (1996) reported a micropropagation
utilizing cotyledonary nodes as explants The highest
average number of shoots in the two inoculations was
obtained with 2 mgL-1 of BA 24 axillary shoots per
explant 7 in the first inoculation and 17 in the second
one Shoots of the two inoculations were excised after
30 and 60 days respectively
Acclimatization
Melissa officinalis leaves are very sensitive to
water loss and this process is irreversible it was necessary
to provide a high humidity environment during the first
acclimatization period plants were covered with a plastic
foil during 2 weeks before being gradually exposed to
greenhouse conditions The acclimatization procedure
used for in vitro plants was successful and a total of 100
survival rate (n=60) was obtained Acclimatized plants
appeared normal and did not exhibit any morphological
abnormalities or variations These results permitted the
soil cultivation (Fig 2B) without chemical defensives
during one year up to the complete vegetative cycle
(flowering)
Essential oils content
Comparative analysis of the chromatographic
profiles showed high percentage of neral and geranial in
relation to nerol and geraniol in field grown (ex vitro)
plantlets and in MS0 (in vitro)
The relative content of the principal components
of essential oil of the aerial parts of M officinalis are
presented as mean peaks area () on Fig 2C geranial
(3813 and 4364) neral (2674 and 317) geraniol (329 and
153) and nerol (116 and 187) in plants cultured ex vitro
and in vitro respectively Plantlets developed in vitro on
MS0 media showed an increase of 14 times in the
proportion of nerol and 41 times of geraniol when
compared with ex vitro cultured plants
Field plants are exposed to considerable more
stressful conditions such as lower relative humidity higher
light levels and herbivory those are the more stressful
The latter conditions tend to favor a greater essential oil
accumulation (TAVARES et al 2004) On other hand
plantlets grown in vitro have been continuously exposed
to a unique microenvironment that has been selected to
provide minimal stress and nearly optimal conditions for
plant multiplication
SILVA S da et al58
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
FIGURE 2 ndash A) In vitro culture of Melissa officinalis on MS + IAA in 30 days of culture B) Ex vitro culture six monthsafter transference to soil maximum height 60 cm C) Composition and percentage of the most abundant essential oilcomponents of Melissa officinalis from aerial parts (100 g Fresh Weight) from in vitro e ex vitro culture
In vitro propagation of Melissa officinalis L and production 59
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
CONCLUSIONS
Melissa officinalis micropropagation can be made
using nodal segments from in vitro plants during 5 weeks
in MS media without growth regulators and posterior
subculture in MS media with 05 mM IAA for a better
development Multiplication rates of 44 and 40 were
obtained at the 3rd and 4th subcultures respectively
It was observed a significant difference between
the effects of auxins IAA and NAA The latter exerted an
unsatisfactory influence on the nodal segment formation
shoot length and rooting when compared with the results
obtained with IAA
The plants produced in vitro were vigorous and
after acclimatization they were well adapted After 1 month
at the greenhouse the survival rate was 100
Considering that the main objective of this work is
to produce monoclonal plants to be used by phytomedicine
industries it is important that the method presents a large
number of buds per explant This result plus an efficient
acclimatization stage can save time and produce
monoclonal plants in sufficient number to be used in
commercial field culture Our results showed a change in
the essential oil composition in the proportion of active
compounds However the characteristics of the oil of in
vitro and ex vitro M officinalis plants were not altered
The manipulation of the culture media composition
is an important biotechnological tool for the optimization
of the essential oils production With this technique this
work developed a protocol for highly production of plants
and productivity in the components (geraniol geranial and
neral) of the oil
ACKNOWLEDGMENTS
This work was supported by ICUNIRIO FAPERJ
and CNPq
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Crescimento in vitro de Laelia tenebrosa (Orchidaceae) 61
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
CRESCIMENTO IN VITRO DE Laelia tenebrosa (ORCHIDACEAE)EM DIFERENTES CONCENTRACcedilOtildeES DE SAIS DE KNUDSON C
E CARVAtildeO ATIVADO
IN VITRO GROWTH OF Laelia tenebrosa (ORCHIDACEAE) IN DIFFERENTCONCENTRATIONS OF KNUDSON C SALTS AND ACTIVATED CHARCOAL
APARECIDA GOMES DE ARAUJO1 MOACIR PASQUAL2 ALBA REGINA PEREIRA3HERMINIO SOUZA ROCHA4
1Doutoranda em AgronomiaFitotecnia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash agaraujo2003yahoocombr2Dr Professor Titular do Departamento de Agricultura ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash LavrasMG ndash mpasqualuflabr3Doutoranda no Jardim Botacircnico do Rio de Janeiro ndash ENBTJBRJ ndash Pacheco Leatildeo 915 ndash 22460-030 ndash Rio de Janeiro RJ4Doutorando em AgronomiaFitopatologia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash herminiouflanetcombr
RESUMOObjetivou-se testar diferentes concentraccedilotildees de carvatildeo
ativado adicionado ao meio Knudson C no crescimento in vitrode orquiacutedeas Placircntulas de Laelia tenebrosa (LA Rolfe) LARolfe com 1 a 15 cm de comprimento e contendo raiacutezes foraminoculadas em frascos contendo 40 mL de meio de cultura Ostratamentos consistiram na combinaccedilatildeo de concentraccedilotildees de carvatildeoativado (0 05 10 20 e 40 g L-1) e sais minerais de Knudson C(0 50 100 150 e 200) acrescidos de sacarose (20 g L-1) Omeio foi solidificado com 6 g L-1de aacutegar e o pH ajustado para58plusmn01 antes da autoclavagem a 121degC e 11 atm por 20 minutosApoacutes a inoculaccedilatildeo os frascos foram mantidos sob 25 plusmn 1degCfotoperiacuteodo de 16 horas e 32 mM m-2 s-1 de irradiacircncia Apoacutes 150dias verificou-se que a adiccedilatildeo de 2g L-1 de carvatildeo ativado ao meiocom metade dos sais de Knudson C promoveu melhor crescimentoin vitro das placircntulas de Laelia tenebrosa
Termos para indexaccedilatildeo Orquiacutedea meio de cultura cultura detecidos
ABSTRACTThe objective of this work was to test the effect of
Knudson C medium supplemented with different concentrationsof activated charcoal on the in vitro growth of orchids Plantletsof the Laelia tenebrosa (LA Rolfe) LA Rolfe measuring 1-15cm in length containing roots were inoculated in flasks containing40 mL of culture medium The treatments consisted of differentconcentrations of activated charcoal (0 05 10 20 and 40 g L-
1) combined with Knudson C salts (0 50 100 150 and 200)supplemented with sucrose (20 g L-1) The medium was solidifiedwith agar (6 g L-1) and pH adjusted to 58plusmn01 before autoclavingat 121ordmC and 11 atm during 20 minutes After inoculation theexplants were transferred to culture rooms with temperaturemaintained at 25plusmn1ordmC during a 16 hours photoperiod with a lightintensity of 32 microM m-2s-1 The best in vitro growth rates of
Laelia tenebrosa plantlets were obtained using Knudson C 50supplemented with 2 g L-1 activated charcoal after 150 days ofculture
Index terms Orchid culture medium tissue culture
INTRODUCcedilAtildeO
A produccedilatildeo de orquiacutedeas a partir germinaccedilatildeo
assimbioacutetica eacute uma alternativa viaacutevel para obtenccedilatildeo de
grande nuacutemero de plantas em curto espaccedilo de tempo
suprindo assim a necessidade dos produtores de
orquiacutedeas na aquisiccedilatildeo de mudas
Na cultura de tecidos os meios de cultura
geralmente satildeo compostos de uma fonte de carboidratos
macro e micronutrientes e outras substacircncias como
vitaminas aminoaacutecidos accediluacutecares agente solidificante
reguladores de crescimento (GEORGE amp SHERRINGTON
1984) e eventualmente aditivos como antibioacuteticos carvatildeo
ativado e componentes complexos
Knudson (1922) observou que era possiacutevel o
cultivo de sementes em meio artificial contendo minerais e
accediluacutecar sem a presenccedila de fungos micorriacutezicos
Posteriormente em 1946 ele aperfeiccediloou esse meio de
cultura sendo atualmente o mais utilizado comercialmente
na germinaccedilatildeo e desenvolvimento de orquiacutedeas (ARDITTI
amp ERNST 1992) No entanto satildeo necessaacuterios estudos
(Recebido em 23 de fevereiro de 2006 e aprovado em 10 de julho de 2006)
supplemented with
ARAUJO A G de et al62
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
pois satildeo descritos vaacuterios meios de cultura para muitos
gecircneros e espeacutecies diferentes
No cultivo e subcultivo de placircntulas do gecircnero
Cattleya George et al (1987) sugerem o meio Knudson C
(1946) ou Reinert amp Mohr (1967) Segundo Arditti amp Ernst
(1992) os meios de propagaccedilatildeo para Cattleya Laelia
Laeliocattleya e Brassocattleya podem ser os mesmos
citados anteriormente Villalobos et al (1994) sugerem o
meio Vacin amp Went (1949) para Cattleya Encyclia e
Oncidium suplementado com 25 de aacutegua de coco e o
meio Knudson C suplementado com 60 g L-1 de polpa de
banana para orquiacutedeas do gecircnero Stanhopea
O carvatildeo ativado normalmente eacute adicionado ao meio
de cultura em concentraccedilotildees que variam de 02 a 3
(BEYL 2000) O seu efeito natildeo-seletivo pode proporcionar
resultados negativos na micropropagaccedilatildeo Pesquisas
relatam a adsorccedilatildeo de tiamina aacutecido nicotiacutenico
(WEATHERHEAD et al 1978) piridoxina aacutecido foacutelico
reguladores de crescimento e quelatos de ferro
(JOHANSSON et al 1990) Entre os efeitos proporcionados
pela adiccedilatildeo do carvatildeo ativado ao meio de cultura
principalmente agrave organogecircnese e agrave embriogecircnese estatildeo
escurecimento do meio de cultura favorecendo o
enraizamento adsorccedilatildeo de substacircncias inibitoacuterias
produzidas pelo proacuteprio meio ou explante adsorccedilatildeo de
reguladores de crescimento e outros compostos orgacircnicos
e liberaccedilatildeo de substacircncias naturalmente presentes no
carvatildeo que beneficiariam o crescimento in vitro das culturas
(PAN amp STADEN 1998)
Arena amp Pastur (2001) citam que a adiccedilatildeo de carvatildeo
ativado ao meio de cultura promoveu alongamento das
brotaccedilotildees de Berberis buxifolia mas reduziu o iacutendice de
multiplicaccedilatildeo Hazra et al (2002) relataram o efeito
sinergiacutestico do carvatildeo ativado na multiplicaccedilatildeo e
enraizamento de brotaccedilotildees de algodoeiro Amin amp Jaiswal
(1987) Anderson (1980) e Damiano (1978) relataram o efeito
favoraacutevel do carvatildeo quando utilizado em baixas
concentraccedilotildees no enraizamento de brotaccedilotildees de
morangueiro framboeseira e goiabeira respectivamente
A diversidade de resultados obtidos com a utilizaccedilatildeo de
carvatildeo ativado deve-se principalmente ao genoacutetipo da
espeacutecie em questatildeo agrave adsorccedilatildeo de algumas substacircncias
quiacutemicas e compostos orgacircnicos aleacutem de metaboacutelitos
toacutexicos liberados no cultivo in vitro (Wang amp Huang 1976)
Este trabalho teve como objetivo verificar efeito de
diferentes concentraccedilotildees de sais de Knudson C e carvatildeo
ativado sobre o crescimento in vitro de placircntulas de
orquiacutedea da espeacutecie Laelia tenebrosa (LA Rolfe) LA Rolfe
MATERIAL E MEacuteTODOS
Placircntulas da espeacutecie Laelia tenebrosa com 1 a 15
cm de comprimento oriundas de sementes germinadas in
vitro e contendo raiacutezes foram inoculadas em frascos
contendo 40 mL do meio de cultura Knudson C nas
concentraccedilotildees de 0 (apenas aacutegua destilada e aacutegar) 50 100
(concentraccedilatildeo da formulaccedilatildeo original) 150 e 200 de sais
minerais combinado com carvatildeo ativado (0 05 1 2 e 4
mg L-1) suplementado com sacarose (20 g L-1)
O pH do meio foi ajustado para 58 plusmn 01 antes da
adiccedilatildeo de aacutegar (6 g L-1) O meio foi vertido em frascos de
vidro com capacidade para 250 cm3 vedados com tampas
plaacutesticas transluacutecidas natildeo perfuradas e autoclavados agrave
pressatildeo de 11 atm e agrave temperatura do 121degC durante 20
minutos Apoacutes a inoculaccedilatildeo os frascos contendo os
explantes foram mantidos em sala de crescimento com
irradiacircncia em torno de 32 mmol m-2 s-1 temperatura de 25 plusmn
1degC e fotoperiacuteodo de 16 horas
O delineamento experimental utilizado foi
inteiramente casualizado em esquema fatorial 5 x 5 com
quatro repeticcedilotildees de cinco placircntulas cada uma Decorridos
150 dias avaliou-se a meacutedia do nuacutemero de folhas nuacutemero
de raiacutezes comprimento da maior raiz comprimento da parte
aeacuterea e massa fresca de placircntulas Os dados foram
comparados por meio de regressatildeo polinomial empregando-
se o programa Sisvar (FERREIRA 2000)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Apenas para a variaacutevel nuacutemero de folhas houve
interaccedilatildeo entre os niacuteveis de sais e carvatildeo ativado Poreacutem
Crescimento in vitro de Laelia tenebrosa (Orchidaceae) 63
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
por meio do teste F somente as concentraccedilotildees de 50 e
100 de sais do meio Knudson C foram significativas em
relaccedilatildeo agraves concentraccedilotildees de carvatildeo ativado
Os melhores resultados (65 e 585) foram
verificados com 50 (metade) dos sais de Knudson C
combinado com 275 g L-1 de carvatildeo ativado e 100 de
sais com 4 g L-1 de carvatildeo respectivamente (Figura 1)
Com o aumento da concentraccedilatildeo do meio de cultura haacute
necessidade de maior concentraccedilatildeo de carvatildeo Sendo
assim o meio com 50 de sais aleacutem de proporcionar
melhores resultados eacute menos oneroso
Estes resultados contradizem os de Silva et al
(2003) que verificaram que a adiccedilatildeo de carvatildeo ativado ao
FIGURA 1 ndash Nuacutemero de folhas em placircntulas de Laeliatenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees de saisde Knudson C e carvatildeo ativado
meio de cultura inibe a formaccedilatildeo de folhas em placircntulas de
Brassocattleya lsquoPastoralrsquo x Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo
O efeito natildeo seletivo do carvatildeo ativado pode proporcionar
resultados negativos na micropropagaccedilatildeo (PAN amp
STADEN 1998)
Agrave medida em que aumentaram as concentraccedilotildees de
sais de Knudson C maiores quantidades de raiacutezes foram
formadas (Figura 2A) Observou-se maior nuacutemero de raiz
(43) com 965 de sais Para o fator carvatildeo ativado as
melhores respostas (395 raiacutezes) foram verificadas com a
utilizaccedilatildeo de 304 g L-1 adicionadas ao meio de cultura
(Figura 2B)
Para muitas espeacutecies o enraizamento eacute favorecido
pela adiccedilatildeo de carvatildeo ativado ao meio de cultura Hazra et
al (2002) relataram o efeito sinergiacutestico do carvatildeo ativado
na multiplicaccedilatildeo e enraizamento de brotaccedilotildees de
algodoeiro O meio MS com metade dos sais minerais
acrescido de 20 g L-1 de sacarose 7 g L-1 de aacutegar e 1 g L-1 de
carvatildeo ativado promoveu maior quantidade de raiacutezes em
placircntulas de Cattleya nobilior Rchb f (REIS et al 2003)
Segundo Paiva et al (2005) aleacutem de um equiliacutebrio
hormonal favoraacutevel agrave formaccedilatildeo de raiacutezes outros fatores
internos tecircm sido relacionados com a iniciaccedilatildeo do processo
de enraizamento como presenccedila de sacarose alta relaccedilatildeo
CN e nutrientes minerais (foacutesforo caacutelcio zinco e boro) O
meio Knudson C natildeo possui micronutrientes apresenta
uma concentraccedilatildeo maior de caacutelcio e tem baixas
FIGURA 2 ndash Nuacutemero de raiacutezes em placircntulas de Laelia tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees de sais deKnudson C (A) e concentraccedilotildees de carvatildeo ativado (B)
ARAUJO A G de et al64
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
concentraccedilotildees de N e K em relaccedilatildeo ao MS e WPM o que
provavelmente favoreceu tanto o nuacutemero quanto o
comprimento de raiacutezes (PASQUAL 2001)
O maior comprimento de raiz (331 cm) foi verificado
com a utilizaccedilatildeo de 100 de sais de Knudson C A partir do
ponto maacuteximo (100) houve diminuiccedilatildeo do comprimento
radicular provavelmente devido ao desbalanccedilo nutricional
(Figura 3A) Com o aumento das concentraccedilotildees de carvatildeo
ativado houve um incremento linear no comprimento de
raiacutezes Melhores resultados foram observados com a
utilizaccedilatildeo de 4 g Lndash1 de carvatildeo ativado (Figura 3B) Como a
relaccedilatildeo foi direta pode-se inferir que o efeito estimulante
do carvatildeo ativado no comprimento da maior raiz continuaria
para concentraccedilotildees superiores a 4 g L-1
A adiccedilatildeo de carvatildeo ativado no meio de cultura foi
beneacutefica promovendo tanto o nuacutemero quanto o
crescimento de raiacutezes O carvatildeo conteacutem impurezas que
podem favorecer o crescimento de raiacutezes jaacute existentes e
induzir emissatildeo de novas raiacutezes (PASQUAL 2001)
Melhores resultados para comprimento da parte
aeacuterea (18 cm) foram observados quando se utilizou o
meio Knudson C na concentraccedilatildeo de 121 de sais (Figura
4A) poreacutem na concentraccedilatildeo de 50 obtiveram-se
explantes com 17 cm de comprimento Essa diferenccedila
observada (01 cm) eacute muito pequena o que natildeo justifica a
utilizaccedilatildeo de um meio mais concentrado mas a reduccedilatildeo
do mesmo agrave sua metade
O enraizamento in vitro pode ser favorecido com o
uso de meio de cultura com a metade ou 75 da
concentraccedilatildeo normal de sais Em algumas espeacutecies altas
concentraccedilotildees de sais principalmente a presenccedila de iacuteons
amocircnio favorecem o desenvolvimento de raiacutezes enquanto
que em outras podem ser inibidoras (PASQUAL et al
2001)
O maior comprimento da parte aeacuterea (19 cm) foi
obtido na presenccedila de 4 g Lndash1 de carvatildeo ativado (Figura
4B) a concentraccedilatildeo de 2 g Lndash1 proporcionou um
comprimento de 18 cm Comparando-se os niacuteveis 4 e 2 g Lndash1
de carvatildeo ativado nota-se pequena diferenccedila (01 cm) o
que justifica a utilizaccedilatildeo de 2 g Lndash1
O carvatildeo ativado conteacutem impurezas que quando
liberadas no meio de cultura podem beneficiar ou natildeo o
crescimento in vitro Simotildees et al (1999) verificaram que a
concentraccedilatildeo de 1 g L-1 de carvatildeo ativado acrescida ao
meio Knudson C proporciona o melhor desenvolvimento
de brotos de Epidendrum sp e Dendrobium sp
Maior massa fresca de placircntulas (0144g) foi
verificada com a utilizaccedilatildeo de 50 de sais de Knudson C
ponto a partir do qual houve diminuiccedilatildeo no peso (Figura
5A) Provavelmente essa reduccedilatildeo ocorreu devido agrave
toxidez
A utilizaccedilatildeo de 4 g L-1 de carvatildeo ativado
proporcionou uma massa de 0185 g nas placircntulas frescas
(Figura 5B)
FIGURA 3 ndash Comprimento da maior raiz em placircntulas de Laelia tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees desais de Knudson C (A) e carvatildeo ativado (B)
Crescimento in vitro de Laelia tenebrosa (Orchidaceae) 65
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
FIGURA 4 ndash Comprimento da parte aeacuterea em placircntulas de Laelia tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees desais de Knudson C (A) e carvatildeo ativado (B)
FIGURA 5 ndash Massa fresca de placircntulas de L tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees de sais de Knudson C(A) e carvatildeo ativado (B)
O carvatildeo ativado eacute comumente utilizado na cultura
de tecidos de plantas Seu efeito eacute atribuiacutedo agrave adsorccedilatildeo de
substacircncias toacutexicas produzidas pelas plantas adsorccedilatildeo
de fitorreguladores do meio e escurecimento do meio onde
se desenvolvem as raiacutezes das plantas (GEORGE 1993)
O melhor desenvolvimento de Phalaenopsis in
vitro ocorreu na presenccedila de carvatildeo ativado na
concentraccedilatildeo de 2 g L-1 indicando que este possa ser um
elemento importante no processo (BRESSAN et al 1999)
Apesar do carvatildeo ativado na concentraccedilatildeo de 4 g
L-1 ter proporcionado melhores resultados verificou-se que
na concentraccedilatildeo de 2 g L-1 os efeitos apresentam uma
diferenccedila miacutenima Embora o carvatildeo ativado natildeo seja o
componente de maior custo no preparo de meio de cultura
a sua reduccedilatildeo juntamente com os sais minerais eacute
economicamente favoraacutevel especialmente para a produccedilatildeo
comercial de mudas
CONCLUSAtildeO
A adiccedilatildeo de 2 g L-1 de carvatildeo ativado ao meio de
cultura Knudson C com metade (50) de sais minerais
promoveu melhor crescimento em placircntulas de Laelia
tenebrosa cultivadas in vitro
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PROPAGACcedilAtildeO IN VITRO DE PLAcircNTULAS DE ORQUIacuteDEA EMDIFERENTES MEIOS DE CULTURA E CONCENTRACcedilOtildeES
DE CITOCININA
IN VITRO PROPAGATION OF ORCHID PLANTLETS CULTIVATED IN DIFFERENTCULTURE MEDIA AND CYTOKININ CONCENTRATIONS
APARECIDA GOMES DE ARAUJO1 MOACIR PASQUAL2 ADRIANO BORTOLOTTI DA SILVA3 FABIacuteOLA VILLA3 HERMIacuteNIO SOUZA ROCHA3 FERNANDA CARVALHO COSTA4
1Doutoranda em AgronomiaFitotecnia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash agaraujo2003yahoocombr2Professor Titular Departamento AgriculturaDAG ndash Universidade Federal de Lavras UFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200000 ndash Lavras MG ndash mpasqualuflabr3Doutorando em Agronomia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200000 ndash Lavras MG4Departamento de AgriculturaDAG ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash fecostapuryahoocombr
RESUMOA taxa de multiplicaccedilatildeo de orquiacutedeas a partir de meacutetodos
convencionais eacute bastante baixa natildeo atendendo as necessidadescomerciais A cultura de tecidos permite maiores taxas demultiplicaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de plantas uniformes e sadiasObjetivou-se estudar a influecircncia da citocinina BAP (6-benzilaminopurina) em diferentes meios de cultura napropagaccedilatildeo in vitro de placircntulas hiacutebridas de BrassocattleyalsquoPastoralrsquox Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo Placircntulas comaproximadamente 15plusmn05 cm de comprimento obtidasassimbioticamente foram transferidas para frascos comcapacidade de 250 cm3 contendo 40 mL das formulaccedilotildees salinasde MS WPM e Knudson C combinados com 0 05 10 20 e40 mg L-1 de BAP acrescidos de 2 g L-1 de carvatildeo ativadosolidificado com 6 g L-1 de aacutegar e pH ajustado para 58plusmn01Apoacutes a inoculaccedilatildeo os frascos foram incubados a 25plusmn2oC 35igravemolm-2s-1 de intensidade luminosa e sob fotoperiacuteodo de 16horas Apoacutes 90 dias observou-se que melhores resultados parapropagaccedilatildeo in vitro em placircntulas de orquiacutedea Bc lsquoPastoralrsquo x LclsquoAmber Glowrsquo satildeo obtidos com o meio WPM A suplementaccedilatildeode 4 mg L-1 de BAP no meio WPM favorece o crescimento invitro Para a multiplicaccedilatildeo maior quantidade de brotos eacuteconseguida em meio MS na ausecircncia de BAP
Termos para indexaccedilatildeo Orquiacutedea crescimento in vitrocitocinina
ABSTRACTThe multiplication rate of orchids by conventional
methods is considerably low and does not attend its commercialneeds Tissue culture results in larger multiplication rates andproduces uniform and healthy orchid plantlets The objective ofthis work was to study the influence of the cytokinin BAP (6-benzilaminopurine) in different culture media for ther in vitropropagation of Brassocattleya lsquoPastoralrsquox Laeliocattleya lsquoAmberGlowrsquo hybrid plantlets Plantlets measuring approximately 15plusmn 05 cm length deriving from in vitro germination were inoculated
in flasks of 250 cm3 volume containing 40 mL MS WPM andKnudson C salt formulations combined with BAP (0 05 1 2and 4 mg L-1) supplemented with 2 g L-1 activated charcoalsolidified with 6 g L-1 agar and pH adjusted for 58 plusmn 01 Afterthe inoculation the plantlets maintained in a growth room at25plusmn2ordmC 35 mMol m-2 s-1 light intensity and 16 hoursphotoperiod After 90 days the best results for the in vitropropagation of orchid plantlets Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquowere obtained with half strength WPM The supplementation of4 mg L-1 BAP to the WPM medium favors in vitro growth Forthe multiplication phase the largest number of sprouts is achievedwith full strength MS medium in the absence of BAP
Index terms Orchid in vitro growth cytokinin
INTRODUCcedilAtildeO
As orquiacutedeas satildeo consideradas as plantas
ornamentais haacute mais tempo cultivadas pelo homem
Pertencem agrave famiacutelia Orchidaceae a maior entre as
monocotiledocircneas e tambeacutem entre as plantas ornamentais
com 600 - 800 gecircneros e 25000-35000 espeacutecies (SHEEHAN
1983) totalizando 7 das plantas ornamentais do mundo
(Van Der PIJL amp DODSON 1966)
A propagaccedilatildeo de orquiacutedeas pode ser tanto
vegetativa quanto por meio de sementes Estas embora
produzidas em grande quantidade natildeo possuem
endosperma funcional prescindindo para tanto da
associaccedilatildeo simbioacutetica com fungos micorriacutezicos dentre os
quais a Rhizoctonia que eacute um dos gecircneros mais importante
(PIERIK 1987 SHEEHAN 1983)
(Recebido em 08 de dezembro de 2005 e aprovado em 10 de julho de 2006)
Propagaccedilatildeo in vitro de placircntulas de orquiacutedea 69
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 68-73 2006
Knudson (1922) observou que era possiacutevel o cultivo
de sementes em meio artificial contendo apenas sais
nutritivos e accediluacutecar na ausecircncia de fungos Posteriormente
em 1946 o mesmo autor aperfeiccediloou este meio de cultura
sendo atualmente um dos mais utilizados comercialmente
na germinaccedilatildeo e desenvolvimento de orquiacutedeas (ARDITTI
amp ERNST 1992) No entanto satildeo necessaacuterios estudos
pois satildeo descritos vaacuterios meios de cultura para muitos
gecircneros e espeacutecies diferentes O meio de cultura mais
utilizado na cultura de tecidos em geral eacute o MS (Murashige
amp Skoog 1962) podendo-se encontrar o uso de outros
meios como Knudson C (1946) e WPM (Wood Plant
Medium) de Loyd amp McCown (1980)
Reguladores de crescimento em diferentes
concentraccedilotildees tecircm sido usados conforme a espeacutecie e a
metodologia utilizada Podem ser necessaacuterios para a
germinaccedilatildeo de sementes formaccedilatildeo de calos e brotaccedilotildees
adventiacutecias (GRATTAPAGLIA amp MACHADO 1998
PASQUAL 2001)
O regulador de crescimento BAP (6-
benzilaminopurina) eacute uma citocinina largamente utilizada
para estimular a induccedilatildeo de brotos em plantas ornamentais
Para o cultivo in vitro de orquiacutedeas do grupo Cattleya a
citocinina BAP geralmente eacute utilizada nas concentraccedilotildees
que variam entre 005 e 10 mg L-1 (CARVALHO 2002)
Martini et al (2001) trabalhando com a orquiacutedea
Gongora quinquenervis observaram que a presenccedila do
BAP inibe a multiplicaccedilatildeo de calos e o potencial
organogecircnico Silva (2003) concluiu que para o estaacutedio de
subcultivo de Brassocattleya lsquoPastoralrsquo x Laeliocattleya
lsquoAmber Glowrsquo natildeo haacute necessidade da adiccedilatildeo de BAP como
estiacutemulo ao desenvolvimento geral do explante Melhor
proliferaccedilatildeo de brotos formaccedilatildeo de raiacutezes nuacutemero de
folhas e comprimento de brotos em Dendrobium foram
obtidos com 25 mg L-1 de BAP + 05 mg L-1 de ANA
adicionados ao meio MS (TALUKDER et al 2003)
Aleacutem do tipo de meio outro aspecto importante na
multiplicaccedilatildeo in vitro estaacute relacionado com o tipo de
citocinina e sua concentraccedilatildeo sendo ambos determinantes
no sucesso da micropropagaccedilatildeo (GRATTAPAGLIA amp
MACHADO 1998)
O maior entrave no processo de micropropagaccedilatildeo
de orquiacutedeas estaacute relacionado ao tempo necessaacuterio para a
produccedilatildeo de mudas a partir de plantas hiacutebridas
selecionadas e a utilizaccedilatildeo de meio de cultura adequado
para cada espeacutecie Assim objetivou-se estudar o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de BAP e formulaccedilotildees de minerais
nutritivos em meios de cultura na propagaccedilatildeo in vitro de
placircntulas de orquiacutedea oriundas do hiacutebrido Brassocattleya
lsquoPastoralrsquo x Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo
MATERIAL E MEacuteTODOS
Placircntulas hiacutebridas oriundas de sementes
germinadas assimbioticamente em meio Knudson C
obtidas do cruzamento entre Brassocattleya lsquoPastoralrsquo x
Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo com aproximadamente
15plusmn05 cm de comprimento foram transferidas para frascos
de 250 cm3 de capacidade contendo 40 mL de meio de
cultura e vedados com tampas plaacutesticas transluacutecidas Os
tratamentos consistiram de diferentes formulaccedilotildees salinas
(MS WPM e Knudson C em suas formulaccedilotildees originais)
combinadas com 0 05 10 20 e 40 mg L-1 de BAP
acrescidos de 2 g L-1 de carvatildeo ativado solidificado com
6 g L-1 de aacutegar e pH ajustado para 58plusmn01 antes da
autoclavagem obtida a 121ordmC e 1 atm por 20 minutos
Posteriormente agrave inoculaccedilatildeo os frascos foram
transferidos para sala de crescimento com temperatura
de 25plusmn2ordmC fotoperiacuteodo de 16 horas e 35 mmolm-2s-1 de
intensidade luminosa fornecida por lacircmpadas do tipo
(Grow-lux) e luz do dia especial O delineamento
experimental utilizado foi inteiramente casualizado no
esquema fatorial 3 x 5 com cinco repeticcedilotildees de quatro
placircntulas cada sendo cada repeticcedilatildeo composta por um
frasco
Apoacutes 90 dias da instalaccedilatildeo do experimento foram
avaliados nuacutemero meacutedio de brotos comprimento meacutedio
da parte aeacuterea nuacutemero meacutedio de raiacutezes nuacutemero meacutedio de
folhas e meacutedia da massa fresca total de placircntulas
ARAUJO A G de et al70
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 68-73 2006
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Para a variaacutevel nuacutemero de folhas natildeo houve
significacircncia dos fatores isolados nem da interaccedilatildeo entre
eles O nuacutemero de raiacutezes e massa fresca total de placircntulas
apresentaram significacircncia apenas para o fator meio de
cultura enquanto que para nuacutemero de brotos e
comprimento da parte aeacuterea a interaccedilatildeo dos fatores foi
significativa (Tabela 1)
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de brotos observou-se
interaccedilatildeo entre os fatores BAP e os meios de cultura
utilizados (Tabela 1) Poreacutem pelo teste F verificou-se que
apenas o meio MS foi significativo em relaccedilatildeo agraves
concentraccedilotildees de BAP (Figura 1)
O maior nuacutemero de brotos (334) foi registrado na
formulaccedilatildeo de MS adicionado de 40 mg L-1 de BAP
Entretanto na ausecircncia dessa citocinina foi observada a
formaccedilatildeo de 304 brotosplanta (Figura 1) Diante da
pequena diferenccedila na quantidade meacutedia de brotos
formados entre a maior concentraccedilatildeo e o tratamento sem
o regulador de crescimento justifica-se a utilizaccedilatildeo do
meio de cultura sem o BAP Estes resultados concordam
com Silva (2003) que obteve maior nuacutemero de brotos (2
brotos) na ausecircncia de BAP para esse mesmo hiacutebrido
poreacutem em meio Knudson C
A natildeo utilizaccedilatildeo de reguladores de crescimento
adicionados ao meio de cultura vai influenciar na
reduccedilatildeo dos custos de produccedilatildeo de mudas jaacute que esse
eacute um dos componentes mais onerosos Isso eacute
extremamente importante principalmente para
laboratoacuterios comerciais
TABELA 1 ndash Resumo da anaacutelise de variacircncia para as caracteriacutesticas meacutedias de nuacutemero de folhas (NF) nuacutemero de raiacutezes(NR) nuacutemero de brotos (NB) comprimento da parte aeacuterea (CPA) e massa fresca total de placircntulas (MFP) e respectivoscoeficientes de variaccedilatildeo (CV)
significativo a 1 e 5 de probabilidade respectivamente pelo teste F
FIGURA 1 ndash Efeito do meio de cultura MS e concentraccedilotildees de BAP no nuacutemero meacutedio de brotos em placircntulas hiacutebridasde Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo apoacutes 90 dias da incubaccedilatildeo
Fontes de variaccedilatildeo GL Quadrados meacutedios
NF NR NB CPA MFP Meios 2 125683 ns 162740 01483 ns 53139 02372 BAP 4 186198 ns 44693 ns 04408 ns 03373 ns 00075 ns
Meio x BAP 8 243984 ns 13417 ns 17417 13579 00459 ns
Resiacuteduo 45 124475 21329 05055 05961 00662 CV () 3467 3081 2801 2443 5100
Propagaccedilatildeo in vitro de placircntulas de orquiacutedea 71
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O estiacutemulo agrave brotaccedilatildeo em placircntulas de Spathoglottis
plicata Griff ocorreu em meio MS suplementado com 10
mg L-1 de BAP e 25 mg L-1 de ANA tendo o enraizamento
estimulado com 20 mg L-1 de AIB (NAYAK et al 1999)
TDZ tambeacutem eacute utilizado em associaccedilatildeo com BAP para
regeneraccedilatildeo de brotos de Rhynchostylis (BUI Le al 1999)
e de Anoectochilus (LI et al 1999) todas orquidaceaes
Observou-se interaccedilatildeo entre o tipo de meio de
cultura e o BAP no que diz respeito ao comprimento de
parte aeacuterea das placircntulas (Tabela 1) Pelo teste de F apenas
o meio WPM foi significativo em relaccedilatildeo agraves concentraccedilotildees
de BAP (Figura 2)
O maior comprimento da parte aeacuterea (47 cm) foi
observado quando se utilizou o meio WPM combinado
com 40 mg L-1 de BAP (Figura 2) Como a relaccedilatildeo foi direta
pode-se inferir que o efeito estimulatoacuterio do BAP sobre o
crescimento da parte aeacuterea continuaria mesmo em
concentraccedilotildees maiores que 40 mg L-1 Talukder et al (2003)
obtiveram melhor comprimento de brotos (0472 cm) em
placircntulas de Dendrobium com utilizaccedilatildeo de 25 mg L-1 de
BAP + 05 mg L-1 de ANA adicionados ao meio MS
Relativo ao nuacutemero meacutedio de raiacutezes houve
significacircncia apenas para o fator meio de cultura (Tabela 1)
Na Tabela 2 verifica-se que os maiores valores foram obtidos
com os meios WPM (557) seguido do MS (487) sendo os
menores valores verificados no meio Knudson C (378) A
emissatildeo de novas raiacutezes eacute favorecida pelo caacutelcio e pelo boro
O meio Knudson C apresenta uma concentraccedilatildeo maior de
caacutelcio e menor de boro em relaccedilatildeo aos meios MS e WPM
que possuem concentraccedilotildees semelhantes de ambos
Segundo Pierik (1987) em concentraccedilotildees mais elevadas
(1 a 10 mg L-1) as citocininas podem induzir a formaccedilatildeo de
gemas adventiacutecias quebrando a dominacircncia apical e retardando
a formaccedilatildeo de raiacutezes Talukder et al (2003) encontraram maior
nuacutemero de raiacutezes (193explante) em placircntulas de Dendrobium
com utilizaccedilatildeo de 25 mg L-1 de BAP + 05 mg L-1 de ANA
adicionados ao meio MS O estiacutemulo ao enraizamento em
Spathoglottis plicata ocorreu em meio MS suplementado com
20 mg L-1 de AIB (NAYAK et al 1999)
FIGURA 2 ndash Comprimento meacutedio da parte aeacuterea em placircntulas hiacutebridas Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo cultivadas emmeio de cultura WPM e diferentes concentraccedilotildees de BAP
TABELA 2 ndash Efeito de diferentes meios de cultura sobreo nuacutemero meacutedio de raiacutezes em placircntulas hiacutebridas de BclsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo
Meios de Cultura Nuacutemero meacutedio de raiacutezes
WPM 557 a MS 487 a KC 378 b
Meacutedias seguidas pela mesma letra natildeo diferem entre sipelo teste de Scott-Knott a 5
ARAUJO A G de et al72
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 68-73 2006
O efeito ora inibitoacuterio ora estimulatoacuterio dos
fitorreguladores na formaccedilatildeo de brotos e raiacutezes em
diferentes plantas pode estar associado agrave proacutepria
concentraccedilatildeo bem como a absorccedilatildeo dos reguladores de
crescimento pelo substrato (GEORGE 1996) agrave habituaccedilatildeo
(SANTANA amp PAIVA 2001) ou agrave deficiecircncia de proteiacutena
ligante promotora da atuaccedilatildeo das citocininas (TAIZ amp
ZEIGER 1998)
O nuacutemero de folhas natildeo apresentou diferenccedilas
significativas para os tratamentos estudados
isoladamente nem houve interaccedilatildeo entre eles (Tabela 1)
Talukder et al (2003) obtiveram maior nuacutemero de folhas
(425placircntula) em Dendrobium com utilizaccedilatildeo de 25 mg L-
1 de BAP + 05 mg L-1 de ANA adicionados ao meio MS
Para massa fresca de placircntulas houve significacircncia
apenas para o fator meio de cultura isoladamente (Tabela
1) Atraveacutes do teste de meacutedias constatou-se maior massa
de placircntulas frescas nos meios WPM e MS com 0524 e
0503g respectivamente Resultado inferior (0326g) foi
registrado em meio Knudson C (Tabela 3)
TABELA 3 ndash Efeito do meio de cultura na massa frescatotal de placircntulas do hiacutebrido Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmberGlowrsquo
Meios de Cultura Massa fresca total de placircntulas (g)
WPM 0524 a MS 0503 a KC 0326 b
Meacutedias seguidas pela mesma letra natildeo diferem entre sipelo teste de Scott-Knott a 5
Dignart (2003) estudando a germinaccedilatildeo in vitro
de sementes de Cattleya nobilior Rchbf em diferentes
meios de cultura (MS WPM Knudson C e B5 de
GAMBORG et al 1968) observou que natildeo houve
diferenccedilas entre os meios utilizados O BAP adicionado
ao meio de cultura provocou aumento da taxa de brotaccedilatildeo
a partir de 1 igravemolL
Segundo (PASQUAL 2001) os meios MS e WPM
possuem concentraccedilotildees similares de micronutrientes e satildeo
ricos em nitrogecircnio (N) e potaacutessio (K) Jaacute o meio Knudson C
natildeo possui micronutrientes e tem baixas concentraccedilotildees de
N e K em relaccedilatildeo ao MS e WPM Os melhores resultados
para as variaacuteveis analisadas foram observados em meio WPM
e MS Essa resposta provavelmente deveu-se ao fato de
que o meio Knudson C possui diferentes sais minerais e
embora seja muito utilizado na germinaccedilatildeo de sementes de
orquiacutedeas parece natildeo propiciar condiccedilotildees satisfatoacuterias para
o desenvolvimento de placircntulas de algumas espeacutecies de
orquiacutedeas
Sabe-se que existe uma relaccedilatildeo entre o nuacutemero de
brotos e seu tamanho e nessa relaccedilatildeo quanto maior for o
nuacutemero de brotos menor o tamanho dos mesmos
(GEORGE 1996) Essa relaccedilatildeo fez-se presente ateacute a
concentraccedilatildeo de 20 mg L-1 de BAP em Bc lsquoPastoralrsquo x Lc
lsquoAmber Glowrsquo No entanto em concentraccedilotildees superiores
tanto o nuacutemero quanto o comprimento dos brotos
aumentaram Tal diversidade de resultados estaacute
relacionada principalmente ao genoacutetipo da espeacutecie meio
de cultura e possivelmente agrave interferecircncia na accedilatildeo dos
reguladores de crescimento
Segundo Malaure et al (1991) diferentes efeitos
dos reguladores de crescimento podem ocorrer para
diferentes espeacutecies inclusive variaccedilotildees dentro de uma
mesma espeacutecie Em orquiacutedeas o efeito dos reguladores de
crescimento e de meios de cultura satildeo diversificados
principalmente quando se utiliza um hiacutebrido trigeneacuterico
com alto grau de heterozigose
CONCLUSOtildeES
Melhores resultados para propagaccedilatildeo in vitro de
placircntulas de orquiacutedea Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo satildeo
obtidos com o meio WPM A suplementaccedilatildeo de 4 mg L-1 de
BAP no meio WPM favorece o crescimento in vitro Para
a multiplicaccedilatildeo maior quantidade de brotos eacute conseguida
em meio MS na ausecircncia de BAP
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SILVEIRA D G et al74
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
EFEITO DO VIacuteRUS DAS ESTRIAS DA BANANEIRA NAMICROPROPAGACcedilAtildeO E NO CRESCIMENTO DAS PLANTAS DA
CULTIVAR CAIPIRA DURANTE A ACLIMATIZACcedilAtildeO1
EFFECT OF BANANA STREAK VIRUS ON MICROPROPAGATION AND PLANTGROWTH OF CULTIVAR CAIPIRA DURING ACLIMATIZATION
DANIELA GARCIA SILVEIRA2 ANTOcircNIO DA SILVA SOUZA3 PAULO ERNESTO MEISSNER FILHO3TALES MILER SOARES4 RANULFO CORREA CALDAS3 KAacuteTIA REGINA BARBOSA LEAtildeO5
1Parte da Dissertaccedilatildeo de Mestrado apresentada pelo primeiro autor ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias Agraacuterias da Escola de AgronomiaUFBA ndash Cruz das Almas BA2Doutoranda em Botacircnica ndash Universidade Estadual de Feira de SantanaUEFS ndash Feira de Santana BA ndash danielagsigcombr3Pesquisador da Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical ndash Caixa Postal 007 ndash 44380-000 ndash Cruz das Almas BA4Doutorando da Escola Superior Luis de QueirozEsalq ndash Piracicaba SP ndash tmsoaresesalquspbr5Engenheira Agrocircnoma MSc EBDA ndash Cruz das Almas BA ndash 44380-000 ndash krbleaohotmailcom
(Recebido em 12 de abril de 2006 e aprovado em 28 de agosto de 2006)
RESUMOAvaliaram-se os efeitos da infecccedilatildeo pelo viacuterus das estrias
de bananeira (Banana Streak Virus BSV) no desenvolvimento invitro e no crescimento das plantas da cultivar Caipira durante aaclimatizaccedilatildeo Utilizou-se o delineamento experimentalinteiramente casualizado com dois tratamentos plantas sadias eplantas infectadas pelo BSV com respectivamente 24 e 28repeticcedilotildees Os explantes foram desinfestados e estabelecidos emmeio MS baacutesico suplementado com 30 gL de sacarose solidificadocom 2 gL de lsquoPhytagelrsquo e pH ajustado em 58 Foram efetuadoscinco subcultivos em meio com 4 mgL de BAP (6-benzilaminopurina) e as plantas obtidas foram enraizadas nessemesmo meio de cultura sem reguladores de crescimento Apoacutesessa etapa transferiram-se as plantas para a aclimatizaccedilatildeo emcacircmara uacutemida onde permaneceram por 30 dias Avaliaram-se astaxas de multiplicaccedilatildeo a presenccedila in vitro dos sintomas do BSVnos explantes provenientes das plantas infectadas durante amicropropagaccedilatildeo e aclimatizaccedilatildeo as perdas por contaminaccedilatildeoenvolvendo fungos e bacteacuterias nas fases da micropropagaccedilatildeo e aaltura das plantas na fase da aclimatizaccedilatildeo A infecccedilatildeo pelo BSVnatildeo afetou significativamente a multiplicaccedilatildeo e o crescimento invitro das plantas sendo os sintomas do viacuterus visiacuteveis em todasas fases da micropropagaccedilatildeo e na aclimatizaccedilatildeo das plantasinfectadas A maior porcentagem de contaminaccedilatildeo ocorreu nafase de estabelecimento in vitro dos explantes independentementedos tipos de plantas utilizadas Apoacutes 30 dias de aclimatizaccedilatildeo asplantas com BSV apresentaram altura inferior agraves plantas sadiasA presenccedila do viacuterus natildeo influenciou a taxa de multiplicaccedilatildeo dosexplantes poreacutem afetou o crescimento das plantas infectadas
Termos para indexaccedilatildeo Musa BSV cultura de tecidospropagaccedilatildeo in vitro
ABSTRACTThe effects of the banana streak virus (BSV) infection on
in vitro development of the cultivar Caipira were evaluated The
used experimental design was a completely randomized withtwo treatments healthy plants and plants infected by BSV with24 and 28 replications respectively The explants weredisinfected and established in a basic MS medium supplementedwith 30 gL sucrose solidified with 2 gL lsquoPhytagelrsquo and pHadjusted to 58 Five subcultures were carried out in a mediumcontaining 4 mgL BAP (6-benzylaminopurine) and the plantletswere rooted in the same culture medium without growthregulators Afterwards the plantlets were transferred to a humidchamber for acclimatization during a 30-day periodMultiplication rates presence of BSV symptoms on in vitroexplants obtained from plants infected during themicropropagation and acclimatization periods losses caused byfungal and bacterial contamination and plantlet height at theacclimatization stage were evaluated The infection by BSVpresented no significant effect on the multiplication rate and invitro plant growth although the virus symptoms were visible inall the micropropagation phases and during the acclimatizationof infected plants The highest percentage of contaminationoccurred during the in vitro establishment phase regardless theused plants After 30 days of acclimatization the plants withBSV presented a lower height compared to the healthy plantsAlthough the presence of the virus had no influence on the explantmultiplication rate it affected the growth of infected plants
Index terms Musa BSV tissue culture in vitro propagation
INTRODUCcedilAtildeO
As bananeiras estatildeo sujeitas as vaacuterias doenccedilas
causadas por fungos bacteacuterias nematoacuteides e viacuterus que
satildeo limitantes agrave sua capacidade de produccedilatildeo Entre as
viroses que ocorrem no Brasil destaca-se a causada pelo
viacuterus das estrias da bananeira (Banana streak virus BSV)
Efeito do viacuterus das estrias da bananeira 75
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
que eacute particularmente importante para os programas de
melhoramento geneacutetico e de multiplicaccedilatildeo comercial de
cultivares uma vez que pode ser incorporada ao genoma e
transmitida pelas sementes de plantas infectadas
(DANIELLS et al 1995) aleacutem de natildeo existir um meacutetodo
eficiente para limpar uma planta infectada com BSV
(LOCKHART 1994)
Esse viacuterus natildeo eacute transmitido mecanicamente sendo as
mudas infectadas sua principal forma de disseminaccedilatildeo
(LOCKHART amp AUSTREY 1988 LOCKHART 1994) A
transmissatildeo eacute feita de maneira semi-persistente pela cochonilha-
dos-citros Planococcus citri Risso e pela cochonilha-da-cana-
de-accediluacutecar Saccharicoccus sacchari cocherell (LOCKHART
1993 LOCKHART amp AUSTREY 1988)
O BSV inicialmente causa na bananeira um estriado
cloroacutetico de linhas descontiacutenuas dispersas e concentradas
em partes da lacircmina foliar Com o envelhecimento das
folhas o estriado causa necrose de coloraccedilatildeo marrom-cafeacute
a negro (RAMIREZ amp RIVERA 1994) As plantas
infectadas geralmente natildeo mostram sintomas em todas as
folhas (CORDEIRO amp KIMATI 1997 LOCKHART 1986)
Outros sintomas do BSV satildeo a reduccedilatildeo do vigor da planta
e a diminuiccedilatildeo do tamanho dos frutos que tambeacutem ficam
deformados (RAMIREZ amp RIVERA 1994)
Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos
da infecccedilatildeo pelo BSV na multiplicaccedilatildeo in vitro e no
crescimento durante a aclimatizaccedilatildeo das plantas de
bananeira da cultivar Caipira Aleacutem disso avaliou-se a taxa
de contaminaccedilatildeo por fungos e bacteacuterias na etapas da
micropropagaccedilatildeo devido a importacircncia dessa variaacutevel na
multiplicaccedilatildeo in vitro das plantas
MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo dos efeitos do BSV na micropropagaccedilatildeo
da cultivar Caipira (grupo AAA) foi conduzido no
Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos da Embrapa Mandioca
e Fruticultura Tropical Utilizou-se o delineamento
experimental inteiramente casualizado com dois
tratamentos plantas sadias com 24 repeticcedilotildees coletadas
no Banco de Germoplasma de Bananeira da Embrapa
Mandioca e Fruticultura Tropical e plantas infectadas com
BSV com 28 repeticcedilotildees Foram usadas mudas do tipo
chifrinho sendo que as matrizes infectadas com BSV com
altura meacutedia de 12 cm foram infestadas pela cochonilha
vetora Planacoccus citri Risso alimentadas em folhas de
banana lsquoMysorersquo com sintomas de BSV em casa-de-
vegetaccedilatildeo Aproximadamente 15 dias apoacutes a infestaccedilatildeo
todas as 28 plantas estavam com os sintomas da virose
Para o estabelecimento in vitro realizou-se a limpeza
das matrizes por meio de uma seacuterie de cortes removendo-
se parte do rizoma e do pseudocaule ateacute o tamanho
aproximado de 50 cm de altura por 15 cm de diacircmetro
lavando-se com detergente e aacutegua deionizada A
desinfestaccedilatildeo foi feita em cacircmara de fluxo laminar
imergindo os explantes em soluccedilatildeo de aacutelcool 70 por
cinco minutos e em soluccedilatildeo 11 de aacutegua sanitaacuteria comercial
(2 de cloro ativo) com aacutegua deionizada por 30 minutos
Em seguida foram realizadas trecircs lavagens com aacutegua
deionizada esterilizada e reduzidos os explantes ateacute o
tamanho final de 06 cm de altura por 04 cm de diacircmetro
As etapas de estabelecimento multiplicaccedilatildeo e
enraizamento foram realizadas em meio nutritivo MS baacutesico
(MURASHIGE amp SKOOG 1962) suplementado com 30 g
L de sacarose solidificado com 2 gL de ldquoPhytagelrdquo e pH
ajustado para 58 Apenas na fase de multiplicaccedilatildeo o meio
MS foi suplementado com 4 mgL de 6-benzilaminopurina
(BAP) Em todas as etapas os explantes foram dispostos
sobre 25 mL de meio de cultura em frascos com 12 cm de
altura por 5 cm de diacircmetro
A multiplicaccedilatildeo foi realizada em cinco subcultivos
das gemas e brotos sendo efetuada a subdivisatildeo
longitudinal dos explantes sempre que possiacutevel O
estabelecimento e os cinco subcultivos foram realizados
com intervalos de 30 dias Apoacutes os subcultivos as
plantas permaneceram 30 dias em enraizamento O
estudo foi desenvolvido sob condiccedilotildees de temperatura
de 27 plusmn 1ordmC fotoperiacuteodo de 16 horas e intensidade
luminosa de 22 microEm2s
SILVEIRA D G et al76
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
Apoacutes o enraizamento in vitro 47 plantas sadias e 40
plantas infectadas com BSV foram transferidas para copos
plaacutesticos de 300 cm3 contendo o Plantmaxreg e vermiculita
(21) permanecendo 30 dias sob condiccedilotildees de 85 de umidade
relativa do ar e 60 de sombreamento em casa-de-vegetaccedilatildeo
Na fase de estabelecimento e em cada subcultivo
foram avaliadas as taxas de multiplicaccedilatildeo e a presenccedila dos
sintomas do BSV nos explantes provenientes das plantas
infectadas Na fase de aclimatizaccedilatildeo avaliaram-se a
presenccedila de sintomas nas plantas infectadas e as suas
respectivas alturas As medidas foram tomadas do coleto
ateacute a extremidade apical da folha mais alta
Os dados referentes ao nuacutemero de gemas obtidas
nos cinco subcultivos foram transformados em raiz
quadrada Foi estabelecida uma regressatildeo linear para cada
tratamento em funccedilatildeo dos subcultivos
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
A infecccedilatildeo pelo BSV natildeo afetou significativamente
o crescimento e a multiplicaccedilatildeo das plantas sendo que o
nuacutemero de gemas cresceu linearmente em funccedilatildeo dos
subcultivos em ambos os tratamentos Trabalhando com
plantas micropropagadas de bananeira sadias e infectadas
com o viacuterus do topo em leque (Banana bunchy top virus
BBTV) Thomas et al (1995) observaram que aquela virose
tambeacutem natildeo afetou a capacidade das plantas em crescer e
multiplicar Nas anaacutelises de regressatildeo realizadas para os
dois tratamentos (plantas sadias e plantas com BSV) o
acreacutescimo no nuacutemero de gemas em funccedilatildeo dos subcultivos
pode ser explicado por um modelo de regressatildeo linear
(Figura 1) As estimativas da regressatildeo linear para plantas
com BSV e plantas sadias foram altamente significativas e
os coeficientes de determinaccedilatildeo (R2) proacuteximos de 1 Foi
observado que as linhas determinadas a partir das
equaccedilotildees obtidas satildeo quase superpostas evidenciando
um comportamento semelhante entre os dois tratamentos
com relaccedilatildeo ao nuacutemero de gemas por subcultivo
Em todas as fases da micropropagaccedilatildeo os sintomas
do BSV foram visiacuteveis ocorrendo nas folhas das plantas
infectadas estriados cloroacuteticos com linhas descontiacutenuas e
FIGURA 1 ndash Curvas de regressatildeo linear obtidas a partir dosdados de gemas em cada subcultivo da cultivar de bananeiraCaipira sadias e infectadas com BSV Cruz das Almas (BA)Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical 2006Dados transformados por x
dispersas (Figura 2) Esses mesmos sintomas foram
observados em plantas de bananeira infectadas com BSV
mantidas a campo (RAMIREZ amp RIVERA 1994)
As contaminaccedilotildees que ocorreram nos materiais
in vitro foram tambeacutem avaliadas As maiores taxas de
contaminaccedilatildeo aconteceram na fase de estabelecimento
in vitro dos explantes obtendo-se niacuteveis de 21 e 32
para as plantas sadias e infectadas com BSV
respectivamente (Figura 3) Os elevados iacutendices de perdas
nesta etapa foram causados principalmente por
contaminaccedilatildeo bacteriana Segundo Oliveira amp Silva
(1997) as maiores contaminaccedilotildees bacterianas dos
explantes de bananeira ocorrem na fase de
estabelecimento in vitro do que nos demais subcultivos
Oliveira et al (2000) trabalhando com plantas livres de
viacuterus obtiveram taxas de contaminaccedilatildeo nesta fase entre
10 e 45 as quais estatildeo proacuteximas agraves obtidas neste
trabalho Durante a fase de multiplicaccedilatildeo as perdas por
contaminaccedilatildeo foram menores variando de 14 a 74
para as plantas sadias e de 0 a 121 no caso das plantas
infectadas com BSV sendo que a maior parte do material
foi contaminada por fungos natildeo-patogecircnicos Estes
valores foram bem inferiores agravequeles obtidos por Oliveira
et al (1999) (131) que utilizaram genoacutetipos diploacuteides
triploacuteides e tetraploacuteides de bananeiras sadias
Efeito do viacuterus das estrias da bananeira 77
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
FIGURA 2 ndash Planta de bananeira lsquoCaipirarsquo infectada com BSV na fase de enraizamento in vitro apresentando estriadoscloroacuteticos com linhas descontiacutenuas e dispersas nas folhas Cruz das Almas (BA) Embrapa Mandioca e FruticulturaTropical 2006
FIGURA 3 ndash Taxas por contaminaccedilatildeo () de explantes dacultivar Caipira na fase de estabelecimento (Est) e ao longode cinco subcultivos (Sub) Cruz das Almas (BA)Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical 2006
Durante o enraizamento in vitro natildeo houve
diferenccedila significativa na altura das plantas Poreacutem com
30 dias de aclimatizaccedilatildeo as plantas com BSV apresentaram
altura significativamente inferior agraves plantas sadias (Tabela 1)
Soares et al (2000) cultivaram mudas de bananeira lsquoCaipirarsquo
sadias e infectadas com BSV durante 141 dias em casa-de-
vegetaccedilatildeo e observaram que a infecccedilatildeo pelo viacuterus implicou
em significativa reduccedilatildeo no crescimento inicial afetando
o porte o desenvolvimento do sistema radicular e a aacuterea
fotossintetizante das plantas Verifica-se assim que a
infecccedilatildeo pelo BSV prejudicou o crescimento inicial das
plantas afetando a altura daquelas infectadas mesmo em
um periacuteodo relativamente curto indicando que em periacuteodos
mais longos o prejuiacutezo com relaccedilatildeo ao crescimento pode
ser ainda maior aconteceu no estudo desenvolvido por
Soares et al (2000)
Os sintomas do BSV permaneceram visiacuteveis em
todas as plantas infectadas durante e apoacutes a fase de
aclimatizaccedilatildeo Esse resultado foi diferente ao obtido por
Dahal et al (1999) quando micropropagaram hiacutebridos de
Musa pois os sintomas soacute foram visiacuteveis em plantas com
trecircs meses apoacutes o enraizamento Provavelmente essa
diferenccedila foi devido agraves condiccedilotildees onde os trabalhos foram
conduzidos casa-de-vegetaccedilatildeo e campo respectivamante
bem como aos genoacutetipos estudados Observaccedilotildees
semelhantes foram tambeacutem efetuadas por Gauhl amp Pasberg-
Gauhl (1995) e Ortiz (1996) ao estudarem a incidecircncia de
viroses em diferentes genoacutetipos de bananeira
SILVEIRA D G et al78
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
Alturas (cm) Plantas de bananeira lsquoCaipirarsquo
Enraizamento
in vitro 30 dias de
aclimatizaccedilatildeo
Sadias 637 a 2690 a BSV 728 a 2192 b
TABELA 1 ndash Meacutedias das alturas das plantas apoacutes oenraizamento in vitro e 30 dias de aclimatizaccedilatildeo em casa-de-vegetaccedilatildeo Cruz das Almas (BA) Embrapa Mandiocae Fruticultura Tropical 2006
Meacutedias seguidas pelas mesmas letras nas colunas natildeodiferem estatisticamente entre si pelo teste F ao niacutevel de 5 de significacircncia
CONCLUSOtildeES
A infecccedilatildeo pelo BSV natildeo influenciou a taxa de
multiplicaccedilatildeo dos explantes embora os sintomas do viacuterus
tenham sido visiacuteveis em todas as fases da micropropagaccedilatildeo
e durante os primeiros 30 dias da aclimatizaccedilatildeo das plantas
infectadas Todavia o crescimento das plantas infectadas
foi afetado pela presenccedila do viacuterus
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FOGACcedilA L A et al80
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
CARACTERIacuteSTICAS MORFOFISIOLOacuteGICAS DE BROTACcedilOtildeES DEAgapanthus umbellatus var minor MULTIPLICADAS EM
BIORREATOR DE IMERSAtildeO TEMPORAacuteRIA1
MORPHOLOGICAL AND PHYSIOLOGICAL CHARACTERISTICS Agapanthus umbellatus varminor OF SHOOTS PROPAGATED IN BIOREACTOR OF TEMPORARY IMMERSION
LUCIANA ALVES FOGACcedilA2 DENILSON DORTZBACH3 ANTONIO CARLOS ALVES4 ENIO LUIZ PEDROTTI5
1Parte da dissertaccedilatildeo de mestrado do primeiro autor junto ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Recursos Geneacuteticos vegetais CCA UFSC ndash Florianoacutepolis SC2Engenheira Agrocircnoma Mestre em Recursos Geneacuteticos Vegetais ndash CCAUFSC ndash UFSC Trindade ndash Florianoacutepolis SC ndash 88040-900 ndash lufogacapopcombr3Empresa Catarinense de Pesquisa Agropecuaacuteria ndash Rodovia Admar Gonzaga 1340 ndash Bairro Itacorubi Florianoacutepolis SC ndash denilsondtbolcombr4Engenheiro Agrocircnomo Professor Dr Departamento Fitotecnia ndash CCAUFSC ndash UFSC ndash alvesccaufscbr5Engenheiro Agrocircnomo Professor Dr Departamento Fitotecnia ndash CCAUFSC ndash UFSC ndashRodovia Admar Gonzaga 1346 ndash 88 040 900 ndash Florianoacutepolis- SC ndash pedrotticcaufscbr
RESUMOCom o presente trabalho objetivou-se estudar alguns
aspectos morfoloacutegicos e fisioloacutegicos de placircntulas de Agapanthusumbellatus LrsquoHeacuter var minor multiplicadas em biorreatores deimersatildeo temporaacuteria (BIT) Foram testadas quatro concentraccedilotildeesde sacarose no meio de cultura e duas intensidades luminosasem um total de oito tratamentos formando um fatorial 2 x 4 Odelineamento experimental utilizado foi inteiramentecasualizado Os resultados obtidos indicaram que as condiccedilotildeesambientais principalmente luz e concentraccedilatildeo de sacarose domeio de cultura influenciaram o desenvolvimento e o crescimentodas placircntulas quando multiplicadas Observou-se que a ausecircnciade sacarose mesmo no niacutevel mais elevado de intensidadeluminosa natildeo estimulou a fotossiacutentese das placircntulas Acombinaccedilatildeo de 30 gL-1 de sacarose e 70 mMm-2s-1 de luzproporcionou maior numero de folhas massa fresca e secaconcentraccedilatildeo de clorofila a b e total fatores estes que tecircmgrande influecircncia na fase de aclimatizaccedilatildeo
Termos para indexaccedilatildeo Plantas ornamentaismicropropagaccedilatildeo sacarose intensidade luminosa
ABSTRACTThe objective of the present work was to study
morphological and physiological characteristics of Agapanthusumbellatus LrsquoHeacuter var minor plantlets propagated in bioreactorof temporary immersion (BIT) Four sucrose concentrationsand two light intensities were analyzed totalizing eighttreatments The experimental design used was a completelyrandomized with a 2 x 4factorial The results indicated that theenvironment conditions mainly light and sucrose concentrationsof the culture medium influenced plantlets development andgrowth It was observed that the absence of sucrose even inthe highest level of light intensity had no stimuli on plantletphotosynthesis The combination of 30 g L-1 sucrose and 70mM m-2 s-1 light had promoted higher leaf number fresh anddry weight concentration of chlorophyll a b and total
parameters that present high influence during theacclimatizationrsquos phase
Index terms Ornamental plants micropropagation sucroselight intensity
INTRODUCcedilAtildeO
Agapanthus umbellatus var minor tambeacutem
conhecida como Agapantho ou Liacuterio do Nilo eacute uma
angiosperma da famiacutelia Amaryllidaceae pertencente agrave
ordem Liliales (BOTANY 2003) eacute uma espeacutecie ornamental
muito utilizada como flor de corte devido agrave sua durabilidade
No entanto o maior interesse econocircmico nesta espeacutecie
decorre do seu uso como forraccedilatildeo em jardins e praccedilas
(LORENZI amp SOUZA 1995)
Sua propagaccedilatildeo eacute tradicionalmente efetuada
atraveacutes da divisatildeo de touceiras No entanto esta teacutecnica
apresenta uma seacuterie de desvantagens visto que a taxa de
propagaccedilatildeo eacute baixa cerca de dez mudas por planta ao ano
aleacutem de possibilitar a dispersatildeo de pragas e doenccedilas que
poderatildeo ocorrer no viveiro de produccedilatildeo Sendo assim a
micropropagaccedilatildeo pode ser uma ferramenta muito
promissora para esta espeacutecie
O processo de micropropagaccedilatildeo induz a um grande
nuacutemero de mudanccedilas anatocircmicas morfoloacutegicas e
fisioloacutegicas que muitas vezes tem limitado o cultivo in vitro
de algumas espeacutecies (DESJARDINS 1993) A
(Recebido em 18 de julho de 2005 e aprovado em 25 de agosto de 2006)
Caracteriacutesticas morfofisioloacutegicas de brotaccedilotildees 81
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
heterogeneidade de respostas agraves placircntulas que ocorrem
na cultura de tecidos eacute promovida natildeo soacute por fatores
inerentes ao tecido vegetal (geneacuteticos e fisioloacutegicos) mas
tambeacutem por modificaccedilotildees do ambiente in vitro
As modificaccedilotildees do ambiente in vitro envolvem a
qualidade e intensidade de luz fotoperiacuteodo temperatura
umidade reguladores de crescimento exoacutegenos fonte de
carbono e estresse mecacircnico Estes satildeo determinantes na
morfogecircnese no crescimento e no desenvolvimento de
placircntulas in vitro (GEORGE 1996 KOZAI et al 1990
SALISBURY 1981) Aleacutem disso interferem no nuacutemero de
folhas teor de clorofila densidade estomaacutetica (LIAN et
al 2002 PREECE amp SUTTER 1991) na fotossiacutentese e na
fase de aclimatizaccedilatildeo (DESJARDINS et al 1995)
Um dos principais fatores que causam grande
influecircncia na fotossiacutentese de placircntulas cultivadas in vitro
eacute a intensidade luminosa (GALZY amp COMPAN 1992) A
quantidade e a qualidade da luz bem como o fotoperiacuteodo
podem afetar o crescimento e o desenvolvimento de
placircntulas in vivo (SMITH 1982) e placircntulas in vitro
(ECONOMOU amp READ 1987 VLAHOS et al 1992) Esta
influecircncia se deve ao grande impacto sobre o acuacutemulo de
pigmentos biossiacutentese de clorofila diferenciaccedilatildeo de
cloroplastos e anatomia da folha (DESJARDINS et al 1995)
Outro fator que vem sendo estudado e que pode
determinar um papel importante no controle da atividade
fotossinteacutetica de placircntulas in vitro eacute a utilizaccedilatildeo de
carboidratos exoacutegenos pois o crescimento da maioria das
culturas in vitro eacute sustentado pela sacarose ou outros
accediluacutecares adicionados ao meio de cultura (PREECE amp
SUTTER 1991) Estes podem ser utilizados pelas placircntulas
quando a taxa de fotossiacutentese natildeo permite assegurar um
balanccedilo positivo em carbono definindo assim uma nutriccedilatildeo
mixotroacutefica ou heterotroacutefica (GALZY amp COMPAN 1992)
Baseado na hipoacutetese de que a composiccedilatildeo do meio
de cultura e a intensidade luminosa influenciam a
morfologia e a fisiologia de placircntulas micropropagadas o
presente trabalho teve como objetivo estudar aspectos
morfoloacutegicos e fisioloacutegicos de placircntulas de Agapanthus
umbellatus LrsquoHeacuter var minor multiplicadas em biorreator de
imersatildeo temporaacuteria (BIT) Para tanto foi avaliado o
desenvolvimento e o crescimento desta espeacutecie durante a
fase de multiplicaccedilatildeo em funccedilatildeo da variaccedilatildeo de niacuteveis de
sacarose e intensidade luminosa
MATERIAIS E MEacuteTODOS
Este trabalho foi realizado no Laboratoacuterio de
Morfogecircnese e Bioquiacutemica Vegetal localizado no Centro
de Ciecircncias Agraacuterias da Universidade Federal de Santa
Catarina em Florianoacutepolis - SC
O trabalho consistiu de um ensaio onde foram
utilizadas brotaccedilotildees de Agapanthus umbellatus var minor
obtidas da terceira repicagem mantidas em meio geleificado
MS + 178 mM de BAP Apoacutes serem individualizadas e
padronizadas tendo o seu tamanho variando entre 25 e
30 cm de comprimento as brotaccedilotildees foram transferidas
para o BIT (ETIENNE amp BERTHOULY 2002) contendo 500
mL de meio liacutequido e sais de MS (MURASHIGE amp SKOOG
1962) em condiccedilotildees asseacutepticas suplementado com
concentraccedilatildeo de 89 mM de BAP O pH foi ajustado com
NAOH (1N) em 59 antes da autoclavagem (durante 15
minutos sob 121ordmC e 15 atm de pressatildeo) O delineamento
experimental utilizado no ensaio foi o inteiramente
casualizado Foram testados quatro concentraccedilotildees de
sacarose no meio de cultura (0 15 30 e 45) e duas
intensidades luminosas (70 e 140 mmolm-2s-1) providas
por lacircmpadas brancas fluorescentes (PHILIPS ndash TLT 40W)
em um total de oito tratamentos formando um fatorial 2 x 4
Cada tratamento foi composto por trecircs frascos (repeticcedilatildeo)
contendo 50 plantas cada um
Os frascos foram mantidos em sala de crescimento
com fotoperiacuteodo de 16 horas e temperatura meacutedia de 22ordmC
com variaccedilatildeo de plusmn 2ordmC por um periacuteodo de 60 dias
Apoacutes 60 dias de cultivo foram avaliadas as
seguintes caracteriacutesticas dos explantes nuacutemero e tamanho
das brotaccedilotildees (cm) nuacutemero de folhasbrotaccedilatildeo massa
fresca e seca (g) da parte aeacuterea e raiz utilizando-se amostras
de 25 placircntulas por repeticcedilatildeo escolhidas ao acaso
FOGACcedilA L A et al82
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
A determinaccedilatildeo do conteuacutedo de clorofila ldquoa b e
totalrdquo consistiu na coleta de amostras de 100 mg de massa
fresca As amostras foram incubadas com 70 mL de DMSO
(dimetilsulfoacutexido) sem maceraccedilatildeo por 30 minutos a 65degC
Apoacutes filtragem seu volume foi completado para 10 mL com
DMSO Desses extratos 2 mL foram analisados em
espectrofotocircmetro (UV - visiacutevel SHIMADZU) para os
valores de absorbacircncia entre 645 e 663 nm Os valores obtidos
foram submetidos agrave foacutermula de Arnon (1949) conforme
descrito por Hiscox amp Israelstam (1979) Chl a = (00127 X
D663) ndash (000269 X D645) e Chl b = (00229 X D645) ndash (000468
X D663) A clorofila total foi a soma da ldquoChl a e Chl brdquo de
cada tratamento foram utilizadas 25 amostras
A determinaccedilatildeo da densidade estomaacutetica (nuacutemero
de estocircmatos por mm2 de superfiacutecie foliar) foi realizada nas
amostras das quais extraiu-se a clorofila Apoacutes a extraccedilatildeo
da clorofila as folhas foram cortadas e somente o terccedilo
meacutedio das folhas foi usado para anaacutelise Em seguida foram
fixadas sobre lacircminas histoloacutegicas com a ajuda de uma
lamiacutenula e de algumas gotas de aacutegua esterilizada A
observaccedilatildeo foi realizada na epiderme das faces adaxial e
abaxial da folha com o auxiacutelio de um microscoacutepio oacutetico
(OLYMPUS CH30 ocular WH10 X 22) com um aumento
de 400 vezes e com um campo conhecido de 024 mm2 Para
cada lacircmina foram feitas leituras em cinco campos
Os dados obtidos foram avaliados por meio da
anaacutelise de variacircncia (ANOVA) seguindo o modelo para
experimento bifatorial inteiramente casualizado O nuacutemero
de brotaccedilotildees o nuacutemero de folhas e a densidade estomaacutetica
foram transformados em Oumlx+1 para a anaacutelise As meacutedias
dos tratamentos foram separadas pelo teste de comparaccedilatildeo
de meacutedias de Duncan a 5 de probabilidade conforme
recomendaccedilotildees de Stell amp Torrie (1980)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
A concentraccedilatildeo de sacarose no meio de cultura
apresentou uma accedilatildeo positiva e interativa com a intensidade
luminosa na proliferaccedilatildeo de brotaccedilotildees (Tabela 1) visto
que a ausecircncia de sacarose no meio de cultura resultou
em insucesso no crescimento das placircntulas de Agapantho
principalmente nos primeiros dias Apoacutes o
desenvolvimento inicial (aproximadamente 10 dias) foi
constatada estagnaccedilatildeo no crescimento das placircntulas
seguido de atrofia e necrose das brotaccedilotildees Apoacutes 20 dias
de cultivo ocorreu a morte das brotaccedilotildees Isso mostrou
que folhas de placircntulas de Agapantho natildeo fixaram
carbono suficiente para sustentar seu crescimento na
ausecircncia de sacarose Portanto para a espeacutecie em estudo
foi necessaacuteria a adiccedilatildeo de uma fonte de carbono no meio
de cultura para o seu desenvolvimento in vitro Segundo
Capellades et al (1991) e Desjardins et al (1995) a total
remoccedilatildeo de carboidratos no meio de cultura para algumas
espeacutecies frequumlentemente torna-se prejudicial para o
crescimento das placircntulas o que pode prejudicar o
processo de micropropagaccedilatildeo e aclimatizaccedilatildeo pois
durante o cultivo in vitro as placircntulas perdem
parcialmente o autotrofismo e consequumlentemente
necessitam de uma fonte de carbono
O maior nuacutemero de brotaccedilotildees foi obtido com a
intensidade luminosa de 70 mmolm-2s-1 e a concentraccedilatildeo
de 45 gL-1 de sacarose (Tabela 1) Enquanto que com a
intensidade luminosa de 140 mmolm-2s-1 o maior nuacutemero
de brotaccedilotildees foi obtido com a concentraccedilatildeo de 30 gL-1 de
TABELA 1 ndash Nuacutemero de brotaccedilotildeesexplante de placircntulasde Agapanthus umbellatus var minor multiplicadasbiorreator de imersatildeo temporaacuteria suplementado comdiferentes concentraccedilotildees de sacarose e intensidadesluminosas no periacuteodo de 60 dias
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1)
Concentraccedilatildeo Sacarose (gL-1) 70 1 140 1
0 000 dA 00 dA 15 370 cB 544 cA 30 553 bB 651 aA 45 745 aA 585 bB
CV 67
Meacutedias seguidas pela mesma letra minuacutescula nas colunase maiuacutescula nas linhas natildeo diferem significativamente peloteste de Duncan a 5 de probabilidade1 Observaccedilotildees transformadas segundo ( x+1)
Caracteriacutesticas morfofisioloacutegicas de brotaccedilotildees 83
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
sacarose Isso demonstrou um alto grau de mixotrofia dessa
espeacutecie
O tamanho das brotaccedilotildees e o nuacutemero de folhas
(Tabela 2) foram afetados apenas pelo efeito simples dos
fatores natildeo havendo interaccedilatildeo entre sacarose e luz O
maior tamanho das brotaccedilotildees foi alcanccedilada quando os
explantes foram submetidos a 15 gL-1 de sacarose e 140
mmolm-2s-1 de intensidade luminosa (Tabela 2) Verificou-
se tambeacutem que o aumento da concentraccedilatildeo desse
carboidrato no meio de cultura natildeo favoreceu o
alongamento das brotaccedilotildees Provavelmente o aumento
da intensidade luminosa favoreceu a taxa de fotossiacutentese
das placircntulas permitindo um balanccedilo positivo de carbono
afetando o crescimento e o desenvolvimento de placircntulas
in vitro (LEE et al 1995)
Por outro lado o maior nuacutemero de folhas de
Agapantho foi obtido na concentraccedilatildeo de 30 gL-1 de
sacarose (Tabela 2) A intensidade luminosa natildeo teve
influecircncia sobre essa variaacutevel Contrastando com os dados
obtidos no presente trabalho Konow amp Wang (2001)
determinaram que a intensidade luminosa de 40 mmolm-
2s-1 promoveu um aumento no nuacutemero de folhas de
Phalaenopsis enquanto placircntulas que se desenvolveram
em ambiente com intensidade de 10 e 80 molm-2s-1
apresentaram um menor nuacutemero de folhas Segundo os
autores o aumento no nuacutemero de folhas pode indicar que
TABELA 2 ndash Tamanho de brotaccedilotildees e nuacutemero de folhasbrotaccedilatildeo de placircntulas de Agapanthus umbellatus var minormultiplicadas em biorreator de imersatildeo temporaacuteria suplementado com diferentes concentraccedilotildees de sacarose eintensidades luminosas no periacuteodo de 60 dias
Meacutedias seguidas pela mesma letra nas linhas e colunas natildeo diferem significativamente pelo teste de Duncan a 5 deprobabilidade
houve estiacutemulo da fotossiacutentese in vitro Outro efeito
observado em placircntulas de Agapantho neste trabalho foi
a presenccedila de folhas mais claras e vitrificadas (folhas com
aspecto viacutetreo pouco desenvolvidas aparecircncia suculenta
e translucente) na grande maioria das placircntulas
multiplicadas em meio suplementado com 15 gL-1 de
sacarose e intensidade luminosa de 70 mmolm-2s-1 Estes
resultados podem indicar que o aparato fotossinteacutetico natildeo
tenha se desenvolvido adequadamente (CAPPELADES et
al 1991 DESJARDINS et al 1995) afetando a acumulaccedilatildeo
de massa fresca Possivelmente a presenccedila de folhas
vitrificadas foi influenciada pelo uso de meio liacutequido pois
de acordo com George (1996) e Etienne amp Berthouly (2002)
o meio liacutequido favorece a produccedilatildeo de folhas vitrificadas
quando comparado com meio geleificado No entanto
observou-se que para os demais tratamentos em
concentraccedilotildees maiores de sacarose (30 e 45 gL-1) a
presenccedila de brotaccedilotildees vitrificadas foi rara ou nenhuma
Neste sentido o desenvolvimento de brotaccedilotildees com esta
caracteriacutestica pode estar relacionado agrave concentraccedilatildeo de
sacarose no meio e agrave diferenccedila osmoacutetica entre as brotaccedilotildees
e o meio de cultura (DEBERGH et al 1981) Este resultado
tambeacutem foi obtido na multiplicaccedilatildeo de rosas na qual onde
a reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo de sacarose para 10 gL-1 na
fase de multiplicaccedilatildeo promoveu um aumento significativo
na presenccedila de plantas vitrificadas e quando submetidas
Tamanho de brotaccedilotildees (cm)
Nuacutemero de folhasbrotaccedilatildeo
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1) Concentraccedilatildeo Sacarose
(gL-1) 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia
0 000 000 000 d 000 000 000 d 15 275 396 335 a 407 408 408 b 30 295 295 295 b 414 404 409 a 45 245 220 233 c 400 408 404 c
Meacutedia 204 b 228 a 276 a 275 a
CV 2595 467
FOGACcedilA L A et al84
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
a concentraccedilotildees de 30 e 40 gL-1 a presenccedila de placircntulas
vitrificadas foi rara (LANGFORD amp WAINWRIGHT 1987)
Outro fator que possivelmente pode ter
influenciado a presenccedila de placircntulas vitrificadas in vitro
foi a baixa intensidade luminosa (GEORGE 1996) pois
placircntulas de Agapantho multiplicadas sob intensidade de
140 mmolm-2s-1 e 15 gL-1 de sacarose natildeo apresentaram
caracteriacutestica de vitrificaccedilatildeo Estes dados indicaram que o
aumento da intensidade luminosa evitou a presenccedila de
plantas vitrificadas aleacutem de proporcionar um incremento e
estiacutemulo na atividade fotossinteacutetica (GEORGE 1996)
A produccedilatildeo de massa fresca e seca das brotaccedilotildees
foram influenciadas pela interaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo
de sacarose e a intensidade luminosa (Tabela 3) Placircntulas
de Agapantho multiplicadas sob intensidade de 70
mmolm-2s-1 apresentaram a maior produccedilatildeo de massa
fresca e seca dentro das concentraccedilotildees de 30 gL-1 Nas
concentraccedilotildees de 15 e 45 gL-1 os resultados obtidos
foram inferiores (Tabela 3) Por outro lado quando se
aumentou a intensidade para 140 mmolm-2s-1 a melhor
produccedilatildeo de massa fresca e seca ocorreu dentro da
concentraccedilatildeo de 15 gL-1 de sacarose (Tabela 3) Verificou-
se assim que o aumento da concentraccedilatildeo de sacarose no
meio de cultura proporcionou efeitos negativos na
produccedilatildeo de massa fresca e seca quando as placircntulas
foram submetidas agrave intensidade luminosa mais elevada
TABELA 3 ndash Massa fresca e seca de brotaccedilotildees de Agapanthus umbellatus var minor multiplicadas em biorreator de imersatildeotemporaacuteria suplementado com diferentes concentraccedilotildees de sacarose e intensidades luminosas no periacuteodo de 60 dias
Tais resultados corroboram as afirmaccedilotildees feitas referentes
agrave variaacutevel nuacutemero de brotaccedilotildees em que demonstrou-se
que foi possiacutevel reduzir a concentraccedilatildeo de sacarose em
maiores intensidade luminosas confirmando o grau de
mixotrofia
Ao analisar a concentraccedilatildeo de clorofila em
folhas de Agapantho verificou-se que natildeo houve
interaccedilatildeo significativa entre as concentraccedilotildees de
sacarose e intensidade luminosa Os teores de clorofila
a b e total (Tabela 4) foram maiores nas concentraccedilotildees
de 30 gL-1 sacarose Serret et al (1995) mostraram que
o aumento da concentraccedilatildeo de accediluacutecares (30 gL-1) no
meio de cultura promoveu maior produccedilatildeo de clorofila
impedindo a fotoinibiccedilatildeo realizaccedilatildeo de fotossiacutentese e
aumento do ganho de massa em plantas de Gardecircnia
cultivadas in vitro
Em relaccedilatildeo ao efeito da intensidade luminosa natildeo
houve efeito deste fator sobre essas variaacuteveis ainda que
Economou amp Read (1987) Galzy amp Compan (1992) Vlahos
et al (1992) George (1996) tenham observado que a
intensidade luminosa eacute um fator que estaacute estreitamente
relacionado agrave siacutentese de clorofila No entanto no presente
trabalho sugere-se a menor intensidade 70 mmolm-2s-1 com
o objetivo de que natildeo ocorra um aumento na velocidade
de decomposiccedilatildeo da clorofila com intensidade mais
elevada
Meacutedias seguidas pela mesma letra minuacutescula nas colunas e maiuacutescula nas linhas natildeo diferem significativamente peloteste de Duncan a 5 de probabilidade
Massa fresca (g)
Massa seca (g)
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1) Concentraccedilatildeo
Sacarose (gL-1) 70 140 70 140
0 000 dA 00 dA 000 dA 000 dA 15 067 cB 106 aA 0069 cB 0109 aA 30 082 aA 076 bB 0085 aA 0081 bB 45 075 bA 049 cB 0078 bA 0051 cB
CV 2873 2655
Caracteriacutesticas morfofisioloacutegicas de brotaccedilotildees 85
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
TABELA 4 ndash Concentraccedilotildees de clorofila a b e total (mgg massa fresca) em folhas de Agapanthus umbellatus varminor multiplicadas em biorreator de imersatildeo temporaacuteria por um periacuteodo de 60 dias submetidas a 4 concentraccedilotildees desacarose e dois niacuteveis de intensidade luminosa
Clrofila a (mgg massa fresca)
Clrofila b (mgg massa fresca)
Clrofila total (mgg massa fresca)
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1) Concentraccedilatildeo
Sacarose (gL-1) 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia
0 000 000 000 d 000 000 000 d 000 000 000 d 15 211 248 295 c 089 076 083 c 301 325 313 c 30 502 509 505 a 200 211 205 a 703 721 710 a 45 486 420 453 b 195 179 187 b 682 633 658 b
Meacutedia 299 a 294 a 121 a 116 a 421 a 420 a
CV 740 820 850
Meacutedias seguidas pela mesma letra nas linhas e colunas natildeo diferem significativamente pelo teste de Duncan a 5 deprobabilidade
Em relaccedilatildeo aos estocircmatos atraveacutes de
observaccedilatildeo microscoacutepica foi possiacutevel verificar que o
Agapantho possui folhas com caracteriacutest ica
anfiestomaacutetica caracterizada pela presenccedila de
estocircmatos em ambas as faces (face abaxial e adaxial)
Esta caracteriacutestica tem sido considerada como um
mecanismo adaptativo para maximizar a condutacircncia
de CO2 quando luz e aacutegua satildeo fatores limitantes
(KRAMER 1969)
Atraveacutes da anaacutelise estatiacutestica para densidade
estomaacutetica da face adaxial verificou-se que natildeo houve
interaccedilatildeo entre os fatores sacarose e intensidade
luminosa havendo portanto efeito isolado dos fatores A
maior densidade estomaacutetica da face abaxial foi obtida na
concentraccedilatildeo de 45 gL-1 (Tabela 5) Natildeo houve efeito da
intensidade luminosa para essa variaacutevel Por outro lado
a maior densidade estomaacutetica na face adaxial foi obtida
na concentraccedilatildeo de 45 gL-1 de sacarose e 140 mmolm-2s-1
de intensidade luminosa (Tabela 5) verificando a
influecircncia positiva da intensidade luminosa para essa
variaacutevel
As folhas de placircntulas multiplicadas na
concentraccedilatildeo de 15 gL-1 de sacarose apresentaram menor
densidade estomaacutetica em ambas as faces (Tabela 5) com
formato anormal largos e salientes caracteriacutesticas estas
natildeo desejaacuteveis pois segundo Preece amp Sutter (1991)
uma alteraccedilatildeo a niacutevel estrutural eou morfoloacutegico podem
impedir o funcionamento do aparelho estomaacutetico e grande
parte dos estocircmatos assim formados satildeo incapazes de se
fechar
Possivelmente este resultado se deve agraves
caracteriacutesticas de vitrificaccedilatildeo que as folhas do
tratamento 15 gL-1 de sacarose e 70 mmol m-2s-1 de
intensidade luminosa apresentaram (BLANKE amp
BELCHERL 1989) e a falta de energia armazenada no
explante com a falta de carbono que eacute proveniente da
sacarose adicionada ao meio de cultura (DESJARDINS
et al 1995) Estes resultados corroboram os obtidos
por Vintildea et al (2001) que demonstraram que folhas
vitrificadas de abacateiro apresentaram estocircmatos
grandes com saliecircncia ceacutelulas subsidiaacuterias assimeacutetricas
e deformadas e seu ostiacuteolo completamente aberto Tal
anomalia pode ser atribuiacuteda agrave perda da elasticidade das
paredes das ceacutelulas-guarda o que impediria o seu
movimento de abertura e fechamento que
consequumlentemente afeta o desenvolvimento das
placircntulas ao serem transferidas para condiccedilotildees ex vitro
atraveacutes da excessiva perda de aacutegua
FOGACcedilA L A et al86
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
TABELA 5 ndash Densidade estocircmatica (estocircmatosmm2) da face adaxial e abaxial de folhas de Agapanthus umbellatus varminor multiplicadas em biorreator de imersatildeo temporaacuteria suplementado com diferentes concentraccedilotildees de sacarose eintensidade luminosa por um periacuteodo de 60 dias
Densidade estomaacutetica (estocircmatosmm2) Epiderme da face Adaxial Epiderme da face Abaxial
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1)
Concentraccedilatildeo Sacarose(gL1) 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia
0 000 000 000 d 000 000 000 d 15 2587 3026 2802 c 3408 4752 4053 c 30 6524 5628 6064 b 9977 8584 9268 b 45 5412 7016 6188 a 8809 10807 9783 a
Meacutedia 2856 b 3089 a 4256 a 4705 a CV 1474 1206
Meacutedias seguidas pela mesma letra nas linhas e colunas natildeo diferem significativamente pelo teste de Duncan a 5 deprobabilidade
CONCLUSAtildeO
Condiccedilotildees ambientais tais como intensidade
luminosa e concentraccedilatildeo de sacarose adicionada ao meio
de cultura influenciaram no desenvolvimento e
crescimento das placircntulas de Agapanthus umbellatus
var minor quando multiplicadas em meio liacutequido no BIT
Placircntulas de Agapantho foram incapazes de se
desenvolver em meio sem sacarose sendo portanto
necessaacuteria a adiccedilatildeo de uma fonte de carbono visto que a
espeacutecie em estudo apresentou uma taxa de fotossiacutentese
incapaz de assegurar um balanccedilo positivo em carbono
Houve uma grande variaccedilatildeo nas respostas obtidas
no entanto fazendo uma avaliaccedilatildeo em conjunto das
variaacuteveis recomenda-se 30 gL-1 de sacarose e intensidade
luminosa de 70 mmolm-2s-1 No entanto deve-se ressaltar
que estudos mais aprofundados devem ser conduzidos
para verificar o efeito destas combinaccedilotildees sobre o
desempenho de placircntulas durante a fase de aclimatizaccedilatildeo
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SOUZA G de F M V e et al88
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
CAPACIDADE DE REGENERACcedilAtildeO IN VITRO DE TOMATEIROCULTIVAR SANTA CLARA
IN VITRO REGENERATION CAPACITY OF TOMATOPLANT CULTIVAR SANTA CLARA
GLAUCIA DE FATIMA MOREIRA VIEIRA E SOUZA1 JOSEacute MAGNO QUEIROZ LUZ2 ALCIONE SILVA ARRUDA3DENISE GARCIA SANTANA2 MARIANA DE SOUZA E SILVA DA COSTA TEIXEIRA4
LUCIANA LONDE5 ADELAIDE SIQUEIRA SILVA6 ELISAcircNGELA RODRIGUES FIGUEIRA7
1Mestranda em Fitotecnia ndash UFU ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash gfmvsyahoocombr2Professor Dr Instituto de Ciecircncias Agraacuterias ndash UFUICIAG ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash jmagnoumuaramaufubr3Dra em Geneacutetica e Bioquiacutemica Professora contratada da UEG ndash Unidade Universitaacuteria de Ipameri ndash Rodovia GO 330 Km 24 ndash Anel Viaacuterio SN ndash 75780-000 ndash Ipameri GO ndash asarrudahotmailcom4Engenheira Agrocircnoma ndash UFU ndash Conab Sede - SGAS 901 Bloco ldquoArdquo Lote 69 - Asa Sul ndash 70390-010 ndash Brasiacutelia DF ndash marisouza81yahoocombr5Dra em Geneacutetica e Bioquiacutemica ndash IGBUFU ndash Av Paraacute 1720 ndash Campus Umuarama ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash llondebolcombr6Mestranda em AgronomiaFitotecnia ndash UFUICIAG ndash Bolsista FAPEMIG ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash adelaidebioyahoocombr7Mestre em AgronomiaFitotecnia ndash UFUICIAG ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash Elis_figueirayahoocombr
RESUMOA cultivar de tomateiro Santa Clara (Lycopersicon
esculentum Mill) foi avaliada quanto ao seu potencial deregeneraccedilatildeo in vitro a partir de trecircs tipos de explantes e trecircsmeios de cultura seguidos de trecircs repicagens Os explantes foramcotileacutedone decapitado cotileacutedone fendido e cotileacutedone aparadonas extremidades Os meios de cultura foram MI macro emicronutrientes do MS vitaminas B5 de Gamborg et al (1968)suplementado com 30 gL de sacarose e de 8 gL de aacutegar pH 58MII meio MI suplementado com 1 mgL de BAP e 30 gL deglicose MIII meio MI suplementado com 25 mgL de BAP e02 mgL de AIA Para as repicagens foi utilizado o meio MIsuplementado com 05 mgL 08 mgL e 10 mgL de BAP paraa primeira segunda e terceira repicagens respectivamente Noenraizamento foi usado o meio MI suplementado com 05 mgL de AIA e as placircntulas enraizadas foram transferidas parasubstrato comercial Plantimax esterilizado e aclimatadas emlaboratoacuterio A maior induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo tanto de calosquanto de brotos foi observada nos meacutetodos cotileacutedone fendidoe cotileacutedone aparado quando colocados no meio MIII no entantoa induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo foi mais raacutepida quando usado cotileacutedonedecapitado indicando um alto potencial de organogecircneseespontacircnea sendo que o meio MI foi o melhor Os resultadosobtidos com as diferentes concentraccedilotildees de BAP nos trecircs ciclosde repicagem natildeo diferiram entre si e 82 das plantas enraizadasaclimataram-se com sucesso
Termos para indexaccedilatildeo Lycopersicon esculentummelhoramento do tomateiro cultura de tecidos
ABSTRACTThe tomato plant cultivar lsquoSanta Clararsquo (Lycopersicon
esculentum Mill) was evaluated as for its in vitro potential ofregeneration using three types of explants and three culture media
following three pricking-outs The explants were as followsdecapitated cotyledon split cotyledon and rim-trimmedcotyledon The culture media were MI MS macro andmicronutrients vitamins B5 of Gamborg et al (1968)supplemented with 30gL sucrose and 8gL agar pH 58 MIImedium MI supplemented with 1 mgL BAP and 30 gL glucoseMIII medium MI supplemented with 25 mgL BAP and 02mgL IAA For the pricking-outs the media MI wassupplemented with 05 mgL 08 mgL and 10 mgL BAP forthe first second and third pricking out respectively As forrooting the MI medium was supplemented with 05 mgL IAAand the rooted seedlings were transplanted to the sterilizedcommercial substrate Plantimax and then acclimatized inlaboratory Higher callus induction and sprout regeneration wasobserved for the methods of split and rim-trimmed cotyledonplaced into medium MIII Nevertheless the induction forregeneration was much faster when the decapitated cotyledonmethod was used indicating a high potential of spontaneousorganogenesis in which the media MI was the best The resultsobtained with the different concentrations of BAP in the threecycles of pricking-out did not differ among themselves and 82of the rooted plants were acclimatized successfully
Index terms Lycopersicon esculentum tomato breeding tissueculture
INTRODUCcedilAtildeO
O tomate pertence ao gecircnero Lycopersicon e a
espeacutecie cultivada cosmopolita eacute botanicamente
denominada de Lycopersicon esculentum (FILGUEIRA
2000) As cultivares atualmente plantadas podem ser
(Recebido em 03 de outubro de 2003 e aprovado em 04 de setembro de 2006)
Capacidade de regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro 89
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
reunidas em cinco grupos Santa Cruz Salada Cereja
Italiano Agroindustrial No presente trabalho foi utilizada
a cultivar Santa Clara do grupo Santa Cruz pois ela continua
sendo a cultivar mais plantada no Brasil
A tomaticultura estaacute associada a seacuterios problemas
fitossanitaacuterios sobretudo viroses aleacutem do ataque de
fungos bacteacuterias e insetos praga Cria-se com isto a
necessidade de se pesquisar novas alternativas ou
obtenccedilatildeo de novos genoacutetipos com resistecircncia muacuteltipla a
doenccedilas e pragas entre essas os estudos sobre
regeneraccedilatildeo e transformaccedilatildeo geneacutetica (FAacuteRI et al 2000)
A engenharia geneacutetica abriu uma nova perspectiva
para o melhoramento geneacutetico do tomateiro a partir do
final da deacutecada de 80 (WIJBRANDI amp BOTH 1993)
visando aumentar a produtividade e melhorar a qualidade
por meio da obtenccedilatildeo de resistecircncia a estresses bioacuteticos e
abioacuteticos A cultura de tecidos destaca-se durante o
processo de realizaccedilatildeo das teacutecnicas de transformaccedilatildeo
geneacutetica pois eacute necessaacuterio induzir gemas vegetativas e
em seguida regenerar brotos alongados e plantas
completas a partir de ceacutelulas ou tecidos geneticamente
modificados
Para a otimizaccedilatildeo de protocolos para o tomateiro
alguns fatores que afetam a eficiecircncia de transformaccedilatildeo
tecircm sido examinados dentre eles o tamanho do explante e
o tipo de explante hipocoacutetilo ou cotileacutedone (FRARY amp
EARLE 1996)
No Brasil haacute poucos trabalhos na aacuterea de
regeneraccedilatildeo in vitro e de transformaccedilatildeo geneacutetica de
cultivares de tomateiro e pouco se conhece sobre a
capacidade de regeneraccedilatildeo das principais cultivares
brasileiras (FAacuteRI et al 2000) Alguns pesquisadores como
Faria amp Illg (1993) analisaram a regeneraccedilatildeo in vitro de
algumas espeacutecies e cultivares de tomateiro observando
uma baixa capacidade morfogecircnica das cultivares se
comparadas com a espeacutecie selvagem Lycopersicon
pimpinellifolium (L) P Miller
Com este trabalho objetivou-se teve como objetivo
avaliar o potencial de regeneraccedilatildeo in vitro da cultivar Santa
Clara do grupo Santa Cruz a partir de diferentes tipos de
explantes e meios de cultura criando e otimizando
protocolos para sua regeneraccedilatildeo in vitro
MATERIAL E MEacuteTODOS
No Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos Vegetais do
Instituto de Geneacutetica e Bioquiacutemica da Universidade Federal
de Uberlacircndia foi avaliada a capacidade de regeneraccedilatildeo
in vitro do tomateiro cultivar Santa Clara usando trecircs
tipos de explantes e trecircs meios de cultura seguido de trecircs
repicagens O experimento foi realizado em delineamento
em blocos casualizados em esquema fatorial (3x3) com trecircs
repeticcedilotildees As plantas regeneradas foram enraizadas e
aclimatadas em laboratoacuterio
Sementes comerciais da cultivar Santa Clara apoacutes
serem desinfestadas por um minuto em aacutelcool etiacutelico a 96
e em hipoclorito de soacutedio comercial a 20 (vv) com duas
gotas de detergente comercial durante 25 minutos foram
enxaguumladas 5 vezes em aacutegua bidestilada esterilizada e
inoculadas em meio MS 100 (MURASHIGE amp SKOOG
1962) solidificado com 7 g L-1 de aacutegarndashaacutegar por sem
reguladores de crescimento O meio foi distribuiacutedo em
frascos de vidro esteacutereis utilizados para cultura de tecidos
com 30 mL de meio MS As culturas foram mantidas em
sala de crescimento com temperatura de 25+2 ordmC
fotoperiacuteodo de 16 horas e luminosidade de 50 mmol m-2s-
1 As placircntulas obtidas aos 14 15 e 20 dias apoacutes a semeadura
foram usadas como fonte de explantes para os blocos 1 2
e 3 respectivamente Os explantes foram inoculados de
acordo com os meacutetodos descritos a seguir em placas de
Petri devidamente esterilizadas e autoclavadas contendo
30 mL de meio de cultura com 16 unidades por tipo de
explante por meio de cultura utilizado Cada 16 explantes
constituiu uma parcela do experimento sendo composta
por duas placas de Petri cada uma com 8 explantes
Os tipos de explantes foram os seguintes
A - que consistiu na decapitaccedilatildeo de placircntulas onde
essa decapitaccedilatildeo ocorreu diretamente abaixo do noacute do
cotileacutedone ficando o hipocoacutetilo com as radiacuteculas
SOUZA G de F M V e et al90
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
B - meacutetodo de cotileacutedones fendidos os cotileacutedones
foram fendidos ao longo da nervura central da extremidade
ateacute sua metade de acordo com o protocolo de Faacuteri et al
(2000)
C - cotileacutedones foram aparados e seguiu-se o
protocolo descrito por Redenbaugh et al (1992) Os
cotileacutedones aparados nas extremidades distal e proximal
(aacutepice e peciacuteolo) foram inoculados com a face abaxial em
contato com o meio
Foram realizadas trecircs repicagens para alongar os
brotos Cerca de 30 dias apoacutes a inoculaccedilatildeo dos explantes
foi realizada a primeira repicagem Os intervalos entre as
repicagens foram em torno de 5 semanas
Os tratamentos consistiram na inoculaccedilatildeo dos trecircs
tipos de explantes descritos nos trecircs meios de cultura
abaixo com trecircs repeticcedilotildees por tratamento
Meio MI macro e micronutrientes de Murashige amp
Skoog (1962) e vitaminas B5 de Gamborg et al (1968)
suplementado com 30 gL de sacarose e de 8 gL de aacutegar-
aacutegar pH 58 meio MII meio de cultura MI suplementado
com 1 mgL de zeatina e 30 gL de glicose conforme
McCormick (1991) meio MIII meio de cultura MI
suplementado com 25 mgL de BAP e 02 mgL de AIA
segundo Rhim et al (1995)
Para as repicagens foi utilizado o meio MI
suplementado com 05 mgL 08 mgL e 10 mgL de BAP
para a primeira segunda e terceira repicagens
respectivamente
Para enraizamento foi usado o meio MI
suplementado com 05 mgL de AIA As placircntulas
enraizadas foram transferidas para substrato comercial
Plantimax esterilizado e aclimatadas em laboratoacuterio
Os brotos com 2 cm de comprimento foram
transferidos para o meio de enraizamento citado e
permaneciam nesse meio durante 15 dias Apoacutes esse periacuteodo
os brotos eram transplantados para substrato comercial
Plantimax autoclavado irrigados com aacutegua uma a duas
vezes por dia ateacute a aclimataccedilatildeo A aclimataccedilatildeo ocorreu em
torno de 20 dias em condiccedilotildees de laboratoacuterio
Avaliou-se a induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo o
alongamento de brotos e o enraizamento e aclimataccedilatildeo
das plantas regeneradas
Os dados de contagem foram transformados para
50x As anaacutelises de normalidade e homogeneidade
foram realizadas pelo software Prophet Os dados obtidos
foram submetidos agrave anaacutelise de variacircncia e as meacutedias
comparadas pelo teste de Tukey ao niacutevel de 5 de
probabilidade pelo software SANEST (ZONTA amp
MACHADO 1989)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Para cotileacutedone decapitado ocorreu um iniacutecio de
formaccedilatildeo de calosidade por volta de 10 dias apoacutes inoculaccedilatildeo
e o surgimento de brotos ocorreu cerca de 12 dias depois da
inoculaccedilatildeo sem a formaccedilatildeo de calos propriamente ditos A
induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo foi mais raacutepida quando usado esse
tipo de explante indicando um alto potencial de
organogecircnese espontacircnea sendo que o meio MI foi o melhor
para a induccedilatildeo e nuacutemero total de brotos (Tabela 1)
No cotileacutedone fendido o iniacutecio de formaccedilatildeo de
calosidade aconteceu com aproximadamente 10 dias apoacutes
inoculaccedilatildeo Por volta de 18 dias depois da inoculaccedilatildeo
iniciou-se o surgimento de brotos e jaacute existiam calos
formados Para esse tipo de explante nos meios MI e MII
ocorreu apenas a formaccedilatildeo de calos enquanto no meio
MIII ocorreu a formaccedilatildeo de calos e calos com brotos sendo
alto o nuacutemero total de brotos (Tabela 1) Supotildee-se que a
maior superfiacutecie de corte tenha influecircncia significativa
sobre esse fenocircmeno onde a maior superfiacutecie de corte do
cotileacutedone resulta em maior capacidade de regeneraccedilatildeo
(FAacuteRI et al 1995b)
No cotileacutedone aparado com cerca de 10 dias apoacutes
inoculaccedilatildeo ocorreu o iniacutecio de formaccedilatildeo de calos e 20 dias
depois da inoculaccedilatildeo ocorreu o surgimento de brotos e jaacute
existiam calos formados Para esse tipo de explante nos
meios MI MII e MIII ocorreu a formaccedilatildeo de calos no
entanto apenas no meio MIII ocorreu a formaccedilatildeo de calos
com brotos (Tabela 1)
Capacidade de regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro 91
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
TABELA 1 ndash Frequumlecircncia de induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo in vitro da cultivar Santa Clara do grupo Santa Cruz UberlacircndiaUFU 2001
Dados seguidos de mesma letra nas colunas (abc) e nas linhas (AB) natildeo diferem entre si a 5 de probabilidade peloteste de TukeyA diferenccedila entre o nordm de explantes de um meacutetodo para outro eacute devida a parcelas (ou parte delas) perdidas
Nos trecircs ciclos de repicagens a capacidade de
alongamento dos brotos foi igual indicando que as
concentraccedilotildees de BAP natildeo diferiram estatisticamente entre
si dentro de cada tipo de explante Em relaccedilatildeo ao nuacutemero
de brotos alongados na primeira e terceira repicagens o
cotileacutedone decapitado apresentou maior nuacutemero jaacute na
segunda repicagem natildeo houve diferenccedila entre os tipos de
explantes (Tabela 2)
As plantas apoacutes serem enraizadas foram
transferidas para aclimataccedilatildeo obtendo-se 82 de plantas
aclimatadas Cerca de 20 dias apoacutes transplantio para o
substrato as plantas jaacute estavam aclimatadas
Apoacutes a terceira repicagem ainda existiam cerca de
334 brotos para serem novamente repicados e 51 brotos
prontos para serem enraizados perfazendo um total geral
de 549 brotos obtidos ateacute a fase estudada
Para o tipo de explante cotileacutedone decapitado foram
obtidos 181 brotos equivalentes a 174 brotos por explante
Para o explante cotileacutedone fendido o nuacutemero de brotos por
Tipos de Explantes Variaacuteveis Meios Cotileacutedone decapitado Cotileacutedone fendido Cotileacutedone aparado
I 396 aA 050 cB 142 bB II 000 bB 632 bA 672 aA Nordm de explantes
com calos III 000 bB 1599 aA 597 bB I 1095 aA 000 bB 000bB II 050 bA 000 bA 000 bA Nordm de explantes
com brotos III 130 bB 1217 aA 850 aA I 396 aA 050 cB 169 cB II 000 bB 632 bA 645 bA Nordm total de
calos III 000 bB 3630 aA 2655 aA I 1850 aA 000 bB 000 bB II 050 bA 000 bA 000 bA Nordm total de
brotos III 130 bB 2760 aA 2934 aA I 48 32 40 II 32 40 32 Nordm de
explantes III 24 40 48 Total de explantes 104 112 120
explante foi igual a 145 e para o cotileacutedone aparado foram
obtidos 170 brotos por explante Esses resultados foram
semelhantes aos obtidos por Faacuteri et al (2000) para as
cultivares IPA-5 e IPA-6 os quais concluiacuteram que a
utilizaccedilatildeo de cotileacutedones fendidos e cotileacutedones aparados
produziram uma regeneraccedilatildeo alta e onde a maior induccedilatildeo
foi conseguida utilizando-se um meio igual ao MIII utilizado
nesse experimento A induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo tambeacutem foi
mais raacutepida quando usado cotileacutedone decapitado indicando
um alto potencial de organogecircnese espontacircnea A cultivar
Santa Clara mostrou-se mais eficiente na formaccedilatildeo de
brotos alongados observados na primeira repicagem
enquanto as cultivares utilizadas por Faacuteri et al (2000) IPA-
5 e IPA-6 necessitaram de duas repicagens para o
alongamento dos brotos no entanto a cultivar IPA-5
mostrou-se mais eficiente na produccedilatildeo de brotos por
explante Faacuteri et al (2000) utilizaram zeatina durante os trecircs
ciclos de repicagem enquanto nesse experimento foi
utilizado BAP
SOUZA G de F M V e et al92
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
TABELA 2 ndash Capacidade de alongamento e enraizamento de brotos da cultivar Santa Clara durante os trecircs ciclos derepicagem Uberlacircndia UFU 2001
Dados seguidos de mesma letra nas colunas (ab) e nas linhas (AB) natildeo diferem entre si a 5 de probabilidade peloteste de TukeyTipos de explantes A - cotileacutedone decapitado B - cotileacutedone fendido C - cotileacutedone aparado
Os resultados aqui obtidos tambeacutem foram
semelhantes aos de Faacuteri et al (1995b) que trabalhando
com transformaccedilatildeo geneacutetica da berinjela (Solanum
melongena L) observaram que a maior superfiacutecie de corte
do cotileacutedone resultou em maior capacidade de
regeneraccedilatildeo Tambeacutem foram obtidos resultados
semelhantes aos de Nogueira et al (2001) que estudando
a regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro Santa Clara utilizando
como explantes cotileacutedones concluiacuteram que o meio com
uma combinaccedilatildeo adequada de auxina e citocinina (10 mg L-
1 de zeatina e 01 mg L-1 de AIA) promoveu uma maior
meacutedia de regeneraccedilatildeo e um maior nuacutemero meacutedio de brotaccedilotildees
por explante Costa et al (2000) trabalhando com as
cultivares IPA-5 e IPA-6 chegaram a uma conclusatildeo
semelhante onde meio suplementado com 10 mg L-1 de
zeatina + 01 mg L-1 de AIA e meio suplementado com 25
mg L-1 de BAP + 02 mg L-1 de AIA determinaram a maior
frequumlecircncia de regeneraccedilatildeo de explantes cotiledonares e
tambeacutem um maior nuacutemero de brotos alongados por explante
McCormick et al (1986) pesquisando a morfogecircnese
in vitro de L esculentum observaram que a presenccedila de 25
mg L-1 de BAP e 10 mg L-1 de AIA ou 10 mg L-1 de BAP e
02 mg L-1 de AIA produziu um maior nuacutemero de ramos por
explante a partir de explantes de cotileacutedones e hipocoacutetilos
Ohki et al (1978) utilizando segmentos de hipocoacutetilos de L
esculentum sugeriram que o efeito positivo da combinaccedilatildeo
de auxinas e citocininas na regeneraccedilatildeo in vitro pode ser
causado por uma maior capacidade das ceacutelulas dessa espeacutecie
em utilizar e adaptar-se agrave combinaccedilatildeo de auxinas e citocininas
de que somente citocininas Para os mesmos autores a
variabilidade observada nas respostas morfogecircnicas in vitro
para diferentes citocininas pode ser causada pela variaccedilatildeo
na razatildeo de degradaccedilatildeo dessas substacircncias nos tecidos
vegetais ou no meio de cultivo Segundo Caldas et al (1999)
uma alta relaccedilatildeo citocininaauxina normalmente leva a maior
induccedilatildeo de parte aeacuterea (brotos) em explantes in vitro
principalmente quando a citocinina usada eacute o BAP que induz
a formaccedilatildeo de grande nuacutemero de brotos e alta taxa de
multiplicaccedilatildeo em muitos sistemas de micropropagaccedilatildeo
Tanto no presente trabalho quanto nos trabalhos acima
citados foram utilizados meios com pelo menos uma
combinaccedilatildeo com alta relaccedilatildeo citocininaauxina e meios
contendo apenas citocinina
CONCLUSOtildeES
A maior induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo tanto de calos
quanto de brotos foi observada nos meacutetodos cotileacutedone
fendido e cotileacutedone aparado quando colocados no meio
com BAP (25 mgL) e AIA (02 mgL) (MIII) Um ciclo de
repicagem foi suficiente para obtenccedilatildeo de brotos
alongados A maior regeneraccedilatildeo de brotos alongados
ocorreu com o meacutetodo cotileacutedone decapitado
Meios M1 + 05 mgL BAP M1 + 08 mgL BAP M1 + 10 mgL BAP
Repicagem 1 Repicagem 2 Repicagem 3
M1+ 05 mgl AIA
Tipos de Explante
s
Nordm total de brotos
Nordm de brotos
alongados
Nordm total de brotos
Nordm de brotos
alongados
Nordm total de brotos
Nordm de brotos
alongados
Nordm total de placircntulas
enraizadas
Nordm total de
plantas aclimatadas
Nordm total geral de brotos
A 3117 bA 899 aA 3684 bA
866 aA 3174 bA
81 aA 80 67 181 B 536 aA 466 bA 6244 aA 633 aA 5158 aA 450 bA 41 33 163 C 3527 bA 400 bA 4368 bA
566 aA 3928 bA
312 bA 43 35 205
Total 164 135 549
Capacidade de regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro 93
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
AGRADECIMENTOS
Ao Instituto de Geneacutetica e Bioquiacutemica e ao Instituto
de Ciecircncias Agraacuterias da Universidade Federal de
Uberlacircndia pelo financiamento deste projeto e a todos
que auxiliaram direta eou indiretamente
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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SILVA A S et al94
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
INDUCcedilAtildeO DE CALOS A PARTIR DE CULTURA DE ANTERAS DECAFEEIRO (Coffea arabica L) CV CATUAIacute VERMELHO 99 E 44
CALLUS INDUCTION FROM ANTHER CULTURE OF COFFEE PLANT (Coffea arabica L) CV CATUAIacute VERMELHO 99 AND 44
ADELAIDE SIQUEIRA SILVA1 JOSEacute MAGNO QUEIROZ LUZ2 DENISE GARCIA SANTANA2 PATRIacuteCIA CRYSTIE VIEIRA MUSTAFA3 MOACIR PASQUAL4 GLAUCIA DE FATIMA MOREIRA VIEIRA E SOUZA2
1Mestranda do Curso de Agronomia ndash Universidade Federal de UberlacircndiaUFU ndash Av Engenheiro Diniz 1178 ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash adelaidebioyahoocombr2Professor Dr ndash Universidade Federal de UberlacircndiaUFU ndash Instituto de Ciecircncias Agraacuterias ndash Curso de Agronomia ndash AV Paraacute Bloco 2E SALA 14campus Umuarana ndash Caixa-Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG3Bioacuteloga Universidade Federal de UberlacircndiaUFU ndash Centro de Ciecircncias Biomeacutedicas ndash Departamento de Agronomia ndash Rua Amazonas snordm - Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos sala 2E-14 ndash Umuarama ndash 38400920 ndash Uberlandia MG ndash patriciacrystiezipmailcombr
4Doutor Departamento de Adgricultura DAG ndash Universidade Federal de Lavras UFLA ndash Campus universitaacuterio ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash mpasqualuflabr
RESUMONo Brasil o cafeacute ainda apresenta poucos progressos com
relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo da cultura de tecidos vegetais tornando-se degrande importacircncia o conhecimento sobre a atuaccedilatildeo dosreguladores de crescimento Com este trabalho avaliou-se ocomportamento de duas cultivares de Coffea arabica L CatuaiacuteVermelho LCH-2077-2-5-99 e LCH-2077-2-5-44 denominadasrespectivamente de Catuaiacute Vermelho 99 e Catuaiacute Vermelho 44quanto agrave ausecircncia e presenccedila de luz e quantificou-se a interaccedilatildeoentre os reguladores de crescimento 24-D e BAP O experimentofoi realizado no Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos Vegetais daUniversidade Federal de Uberlacircndia As anteras das cultivaresCatuaiacute Vermelho 99 e 44 foram inoculadas em meio basal MSsuplementado com quatro concentraccedilotildees de 24-D (905 181271 e 362 mM) e duas concentraccedilotildees de BAP (0 e 89 mM) napresenccedila de luz e ausecircncia de luz As avaliaccedilotildees para a oxidaccedilatildeointumescimento e calosidade foram realizadas aos 30 dias apoacutes ainoculaccedilatildeo no meio de cultura e o diacircmetro dos calos aos 45 diasApoacutes 30 dias de cultivo os calos obtidos foram classificados emfriaacuteveis esverdeados esbranquiccedilados e cinza Os resultadosmostraram que para ocorrer intumescimento das anterasformaccedilatildeo e aumento do tamanho dos calos de ambas cultivares eacutenecessaacuterio que haja interaccedilatildeo entre a auxina (24-D) e a citocinina(BAP) Dentre os tipos de calos os de coloraccedilatildeo cinza foram osque apresentaram maior frequumlecircncia para as duas cultivares
Termos para indexaccedilatildeo Melhoramento calos reguladores decrescimento cafeeiro
ABSTRACTIn Brazil coffee still presents little progress regarding
the application of plant tissue culture which turns important theunderstanding of the action of growth regulators This workevaluated the in vitro performance of two Coffea arabica Lcultivars Catuaiacute Vermelho LCH-2077-2-5-99 and LCH-2077-2-5-44 known as Catuaiacute Vermelho 99 and Catuaiacute Vermelho 44respectively in the presence and absence of light and theinteraction of 24-D and BAP The experiment was carried out at
the Plant Tissue Culture Laboratory of the Universidade Federalde Uberlacircndia Anthers from both cultivars were inoculated inMS basal medium supplemented with four concentrations of24-D (905 181 271 and 362 mM) and two concentrations ofBAP (0 or 89 mM) in the presence and absence of lightOxidation intumescences and callus formation evaluations wereobtained 30 days after inoculation and callus diameter measuredat 45 days of inoculation The observed callus was classified asfriable greenish whitish or gray The results showed that antherintumescences callus formation and growth of both cultivarsdemand the interaction between the auxin (24-D) and thecytokinin (BAP) Callus presenting gray color were the mostfrequent for both cultivars
Index terms Plant breeding callus growth regulators coffee plant
INTRODUCcedilAtildeO
O cafeeiro pertence agrave famiacutelia Rubiaceae na qual o
gecircnero Coffea abrange cerca de 60 espeacutecies sendo as mais
comuns no mercado Coffea araacutebica L e Coffea canephora
Pierre ex Froehn Os programas de melhoramento do cafeacute
demandam aproximadamente 25 anos desde a hibridaccedilatildeo
ateacute a obtenccedilatildeo de uma nova cultivar (PASQUAL et al
2002) A cultura de anteras eacute considerada uma ferramenta
importante pois possibilita a obtenccedilatildeo de linhas
homozigoacuteticas em uma uacutenica etapa (ANDRADE 1998)
acelerando drasticamente o processo de obtenccedilatildeo de novas
cultivares Sendo assim a teacutecnica de cultura de anteras
vem auxiliar no melhoramento da cultura pois permite a
obtenccedilatildeo de haploacuteides em geraccedilotildees segregantes o que
leva agrave raacutepida produccedilatildeo de plantas homozigotas por meio
(Recebido em 14 de outubro de 2003 e aprovado em 29 de outubro de 2006)
Induccedilatildeo de calos a partir de cultura 95
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
da duplicaccedilatildeo do nuacutemero de cromossomos numa uacutenica
etapa substituindo as geraccedilotildees de auto fecundaccedilatildeo
Acrescenta-se a isso o fato de os haploacuteides serem livres
dos problemas de dominacircncia e recessividade por possuir
apenas um alelo em cada loco gecircnico
No Brasil Coffea arabica ainda apresenta poucos
progressos com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo da cultura de anteras
Daiacute a importacircncia de se produzir mais conhecimentos sobre
a atuaccedilatildeo dos reguladores de crescimento na expressatildeo
androgeneacutetica de Coffea arabica identificaccedilatildeo de
genoacutetipos androgecircnicos bem como a determinaccedilatildeo de
condiccedilotildees fiacutesicas mais adequadas agrave incubaccedilatildeo de anteras
nessa espeacutecie
Nos programas de melhoramento as teacutecnicas
convencionais tecircm apresentado resultados promissores
na cultura do cafeacute no que se refere ao aumento de
produtividade e obtenccedilatildeo de novas cultivares Um fator
importante para o sucesso da cultura de anteras eacute conhecer
o estaacutedio ideal de desenvolvimento dos microacutesporos com
o intuito de se obter uma melhor resposta androgeneacutetica
utilizando microacutesporos receacutem-liberados da teacutetrade meioacutetica
ateacute no maacuteximo o estaacutedio binucleado A fase uninucleada
responde positivamente ao processo embriogecircnico porque
nesta fase os microacutesporos apresentam uma parede celular
delgada o que a torna mais receptiva aos fatores externos
Em estaacutedios mais avanccedilados da microsporogecircnese ocorre
um engrossamento da parede celular sendo esta uma
caracteriacutestica do gratildeo de poacutelen maduro do cafeacute
prejudicando o processo de regeneraccedilatildeo (ASCANIO amp
ARCIA 1994) Os autores Grando amp Moraes Fernandes
(1993) sugerem que o potencial embriogecircnico do gratildeo de
poacutelen pode ser determinado tanto no periacuteodo da meiose
quanto no periacuteodo da preacute-mitose do microacutesporo pois
nestes dois momentos o microacutesporo ainda teria
metabolicamente caracteriacutesticas esporofiacuteticas o que
permite a diferenciaccedilatildeo do gratildeo de poacutelen em embriatildeo e
posterior formaccedilatildeo de uma planta
Segundo Mantell et al (1994) satildeo possiacuteveis vaacuterios
tipos de desenvolvimento do microacutesporo in vitro sendo
que tanto o nuacutecleo generativo quanto o vegetativo pode
se dividir continuamente originando um embrioacuteide
haploacuteide ou ainda a primeira mitose produziria dois nuacutecleos
semelhantes e estes se dividiriam repetidamente resultando
na formaccedilatildeo de embrioacuteides haploacuteides
A composiccedilatildeo do meio de cultura tambeacutem eacute de
grande importacircncia para o sucesso da cultura de anteras
natildeo existindo contudo uma recomendaccedilatildeo generalizada
Na maioria das espeacutecies a androgecircnese se verifica em meios
que conteacutem sais minerais sacarose vitaminas reguladores
de crescimento e aacutegar (MORAES FERNANDES 1990) A
consistecircncia do meio normalmente eacute semi-soacutelida mas os
meios liacutequidos estatildeo sendo cada vez mais usados pois
tecircm vantagens no aumento do rendimento pela maior
obtenccedilatildeo de embriotildees e calos (PIERIK 1987) O
presente trabalho teve como objetivo aplicar a teacutecnica da
cultura de anteras em diferentes cultivares de Coffea
arabica verificando os vaacuterios fatores que influenciam a
induccedilatildeo de calos
MATERIAL E MEacuteTODOS
Experimentos de Induccedilatildeo e Regeneraccedilatildeo de Calos
Esta etapa constituiu-se de dois experimentos cada
um com uma cultivar tendo sido conduzidos no laboratoacuterio
de Cultura de Tecidos Vegetais da Universidade Federal
de Uberlacircndia em Uberlacircndia - Minas Gerais no periacuteodo
de setembro de 2002 a janeiro de 2003
Foram utilizados bototildees florais de duas cultivares
de Coffea araacutebica Catuaiacute Vermelho LCH-2077-2-5-99 e
LCH-2077-2-5-44 denominadas respectivamente de Catuaiacute
Vermelho 99 e Catuaiacute Vermelho 44 plantadas na aacuterea
experimental do Campus Umuarama dessa Universidade
Os bototildees florais foram coletados no periacuteodo de 8 agraves 9
horas da manhatilde e armazenados em placas de Petri contendo
papel de filtro umedecido em aacutegua destilada e colocados
dentro de uma caixa de isopor para evitar a desidrataccedilatildeo
ateacute serem conduzidos ao laboratoacuterio
No laboratoacuterio o comprimento dos bototildees foi
medido com o auxiacutelio de um paquiacutemetro e utilizaram-se
SILVA A S et al96
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
bototildees florais entre 45 a 60 mm de comprimento em todos
os experimentos Os bototildees foram envoltos em gaze
previamente autoclavada e desinfestados em uma soluccedilatildeo
de aacutelcool 70 por alguns segundos e por 10 minutos em
soluccedilatildeo de hipoclorito de soacutedio a 02 sob agitaccedilatildeo Em
seguida na cacircmara de fluxo laminar foram lavados 3 vezes
em aacutegua destilada e autoclavada Apoacutes este processo as
anteras foram retiradas dos bototildees com o auxiacutelio de uma
lupa uma pinccedila fina e bisturi nordm 10 sendo os uacuteltimos
flambados para cada botatildeo tomando-se o cuidado para
natildeo ferir as anteras Logo apoacutes as anteras foram imersas
por 1 segundo em soluccedilatildeo de aacutecido ascoacuterbico na
concentraccedilatildeo de 600 mgL-1 hipoclorito de soacutedio 02 e
aacutegua destilada e autoclavada respectivamente
Apoacutes este processo as anteras foram inoculadas
em tubo de ensaio contendo 20 mL do meio MS
(MURASHIGE amp SKOOG 1962) suplementado com aacutecido
24-diclorofenoxiaceacutetico (24-D) e 6- benzilaminopurina
(BAP) em diferentes concentraccedilotildees com pH ajustado para
58 Este meio foi esterilizado em autoclave vertical agrave
temperatura de 121deg C sob pressatildeo de 1 atm por 20 minutos
O delineamento experimental utilizado foi o de
blocos casualizados com 10 repeticcedilotildees em esquema fatorial
4 x 2 x 2 sendo que os fatores foram compostos de quatro
concentraccedilotildees de 24-D (905 181 271 362 mM) duas
concentraccedilotildees de BAP (0 e 89 mM) perfazendo oito
tratamentos incubados na ausecircncia ou presenccedila de luz
em sala de crescimento com temperatura de 25 plusmn 2degC e 16
horas de fotoperiacuteodo Nos dois experimentos cada
tratamento teve 10 repeticcedilotildees sendo um tubo com 10
anteras considerado uma repeticcedilatildeo
Aos 30 dias apoacutes a inoculaccedilatildeo das anteras foram
avaliadas as porcentagens de oxidaccedilatildeo de intumescimento
e de formaccedilatildeo de calos (calosidade) e aos 45 dias foi medido
o diacircmetro dos calos
Os calos obtidos das duas cultivares apoacutes 45 dias
de inoculaccedilatildeo das anteras foram transferidos para o meio
MS suplementado com 30 gL-1 de sacarose 6gL-1 de agar e
de 24-DBAP nas seguintes concentraccedilotildees de 1810 181
2 2710 e 3620 mM com pH ajustado para 58 associando
a ausecircncia e presenccedila de luz
Apoacutes a permanecircncia destes calos no meio de cultura
por 30 dias aqueles provenientes da cultivar Catuaiacute
Vermelho 99 incubados na presenccedila de luz foram
transferidos para o meio de cultura contendo 271 mM de
24-D enquanto que aqueles incubados na ausecircncia de
luz foram transferidos para meio contendo 362 mM de 24-
D Jaacute os calos da cultivar Catuaiacute Vermelho 44 incubados
na presenccedila de luz foram transferidos para meio contendo
181 mM de 24-D e 89 mM de BAP e os incubados na
ausecircncia de luz transferidos para o meio contendo 181
mM de 24-D
Apoacutes 30 dias neste tratamento foram avaliadas as
caracteriacutesticas referentes ao tipo de calo (friaacuteveis
esverdeados esbranquiccedilados e cinza)
Os dados obtidos foram testados quanto agrave
normalidade e agrave homogeneidade necessitando de
transformaccedilatildeo em arco seno para os dados em
porcentagem e raiz quadrada de (x + 05) para os dados
referentes ao diacircmetro dos calos
RESULTADOS
Interaccedilatildeo entre os Reguladores de Crescimento e oFotoperiacuteodo
Para a cultivar Catuaiacute 99 em todas as concentraccedilotildees
de 24-D e independentemente da concentraccedilatildeo de BAP a
oxidaccedilatildeo foi menor na ausecircncia de luz diferindo
estatisticamente da fase em que se tinha presenccedila de luz
No entanto nos calos cultivados nas concentraccedilotildees de
905 e 271 mM de 24-D e 89 mM de BAP na ausecircncia de
luz foi observado um aumento significativo na oxidaccedilatildeo
das anteras o mesmo acontecendo na concentraccedilatildeo de
271 mM de 24-D na presenccedila de luz No entanto resultado
inverso foi observado para a concentraccedilatildeo de 362 mM de
24-D (Tabela 1)
Os resultados do percentual de intumescimento
variaram bastante em funccedilatildeo da luminosidade e
reguladores de crescimento (Tabela 1) Na presenccedila do
Induccedilatildeo de calos a partir de cultura 97
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
BAP e concentraccedilatildeo 89 mM de 24-D tanto na presenccedila
ou ausecircncia de luz o intumescimento dos calos natildeo diferiu
significativamente Jaacute na concentraccedilatildeo de 181 mM de 24-
D na presenccedila de luz se mostrou melhor promovendo um
aumento significativo do intumescimento das anteras
Quanto agraves concentraccedilotildees de 271 e 362 mM de 24-D
cultivados na presenccedila de luz se mostrou melhor ao
intumescimento quando comparado agravequeles cultivados na
ausecircncia de luz (Figura 1)
A presenccedila de calos aumentou significativamente
com a incubaccedilatildeo das anteras na ausecircncia de luz e na
TABELA 1 ndash Meacutedias do nuacutemero de anteras oxidadas intumescidas e com calos e diacircmetro dos calos (mm) em funccedilatildeode diferentes concentraccedilotildees de 24-D e ausecircncia ou presenccedila de BAP em duas condiccedilotildees de luminosidade (presenccedilaou ausecircncia de luz) para anteras do genoacutetipo cv 99
Luminosidade1
Oxidaccedilatildeo () Intumescimento ()
Calosidade () Diacircmetro (mm) 24-D M
BAP M luz Escuro Luz Escuro luz Escuro luz Escuro 0 980 b A 395 a A 000b B 434 a A 000 b A 740 a A 000 b A 309 a A 905
89 999 b A 823 a B 398 a A 327 a B 007 b A 615 a A 000 b A 300 a A 0 999 b A 524 a A 000 b B 447 a A 007 b A 750 a A 000 b B 368 a A
181 89 935 b A 511 a A 614 a A 407 b A 030 b A 720 a A 300 b A 387 a A
0 745 b A 000 a A 534 a A 000 b B 530 a A 000 b B 318 a B 000 b B 271
89 914 b B 590 a B 625 a A 634 a A 708 a A 809 a A 377 a A 298 b A 0 999 b B 440 a A 607 a A 492 b A 097 b B 815 a A 300 a B 277 a A
362 89 813 b A 426 a A 493 a B 527 a A 378 b A 758 a A 398 a A 298 b A
1Meacutedias seguidas por letras diferentes minuacutesculas na linha e maiuacutesculas na coluna dentro de cada concentraccedilatildeo de 2-4-D diferem entre si pelo teste de Tuckey a significacircncia de 5
concentraccedilatildeo de 271 mM de 24-D nas demais
concentraccedilotildees de 24-D independente da concentraccedilatildeo
do BAP a incubaccedilatildeo na ausecircncia de luz apresentou
meacutedias de calosidade significativamente maiores (Figura
2) A presenccedila do BAP promoveu aumento significativo
na calosidade das anteras na concentraccedilatildeo 271 mM de
24-D na ausecircncia de luz e na concentraccedilatildeo de 362 mM
de 24-D na presenccedila de luz Nas demais concentraccedilotildees
natildeo houve diferenccedila significativa entre presenccedila ou
ausecircncia de BAP tanto na ausecircncia ou presenccedila de luz
(Tabela 1)
FIGURA 1 ndash Anteras da cv Catuaiacute Vermelho 99 naconcentraccedilatildeo de 181 M de 24-D na presenccedila de luz
FIGURA 2 ndash Calos de anteras incubadas na ausecircncia deluz e na concentraccedilatildeo de 271 M de 24-D
SILVA A S et al98
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
Quanto ao diacircmetro nas concentraccedilotildees 905 e 181 M
de 24-D a ausecircncia de luz promoveu aumento significativo
no diacircmetro dos calos diferindo-se estatisticamente do
tratamento na presenccedila de luz Somente para a concentraccedilatildeo
de 271 mM de 24-D na ausecircncia do BAP natildeo houve diferenccedila
significativa para a caracteriacutestica independentemente do
fotoperiacuteodo Nas demais concentraccedilotildees de 24-D o tratamento
na presenccedila de luz promoveu um aumento significativo no
diacircmetro dos calos No tratamento em que houve a associaccedilatildeo
da presenccedila de luz e de BAP natildeo diferiu estatisticamente do
tratamento em que houve a ausecircncia de BAP quando a
concentraccedilatildeo de 24-D foi de 905 mM nos demais
proporcionou aumento significativo no diacircmetro dos calos
Para o tratamento na ausecircncia de luz apenas na concentraccedilatildeo
de 271 mM de 24-D a ausecircncia de BAP promoveu diminuiccedilatildeo
significativa no diacircmetro de calos Nas demais concentraccedilotildees
natildeo houve diferenccedila significativa entre presenccedila ou ausecircncia
de BAP (Tabela 1)
Para as variaacuteveis intumescimento e calosidade da
cultivar cv 44 a interaccedilatildeo entre 24-D e BAP natildeo diferiram
estatisticamente quanto presenccedila e ausecircncia de luz nas
concentraccedilotildees 905 e 362 mM de 24-D e que tambeacutem natildeo
difere para o diacircmetro na concentraccedilatildeo de 181 mM de 24-
D Jaacute na concentraccedilatildeo 271 mM de 24-D haacute uma semelhanccedila
quanto ao intumescimento calosidade e diacircmetro que
diferem das demais concentraccedilotildees natildeo apresentando
portanto uma boa interaccedilatildeo
A melhor interaccedilatildeo para intumescimento calosidade
e diacircmetro encontra-se respectivamente na concentraccedilatildeo
905 mM de 24-D na presenccedila de luz na concentraccedilatildeo 181
mM de 24-D na ausecircncia de luz e na concentraccedilatildeo 905
mM de 24-D na ausecircncia de luz Jaacute as piores interaccedilotildees
estatildeo na concentraccedilatildeo 271 mM de 24-D na luz tanto para
o intumescimento quanto para o diacircmetro analisados na
Tabela 2
De acordo com a Tabela 2 observou-se que os
melhores resultados ou seja as interaccedilotildees independem
da presenccedila ou ausecircncia de BAP Na Tabela 3 notou-se
uma maior oxidaccedilatildeo das anteras quando incubadas no claro
estas apresentaram uma maior oxidaccedilatildeo em relaccedilatildeo as que
foram incubadas no escuro tornando-se mais tarde calos
previamente oxidados
TABELA 2 ndash Meacutedias do nuacutemero de anteras intumescidas e com calos diacircmetro dos calos (mm) em funccedilatildeo de diferentesconcentraccedilotildees de 24-D e ausecircncia ou presenccedila de BAP em duas condiccedilotildees de luminosidade (luz e escuro) para anterasdo genoacutetipo cv 44
Luminosidade1
Intumescimento () Calosidade () Diacircmetro (mm) 24-D ( M)
BAP ( M) Luz Escuro Luz Escuro Luz Escuro
0 907 a A 775 a A 779 bA 948 aA 609 bA 800 aA 905 89 843 a A 875 a A 889 aA 946 aA 607 aA 420 bB 0 887 a A 852 a A 939 aA 990 aA 490 aA 466 aA
181 89 906 a A 786 a A 917 aA 959 aA 420 aA 493 aA 0 600 b A 772 a A 694 bA 895 aA 000 bA 373 aA
271 89 022 b B 827 a A 294 bB 837 aA 000 bA 376 aA 0 828 a A 737 a A 928 aA 939 aA 414 bA 595 aA
362 89 866 a A 725 a A 949 aA 866 aA 329 aA 376 aA
1Meacutedias seguidas por letras diferente minuacutesculas na linha e maiuacutesculas na coluna dentro de cada concentraccedilatildeo de 2-4-D diferem entre si pelo teste de Tukey a significacircncia de 5
Induccedilatildeo de calos a partir de cultura 99
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
TABELA 3 ndash Meacutedias de oxidaccedilatildeo das anteras entre asdiferentes concentraccedilotildees de 24-D em duas condiccedilotildeesde luminosidade (luz e escuro) para anteras da cultivarCatuaiacute Vermelho 44
Concentraccedilotildees
24-D ( M ) OXIDACcedilAtildeO ()
Claro Escuro 905 749 a 269 b 181 420 a 270 b 271 999 a 221 b 362 308 a 334 a
1Meacutedias seguidas por letras diferentes minuacutesculas na linhadentro de cada concentraccedilatildeo de 2-4-D diferem entre sipelo teste de Tukey a significacircncia de 5
TABELA 4 ndash Tipos de calos obtidos apoacutes 30 dias em meioMS com 362 M de 24-D na ausecircncia de luz da cultivarCatuaiacute Vermelho 99
Tipos de Calos
Nuacutemero de Calos
Nuacutemero de Calos com diacircmetro acima
de 05 mm Friaacuteveis 03 Esverdeados 13 06 Esbranquiaccedilados
03 Cinza 26
Dados de contagem natildeo transformados O recultivo emmeio MS com 362 M de 24-D na presenccedila de luz teve100 de contaminaccedilatildeo apoacutes sua inoculaccedilatildeo
TABELA 5 ndashTipos de calos obtidos apoacutes 30 dias em meioMS com 181 M de 24D e 89 M de BAP na presenccedilade luz da cultivar Catuaiacute Vermelho 44
TABELA 6 ndash Tipos de calos obtidos apoacutes 30 dias em meioMS com 181 M de 24D na ausecircncia de luz da cultivarCatuaiacute Vermelho 44
Tipos de Calos Nuacutemero de Calos
Nuacutemero de Calos com diacircmetro
acima de 05 mm Friaacuteveis 58 Esverdeados 23 214 Esbranquiaccedilados 94 Cinza 203
Tipos de Calos
Nuacutemero de Calos
Nuacutemero de Calos com diacircmetro
acima de 05 mm Friaacuteveis 25 Esverdeados 11 69 Esbranquiaccedilados 19 Cinza 350
Dados de contagem natildeo transformados Dados de contagem natildeo transformados
Nesta etapa a maioria dos calos encontrados para
as trecircs cultivares apresentaram coloraccedilatildeo cinza (Tabelas 4
5 e 6) A perda gradativa da coloraccedilatildeo natural dos calos
passando de verdes para a cor marrom a diminuiccedilatildeo do
ritmo de crescimento dos mesmos a estagnaccedilatildeo do
processo de formaccedilatildeo de embrioacuteides seguido do
surgimento de aacutereas necrosadas na superfiacutecie satildeo sinais
que caracterizam a senescecircncia da cultura (SILVA 2002)
DISCUSSAtildeO
A resposta das anteras da cultivar Catuaiacute Vermelho 99
com relaccedilatildeo agrave oxidaccedilatildeo indica que a mesma estaacute associada agrave
combinaccedilatildeo entre auxina e citocinina promovendo os menores
iacutendices de oxidaccedilatildeo Agrave medida que se aumentou a
concentraccedilatildeo de 24-D na presenccedila de BAP houve um
aumento gradativo da oxidaccedilatildeo ateacute atingir um ponto maacuteximo
em torno de 80 na dosagem de 271 mM de 24-D Jaacute na
ausecircncia de BAP a oxidaccedilatildeo foi bem maior quando comparada
agrave porcentagem de oxidaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 905 mM de
24-D De acordo com Wang amp Huang (1976) o cultivo in
vitro por um periacuteodo longo induz a formaccedilatildeo de compostos
fenoacutelicos no meio que podem causar necrose e posteriormente
morte dos calos Maciel (2001) e Paluacute (2002) citam que pelos
resultados obtidos para a induccedilatildeo de calogecircnese em anteras
de cafeeiro observa-se que eacute necessaacuteria uma auxina
juntamente com uma citocinina Dentre as auxinas sinteacuteticas
o 24-D eacute sem duacutevida o mais adequado agrave induccedilatildeo e
manutenccedilatildeo do calo (GAMBORG et al 1976)
Para Thomas amp Ravindra (1997) o maior problema
na iniciaccedilatildeo de culturas lenhosas eacute a ocorrecircncia de
compostos fenoacutelicos que estatildeo ligados com processos de
regulaccedilatildeo de crescimento especialmente com as auxinas
que dependendo da sua concentraccedilatildeo endoacutegena no tecido
resulta na induccedilatildeo desses compostos
SILVA A S et al100
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
O fotoperiacuteodo que estas anteras foram submetidas
influenciou tambeacutem na porcentagem de oxidaccedilatildeo sendo
que no escuro e na presenccedila de 24-D (89 mM) a oxidaccedilatildeo
foi miacutenima Agrave medida que foi aumentando a concentraccedilatildeo
da auxina foi aumentando tambeacutem a oxidaccedilatildeo poreacutem este
aumento foi bem menor quando comparado ao cultivo das
anteras na presenccedila de luz
A oxidaccedilatildeo fenoacutelica tem sido controlada em
diferentes espeacutecies lenhosas pela reduccedilatildeo da intensidade
luminosa (MARKS amp SIMPSON 1990) associada com a
substituiccedilatildeo frequumlente do meio de cultura e dessa forma
as chances de se obter sucesso no estabelecimento e
cultivo de explantes de espeacutecies lenhosas satildeo bastante
elevadas (TEIXEIRA 2001)
Em muitas espeacutecies por razotildees natildeo conhecidas a
embriogecircnese direta eacute rara e as plantas tecircm que ser
diferenciadas a partir de calos Para induccedilatildeo destes
geralmente eacute necessaacuteria uma auxina (MAHESHWARI et
al 1982) Segundo Rocha (1998) para a induccedilatildeo e
manutenccedilatildeo do calo a maioria das espeacutecies parece
comportar-se diferentemente natildeo soacute quanto aos
reguladores de crescimento podendo ocorrer
independentemente de auxinas e citocininas dependente
de ambas ou dependente de uma ou de outra mas tambeacutem
quanto agrave presenccedila ou ausecircncia de luminosidade Sharp et
al (1973) obtiveram calos atraveacutes do cultivo de sementes
folhas e anteras de C arabica das cultivares Mundo Novo
e Bourbon Amarelo A induccedilatildeo de calos tambeacutem foi mais
eficiente na ausecircncia de luz Aleacutem disso Ascanio amp Arcia
(1994) citam que para o desenvolvimento do calo as
anteras devem ser mantidas no escuro jaacute para o
desenvolvimento do embriatildeo os calos devem ser mantidos
no claro
Natildeo houve a formaccedilatildeo de embriotildees e isto pode ser
devido agraves doses de reguladores ou mesmo de combinaccedilotildees
que natildeo foram apropriadas para estas cultivares
CONCLUSAtildeO
Os resultados mostraram que para ocorrer
intumescimento das anteras formaccedilatildeo e aumento do
tamanho dos calos de ambas as cultivares eacute necessaacuterio
que haja interaccedilatildeo entre a auxina (24-D) e a citocinina
(BAP) e incubaccedilatildeo no escuro
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PEREIRA F D et al102
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 102-106 2006
COMUNICACcedilAtildeO CIENTIacuteFICA
PROLIFERACcedilAtildeO IN VITRO DE BROTOS DE CURAUAacuteUTILIZANDO DIFERENTES VOLUMES DE MEIO DE CULTURA
IN VITRO SHOOT PROLIFERATION OF Ananas erectifolius USING DIFFERENTVOLUMES OF CULTURE MEDIUM
FLAacuteVIA DIONIacuteSIO PEREIRA1 JOSEacute EDUARDO BRASIL PEREIRA PINTO2HELEN CRISTINA DE ARRUDA RODRIGUES3 LUCIANA DOMICIANO SILVA ROSADO3
LUIZ ALBERTO BEIJO4 OSMAR ALVES LAMEIRA5
1Doutoranda em Agronomia ndash Universidade Estadual de Feira de SantanaUEFS ndash Horto Florestal ndash 44055-000 ndash Feira de Santana BA ndash flavia1808hotmailcom
2Doutor em Fisiologia Vegetal ndash Departamento de AgriculturaDAG ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash jeduardouflabr
3Graduanda em Agronomia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG4Doutorado em Agronomia ndash Universidade Federal de AlfenasUNIFAL ndash Departamento de Ciecircncias Exatas ndash Rua Gabriel Monteiro da Silva n deg 714 ndash Centro ndash 37130-000 ndash Alfenas MG ndash luizbeijoyahoocombr5Doutor em Agronomia ndash EMBRAPA ndash Amazocircnia Oriental ndash Trav Dr Eneacuteas Pinheiro sn ndash Bairro Marco ndash 66095-100 ndash Beleacutem PA ndash osmarcpatuembrapabr
RESUMOCurauaacute [Ananas erectifolius LBSm ndash Bromeliaceae] eacute
uma espeacutecie com grande potencial de uso de suas fibras comorevestimento na induacutestria automobiliacutestica Aleacutem disso o poacute dosumo do curauaacute tem sido utilizado no tratamento de cicatrizaccedilatildeode lesotildees cutacircneas Neste trabalho avaliaram-se diferentes volumesde meio MS Os volumes utilizados foram de 10 15 20 25 e 30 mLO delineamento experimental foi inteiramente casualizado (DIC)e cada tratamento continha 19 repeticcedilotildees Aos 30 dias avaliaram-se o nuacutemero e o tamanho de brotaccedilotildees Segundo a anaacutelise devariacircncia houve efeito linear do volume de meio na produccedilatildeo debrotos de curauaacute Agrave medida em que se aumenta o volume domeio aumenta o nuacutemero de brotos Natildeo houve diferenccedilasignificativa nos comprimentos dos brotos
Termos para indexaccedilatildeo Ananas erectifolius fibras vegetaismicropropagaccedilatildeo
ABSTRACTAnanas erectifolius LBSm ndash Bromeliaceae is a species
that presents fibers with great potential to be used as revetmentfor the automobile industry Besides the powder obtained fromits juice has been used in the treatment of skin lesionscicatrisation In this work the effect of different volumes (1015 20 25 and 30 mL) of MS medium during the in vitro cultureof axillary buds was evaluated A completely randomized design(CDR) was used with each treatment containing 19 replicatesAfter 30 days of inoculation shoot number and size wereevaluated The analysis of variance showed a linear effect of theculture medium volume and shoot proliferation Higher shoot
number was observed with the increase of medium volume Nosignificant difference was observed on shoot lenght
Index terms Ananas erectifolius vegetable fibermicropropagation
A produccedilatildeo de fibras vegetais ocupa um papel
relevante na economia agriacutecola mundial mesmo com a
intensa produccedilatildeo de fibras sinteacuteticas Mateacuterias-primas de
origens renovaacuteveis reciclaacuteveis e biodegradaacuteveis satildeo uma
das alternativas para a produccedilatildeo de manufaturados
ecologicamente corretos em consequumlecircncia do acuacutemulo
nos descartes de materiais natildeo biodegradaacuteveis os quais
tendem a aumentar com o crescimento populacional nos
centros urbanos A substituiccedilatildeo de materiais derivados do
petroacuteleo na produccedilatildeo de compostos elastomeacutericos por
mateacuteria-prima renovaacutevel vai ao encontro desses ideais
(ROCHA et al 2003)
As fibras sinteacuteticas destacam-se pela elevada
resistecircncia baixa densidade e elevada produccedilatildeo
Entretanto as fibras animais e vegetais satildeo as de maior
importacircncia principalmente para atender aos apelos
(Recebido em 31 de agosto de 2006 e aprovado em 19 de janeiro de 2007)
Proliferaccedilatildeo in vitro de brotos de curauaacute 103
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 102-106 2006
ecoloacutegicos e pelo nuacutemero de plantas e animais produtores
de fibras (SCHREIBER1998)
As plantas produtoras de fibras utilizaacuteveis foram
quantificadas por vaacuterios autores e em diferentes eacutepocas
tendo sido enumeradas 2000 mil plantas fibrosas e o seu
total estimado em 2300 destacando-se as florestas tropicais
que encerram recursos inesgotaacuteveis em potencial
(MEDINA 1959)
O curauaacute [Ananas erectifolius LBSm ndash
Bromeliaceae] utilizado principalmente na fabricaccedilatildeo de
cordas sacos e utensiacutelios domeacutesticos surge como
sucedacircneo para o aproveitamento de fibras O curauaacute eacute
uma bromeliaacutecea distribuiacuteda nos Estados do Paraacute Acre
Mato grosso Goiaacutes e Amazonas e eacute cultivada
principalmente por pequenos produtores da regiatildeo do
Lago Grande de Curuai no municiacutepio de Santareacutem PA
Estudos recentes tecircm demonstrado o grande potencial do
uso das fibras dessa planta como revestimento na induacutestria
automobiliacutestica devido agrave sua resistecircncia maciez e peso
reduzido O grande problema eacute que natildeo haacute suprimento
suficiente de mateacuteria-prima para atender agrave induacutestria
automobiliacutestica pois o curauaacute eacute fiel agraves suas origens amazocircnicas
e soacute se desenvolve em clima quente e uacutemido criando um
problema para a aquisiccedilatildeo de mudas fora desta regiatildeo que
por tal motivo eacute escassa no mercado (SILVA 2004)
A micropropagaccedilatildeo utilizando teacutecnicas de cultura
de tecido tem sido um valioso instrumento na propagaccedilatildeo
de diversos tipos de plantas Embora este processo envolva
diferentes etapas depois de definido um protocolo de
micropropagaccedilatildeo seja qual for a espeacutecie este pode ser
otimizado no intuito de se obter placircntulas de alta qualidade
e com baixo valor de produccedilatildeo O tipo e tamanho de frasco
e a quantidade de meio satildeo variaacuteveis que tecircm recebido
pouca atenccedilatildeo embora afetem diretamente a aacuterea superficial
da interface meio de cultura-atmosfera o volume de ar sobre
o meio de cultura e a sua profundidade Tais fatores tambeacutem
afetam a composiccedilatildeo da fase gasosa do frasco e
consequumlentemente o crescimento e desenvolvimento das
culturas (GRATTAPAGLIA amp MACHADO 1998)
Rodrigues et al (2005) verificaram maior
proliferaccedilatildeo de brotos de Cattleya persivaliana Hort
em frascos contendo 50 mL de meio quando comparados
com aqueles de 25 75 e 100 mL Nicoloso amp Erig (2002)
trabalhando com Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen
verificaram que 10 mL de meio MS (MURASHIGE amp
SKOOG 1962) proporcionaram o melhor crescimento
das placircntulas em biomassa quando cultivadas em tubos
de 20 cm de altura x 2 cm diacircmetro em comparaccedilatildeo com
os de 25 cm de altura x 2 cm 15 cm de altura x 2 cm
Carvalho et al (1995) estudando a influecircncia de fatores
fiacutesicos no desenvolvimento e crescimento in vitro de
batata-doce (Ipomoea batatas L Poir) verificaram que
10 mL de meio de cultura por frasco com explantes
proporcionaram maior formaccedilatildeo de gemas em relaccedilatildeo
aos volumes de 20 e 30 mL
Sendo assim objetivou-se neste trabalho avaliar
o volume de meio apropriado para a propagaccedilatildeo in vitro
de brotaccedilotildees de curauaacute
As brotaccedilotildees utilizadas como fonte de explante
foram fornecidas pela EMBRAPACPATU situada em
Beleacutem do Paraacute Gemas axilares de curauaacute foram
inoculadas em meio MS completo suplementado com
20 mgL de BAP (6-Benzilaminopurina) Apoacutes 30 dias
estas se desenvolveram e as brotaccedilotildees obtidas foram
transferidas para o meio MS sem regulador de
crescimento por 30 dias
Apoacutes este periacuteodo quatro explantes foram
desfolhados completamente ficando apenas porccedilotildees
basais com aproximadamente 1cm de comprimento que
foram inoculadas em meio de cultura baacutesico MS sem
regulador de crescimento em frasco de 12 cm de altura por
5 cm de diacircmetro (volume interno = 300 mL) com volumes
de 10 15 20 25 30 mL Os explantes foram mantidos em
sala de crescimento a uma temperatura de 26plusmn1degC e
fotoperiacuteodo de 16 horas sob uma Irradiacircncia de foacutetons de
25mmol m-2 s-1
O delineamento experimental foi inteiramente
casualizado (DIC) Cada tratamento continha 19 repeticcedilotildees
PEREIRA F D et al104
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 102-106 2006
(um frasco por repeticcedilatildeo) Aos 30 dias avaliaram-se o
nuacutemero e o comprimento das brotaccedilotildees O programa
utilizado para anaacutelise dos dados foi o software statistica
(SISVAR) tendo sido submetidas agrave anaacutelise de variacircncia
com aplicaccedilatildeo do teste F a 5 de probabilidade
analisando-se as meacutedias por regressatildeo polinomial
O efeito linear foi o mais adequado para explicar
a evoluccedilatildeo da taxa meacutedia de regeneraccedilatildeo do curauaacute Agrave
medida que o volume do meio de cultura aumenta existe
tendecircncia de aumento do nuacutemero de brotos Com 25
mL de meio produziu-se maior nuacutemero de brotos por
frasco (2557) e com 10 mL de meio produziu-se menor
nuacutemero de brotos (1226) O tratamento com 15 mL de
meio produziu 1765 brotos o com 20 mL 1750 e o com
30 mL 2242 (Figura 1) O volume maior de meio
disponibiliza mais nutrientes e diminui tambeacutem a
competiccedilatildeo entre as placircntulas o que explica a tendecircncia
em se obter um maior nuacutemero de brotos agrave medida que
se aumenta a quantidade do meio de cultura Em todos
os tratamentos as brotaccedilotildees obtidas foram vigorosas
com a coloraccedilatildeo verde-escura caracteriacutestica das
plantas matrizes As brotaccedilotildees tinham tambeacutem rigidez
outra caracteriacutestica da espeacutecie o que eacute devido agrave
presenccedila das fibras nas folhas Observou-se maior
concentraccedilatildeo de raiacutezes nas brotaccedilotildees maiores e natildeo
FIGURA 1 ndash Nuacutemero meacutedio de brotos por frasco de curauaacute(Ananas erectifolius) cultivados em diferentes volumesde meio MS completo 10 15 20 25 e 30
foi observada a presenccedila de calos em nenhum dos
tratamentos (Figura 2)
Resultados semelhantes foram obtidos por Reis
Lameira Reis (2004) trabalhando com curauaacute utilizando
volumes de 5 75 10 e 15 mL do meio liacutequido MS suplementados
com 25 mgL-1 de BAP (6-benzilaminopurina) os melhores
resultados sendo com os tratamentos que continham 10 e
15ml produzindo em meacutedia 121 e 154 brotosexplante
respectivamente
Da mesma forma Reis et al(2003) trabalhando com
ipeca (Psychotria ipecacuanha Stokes) em meio MS
acrescido de 15 mg L-1de BAP nos volumes de 10 20 30
e 40 mL obtiveram melhor resultado com os volumes de 30
e 40 mL (7 e 8 brotosfrasco respectivamente)
Quanto ao comprimento dos brotos natildeo houve
diferenccedila significativa Os brotos t iveram um
crescimento meacutedio de 228 cm sendo que no tratamento
com 10 mL de meio foi 257 cm com 15 mL 222 cm
com 20 mL 224 cm com 25 mL 224 cm e o tratamento
com 30 mL 215 cm Embora natildeo se tenham realizado
estudos mais aprofundados uma das hipoacuteteses
sugeridas para explicar tais resultados possivelmente
estaacute relacionada a fatores nutricionais do explante
Segundo Cappelades et al (1991) e Pereira et al (2001)
porccedilotildees basais satildeo mais robustas apresentando maior
quantidade de reservas acumuladas em seus tecidos
o que poderia levar agrave utilizaccedilatildeo dessas reservas pelas
brotaccedilotildees regeneradas para sustentar seu crescimento
Esta seria uma das causas da uniformidade apresentada
no tamanho das brotaccedilotildees em todos os tratamentos
Resultados iguais foram obtidos em estudos feitos por
Rodrigues et al (2005) quando avaliaram comprimento
meacutedio de duas espeacutecies de orquiacutedeas mantidas em meio
de cultura cujos volumes testados eram de 25 50 75 e
100 mL Portanto verifica-se que eacute muito importante
selecionar material com bom estado fisioloacutegico e
tamanho homogecircneo para se obter melhores
resultados na proliferaccedilatildeo das brotaccedilotildees eou na
morfogecircnese
Proliferaccedilatildeo in vitro de brotos de curauaacute 105
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 102-106 2006
FIGURA 2 ndash Brotaccedilotildees de curauaacute (Ananas erectifolius) produzidas in vitro em diferentes volumes de meio MS 1-Repicagem dos brotos 2- 10 mL de meio MS 3- 15 mL de meio MS 4- 20 mL de meio MS 5- 25 mL de meio MS 6- 30mL de meio MS
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
CARVALHO R FAVARETTO N PINTO J E B P Influecircnciade fatores fiacutesicos no desenvolvimento e crescimento in vitrode batata-doce (Ipomea batatas (l) Peir Ciecircncia e PraacuteticaLavras v 19 n 2 p 158-164 abrjun 1995
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PEREIRA F D et al106
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 102-106 2006
NICOLOSO F T ERIG A C Efeito do tipo de segmentonodal e tamanho do recipiente no crescimento de plantasde Pfaffia glomerata in vitro Ciecircncia e AgrotecnologiaLavras v 26 p 1499-1506 dez 2002 Ediccedilatildeo especial
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SCHREIBER V (Org) Vias de desenvolvimentosustentaacutevel as dimensotildees do desafio Beleacutem UFBANUMAPOEMAIDESP 1998 495 p (POEMA 6)
NORMAS PARA PUBLICACcedilAtildeO DE ARTIGOS E COMUNICACcedilOtildeES CIENTIacuteFICAS
1 Os conceitos e afirmaccedilotildees contidos nos artigos e comunicaccedilotildeesseratildeo de inteira responsabilidade do(s) autor(es)
2 A revista ldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquo editadasemestralmente pela Editora da Universidade Federal de Lavras(Editora UFLA) publica artigos cientiacuteficos e comunicaccedilotildeescientiacuteficas da aacuterea de cultura de tecidos de plantas elaboradospor membros da comunidade cientiacutefica nacional e internacionalNatildeo eacute cobrada taxa para publicaccedilatildeo de trabalhos Eacute condiccedilatildeofundamental que os artigoscomunicaccedilotildees submetidos agrave apreciaccedilatildeoda revista ldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquo natildeo forame nem seratildeo publicados simultaneamente em outro lugar Com aaceitaccedilatildeo do artigo para publicaccedilatildeo os editores adquirem amplose exclusivos direitos sobre o artigo para todas as liacutenguas e paiacutesesA publicaccedilatildeo de artigoscomunicaccedilotildees dependeraacute da observacircnciadas Normas Editoriais dos pareceres do Corpo Editorial e daComissatildeo ad hoc Todos os pareceres tecircm caraacuteter sigiloso eimparcial e tanto os autores quanto os membros do CorpoEditorial eou Comissatildeo ad hoc natildeo obtecircm informaccedilotildeesidentificadoras entre si
3 Os artigos e comunicaccedilotildees submetidos para publicaccedilatildeo deveratildeoser apresentados em CD utilizando-se o processador de textoMicrosoft Word for Windows (version 98 2000 XP ou 2003)ser escrito em liacutengua portuguesa inglesa ou espanhola e usarsomente nomenclaturas oficiais e abreviaturas consagradas natildeoempregando abreviaturas no tiacutetulo do artigo Juntamente com oCD deveratildeo ser enviadas 4 (QUATRO) vias sendo uma originale as demais coacutepias omitindo os autores e a chamada de rodapeacute daprimeira paacutegina (para serem enviadas aos consultores cientiacuteficos)impressas em papel branco tipo A4 (21cm x 297cm) ou emformulaacuterio contiacutenuo em uma soacute face espaccedilo duplo entre linhasfonte Times New Roman tamanho 12 observada uma margemde 3 cm para o lado esquerdo e de 2 cm para o direito 25 cm paramargem superior e inferior 25 cm para o cabeccedilalho e 25 cm parao rodapeacute Cada trabalho deveraacute ter no maacuteximo 14 paacuteginas ejunto do mesmo deveraacute ser encaminhado ofiacutecio dirigido ao EditorChefe da revista solicitando a publicaccedilatildeo do artigo Esse ofiacuteciodeveraacute ser assinado por todos os autores constar o endereccedilocompleto telefone e e-mail de todos Qualquer inclusatildeo exclusatildeoou alteraccedilatildeo na ordem dos autores deveraacute ser notificada medianteofiacutecio assinado por todos os autores (inclusive do autor excluiacutedo)
4 O artigo cientiacutefico deveraacute conter os seguintes toacutepicos a)TIacuteTULO suficientemente claro conciso e completo evitandopalavras supeacuterfluas Recomenda-se comeccedilar pelo termo querepresente o aspecto mais importante do trabalho com os demais
termos em ordem decrescente de importacircncia b) TIacuteTULO EMINGLEcircS c) NOME(s) DO(s) AUTOR(es) no maacuteximo 6 (seis)em letras maiuacutesculas um apoacutes o outro centralizados e no rodapeacuteda primeira paacutegina deveratildeo vir a formaccedilatildeo acadecircmica e aInstituiccedilatildeo onde trabalham d) RESUMO (de acordo comNBR6028 da ABNT) O resumo natildeo deve ultrapassar a 250(duzentos e cinquumlenta) palavras e natildeo possuir paraacutegrafos Apoacuteso Resumo devem-se incluir TERMOS PARA INDEXACcedilAtildeO(palavraschave) diferentes daqueles constantes do tiacutetulo eseparados por viacutergula Os termos para indexaccedilatildeo devem estardescritos na forma maiuacutescula e minuacutescula serem expressotildees queidentifiquem o conteuacutedo do artigo ser indicadas entre 3 e 5 e sepossiacutevel extraiacutedas do vocabulaacuterio Thesagro ndash Thesaurus AgriacutecolaNacional desenvolvido pela CENAGRI (indicaccedilatildeo da revistaldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquopara evitar o usode vaacuterios sinocircnimos como termos de indexaccedilatildeo) Se natildeo foremencontrados descritores disponiacuteveis para cobrirem a temaacutetica doartigo poderatildeo ser indicados termos ou expressotildees de usoconhecido e) ABSTRACT incluindo em seguida INDEXTERMS f) INTRODUCcedilAtildeO (incluindo a revisatildeo de literatura)g) MATERIAL E MEacuteTODOS h) RESULTADOS EDISCUSSAtildeO (podendo conter tabelas e figuras) i)CONCLUSOtildeES e j) REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
5 A comunicaccedilatildeo deveraacute conter os seguintes toacutepicos a)TIacuteTULO suficientemente claro conciso e completo evitandopalavras supeacuterfluas Recomenda-se comeccedilar pelo termo querepresente o aspecto mais importante do trabalho com os demaistermos em ordem decrescente de importacircncia Deve serapresentada a versatildeo do tiacutetulo para o idioma inglecircs b) TIacuteTULOEM INGLEcircS c) NOME(s) DO(s) AUTOR(es) no maacuteximo 6(seis) em letras maiuacutesculas um apoacutes o outro centralizados e norodapeacute da primeira paacutegina deveratildeo vir a formaccedilatildeo acadecircmica e aInstituiccedilatildeo onde trabalham d) RESUMO (de acordo comNBR6028 da ABNT) O resumo natildeo deve ultrapassar a 250(duzentos cinquumlenta) palavras e natildeo possuir paraacutegrafos Apoacutes oResumo devem-se incluir TERMOS PARA INDEXACcedilAtildeO(palavras-chave) diferentes daqueles constantes do tiacutetulo eseparados por viacutergula Os termos para indexaccedilatildeo devem estardescritos na forma maiuacutescula e minuacutescula serem expressotildees queidentifiquem o conteuacutedo do artigo ser indicadas entre 3 e 5 e)ABSTRACT incluindo em seguida INDEX TERMS f)TEXTO [sem subdivisatildeo poreacutem com introduccedilatildeo material emeacutetodos resultados e discussatildeo e conclusatildeo subtendidos(podendo conter tabelas ou figuras)] e g) REFEREcircNCIASBIBLIOGRAacuteFICAS
6 AGRADECIMENTOS ao fim do texto e antes das ReferecircnciasBibliograacuteficas poderatildeo vir os agradecimentos a pessoas ouinstituiccedilotildees O estilo tambeacutem aqui deve ser soacutebrio e claroindicando as razotildees pelas quais se fazem os agradecimentos
7 TABELAS E QUADROS deveratildeo ser inseridos apoacutes citaccedilatildeodos mesmos dentro do proacuteprio texto
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS as referecircnciasbibliograacuteficas devem ser citadas conforme a NBR60232002 daABNTA exatidatildeo das referecircncias constantes da listagem e a corretacitaccedilatildeo no texto satildeo de responsabilidade do(s) autor(es) doartigo
Orientaccedilotildees gerais- Deve-se apresentar todos os autores do documento cientiacutefico(fonte)- O nome do perioacutedico deve ser descrito por extenso natildeo deveser abreviado- Em todas as referecircncias deve-se apresentar o local de publicaccedilatildeo(cidade) a ser descrito no lugar adequado para cada tipo dedocumento- As referecircncias devem ser ordenadas alfabeticamente
EXEMPLIFICACcedilAtildeO (TIPOS MAIS COMUNS)
ARTIGO DE PERIOacuteDICO
VIEIRA R F RESENDE M A V de Eacutepocas de plantio deervilha em Patos de Minas Uberaba e Janauacuteba Minas GeraisCiecircncia e Agrotecnologia Lavras v 24 n 1 p 74-80 janmar 2000
LIVRO
a) Livro no todo
STEEL R G D TORRIE J H Principles and procedures ofstatistics New York McGraw-Hill Book l960 481 p
b) Parte de livro com autoria especiacutefica
FLEURY J A Anaacutelise ao niacutevel de empresa dos impactos daautomaccedilatildeo sobre a organizaccedilatildeo da produccedilatildeo de trabalho InSOARES R M S M Gestatildeo da empresa Brasiacutelia IPEAIPLAN 1980 p 149-159
c) Parte de livro sem autoria especiacutefica
MARTIM L C T Nutriccedilatildeo de bovino de corte em confinamentoIn ______ Confinamento de bovino de corte 2 ed Satildeo PauloNobel 1986 cap 3 p 29-89
DISSERTACcedilAtildeO E TESE
GONCcedilALVES R A Preservaccedilatildeo da qualidade tecnoloacutegicade trigo (Triticum aestivum L) e controle de Rhyzoperthadominica (F) durante o armazenamento em atmosferacontrolada com Co2 e N2 1997 52 f Dissertaccedilatildeo (Mestradoem Ciecircncia dos Alimentos) ndash Universidade Federal de LavrasLavras 1997
MATIOLI G P Influecircncia do leite proveniente de vacasmastiacuteticas no rendimento de queijo frescal 2000 55 pDissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncias dos Alimentos) - UniversidadeFederal de Lavras Lavras 2000
Nota ldquoA folha eacute composta de duas paacuteginas anverso e versoAlguns trabalhos como teses e dissertaccedilotildees satildeo impressos apenasno anverso e neste caso indica-se frdquo (ABNT NBR60232002p 18)
TRABALHOS DE CONGRESSO E OUTROS EVENTOS
SILVA J N M Possibilidades de produccedilatildeo sustentada de madeiraem floresta densa de terra firme da Amazocircnia brasileira InCONGRESSO FLORESTAL BRASILEIRO 6 1990 Campos doJordatildeo Anais Campos do Jordatildeo SBSSBEF 1990 p 39-45
DOCUMENTOS ELETROcircNICOS
As obras consultadas online satildeo referenciadas conformenormas especiacuteficas para cada tipo de documento (monografia notodo e em parte trabalho apresentado em evento artigo deperioacutedico artigo de jornal etc) acrescidas de informaccedilotildees sobreo endereccedilo eletrocircnico apresentado entre braquetes (lt gt)precedido da expressatildeo ldquoDisponiacutevel emrdquo e da data de acessoao documento precedida da expressatildeo ldquoAcesso emrdquo
Nota ldquoNatildeo se recomenda referenciar material eletrocircnico de curtaduraccedilatildeo nas redesrdquo (ABNT NBR60232000 p 4) Segundopadrotildees internacionais a divisatildeo de endereccedilo eletrocircnico no fimda linha deve ocorrer sempre apoacutes barra ()
Monografia (acesso online)
a) Livro no todo
TAKAHASHI T (Coord) Tecnologia em foco BrasiacuteliaSocinfoMCT 2000 90 p Disponiacutevel em lthttpwwwsocinfoorgbrgt Acesso em 22 ago 2000
b) parte de livro
TAKAHASHI T Mercado trabalho e oportunidades In ______Sociedade da informaccedilatildeo no Brasil livro verde BrasiacuteliaSocinfoMCT 2000 cap 2 p 13-24 Disponiacutevel em lthttpwwwsocinfogovbrgt Acesso em 22 ago 2000
c) Parte de congresso seminaacuterio etc
GIESBRECHT H O Avaliaccedilatildeo de desempenho de institutos depesquisa tecnoloacutegica a experiecircncia de projeto excelecircncia napesquisa tecnoloacutegica In CONGRESSO ABIPTI 2000Fortaleza Gestatildeo de institutos de pesquisa tecnoloacutegicaFortaleza Nutec 2000 Disponiacutevel em lthttpwwwabiptiorgbrgt Acesso em 01 dez 2000
d) Tese
SILVA E M Arbitrariedade do signo a liacutengua brasileira desinais (LIBRAS) 1997 144 p Dissertaccedilatildeo (Mestrado emLinguumliacutestica Aplicada e Estudo de Liacutengua) - Pontifiacutecia UniversidadeCatoacutelica de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 1997 Disponiacutevel em lthttpwwwterracombrvirtualbooks freebookportdid teseshtmgtAcesso em 28 nov 2000
Artigo de perioacutedico (acesso online)
RESENDE A M G Hipertexto tramas e trilhas de um conceitocontemporacircneo Informaccedilatildeo e Sociedade Recife v 10 n 12000 Seccedilatildeo Educaccedilatildeo Disponiacutevel em lthttpwwwinformaccedilatildeoesociedadeufpbbrgt Acesso em 30 nov 2000
CITACcedilAtildeO PELO SISTEMA ALFABEacuteTICO (AUTOR-DATA)(conforme ABNT NBR105202002)Dois autores - Steel amp Torrie (1960) ou (STEEL amp TORRIE1960)Trecircs ou mais autores - Valle et al (l945) ou (VALLE et al 1945)Obs Quando forem citados dois autores de uma mesma obradeve-se separaacute-los pelo sinal amp (comercial)
9 CASO O ARTIGO CONTENHA FOTOGRAFIASGRAacuteFICOS FIGURAS SIacuteMBOLOS E FOacuteRMULASESSAS DEVERAtildeO OBEDECER AgraveS SEGUINTESNORMAS
91 Fotografias deveratildeo ser apresentadas em preto e branconiacutetidas e com contraste inseridas no texto apoacutes a citaccedilatildeo dasmesmas e tambeacutem em um arquivo agrave parte salvas em extensatildeoldquoTIFFrdquo ou ldquoJPEGrdquo com resoluccedilatildeo de 300 dpi
92 Figuras deveratildeo ser apresentadas em preto e branco niacutetidase com contraste inseridas no texto apoacutes a citaccedilatildeo das mesmas etambeacutem em um arquivo agrave parte salvas em extensatildeo ldquoTIFFrdquo ouldquoJPEGrdquo com resoluccedilatildeo de 300 dpi As figuras deveratildeo serelaboradas com letra Times New Roman tamanho 10 semnegrito sem caixa de textos e agrupadas
93 Graacuteficos deveratildeo ser inseridos apoacutes citaccedilatildeo dos mesmosdentro do proacuteprio texto elaborado preferencialmente em Excelcom letra Times New Roman tamanho 10 sem negrito
94 Siacutembolos e Foacutermulas Quiacutemicas deveratildeo ser feitas emprocessador que possibilite a formataccedilatildeo para o programa PageMaker (ex MathType Equation) sem perda de suas formasoriginais
10 O Editor Chefe notificaraacute o autor do recebimento do originale posteriormente o informaraacute sobre sua publicaccedilatildeo Os artigosque necessitarem de modificaccedilotildees seratildeo devolvidos ao autor paraa devida revisatildeo
11 Os artigos natildeo aprovados seratildeo devolvidos
12 Os artigos seratildeo publicados em ordem de aprovaccedilatildeo
13 O natildeo-cumprimento dessas normas implicaraacute na devoluccedilatildeodo artigo ao autor
14 Os casos omissos seratildeo resolvidos pela Comissatildeo Editorial
15 O artigo deveraacute ser enviado para
ABCTPPlant Cell Culture amp MicropropagationUniversidade Federal de LavrasDepartamento de Biologia - Setor de Fisiologia VegetalCaixa Postal 3037Lavras ndash MGCEP 37200-000E-mail abctpuflabr
INSTRUCTIONS FOR AUTHORS
1 Concepts and affirmations included in articles andcommunications are of the entire responsibility of the authors
2 ldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquo a semestral journaledited by Editora UFLA of the Universidade Federal de Lavraspublishes scientific articles and communications in the area ofplant tissue culture elaborated by researchers of the national andinternational scientific community There are no page charges forpublication Submission of a manuscript implies that it is neitherunder consideration for publication elsewhere nor has appearedpreviously in part or in whole On acceptance for publicationauthors assign to the Editors full copyright of the manuscript inall languages and countries Publications will depend on editorialrules and on the review of experts and ad hoc commissionReviewer and editorial opinions will be anonymouslycommunicated to authors
3 The articles and communication submitted for publicationmust be presented in CD using the program Microsoft Wordfor Windows (version 98 2000 XP or 2003) written inPortuguese English or Spanish using only conventionalnomenclature At the time of submission authors are requiredto submit together with the CD 4 (four) hard copies one originaland three copies without the name(s) of the author(s) as well asthe footnote on the first page (to be used by the reviewers)printed on A4 white paper (21 cm x 297cm) or on continuousform typewritten only on one side double spaced using fontTimes New Roman size 12 with a 3 cm margin on the left handside and 20 cm margin on the right hand side 25 cm upper andlower margin 25 cm for the heading and 25 cm for the footnoteThe manuscript must present a maximum of 14 pages At thetime of submission a cover letter must be sent with themanuscript copies to the Editor requesting publication of thearticle This cover letter must be signed by all authors andalso contain the full address telephone number and e-mail ofthe authors Any inclusion exclusion or alteration in the authorsorder must be notified and signed by all authors including theone excluded
4 Each manuscript must be organized in a) TITLE sufficientlyclear conspicuous and complete without superfluous words Itis recommended to initiate with the term that represent the mostimportant aspect with other terms in decreasing of importanceb) TITLE in Portuguese c) FULL NAME(s) OF THEAUTHOR(s) maximum of 6 (six) in capital letters one after theother in the center of the page with the footnote of the first pagecontaining their professional qualification or academic training
and their work institution d) ABSTRACT written continuouslywithout paragraph It must not exceed 250 words Index termsmust be enclosed after the abstract using terms different fromthose used in the title and separated by comma The index terms(3 to 5) must be described in capital and small letters and expressthe content of the article e) ABSTRACT and INDEX TERMSin Portuguese f) INTRODUCTION (including literaturereview) g) MATERIAL AND METHODS h) RESULTS ANDDISCUSSION (it may include tables and figures) i)CONCLUSIONS and j) REFERENCES
5 Communication must have the following topics a) TITLEsufficiently clear conspicuous and complete without superfluouswords It is recommended to initiate with the term that representthe most important aspect with other terms in decreasing ofimportance The PORTUGUESE version of the title has to bepresented b) TITLE in Portuguese c) FULL NAME(s) OFTHE AUTHOR(s) maximum of 6 (six) in capital letters oneafter the other in the center of the page with the footnote of thefirst page containing their professional qualification or academictraining and their work institution d) ABSTRACT writtencontinuously without paragraph It must not exceed 250 wordsIndex terms must be enclosed after the abstract using termsdifferent from those used in the title and separated by commaThe index terms (3 to 5) must be described in capital and smallletters and express the content of the article e) ABSTRACTand INDEX TERMS in Portuguese f) TEXT (with no divisionbut must include introduction material and methods results anddiscussion and conclusion (it may include tables and figures) andg)REFERENCES
6 ACKNOWLEDGEMENTS Acknowledgements to peopleor institutions might be included at the end of the text priorReferences The written style must be serious and clear indicatingthe reasons of the acknowledgements made
7 TABLES AND FIGURES must be included right after theircitation in the text
8 REFERENCES references must be cited according toNBR60232002 of ABNT All references and their correct citationin the text are of the entire responsibility of the author(s)- Some important orientations all authors of the scientificdocument must be presented (source) the journal must be citedusing its full name all references must present the name of thecity where the journal was published all references must be citedalphabetically
9 PHOTOGRAPHS GRAPHS FIGURES SYMBOLS ORFORMULA CONTAINED IN THE ARTICLE SHOULDOBEY THE FOLLOWING RULES
91 Photographs must be presented in black and whiteclear and with contrast inserted in the text after their citationand also in a separate file (on the same diskette as the article)saved in extension ldquoTIFFrdquo or ldquoJPEGrdquo with resolution of300 dpi
92 Figures must be presented in black and white clear andwith contrast inserted in the text after their citation and also in aseparate file (on the same diskette as the article) saved inextension ldquoTIFFrdquo or ldquoJPEGrdquo with resolution of 300 dpiThey must be elaborated using Times New Roman font size10 without bold without text box and arranged
93 Graphs must be inserted in the text after their citationelaborated preferentially in Excel using Times New Romanfont size 10 without bold
94 Symbols and Chemical Formula must be presented usinga word processor that permits a format for Page Maker (exMathType Equation) without loss of its original form
10 The Brazilian Association of Plant Tissue Culture (ABCTP)will inform the author the receipt of the original manuscript andeventually it will also send information regarding its publicationManuscripts that require modifications will be returned to theauthor for the respective revision andcorrections
11 Manuscripts not approved will be returned to the author
12 Articles will be published according to the order of receiptand approval
13 If any of these rules are not attended the manuscript will bereturned to the author
14 Manuscripts should be sent to the following address
ABCTPPlant Cell Culture amp MicropropagationUniversidade Federal de LavrasDepartamento de Biologia - Setor de Fisiologia VegetalCaixa Postal 3037Lavras ndash MGCEP 37200-000BrazilE-mail abctpuflabr
DIRETORIA
Presidente ndash Renato Paiva ndash UFLA Secretaacuterio ndash Moacir Pasqual ndash UFLA
Secretaacuterio Adjunto ndash Antocircnio Carlos Torres ndash EMBRAPA Hortaliccedilas Tesoureiro ndash Guilherme Augusto Canella Gomes ndash Benger do Brasil
COMISSAtildeO EDITORIAL
EDITOR CHEFE Renato Paiva ndash UFLA
CONSELHO EDITORIAL Antocircnio Carlos Torres ndash EMBRAPA Hortaliccedilas
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REVISAtildeO DE REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS Luiz Carlos de Miranda ndash UFLA
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EDITORACcedilAtildeO Christyane Aparecida Caetano ndash Editora UFLA
Aleacutezia Conceiccedilatildeo Modesto Ribeiro ndash Editora UFLA Luciana Carvalho Costa ndash Editora UFLA
REVISAtildeO DE PORTUGUEcircS Amanda Jackeline Santos Silva
REVISAtildeO DE INGLEcircS Renato Paiva
ndash UFLA
SECRETARIACr ist iano Mar t inot t o ndash UFLA
Daiane Peixot o Var gas ndash UFLA
EDI TORES ASSOCI ADOSEnio Luiz Pedrotti - UFSC
Fr ancisco de Assis Paiva Campos - UFCGilber t o Bar bant e Ker bauy - USP
J oatildeo Bat ist a Teixeir a - EMBRAPA Recur sos Geneacutet icos e Biot ecnologiaJ oseacute Ant ocircnio Pet er s - UFPEL
Kasumit su Mat sumot o- EMBRAPA Recur sos Geneacutet icos e Biot ecnologiaLilia Gomes Willadino - UFRPE
Linda St yer Caldas - UNBLuciana Ribas - UFPR
Magdi Ahmed I br ahim Alouf a - UFRNMar guer it e Ger maine Ghislaine Quoir in- UFPR
Miguel Pedr o Guer r a - UFSCMiklos Gaacutebor Faacuter i ndash Univer sidade de Debr ecen ndash Ungr ia
Otto Jesu Crocomo ndash ESALQ - USPRenat o de Oliveir a Resende - UNB
Schuyler Kor ban ndash Univer sidade de I llinois - Est ados UnidosSilvio Lopes Teixeira - UENF
Ter ezinha Rangel Camar a ndash UFRPEWagner Apar ecido Vendr ame ndash Univer sidade da Floacuter ida ndash Est ados Unidos
Wagner Campos Ot oni ndash UFV
CONSULTORI A CI ENTIacute FI CA (Vol 2 N 2)Alexandr e Hof f mann ndash EMBRAPA Uva e VinhoAlexandr e Mor ais do Amar al ndash EMBRAPA-I AC
Aloisio Xavier ndash UFVAnt ocircnio Chalf un J unior ndash UFLA
Eur ico Eduar do Pint o de Lemos ndash UFALEvar ist o Maur o de Cast r o ndash UFLAGilber t o Bar bant e Ker bauy ndash USP
J oatildeo Bat ist a Teixeir a ndash EMBRAPA Cenar gemJoseacute Raniere F Santana ndash UEFS
Luiz Ant ocircnio Biasi ndash UFPRMiguel Pedr o Guer r a ndash UFSC
Osmar Alves Lameir a ndash EMBRAPA Amazocircnia Or ient alOt t o J esu Cr ocomo ndash ESALQ USP
Ricar do Tadeu de Far ia ndash UELWagner Campos Ot oni ndash UFV
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-106 2006
Plant Cell Culture amp Micropropagation
ISSN 1808-9909
CONTEUacuteDO
01 In vitro propagation of Melissa officinalis L and production of essential oil In vitro propagation of Melissa officinalis L and production of essential oil Simone da Silva Celso Luiz Salgueiro Lage Maria Apparecida Esquibel Rosane Aguiar da Silva San Gil Alice Sato
53
02 Crescimento in vitro de Laelia tenebrosa (ORCHIDACEAE) em diferentes concentraccedilotildees de sais de Knudson C e carvatildeo ativado In vitro growth of Laelia tenebrosa (ORCHIDACEAE) in different concentrations of Knudson C salts and activated charcoal Aparecida Gomes de Araujo Moacir Pasqual Alba Regina Pereira Herminio Souza Rocha 61
03 Propagaccedilatildeo in vitro de placircntulas de orquiacutedea em diferentes meios de cultura e concentraccedilotildees de citocinina In vitro propagation of orchid plantlets cultivated in different culture media and cytokinin concentrations Aparecida Gomes de Araujo Moacir Pasqual Adriano Bortolotti da Silva Fabiacuteola Villa Hermiacutenio Souza Rocha Fernanda Carvalho Costa 68
04 Efeito do viacuterus das estrias da bananeira na micropropagaccedilatildeo e no crescimento das plantas da cultivar caipira durante a aclimatizaccedilatildeo Effect of banana streak virus on micropropagation and plant growth of cultivar caipira during acclimatization Daniela Garcia Silveira Antocircnio da Silva Souza Paulo Ernesto Meissner Filho Tales Miler Soares Ranulfo Correa Caldas Kaacutetia Regina Barbosa Leatildeo 74
05 Caracteriacutesticas morfofisioloacutegicas de brotaccedilotildees de Agapanthus umbellatus var minor multiplicadas em biorreator de imersatildeo temporaacuteria Morphological and physiological characteristics Agapanthus umbellatus var minor of shoots propagated in bioreactor of temporary immersion Luciana Alves Fogaccedila Denilson Dortzbach Antonio Carlos Alves Enio Luiz Pedrotti 80 06 Capacidade de regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro cultivar Santa Clara In vitro regeneration capacity of tomato plant cultivar Santa Clara Glaucia de Fatima Moreira Vieira e Souza Joseacute Magno Queiroz Luz Alcione Silva Arruda Denise Garcia Santana Mariana de Souza e Silva da Costa Teixeira Luciana Londe Adelaide Siqueira Silva Elisacircngela Rodrigues Figueira 88
07 Induccedilatildeo de calos a partir de cultura de anteras de cafeeiro (Coffea arabica L) cv Catuaiacute Vermelho 99 e 44 Callus induction from anther culture of coffee plant (Coffea arabica L) cv Catuaiacute Vermelho 99 and 44 Adelaide Siqueira Silva Joseacute Magno Queiroz Luz Denise Garcia Santana Patriacutecia Crystie Vieira Mustafa Moacir Pasqual Glaucia de Fatima Moreira Vieira e Souza 94
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-106 2006
Plant Cell Culture amp Micropropagation
ISSN 1808-9909
COMUNICACcedilAtildeO CIENTIacuteFICA
08 Proliferaccedilatildeo in vitro de brotos de Curauaacute utilizando diferentes volumes de meio de cultura In vitro shoot proliferation of Ananas erectifolius using different volumes of culture medium Flaacutevia Dioniacutesio Pereira Joseacute Eduardo Brasil Pereira Pinto Helen Cristina de Arruda Rodrigues Luciana Domiciano Silva Rosado Luiz Alberto Beijo Osmar Alves Lameira 102
In vitro propagation of Melissa officinalis L and production 53
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
IN VITRO PROPAGATION OF Melissa officinalis L AND PRODUCTIONOF ESSENTIAL OIL
IN VITRO PROPAGATION OF Melissa officinalis L AND PRODUCTION OFESSENTIAL OIL
SIMONE DA SILVA1 CELSO LUIZ SALGUEIRO LAGE2 MARIA APPARECIDA ESQUIBEL3ROSANE AGUIAR DA SILVA SAN GIL4 ALICE SATO5
1Doutoranda em Biotecnologia Vegetal ndashUFRJIBC Chagas Filho ndash Av Brigadeiro Trompowsky SN Ccs ndash Bloco G ndash Sala G2-050 ndash Cidade Universitaacuteria ndash Laboratoacuterio de Fisiologia Vegetal ndash Ilha do Fundatildeo ndash 21949-900 ndash Rio de Janeiro RJ ndash monybiofufrjbr
2Dr em Biofiacutesica ndashUFRJ ndash Instituto de Biofiacutesica Carlos Chagas Filho ndash Laboratoacuterio de Fisiologia Vegetal ndash Ilha do Fundatildeo ndash 21949-900 ndash Rio de Janeiro RJ ndash clslagebiofufrjbr3Poacutes-Doutorado em Bioeletrogecircnese ndash UFRJ ndash Instituto de Biofiacutesica Carlos Chagas Filho ndash Laboratoacuterio de Fisiologia Vegetal ndash Ilha do Fundatildeo ndash 21949-900 ndash Rio de Janeiro RJ ndash esquibelbiofufrjbr4Dra em Quiacutemica Orgacircnica ndash Ufrj DQO ndash Edifiacutecio do Centro de Tecnologia ndash Bloco A ndash Sala 605 ndash Ilha do Fundatildeo ndash Cidade Universitaacuteria ndash Caixa Postal 068556 ndash 21941-972 ndash Rio de Janeiro RJ ndash rsangilIqufrjbr5Dra em Biotecnologia Vegetal ndash UNIRIODCN ndash Centro de Ciecircncias Bioloacutegicas e da Sauacutede ndash Av Pasteur 458 Preacutedio da ECB ndash 4ordmandar Sala 415 URCA ndash 22290-240 ndash Rio de Janeiro RJ ndash alicesatouniriobr
ABSTRACTThis work presents an efficient protocol for micropropagation
of Melissa officinalis L through axillary bud proliferation obtainedfrom in vitro germinated seeds on basal Murashige amp Skoog medium(MS) The explants were grown on MS supplemented with differentgrowth regulators NAA (05 mM) KIN (05 mM) BA (05 mM)GA
3 (28 microM) and IAA (05 mM) Higher shoot proliferation and
rooting rates were obtained on MS supplemented with 05 microM IAAMicropropagated plants were acclimatized and transferred to soilwith success The essential oil composition in shoots of in vitro andfield-grown (ex vitro) plants was determined by gas chromatographymass spectrometry The major components of essential oils detectedin both plant materials were pujone neral geraniol and geranial Mofficinalis in vitro plantlets developed on MS media showed 14higher proportions of nerol and 41 of geraniol when compared withfield grown plants
Index terms Growth regulators medicinal plant tissue culture
RESUMOEste trabalho apresenta um protocolo raacutepido e eficiente
para propagaccedilatildeo in vitro de Melissa officinalis L atraveacutes daproliferaccedilatildeo de gemas axilares de plantas obtidas de sementesgerminadas em meio basal de Murashige amp Skoog (MS) Os explantesforam cultivados em meio de Murashige amp Skoog (MS) 1962com adiccedilatildeo de diferentes reguladores de crescimento Aacutecido alfa-naftaleno-aceacutetico (ANA ndash 05 mM) Cinetina (KIN ndash 05 mM)Benziladenina (BA ndash 05 mM) Aacutecido Gibereacutelico (GA
3 ndash 28 microM)
e Aacutecido Indolaceacutetico (AIA ndash 05 mM) O alongamento e formaccedilatildeode segmentos nodais maacuteximos foram obtidos com AIA Explantesdesenvolveram 5 novos brotos com 10 cm em meacutedia e 100 deenraizamento em 30 dias de cultura Plantas micropropagadasforam aclimatadas e transferidas para o solo com sucesso Acomposiccedilatildeo do oacuteleo essencial de partes aeacutereas de plantas produzidasin vitro e plantas crescidas em campo (ex vitro) foi determinadapor cromatografia gasosa acoplada agrave espectrometria de massas Os
principais componentes do oacuteleo essencial encontrados em ambosos materiais vegetais foram a pujona neral geraniol e geranial Asplantas de Melissa officinalis desenvolvidas in vitro em MSapresentaram aumento de 14 vezes na proporccedilatildeo do nerol e de 41na de geraniol quando comparadas agraves plantas ex vitro
Termos para indexaccedilatildeo Reguladores de crescimento plantamedicinal cultura de tecidos
INTRODUCTION
Melissa officinalis L (Lamiaceae) is a well-known
herb used to give fragrance to different food and beverage
products It has also been used as a medicinal plant for
treatment of headaches gastrointestinal disorders
nervousness and rheumatism The essential oil is a well-
known antibacterial and antifungal agent and it is also
responsible for the mild depressive and spasmolytic
properties of the plant Literature data pointed out antioxidant
properties of methanolic extracts of Melissa officinalis which
are mostly due to high portion of phenolic acids revealing
significant antimicrobial particularly antibacterial activity of
this essential oil (MIMICA-DUKIC et al 2004)
The chemical composition of the essential oil of
Melissa officinalis leaf (02-1 on dry weight) has been
studied The major compounds (10-40) are citral (neral
and geranial) and these are accompanied by limonene
cineole geraniol szlig-caryophyllene and spathulenol The
(Recebido em 06 de setembro de 2005 e aprovado em 21 de junho de 2006)
SILVA S da et al54
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
leaf also contains polyphenolic compounds
hydroxycinnamic derivatives with verbascoside (53)
flavonoids such as luteolin 7-glucoside and luteolin 7-
diglucuronide (08) These compounds probably
intervene in the antispasmodic activity Iridoid glucosides
were also reported and the infusion contains potassium
(CARNAT et al 1999)
Cultivation of medicinal plants for the purpose of
extraction of active constituents may face certain limitations
such as climate season water availability diseases and
pests and scarcity of naturally growing plants Such
limitations led to the use of tissue culture techniques for
production of the active constituents Tissue culture
provides means of rapid propagation of a large number of
uniform plants while maintaining their genotype Beneficial
uses of tissue culture for the purpose of extraction of
secondary metabolites include avoidance of collection of
endangered wild species production of secondary
metabolites due to rapid growth of cultures in vitro
(ARIKAT et al 2004)
Due to the importance of this plant for multiple
purposes and the difficulty to produce active compounds
in vitro the application of methods that provide higher
number of cloned plants of M officinalis is justified aiming
to select high quality plant lines to extensive culture and
extraction of pharmaceutical products In Brazil M
officinalis is used in phytomedicine by pharmaceutical
industries One of the most critical problems of
phytomedicine is the natural variation of plants chemical
constituents (CURRIER et al 2000) This variation could
be originated from genetical factors or under influence of
environmental characteristics
The use of in vitro systems have been reported as
an effective tool for obtaining genetically uniform plants
which can be the source for less variable pharmaceutical
preparations Plant regeneration of M officinalis has been
achieved using as explants cotyledonary nodes of 10-day-
old Melissa officinalis seedlings (TAVARES et al 1996)
shoot tips from plants cultivated at greenhouse
(MEacuteSZAacuteROS et al 1999) using various types and
concentrations of cytokinins auxins and triacontanol
(TANTOS et al 1999)
The aim of this work is to develop a
micropropagation method in order to obtain a significant
number of monoclonal plants for further field cultivation
comparing the essential oil content and composition
between micropropagated and field-grown plants
MATERIALS AND METHODS
Plant material
Representative specimens from field grown plants
of M officinalis were selected and submitted to Erika Von
Sohsten Medeiros and Angela Vaz (Rio de Janeiro
Botanical Garden) for the taxonomic confirmation A
voucher nordm RB ndash 365926 is deposited at the Herbarium of
Rio de Janeiro Botanic Garden
Melissa officinalis seeds were obtained from
commercial market ISLAR batch Nordm 8250 The seeds were
germinated and grown to the seedling stage in vitro Seeds
were pre-treated by immersion into 2 commercial bleach
solution (Globoacirc) for 20 min and then rinsed thoroughly
in running tap water After that the seeds were surface
sterilized in 70 ethanol for 20 min followed by 15 min in a
20 commercial bleach solution containing 2-3 drops of
Tween 20 under aseptic conditions and rinsed three times
with sterile distilled water The seeds were cultured on MS
(MURASHIGE amp SKOOG 1962) solid medium
supplemented with 30 gL-1 sucrose 148 mM thiamine-
HCl 243 mM pyridoxine-HCl 41 mM nicotinic acid and
06 mM myo-inositol The pH value was adjusted at 58 plusmn
01 before addition of 8 gL-1 of agar and the media were
sterilized in autoclave (120 degC during 15 min) The cultures
were incubed at 25 plusmn 1 degC under a 16 h light 8 h dark
regime at an irradiance of 230 mmolm-sup2s-1 (white light
illumination Sylvaniaacirc fluorescent tubes)
Establishment of in vitro shoot cultures
From in vitro 8-day-old germinated seeds plants
(20-30 cm in length) of three different clones designated
In vitro propagation of Melissa officinalis L and production 55
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
as clones 1 2 e 3 were selected and axillary shoot induction
takes place from nodal segments (1 cm in length)
subcultivated on MS hormone-free media (MS0) These
materials were used as donors of explants to be tested
with different culture media 05mM a-naphthaleneacetic
acid (NAA) 05mM kinetin (KIN) 05mM benzyladenine
(BA) 28 mM gibberellic acid (GA3) and 05mM indole-3-
acetic acid (IAA) Cultures were grown in 300 mL glass
flasks containing 40 ml of media each
Shoot proliferation rate length of both shoots and
roots and calli formation were monitored as growth
parameters Each treatment was replicated 3 times using
100 explants per repetition Subcultures were performed at
30 days intervals
Acclimatization
A total of 60 in vitro rooted microshoots (those grown
on MS + IAA during 30 days with average height of 10 cm
were removed from the medium and the agar washed gently
with tap water They were transferred to 60 cm diameter
plastic pots containing soil and humus (31 vv) and kept at
a greenhouse High humidity environment was provide by
covering the plants with a plastic foil and watering them
one time per day during the first 2 weeks Then plants were
gradually exposed to greenhouse conditions for 1 month
and finally transferred to the field where they were cultivated
during one year until complete life cycle
Extraction
Field-grown and fresh in vitro plantlets aerial parts
(100 g each) were submitted to hydro distillation for 140 h
in a Clevenger type apparatus as recommended by the
Brazilian Pharmacopoeia (1988) in replicate (n = 2) The
time between the isolation and analysis was the same in all
experiments to preclude differences in composition due to
external factors (SILVA et al 2003)
Gas chromatographic and gas chromatography-massspectrometric analysis
Gas chromatography with flame ionization
detection (GCFID) was carried out on a Varian Star Model
3350 instrument using a capillary column coated with DB-
5 (30 m x 025 mm i d 025 mm film thickness J amp W
Scientific Folsom CA USA) The GC oven was heated
using the following program 40 oC to 220 oC at 4 oC min-1
with an initial isothermal period of 1 min splitless The
detector and injector temperatures were held at 280 oC
Hydrogen was used as carrier gas The injection consisted
of 10 microL of distilled oil diluted with hexane The GCMS
analyses were carried out on a Hewlett-Packard (Agilent
Technologies Avondale USA) Model 5972 MSD coupled
to a HP 5890 GC The GC conditions were the same as
above except for the fact that helium was used as carrier
gas The mass spectrometer was operated on electron
impact mode at 70 eV Molecular assignments were
performed with the help of the Wiley 275 standard library
of mass spectra literature data (ADAMS 1995) authentic
geraniol standard (Sigma Part Number G5135) and mass
spectra interpretation besides the comparison with
previously published elution order (KREIS amp MOSAND
1994) Quantification was performed from GC profiles using
area percent since in the literature the FID response factor
for most of monoterpenes is determined as 1 (CARNAT et
al 1999)
Statistical analysis
Data for each experiment were subjected to analysis
of variance (ANOVA) and means were compared using the
Tukey-Kramer test Percent data were submitted to
significance test ndash difference between two percentages
using the Statistica for WindowsTM 50 version A
significance level of 5 was used for all statistical analysis
RESULTS AND DISCUSSION
In vitro multiplication of Melissa officinalis was
followed during four developing cycles Micropropagation
papers usually present an efficient protocol evaluated in
only one developing cycle This kind of protocol however
may fail when the cultures have to be kept during long
time many successive subcultures being necessary in
order to produce large number of clonal plants
SILVA S da et al56
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
In vitro establishment
In this work three different clones of M officinalis
were used and they had shown similar development
responses on in vitro cultures
The clones 1 and 2 had in vitro multiplication rate
lower than the clone 3 which means a decrease in the
absolute number of nodal segments (Fig 1A and B) From
these results the clone 3 was selected to run the tests
The average number of four new nodes was
produced by explant on MS0 after 30 days and this value
was used as a control to evaluate effects of the presence
of growth regulators in the media (Tab 1)
FIGURE 1 ndash Nodal segments development of three clones of Melissa officinalis on MS+ 05 M IAA during 30 daysA) Multiplication rate of in vitro culture from 2nd to 4th subcultures B) Number of nodal segments developed per clone
TABLE 1 ndash Effect of growth regulators in Melissa officinalis axillary segments culture after four weeks of culture
Culture Media
Shoot Explant
xplusmnse
Shoot Length (CM)
Multiplication Rate (ndeg of
Nodal Segment Explant)
Node Plantlet
xplusmnse
Root Frequency
()
Root Number
Explant xplusmnse
Root Length
(CM) xplusmnse
MS0 171B 403 08B 68C 41 B 50 105 11B 30 06B
05 M KIN 111C 349 11C 33D 31 C 50 073 09C 27 07C
28 M GA3 111C 100 03D 22E 21 D 50 071 09C 25 07C
05 M IAA 191B 1000 09A 95B 51 A 100 897 08A 137 08A
05 M NAA
301A 333 16C 90A 31 C 0 0 - 05 M BA 111C 385 54C 33D 31 C 0 0 -
Value are means (x) plusmn standard error (se) n=100 Values in the same column followed by the same letter do not differstatistically at Pdrdquo005
The influence of plant growth regulators and their
interactions on micropropagation of different plant species
have been discussed in detail by Lameira et al (2005) Rout
et al (1989) Rout amp Das (1997ab) Skirvin et al (1990) and
Zieslin et al (1989)
In this work addition of IAA to MS presented the
best results among all tested growth regulators in all
evaluated parameters However to shoot production there
is no statistical difference to the control The analysis of
effects of the other growth regulators shows that only
05mM NAA was able to improve shoot production
although it is not able to promote rhizogenesis
In vitro propagation of Melissa officinalis L and production 57
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
The use of MS plus 05mM Kinetin or 05mM BA
or 05mM NAA promoted the development of three nodal
segments per elongated plant in 30 days culture (Tab
1) However when BA was used these new shoots
exhibited apical necrosis When GA3 (28 mM) was added
to medium there was induction of only one shoot per
explant and after 30 days there were 2 nodes per
elongated shoot
There was no rooting in explants placed on MS
added of NAA and BA In MS medium containing KIN or
GA3
and in basic MS 50 of the shoots developed new
roots in 30 days of culture
The best result of rhizogenesis was presented
by explants cultured in MS plus IAA where 100 of
shoots rooted with more than 8 new roots per explant
(Tab 1) In terms of root length the cultures in MS
supplemented with IAA presented longer roots when
compared with the other media compositions used at
the present work
In short the addition of 05mM of IAA was chosen
as that presenting the best results in all evaluated
parameters (Fig 2A)
The action of IAA on the in vitro plant
development was in accordance to the known effects of
such hormone (CLELAND 1995) Shoot elongation was
obtained concomitantly with rooting in media MS plus
05 mM IAA That is specially interesting once it may
reduce the micropropagation process through nodal
segments explants to only three steps germination
shoot elongation and multiplication concomitant to
rooting this represents gain of time culture medium
and constitutes a quick micropropagation process
Tavares et al (1996) reported a micropropagation
utilizing cotyledonary nodes as explants The highest
average number of shoots in the two inoculations was
obtained with 2 mgL-1 of BA 24 axillary shoots per
explant 7 in the first inoculation and 17 in the second
one Shoots of the two inoculations were excised after
30 and 60 days respectively
Acclimatization
Melissa officinalis leaves are very sensitive to
water loss and this process is irreversible it was necessary
to provide a high humidity environment during the first
acclimatization period plants were covered with a plastic
foil during 2 weeks before being gradually exposed to
greenhouse conditions The acclimatization procedure
used for in vitro plants was successful and a total of 100
survival rate (n=60) was obtained Acclimatized plants
appeared normal and did not exhibit any morphological
abnormalities or variations These results permitted the
soil cultivation (Fig 2B) without chemical defensives
during one year up to the complete vegetative cycle
(flowering)
Essential oils content
Comparative analysis of the chromatographic
profiles showed high percentage of neral and geranial in
relation to nerol and geraniol in field grown (ex vitro)
plantlets and in MS0 (in vitro)
The relative content of the principal components
of essential oil of the aerial parts of M officinalis are
presented as mean peaks area () on Fig 2C geranial
(3813 and 4364) neral (2674 and 317) geraniol (329 and
153) and nerol (116 and 187) in plants cultured ex vitro
and in vitro respectively Plantlets developed in vitro on
MS0 media showed an increase of 14 times in the
proportion of nerol and 41 times of geraniol when
compared with ex vitro cultured plants
Field plants are exposed to considerable more
stressful conditions such as lower relative humidity higher
light levels and herbivory those are the more stressful
The latter conditions tend to favor a greater essential oil
accumulation (TAVARES et al 2004) On other hand
plantlets grown in vitro have been continuously exposed
to a unique microenvironment that has been selected to
provide minimal stress and nearly optimal conditions for
plant multiplication
SILVA S da et al58
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
FIGURE 2 ndash A) In vitro culture of Melissa officinalis on MS + IAA in 30 days of culture B) Ex vitro culture six monthsafter transference to soil maximum height 60 cm C) Composition and percentage of the most abundant essential oilcomponents of Melissa officinalis from aerial parts (100 g Fresh Weight) from in vitro e ex vitro culture
In vitro propagation of Melissa officinalis L and production 59
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
CONCLUSIONS
Melissa officinalis micropropagation can be made
using nodal segments from in vitro plants during 5 weeks
in MS media without growth regulators and posterior
subculture in MS media with 05 mM IAA for a better
development Multiplication rates of 44 and 40 were
obtained at the 3rd and 4th subcultures respectively
It was observed a significant difference between
the effects of auxins IAA and NAA The latter exerted an
unsatisfactory influence on the nodal segment formation
shoot length and rooting when compared with the results
obtained with IAA
The plants produced in vitro were vigorous and
after acclimatization they were well adapted After 1 month
at the greenhouse the survival rate was 100
Considering that the main objective of this work is
to produce monoclonal plants to be used by phytomedicine
industries it is important that the method presents a large
number of buds per explant This result plus an efficient
acclimatization stage can save time and produce
monoclonal plants in sufficient number to be used in
commercial field culture Our results showed a change in
the essential oil composition in the proportion of active
compounds However the characteristics of the oil of in
vitro and ex vitro M officinalis plants were not altered
The manipulation of the culture media composition
is an important biotechnological tool for the optimization
of the essential oils production With this technique this
work developed a protocol for highly production of plants
and productivity in the components (geraniol geranial and
neral) of the oil
ACKNOWLEDGMENTS
This work was supported by ICUNIRIO FAPERJ
and CNPq
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CRESCIMENTO IN VITRO DE Laelia tenebrosa (ORCHIDACEAE)EM DIFERENTES CONCENTRACcedilOtildeES DE SAIS DE KNUDSON C
E CARVAtildeO ATIVADO
IN VITRO GROWTH OF Laelia tenebrosa (ORCHIDACEAE) IN DIFFERENTCONCENTRATIONS OF KNUDSON C SALTS AND ACTIVATED CHARCOAL
APARECIDA GOMES DE ARAUJO1 MOACIR PASQUAL2 ALBA REGINA PEREIRA3HERMINIO SOUZA ROCHA4
1Doutoranda em AgronomiaFitotecnia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash agaraujo2003yahoocombr2Dr Professor Titular do Departamento de Agricultura ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash LavrasMG ndash mpasqualuflabr3Doutoranda no Jardim Botacircnico do Rio de Janeiro ndash ENBTJBRJ ndash Pacheco Leatildeo 915 ndash 22460-030 ndash Rio de Janeiro RJ4Doutorando em AgronomiaFitopatologia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash herminiouflanetcombr
RESUMOObjetivou-se testar diferentes concentraccedilotildees de carvatildeo
ativado adicionado ao meio Knudson C no crescimento in vitrode orquiacutedeas Placircntulas de Laelia tenebrosa (LA Rolfe) LARolfe com 1 a 15 cm de comprimento e contendo raiacutezes foraminoculadas em frascos contendo 40 mL de meio de cultura Ostratamentos consistiram na combinaccedilatildeo de concentraccedilotildees de carvatildeoativado (0 05 10 20 e 40 g L-1) e sais minerais de Knudson C(0 50 100 150 e 200) acrescidos de sacarose (20 g L-1) Omeio foi solidificado com 6 g L-1de aacutegar e o pH ajustado para58plusmn01 antes da autoclavagem a 121degC e 11 atm por 20 minutosApoacutes a inoculaccedilatildeo os frascos foram mantidos sob 25 plusmn 1degCfotoperiacuteodo de 16 horas e 32 mM m-2 s-1 de irradiacircncia Apoacutes 150dias verificou-se que a adiccedilatildeo de 2g L-1 de carvatildeo ativado ao meiocom metade dos sais de Knudson C promoveu melhor crescimentoin vitro das placircntulas de Laelia tenebrosa
Termos para indexaccedilatildeo Orquiacutedea meio de cultura cultura detecidos
ABSTRACTThe objective of this work was to test the effect of
Knudson C medium supplemented with different concentrationsof activated charcoal on the in vitro growth of orchids Plantletsof the Laelia tenebrosa (LA Rolfe) LA Rolfe measuring 1-15cm in length containing roots were inoculated in flasks containing40 mL of culture medium The treatments consisted of differentconcentrations of activated charcoal (0 05 10 20 and 40 g L-
1) combined with Knudson C salts (0 50 100 150 and 200)supplemented with sucrose (20 g L-1) The medium was solidifiedwith agar (6 g L-1) and pH adjusted to 58plusmn01 before autoclavingat 121ordmC and 11 atm during 20 minutes After inoculation theexplants were transferred to culture rooms with temperaturemaintained at 25plusmn1ordmC during a 16 hours photoperiod with a lightintensity of 32 microM m-2s-1 The best in vitro growth rates of
Laelia tenebrosa plantlets were obtained using Knudson C 50supplemented with 2 g L-1 activated charcoal after 150 days ofculture
Index terms Orchid culture medium tissue culture
INTRODUCcedilAtildeO
A produccedilatildeo de orquiacutedeas a partir germinaccedilatildeo
assimbioacutetica eacute uma alternativa viaacutevel para obtenccedilatildeo de
grande nuacutemero de plantas em curto espaccedilo de tempo
suprindo assim a necessidade dos produtores de
orquiacutedeas na aquisiccedilatildeo de mudas
Na cultura de tecidos os meios de cultura
geralmente satildeo compostos de uma fonte de carboidratos
macro e micronutrientes e outras substacircncias como
vitaminas aminoaacutecidos accediluacutecares agente solidificante
reguladores de crescimento (GEORGE amp SHERRINGTON
1984) e eventualmente aditivos como antibioacuteticos carvatildeo
ativado e componentes complexos
Knudson (1922) observou que era possiacutevel o
cultivo de sementes em meio artificial contendo minerais e
accediluacutecar sem a presenccedila de fungos micorriacutezicos
Posteriormente em 1946 ele aperfeiccediloou esse meio de
cultura sendo atualmente o mais utilizado comercialmente
na germinaccedilatildeo e desenvolvimento de orquiacutedeas (ARDITTI
amp ERNST 1992) No entanto satildeo necessaacuterios estudos
(Recebido em 23 de fevereiro de 2006 e aprovado em 10 de julho de 2006)
supplemented with
ARAUJO A G de et al62
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
pois satildeo descritos vaacuterios meios de cultura para muitos
gecircneros e espeacutecies diferentes
No cultivo e subcultivo de placircntulas do gecircnero
Cattleya George et al (1987) sugerem o meio Knudson C
(1946) ou Reinert amp Mohr (1967) Segundo Arditti amp Ernst
(1992) os meios de propagaccedilatildeo para Cattleya Laelia
Laeliocattleya e Brassocattleya podem ser os mesmos
citados anteriormente Villalobos et al (1994) sugerem o
meio Vacin amp Went (1949) para Cattleya Encyclia e
Oncidium suplementado com 25 de aacutegua de coco e o
meio Knudson C suplementado com 60 g L-1 de polpa de
banana para orquiacutedeas do gecircnero Stanhopea
O carvatildeo ativado normalmente eacute adicionado ao meio
de cultura em concentraccedilotildees que variam de 02 a 3
(BEYL 2000) O seu efeito natildeo-seletivo pode proporcionar
resultados negativos na micropropagaccedilatildeo Pesquisas
relatam a adsorccedilatildeo de tiamina aacutecido nicotiacutenico
(WEATHERHEAD et al 1978) piridoxina aacutecido foacutelico
reguladores de crescimento e quelatos de ferro
(JOHANSSON et al 1990) Entre os efeitos proporcionados
pela adiccedilatildeo do carvatildeo ativado ao meio de cultura
principalmente agrave organogecircnese e agrave embriogecircnese estatildeo
escurecimento do meio de cultura favorecendo o
enraizamento adsorccedilatildeo de substacircncias inibitoacuterias
produzidas pelo proacuteprio meio ou explante adsorccedilatildeo de
reguladores de crescimento e outros compostos orgacircnicos
e liberaccedilatildeo de substacircncias naturalmente presentes no
carvatildeo que beneficiariam o crescimento in vitro das culturas
(PAN amp STADEN 1998)
Arena amp Pastur (2001) citam que a adiccedilatildeo de carvatildeo
ativado ao meio de cultura promoveu alongamento das
brotaccedilotildees de Berberis buxifolia mas reduziu o iacutendice de
multiplicaccedilatildeo Hazra et al (2002) relataram o efeito
sinergiacutestico do carvatildeo ativado na multiplicaccedilatildeo e
enraizamento de brotaccedilotildees de algodoeiro Amin amp Jaiswal
(1987) Anderson (1980) e Damiano (1978) relataram o efeito
favoraacutevel do carvatildeo quando utilizado em baixas
concentraccedilotildees no enraizamento de brotaccedilotildees de
morangueiro framboeseira e goiabeira respectivamente
A diversidade de resultados obtidos com a utilizaccedilatildeo de
carvatildeo ativado deve-se principalmente ao genoacutetipo da
espeacutecie em questatildeo agrave adsorccedilatildeo de algumas substacircncias
quiacutemicas e compostos orgacircnicos aleacutem de metaboacutelitos
toacutexicos liberados no cultivo in vitro (Wang amp Huang 1976)
Este trabalho teve como objetivo verificar efeito de
diferentes concentraccedilotildees de sais de Knudson C e carvatildeo
ativado sobre o crescimento in vitro de placircntulas de
orquiacutedea da espeacutecie Laelia tenebrosa (LA Rolfe) LA Rolfe
MATERIAL E MEacuteTODOS
Placircntulas da espeacutecie Laelia tenebrosa com 1 a 15
cm de comprimento oriundas de sementes germinadas in
vitro e contendo raiacutezes foram inoculadas em frascos
contendo 40 mL do meio de cultura Knudson C nas
concentraccedilotildees de 0 (apenas aacutegua destilada e aacutegar) 50 100
(concentraccedilatildeo da formulaccedilatildeo original) 150 e 200 de sais
minerais combinado com carvatildeo ativado (0 05 1 2 e 4
mg L-1) suplementado com sacarose (20 g L-1)
O pH do meio foi ajustado para 58 plusmn 01 antes da
adiccedilatildeo de aacutegar (6 g L-1) O meio foi vertido em frascos de
vidro com capacidade para 250 cm3 vedados com tampas
plaacutesticas transluacutecidas natildeo perfuradas e autoclavados agrave
pressatildeo de 11 atm e agrave temperatura do 121degC durante 20
minutos Apoacutes a inoculaccedilatildeo os frascos contendo os
explantes foram mantidos em sala de crescimento com
irradiacircncia em torno de 32 mmol m-2 s-1 temperatura de 25 plusmn
1degC e fotoperiacuteodo de 16 horas
O delineamento experimental utilizado foi
inteiramente casualizado em esquema fatorial 5 x 5 com
quatro repeticcedilotildees de cinco placircntulas cada uma Decorridos
150 dias avaliou-se a meacutedia do nuacutemero de folhas nuacutemero
de raiacutezes comprimento da maior raiz comprimento da parte
aeacuterea e massa fresca de placircntulas Os dados foram
comparados por meio de regressatildeo polinomial empregando-
se o programa Sisvar (FERREIRA 2000)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Apenas para a variaacutevel nuacutemero de folhas houve
interaccedilatildeo entre os niacuteveis de sais e carvatildeo ativado Poreacutem
Crescimento in vitro de Laelia tenebrosa (Orchidaceae) 63
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
por meio do teste F somente as concentraccedilotildees de 50 e
100 de sais do meio Knudson C foram significativas em
relaccedilatildeo agraves concentraccedilotildees de carvatildeo ativado
Os melhores resultados (65 e 585) foram
verificados com 50 (metade) dos sais de Knudson C
combinado com 275 g L-1 de carvatildeo ativado e 100 de
sais com 4 g L-1 de carvatildeo respectivamente (Figura 1)
Com o aumento da concentraccedilatildeo do meio de cultura haacute
necessidade de maior concentraccedilatildeo de carvatildeo Sendo
assim o meio com 50 de sais aleacutem de proporcionar
melhores resultados eacute menos oneroso
Estes resultados contradizem os de Silva et al
(2003) que verificaram que a adiccedilatildeo de carvatildeo ativado ao
FIGURA 1 ndash Nuacutemero de folhas em placircntulas de Laeliatenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees de saisde Knudson C e carvatildeo ativado
meio de cultura inibe a formaccedilatildeo de folhas em placircntulas de
Brassocattleya lsquoPastoralrsquo x Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo
O efeito natildeo seletivo do carvatildeo ativado pode proporcionar
resultados negativos na micropropagaccedilatildeo (PAN amp
STADEN 1998)
Agrave medida em que aumentaram as concentraccedilotildees de
sais de Knudson C maiores quantidades de raiacutezes foram
formadas (Figura 2A) Observou-se maior nuacutemero de raiz
(43) com 965 de sais Para o fator carvatildeo ativado as
melhores respostas (395 raiacutezes) foram verificadas com a
utilizaccedilatildeo de 304 g L-1 adicionadas ao meio de cultura
(Figura 2B)
Para muitas espeacutecies o enraizamento eacute favorecido
pela adiccedilatildeo de carvatildeo ativado ao meio de cultura Hazra et
al (2002) relataram o efeito sinergiacutestico do carvatildeo ativado
na multiplicaccedilatildeo e enraizamento de brotaccedilotildees de
algodoeiro O meio MS com metade dos sais minerais
acrescido de 20 g L-1 de sacarose 7 g L-1 de aacutegar e 1 g L-1 de
carvatildeo ativado promoveu maior quantidade de raiacutezes em
placircntulas de Cattleya nobilior Rchb f (REIS et al 2003)
Segundo Paiva et al (2005) aleacutem de um equiliacutebrio
hormonal favoraacutevel agrave formaccedilatildeo de raiacutezes outros fatores
internos tecircm sido relacionados com a iniciaccedilatildeo do processo
de enraizamento como presenccedila de sacarose alta relaccedilatildeo
CN e nutrientes minerais (foacutesforo caacutelcio zinco e boro) O
meio Knudson C natildeo possui micronutrientes apresenta
uma concentraccedilatildeo maior de caacutelcio e tem baixas
FIGURA 2 ndash Nuacutemero de raiacutezes em placircntulas de Laelia tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees de sais deKnudson C (A) e concentraccedilotildees de carvatildeo ativado (B)
ARAUJO A G de et al64
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
concentraccedilotildees de N e K em relaccedilatildeo ao MS e WPM o que
provavelmente favoreceu tanto o nuacutemero quanto o
comprimento de raiacutezes (PASQUAL 2001)
O maior comprimento de raiz (331 cm) foi verificado
com a utilizaccedilatildeo de 100 de sais de Knudson C A partir do
ponto maacuteximo (100) houve diminuiccedilatildeo do comprimento
radicular provavelmente devido ao desbalanccedilo nutricional
(Figura 3A) Com o aumento das concentraccedilotildees de carvatildeo
ativado houve um incremento linear no comprimento de
raiacutezes Melhores resultados foram observados com a
utilizaccedilatildeo de 4 g Lndash1 de carvatildeo ativado (Figura 3B) Como a
relaccedilatildeo foi direta pode-se inferir que o efeito estimulante
do carvatildeo ativado no comprimento da maior raiz continuaria
para concentraccedilotildees superiores a 4 g L-1
A adiccedilatildeo de carvatildeo ativado no meio de cultura foi
beneacutefica promovendo tanto o nuacutemero quanto o
crescimento de raiacutezes O carvatildeo conteacutem impurezas que
podem favorecer o crescimento de raiacutezes jaacute existentes e
induzir emissatildeo de novas raiacutezes (PASQUAL 2001)
Melhores resultados para comprimento da parte
aeacuterea (18 cm) foram observados quando se utilizou o
meio Knudson C na concentraccedilatildeo de 121 de sais (Figura
4A) poreacutem na concentraccedilatildeo de 50 obtiveram-se
explantes com 17 cm de comprimento Essa diferenccedila
observada (01 cm) eacute muito pequena o que natildeo justifica a
utilizaccedilatildeo de um meio mais concentrado mas a reduccedilatildeo
do mesmo agrave sua metade
O enraizamento in vitro pode ser favorecido com o
uso de meio de cultura com a metade ou 75 da
concentraccedilatildeo normal de sais Em algumas espeacutecies altas
concentraccedilotildees de sais principalmente a presenccedila de iacuteons
amocircnio favorecem o desenvolvimento de raiacutezes enquanto
que em outras podem ser inibidoras (PASQUAL et al
2001)
O maior comprimento da parte aeacuterea (19 cm) foi
obtido na presenccedila de 4 g Lndash1 de carvatildeo ativado (Figura
4B) a concentraccedilatildeo de 2 g Lndash1 proporcionou um
comprimento de 18 cm Comparando-se os niacuteveis 4 e 2 g Lndash1
de carvatildeo ativado nota-se pequena diferenccedila (01 cm) o
que justifica a utilizaccedilatildeo de 2 g Lndash1
O carvatildeo ativado conteacutem impurezas que quando
liberadas no meio de cultura podem beneficiar ou natildeo o
crescimento in vitro Simotildees et al (1999) verificaram que a
concentraccedilatildeo de 1 g L-1 de carvatildeo ativado acrescida ao
meio Knudson C proporciona o melhor desenvolvimento
de brotos de Epidendrum sp e Dendrobium sp
Maior massa fresca de placircntulas (0144g) foi
verificada com a utilizaccedilatildeo de 50 de sais de Knudson C
ponto a partir do qual houve diminuiccedilatildeo no peso (Figura
5A) Provavelmente essa reduccedilatildeo ocorreu devido agrave
toxidez
A utilizaccedilatildeo de 4 g L-1 de carvatildeo ativado
proporcionou uma massa de 0185 g nas placircntulas frescas
(Figura 5B)
FIGURA 3 ndash Comprimento da maior raiz em placircntulas de Laelia tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees desais de Knudson C (A) e carvatildeo ativado (B)
Crescimento in vitro de Laelia tenebrosa (Orchidaceae) 65
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
FIGURA 4 ndash Comprimento da parte aeacuterea em placircntulas de Laelia tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees desais de Knudson C (A) e carvatildeo ativado (B)
FIGURA 5 ndash Massa fresca de placircntulas de L tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees de sais de Knudson C(A) e carvatildeo ativado (B)
O carvatildeo ativado eacute comumente utilizado na cultura
de tecidos de plantas Seu efeito eacute atribuiacutedo agrave adsorccedilatildeo de
substacircncias toacutexicas produzidas pelas plantas adsorccedilatildeo
de fitorreguladores do meio e escurecimento do meio onde
se desenvolvem as raiacutezes das plantas (GEORGE 1993)
O melhor desenvolvimento de Phalaenopsis in
vitro ocorreu na presenccedila de carvatildeo ativado na
concentraccedilatildeo de 2 g L-1 indicando que este possa ser um
elemento importante no processo (BRESSAN et al 1999)
Apesar do carvatildeo ativado na concentraccedilatildeo de 4 g
L-1 ter proporcionado melhores resultados verificou-se que
na concentraccedilatildeo de 2 g L-1 os efeitos apresentam uma
diferenccedila miacutenima Embora o carvatildeo ativado natildeo seja o
componente de maior custo no preparo de meio de cultura
a sua reduccedilatildeo juntamente com os sais minerais eacute
economicamente favoraacutevel especialmente para a produccedilatildeo
comercial de mudas
CONCLUSAtildeO
A adiccedilatildeo de 2 g L-1 de carvatildeo ativado ao meio de
cultura Knudson C com metade (50) de sais minerais
promoveu melhor crescimento em placircntulas de Laelia
tenebrosa cultivadas in vitro
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PROPAGACcedilAtildeO IN VITRO DE PLAcircNTULAS DE ORQUIacuteDEA EMDIFERENTES MEIOS DE CULTURA E CONCENTRACcedilOtildeES
DE CITOCININA
IN VITRO PROPAGATION OF ORCHID PLANTLETS CULTIVATED IN DIFFERENTCULTURE MEDIA AND CYTOKININ CONCENTRATIONS
APARECIDA GOMES DE ARAUJO1 MOACIR PASQUAL2 ADRIANO BORTOLOTTI DA SILVA3 FABIacuteOLA VILLA3 HERMIacuteNIO SOUZA ROCHA3 FERNANDA CARVALHO COSTA4
1Doutoranda em AgronomiaFitotecnia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash agaraujo2003yahoocombr2Professor Titular Departamento AgriculturaDAG ndash Universidade Federal de Lavras UFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200000 ndash Lavras MG ndash mpasqualuflabr3Doutorando em Agronomia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200000 ndash Lavras MG4Departamento de AgriculturaDAG ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash fecostapuryahoocombr
RESUMOA taxa de multiplicaccedilatildeo de orquiacutedeas a partir de meacutetodos
convencionais eacute bastante baixa natildeo atendendo as necessidadescomerciais A cultura de tecidos permite maiores taxas demultiplicaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de plantas uniformes e sadiasObjetivou-se estudar a influecircncia da citocinina BAP (6-benzilaminopurina) em diferentes meios de cultura napropagaccedilatildeo in vitro de placircntulas hiacutebridas de BrassocattleyalsquoPastoralrsquox Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo Placircntulas comaproximadamente 15plusmn05 cm de comprimento obtidasassimbioticamente foram transferidas para frascos comcapacidade de 250 cm3 contendo 40 mL das formulaccedilotildees salinasde MS WPM e Knudson C combinados com 0 05 10 20 e40 mg L-1 de BAP acrescidos de 2 g L-1 de carvatildeo ativadosolidificado com 6 g L-1 de aacutegar e pH ajustado para 58plusmn01Apoacutes a inoculaccedilatildeo os frascos foram incubados a 25plusmn2oC 35igravemolm-2s-1 de intensidade luminosa e sob fotoperiacuteodo de 16horas Apoacutes 90 dias observou-se que melhores resultados parapropagaccedilatildeo in vitro em placircntulas de orquiacutedea Bc lsquoPastoralrsquo x LclsquoAmber Glowrsquo satildeo obtidos com o meio WPM A suplementaccedilatildeode 4 mg L-1 de BAP no meio WPM favorece o crescimento invitro Para a multiplicaccedilatildeo maior quantidade de brotos eacuteconseguida em meio MS na ausecircncia de BAP
Termos para indexaccedilatildeo Orquiacutedea crescimento in vitrocitocinina
ABSTRACTThe multiplication rate of orchids by conventional
methods is considerably low and does not attend its commercialneeds Tissue culture results in larger multiplication rates andproduces uniform and healthy orchid plantlets The objective ofthis work was to study the influence of the cytokinin BAP (6-benzilaminopurine) in different culture media for ther in vitropropagation of Brassocattleya lsquoPastoralrsquox Laeliocattleya lsquoAmberGlowrsquo hybrid plantlets Plantlets measuring approximately 15plusmn 05 cm length deriving from in vitro germination were inoculated
in flasks of 250 cm3 volume containing 40 mL MS WPM andKnudson C salt formulations combined with BAP (0 05 1 2and 4 mg L-1) supplemented with 2 g L-1 activated charcoalsolidified with 6 g L-1 agar and pH adjusted for 58 plusmn 01 Afterthe inoculation the plantlets maintained in a growth room at25plusmn2ordmC 35 mMol m-2 s-1 light intensity and 16 hoursphotoperiod After 90 days the best results for the in vitropropagation of orchid plantlets Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquowere obtained with half strength WPM The supplementation of4 mg L-1 BAP to the WPM medium favors in vitro growth Forthe multiplication phase the largest number of sprouts is achievedwith full strength MS medium in the absence of BAP
Index terms Orchid in vitro growth cytokinin
INTRODUCcedilAtildeO
As orquiacutedeas satildeo consideradas as plantas
ornamentais haacute mais tempo cultivadas pelo homem
Pertencem agrave famiacutelia Orchidaceae a maior entre as
monocotiledocircneas e tambeacutem entre as plantas ornamentais
com 600 - 800 gecircneros e 25000-35000 espeacutecies (SHEEHAN
1983) totalizando 7 das plantas ornamentais do mundo
(Van Der PIJL amp DODSON 1966)
A propagaccedilatildeo de orquiacutedeas pode ser tanto
vegetativa quanto por meio de sementes Estas embora
produzidas em grande quantidade natildeo possuem
endosperma funcional prescindindo para tanto da
associaccedilatildeo simbioacutetica com fungos micorriacutezicos dentre os
quais a Rhizoctonia que eacute um dos gecircneros mais importante
(PIERIK 1987 SHEEHAN 1983)
(Recebido em 08 de dezembro de 2005 e aprovado em 10 de julho de 2006)
Propagaccedilatildeo in vitro de placircntulas de orquiacutedea 69
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 68-73 2006
Knudson (1922) observou que era possiacutevel o cultivo
de sementes em meio artificial contendo apenas sais
nutritivos e accediluacutecar na ausecircncia de fungos Posteriormente
em 1946 o mesmo autor aperfeiccediloou este meio de cultura
sendo atualmente um dos mais utilizados comercialmente
na germinaccedilatildeo e desenvolvimento de orquiacutedeas (ARDITTI
amp ERNST 1992) No entanto satildeo necessaacuterios estudos
pois satildeo descritos vaacuterios meios de cultura para muitos
gecircneros e espeacutecies diferentes O meio de cultura mais
utilizado na cultura de tecidos em geral eacute o MS (Murashige
amp Skoog 1962) podendo-se encontrar o uso de outros
meios como Knudson C (1946) e WPM (Wood Plant
Medium) de Loyd amp McCown (1980)
Reguladores de crescimento em diferentes
concentraccedilotildees tecircm sido usados conforme a espeacutecie e a
metodologia utilizada Podem ser necessaacuterios para a
germinaccedilatildeo de sementes formaccedilatildeo de calos e brotaccedilotildees
adventiacutecias (GRATTAPAGLIA amp MACHADO 1998
PASQUAL 2001)
O regulador de crescimento BAP (6-
benzilaminopurina) eacute uma citocinina largamente utilizada
para estimular a induccedilatildeo de brotos em plantas ornamentais
Para o cultivo in vitro de orquiacutedeas do grupo Cattleya a
citocinina BAP geralmente eacute utilizada nas concentraccedilotildees
que variam entre 005 e 10 mg L-1 (CARVALHO 2002)
Martini et al (2001) trabalhando com a orquiacutedea
Gongora quinquenervis observaram que a presenccedila do
BAP inibe a multiplicaccedilatildeo de calos e o potencial
organogecircnico Silva (2003) concluiu que para o estaacutedio de
subcultivo de Brassocattleya lsquoPastoralrsquo x Laeliocattleya
lsquoAmber Glowrsquo natildeo haacute necessidade da adiccedilatildeo de BAP como
estiacutemulo ao desenvolvimento geral do explante Melhor
proliferaccedilatildeo de brotos formaccedilatildeo de raiacutezes nuacutemero de
folhas e comprimento de brotos em Dendrobium foram
obtidos com 25 mg L-1 de BAP + 05 mg L-1 de ANA
adicionados ao meio MS (TALUKDER et al 2003)
Aleacutem do tipo de meio outro aspecto importante na
multiplicaccedilatildeo in vitro estaacute relacionado com o tipo de
citocinina e sua concentraccedilatildeo sendo ambos determinantes
no sucesso da micropropagaccedilatildeo (GRATTAPAGLIA amp
MACHADO 1998)
O maior entrave no processo de micropropagaccedilatildeo
de orquiacutedeas estaacute relacionado ao tempo necessaacuterio para a
produccedilatildeo de mudas a partir de plantas hiacutebridas
selecionadas e a utilizaccedilatildeo de meio de cultura adequado
para cada espeacutecie Assim objetivou-se estudar o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de BAP e formulaccedilotildees de minerais
nutritivos em meios de cultura na propagaccedilatildeo in vitro de
placircntulas de orquiacutedea oriundas do hiacutebrido Brassocattleya
lsquoPastoralrsquo x Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo
MATERIAL E MEacuteTODOS
Placircntulas hiacutebridas oriundas de sementes
germinadas assimbioticamente em meio Knudson C
obtidas do cruzamento entre Brassocattleya lsquoPastoralrsquo x
Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo com aproximadamente
15plusmn05 cm de comprimento foram transferidas para frascos
de 250 cm3 de capacidade contendo 40 mL de meio de
cultura e vedados com tampas plaacutesticas transluacutecidas Os
tratamentos consistiram de diferentes formulaccedilotildees salinas
(MS WPM e Knudson C em suas formulaccedilotildees originais)
combinadas com 0 05 10 20 e 40 mg L-1 de BAP
acrescidos de 2 g L-1 de carvatildeo ativado solidificado com
6 g L-1 de aacutegar e pH ajustado para 58plusmn01 antes da
autoclavagem obtida a 121ordmC e 1 atm por 20 minutos
Posteriormente agrave inoculaccedilatildeo os frascos foram
transferidos para sala de crescimento com temperatura
de 25plusmn2ordmC fotoperiacuteodo de 16 horas e 35 mmolm-2s-1 de
intensidade luminosa fornecida por lacircmpadas do tipo
(Grow-lux) e luz do dia especial O delineamento
experimental utilizado foi inteiramente casualizado no
esquema fatorial 3 x 5 com cinco repeticcedilotildees de quatro
placircntulas cada sendo cada repeticcedilatildeo composta por um
frasco
Apoacutes 90 dias da instalaccedilatildeo do experimento foram
avaliados nuacutemero meacutedio de brotos comprimento meacutedio
da parte aeacuterea nuacutemero meacutedio de raiacutezes nuacutemero meacutedio de
folhas e meacutedia da massa fresca total de placircntulas
ARAUJO A G de et al70
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 68-73 2006
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Para a variaacutevel nuacutemero de folhas natildeo houve
significacircncia dos fatores isolados nem da interaccedilatildeo entre
eles O nuacutemero de raiacutezes e massa fresca total de placircntulas
apresentaram significacircncia apenas para o fator meio de
cultura enquanto que para nuacutemero de brotos e
comprimento da parte aeacuterea a interaccedilatildeo dos fatores foi
significativa (Tabela 1)
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de brotos observou-se
interaccedilatildeo entre os fatores BAP e os meios de cultura
utilizados (Tabela 1) Poreacutem pelo teste F verificou-se que
apenas o meio MS foi significativo em relaccedilatildeo agraves
concentraccedilotildees de BAP (Figura 1)
O maior nuacutemero de brotos (334) foi registrado na
formulaccedilatildeo de MS adicionado de 40 mg L-1 de BAP
Entretanto na ausecircncia dessa citocinina foi observada a
formaccedilatildeo de 304 brotosplanta (Figura 1) Diante da
pequena diferenccedila na quantidade meacutedia de brotos
formados entre a maior concentraccedilatildeo e o tratamento sem
o regulador de crescimento justifica-se a utilizaccedilatildeo do
meio de cultura sem o BAP Estes resultados concordam
com Silva (2003) que obteve maior nuacutemero de brotos (2
brotos) na ausecircncia de BAP para esse mesmo hiacutebrido
poreacutem em meio Knudson C
A natildeo utilizaccedilatildeo de reguladores de crescimento
adicionados ao meio de cultura vai influenciar na
reduccedilatildeo dos custos de produccedilatildeo de mudas jaacute que esse
eacute um dos componentes mais onerosos Isso eacute
extremamente importante principalmente para
laboratoacuterios comerciais
TABELA 1 ndash Resumo da anaacutelise de variacircncia para as caracteriacutesticas meacutedias de nuacutemero de folhas (NF) nuacutemero de raiacutezes(NR) nuacutemero de brotos (NB) comprimento da parte aeacuterea (CPA) e massa fresca total de placircntulas (MFP) e respectivoscoeficientes de variaccedilatildeo (CV)
significativo a 1 e 5 de probabilidade respectivamente pelo teste F
FIGURA 1 ndash Efeito do meio de cultura MS e concentraccedilotildees de BAP no nuacutemero meacutedio de brotos em placircntulas hiacutebridasde Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo apoacutes 90 dias da incubaccedilatildeo
Fontes de variaccedilatildeo GL Quadrados meacutedios
NF NR NB CPA MFP Meios 2 125683 ns 162740 01483 ns 53139 02372 BAP 4 186198 ns 44693 ns 04408 ns 03373 ns 00075 ns
Meio x BAP 8 243984 ns 13417 ns 17417 13579 00459 ns
Resiacuteduo 45 124475 21329 05055 05961 00662 CV () 3467 3081 2801 2443 5100
Propagaccedilatildeo in vitro de placircntulas de orquiacutedea 71
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 68-73 2006
O estiacutemulo agrave brotaccedilatildeo em placircntulas de Spathoglottis
plicata Griff ocorreu em meio MS suplementado com 10
mg L-1 de BAP e 25 mg L-1 de ANA tendo o enraizamento
estimulado com 20 mg L-1 de AIB (NAYAK et al 1999)
TDZ tambeacutem eacute utilizado em associaccedilatildeo com BAP para
regeneraccedilatildeo de brotos de Rhynchostylis (BUI Le al 1999)
e de Anoectochilus (LI et al 1999) todas orquidaceaes
Observou-se interaccedilatildeo entre o tipo de meio de
cultura e o BAP no que diz respeito ao comprimento de
parte aeacuterea das placircntulas (Tabela 1) Pelo teste de F apenas
o meio WPM foi significativo em relaccedilatildeo agraves concentraccedilotildees
de BAP (Figura 2)
O maior comprimento da parte aeacuterea (47 cm) foi
observado quando se utilizou o meio WPM combinado
com 40 mg L-1 de BAP (Figura 2) Como a relaccedilatildeo foi direta
pode-se inferir que o efeito estimulatoacuterio do BAP sobre o
crescimento da parte aeacuterea continuaria mesmo em
concentraccedilotildees maiores que 40 mg L-1 Talukder et al (2003)
obtiveram melhor comprimento de brotos (0472 cm) em
placircntulas de Dendrobium com utilizaccedilatildeo de 25 mg L-1 de
BAP + 05 mg L-1 de ANA adicionados ao meio MS
Relativo ao nuacutemero meacutedio de raiacutezes houve
significacircncia apenas para o fator meio de cultura (Tabela 1)
Na Tabela 2 verifica-se que os maiores valores foram obtidos
com os meios WPM (557) seguido do MS (487) sendo os
menores valores verificados no meio Knudson C (378) A
emissatildeo de novas raiacutezes eacute favorecida pelo caacutelcio e pelo boro
O meio Knudson C apresenta uma concentraccedilatildeo maior de
caacutelcio e menor de boro em relaccedilatildeo aos meios MS e WPM
que possuem concentraccedilotildees semelhantes de ambos
Segundo Pierik (1987) em concentraccedilotildees mais elevadas
(1 a 10 mg L-1) as citocininas podem induzir a formaccedilatildeo de
gemas adventiacutecias quebrando a dominacircncia apical e retardando
a formaccedilatildeo de raiacutezes Talukder et al (2003) encontraram maior
nuacutemero de raiacutezes (193explante) em placircntulas de Dendrobium
com utilizaccedilatildeo de 25 mg L-1 de BAP + 05 mg L-1 de ANA
adicionados ao meio MS O estiacutemulo ao enraizamento em
Spathoglottis plicata ocorreu em meio MS suplementado com
20 mg L-1 de AIB (NAYAK et al 1999)
FIGURA 2 ndash Comprimento meacutedio da parte aeacuterea em placircntulas hiacutebridas Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo cultivadas emmeio de cultura WPM e diferentes concentraccedilotildees de BAP
TABELA 2 ndash Efeito de diferentes meios de cultura sobreo nuacutemero meacutedio de raiacutezes em placircntulas hiacutebridas de BclsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo
Meios de Cultura Nuacutemero meacutedio de raiacutezes
WPM 557 a MS 487 a KC 378 b
Meacutedias seguidas pela mesma letra natildeo diferem entre sipelo teste de Scott-Knott a 5
ARAUJO A G de et al72
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 68-73 2006
O efeito ora inibitoacuterio ora estimulatoacuterio dos
fitorreguladores na formaccedilatildeo de brotos e raiacutezes em
diferentes plantas pode estar associado agrave proacutepria
concentraccedilatildeo bem como a absorccedilatildeo dos reguladores de
crescimento pelo substrato (GEORGE 1996) agrave habituaccedilatildeo
(SANTANA amp PAIVA 2001) ou agrave deficiecircncia de proteiacutena
ligante promotora da atuaccedilatildeo das citocininas (TAIZ amp
ZEIGER 1998)
O nuacutemero de folhas natildeo apresentou diferenccedilas
significativas para os tratamentos estudados
isoladamente nem houve interaccedilatildeo entre eles (Tabela 1)
Talukder et al (2003) obtiveram maior nuacutemero de folhas
(425placircntula) em Dendrobium com utilizaccedilatildeo de 25 mg L-
1 de BAP + 05 mg L-1 de ANA adicionados ao meio MS
Para massa fresca de placircntulas houve significacircncia
apenas para o fator meio de cultura isoladamente (Tabela
1) Atraveacutes do teste de meacutedias constatou-se maior massa
de placircntulas frescas nos meios WPM e MS com 0524 e
0503g respectivamente Resultado inferior (0326g) foi
registrado em meio Knudson C (Tabela 3)
TABELA 3 ndash Efeito do meio de cultura na massa frescatotal de placircntulas do hiacutebrido Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmberGlowrsquo
Meios de Cultura Massa fresca total de placircntulas (g)
WPM 0524 a MS 0503 a KC 0326 b
Meacutedias seguidas pela mesma letra natildeo diferem entre sipelo teste de Scott-Knott a 5
Dignart (2003) estudando a germinaccedilatildeo in vitro
de sementes de Cattleya nobilior Rchbf em diferentes
meios de cultura (MS WPM Knudson C e B5 de
GAMBORG et al 1968) observou que natildeo houve
diferenccedilas entre os meios utilizados O BAP adicionado
ao meio de cultura provocou aumento da taxa de brotaccedilatildeo
a partir de 1 igravemolL
Segundo (PASQUAL 2001) os meios MS e WPM
possuem concentraccedilotildees similares de micronutrientes e satildeo
ricos em nitrogecircnio (N) e potaacutessio (K) Jaacute o meio Knudson C
natildeo possui micronutrientes e tem baixas concentraccedilotildees de
N e K em relaccedilatildeo ao MS e WPM Os melhores resultados
para as variaacuteveis analisadas foram observados em meio WPM
e MS Essa resposta provavelmente deveu-se ao fato de
que o meio Knudson C possui diferentes sais minerais e
embora seja muito utilizado na germinaccedilatildeo de sementes de
orquiacutedeas parece natildeo propiciar condiccedilotildees satisfatoacuterias para
o desenvolvimento de placircntulas de algumas espeacutecies de
orquiacutedeas
Sabe-se que existe uma relaccedilatildeo entre o nuacutemero de
brotos e seu tamanho e nessa relaccedilatildeo quanto maior for o
nuacutemero de brotos menor o tamanho dos mesmos
(GEORGE 1996) Essa relaccedilatildeo fez-se presente ateacute a
concentraccedilatildeo de 20 mg L-1 de BAP em Bc lsquoPastoralrsquo x Lc
lsquoAmber Glowrsquo No entanto em concentraccedilotildees superiores
tanto o nuacutemero quanto o comprimento dos brotos
aumentaram Tal diversidade de resultados estaacute
relacionada principalmente ao genoacutetipo da espeacutecie meio
de cultura e possivelmente agrave interferecircncia na accedilatildeo dos
reguladores de crescimento
Segundo Malaure et al (1991) diferentes efeitos
dos reguladores de crescimento podem ocorrer para
diferentes espeacutecies inclusive variaccedilotildees dentro de uma
mesma espeacutecie Em orquiacutedeas o efeito dos reguladores de
crescimento e de meios de cultura satildeo diversificados
principalmente quando se utiliza um hiacutebrido trigeneacuterico
com alto grau de heterozigose
CONCLUSOtildeES
Melhores resultados para propagaccedilatildeo in vitro de
placircntulas de orquiacutedea Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo satildeo
obtidos com o meio WPM A suplementaccedilatildeo de 4 mg L-1 de
BAP no meio WPM favorece o crescimento in vitro Para
a multiplicaccedilatildeo maior quantidade de brotos eacute conseguida
em meio MS na ausecircncia de BAP
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SILVEIRA D G et al74
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
EFEITO DO VIacuteRUS DAS ESTRIAS DA BANANEIRA NAMICROPROPAGACcedilAtildeO E NO CRESCIMENTO DAS PLANTAS DA
CULTIVAR CAIPIRA DURANTE A ACLIMATIZACcedilAtildeO1
EFFECT OF BANANA STREAK VIRUS ON MICROPROPAGATION AND PLANTGROWTH OF CULTIVAR CAIPIRA DURING ACLIMATIZATION
DANIELA GARCIA SILVEIRA2 ANTOcircNIO DA SILVA SOUZA3 PAULO ERNESTO MEISSNER FILHO3TALES MILER SOARES4 RANULFO CORREA CALDAS3 KAacuteTIA REGINA BARBOSA LEAtildeO5
1Parte da Dissertaccedilatildeo de Mestrado apresentada pelo primeiro autor ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias Agraacuterias da Escola de AgronomiaUFBA ndash Cruz das Almas BA2Doutoranda em Botacircnica ndash Universidade Estadual de Feira de SantanaUEFS ndash Feira de Santana BA ndash danielagsigcombr3Pesquisador da Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical ndash Caixa Postal 007 ndash 44380-000 ndash Cruz das Almas BA4Doutorando da Escola Superior Luis de QueirozEsalq ndash Piracicaba SP ndash tmsoaresesalquspbr5Engenheira Agrocircnoma MSc EBDA ndash Cruz das Almas BA ndash 44380-000 ndash krbleaohotmailcom
(Recebido em 12 de abril de 2006 e aprovado em 28 de agosto de 2006)
RESUMOAvaliaram-se os efeitos da infecccedilatildeo pelo viacuterus das estrias
de bananeira (Banana Streak Virus BSV) no desenvolvimento invitro e no crescimento das plantas da cultivar Caipira durante aaclimatizaccedilatildeo Utilizou-se o delineamento experimentalinteiramente casualizado com dois tratamentos plantas sadias eplantas infectadas pelo BSV com respectivamente 24 e 28repeticcedilotildees Os explantes foram desinfestados e estabelecidos emmeio MS baacutesico suplementado com 30 gL de sacarose solidificadocom 2 gL de lsquoPhytagelrsquo e pH ajustado em 58 Foram efetuadoscinco subcultivos em meio com 4 mgL de BAP (6-benzilaminopurina) e as plantas obtidas foram enraizadas nessemesmo meio de cultura sem reguladores de crescimento Apoacutesessa etapa transferiram-se as plantas para a aclimatizaccedilatildeo emcacircmara uacutemida onde permaneceram por 30 dias Avaliaram-se astaxas de multiplicaccedilatildeo a presenccedila in vitro dos sintomas do BSVnos explantes provenientes das plantas infectadas durante amicropropagaccedilatildeo e aclimatizaccedilatildeo as perdas por contaminaccedilatildeoenvolvendo fungos e bacteacuterias nas fases da micropropagaccedilatildeo e aaltura das plantas na fase da aclimatizaccedilatildeo A infecccedilatildeo pelo BSVnatildeo afetou significativamente a multiplicaccedilatildeo e o crescimento invitro das plantas sendo os sintomas do viacuterus visiacuteveis em todasas fases da micropropagaccedilatildeo e na aclimatizaccedilatildeo das plantasinfectadas A maior porcentagem de contaminaccedilatildeo ocorreu nafase de estabelecimento in vitro dos explantes independentementedos tipos de plantas utilizadas Apoacutes 30 dias de aclimatizaccedilatildeo asplantas com BSV apresentaram altura inferior agraves plantas sadiasA presenccedila do viacuterus natildeo influenciou a taxa de multiplicaccedilatildeo dosexplantes poreacutem afetou o crescimento das plantas infectadas
Termos para indexaccedilatildeo Musa BSV cultura de tecidospropagaccedilatildeo in vitro
ABSTRACTThe effects of the banana streak virus (BSV) infection on
in vitro development of the cultivar Caipira were evaluated The
used experimental design was a completely randomized withtwo treatments healthy plants and plants infected by BSV with24 and 28 replications respectively The explants weredisinfected and established in a basic MS medium supplementedwith 30 gL sucrose solidified with 2 gL lsquoPhytagelrsquo and pHadjusted to 58 Five subcultures were carried out in a mediumcontaining 4 mgL BAP (6-benzylaminopurine) and the plantletswere rooted in the same culture medium without growthregulators Afterwards the plantlets were transferred to a humidchamber for acclimatization during a 30-day periodMultiplication rates presence of BSV symptoms on in vitroexplants obtained from plants infected during themicropropagation and acclimatization periods losses caused byfungal and bacterial contamination and plantlet height at theacclimatization stage were evaluated The infection by BSVpresented no significant effect on the multiplication rate and invitro plant growth although the virus symptoms were visible inall the micropropagation phases and during the acclimatizationof infected plants The highest percentage of contaminationoccurred during the in vitro establishment phase regardless theused plants After 30 days of acclimatization the plants withBSV presented a lower height compared to the healthy plantsAlthough the presence of the virus had no influence on the explantmultiplication rate it affected the growth of infected plants
Index terms Musa BSV tissue culture in vitro propagation
INTRODUCcedilAtildeO
As bananeiras estatildeo sujeitas as vaacuterias doenccedilas
causadas por fungos bacteacuterias nematoacuteides e viacuterus que
satildeo limitantes agrave sua capacidade de produccedilatildeo Entre as
viroses que ocorrem no Brasil destaca-se a causada pelo
viacuterus das estrias da bananeira (Banana streak virus BSV)
Efeito do viacuterus das estrias da bananeira 75
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
que eacute particularmente importante para os programas de
melhoramento geneacutetico e de multiplicaccedilatildeo comercial de
cultivares uma vez que pode ser incorporada ao genoma e
transmitida pelas sementes de plantas infectadas
(DANIELLS et al 1995) aleacutem de natildeo existir um meacutetodo
eficiente para limpar uma planta infectada com BSV
(LOCKHART 1994)
Esse viacuterus natildeo eacute transmitido mecanicamente sendo as
mudas infectadas sua principal forma de disseminaccedilatildeo
(LOCKHART amp AUSTREY 1988 LOCKHART 1994) A
transmissatildeo eacute feita de maneira semi-persistente pela cochonilha-
dos-citros Planococcus citri Risso e pela cochonilha-da-cana-
de-accediluacutecar Saccharicoccus sacchari cocherell (LOCKHART
1993 LOCKHART amp AUSTREY 1988)
O BSV inicialmente causa na bananeira um estriado
cloroacutetico de linhas descontiacutenuas dispersas e concentradas
em partes da lacircmina foliar Com o envelhecimento das
folhas o estriado causa necrose de coloraccedilatildeo marrom-cafeacute
a negro (RAMIREZ amp RIVERA 1994) As plantas
infectadas geralmente natildeo mostram sintomas em todas as
folhas (CORDEIRO amp KIMATI 1997 LOCKHART 1986)
Outros sintomas do BSV satildeo a reduccedilatildeo do vigor da planta
e a diminuiccedilatildeo do tamanho dos frutos que tambeacutem ficam
deformados (RAMIREZ amp RIVERA 1994)
Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos
da infecccedilatildeo pelo BSV na multiplicaccedilatildeo in vitro e no
crescimento durante a aclimatizaccedilatildeo das plantas de
bananeira da cultivar Caipira Aleacutem disso avaliou-se a taxa
de contaminaccedilatildeo por fungos e bacteacuterias na etapas da
micropropagaccedilatildeo devido a importacircncia dessa variaacutevel na
multiplicaccedilatildeo in vitro das plantas
MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo dos efeitos do BSV na micropropagaccedilatildeo
da cultivar Caipira (grupo AAA) foi conduzido no
Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos da Embrapa Mandioca
e Fruticultura Tropical Utilizou-se o delineamento
experimental inteiramente casualizado com dois
tratamentos plantas sadias com 24 repeticcedilotildees coletadas
no Banco de Germoplasma de Bananeira da Embrapa
Mandioca e Fruticultura Tropical e plantas infectadas com
BSV com 28 repeticcedilotildees Foram usadas mudas do tipo
chifrinho sendo que as matrizes infectadas com BSV com
altura meacutedia de 12 cm foram infestadas pela cochonilha
vetora Planacoccus citri Risso alimentadas em folhas de
banana lsquoMysorersquo com sintomas de BSV em casa-de-
vegetaccedilatildeo Aproximadamente 15 dias apoacutes a infestaccedilatildeo
todas as 28 plantas estavam com os sintomas da virose
Para o estabelecimento in vitro realizou-se a limpeza
das matrizes por meio de uma seacuterie de cortes removendo-
se parte do rizoma e do pseudocaule ateacute o tamanho
aproximado de 50 cm de altura por 15 cm de diacircmetro
lavando-se com detergente e aacutegua deionizada A
desinfestaccedilatildeo foi feita em cacircmara de fluxo laminar
imergindo os explantes em soluccedilatildeo de aacutelcool 70 por
cinco minutos e em soluccedilatildeo 11 de aacutegua sanitaacuteria comercial
(2 de cloro ativo) com aacutegua deionizada por 30 minutos
Em seguida foram realizadas trecircs lavagens com aacutegua
deionizada esterilizada e reduzidos os explantes ateacute o
tamanho final de 06 cm de altura por 04 cm de diacircmetro
As etapas de estabelecimento multiplicaccedilatildeo e
enraizamento foram realizadas em meio nutritivo MS baacutesico
(MURASHIGE amp SKOOG 1962) suplementado com 30 g
L de sacarose solidificado com 2 gL de ldquoPhytagelrdquo e pH
ajustado para 58 Apenas na fase de multiplicaccedilatildeo o meio
MS foi suplementado com 4 mgL de 6-benzilaminopurina
(BAP) Em todas as etapas os explantes foram dispostos
sobre 25 mL de meio de cultura em frascos com 12 cm de
altura por 5 cm de diacircmetro
A multiplicaccedilatildeo foi realizada em cinco subcultivos
das gemas e brotos sendo efetuada a subdivisatildeo
longitudinal dos explantes sempre que possiacutevel O
estabelecimento e os cinco subcultivos foram realizados
com intervalos de 30 dias Apoacutes os subcultivos as
plantas permaneceram 30 dias em enraizamento O
estudo foi desenvolvido sob condiccedilotildees de temperatura
de 27 plusmn 1ordmC fotoperiacuteodo de 16 horas e intensidade
luminosa de 22 microEm2s
SILVEIRA D G et al76
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
Apoacutes o enraizamento in vitro 47 plantas sadias e 40
plantas infectadas com BSV foram transferidas para copos
plaacutesticos de 300 cm3 contendo o Plantmaxreg e vermiculita
(21) permanecendo 30 dias sob condiccedilotildees de 85 de umidade
relativa do ar e 60 de sombreamento em casa-de-vegetaccedilatildeo
Na fase de estabelecimento e em cada subcultivo
foram avaliadas as taxas de multiplicaccedilatildeo e a presenccedila dos
sintomas do BSV nos explantes provenientes das plantas
infectadas Na fase de aclimatizaccedilatildeo avaliaram-se a
presenccedila de sintomas nas plantas infectadas e as suas
respectivas alturas As medidas foram tomadas do coleto
ateacute a extremidade apical da folha mais alta
Os dados referentes ao nuacutemero de gemas obtidas
nos cinco subcultivos foram transformados em raiz
quadrada Foi estabelecida uma regressatildeo linear para cada
tratamento em funccedilatildeo dos subcultivos
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
A infecccedilatildeo pelo BSV natildeo afetou significativamente
o crescimento e a multiplicaccedilatildeo das plantas sendo que o
nuacutemero de gemas cresceu linearmente em funccedilatildeo dos
subcultivos em ambos os tratamentos Trabalhando com
plantas micropropagadas de bananeira sadias e infectadas
com o viacuterus do topo em leque (Banana bunchy top virus
BBTV) Thomas et al (1995) observaram que aquela virose
tambeacutem natildeo afetou a capacidade das plantas em crescer e
multiplicar Nas anaacutelises de regressatildeo realizadas para os
dois tratamentos (plantas sadias e plantas com BSV) o
acreacutescimo no nuacutemero de gemas em funccedilatildeo dos subcultivos
pode ser explicado por um modelo de regressatildeo linear
(Figura 1) As estimativas da regressatildeo linear para plantas
com BSV e plantas sadias foram altamente significativas e
os coeficientes de determinaccedilatildeo (R2) proacuteximos de 1 Foi
observado que as linhas determinadas a partir das
equaccedilotildees obtidas satildeo quase superpostas evidenciando
um comportamento semelhante entre os dois tratamentos
com relaccedilatildeo ao nuacutemero de gemas por subcultivo
Em todas as fases da micropropagaccedilatildeo os sintomas
do BSV foram visiacuteveis ocorrendo nas folhas das plantas
infectadas estriados cloroacuteticos com linhas descontiacutenuas e
FIGURA 1 ndash Curvas de regressatildeo linear obtidas a partir dosdados de gemas em cada subcultivo da cultivar de bananeiraCaipira sadias e infectadas com BSV Cruz das Almas (BA)Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical 2006Dados transformados por x
dispersas (Figura 2) Esses mesmos sintomas foram
observados em plantas de bananeira infectadas com BSV
mantidas a campo (RAMIREZ amp RIVERA 1994)
As contaminaccedilotildees que ocorreram nos materiais
in vitro foram tambeacutem avaliadas As maiores taxas de
contaminaccedilatildeo aconteceram na fase de estabelecimento
in vitro dos explantes obtendo-se niacuteveis de 21 e 32
para as plantas sadias e infectadas com BSV
respectivamente (Figura 3) Os elevados iacutendices de perdas
nesta etapa foram causados principalmente por
contaminaccedilatildeo bacteriana Segundo Oliveira amp Silva
(1997) as maiores contaminaccedilotildees bacterianas dos
explantes de bananeira ocorrem na fase de
estabelecimento in vitro do que nos demais subcultivos
Oliveira et al (2000) trabalhando com plantas livres de
viacuterus obtiveram taxas de contaminaccedilatildeo nesta fase entre
10 e 45 as quais estatildeo proacuteximas agraves obtidas neste
trabalho Durante a fase de multiplicaccedilatildeo as perdas por
contaminaccedilatildeo foram menores variando de 14 a 74
para as plantas sadias e de 0 a 121 no caso das plantas
infectadas com BSV sendo que a maior parte do material
foi contaminada por fungos natildeo-patogecircnicos Estes
valores foram bem inferiores agravequeles obtidos por Oliveira
et al (1999) (131) que utilizaram genoacutetipos diploacuteides
triploacuteides e tetraploacuteides de bananeiras sadias
Efeito do viacuterus das estrias da bananeira 77
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
FIGURA 2 ndash Planta de bananeira lsquoCaipirarsquo infectada com BSV na fase de enraizamento in vitro apresentando estriadoscloroacuteticos com linhas descontiacutenuas e dispersas nas folhas Cruz das Almas (BA) Embrapa Mandioca e FruticulturaTropical 2006
FIGURA 3 ndash Taxas por contaminaccedilatildeo () de explantes dacultivar Caipira na fase de estabelecimento (Est) e ao longode cinco subcultivos (Sub) Cruz das Almas (BA)Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical 2006
Durante o enraizamento in vitro natildeo houve
diferenccedila significativa na altura das plantas Poreacutem com
30 dias de aclimatizaccedilatildeo as plantas com BSV apresentaram
altura significativamente inferior agraves plantas sadias (Tabela 1)
Soares et al (2000) cultivaram mudas de bananeira lsquoCaipirarsquo
sadias e infectadas com BSV durante 141 dias em casa-de-
vegetaccedilatildeo e observaram que a infecccedilatildeo pelo viacuterus implicou
em significativa reduccedilatildeo no crescimento inicial afetando
o porte o desenvolvimento do sistema radicular e a aacuterea
fotossintetizante das plantas Verifica-se assim que a
infecccedilatildeo pelo BSV prejudicou o crescimento inicial das
plantas afetando a altura daquelas infectadas mesmo em
um periacuteodo relativamente curto indicando que em periacuteodos
mais longos o prejuiacutezo com relaccedilatildeo ao crescimento pode
ser ainda maior aconteceu no estudo desenvolvido por
Soares et al (2000)
Os sintomas do BSV permaneceram visiacuteveis em
todas as plantas infectadas durante e apoacutes a fase de
aclimatizaccedilatildeo Esse resultado foi diferente ao obtido por
Dahal et al (1999) quando micropropagaram hiacutebridos de
Musa pois os sintomas soacute foram visiacuteveis em plantas com
trecircs meses apoacutes o enraizamento Provavelmente essa
diferenccedila foi devido agraves condiccedilotildees onde os trabalhos foram
conduzidos casa-de-vegetaccedilatildeo e campo respectivamante
bem como aos genoacutetipos estudados Observaccedilotildees
semelhantes foram tambeacutem efetuadas por Gauhl amp Pasberg-
Gauhl (1995) e Ortiz (1996) ao estudarem a incidecircncia de
viroses em diferentes genoacutetipos de bananeira
SILVEIRA D G et al78
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
Alturas (cm) Plantas de bananeira lsquoCaipirarsquo
Enraizamento
in vitro 30 dias de
aclimatizaccedilatildeo
Sadias 637 a 2690 a BSV 728 a 2192 b
TABELA 1 ndash Meacutedias das alturas das plantas apoacutes oenraizamento in vitro e 30 dias de aclimatizaccedilatildeo em casa-de-vegetaccedilatildeo Cruz das Almas (BA) Embrapa Mandiocae Fruticultura Tropical 2006
Meacutedias seguidas pelas mesmas letras nas colunas natildeodiferem estatisticamente entre si pelo teste F ao niacutevel de 5 de significacircncia
CONCLUSOtildeES
A infecccedilatildeo pelo BSV natildeo influenciou a taxa de
multiplicaccedilatildeo dos explantes embora os sintomas do viacuterus
tenham sido visiacuteveis em todas as fases da micropropagaccedilatildeo
e durante os primeiros 30 dias da aclimatizaccedilatildeo das plantas
infectadas Todavia o crescimento das plantas infectadas
foi afetado pela presenccedila do viacuterus
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FOGACcedilA L A et al80
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
CARACTERIacuteSTICAS MORFOFISIOLOacuteGICAS DE BROTACcedilOtildeES DEAgapanthus umbellatus var minor MULTIPLICADAS EM
BIORREATOR DE IMERSAtildeO TEMPORAacuteRIA1
MORPHOLOGICAL AND PHYSIOLOGICAL CHARACTERISTICS Agapanthus umbellatus varminor OF SHOOTS PROPAGATED IN BIOREACTOR OF TEMPORARY IMMERSION
LUCIANA ALVES FOGACcedilA2 DENILSON DORTZBACH3 ANTONIO CARLOS ALVES4 ENIO LUIZ PEDROTTI5
1Parte da dissertaccedilatildeo de mestrado do primeiro autor junto ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Recursos Geneacuteticos vegetais CCA UFSC ndash Florianoacutepolis SC2Engenheira Agrocircnoma Mestre em Recursos Geneacuteticos Vegetais ndash CCAUFSC ndash UFSC Trindade ndash Florianoacutepolis SC ndash 88040-900 ndash lufogacapopcombr3Empresa Catarinense de Pesquisa Agropecuaacuteria ndash Rodovia Admar Gonzaga 1340 ndash Bairro Itacorubi Florianoacutepolis SC ndash denilsondtbolcombr4Engenheiro Agrocircnomo Professor Dr Departamento Fitotecnia ndash CCAUFSC ndash UFSC ndash alvesccaufscbr5Engenheiro Agrocircnomo Professor Dr Departamento Fitotecnia ndash CCAUFSC ndash UFSC ndashRodovia Admar Gonzaga 1346 ndash 88 040 900 ndash Florianoacutepolis- SC ndash pedrotticcaufscbr
RESUMOCom o presente trabalho objetivou-se estudar alguns
aspectos morfoloacutegicos e fisioloacutegicos de placircntulas de Agapanthusumbellatus LrsquoHeacuter var minor multiplicadas em biorreatores deimersatildeo temporaacuteria (BIT) Foram testadas quatro concentraccedilotildeesde sacarose no meio de cultura e duas intensidades luminosasem um total de oito tratamentos formando um fatorial 2 x 4 Odelineamento experimental utilizado foi inteiramentecasualizado Os resultados obtidos indicaram que as condiccedilotildeesambientais principalmente luz e concentraccedilatildeo de sacarose domeio de cultura influenciaram o desenvolvimento e o crescimentodas placircntulas quando multiplicadas Observou-se que a ausecircnciade sacarose mesmo no niacutevel mais elevado de intensidadeluminosa natildeo estimulou a fotossiacutentese das placircntulas Acombinaccedilatildeo de 30 gL-1 de sacarose e 70 mMm-2s-1 de luzproporcionou maior numero de folhas massa fresca e secaconcentraccedilatildeo de clorofila a b e total fatores estes que tecircmgrande influecircncia na fase de aclimatizaccedilatildeo
Termos para indexaccedilatildeo Plantas ornamentaismicropropagaccedilatildeo sacarose intensidade luminosa
ABSTRACTThe objective of the present work was to study
morphological and physiological characteristics of Agapanthusumbellatus LrsquoHeacuter var minor plantlets propagated in bioreactorof temporary immersion (BIT) Four sucrose concentrationsand two light intensities were analyzed totalizing eighttreatments The experimental design used was a completelyrandomized with a 2 x 4factorial The results indicated that theenvironment conditions mainly light and sucrose concentrationsof the culture medium influenced plantlets development andgrowth It was observed that the absence of sucrose even inthe highest level of light intensity had no stimuli on plantletphotosynthesis The combination of 30 g L-1 sucrose and 70mM m-2 s-1 light had promoted higher leaf number fresh anddry weight concentration of chlorophyll a b and total
parameters that present high influence during theacclimatizationrsquos phase
Index terms Ornamental plants micropropagation sucroselight intensity
INTRODUCcedilAtildeO
Agapanthus umbellatus var minor tambeacutem
conhecida como Agapantho ou Liacuterio do Nilo eacute uma
angiosperma da famiacutelia Amaryllidaceae pertencente agrave
ordem Liliales (BOTANY 2003) eacute uma espeacutecie ornamental
muito utilizada como flor de corte devido agrave sua durabilidade
No entanto o maior interesse econocircmico nesta espeacutecie
decorre do seu uso como forraccedilatildeo em jardins e praccedilas
(LORENZI amp SOUZA 1995)
Sua propagaccedilatildeo eacute tradicionalmente efetuada
atraveacutes da divisatildeo de touceiras No entanto esta teacutecnica
apresenta uma seacuterie de desvantagens visto que a taxa de
propagaccedilatildeo eacute baixa cerca de dez mudas por planta ao ano
aleacutem de possibilitar a dispersatildeo de pragas e doenccedilas que
poderatildeo ocorrer no viveiro de produccedilatildeo Sendo assim a
micropropagaccedilatildeo pode ser uma ferramenta muito
promissora para esta espeacutecie
O processo de micropropagaccedilatildeo induz a um grande
nuacutemero de mudanccedilas anatocircmicas morfoloacutegicas e
fisioloacutegicas que muitas vezes tem limitado o cultivo in vitro
de algumas espeacutecies (DESJARDINS 1993) A
(Recebido em 18 de julho de 2005 e aprovado em 25 de agosto de 2006)
Caracteriacutesticas morfofisioloacutegicas de brotaccedilotildees 81
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
heterogeneidade de respostas agraves placircntulas que ocorrem
na cultura de tecidos eacute promovida natildeo soacute por fatores
inerentes ao tecido vegetal (geneacuteticos e fisioloacutegicos) mas
tambeacutem por modificaccedilotildees do ambiente in vitro
As modificaccedilotildees do ambiente in vitro envolvem a
qualidade e intensidade de luz fotoperiacuteodo temperatura
umidade reguladores de crescimento exoacutegenos fonte de
carbono e estresse mecacircnico Estes satildeo determinantes na
morfogecircnese no crescimento e no desenvolvimento de
placircntulas in vitro (GEORGE 1996 KOZAI et al 1990
SALISBURY 1981) Aleacutem disso interferem no nuacutemero de
folhas teor de clorofila densidade estomaacutetica (LIAN et
al 2002 PREECE amp SUTTER 1991) na fotossiacutentese e na
fase de aclimatizaccedilatildeo (DESJARDINS et al 1995)
Um dos principais fatores que causam grande
influecircncia na fotossiacutentese de placircntulas cultivadas in vitro
eacute a intensidade luminosa (GALZY amp COMPAN 1992) A
quantidade e a qualidade da luz bem como o fotoperiacuteodo
podem afetar o crescimento e o desenvolvimento de
placircntulas in vivo (SMITH 1982) e placircntulas in vitro
(ECONOMOU amp READ 1987 VLAHOS et al 1992) Esta
influecircncia se deve ao grande impacto sobre o acuacutemulo de
pigmentos biossiacutentese de clorofila diferenciaccedilatildeo de
cloroplastos e anatomia da folha (DESJARDINS et al 1995)
Outro fator que vem sendo estudado e que pode
determinar um papel importante no controle da atividade
fotossinteacutetica de placircntulas in vitro eacute a utilizaccedilatildeo de
carboidratos exoacutegenos pois o crescimento da maioria das
culturas in vitro eacute sustentado pela sacarose ou outros
accediluacutecares adicionados ao meio de cultura (PREECE amp
SUTTER 1991) Estes podem ser utilizados pelas placircntulas
quando a taxa de fotossiacutentese natildeo permite assegurar um
balanccedilo positivo em carbono definindo assim uma nutriccedilatildeo
mixotroacutefica ou heterotroacutefica (GALZY amp COMPAN 1992)
Baseado na hipoacutetese de que a composiccedilatildeo do meio
de cultura e a intensidade luminosa influenciam a
morfologia e a fisiologia de placircntulas micropropagadas o
presente trabalho teve como objetivo estudar aspectos
morfoloacutegicos e fisioloacutegicos de placircntulas de Agapanthus
umbellatus LrsquoHeacuter var minor multiplicadas em biorreator de
imersatildeo temporaacuteria (BIT) Para tanto foi avaliado o
desenvolvimento e o crescimento desta espeacutecie durante a
fase de multiplicaccedilatildeo em funccedilatildeo da variaccedilatildeo de niacuteveis de
sacarose e intensidade luminosa
MATERIAIS E MEacuteTODOS
Este trabalho foi realizado no Laboratoacuterio de
Morfogecircnese e Bioquiacutemica Vegetal localizado no Centro
de Ciecircncias Agraacuterias da Universidade Federal de Santa
Catarina em Florianoacutepolis - SC
O trabalho consistiu de um ensaio onde foram
utilizadas brotaccedilotildees de Agapanthus umbellatus var minor
obtidas da terceira repicagem mantidas em meio geleificado
MS + 178 mM de BAP Apoacutes serem individualizadas e
padronizadas tendo o seu tamanho variando entre 25 e
30 cm de comprimento as brotaccedilotildees foram transferidas
para o BIT (ETIENNE amp BERTHOULY 2002) contendo 500
mL de meio liacutequido e sais de MS (MURASHIGE amp SKOOG
1962) em condiccedilotildees asseacutepticas suplementado com
concentraccedilatildeo de 89 mM de BAP O pH foi ajustado com
NAOH (1N) em 59 antes da autoclavagem (durante 15
minutos sob 121ordmC e 15 atm de pressatildeo) O delineamento
experimental utilizado no ensaio foi o inteiramente
casualizado Foram testados quatro concentraccedilotildees de
sacarose no meio de cultura (0 15 30 e 45) e duas
intensidades luminosas (70 e 140 mmolm-2s-1) providas
por lacircmpadas brancas fluorescentes (PHILIPS ndash TLT 40W)
em um total de oito tratamentos formando um fatorial 2 x 4
Cada tratamento foi composto por trecircs frascos (repeticcedilatildeo)
contendo 50 plantas cada um
Os frascos foram mantidos em sala de crescimento
com fotoperiacuteodo de 16 horas e temperatura meacutedia de 22ordmC
com variaccedilatildeo de plusmn 2ordmC por um periacuteodo de 60 dias
Apoacutes 60 dias de cultivo foram avaliadas as
seguintes caracteriacutesticas dos explantes nuacutemero e tamanho
das brotaccedilotildees (cm) nuacutemero de folhasbrotaccedilatildeo massa
fresca e seca (g) da parte aeacuterea e raiz utilizando-se amostras
de 25 placircntulas por repeticcedilatildeo escolhidas ao acaso
FOGACcedilA L A et al82
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
A determinaccedilatildeo do conteuacutedo de clorofila ldquoa b e
totalrdquo consistiu na coleta de amostras de 100 mg de massa
fresca As amostras foram incubadas com 70 mL de DMSO
(dimetilsulfoacutexido) sem maceraccedilatildeo por 30 minutos a 65degC
Apoacutes filtragem seu volume foi completado para 10 mL com
DMSO Desses extratos 2 mL foram analisados em
espectrofotocircmetro (UV - visiacutevel SHIMADZU) para os
valores de absorbacircncia entre 645 e 663 nm Os valores obtidos
foram submetidos agrave foacutermula de Arnon (1949) conforme
descrito por Hiscox amp Israelstam (1979) Chl a = (00127 X
D663) ndash (000269 X D645) e Chl b = (00229 X D645) ndash (000468
X D663) A clorofila total foi a soma da ldquoChl a e Chl brdquo de
cada tratamento foram utilizadas 25 amostras
A determinaccedilatildeo da densidade estomaacutetica (nuacutemero
de estocircmatos por mm2 de superfiacutecie foliar) foi realizada nas
amostras das quais extraiu-se a clorofila Apoacutes a extraccedilatildeo
da clorofila as folhas foram cortadas e somente o terccedilo
meacutedio das folhas foi usado para anaacutelise Em seguida foram
fixadas sobre lacircminas histoloacutegicas com a ajuda de uma
lamiacutenula e de algumas gotas de aacutegua esterilizada A
observaccedilatildeo foi realizada na epiderme das faces adaxial e
abaxial da folha com o auxiacutelio de um microscoacutepio oacutetico
(OLYMPUS CH30 ocular WH10 X 22) com um aumento
de 400 vezes e com um campo conhecido de 024 mm2 Para
cada lacircmina foram feitas leituras em cinco campos
Os dados obtidos foram avaliados por meio da
anaacutelise de variacircncia (ANOVA) seguindo o modelo para
experimento bifatorial inteiramente casualizado O nuacutemero
de brotaccedilotildees o nuacutemero de folhas e a densidade estomaacutetica
foram transformados em Oumlx+1 para a anaacutelise As meacutedias
dos tratamentos foram separadas pelo teste de comparaccedilatildeo
de meacutedias de Duncan a 5 de probabilidade conforme
recomendaccedilotildees de Stell amp Torrie (1980)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
A concentraccedilatildeo de sacarose no meio de cultura
apresentou uma accedilatildeo positiva e interativa com a intensidade
luminosa na proliferaccedilatildeo de brotaccedilotildees (Tabela 1) visto
que a ausecircncia de sacarose no meio de cultura resultou
em insucesso no crescimento das placircntulas de Agapantho
principalmente nos primeiros dias Apoacutes o
desenvolvimento inicial (aproximadamente 10 dias) foi
constatada estagnaccedilatildeo no crescimento das placircntulas
seguido de atrofia e necrose das brotaccedilotildees Apoacutes 20 dias
de cultivo ocorreu a morte das brotaccedilotildees Isso mostrou
que folhas de placircntulas de Agapantho natildeo fixaram
carbono suficiente para sustentar seu crescimento na
ausecircncia de sacarose Portanto para a espeacutecie em estudo
foi necessaacuteria a adiccedilatildeo de uma fonte de carbono no meio
de cultura para o seu desenvolvimento in vitro Segundo
Capellades et al (1991) e Desjardins et al (1995) a total
remoccedilatildeo de carboidratos no meio de cultura para algumas
espeacutecies frequumlentemente torna-se prejudicial para o
crescimento das placircntulas o que pode prejudicar o
processo de micropropagaccedilatildeo e aclimatizaccedilatildeo pois
durante o cultivo in vitro as placircntulas perdem
parcialmente o autotrofismo e consequumlentemente
necessitam de uma fonte de carbono
O maior nuacutemero de brotaccedilotildees foi obtido com a
intensidade luminosa de 70 mmolm-2s-1 e a concentraccedilatildeo
de 45 gL-1 de sacarose (Tabela 1) Enquanto que com a
intensidade luminosa de 140 mmolm-2s-1 o maior nuacutemero
de brotaccedilotildees foi obtido com a concentraccedilatildeo de 30 gL-1 de
TABELA 1 ndash Nuacutemero de brotaccedilotildeesexplante de placircntulasde Agapanthus umbellatus var minor multiplicadasbiorreator de imersatildeo temporaacuteria suplementado comdiferentes concentraccedilotildees de sacarose e intensidadesluminosas no periacuteodo de 60 dias
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1)
Concentraccedilatildeo Sacarose (gL-1) 70 1 140 1
0 000 dA 00 dA 15 370 cB 544 cA 30 553 bB 651 aA 45 745 aA 585 bB
CV 67
Meacutedias seguidas pela mesma letra minuacutescula nas colunase maiuacutescula nas linhas natildeo diferem significativamente peloteste de Duncan a 5 de probabilidade1 Observaccedilotildees transformadas segundo ( x+1)
Caracteriacutesticas morfofisioloacutegicas de brotaccedilotildees 83
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
sacarose Isso demonstrou um alto grau de mixotrofia dessa
espeacutecie
O tamanho das brotaccedilotildees e o nuacutemero de folhas
(Tabela 2) foram afetados apenas pelo efeito simples dos
fatores natildeo havendo interaccedilatildeo entre sacarose e luz O
maior tamanho das brotaccedilotildees foi alcanccedilada quando os
explantes foram submetidos a 15 gL-1 de sacarose e 140
mmolm-2s-1 de intensidade luminosa (Tabela 2) Verificou-
se tambeacutem que o aumento da concentraccedilatildeo desse
carboidrato no meio de cultura natildeo favoreceu o
alongamento das brotaccedilotildees Provavelmente o aumento
da intensidade luminosa favoreceu a taxa de fotossiacutentese
das placircntulas permitindo um balanccedilo positivo de carbono
afetando o crescimento e o desenvolvimento de placircntulas
in vitro (LEE et al 1995)
Por outro lado o maior nuacutemero de folhas de
Agapantho foi obtido na concentraccedilatildeo de 30 gL-1 de
sacarose (Tabela 2) A intensidade luminosa natildeo teve
influecircncia sobre essa variaacutevel Contrastando com os dados
obtidos no presente trabalho Konow amp Wang (2001)
determinaram que a intensidade luminosa de 40 mmolm-
2s-1 promoveu um aumento no nuacutemero de folhas de
Phalaenopsis enquanto placircntulas que se desenvolveram
em ambiente com intensidade de 10 e 80 molm-2s-1
apresentaram um menor nuacutemero de folhas Segundo os
autores o aumento no nuacutemero de folhas pode indicar que
TABELA 2 ndash Tamanho de brotaccedilotildees e nuacutemero de folhasbrotaccedilatildeo de placircntulas de Agapanthus umbellatus var minormultiplicadas em biorreator de imersatildeo temporaacuteria suplementado com diferentes concentraccedilotildees de sacarose eintensidades luminosas no periacuteodo de 60 dias
Meacutedias seguidas pela mesma letra nas linhas e colunas natildeo diferem significativamente pelo teste de Duncan a 5 deprobabilidade
houve estiacutemulo da fotossiacutentese in vitro Outro efeito
observado em placircntulas de Agapantho neste trabalho foi
a presenccedila de folhas mais claras e vitrificadas (folhas com
aspecto viacutetreo pouco desenvolvidas aparecircncia suculenta
e translucente) na grande maioria das placircntulas
multiplicadas em meio suplementado com 15 gL-1 de
sacarose e intensidade luminosa de 70 mmolm-2s-1 Estes
resultados podem indicar que o aparato fotossinteacutetico natildeo
tenha se desenvolvido adequadamente (CAPPELADES et
al 1991 DESJARDINS et al 1995) afetando a acumulaccedilatildeo
de massa fresca Possivelmente a presenccedila de folhas
vitrificadas foi influenciada pelo uso de meio liacutequido pois
de acordo com George (1996) e Etienne amp Berthouly (2002)
o meio liacutequido favorece a produccedilatildeo de folhas vitrificadas
quando comparado com meio geleificado No entanto
observou-se que para os demais tratamentos em
concentraccedilotildees maiores de sacarose (30 e 45 gL-1) a
presenccedila de brotaccedilotildees vitrificadas foi rara ou nenhuma
Neste sentido o desenvolvimento de brotaccedilotildees com esta
caracteriacutestica pode estar relacionado agrave concentraccedilatildeo de
sacarose no meio e agrave diferenccedila osmoacutetica entre as brotaccedilotildees
e o meio de cultura (DEBERGH et al 1981) Este resultado
tambeacutem foi obtido na multiplicaccedilatildeo de rosas na qual onde
a reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo de sacarose para 10 gL-1 na
fase de multiplicaccedilatildeo promoveu um aumento significativo
na presenccedila de plantas vitrificadas e quando submetidas
Tamanho de brotaccedilotildees (cm)
Nuacutemero de folhasbrotaccedilatildeo
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1) Concentraccedilatildeo Sacarose
(gL-1) 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia
0 000 000 000 d 000 000 000 d 15 275 396 335 a 407 408 408 b 30 295 295 295 b 414 404 409 a 45 245 220 233 c 400 408 404 c
Meacutedia 204 b 228 a 276 a 275 a
CV 2595 467
FOGACcedilA L A et al84
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
a concentraccedilotildees de 30 e 40 gL-1 a presenccedila de placircntulas
vitrificadas foi rara (LANGFORD amp WAINWRIGHT 1987)
Outro fator que possivelmente pode ter
influenciado a presenccedila de placircntulas vitrificadas in vitro
foi a baixa intensidade luminosa (GEORGE 1996) pois
placircntulas de Agapantho multiplicadas sob intensidade de
140 mmolm-2s-1 e 15 gL-1 de sacarose natildeo apresentaram
caracteriacutestica de vitrificaccedilatildeo Estes dados indicaram que o
aumento da intensidade luminosa evitou a presenccedila de
plantas vitrificadas aleacutem de proporcionar um incremento e
estiacutemulo na atividade fotossinteacutetica (GEORGE 1996)
A produccedilatildeo de massa fresca e seca das brotaccedilotildees
foram influenciadas pela interaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo
de sacarose e a intensidade luminosa (Tabela 3) Placircntulas
de Agapantho multiplicadas sob intensidade de 70
mmolm-2s-1 apresentaram a maior produccedilatildeo de massa
fresca e seca dentro das concentraccedilotildees de 30 gL-1 Nas
concentraccedilotildees de 15 e 45 gL-1 os resultados obtidos
foram inferiores (Tabela 3) Por outro lado quando se
aumentou a intensidade para 140 mmolm-2s-1 a melhor
produccedilatildeo de massa fresca e seca ocorreu dentro da
concentraccedilatildeo de 15 gL-1 de sacarose (Tabela 3) Verificou-
se assim que o aumento da concentraccedilatildeo de sacarose no
meio de cultura proporcionou efeitos negativos na
produccedilatildeo de massa fresca e seca quando as placircntulas
foram submetidas agrave intensidade luminosa mais elevada
TABELA 3 ndash Massa fresca e seca de brotaccedilotildees de Agapanthus umbellatus var minor multiplicadas em biorreator de imersatildeotemporaacuteria suplementado com diferentes concentraccedilotildees de sacarose e intensidades luminosas no periacuteodo de 60 dias
Tais resultados corroboram as afirmaccedilotildees feitas referentes
agrave variaacutevel nuacutemero de brotaccedilotildees em que demonstrou-se
que foi possiacutevel reduzir a concentraccedilatildeo de sacarose em
maiores intensidade luminosas confirmando o grau de
mixotrofia
Ao analisar a concentraccedilatildeo de clorofila em
folhas de Agapantho verificou-se que natildeo houve
interaccedilatildeo significativa entre as concentraccedilotildees de
sacarose e intensidade luminosa Os teores de clorofila
a b e total (Tabela 4) foram maiores nas concentraccedilotildees
de 30 gL-1 sacarose Serret et al (1995) mostraram que
o aumento da concentraccedilatildeo de accediluacutecares (30 gL-1) no
meio de cultura promoveu maior produccedilatildeo de clorofila
impedindo a fotoinibiccedilatildeo realizaccedilatildeo de fotossiacutentese e
aumento do ganho de massa em plantas de Gardecircnia
cultivadas in vitro
Em relaccedilatildeo ao efeito da intensidade luminosa natildeo
houve efeito deste fator sobre essas variaacuteveis ainda que
Economou amp Read (1987) Galzy amp Compan (1992) Vlahos
et al (1992) George (1996) tenham observado que a
intensidade luminosa eacute um fator que estaacute estreitamente
relacionado agrave siacutentese de clorofila No entanto no presente
trabalho sugere-se a menor intensidade 70 mmolm-2s-1 com
o objetivo de que natildeo ocorra um aumento na velocidade
de decomposiccedilatildeo da clorofila com intensidade mais
elevada
Meacutedias seguidas pela mesma letra minuacutescula nas colunas e maiuacutescula nas linhas natildeo diferem significativamente peloteste de Duncan a 5 de probabilidade
Massa fresca (g)
Massa seca (g)
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1) Concentraccedilatildeo
Sacarose (gL-1) 70 140 70 140
0 000 dA 00 dA 000 dA 000 dA 15 067 cB 106 aA 0069 cB 0109 aA 30 082 aA 076 bB 0085 aA 0081 bB 45 075 bA 049 cB 0078 bA 0051 cB
CV 2873 2655
Caracteriacutesticas morfofisioloacutegicas de brotaccedilotildees 85
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
TABELA 4 ndash Concentraccedilotildees de clorofila a b e total (mgg massa fresca) em folhas de Agapanthus umbellatus varminor multiplicadas em biorreator de imersatildeo temporaacuteria por um periacuteodo de 60 dias submetidas a 4 concentraccedilotildees desacarose e dois niacuteveis de intensidade luminosa
Clrofila a (mgg massa fresca)
Clrofila b (mgg massa fresca)
Clrofila total (mgg massa fresca)
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1) Concentraccedilatildeo
Sacarose (gL-1) 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia
0 000 000 000 d 000 000 000 d 000 000 000 d 15 211 248 295 c 089 076 083 c 301 325 313 c 30 502 509 505 a 200 211 205 a 703 721 710 a 45 486 420 453 b 195 179 187 b 682 633 658 b
Meacutedia 299 a 294 a 121 a 116 a 421 a 420 a
CV 740 820 850
Meacutedias seguidas pela mesma letra nas linhas e colunas natildeo diferem significativamente pelo teste de Duncan a 5 deprobabilidade
Em relaccedilatildeo aos estocircmatos atraveacutes de
observaccedilatildeo microscoacutepica foi possiacutevel verificar que o
Agapantho possui folhas com caracteriacutest ica
anfiestomaacutetica caracterizada pela presenccedila de
estocircmatos em ambas as faces (face abaxial e adaxial)
Esta caracteriacutestica tem sido considerada como um
mecanismo adaptativo para maximizar a condutacircncia
de CO2 quando luz e aacutegua satildeo fatores limitantes
(KRAMER 1969)
Atraveacutes da anaacutelise estatiacutestica para densidade
estomaacutetica da face adaxial verificou-se que natildeo houve
interaccedilatildeo entre os fatores sacarose e intensidade
luminosa havendo portanto efeito isolado dos fatores A
maior densidade estomaacutetica da face abaxial foi obtida na
concentraccedilatildeo de 45 gL-1 (Tabela 5) Natildeo houve efeito da
intensidade luminosa para essa variaacutevel Por outro lado
a maior densidade estomaacutetica na face adaxial foi obtida
na concentraccedilatildeo de 45 gL-1 de sacarose e 140 mmolm-2s-1
de intensidade luminosa (Tabela 5) verificando a
influecircncia positiva da intensidade luminosa para essa
variaacutevel
As folhas de placircntulas multiplicadas na
concentraccedilatildeo de 15 gL-1 de sacarose apresentaram menor
densidade estomaacutetica em ambas as faces (Tabela 5) com
formato anormal largos e salientes caracteriacutesticas estas
natildeo desejaacuteveis pois segundo Preece amp Sutter (1991)
uma alteraccedilatildeo a niacutevel estrutural eou morfoloacutegico podem
impedir o funcionamento do aparelho estomaacutetico e grande
parte dos estocircmatos assim formados satildeo incapazes de se
fechar
Possivelmente este resultado se deve agraves
caracteriacutesticas de vitrificaccedilatildeo que as folhas do
tratamento 15 gL-1 de sacarose e 70 mmol m-2s-1 de
intensidade luminosa apresentaram (BLANKE amp
BELCHERL 1989) e a falta de energia armazenada no
explante com a falta de carbono que eacute proveniente da
sacarose adicionada ao meio de cultura (DESJARDINS
et al 1995) Estes resultados corroboram os obtidos
por Vintildea et al (2001) que demonstraram que folhas
vitrificadas de abacateiro apresentaram estocircmatos
grandes com saliecircncia ceacutelulas subsidiaacuterias assimeacutetricas
e deformadas e seu ostiacuteolo completamente aberto Tal
anomalia pode ser atribuiacuteda agrave perda da elasticidade das
paredes das ceacutelulas-guarda o que impediria o seu
movimento de abertura e fechamento que
consequumlentemente afeta o desenvolvimento das
placircntulas ao serem transferidas para condiccedilotildees ex vitro
atraveacutes da excessiva perda de aacutegua
FOGACcedilA L A et al86
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
TABELA 5 ndash Densidade estocircmatica (estocircmatosmm2) da face adaxial e abaxial de folhas de Agapanthus umbellatus varminor multiplicadas em biorreator de imersatildeo temporaacuteria suplementado com diferentes concentraccedilotildees de sacarose eintensidade luminosa por um periacuteodo de 60 dias
Densidade estomaacutetica (estocircmatosmm2) Epiderme da face Adaxial Epiderme da face Abaxial
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1)
Concentraccedilatildeo Sacarose(gL1) 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia
0 000 000 000 d 000 000 000 d 15 2587 3026 2802 c 3408 4752 4053 c 30 6524 5628 6064 b 9977 8584 9268 b 45 5412 7016 6188 a 8809 10807 9783 a
Meacutedia 2856 b 3089 a 4256 a 4705 a CV 1474 1206
Meacutedias seguidas pela mesma letra nas linhas e colunas natildeo diferem significativamente pelo teste de Duncan a 5 deprobabilidade
CONCLUSAtildeO
Condiccedilotildees ambientais tais como intensidade
luminosa e concentraccedilatildeo de sacarose adicionada ao meio
de cultura influenciaram no desenvolvimento e
crescimento das placircntulas de Agapanthus umbellatus
var minor quando multiplicadas em meio liacutequido no BIT
Placircntulas de Agapantho foram incapazes de se
desenvolver em meio sem sacarose sendo portanto
necessaacuteria a adiccedilatildeo de uma fonte de carbono visto que a
espeacutecie em estudo apresentou uma taxa de fotossiacutentese
incapaz de assegurar um balanccedilo positivo em carbono
Houve uma grande variaccedilatildeo nas respostas obtidas
no entanto fazendo uma avaliaccedilatildeo em conjunto das
variaacuteveis recomenda-se 30 gL-1 de sacarose e intensidade
luminosa de 70 mmolm-2s-1 No entanto deve-se ressaltar
que estudos mais aprofundados devem ser conduzidos
para verificar o efeito destas combinaccedilotildees sobre o
desempenho de placircntulas durante a fase de aclimatizaccedilatildeo
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Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
CAPACIDADE DE REGENERACcedilAtildeO IN VITRO DE TOMATEIROCULTIVAR SANTA CLARA
IN VITRO REGENERATION CAPACITY OF TOMATOPLANT CULTIVAR SANTA CLARA
GLAUCIA DE FATIMA MOREIRA VIEIRA E SOUZA1 JOSEacute MAGNO QUEIROZ LUZ2 ALCIONE SILVA ARRUDA3DENISE GARCIA SANTANA2 MARIANA DE SOUZA E SILVA DA COSTA TEIXEIRA4
LUCIANA LONDE5 ADELAIDE SIQUEIRA SILVA6 ELISAcircNGELA RODRIGUES FIGUEIRA7
1Mestranda em Fitotecnia ndash UFU ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash gfmvsyahoocombr2Professor Dr Instituto de Ciecircncias Agraacuterias ndash UFUICIAG ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash jmagnoumuaramaufubr3Dra em Geneacutetica e Bioquiacutemica Professora contratada da UEG ndash Unidade Universitaacuteria de Ipameri ndash Rodovia GO 330 Km 24 ndash Anel Viaacuterio SN ndash 75780-000 ndash Ipameri GO ndash asarrudahotmailcom4Engenheira Agrocircnoma ndash UFU ndash Conab Sede - SGAS 901 Bloco ldquoArdquo Lote 69 - Asa Sul ndash 70390-010 ndash Brasiacutelia DF ndash marisouza81yahoocombr5Dra em Geneacutetica e Bioquiacutemica ndash IGBUFU ndash Av Paraacute 1720 ndash Campus Umuarama ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash llondebolcombr6Mestranda em AgronomiaFitotecnia ndash UFUICIAG ndash Bolsista FAPEMIG ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash adelaidebioyahoocombr7Mestre em AgronomiaFitotecnia ndash UFUICIAG ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash Elis_figueirayahoocombr
RESUMOA cultivar de tomateiro Santa Clara (Lycopersicon
esculentum Mill) foi avaliada quanto ao seu potencial deregeneraccedilatildeo in vitro a partir de trecircs tipos de explantes e trecircsmeios de cultura seguidos de trecircs repicagens Os explantes foramcotileacutedone decapitado cotileacutedone fendido e cotileacutedone aparadonas extremidades Os meios de cultura foram MI macro emicronutrientes do MS vitaminas B5 de Gamborg et al (1968)suplementado com 30 gL de sacarose e de 8 gL de aacutegar pH 58MII meio MI suplementado com 1 mgL de BAP e 30 gL deglicose MIII meio MI suplementado com 25 mgL de BAP e02 mgL de AIA Para as repicagens foi utilizado o meio MIsuplementado com 05 mgL 08 mgL e 10 mgL de BAP paraa primeira segunda e terceira repicagens respectivamente Noenraizamento foi usado o meio MI suplementado com 05 mgL de AIA e as placircntulas enraizadas foram transferidas parasubstrato comercial Plantimax esterilizado e aclimatadas emlaboratoacuterio A maior induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo tanto de calosquanto de brotos foi observada nos meacutetodos cotileacutedone fendidoe cotileacutedone aparado quando colocados no meio MIII no entantoa induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo foi mais raacutepida quando usado cotileacutedonedecapitado indicando um alto potencial de organogecircneseespontacircnea sendo que o meio MI foi o melhor Os resultadosobtidos com as diferentes concentraccedilotildees de BAP nos trecircs ciclosde repicagem natildeo diferiram entre si e 82 das plantas enraizadasaclimataram-se com sucesso
Termos para indexaccedilatildeo Lycopersicon esculentummelhoramento do tomateiro cultura de tecidos
ABSTRACTThe tomato plant cultivar lsquoSanta Clararsquo (Lycopersicon
esculentum Mill) was evaluated as for its in vitro potential ofregeneration using three types of explants and three culture media
following three pricking-outs The explants were as followsdecapitated cotyledon split cotyledon and rim-trimmedcotyledon The culture media were MI MS macro andmicronutrients vitamins B5 of Gamborg et al (1968)supplemented with 30gL sucrose and 8gL agar pH 58 MIImedium MI supplemented with 1 mgL BAP and 30 gL glucoseMIII medium MI supplemented with 25 mgL BAP and 02mgL IAA For the pricking-outs the media MI wassupplemented with 05 mgL 08 mgL and 10 mgL BAP forthe first second and third pricking out respectively As forrooting the MI medium was supplemented with 05 mgL IAAand the rooted seedlings were transplanted to the sterilizedcommercial substrate Plantimax and then acclimatized inlaboratory Higher callus induction and sprout regeneration wasobserved for the methods of split and rim-trimmed cotyledonplaced into medium MIII Nevertheless the induction forregeneration was much faster when the decapitated cotyledonmethod was used indicating a high potential of spontaneousorganogenesis in which the media MI was the best The resultsobtained with the different concentrations of BAP in the threecycles of pricking-out did not differ among themselves and 82of the rooted plants were acclimatized successfully
Index terms Lycopersicon esculentum tomato breeding tissueculture
INTRODUCcedilAtildeO
O tomate pertence ao gecircnero Lycopersicon e a
espeacutecie cultivada cosmopolita eacute botanicamente
denominada de Lycopersicon esculentum (FILGUEIRA
2000) As cultivares atualmente plantadas podem ser
(Recebido em 03 de outubro de 2003 e aprovado em 04 de setembro de 2006)
Capacidade de regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro 89
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
reunidas em cinco grupos Santa Cruz Salada Cereja
Italiano Agroindustrial No presente trabalho foi utilizada
a cultivar Santa Clara do grupo Santa Cruz pois ela continua
sendo a cultivar mais plantada no Brasil
A tomaticultura estaacute associada a seacuterios problemas
fitossanitaacuterios sobretudo viroses aleacutem do ataque de
fungos bacteacuterias e insetos praga Cria-se com isto a
necessidade de se pesquisar novas alternativas ou
obtenccedilatildeo de novos genoacutetipos com resistecircncia muacuteltipla a
doenccedilas e pragas entre essas os estudos sobre
regeneraccedilatildeo e transformaccedilatildeo geneacutetica (FAacuteRI et al 2000)
A engenharia geneacutetica abriu uma nova perspectiva
para o melhoramento geneacutetico do tomateiro a partir do
final da deacutecada de 80 (WIJBRANDI amp BOTH 1993)
visando aumentar a produtividade e melhorar a qualidade
por meio da obtenccedilatildeo de resistecircncia a estresses bioacuteticos e
abioacuteticos A cultura de tecidos destaca-se durante o
processo de realizaccedilatildeo das teacutecnicas de transformaccedilatildeo
geneacutetica pois eacute necessaacuterio induzir gemas vegetativas e
em seguida regenerar brotos alongados e plantas
completas a partir de ceacutelulas ou tecidos geneticamente
modificados
Para a otimizaccedilatildeo de protocolos para o tomateiro
alguns fatores que afetam a eficiecircncia de transformaccedilatildeo
tecircm sido examinados dentre eles o tamanho do explante e
o tipo de explante hipocoacutetilo ou cotileacutedone (FRARY amp
EARLE 1996)
No Brasil haacute poucos trabalhos na aacuterea de
regeneraccedilatildeo in vitro e de transformaccedilatildeo geneacutetica de
cultivares de tomateiro e pouco se conhece sobre a
capacidade de regeneraccedilatildeo das principais cultivares
brasileiras (FAacuteRI et al 2000) Alguns pesquisadores como
Faria amp Illg (1993) analisaram a regeneraccedilatildeo in vitro de
algumas espeacutecies e cultivares de tomateiro observando
uma baixa capacidade morfogecircnica das cultivares se
comparadas com a espeacutecie selvagem Lycopersicon
pimpinellifolium (L) P Miller
Com este trabalho objetivou-se teve como objetivo
avaliar o potencial de regeneraccedilatildeo in vitro da cultivar Santa
Clara do grupo Santa Cruz a partir de diferentes tipos de
explantes e meios de cultura criando e otimizando
protocolos para sua regeneraccedilatildeo in vitro
MATERIAL E MEacuteTODOS
No Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos Vegetais do
Instituto de Geneacutetica e Bioquiacutemica da Universidade Federal
de Uberlacircndia foi avaliada a capacidade de regeneraccedilatildeo
in vitro do tomateiro cultivar Santa Clara usando trecircs
tipos de explantes e trecircs meios de cultura seguido de trecircs
repicagens O experimento foi realizado em delineamento
em blocos casualizados em esquema fatorial (3x3) com trecircs
repeticcedilotildees As plantas regeneradas foram enraizadas e
aclimatadas em laboratoacuterio
Sementes comerciais da cultivar Santa Clara apoacutes
serem desinfestadas por um minuto em aacutelcool etiacutelico a 96
e em hipoclorito de soacutedio comercial a 20 (vv) com duas
gotas de detergente comercial durante 25 minutos foram
enxaguumladas 5 vezes em aacutegua bidestilada esterilizada e
inoculadas em meio MS 100 (MURASHIGE amp SKOOG
1962) solidificado com 7 g L-1 de aacutegarndashaacutegar por sem
reguladores de crescimento O meio foi distribuiacutedo em
frascos de vidro esteacutereis utilizados para cultura de tecidos
com 30 mL de meio MS As culturas foram mantidas em
sala de crescimento com temperatura de 25+2 ordmC
fotoperiacuteodo de 16 horas e luminosidade de 50 mmol m-2s-
1 As placircntulas obtidas aos 14 15 e 20 dias apoacutes a semeadura
foram usadas como fonte de explantes para os blocos 1 2
e 3 respectivamente Os explantes foram inoculados de
acordo com os meacutetodos descritos a seguir em placas de
Petri devidamente esterilizadas e autoclavadas contendo
30 mL de meio de cultura com 16 unidades por tipo de
explante por meio de cultura utilizado Cada 16 explantes
constituiu uma parcela do experimento sendo composta
por duas placas de Petri cada uma com 8 explantes
Os tipos de explantes foram os seguintes
A - que consistiu na decapitaccedilatildeo de placircntulas onde
essa decapitaccedilatildeo ocorreu diretamente abaixo do noacute do
cotileacutedone ficando o hipocoacutetilo com as radiacuteculas
SOUZA G de F M V e et al90
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
B - meacutetodo de cotileacutedones fendidos os cotileacutedones
foram fendidos ao longo da nervura central da extremidade
ateacute sua metade de acordo com o protocolo de Faacuteri et al
(2000)
C - cotileacutedones foram aparados e seguiu-se o
protocolo descrito por Redenbaugh et al (1992) Os
cotileacutedones aparados nas extremidades distal e proximal
(aacutepice e peciacuteolo) foram inoculados com a face abaxial em
contato com o meio
Foram realizadas trecircs repicagens para alongar os
brotos Cerca de 30 dias apoacutes a inoculaccedilatildeo dos explantes
foi realizada a primeira repicagem Os intervalos entre as
repicagens foram em torno de 5 semanas
Os tratamentos consistiram na inoculaccedilatildeo dos trecircs
tipos de explantes descritos nos trecircs meios de cultura
abaixo com trecircs repeticcedilotildees por tratamento
Meio MI macro e micronutrientes de Murashige amp
Skoog (1962) e vitaminas B5 de Gamborg et al (1968)
suplementado com 30 gL de sacarose e de 8 gL de aacutegar-
aacutegar pH 58 meio MII meio de cultura MI suplementado
com 1 mgL de zeatina e 30 gL de glicose conforme
McCormick (1991) meio MIII meio de cultura MI
suplementado com 25 mgL de BAP e 02 mgL de AIA
segundo Rhim et al (1995)
Para as repicagens foi utilizado o meio MI
suplementado com 05 mgL 08 mgL e 10 mgL de BAP
para a primeira segunda e terceira repicagens
respectivamente
Para enraizamento foi usado o meio MI
suplementado com 05 mgL de AIA As placircntulas
enraizadas foram transferidas para substrato comercial
Plantimax esterilizado e aclimatadas em laboratoacuterio
Os brotos com 2 cm de comprimento foram
transferidos para o meio de enraizamento citado e
permaneciam nesse meio durante 15 dias Apoacutes esse periacuteodo
os brotos eram transplantados para substrato comercial
Plantimax autoclavado irrigados com aacutegua uma a duas
vezes por dia ateacute a aclimataccedilatildeo A aclimataccedilatildeo ocorreu em
torno de 20 dias em condiccedilotildees de laboratoacuterio
Avaliou-se a induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo o
alongamento de brotos e o enraizamento e aclimataccedilatildeo
das plantas regeneradas
Os dados de contagem foram transformados para
50x As anaacutelises de normalidade e homogeneidade
foram realizadas pelo software Prophet Os dados obtidos
foram submetidos agrave anaacutelise de variacircncia e as meacutedias
comparadas pelo teste de Tukey ao niacutevel de 5 de
probabilidade pelo software SANEST (ZONTA amp
MACHADO 1989)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Para cotileacutedone decapitado ocorreu um iniacutecio de
formaccedilatildeo de calosidade por volta de 10 dias apoacutes inoculaccedilatildeo
e o surgimento de brotos ocorreu cerca de 12 dias depois da
inoculaccedilatildeo sem a formaccedilatildeo de calos propriamente ditos A
induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo foi mais raacutepida quando usado esse
tipo de explante indicando um alto potencial de
organogecircnese espontacircnea sendo que o meio MI foi o melhor
para a induccedilatildeo e nuacutemero total de brotos (Tabela 1)
No cotileacutedone fendido o iniacutecio de formaccedilatildeo de
calosidade aconteceu com aproximadamente 10 dias apoacutes
inoculaccedilatildeo Por volta de 18 dias depois da inoculaccedilatildeo
iniciou-se o surgimento de brotos e jaacute existiam calos
formados Para esse tipo de explante nos meios MI e MII
ocorreu apenas a formaccedilatildeo de calos enquanto no meio
MIII ocorreu a formaccedilatildeo de calos e calos com brotos sendo
alto o nuacutemero total de brotos (Tabela 1) Supotildee-se que a
maior superfiacutecie de corte tenha influecircncia significativa
sobre esse fenocircmeno onde a maior superfiacutecie de corte do
cotileacutedone resulta em maior capacidade de regeneraccedilatildeo
(FAacuteRI et al 1995b)
No cotileacutedone aparado com cerca de 10 dias apoacutes
inoculaccedilatildeo ocorreu o iniacutecio de formaccedilatildeo de calos e 20 dias
depois da inoculaccedilatildeo ocorreu o surgimento de brotos e jaacute
existiam calos formados Para esse tipo de explante nos
meios MI MII e MIII ocorreu a formaccedilatildeo de calos no
entanto apenas no meio MIII ocorreu a formaccedilatildeo de calos
com brotos (Tabela 1)
Capacidade de regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro 91
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
TABELA 1 ndash Frequumlecircncia de induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo in vitro da cultivar Santa Clara do grupo Santa Cruz UberlacircndiaUFU 2001
Dados seguidos de mesma letra nas colunas (abc) e nas linhas (AB) natildeo diferem entre si a 5 de probabilidade peloteste de TukeyA diferenccedila entre o nordm de explantes de um meacutetodo para outro eacute devida a parcelas (ou parte delas) perdidas
Nos trecircs ciclos de repicagens a capacidade de
alongamento dos brotos foi igual indicando que as
concentraccedilotildees de BAP natildeo diferiram estatisticamente entre
si dentro de cada tipo de explante Em relaccedilatildeo ao nuacutemero
de brotos alongados na primeira e terceira repicagens o
cotileacutedone decapitado apresentou maior nuacutemero jaacute na
segunda repicagem natildeo houve diferenccedila entre os tipos de
explantes (Tabela 2)
As plantas apoacutes serem enraizadas foram
transferidas para aclimataccedilatildeo obtendo-se 82 de plantas
aclimatadas Cerca de 20 dias apoacutes transplantio para o
substrato as plantas jaacute estavam aclimatadas
Apoacutes a terceira repicagem ainda existiam cerca de
334 brotos para serem novamente repicados e 51 brotos
prontos para serem enraizados perfazendo um total geral
de 549 brotos obtidos ateacute a fase estudada
Para o tipo de explante cotileacutedone decapitado foram
obtidos 181 brotos equivalentes a 174 brotos por explante
Para o explante cotileacutedone fendido o nuacutemero de brotos por
Tipos de Explantes Variaacuteveis Meios Cotileacutedone decapitado Cotileacutedone fendido Cotileacutedone aparado
I 396 aA 050 cB 142 bB II 000 bB 632 bA 672 aA Nordm de explantes
com calos III 000 bB 1599 aA 597 bB I 1095 aA 000 bB 000bB II 050 bA 000 bA 000 bA Nordm de explantes
com brotos III 130 bB 1217 aA 850 aA I 396 aA 050 cB 169 cB II 000 bB 632 bA 645 bA Nordm total de
calos III 000 bB 3630 aA 2655 aA I 1850 aA 000 bB 000 bB II 050 bA 000 bA 000 bA Nordm total de
brotos III 130 bB 2760 aA 2934 aA I 48 32 40 II 32 40 32 Nordm de
explantes III 24 40 48 Total de explantes 104 112 120
explante foi igual a 145 e para o cotileacutedone aparado foram
obtidos 170 brotos por explante Esses resultados foram
semelhantes aos obtidos por Faacuteri et al (2000) para as
cultivares IPA-5 e IPA-6 os quais concluiacuteram que a
utilizaccedilatildeo de cotileacutedones fendidos e cotileacutedones aparados
produziram uma regeneraccedilatildeo alta e onde a maior induccedilatildeo
foi conseguida utilizando-se um meio igual ao MIII utilizado
nesse experimento A induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo tambeacutem foi
mais raacutepida quando usado cotileacutedone decapitado indicando
um alto potencial de organogecircnese espontacircnea A cultivar
Santa Clara mostrou-se mais eficiente na formaccedilatildeo de
brotos alongados observados na primeira repicagem
enquanto as cultivares utilizadas por Faacuteri et al (2000) IPA-
5 e IPA-6 necessitaram de duas repicagens para o
alongamento dos brotos no entanto a cultivar IPA-5
mostrou-se mais eficiente na produccedilatildeo de brotos por
explante Faacuteri et al (2000) utilizaram zeatina durante os trecircs
ciclos de repicagem enquanto nesse experimento foi
utilizado BAP
SOUZA G de F M V e et al92
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
TABELA 2 ndash Capacidade de alongamento e enraizamento de brotos da cultivar Santa Clara durante os trecircs ciclos derepicagem Uberlacircndia UFU 2001
Dados seguidos de mesma letra nas colunas (ab) e nas linhas (AB) natildeo diferem entre si a 5 de probabilidade peloteste de TukeyTipos de explantes A - cotileacutedone decapitado B - cotileacutedone fendido C - cotileacutedone aparado
Os resultados aqui obtidos tambeacutem foram
semelhantes aos de Faacuteri et al (1995b) que trabalhando
com transformaccedilatildeo geneacutetica da berinjela (Solanum
melongena L) observaram que a maior superfiacutecie de corte
do cotileacutedone resultou em maior capacidade de
regeneraccedilatildeo Tambeacutem foram obtidos resultados
semelhantes aos de Nogueira et al (2001) que estudando
a regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro Santa Clara utilizando
como explantes cotileacutedones concluiacuteram que o meio com
uma combinaccedilatildeo adequada de auxina e citocinina (10 mg L-
1 de zeatina e 01 mg L-1 de AIA) promoveu uma maior
meacutedia de regeneraccedilatildeo e um maior nuacutemero meacutedio de brotaccedilotildees
por explante Costa et al (2000) trabalhando com as
cultivares IPA-5 e IPA-6 chegaram a uma conclusatildeo
semelhante onde meio suplementado com 10 mg L-1 de
zeatina + 01 mg L-1 de AIA e meio suplementado com 25
mg L-1 de BAP + 02 mg L-1 de AIA determinaram a maior
frequumlecircncia de regeneraccedilatildeo de explantes cotiledonares e
tambeacutem um maior nuacutemero de brotos alongados por explante
McCormick et al (1986) pesquisando a morfogecircnese
in vitro de L esculentum observaram que a presenccedila de 25
mg L-1 de BAP e 10 mg L-1 de AIA ou 10 mg L-1 de BAP e
02 mg L-1 de AIA produziu um maior nuacutemero de ramos por
explante a partir de explantes de cotileacutedones e hipocoacutetilos
Ohki et al (1978) utilizando segmentos de hipocoacutetilos de L
esculentum sugeriram que o efeito positivo da combinaccedilatildeo
de auxinas e citocininas na regeneraccedilatildeo in vitro pode ser
causado por uma maior capacidade das ceacutelulas dessa espeacutecie
em utilizar e adaptar-se agrave combinaccedilatildeo de auxinas e citocininas
de que somente citocininas Para os mesmos autores a
variabilidade observada nas respostas morfogecircnicas in vitro
para diferentes citocininas pode ser causada pela variaccedilatildeo
na razatildeo de degradaccedilatildeo dessas substacircncias nos tecidos
vegetais ou no meio de cultivo Segundo Caldas et al (1999)
uma alta relaccedilatildeo citocininaauxina normalmente leva a maior
induccedilatildeo de parte aeacuterea (brotos) em explantes in vitro
principalmente quando a citocinina usada eacute o BAP que induz
a formaccedilatildeo de grande nuacutemero de brotos e alta taxa de
multiplicaccedilatildeo em muitos sistemas de micropropagaccedilatildeo
Tanto no presente trabalho quanto nos trabalhos acima
citados foram utilizados meios com pelo menos uma
combinaccedilatildeo com alta relaccedilatildeo citocininaauxina e meios
contendo apenas citocinina
CONCLUSOtildeES
A maior induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo tanto de calos
quanto de brotos foi observada nos meacutetodos cotileacutedone
fendido e cotileacutedone aparado quando colocados no meio
com BAP (25 mgL) e AIA (02 mgL) (MIII) Um ciclo de
repicagem foi suficiente para obtenccedilatildeo de brotos
alongados A maior regeneraccedilatildeo de brotos alongados
ocorreu com o meacutetodo cotileacutedone decapitado
Meios M1 + 05 mgL BAP M1 + 08 mgL BAP M1 + 10 mgL BAP
Repicagem 1 Repicagem 2 Repicagem 3
M1+ 05 mgl AIA
Tipos de Explante
s
Nordm total de brotos
Nordm de brotos
alongados
Nordm total de brotos
Nordm de brotos
alongados
Nordm total de brotos
Nordm de brotos
alongados
Nordm total de placircntulas
enraizadas
Nordm total de
plantas aclimatadas
Nordm total geral de brotos
A 3117 bA 899 aA 3684 bA
866 aA 3174 bA
81 aA 80 67 181 B 536 aA 466 bA 6244 aA 633 aA 5158 aA 450 bA 41 33 163 C 3527 bA 400 bA 4368 bA
566 aA 3928 bA
312 bA 43 35 205
Total 164 135 549
Capacidade de regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro 93
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
AGRADECIMENTOS
Ao Instituto de Geneacutetica e Bioquiacutemica e ao Instituto
de Ciecircncias Agraacuterias da Universidade Federal de
Uberlacircndia pelo financiamento deste projeto e a todos
que auxiliaram direta eou indiretamente
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SILVA A S et al94
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
INDUCcedilAtildeO DE CALOS A PARTIR DE CULTURA DE ANTERAS DECAFEEIRO (Coffea arabica L) CV CATUAIacute VERMELHO 99 E 44
CALLUS INDUCTION FROM ANTHER CULTURE OF COFFEE PLANT (Coffea arabica L) CV CATUAIacute VERMELHO 99 AND 44
ADELAIDE SIQUEIRA SILVA1 JOSEacute MAGNO QUEIROZ LUZ2 DENISE GARCIA SANTANA2 PATRIacuteCIA CRYSTIE VIEIRA MUSTAFA3 MOACIR PASQUAL4 GLAUCIA DE FATIMA MOREIRA VIEIRA E SOUZA2
1Mestranda do Curso de Agronomia ndash Universidade Federal de UberlacircndiaUFU ndash Av Engenheiro Diniz 1178 ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash adelaidebioyahoocombr2Professor Dr ndash Universidade Federal de UberlacircndiaUFU ndash Instituto de Ciecircncias Agraacuterias ndash Curso de Agronomia ndash AV Paraacute Bloco 2E SALA 14campus Umuarana ndash Caixa-Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG3Bioacuteloga Universidade Federal de UberlacircndiaUFU ndash Centro de Ciecircncias Biomeacutedicas ndash Departamento de Agronomia ndash Rua Amazonas snordm - Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos sala 2E-14 ndash Umuarama ndash 38400920 ndash Uberlandia MG ndash patriciacrystiezipmailcombr
4Doutor Departamento de Adgricultura DAG ndash Universidade Federal de Lavras UFLA ndash Campus universitaacuterio ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash mpasqualuflabr
RESUMONo Brasil o cafeacute ainda apresenta poucos progressos com
relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo da cultura de tecidos vegetais tornando-se degrande importacircncia o conhecimento sobre a atuaccedilatildeo dosreguladores de crescimento Com este trabalho avaliou-se ocomportamento de duas cultivares de Coffea arabica L CatuaiacuteVermelho LCH-2077-2-5-99 e LCH-2077-2-5-44 denominadasrespectivamente de Catuaiacute Vermelho 99 e Catuaiacute Vermelho 44quanto agrave ausecircncia e presenccedila de luz e quantificou-se a interaccedilatildeoentre os reguladores de crescimento 24-D e BAP O experimentofoi realizado no Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos Vegetais daUniversidade Federal de Uberlacircndia As anteras das cultivaresCatuaiacute Vermelho 99 e 44 foram inoculadas em meio basal MSsuplementado com quatro concentraccedilotildees de 24-D (905 181271 e 362 mM) e duas concentraccedilotildees de BAP (0 e 89 mM) napresenccedila de luz e ausecircncia de luz As avaliaccedilotildees para a oxidaccedilatildeointumescimento e calosidade foram realizadas aos 30 dias apoacutes ainoculaccedilatildeo no meio de cultura e o diacircmetro dos calos aos 45 diasApoacutes 30 dias de cultivo os calos obtidos foram classificados emfriaacuteveis esverdeados esbranquiccedilados e cinza Os resultadosmostraram que para ocorrer intumescimento das anterasformaccedilatildeo e aumento do tamanho dos calos de ambas cultivares eacutenecessaacuterio que haja interaccedilatildeo entre a auxina (24-D) e a citocinina(BAP) Dentre os tipos de calos os de coloraccedilatildeo cinza foram osque apresentaram maior frequumlecircncia para as duas cultivares
Termos para indexaccedilatildeo Melhoramento calos reguladores decrescimento cafeeiro
ABSTRACTIn Brazil coffee still presents little progress regarding
the application of plant tissue culture which turns important theunderstanding of the action of growth regulators This workevaluated the in vitro performance of two Coffea arabica Lcultivars Catuaiacute Vermelho LCH-2077-2-5-99 and LCH-2077-2-5-44 known as Catuaiacute Vermelho 99 and Catuaiacute Vermelho 44respectively in the presence and absence of light and theinteraction of 24-D and BAP The experiment was carried out at
the Plant Tissue Culture Laboratory of the Universidade Federalde Uberlacircndia Anthers from both cultivars were inoculated inMS basal medium supplemented with four concentrations of24-D (905 181 271 and 362 mM) and two concentrations ofBAP (0 or 89 mM) in the presence and absence of lightOxidation intumescences and callus formation evaluations wereobtained 30 days after inoculation and callus diameter measuredat 45 days of inoculation The observed callus was classified asfriable greenish whitish or gray The results showed that antherintumescences callus formation and growth of both cultivarsdemand the interaction between the auxin (24-D) and thecytokinin (BAP) Callus presenting gray color were the mostfrequent for both cultivars
Index terms Plant breeding callus growth regulators coffee plant
INTRODUCcedilAtildeO
O cafeeiro pertence agrave famiacutelia Rubiaceae na qual o
gecircnero Coffea abrange cerca de 60 espeacutecies sendo as mais
comuns no mercado Coffea araacutebica L e Coffea canephora
Pierre ex Froehn Os programas de melhoramento do cafeacute
demandam aproximadamente 25 anos desde a hibridaccedilatildeo
ateacute a obtenccedilatildeo de uma nova cultivar (PASQUAL et al
2002) A cultura de anteras eacute considerada uma ferramenta
importante pois possibilita a obtenccedilatildeo de linhas
homozigoacuteticas em uma uacutenica etapa (ANDRADE 1998)
acelerando drasticamente o processo de obtenccedilatildeo de novas
cultivares Sendo assim a teacutecnica de cultura de anteras
vem auxiliar no melhoramento da cultura pois permite a
obtenccedilatildeo de haploacuteides em geraccedilotildees segregantes o que
leva agrave raacutepida produccedilatildeo de plantas homozigotas por meio
(Recebido em 14 de outubro de 2003 e aprovado em 29 de outubro de 2006)
Induccedilatildeo de calos a partir de cultura 95
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
da duplicaccedilatildeo do nuacutemero de cromossomos numa uacutenica
etapa substituindo as geraccedilotildees de auto fecundaccedilatildeo
Acrescenta-se a isso o fato de os haploacuteides serem livres
dos problemas de dominacircncia e recessividade por possuir
apenas um alelo em cada loco gecircnico
No Brasil Coffea arabica ainda apresenta poucos
progressos com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo da cultura de anteras
Daiacute a importacircncia de se produzir mais conhecimentos sobre
a atuaccedilatildeo dos reguladores de crescimento na expressatildeo
androgeneacutetica de Coffea arabica identificaccedilatildeo de
genoacutetipos androgecircnicos bem como a determinaccedilatildeo de
condiccedilotildees fiacutesicas mais adequadas agrave incubaccedilatildeo de anteras
nessa espeacutecie
Nos programas de melhoramento as teacutecnicas
convencionais tecircm apresentado resultados promissores
na cultura do cafeacute no que se refere ao aumento de
produtividade e obtenccedilatildeo de novas cultivares Um fator
importante para o sucesso da cultura de anteras eacute conhecer
o estaacutedio ideal de desenvolvimento dos microacutesporos com
o intuito de se obter uma melhor resposta androgeneacutetica
utilizando microacutesporos receacutem-liberados da teacutetrade meioacutetica
ateacute no maacuteximo o estaacutedio binucleado A fase uninucleada
responde positivamente ao processo embriogecircnico porque
nesta fase os microacutesporos apresentam uma parede celular
delgada o que a torna mais receptiva aos fatores externos
Em estaacutedios mais avanccedilados da microsporogecircnese ocorre
um engrossamento da parede celular sendo esta uma
caracteriacutestica do gratildeo de poacutelen maduro do cafeacute
prejudicando o processo de regeneraccedilatildeo (ASCANIO amp
ARCIA 1994) Os autores Grando amp Moraes Fernandes
(1993) sugerem que o potencial embriogecircnico do gratildeo de
poacutelen pode ser determinado tanto no periacuteodo da meiose
quanto no periacuteodo da preacute-mitose do microacutesporo pois
nestes dois momentos o microacutesporo ainda teria
metabolicamente caracteriacutesticas esporofiacuteticas o que
permite a diferenciaccedilatildeo do gratildeo de poacutelen em embriatildeo e
posterior formaccedilatildeo de uma planta
Segundo Mantell et al (1994) satildeo possiacuteveis vaacuterios
tipos de desenvolvimento do microacutesporo in vitro sendo
que tanto o nuacutecleo generativo quanto o vegetativo pode
se dividir continuamente originando um embrioacuteide
haploacuteide ou ainda a primeira mitose produziria dois nuacutecleos
semelhantes e estes se dividiriam repetidamente resultando
na formaccedilatildeo de embrioacuteides haploacuteides
A composiccedilatildeo do meio de cultura tambeacutem eacute de
grande importacircncia para o sucesso da cultura de anteras
natildeo existindo contudo uma recomendaccedilatildeo generalizada
Na maioria das espeacutecies a androgecircnese se verifica em meios
que conteacutem sais minerais sacarose vitaminas reguladores
de crescimento e aacutegar (MORAES FERNANDES 1990) A
consistecircncia do meio normalmente eacute semi-soacutelida mas os
meios liacutequidos estatildeo sendo cada vez mais usados pois
tecircm vantagens no aumento do rendimento pela maior
obtenccedilatildeo de embriotildees e calos (PIERIK 1987) O
presente trabalho teve como objetivo aplicar a teacutecnica da
cultura de anteras em diferentes cultivares de Coffea
arabica verificando os vaacuterios fatores que influenciam a
induccedilatildeo de calos
MATERIAL E MEacuteTODOS
Experimentos de Induccedilatildeo e Regeneraccedilatildeo de Calos
Esta etapa constituiu-se de dois experimentos cada
um com uma cultivar tendo sido conduzidos no laboratoacuterio
de Cultura de Tecidos Vegetais da Universidade Federal
de Uberlacircndia em Uberlacircndia - Minas Gerais no periacuteodo
de setembro de 2002 a janeiro de 2003
Foram utilizados bototildees florais de duas cultivares
de Coffea araacutebica Catuaiacute Vermelho LCH-2077-2-5-99 e
LCH-2077-2-5-44 denominadas respectivamente de Catuaiacute
Vermelho 99 e Catuaiacute Vermelho 44 plantadas na aacuterea
experimental do Campus Umuarama dessa Universidade
Os bototildees florais foram coletados no periacuteodo de 8 agraves 9
horas da manhatilde e armazenados em placas de Petri contendo
papel de filtro umedecido em aacutegua destilada e colocados
dentro de uma caixa de isopor para evitar a desidrataccedilatildeo
ateacute serem conduzidos ao laboratoacuterio
No laboratoacuterio o comprimento dos bototildees foi
medido com o auxiacutelio de um paquiacutemetro e utilizaram-se
SILVA A S et al96
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bototildees florais entre 45 a 60 mm de comprimento em todos
os experimentos Os bototildees foram envoltos em gaze
previamente autoclavada e desinfestados em uma soluccedilatildeo
de aacutelcool 70 por alguns segundos e por 10 minutos em
soluccedilatildeo de hipoclorito de soacutedio a 02 sob agitaccedilatildeo Em
seguida na cacircmara de fluxo laminar foram lavados 3 vezes
em aacutegua destilada e autoclavada Apoacutes este processo as
anteras foram retiradas dos bototildees com o auxiacutelio de uma
lupa uma pinccedila fina e bisturi nordm 10 sendo os uacuteltimos
flambados para cada botatildeo tomando-se o cuidado para
natildeo ferir as anteras Logo apoacutes as anteras foram imersas
por 1 segundo em soluccedilatildeo de aacutecido ascoacuterbico na
concentraccedilatildeo de 600 mgL-1 hipoclorito de soacutedio 02 e
aacutegua destilada e autoclavada respectivamente
Apoacutes este processo as anteras foram inoculadas
em tubo de ensaio contendo 20 mL do meio MS
(MURASHIGE amp SKOOG 1962) suplementado com aacutecido
24-diclorofenoxiaceacutetico (24-D) e 6- benzilaminopurina
(BAP) em diferentes concentraccedilotildees com pH ajustado para
58 Este meio foi esterilizado em autoclave vertical agrave
temperatura de 121deg C sob pressatildeo de 1 atm por 20 minutos
O delineamento experimental utilizado foi o de
blocos casualizados com 10 repeticcedilotildees em esquema fatorial
4 x 2 x 2 sendo que os fatores foram compostos de quatro
concentraccedilotildees de 24-D (905 181 271 362 mM) duas
concentraccedilotildees de BAP (0 e 89 mM) perfazendo oito
tratamentos incubados na ausecircncia ou presenccedila de luz
em sala de crescimento com temperatura de 25 plusmn 2degC e 16
horas de fotoperiacuteodo Nos dois experimentos cada
tratamento teve 10 repeticcedilotildees sendo um tubo com 10
anteras considerado uma repeticcedilatildeo
Aos 30 dias apoacutes a inoculaccedilatildeo das anteras foram
avaliadas as porcentagens de oxidaccedilatildeo de intumescimento
e de formaccedilatildeo de calos (calosidade) e aos 45 dias foi medido
o diacircmetro dos calos
Os calos obtidos das duas cultivares apoacutes 45 dias
de inoculaccedilatildeo das anteras foram transferidos para o meio
MS suplementado com 30 gL-1 de sacarose 6gL-1 de agar e
de 24-DBAP nas seguintes concentraccedilotildees de 1810 181
2 2710 e 3620 mM com pH ajustado para 58 associando
a ausecircncia e presenccedila de luz
Apoacutes a permanecircncia destes calos no meio de cultura
por 30 dias aqueles provenientes da cultivar Catuaiacute
Vermelho 99 incubados na presenccedila de luz foram
transferidos para o meio de cultura contendo 271 mM de
24-D enquanto que aqueles incubados na ausecircncia de
luz foram transferidos para meio contendo 362 mM de 24-
D Jaacute os calos da cultivar Catuaiacute Vermelho 44 incubados
na presenccedila de luz foram transferidos para meio contendo
181 mM de 24-D e 89 mM de BAP e os incubados na
ausecircncia de luz transferidos para o meio contendo 181
mM de 24-D
Apoacutes 30 dias neste tratamento foram avaliadas as
caracteriacutesticas referentes ao tipo de calo (friaacuteveis
esverdeados esbranquiccedilados e cinza)
Os dados obtidos foram testados quanto agrave
normalidade e agrave homogeneidade necessitando de
transformaccedilatildeo em arco seno para os dados em
porcentagem e raiz quadrada de (x + 05) para os dados
referentes ao diacircmetro dos calos
RESULTADOS
Interaccedilatildeo entre os Reguladores de Crescimento e oFotoperiacuteodo
Para a cultivar Catuaiacute 99 em todas as concentraccedilotildees
de 24-D e independentemente da concentraccedilatildeo de BAP a
oxidaccedilatildeo foi menor na ausecircncia de luz diferindo
estatisticamente da fase em que se tinha presenccedila de luz
No entanto nos calos cultivados nas concentraccedilotildees de
905 e 271 mM de 24-D e 89 mM de BAP na ausecircncia de
luz foi observado um aumento significativo na oxidaccedilatildeo
das anteras o mesmo acontecendo na concentraccedilatildeo de
271 mM de 24-D na presenccedila de luz No entanto resultado
inverso foi observado para a concentraccedilatildeo de 362 mM de
24-D (Tabela 1)
Os resultados do percentual de intumescimento
variaram bastante em funccedilatildeo da luminosidade e
reguladores de crescimento (Tabela 1) Na presenccedila do
Induccedilatildeo de calos a partir de cultura 97
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BAP e concentraccedilatildeo 89 mM de 24-D tanto na presenccedila
ou ausecircncia de luz o intumescimento dos calos natildeo diferiu
significativamente Jaacute na concentraccedilatildeo de 181 mM de 24-
D na presenccedila de luz se mostrou melhor promovendo um
aumento significativo do intumescimento das anteras
Quanto agraves concentraccedilotildees de 271 e 362 mM de 24-D
cultivados na presenccedila de luz se mostrou melhor ao
intumescimento quando comparado agravequeles cultivados na
ausecircncia de luz (Figura 1)
A presenccedila de calos aumentou significativamente
com a incubaccedilatildeo das anteras na ausecircncia de luz e na
TABELA 1 ndash Meacutedias do nuacutemero de anteras oxidadas intumescidas e com calos e diacircmetro dos calos (mm) em funccedilatildeode diferentes concentraccedilotildees de 24-D e ausecircncia ou presenccedila de BAP em duas condiccedilotildees de luminosidade (presenccedilaou ausecircncia de luz) para anteras do genoacutetipo cv 99
Luminosidade1
Oxidaccedilatildeo () Intumescimento ()
Calosidade () Diacircmetro (mm) 24-D M
BAP M luz Escuro Luz Escuro luz Escuro luz Escuro 0 980 b A 395 a A 000b B 434 a A 000 b A 740 a A 000 b A 309 a A 905
89 999 b A 823 a B 398 a A 327 a B 007 b A 615 a A 000 b A 300 a A 0 999 b A 524 a A 000 b B 447 a A 007 b A 750 a A 000 b B 368 a A
181 89 935 b A 511 a A 614 a A 407 b A 030 b A 720 a A 300 b A 387 a A
0 745 b A 000 a A 534 a A 000 b B 530 a A 000 b B 318 a B 000 b B 271
89 914 b B 590 a B 625 a A 634 a A 708 a A 809 a A 377 a A 298 b A 0 999 b B 440 a A 607 a A 492 b A 097 b B 815 a A 300 a B 277 a A
362 89 813 b A 426 a A 493 a B 527 a A 378 b A 758 a A 398 a A 298 b A
1Meacutedias seguidas por letras diferentes minuacutesculas na linha e maiuacutesculas na coluna dentro de cada concentraccedilatildeo de 2-4-D diferem entre si pelo teste de Tuckey a significacircncia de 5
concentraccedilatildeo de 271 mM de 24-D nas demais
concentraccedilotildees de 24-D independente da concentraccedilatildeo
do BAP a incubaccedilatildeo na ausecircncia de luz apresentou
meacutedias de calosidade significativamente maiores (Figura
2) A presenccedila do BAP promoveu aumento significativo
na calosidade das anteras na concentraccedilatildeo 271 mM de
24-D na ausecircncia de luz e na concentraccedilatildeo de 362 mM
de 24-D na presenccedila de luz Nas demais concentraccedilotildees
natildeo houve diferenccedila significativa entre presenccedila ou
ausecircncia de BAP tanto na ausecircncia ou presenccedila de luz
(Tabela 1)
FIGURA 1 ndash Anteras da cv Catuaiacute Vermelho 99 naconcentraccedilatildeo de 181 M de 24-D na presenccedila de luz
FIGURA 2 ndash Calos de anteras incubadas na ausecircncia deluz e na concentraccedilatildeo de 271 M de 24-D
SILVA A S et al98
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Quanto ao diacircmetro nas concentraccedilotildees 905 e 181 M
de 24-D a ausecircncia de luz promoveu aumento significativo
no diacircmetro dos calos diferindo-se estatisticamente do
tratamento na presenccedila de luz Somente para a concentraccedilatildeo
de 271 mM de 24-D na ausecircncia do BAP natildeo houve diferenccedila
significativa para a caracteriacutestica independentemente do
fotoperiacuteodo Nas demais concentraccedilotildees de 24-D o tratamento
na presenccedila de luz promoveu um aumento significativo no
diacircmetro dos calos No tratamento em que houve a associaccedilatildeo
da presenccedila de luz e de BAP natildeo diferiu estatisticamente do
tratamento em que houve a ausecircncia de BAP quando a
concentraccedilatildeo de 24-D foi de 905 mM nos demais
proporcionou aumento significativo no diacircmetro dos calos
Para o tratamento na ausecircncia de luz apenas na concentraccedilatildeo
de 271 mM de 24-D a ausecircncia de BAP promoveu diminuiccedilatildeo
significativa no diacircmetro de calos Nas demais concentraccedilotildees
natildeo houve diferenccedila significativa entre presenccedila ou ausecircncia
de BAP (Tabela 1)
Para as variaacuteveis intumescimento e calosidade da
cultivar cv 44 a interaccedilatildeo entre 24-D e BAP natildeo diferiram
estatisticamente quanto presenccedila e ausecircncia de luz nas
concentraccedilotildees 905 e 362 mM de 24-D e que tambeacutem natildeo
difere para o diacircmetro na concentraccedilatildeo de 181 mM de 24-
D Jaacute na concentraccedilatildeo 271 mM de 24-D haacute uma semelhanccedila
quanto ao intumescimento calosidade e diacircmetro que
diferem das demais concentraccedilotildees natildeo apresentando
portanto uma boa interaccedilatildeo
A melhor interaccedilatildeo para intumescimento calosidade
e diacircmetro encontra-se respectivamente na concentraccedilatildeo
905 mM de 24-D na presenccedila de luz na concentraccedilatildeo 181
mM de 24-D na ausecircncia de luz e na concentraccedilatildeo 905
mM de 24-D na ausecircncia de luz Jaacute as piores interaccedilotildees
estatildeo na concentraccedilatildeo 271 mM de 24-D na luz tanto para
o intumescimento quanto para o diacircmetro analisados na
Tabela 2
De acordo com a Tabela 2 observou-se que os
melhores resultados ou seja as interaccedilotildees independem
da presenccedila ou ausecircncia de BAP Na Tabela 3 notou-se
uma maior oxidaccedilatildeo das anteras quando incubadas no claro
estas apresentaram uma maior oxidaccedilatildeo em relaccedilatildeo as que
foram incubadas no escuro tornando-se mais tarde calos
previamente oxidados
TABELA 2 ndash Meacutedias do nuacutemero de anteras intumescidas e com calos diacircmetro dos calos (mm) em funccedilatildeo de diferentesconcentraccedilotildees de 24-D e ausecircncia ou presenccedila de BAP em duas condiccedilotildees de luminosidade (luz e escuro) para anterasdo genoacutetipo cv 44
Luminosidade1
Intumescimento () Calosidade () Diacircmetro (mm) 24-D ( M)
BAP ( M) Luz Escuro Luz Escuro Luz Escuro
0 907 a A 775 a A 779 bA 948 aA 609 bA 800 aA 905 89 843 a A 875 a A 889 aA 946 aA 607 aA 420 bB 0 887 a A 852 a A 939 aA 990 aA 490 aA 466 aA
181 89 906 a A 786 a A 917 aA 959 aA 420 aA 493 aA 0 600 b A 772 a A 694 bA 895 aA 000 bA 373 aA
271 89 022 b B 827 a A 294 bB 837 aA 000 bA 376 aA 0 828 a A 737 a A 928 aA 939 aA 414 bA 595 aA
362 89 866 a A 725 a A 949 aA 866 aA 329 aA 376 aA
1Meacutedias seguidas por letras diferente minuacutesculas na linha e maiuacutesculas na coluna dentro de cada concentraccedilatildeo de 2-4-D diferem entre si pelo teste de Tukey a significacircncia de 5
Induccedilatildeo de calos a partir de cultura 99
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TABELA 3 ndash Meacutedias de oxidaccedilatildeo das anteras entre asdiferentes concentraccedilotildees de 24-D em duas condiccedilotildeesde luminosidade (luz e escuro) para anteras da cultivarCatuaiacute Vermelho 44
Concentraccedilotildees
24-D ( M ) OXIDACcedilAtildeO ()
Claro Escuro 905 749 a 269 b 181 420 a 270 b 271 999 a 221 b 362 308 a 334 a
1Meacutedias seguidas por letras diferentes minuacutesculas na linhadentro de cada concentraccedilatildeo de 2-4-D diferem entre sipelo teste de Tukey a significacircncia de 5
TABELA 4 ndash Tipos de calos obtidos apoacutes 30 dias em meioMS com 362 M de 24-D na ausecircncia de luz da cultivarCatuaiacute Vermelho 99
Tipos de Calos
Nuacutemero de Calos
Nuacutemero de Calos com diacircmetro acima
de 05 mm Friaacuteveis 03 Esverdeados 13 06 Esbranquiaccedilados
03 Cinza 26
Dados de contagem natildeo transformados O recultivo emmeio MS com 362 M de 24-D na presenccedila de luz teve100 de contaminaccedilatildeo apoacutes sua inoculaccedilatildeo
TABELA 5 ndashTipos de calos obtidos apoacutes 30 dias em meioMS com 181 M de 24D e 89 M de BAP na presenccedilade luz da cultivar Catuaiacute Vermelho 44
TABELA 6 ndash Tipos de calos obtidos apoacutes 30 dias em meioMS com 181 M de 24D na ausecircncia de luz da cultivarCatuaiacute Vermelho 44
Tipos de Calos Nuacutemero de Calos
Nuacutemero de Calos com diacircmetro
acima de 05 mm Friaacuteveis 58 Esverdeados 23 214 Esbranquiaccedilados 94 Cinza 203
Tipos de Calos
Nuacutemero de Calos
Nuacutemero de Calos com diacircmetro
acima de 05 mm Friaacuteveis 25 Esverdeados 11 69 Esbranquiaccedilados 19 Cinza 350
Dados de contagem natildeo transformados Dados de contagem natildeo transformados
Nesta etapa a maioria dos calos encontrados para
as trecircs cultivares apresentaram coloraccedilatildeo cinza (Tabelas 4
5 e 6) A perda gradativa da coloraccedilatildeo natural dos calos
passando de verdes para a cor marrom a diminuiccedilatildeo do
ritmo de crescimento dos mesmos a estagnaccedilatildeo do
processo de formaccedilatildeo de embrioacuteides seguido do
surgimento de aacutereas necrosadas na superfiacutecie satildeo sinais
que caracterizam a senescecircncia da cultura (SILVA 2002)
DISCUSSAtildeO
A resposta das anteras da cultivar Catuaiacute Vermelho 99
com relaccedilatildeo agrave oxidaccedilatildeo indica que a mesma estaacute associada agrave
combinaccedilatildeo entre auxina e citocinina promovendo os menores
iacutendices de oxidaccedilatildeo Agrave medida que se aumentou a
concentraccedilatildeo de 24-D na presenccedila de BAP houve um
aumento gradativo da oxidaccedilatildeo ateacute atingir um ponto maacuteximo
em torno de 80 na dosagem de 271 mM de 24-D Jaacute na
ausecircncia de BAP a oxidaccedilatildeo foi bem maior quando comparada
agrave porcentagem de oxidaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 905 mM de
24-D De acordo com Wang amp Huang (1976) o cultivo in
vitro por um periacuteodo longo induz a formaccedilatildeo de compostos
fenoacutelicos no meio que podem causar necrose e posteriormente
morte dos calos Maciel (2001) e Paluacute (2002) citam que pelos
resultados obtidos para a induccedilatildeo de calogecircnese em anteras
de cafeeiro observa-se que eacute necessaacuteria uma auxina
juntamente com uma citocinina Dentre as auxinas sinteacuteticas
o 24-D eacute sem duacutevida o mais adequado agrave induccedilatildeo e
manutenccedilatildeo do calo (GAMBORG et al 1976)
Para Thomas amp Ravindra (1997) o maior problema
na iniciaccedilatildeo de culturas lenhosas eacute a ocorrecircncia de
compostos fenoacutelicos que estatildeo ligados com processos de
regulaccedilatildeo de crescimento especialmente com as auxinas
que dependendo da sua concentraccedilatildeo endoacutegena no tecido
resulta na induccedilatildeo desses compostos
SILVA A S et al100
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
O fotoperiacuteodo que estas anteras foram submetidas
influenciou tambeacutem na porcentagem de oxidaccedilatildeo sendo
que no escuro e na presenccedila de 24-D (89 mM) a oxidaccedilatildeo
foi miacutenima Agrave medida que foi aumentando a concentraccedilatildeo
da auxina foi aumentando tambeacutem a oxidaccedilatildeo poreacutem este
aumento foi bem menor quando comparado ao cultivo das
anteras na presenccedila de luz
A oxidaccedilatildeo fenoacutelica tem sido controlada em
diferentes espeacutecies lenhosas pela reduccedilatildeo da intensidade
luminosa (MARKS amp SIMPSON 1990) associada com a
substituiccedilatildeo frequumlente do meio de cultura e dessa forma
as chances de se obter sucesso no estabelecimento e
cultivo de explantes de espeacutecies lenhosas satildeo bastante
elevadas (TEIXEIRA 2001)
Em muitas espeacutecies por razotildees natildeo conhecidas a
embriogecircnese direta eacute rara e as plantas tecircm que ser
diferenciadas a partir de calos Para induccedilatildeo destes
geralmente eacute necessaacuteria uma auxina (MAHESHWARI et
al 1982) Segundo Rocha (1998) para a induccedilatildeo e
manutenccedilatildeo do calo a maioria das espeacutecies parece
comportar-se diferentemente natildeo soacute quanto aos
reguladores de crescimento podendo ocorrer
independentemente de auxinas e citocininas dependente
de ambas ou dependente de uma ou de outra mas tambeacutem
quanto agrave presenccedila ou ausecircncia de luminosidade Sharp et
al (1973) obtiveram calos atraveacutes do cultivo de sementes
folhas e anteras de C arabica das cultivares Mundo Novo
e Bourbon Amarelo A induccedilatildeo de calos tambeacutem foi mais
eficiente na ausecircncia de luz Aleacutem disso Ascanio amp Arcia
(1994) citam que para o desenvolvimento do calo as
anteras devem ser mantidas no escuro jaacute para o
desenvolvimento do embriatildeo os calos devem ser mantidos
no claro
Natildeo houve a formaccedilatildeo de embriotildees e isto pode ser
devido agraves doses de reguladores ou mesmo de combinaccedilotildees
que natildeo foram apropriadas para estas cultivares
CONCLUSAtildeO
Os resultados mostraram que para ocorrer
intumescimento das anteras formaccedilatildeo e aumento do
tamanho dos calos de ambas as cultivares eacute necessaacuterio
que haja interaccedilatildeo entre a auxina (24-D) e a citocinina
(BAP) e incubaccedilatildeo no escuro
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COMUNICACcedilAtildeO CIENTIacuteFICA
PROLIFERACcedilAtildeO IN VITRO DE BROTOS DE CURAUAacuteUTILIZANDO DIFERENTES VOLUMES DE MEIO DE CULTURA
IN VITRO SHOOT PROLIFERATION OF Ananas erectifolius USING DIFFERENTVOLUMES OF CULTURE MEDIUM
FLAacuteVIA DIONIacuteSIO PEREIRA1 JOSEacute EDUARDO BRASIL PEREIRA PINTO2HELEN CRISTINA DE ARRUDA RODRIGUES3 LUCIANA DOMICIANO SILVA ROSADO3
LUIZ ALBERTO BEIJO4 OSMAR ALVES LAMEIRA5
1Doutoranda em Agronomia ndash Universidade Estadual de Feira de SantanaUEFS ndash Horto Florestal ndash 44055-000 ndash Feira de Santana BA ndash flavia1808hotmailcom
2Doutor em Fisiologia Vegetal ndash Departamento de AgriculturaDAG ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash jeduardouflabr
3Graduanda em Agronomia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG4Doutorado em Agronomia ndash Universidade Federal de AlfenasUNIFAL ndash Departamento de Ciecircncias Exatas ndash Rua Gabriel Monteiro da Silva n deg 714 ndash Centro ndash 37130-000 ndash Alfenas MG ndash luizbeijoyahoocombr5Doutor em Agronomia ndash EMBRAPA ndash Amazocircnia Oriental ndash Trav Dr Eneacuteas Pinheiro sn ndash Bairro Marco ndash 66095-100 ndash Beleacutem PA ndash osmarcpatuembrapabr
RESUMOCurauaacute [Ananas erectifolius LBSm ndash Bromeliaceae] eacute
uma espeacutecie com grande potencial de uso de suas fibras comorevestimento na induacutestria automobiliacutestica Aleacutem disso o poacute dosumo do curauaacute tem sido utilizado no tratamento de cicatrizaccedilatildeode lesotildees cutacircneas Neste trabalho avaliaram-se diferentes volumesde meio MS Os volumes utilizados foram de 10 15 20 25 e 30 mLO delineamento experimental foi inteiramente casualizado (DIC)e cada tratamento continha 19 repeticcedilotildees Aos 30 dias avaliaram-se o nuacutemero e o tamanho de brotaccedilotildees Segundo a anaacutelise devariacircncia houve efeito linear do volume de meio na produccedilatildeo debrotos de curauaacute Agrave medida em que se aumenta o volume domeio aumenta o nuacutemero de brotos Natildeo houve diferenccedilasignificativa nos comprimentos dos brotos
Termos para indexaccedilatildeo Ananas erectifolius fibras vegetaismicropropagaccedilatildeo
ABSTRACTAnanas erectifolius LBSm ndash Bromeliaceae is a species
that presents fibers with great potential to be used as revetmentfor the automobile industry Besides the powder obtained fromits juice has been used in the treatment of skin lesionscicatrisation In this work the effect of different volumes (1015 20 25 and 30 mL) of MS medium during the in vitro cultureof axillary buds was evaluated A completely randomized design(CDR) was used with each treatment containing 19 replicatesAfter 30 days of inoculation shoot number and size wereevaluated The analysis of variance showed a linear effect of theculture medium volume and shoot proliferation Higher shoot
number was observed with the increase of medium volume Nosignificant difference was observed on shoot lenght
Index terms Ananas erectifolius vegetable fibermicropropagation
A produccedilatildeo de fibras vegetais ocupa um papel
relevante na economia agriacutecola mundial mesmo com a
intensa produccedilatildeo de fibras sinteacuteticas Mateacuterias-primas de
origens renovaacuteveis reciclaacuteveis e biodegradaacuteveis satildeo uma
das alternativas para a produccedilatildeo de manufaturados
ecologicamente corretos em consequumlecircncia do acuacutemulo
nos descartes de materiais natildeo biodegradaacuteveis os quais
tendem a aumentar com o crescimento populacional nos
centros urbanos A substituiccedilatildeo de materiais derivados do
petroacuteleo na produccedilatildeo de compostos elastomeacutericos por
mateacuteria-prima renovaacutevel vai ao encontro desses ideais
(ROCHA et al 2003)
As fibras sinteacuteticas destacam-se pela elevada
resistecircncia baixa densidade e elevada produccedilatildeo
Entretanto as fibras animais e vegetais satildeo as de maior
importacircncia principalmente para atender aos apelos
(Recebido em 31 de agosto de 2006 e aprovado em 19 de janeiro de 2007)
Proliferaccedilatildeo in vitro de brotos de curauaacute 103
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 102-106 2006
ecoloacutegicos e pelo nuacutemero de plantas e animais produtores
de fibras (SCHREIBER1998)
As plantas produtoras de fibras utilizaacuteveis foram
quantificadas por vaacuterios autores e em diferentes eacutepocas
tendo sido enumeradas 2000 mil plantas fibrosas e o seu
total estimado em 2300 destacando-se as florestas tropicais
que encerram recursos inesgotaacuteveis em potencial
(MEDINA 1959)
O curauaacute [Ananas erectifolius LBSm ndash
Bromeliaceae] utilizado principalmente na fabricaccedilatildeo de
cordas sacos e utensiacutelios domeacutesticos surge como
sucedacircneo para o aproveitamento de fibras O curauaacute eacute
uma bromeliaacutecea distribuiacuteda nos Estados do Paraacute Acre
Mato grosso Goiaacutes e Amazonas e eacute cultivada
principalmente por pequenos produtores da regiatildeo do
Lago Grande de Curuai no municiacutepio de Santareacutem PA
Estudos recentes tecircm demonstrado o grande potencial do
uso das fibras dessa planta como revestimento na induacutestria
automobiliacutestica devido agrave sua resistecircncia maciez e peso
reduzido O grande problema eacute que natildeo haacute suprimento
suficiente de mateacuteria-prima para atender agrave induacutestria
automobiliacutestica pois o curauaacute eacute fiel agraves suas origens amazocircnicas
e soacute se desenvolve em clima quente e uacutemido criando um
problema para a aquisiccedilatildeo de mudas fora desta regiatildeo que
por tal motivo eacute escassa no mercado (SILVA 2004)
A micropropagaccedilatildeo utilizando teacutecnicas de cultura
de tecido tem sido um valioso instrumento na propagaccedilatildeo
de diversos tipos de plantas Embora este processo envolva
diferentes etapas depois de definido um protocolo de
micropropagaccedilatildeo seja qual for a espeacutecie este pode ser
otimizado no intuito de se obter placircntulas de alta qualidade
e com baixo valor de produccedilatildeo O tipo e tamanho de frasco
e a quantidade de meio satildeo variaacuteveis que tecircm recebido
pouca atenccedilatildeo embora afetem diretamente a aacuterea superficial
da interface meio de cultura-atmosfera o volume de ar sobre
o meio de cultura e a sua profundidade Tais fatores tambeacutem
afetam a composiccedilatildeo da fase gasosa do frasco e
consequumlentemente o crescimento e desenvolvimento das
culturas (GRATTAPAGLIA amp MACHADO 1998)
Rodrigues et al (2005) verificaram maior
proliferaccedilatildeo de brotos de Cattleya persivaliana Hort
em frascos contendo 50 mL de meio quando comparados
com aqueles de 25 75 e 100 mL Nicoloso amp Erig (2002)
trabalhando com Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen
verificaram que 10 mL de meio MS (MURASHIGE amp
SKOOG 1962) proporcionaram o melhor crescimento
das placircntulas em biomassa quando cultivadas em tubos
de 20 cm de altura x 2 cm diacircmetro em comparaccedilatildeo com
os de 25 cm de altura x 2 cm 15 cm de altura x 2 cm
Carvalho et al (1995) estudando a influecircncia de fatores
fiacutesicos no desenvolvimento e crescimento in vitro de
batata-doce (Ipomoea batatas L Poir) verificaram que
10 mL de meio de cultura por frasco com explantes
proporcionaram maior formaccedilatildeo de gemas em relaccedilatildeo
aos volumes de 20 e 30 mL
Sendo assim objetivou-se neste trabalho avaliar
o volume de meio apropriado para a propagaccedilatildeo in vitro
de brotaccedilotildees de curauaacute
As brotaccedilotildees utilizadas como fonte de explante
foram fornecidas pela EMBRAPACPATU situada em
Beleacutem do Paraacute Gemas axilares de curauaacute foram
inoculadas em meio MS completo suplementado com
20 mgL de BAP (6-Benzilaminopurina) Apoacutes 30 dias
estas se desenvolveram e as brotaccedilotildees obtidas foram
transferidas para o meio MS sem regulador de
crescimento por 30 dias
Apoacutes este periacuteodo quatro explantes foram
desfolhados completamente ficando apenas porccedilotildees
basais com aproximadamente 1cm de comprimento que
foram inoculadas em meio de cultura baacutesico MS sem
regulador de crescimento em frasco de 12 cm de altura por
5 cm de diacircmetro (volume interno = 300 mL) com volumes
de 10 15 20 25 30 mL Os explantes foram mantidos em
sala de crescimento a uma temperatura de 26plusmn1degC e
fotoperiacuteodo de 16 horas sob uma Irradiacircncia de foacutetons de
25mmol m-2 s-1
O delineamento experimental foi inteiramente
casualizado (DIC) Cada tratamento continha 19 repeticcedilotildees
PEREIRA F D et al104
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 102-106 2006
(um frasco por repeticcedilatildeo) Aos 30 dias avaliaram-se o
nuacutemero e o comprimento das brotaccedilotildees O programa
utilizado para anaacutelise dos dados foi o software statistica
(SISVAR) tendo sido submetidas agrave anaacutelise de variacircncia
com aplicaccedilatildeo do teste F a 5 de probabilidade
analisando-se as meacutedias por regressatildeo polinomial
O efeito linear foi o mais adequado para explicar
a evoluccedilatildeo da taxa meacutedia de regeneraccedilatildeo do curauaacute Agrave
medida que o volume do meio de cultura aumenta existe
tendecircncia de aumento do nuacutemero de brotos Com 25
mL de meio produziu-se maior nuacutemero de brotos por
frasco (2557) e com 10 mL de meio produziu-se menor
nuacutemero de brotos (1226) O tratamento com 15 mL de
meio produziu 1765 brotos o com 20 mL 1750 e o com
30 mL 2242 (Figura 1) O volume maior de meio
disponibiliza mais nutrientes e diminui tambeacutem a
competiccedilatildeo entre as placircntulas o que explica a tendecircncia
em se obter um maior nuacutemero de brotos agrave medida que
se aumenta a quantidade do meio de cultura Em todos
os tratamentos as brotaccedilotildees obtidas foram vigorosas
com a coloraccedilatildeo verde-escura caracteriacutestica das
plantas matrizes As brotaccedilotildees tinham tambeacutem rigidez
outra caracteriacutestica da espeacutecie o que eacute devido agrave
presenccedila das fibras nas folhas Observou-se maior
concentraccedilatildeo de raiacutezes nas brotaccedilotildees maiores e natildeo
FIGURA 1 ndash Nuacutemero meacutedio de brotos por frasco de curauaacute(Ananas erectifolius) cultivados em diferentes volumesde meio MS completo 10 15 20 25 e 30
foi observada a presenccedila de calos em nenhum dos
tratamentos (Figura 2)
Resultados semelhantes foram obtidos por Reis
Lameira Reis (2004) trabalhando com curauaacute utilizando
volumes de 5 75 10 e 15 mL do meio liacutequido MS suplementados
com 25 mgL-1 de BAP (6-benzilaminopurina) os melhores
resultados sendo com os tratamentos que continham 10 e
15ml produzindo em meacutedia 121 e 154 brotosexplante
respectivamente
Da mesma forma Reis et al(2003) trabalhando com
ipeca (Psychotria ipecacuanha Stokes) em meio MS
acrescido de 15 mg L-1de BAP nos volumes de 10 20 30
e 40 mL obtiveram melhor resultado com os volumes de 30
e 40 mL (7 e 8 brotosfrasco respectivamente)
Quanto ao comprimento dos brotos natildeo houve
diferenccedila significativa Os brotos t iveram um
crescimento meacutedio de 228 cm sendo que no tratamento
com 10 mL de meio foi 257 cm com 15 mL 222 cm
com 20 mL 224 cm com 25 mL 224 cm e o tratamento
com 30 mL 215 cm Embora natildeo se tenham realizado
estudos mais aprofundados uma das hipoacuteteses
sugeridas para explicar tais resultados possivelmente
estaacute relacionada a fatores nutricionais do explante
Segundo Cappelades et al (1991) e Pereira et al (2001)
porccedilotildees basais satildeo mais robustas apresentando maior
quantidade de reservas acumuladas em seus tecidos
o que poderia levar agrave utilizaccedilatildeo dessas reservas pelas
brotaccedilotildees regeneradas para sustentar seu crescimento
Esta seria uma das causas da uniformidade apresentada
no tamanho das brotaccedilotildees em todos os tratamentos
Resultados iguais foram obtidos em estudos feitos por
Rodrigues et al (2005) quando avaliaram comprimento
meacutedio de duas espeacutecies de orquiacutedeas mantidas em meio
de cultura cujos volumes testados eram de 25 50 75 e
100 mL Portanto verifica-se que eacute muito importante
selecionar material com bom estado fisioloacutegico e
tamanho homogecircneo para se obter melhores
resultados na proliferaccedilatildeo das brotaccedilotildees eou na
morfogecircnese
Proliferaccedilatildeo in vitro de brotos de curauaacute 105
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 102-106 2006
FIGURA 2 ndash Brotaccedilotildees de curauaacute (Ananas erectifolius) produzidas in vitro em diferentes volumes de meio MS 1-Repicagem dos brotos 2- 10 mL de meio MS 3- 15 mL de meio MS 4- 20 mL de meio MS 5- 25 mL de meio MS 6- 30mL de meio MS
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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GRATTAPAGLIA D MACHADO M A MicropropagaccedilatildeoIn TORRES A C CALDAS L S (Ed) Cultura de tecidos etransformaccedilatildeo geneacutetica de plantas Brasiacutelia EMBRAPA-SPIEMBRAPA-CNPH 1998 p 183-260
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NICOLOSO F T ERIG A C Efeito do tipo de segmentonodal e tamanho do recipiente no crescimento de plantasde Pfaffia glomerata in vitro Ciecircncia e AgrotecnologiaLavras v 26 p 1499-1506 dez 2002 Ediccedilatildeo especial
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SILVA C Paiacutes pesquisa mais fibras naturais para carrosDisponiacutevel em lthttpwwwsebrae_sccombrn o v o s _ d e s t a q u e s o p o r t u n i d a d e mostra_mateacuteriaaspcd_noticia=8356gt Acesso em out 2004
SCHREIBER V (Org) Vias de desenvolvimentosustentaacutevel as dimensotildees do desafio Beleacutem UFBANUMAPOEMAIDESP 1998 495 p (POEMA 6)
NORMAS PARA PUBLICACcedilAtildeO DE ARTIGOS E COMUNICACcedilOtildeES CIENTIacuteFICAS
1 Os conceitos e afirmaccedilotildees contidos nos artigos e comunicaccedilotildeesseratildeo de inteira responsabilidade do(s) autor(es)
2 A revista ldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquo editadasemestralmente pela Editora da Universidade Federal de Lavras(Editora UFLA) publica artigos cientiacuteficos e comunicaccedilotildeescientiacuteficas da aacuterea de cultura de tecidos de plantas elaboradospor membros da comunidade cientiacutefica nacional e internacionalNatildeo eacute cobrada taxa para publicaccedilatildeo de trabalhos Eacute condiccedilatildeofundamental que os artigoscomunicaccedilotildees submetidos agrave apreciaccedilatildeoda revista ldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquo natildeo forame nem seratildeo publicados simultaneamente em outro lugar Com aaceitaccedilatildeo do artigo para publicaccedilatildeo os editores adquirem amplose exclusivos direitos sobre o artigo para todas as liacutenguas e paiacutesesA publicaccedilatildeo de artigoscomunicaccedilotildees dependeraacute da observacircnciadas Normas Editoriais dos pareceres do Corpo Editorial e daComissatildeo ad hoc Todos os pareceres tecircm caraacuteter sigiloso eimparcial e tanto os autores quanto os membros do CorpoEditorial eou Comissatildeo ad hoc natildeo obtecircm informaccedilotildeesidentificadoras entre si
3 Os artigos e comunicaccedilotildees submetidos para publicaccedilatildeo deveratildeoser apresentados em CD utilizando-se o processador de textoMicrosoft Word for Windows (version 98 2000 XP ou 2003)ser escrito em liacutengua portuguesa inglesa ou espanhola e usarsomente nomenclaturas oficiais e abreviaturas consagradas natildeoempregando abreviaturas no tiacutetulo do artigo Juntamente com oCD deveratildeo ser enviadas 4 (QUATRO) vias sendo uma originale as demais coacutepias omitindo os autores e a chamada de rodapeacute daprimeira paacutegina (para serem enviadas aos consultores cientiacuteficos)impressas em papel branco tipo A4 (21cm x 297cm) ou emformulaacuterio contiacutenuo em uma soacute face espaccedilo duplo entre linhasfonte Times New Roman tamanho 12 observada uma margemde 3 cm para o lado esquerdo e de 2 cm para o direito 25 cm paramargem superior e inferior 25 cm para o cabeccedilalho e 25 cm parao rodapeacute Cada trabalho deveraacute ter no maacuteximo 14 paacuteginas ejunto do mesmo deveraacute ser encaminhado ofiacutecio dirigido ao EditorChefe da revista solicitando a publicaccedilatildeo do artigo Esse ofiacuteciodeveraacute ser assinado por todos os autores constar o endereccedilocompleto telefone e e-mail de todos Qualquer inclusatildeo exclusatildeoou alteraccedilatildeo na ordem dos autores deveraacute ser notificada medianteofiacutecio assinado por todos os autores (inclusive do autor excluiacutedo)
4 O artigo cientiacutefico deveraacute conter os seguintes toacutepicos a)TIacuteTULO suficientemente claro conciso e completo evitandopalavras supeacuterfluas Recomenda-se comeccedilar pelo termo querepresente o aspecto mais importante do trabalho com os demais
termos em ordem decrescente de importacircncia b) TIacuteTULO EMINGLEcircS c) NOME(s) DO(s) AUTOR(es) no maacuteximo 6 (seis)em letras maiuacutesculas um apoacutes o outro centralizados e no rodapeacuteda primeira paacutegina deveratildeo vir a formaccedilatildeo acadecircmica e aInstituiccedilatildeo onde trabalham d) RESUMO (de acordo comNBR6028 da ABNT) O resumo natildeo deve ultrapassar a 250(duzentos e cinquumlenta) palavras e natildeo possuir paraacutegrafos Apoacuteso Resumo devem-se incluir TERMOS PARA INDEXACcedilAtildeO(palavraschave) diferentes daqueles constantes do tiacutetulo eseparados por viacutergula Os termos para indexaccedilatildeo devem estardescritos na forma maiuacutescula e minuacutescula serem expressotildees queidentifiquem o conteuacutedo do artigo ser indicadas entre 3 e 5 e sepossiacutevel extraiacutedas do vocabulaacuterio Thesagro ndash Thesaurus AgriacutecolaNacional desenvolvido pela CENAGRI (indicaccedilatildeo da revistaldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquopara evitar o usode vaacuterios sinocircnimos como termos de indexaccedilatildeo) Se natildeo foremencontrados descritores disponiacuteveis para cobrirem a temaacutetica doartigo poderatildeo ser indicados termos ou expressotildees de usoconhecido e) ABSTRACT incluindo em seguida INDEXTERMS f) INTRODUCcedilAtildeO (incluindo a revisatildeo de literatura)g) MATERIAL E MEacuteTODOS h) RESULTADOS EDISCUSSAtildeO (podendo conter tabelas e figuras) i)CONCLUSOtildeES e j) REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
5 A comunicaccedilatildeo deveraacute conter os seguintes toacutepicos a)TIacuteTULO suficientemente claro conciso e completo evitandopalavras supeacuterfluas Recomenda-se comeccedilar pelo termo querepresente o aspecto mais importante do trabalho com os demaistermos em ordem decrescente de importacircncia Deve serapresentada a versatildeo do tiacutetulo para o idioma inglecircs b) TIacuteTULOEM INGLEcircS c) NOME(s) DO(s) AUTOR(es) no maacuteximo 6(seis) em letras maiuacutesculas um apoacutes o outro centralizados e norodapeacute da primeira paacutegina deveratildeo vir a formaccedilatildeo acadecircmica e aInstituiccedilatildeo onde trabalham d) RESUMO (de acordo comNBR6028 da ABNT) O resumo natildeo deve ultrapassar a 250(duzentos cinquumlenta) palavras e natildeo possuir paraacutegrafos Apoacutes oResumo devem-se incluir TERMOS PARA INDEXACcedilAtildeO(palavras-chave) diferentes daqueles constantes do tiacutetulo eseparados por viacutergula Os termos para indexaccedilatildeo devem estardescritos na forma maiuacutescula e minuacutescula serem expressotildees queidentifiquem o conteuacutedo do artigo ser indicadas entre 3 e 5 e)ABSTRACT incluindo em seguida INDEX TERMS f)TEXTO [sem subdivisatildeo poreacutem com introduccedilatildeo material emeacutetodos resultados e discussatildeo e conclusatildeo subtendidos(podendo conter tabelas ou figuras)] e g) REFEREcircNCIASBIBLIOGRAacuteFICAS
6 AGRADECIMENTOS ao fim do texto e antes das ReferecircnciasBibliograacuteficas poderatildeo vir os agradecimentos a pessoas ouinstituiccedilotildees O estilo tambeacutem aqui deve ser soacutebrio e claroindicando as razotildees pelas quais se fazem os agradecimentos
7 TABELAS E QUADROS deveratildeo ser inseridos apoacutes citaccedilatildeodos mesmos dentro do proacuteprio texto
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS as referecircnciasbibliograacuteficas devem ser citadas conforme a NBR60232002 daABNTA exatidatildeo das referecircncias constantes da listagem e a corretacitaccedilatildeo no texto satildeo de responsabilidade do(s) autor(es) doartigo
Orientaccedilotildees gerais- Deve-se apresentar todos os autores do documento cientiacutefico(fonte)- O nome do perioacutedico deve ser descrito por extenso natildeo deveser abreviado- Em todas as referecircncias deve-se apresentar o local de publicaccedilatildeo(cidade) a ser descrito no lugar adequado para cada tipo dedocumento- As referecircncias devem ser ordenadas alfabeticamente
EXEMPLIFICACcedilAtildeO (TIPOS MAIS COMUNS)
ARTIGO DE PERIOacuteDICO
VIEIRA R F RESENDE M A V de Eacutepocas de plantio deervilha em Patos de Minas Uberaba e Janauacuteba Minas GeraisCiecircncia e Agrotecnologia Lavras v 24 n 1 p 74-80 janmar 2000
LIVRO
a) Livro no todo
STEEL R G D TORRIE J H Principles and procedures ofstatistics New York McGraw-Hill Book l960 481 p
b) Parte de livro com autoria especiacutefica
FLEURY J A Anaacutelise ao niacutevel de empresa dos impactos daautomaccedilatildeo sobre a organizaccedilatildeo da produccedilatildeo de trabalho InSOARES R M S M Gestatildeo da empresa Brasiacutelia IPEAIPLAN 1980 p 149-159
c) Parte de livro sem autoria especiacutefica
MARTIM L C T Nutriccedilatildeo de bovino de corte em confinamentoIn ______ Confinamento de bovino de corte 2 ed Satildeo PauloNobel 1986 cap 3 p 29-89
DISSERTACcedilAtildeO E TESE
GONCcedilALVES R A Preservaccedilatildeo da qualidade tecnoloacutegicade trigo (Triticum aestivum L) e controle de Rhyzoperthadominica (F) durante o armazenamento em atmosferacontrolada com Co2 e N2 1997 52 f Dissertaccedilatildeo (Mestradoem Ciecircncia dos Alimentos) ndash Universidade Federal de LavrasLavras 1997
MATIOLI G P Influecircncia do leite proveniente de vacasmastiacuteticas no rendimento de queijo frescal 2000 55 pDissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncias dos Alimentos) - UniversidadeFederal de Lavras Lavras 2000
Nota ldquoA folha eacute composta de duas paacuteginas anverso e versoAlguns trabalhos como teses e dissertaccedilotildees satildeo impressos apenasno anverso e neste caso indica-se frdquo (ABNT NBR60232002p 18)
TRABALHOS DE CONGRESSO E OUTROS EVENTOS
SILVA J N M Possibilidades de produccedilatildeo sustentada de madeiraem floresta densa de terra firme da Amazocircnia brasileira InCONGRESSO FLORESTAL BRASILEIRO 6 1990 Campos doJordatildeo Anais Campos do Jordatildeo SBSSBEF 1990 p 39-45
DOCUMENTOS ELETROcircNICOS
As obras consultadas online satildeo referenciadas conformenormas especiacuteficas para cada tipo de documento (monografia notodo e em parte trabalho apresentado em evento artigo deperioacutedico artigo de jornal etc) acrescidas de informaccedilotildees sobreo endereccedilo eletrocircnico apresentado entre braquetes (lt gt)precedido da expressatildeo ldquoDisponiacutevel emrdquo e da data de acessoao documento precedida da expressatildeo ldquoAcesso emrdquo
Nota ldquoNatildeo se recomenda referenciar material eletrocircnico de curtaduraccedilatildeo nas redesrdquo (ABNT NBR60232000 p 4) Segundopadrotildees internacionais a divisatildeo de endereccedilo eletrocircnico no fimda linha deve ocorrer sempre apoacutes barra ()
Monografia (acesso online)
a) Livro no todo
TAKAHASHI T (Coord) Tecnologia em foco BrasiacuteliaSocinfoMCT 2000 90 p Disponiacutevel em lthttpwwwsocinfoorgbrgt Acesso em 22 ago 2000
b) parte de livro
TAKAHASHI T Mercado trabalho e oportunidades In ______Sociedade da informaccedilatildeo no Brasil livro verde BrasiacuteliaSocinfoMCT 2000 cap 2 p 13-24 Disponiacutevel em lthttpwwwsocinfogovbrgt Acesso em 22 ago 2000
c) Parte de congresso seminaacuterio etc
GIESBRECHT H O Avaliaccedilatildeo de desempenho de institutos depesquisa tecnoloacutegica a experiecircncia de projeto excelecircncia napesquisa tecnoloacutegica In CONGRESSO ABIPTI 2000Fortaleza Gestatildeo de institutos de pesquisa tecnoloacutegicaFortaleza Nutec 2000 Disponiacutevel em lthttpwwwabiptiorgbrgt Acesso em 01 dez 2000
d) Tese
SILVA E M Arbitrariedade do signo a liacutengua brasileira desinais (LIBRAS) 1997 144 p Dissertaccedilatildeo (Mestrado emLinguumliacutestica Aplicada e Estudo de Liacutengua) - Pontifiacutecia UniversidadeCatoacutelica de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 1997 Disponiacutevel em lthttpwwwterracombrvirtualbooks freebookportdid teseshtmgtAcesso em 28 nov 2000
Artigo de perioacutedico (acesso online)
RESENDE A M G Hipertexto tramas e trilhas de um conceitocontemporacircneo Informaccedilatildeo e Sociedade Recife v 10 n 12000 Seccedilatildeo Educaccedilatildeo Disponiacutevel em lthttpwwwinformaccedilatildeoesociedadeufpbbrgt Acesso em 30 nov 2000
CITACcedilAtildeO PELO SISTEMA ALFABEacuteTICO (AUTOR-DATA)(conforme ABNT NBR105202002)Dois autores - Steel amp Torrie (1960) ou (STEEL amp TORRIE1960)Trecircs ou mais autores - Valle et al (l945) ou (VALLE et al 1945)Obs Quando forem citados dois autores de uma mesma obradeve-se separaacute-los pelo sinal amp (comercial)
9 CASO O ARTIGO CONTENHA FOTOGRAFIASGRAacuteFICOS FIGURAS SIacuteMBOLOS E FOacuteRMULASESSAS DEVERAtildeO OBEDECER AgraveS SEGUINTESNORMAS
91 Fotografias deveratildeo ser apresentadas em preto e branconiacutetidas e com contraste inseridas no texto apoacutes a citaccedilatildeo dasmesmas e tambeacutem em um arquivo agrave parte salvas em extensatildeoldquoTIFFrdquo ou ldquoJPEGrdquo com resoluccedilatildeo de 300 dpi
92 Figuras deveratildeo ser apresentadas em preto e branco niacutetidase com contraste inseridas no texto apoacutes a citaccedilatildeo das mesmas etambeacutem em um arquivo agrave parte salvas em extensatildeo ldquoTIFFrdquo ouldquoJPEGrdquo com resoluccedilatildeo de 300 dpi As figuras deveratildeo serelaboradas com letra Times New Roman tamanho 10 semnegrito sem caixa de textos e agrupadas
93 Graacuteficos deveratildeo ser inseridos apoacutes citaccedilatildeo dos mesmosdentro do proacuteprio texto elaborado preferencialmente em Excelcom letra Times New Roman tamanho 10 sem negrito
94 Siacutembolos e Foacutermulas Quiacutemicas deveratildeo ser feitas emprocessador que possibilite a formataccedilatildeo para o programa PageMaker (ex MathType Equation) sem perda de suas formasoriginais
10 O Editor Chefe notificaraacute o autor do recebimento do originale posteriormente o informaraacute sobre sua publicaccedilatildeo Os artigosque necessitarem de modificaccedilotildees seratildeo devolvidos ao autor paraa devida revisatildeo
11 Os artigos natildeo aprovados seratildeo devolvidos
12 Os artigos seratildeo publicados em ordem de aprovaccedilatildeo
13 O natildeo-cumprimento dessas normas implicaraacute na devoluccedilatildeodo artigo ao autor
14 Os casos omissos seratildeo resolvidos pela Comissatildeo Editorial
15 O artigo deveraacute ser enviado para
ABCTPPlant Cell Culture amp MicropropagationUniversidade Federal de LavrasDepartamento de Biologia - Setor de Fisiologia VegetalCaixa Postal 3037Lavras ndash MGCEP 37200-000E-mail abctpuflabr
INSTRUCTIONS FOR AUTHORS
1 Concepts and affirmations included in articles andcommunications are of the entire responsibility of the authors
2 ldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquo a semestral journaledited by Editora UFLA of the Universidade Federal de Lavraspublishes scientific articles and communications in the area ofplant tissue culture elaborated by researchers of the national andinternational scientific community There are no page charges forpublication Submission of a manuscript implies that it is neitherunder consideration for publication elsewhere nor has appearedpreviously in part or in whole On acceptance for publicationauthors assign to the Editors full copyright of the manuscript inall languages and countries Publications will depend on editorialrules and on the review of experts and ad hoc commissionReviewer and editorial opinions will be anonymouslycommunicated to authors
3 The articles and communication submitted for publicationmust be presented in CD using the program Microsoft Wordfor Windows (version 98 2000 XP or 2003) written inPortuguese English or Spanish using only conventionalnomenclature At the time of submission authors are requiredto submit together with the CD 4 (four) hard copies one originaland three copies without the name(s) of the author(s) as well asthe footnote on the first page (to be used by the reviewers)printed on A4 white paper (21 cm x 297cm) or on continuousform typewritten only on one side double spaced using fontTimes New Roman size 12 with a 3 cm margin on the left handside and 20 cm margin on the right hand side 25 cm upper andlower margin 25 cm for the heading and 25 cm for the footnoteThe manuscript must present a maximum of 14 pages At thetime of submission a cover letter must be sent with themanuscript copies to the Editor requesting publication of thearticle This cover letter must be signed by all authors andalso contain the full address telephone number and e-mail ofthe authors Any inclusion exclusion or alteration in the authorsorder must be notified and signed by all authors including theone excluded
4 Each manuscript must be organized in a) TITLE sufficientlyclear conspicuous and complete without superfluous words Itis recommended to initiate with the term that represent the mostimportant aspect with other terms in decreasing of importanceb) TITLE in Portuguese c) FULL NAME(s) OF THEAUTHOR(s) maximum of 6 (six) in capital letters one after theother in the center of the page with the footnote of the first pagecontaining their professional qualification or academic training
and their work institution d) ABSTRACT written continuouslywithout paragraph It must not exceed 250 words Index termsmust be enclosed after the abstract using terms different fromthose used in the title and separated by comma The index terms(3 to 5) must be described in capital and small letters and expressthe content of the article e) ABSTRACT and INDEX TERMSin Portuguese f) INTRODUCTION (including literaturereview) g) MATERIAL AND METHODS h) RESULTS ANDDISCUSSION (it may include tables and figures) i)CONCLUSIONS and j) REFERENCES
5 Communication must have the following topics a) TITLEsufficiently clear conspicuous and complete without superfluouswords It is recommended to initiate with the term that representthe most important aspect with other terms in decreasing ofimportance The PORTUGUESE version of the title has to bepresented b) TITLE in Portuguese c) FULL NAME(s) OFTHE AUTHOR(s) maximum of 6 (six) in capital letters oneafter the other in the center of the page with the footnote of thefirst page containing their professional qualification or academictraining and their work institution d) ABSTRACT writtencontinuously without paragraph It must not exceed 250 wordsIndex terms must be enclosed after the abstract using termsdifferent from those used in the title and separated by commaThe index terms (3 to 5) must be described in capital and smallletters and express the content of the article e) ABSTRACTand INDEX TERMS in Portuguese f) TEXT (with no divisionbut must include introduction material and methods results anddiscussion and conclusion (it may include tables and figures) andg)REFERENCES
6 ACKNOWLEDGEMENTS Acknowledgements to peopleor institutions might be included at the end of the text priorReferences The written style must be serious and clear indicatingthe reasons of the acknowledgements made
7 TABLES AND FIGURES must be included right after theircitation in the text
8 REFERENCES references must be cited according toNBR60232002 of ABNT All references and their correct citationin the text are of the entire responsibility of the author(s)- Some important orientations all authors of the scientificdocument must be presented (source) the journal must be citedusing its full name all references must present the name of thecity where the journal was published all references must be citedalphabetically
9 PHOTOGRAPHS GRAPHS FIGURES SYMBOLS ORFORMULA CONTAINED IN THE ARTICLE SHOULDOBEY THE FOLLOWING RULES
91 Photographs must be presented in black and whiteclear and with contrast inserted in the text after their citationand also in a separate file (on the same diskette as the article)saved in extension ldquoTIFFrdquo or ldquoJPEGrdquo with resolution of300 dpi
92 Figures must be presented in black and white clear andwith contrast inserted in the text after their citation and also in aseparate file (on the same diskette as the article) saved inextension ldquoTIFFrdquo or ldquoJPEGrdquo with resolution of 300 dpiThey must be elaborated using Times New Roman font size10 without bold without text box and arranged
93 Graphs must be inserted in the text after their citationelaborated preferentially in Excel using Times New Romanfont size 10 without bold
94 Symbols and Chemical Formula must be presented usinga word processor that permits a format for Page Maker (exMathType Equation) without loss of its original form
10 The Brazilian Association of Plant Tissue Culture (ABCTP)will inform the author the receipt of the original manuscript andeventually it will also send information regarding its publicationManuscripts that require modifications will be returned to theauthor for the respective revision andcorrections
11 Manuscripts not approved will be returned to the author
12 Articles will be published according to the order of receiptand approval
13 If any of these rules are not attended the manuscript will bereturned to the author
14 Manuscripts should be sent to the following address
ABCTPPlant Cell Culture amp MicropropagationUniversidade Federal de LavrasDepartamento de Biologia - Setor de Fisiologia VegetalCaixa Postal 3037Lavras ndash MGCEP 37200-000BrazilE-mail abctpuflabr
SECRETARIACr ist iano Mar t inot t o ndash UFLA
Daiane Peixot o Var gas ndash UFLA
EDI TORES ASSOCI ADOSEnio Luiz Pedrotti - UFSC
Fr ancisco de Assis Paiva Campos - UFCGilber t o Bar bant e Ker bauy - USP
J oatildeo Bat ist a Teixeir a - EMBRAPA Recur sos Geneacutet icos e Biot ecnologiaJ oseacute Ant ocircnio Pet er s - UFPEL
Kasumit su Mat sumot o- EMBRAPA Recur sos Geneacutet icos e Biot ecnologiaLilia Gomes Willadino - UFRPE
Linda St yer Caldas - UNBLuciana Ribas - UFPR
Magdi Ahmed I br ahim Alouf a - UFRNMar guer it e Ger maine Ghislaine Quoir in- UFPR
Miguel Pedr o Guer r a - UFSCMiklos Gaacutebor Faacuter i ndash Univer sidade de Debr ecen ndash Ungr ia
Otto Jesu Crocomo ndash ESALQ - USPRenat o de Oliveir a Resende - UNB
Schuyler Kor ban ndash Univer sidade de I llinois - Est ados UnidosSilvio Lopes Teixeira - UENF
Ter ezinha Rangel Camar a ndash UFRPEWagner Apar ecido Vendr ame ndash Univer sidade da Floacuter ida ndash Est ados Unidos
Wagner Campos Ot oni ndash UFV
CONSULTORI A CI ENTIacute FI CA (Vol 2 N 2)Alexandr e Hof f mann ndash EMBRAPA Uva e VinhoAlexandr e Mor ais do Amar al ndash EMBRAPA-I AC
Aloisio Xavier ndash UFVAnt ocircnio Chalf un J unior ndash UFLA
Eur ico Eduar do Pint o de Lemos ndash UFALEvar ist o Maur o de Cast r o ndash UFLAGilber t o Bar bant e Ker bauy ndash USP
J oatildeo Bat ist a Teixeir a ndash EMBRAPA Cenar gemJoseacute Raniere F Santana ndash UEFS
Luiz Ant ocircnio Biasi ndash UFPRMiguel Pedr o Guer r a ndash UFSC
Osmar Alves Lameir a ndash EMBRAPA Amazocircnia Or ient alOt t o J esu Cr ocomo ndash ESALQ USP
Ricar do Tadeu de Far ia ndash UELWagner Campos Ot oni ndash UFV
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-106 2006
Plant Cell Culture amp Micropropagation
ISSN 1808-9909
CONTEUacuteDO
01 In vitro propagation of Melissa officinalis L and production of essential oil In vitro propagation of Melissa officinalis L and production of essential oil Simone da Silva Celso Luiz Salgueiro Lage Maria Apparecida Esquibel Rosane Aguiar da Silva San Gil Alice Sato
53
02 Crescimento in vitro de Laelia tenebrosa (ORCHIDACEAE) em diferentes concentraccedilotildees de sais de Knudson C e carvatildeo ativado In vitro growth of Laelia tenebrosa (ORCHIDACEAE) in different concentrations of Knudson C salts and activated charcoal Aparecida Gomes de Araujo Moacir Pasqual Alba Regina Pereira Herminio Souza Rocha 61
03 Propagaccedilatildeo in vitro de placircntulas de orquiacutedea em diferentes meios de cultura e concentraccedilotildees de citocinina In vitro propagation of orchid plantlets cultivated in different culture media and cytokinin concentrations Aparecida Gomes de Araujo Moacir Pasqual Adriano Bortolotti da Silva Fabiacuteola Villa Hermiacutenio Souza Rocha Fernanda Carvalho Costa 68
04 Efeito do viacuterus das estrias da bananeira na micropropagaccedilatildeo e no crescimento das plantas da cultivar caipira durante a aclimatizaccedilatildeo Effect of banana streak virus on micropropagation and plant growth of cultivar caipira during acclimatization Daniela Garcia Silveira Antocircnio da Silva Souza Paulo Ernesto Meissner Filho Tales Miler Soares Ranulfo Correa Caldas Kaacutetia Regina Barbosa Leatildeo 74
05 Caracteriacutesticas morfofisioloacutegicas de brotaccedilotildees de Agapanthus umbellatus var minor multiplicadas em biorreator de imersatildeo temporaacuteria Morphological and physiological characteristics Agapanthus umbellatus var minor of shoots propagated in bioreactor of temporary immersion Luciana Alves Fogaccedila Denilson Dortzbach Antonio Carlos Alves Enio Luiz Pedrotti 80 06 Capacidade de regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro cultivar Santa Clara In vitro regeneration capacity of tomato plant cultivar Santa Clara Glaucia de Fatima Moreira Vieira e Souza Joseacute Magno Queiroz Luz Alcione Silva Arruda Denise Garcia Santana Mariana de Souza e Silva da Costa Teixeira Luciana Londe Adelaide Siqueira Silva Elisacircngela Rodrigues Figueira 88
07 Induccedilatildeo de calos a partir de cultura de anteras de cafeeiro (Coffea arabica L) cv Catuaiacute Vermelho 99 e 44 Callus induction from anther culture of coffee plant (Coffea arabica L) cv Catuaiacute Vermelho 99 and 44 Adelaide Siqueira Silva Joseacute Magno Queiroz Luz Denise Garcia Santana Patriacutecia Crystie Vieira Mustafa Moacir Pasqual Glaucia de Fatima Moreira Vieira e Souza 94
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-106 2006
Plant Cell Culture amp Micropropagation
ISSN 1808-9909
COMUNICACcedilAtildeO CIENTIacuteFICA
08 Proliferaccedilatildeo in vitro de brotos de Curauaacute utilizando diferentes volumes de meio de cultura In vitro shoot proliferation of Ananas erectifolius using different volumes of culture medium Flaacutevia Dioniacutesio Pereira Joseacute Eduardo Brasil Pereira Pinto Helen Cristina de Arruda Rodrigues Luciana Domiciano Silva Rosado Luiz Alberto Beijo Osmar Alves Lameira 102
In vitro propagation of Melissa officinalis L and production 53
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
IN VITRO PROPAGATION OF Melissa officinalis L AND PRODUCTIONOF ESSENTIAL OIL
IN VITRO PROPAGATION OF Melissa officinalis L AND PRODUCTION OFESSENTIAL OIL
SIMONE DA SILVA1 CELSO LUIZ SALGUEIRO LAGE2 MARIA APPARECIDA ESQUIBEL3ROSANE AGUIAR DA SILVA SAN GIL4 ALICE SATO5
1Doutoranda em Biotecnologia Vegetal ndashUFRJIBC Chagas Filho ndash Av Brigadeiro Trompowsky SN Ccs ndash Bloco G ndash Sala G2-050 ndash Cidade Universitaacuteria ndash Laboratoacuterio de Fisiologia Vegetal ndash Ilha do Fundatildeo ndash 21949-900 ndash Rio de Janeiro RJ ndash monybiofufrjbr
2Dr em Biofiacutesica ndashUFRJ ndash Instituto de Biofiacutesica Carlos Chagas Filho ndash Laboratoacuterio de Fisiologia Vegetal ndash Ilha do Fundatildeo ndash 21949-900 ndash Rio de Janeiro RJ ndash clslagebiofufrjbr3Poacutes-Doutorado em Bioeletrogecircnese ndash UFRJ ndash Instituto de Biofiacutesica Carlos Chagas Filho ndash Laboratoacuterio de Fisiologia Vegetal ndash Ilha do Fundatildeo ndash 21949-900 ndash Rio de Janeiro RJ ndash esquibelbiofufrjbr4Dra em Quiacutemica Orgacircnica ndash Ufrj DQO ndash Edifiacutecio do Centro de Tecnologia ndash Bloco A ndash Sala 605 ndash Ilha do Fundatildeo ndash Cidade Universitaacuteria ndash Caixa Postal 068556 ndash 21941-972 ndash Rio de Janeiro RJ ndash rsangilIqufrjbr5Dra em Biotecnologia Vegetal ndash UNIRIODCN ndash Centro de Ciecircncias Bioloacutegicas e da Sauacutede ndash Av Pasteur 458 Preacutedio da ECB ndash 4ordmandar Sala 415 URCA ndash 22290-240 ndash Rio de Janeiro RJ ndash alicesatouniriobr
ABSTRACTThis work presents an efficient protocol for micropropagation
of Melissa officinalis L through axillary bud proliferation obtainedfrom in vitro germinated seeds on basal Murashige amp Skoog medium(MS) The explants were grown on MS supplemented with differentgrowth regulators NAA (05 mM) KIN (05 mM) BA (05 mM)GA
3 (28 microM) and IAA (05 mM) Higher shoot proliferation and
rooting rates were obtained on MS supplemented with 05 microM IAAMicropropagated plants were acclimatized and transferred to soilwith success The essential oil composition in shoots of in vitro andfield-grown (ex vitro) plants was determined by gas chromatographymass spectrometry The major components of essential oils detectedin both plant materials were pujone neral geraniol and geranial Mofficinalis in vitro plantlets developed on MS media showed 14higher proportions of nerol and 41 of geraniol when compared withfield grown plants
Index terms Growth regulators medicinal plant tissue culture
RESUMOEste trabalho apresenta um protocolo raacutepido e eficiente
para propagaccedilatildeo in vitro de Melissa officinalis L atraveacutes daproliferaccedilatildeo de gemas axilares de plantas obtidas de sementesgerminadas em meio basal de Murashige amp Skoog (MS) Os explantesforam cultivados em meio de Murashige amp Skoog (MS) 1962com adiccedilatildeo de diferentes reguladores de crescimento Aacutecido alfa-naftaleno-aceacutetico (ANA ndash 05 mM) Cinetina (KIN ndash 05 mM)Benziladenina (BA ndash 05 mM) Aacutecido Gibereacutelico (GA
3 ndash 28 microM)
e Aacutecido Indolaceacutetico (AIA ndash 05 mM) O alongamento e formaccedilatildeode segmentos nodais maacuteximos foram obtidos com AIA Explantesdesenvolveram 5 novos brotos com 10 cm em meacutedia e 100 deenraizamento em 30 dias de cultura Plantas micropropagadasforam aclimatadas e transferidas para o solo com sucesso Acomposiccedilatildeo do oacuteleo essencial de partes aeacutereas de plantas produzidasin vitro e plantas crescidas em campo (ex vitro) foi determinadapor cromatografia gasosa acoplada agrave espectrometria de massas Os
principais componentes do oacuteleo essencial encontrados em ambosos materiais vegetais foram a pujona neral geraniol e geranial Asplantas de Melissa officinalis desenvolvidas in vitro em MSapresentaram aumento de 14 vezes na proporccedilatildeo do nerol e de 41na de geraniol quando comparadas agraves plantas ex vitro
Termos para indexaccedilatildeo Reguladores de crescimento plantamedicinal cultura de tecidos
INTRODUCTION
Melissa officinalis L (Lamiaceae) is a well-known
herb used to give fragrance to different food and beverage
products It has also been used as a medicinal plant for
treatment of headaches gastrointestinal disorders
nervousness and rheumatism The essential oil is a well-
known antibacterial and antifungal agent and it is also
responsible for the mild depressive and spasmolytic
properties of the plant Literature data pointed out antioxidant
properties of methanolic extracts of Melissa officinalis which
are mostly due to high portion of phenolic acids revealing
significant antimicrobial particularly antibacterial activity of
this essential oil (MIMICA-DUKIC et al 2004)
The chemical composition of the essential oil of
Melissa officinalis leaf (02-1 on dry weight) has been
studied The major compounds (10-40) are citral (neral
and geranial) and these are accompanied by limonene
cineole geraniol szlig-caryophyllene and spathulenol The
(Recebido em 06 de setembro de 2005 e aprovado em 21 de junho de 2006)
SILVA S da et al54
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
leaf also contains polyphenolic compounds
hydroxycinnamic derivatives with verbascoside (53)
flavonoids such as luteolin 7-glucoside and luteolin 7-
diglucuronide (08) These compounds probably
intervene in the antispasmodic activity Iridoid glucosides
were also reported and the infusion contains potassium
(CARNAT et al 1999)
Cultivation of medicinal plants for the purpose of
extraction of active constituents may face certain limitations
such as climate season water availability diseases and
pests and scarcity of naturally growing plants Such
limitations led to the use of tissue culture techniques for
production of the active constituents Tissue culture
provides means of rapid propagation of a large number of
uniform plants while maintaining their genotype Beneficial
uses of tissue culture for the purpose of extraction of
secondary metabolites include avoidance of collection of
endangered wild species production of secondary
metabolites due to rapid growth of cultures in vitro
(ARIKAT et al 2004)
Due to the importance of this plant for multiple
purposes and the difficulty to produce active compounds
in vitro the application of methods that provide higher
number of cloned plants of M officinalis is justified aiming
to select high quality plant lines to extensive culture and
extraction of pharmaceutical products In Brazil M
officinalis is used in phytomedicine by pharmaceutical
industries One of the most critical problems of
phytomedicine is the natural variation of plants chemical
constituents (CURRIER et al 2000) This variation could
be originated from genetical factors or under influence of
environmental characteristics
The use of in vitro systems have been reported as
an effective tool for obtaining genetically uniform plants
which can be the source for less variable pharmaceutical
preparations Plant regeneration of M officinalis has been
achieved using as explants cotyledonary nodes of 10-day-
old Melissa officinalis seedlings (TAVARES et al 1996)
shoot tips from plants cultivated at greenhouse
(MEacuteSZAacuteROS et al 1999) using various types and
concentrations of cytokinins auxins and triacontanol
(TANTOS et al 1999)
The aim of this work is to develop a
micropropagation method in order to obtain a significant
number of monoclonal plants for further field cultivation
comparing the essential oil content and composition
between micropropagated and field-grown plants
MATERIALS AND METHODS
Plant material
Representative specimens from field grown plants
of M officinalis were selected and submitted to Erika Von
Sohsten Medeiros and Angela Vaz (Rio de Janeiro
Botanical Garden) for the taxonomic confirmation A
voucher nordm RB ndash 365926 is deposited at the Herbarium of
Rio de Janeiro Botanic Garden
Melissa officinalis seeds were obtained from
commercial market ISLAR batch Nordm 8250 The seeds were
germinated and grown to the seedling stage in vitro Seeds
were pre-treated by immersion into 2 commercial bleach
solution (Globoacirc) for 20 min and then rinsed thoroughly
in running tap water After that the seeds were surface
sterilized in 70 ethanol for 20 min followed by 15 min in a
20 commercial bleach solution containing 2-3 drops of
Tween 20 under aseptic conditions and rinsed three times
with sterile distilled water The seeds were cultured on MS
(MURASHIGE amp SKOOG 1962) solid medium
supplemented with 30 gL-1 sucrose 148 mM thiamine-
HCl 243 mM pyridoxine-HCl 41 mM nicotinic acid and
06 mM myo-inositol The pH value was adjusted at 58 plusmn
01 before addition of 8 gL-1 of agar and the media were
sterilized in autoclave (120 degC during 15 min) The cultures
were incubed at 25 plusmn 1 degC under a 16 h light 8 h dark
regime at an irradiance of 230 mmolm-sup2s-1 (white light
illumination Sylvaniaacirc fluorescent tubes)
Establishment of in vitro shoot cultures
From in vitro 8-day-old germinated seeds plants
(20-30 cm in length) of three different clones designated
In vitro propagation of Melissa officinalis L and production 55
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
as clones 1 2 e 3 were selected and axillary shoot induction
takes place from nodal segments (1 cm in length)
subcultivated on MS hormone-free media (MS0) These
materials were used as donors of explants to be tested
with different culture media 05mM a-naphthaleneacetic
acid (NAA) 05mM kinetin (KIN) 05mM benzyladenine
(BA) 28 mM gibberellic acid (GA3) and 05mM indole-3-
acetic acid (IAA) Cultures were grown in 300 mL glass
flasks containing 40 ml of media each
Shoot proliferation rate length of both shoots and
roots and calli formation were monitored as growth
parameters Each treatment was replicated 3 times using
100 explants per repetition Subcultures were performed at
30 days intervals
Acclimatization
A total of 60 in vitro rooted microshoots (those grown
on MS + IAA during 30 days with average height of 10 cm
were removed from the medium and the agar washed gently
with tap water They were transferred to 60 cm diameter
plastic pots containing soil and humus (31 vv) and kept at
a greenhouse High humidity environment was provide by
covering the plants with a plastic foil and watering them
one time per day during the first 2 weeks Then plants were
gradually exposed to greenhouse conditions for 1 month
and finally transferred to the field where they were cultivated
during one year until complete life cycle
Extraction
Field-grown and fresh in vitro plantlets aerial parts
(100 g each) were submitted to hydro distillation for 140 h
in a Clevenger type apparatus as recommended by the
Brazilian Pharmacopoeia (1988) in replicate (n = 2) The
time between the isolation and analysis was the same in all
experiments to preclude differences in composition due to
external factors (SILVA et al 2003)
Gas chromatographic and gas chromatography-massspectrometric analysis
Gas chromatography with flame ionization
detection (GCFID) was carried out on a Varian Star Model
3350 instrument using a capillary column coated with DB-
5 (30 m x 025 mm i d 025 mm film thickness J amp W
Scientific Folsom CA USA) The GC oven was heated
using the following program 40 oC to 220 oC at 4 oC min-1
with an initial isothermal period of 1 min splitless The
detector and injector temperatures were held at 280 oC
Hydrogen was used as carrier gas The injection consisted
of 10 microL of distilled oil diluted with hexane The GCMS
analyses were carried out on a Hewlett-Packard (Agilent
Technologies Avondale USA) Model 5972 MSD coupled
to a HP 5890 GC The GC conditions were the same as
above except for the fact that helium was used as carrier
gas The mass spectrometer was operated on electron
impact mode at 70 eV Molecular assignments were
performed with the help of the Wiley 275 standard library
of mass spectra literature data (ADAMS 1995) authentic
geraniol standard (Sigma Part Number G5135) and mass
spectra interpretation besides the comparison with
previously published elution order (KREIS amp MOSAND
1994) Quantification was performed from GC profiles using
area percent since in the literature the FID response factor
for most of monoterpenes is determined as 1 (CARNAT et
al 1999)
Statistical analysis
Data for each experiment were subjected to analysis
of variance (ANOVA) and means were compared using the
Tukey-Kramer test Percent data were submitted to
significance test ndash difference between two percentages
using the Statistica for WindowsTM 50 version A
significance level of 5 was used for all statistical analysis
RESULTS AND DISCUSSION
In vitro multiplication of Melissa officinalis was
followed during four developing cycles Micropropagation
papers usually present an efficient protocol evaluated in
only one developing cycle This kind of protocol however
may fail when the cultures have to be kept during long
time many successive subcultures being necessary in
order to produce large number of clonal plants
SILVA S da et al56
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
In vitro establishment
In this work three different clones of M officinalis
were used and they had shown similar development
responses on in vitro cultures
The clones 1 and 2 had in vitro multiplication rate
lower than the clone 3 which means a decrease in the
absolute number of nodal segments (Fig 1A and B) From
these results the clone 3 was selected to run the tests
The average number of four new nodes was
produced by explant on MS0 after 30 days and this value
was used as a control to evaluate effects of the presence
of growth regulators in the media (Tab 1)
FIGURE 1 ndash Nodal segments development of three clones of Melissa officinalis on MS+ 05 M IAA during 30 daysA) Multiplication rate of in vitro culture from 2nd to 4th subcultures B) Number of nodal segments developed per clone
TABLE 1 ndash Effect of growth regulators in Melissa officinalis axillary segments culture after four weeks of culture
Culture Media
Shoot Explant
xplusmnse
Shoot Length (CM)
Multiplication Rate (ndeg of
Nodal Segment Explant)
Node Plantlet
xplusmnse
Root Frequency
()
Root Number
Explant xplusmnse
Root Length
(CM) xplusmnse
MS0 171B 403 08B 68C 41 B 50 105 11B 30 06B
05 M KIN 111C 349 11C 33D 31 C 50 073 09C 27 07C
28 M GA3 111C 100 03D 22E 21 D 50 071 09C 25 07C
05 M IAA 191B 1000 09A 95B 51 A 100 897 08A 137 08A
05 M NAA
301A 333 16C 90A 31 C 0 0 - 05 M BA 111C 385 54C 33D 31 C 0 0 -
Value are means (x) plusmn standard error (se) n=100 Values in the same column followed by the same letter do not differstatistically at Pdrdquo005
The influence of plant growth regulators and their
interactions on micropropagation of different plant species
have been discussed in detail by Lameira et al (2005) Rout
et al (1989) Rout amp Das (1997ab) Skirvin et al (1990) and
Zieslin et al (1989)
In this work addition of IAA to MS presented the
best results among all tested growth regulators in all
evaluated parameters However to shoot production there
is no statistical difference to the control The analysis of
effects of the other growth regulators shows that only
05mM NAA was able to improve shoot production
although it is not able to promote rhizogenesis
In vitro propagation of Melissa officinalis L and production 57
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
The use of MS plus 05mM Kinetin or 05mM BA
or 05mM NAA promoted the development of three nodal
segments per elongated plant in 30 days culture (Tab
1) However when BA was used these new shoots
exhibited apical necrosis When GA3 (28 mM) was added
to medium there was induction of only one shoot per
explant and after 30 days there were 2 nodes per
elongated shoot
There was no rooting in explants placed on MS
added of NAA and BA In MS medium containing KIN or
GA3
and in basic MS 50 of the shoots developed new
roots in 30 days of culture
The best result of rhizogenesis was presented
by explants cultured in MS plus IAA where 100 of
shoots rooted with more than 8 new roots per explant
(Tab 1) In terms of root length the cultures in MS
supplemented with IAA presented longer roots when
compared with the other media compositions used at
the present work
In short the addition of 05mM of IAA was chosen
as that presenting the best results in all evaluated
parameters (Fig 2A)
The action of IAA on the in vitro plant
development was in accordance to the known effects of
such hormone (CLELAND 1995) Shoot elongation was
obtained concomitantly with rooting in media MS plus
05 mM IAA That is specially interesting once it may
reduce the micropropagation process through nodal
segments explants to only three steps germination
shoot elongation and multiplication concomitant to
rooting this represents gain of time culture medium
and constitutes a quick micropropagation process
Tavares et al (1996) reported a micropropagation
utilizing cotyledonary nodes as explants The highest
average number of shoots in the two inoculations was
obtained with 2 mgL-1 of BA 24 axillary shoots per
explant 7 in the first inoculation and 17 in the second
one Shoots of the two inoculations were excised after
30 and 60 days respectively
Acclimatization
Melissa officinalis leaves are very sensitive to
water loss and this process is irreversible it was necessary
to provide a high humidity environment during the first
acclimatization period plants were covered with a plastic
foil during 2 weeks before being gradually exposed to
greenhouse conditions The acclimatization procedure
used for in vitro plants was successful and a total of 100
survival rate (n=60) was obtained Acclimatized plants
appeared normal and did not exhibit any morphological
abnormalities or variations These results permitted the
soil cultivation (Fig 2B) without chemical defensives
during one year up to the complete vegetative cycle
(flowering)
Essential oils content
Comparative analysis of the chromatographic
profiles showed high percentage of neral and geranial in
relation to nerol and geraniol in field grown (ex vitro)
plantlets and in MS0 (in vitro)
The relative content of the principal components
of essential oil of the aerial parts of M officinalis are
presented as mean peaks area () on Fig 2C geranial
(3813 and 4364) neral (2674 and 317) geraniol (329 and
153) and nerol (116 and 187) in plants cultured ex vitro
and in vitro respectively Plantlets developed in vitro on
MS0 media showed an increase of 14 times in the
proportion of nerol and 41 times of geraniol when
compared with ex vitro cultured plants
Field plants are exposed to considerable more
stressful conditions such as lower relative humidity higher
light levels and herbivory those are the more stressful
The latter conditions tend to favor a greater essential oil
accumulation (TAVARES et al 2004) On other hand
plantlets grown in vitro have been continuously exposed
to a unique microenvironment that has been selected to
provide minimal stress and nearly optimal conditions for
plant multiplication
SILVA S da et al58
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
FIGURE 2 ndash A) In vitro culture of Melissa officinalis on MS + IAA in 30 days of culture B) Ex vitro culture six monthsafter transference to soil maximum height 60 cm C) Composition and percentage of the most abundant essential oilcomponents of Melissa officinalis from aerial parts (100 g Fresh Weight) from in vitro e ex vitro culture
In vitro propagation of Melissa officinalis L and production 59
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
CONCLUSIONS
Melissa officinalis micropropagation can be made
using nodal segments from in vitro plants during 5 weeks
in MS media without growth regulators and posterior
subculture in MS media with 05 mM IAA for a better
development Multiplication rates of 44 and 40 were
obtained at the 3rd and 4th subcultures respectively
It was observed a significant difference between
the effects of auxins IAA and NAA The latter exerted an
unsatisfactory influence on the nodal segment formation
shoot length and rooting when compared with the results
obtained with IAA
The plants produced in vitro were vigorous and
after acclimatization they were well adapted After 1 month
at the greenhouse the survival rate was 100
Considering that the main objective of this work is
to produce monoclonal plants to be used by phytomedicine
industries it is important that the method presents a large
number of buds per explant This result plus an efficient
acclimatization stage can save time and produce
monoclonal plants in sufficient number to be used in
commercial field culture Our results showed a change in
the essential oil composition in the proportion of active
compounds However the characteristics of the oil of in
vitro and ex vitro M officinalis plants were not altered
The manipulation of the culture media composition
is an important biotechnological tool for the optimization
of the essential oils production With this technique this
work developed a protocol for highly production of plants
and productivity in the components (geraniol geranial and
neral) of the oil
ACKNOWLEDGMENTS
This work was supported by ICUNIRIO FAPERJ
and CNPq
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Crescimento in vitro de Laelia tenebrosa (Orchidaceae) 61
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
CRESCIMENTO IN VITRO DE Laelia tenebrosa (ORCHIDACEAE)EM DIFERENTES CONCENTRACcedilOtildeES DE SAIS DE KNUDSON C
E CARVAtildeO ATIVADO
IN VITRO GROWTH OF Laelia tenebrosa (ORCHIDACEAE) IN DIFFERENTCONCENTRATIONS OF KNUDSON C SALTS AND ACTIVATED CHARCOAL
APARECIDA GOMES DE ARAUJO1 MOACIR PASQUAL2 ALBA REGINA PEREIRA3HERMINIO SOUZA ROCHA4
1Doutoranda em AgronomiaFitotecnia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash agaraujo2003yahoocombr2Dr Professor Titular do Departamento de Agricultura ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash LavrasMG ndash mpasqualuflabr3Doutoranda no Jardim Botacircnico do Rio de Janeiro ndash ENBTJBRJ ndash Pacheco Leatildeo 915 ndash 22460-030 ndash Rio de Janeiro RJ4Doutorando em AgronomiaFitopatologia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash herminiouflanetcombr
RESUMOObjetivou-se testar diferentes concentraccedilotildees de carvatildeo
ativado adicionado ao meio Knudson C no crescimento in vitrode orquiacutedeas Placircntulas de Laelia tenebrosa (LA Rolfe) LARolfe com 1 a 15 cm de comprimento e contendo raiacutezes foraminoculadas em frascos contendo 40 mL de meio de cultura Ostratamentos consistiram na combinaccedilatildeo de concentraccedilotildees de carvatildeoativado (0 05 10 20 e 40 g L-1) e sais minerais de Knudson C(0 50 100 150 e 200) acrescidos de sacarose (20 g L-1) Omeio foi solidificado com 6 g L-1de aacutegar e o pH ajustado para58plusmn01 antes da autoclavagem a 121degC e 11 atm por 20 minutosApoacutes a inoculaccedilatildeo os frascos foram mantidos sob 25 plusmn 1degCfotoperiacuteodo de 16 horas e 32 mM m-2 s-1 de irradiacircncia Apoacutes 150dias verificou-se que a adiccedilatildeo de 2g L-1 de carvatildeo ativado ao meiocom metade dos sais de Knudson C promoveu melhor crescimentoin vitro das placircntulas de Laelia tenebrosa
Termos para indexaccedilatildeo Orquiacutedea meio de cultura cultura detecidos
ABSTRACTThe objective of this work was to test the effect of
Knudson C medium supplemented with different concentrationsof activated charcoal on the in vitro growth of orchids Plantletsof the Laelia tenebrosa (LA Rolfe) LA Rolfe measuring 1-15cm in length containing roots were inoculated in flasks containing40 mL of culture medium The treatments consisted of differentconcentrations of activated charcoal (0 05 10 20 and 40 g L-
1) combined with Knudson C salts (0 50 100 150 and 200)supplemented with sucrose (20 g L-1) The medium was solidifiedwith agar (6 g L-1) and pH adjusted to 58plusmn01 before autoclavingat 121ordmC and 11 atm during 20 minutes After inoculation theexplants were transferred to culture rooms with temperaturemaintained at 25plusmn1ordmC during a 16 hours photoperiod with a lightintensity of 32 microM m-2s-1 The best in vitro growth rates of
Laelia tenebrosa plantlets were obtained using Knudson C 50supplemented with 2 g L-1 activated charcoal after 150 days ofculture
Index terms Orchid culture medium tissue culture
INTRODUCcedilAtildeO
A produccedilatildeo de orquiacutedeas a partir germinaccedilatildeo
assimbioacutetica eacute uma alternativa viaacutevel para obtenccedilatildeo de
grande nuacutemero de plantas em curto espaccedilo de tempo
suprindo assim a necessidade dos produtores de
orquiacutedeas na aquisiccedilatildeo de mudas
Na cultura de tecidos os meios de cultura
geralmente satildeo compostos de uma fonte de carboidratos
macro e micronutrientes e outras substacircncias como
vitaminas aminoaacutecidos accediluacutecares agente solidificante
reguladores de crescimento (GEORGE amp SHERRINGTON
1984) e eventualmente aditivos como antibioacuteticos carvatildeo
ativado e componentes complexos
Knudson (1922) observou que era possiacutevel o
cultivo de sementes em meio artificial contendo minerais e
accediluacutecar sem a presenccedila de fungos micorriacutezicos
Posteriormente em 1946 ele aperfeiccediloou esse meio de
cultura sendo atualmente o mais utilizado comercialmente
na germinaccedilatildeo e desenvolvimento de orquiacutedeas (ARDITTI
amp ERNST 1992) No entanto satildeo necessaacuterios estudos
(Recebido em 23 de fevereiro de 2006 e aprovado em 10 de julho de 2006)
supplemented with
ARAUJO A G de et al62
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
pois satildeo descritos vaacuterios meios de cultura para muitos
gecircneros e espeacutecies diferentes
No cultivo e subcultivo de placircntulas do gecircnero
Cattleya George et al (1987) sugerem o meio Knudson C
(1946) ou Reinert amp Mohr (1967) Segundo Arditti amp Ernst
(1992) os meios de propagaccedilatildeo para Cattleya Laelia
Laeliocattleya e Brassocattleya podem ser os mesmos
citados anteriormente Villalobos et al (1994) sugerem o
meio Vacin amp Went (1949) para Cattleya Encyclia e
Oncidium suplementado com 25 de aacutegua de coco e o
meio Knudson C suplementado com 60 g L-1 de polpa de
banana para orquiacutedeas do gecircnero Stanhopea
O carvatildeo ativado normalmente eacute adicionado ao meio
de cultura em concentraccedilotildees que variam de 02 a 3
(BEYL 2000) O seu efeito natildeo-seletivo pode proporcionar
resultados negativos na micropropagaccedilatildeo Pesquisas
relatam a adsorccedilatildeo de tiamina aacutecido nicotiacutenico
(WEATHERHEAD et al 1978) piridoxina aacutecido foacutelico
reguladores de crescimento e quelatos de ferro
(JOHANSSON et al 1990) Entre os efeitos proporcionados
pela adiccedilatildeo do carvatildeo ativado ao meio de cultura
principalmente agrave organogecircnese e agrave embriogecircnese estatildeo
escurecimento do meio de cultura favorecendo o
enraizamento adsorccedilatildeo de substacircncias inibitoacuterias
produzidas pelo proacuteprio meio ou explante adsorccedilatildeo de
reguladores de crescimento e outros compostos orgacircnicos
e liberaccedilatildeo de substacircncias naturalmente presentes no
carvatildeo que beneficiariam o crescimento in vitro das culturas
(PAN amp STADEN 1998)
Arena amp Pastur (2001) citam que a adiccedilatildeo de carvatildeo
ativado ao meio de cultura promoveu alongamento das
brotaccedilotildees de Berberis buxifolia mas reduziu o iacutendice de
multiplicaccedilatildeo Hazra et al (2002) relataram o efeito
sinergiacutestico do carvatildeo ativado na multiplicaccedilatildeo e
enraizamento de brotaccedilotildees de algodoeiro Amin amp Jaiswal
(1987) Anderson (1980) e Damiano (1978) relataram o efeito
favoraacutevel do carvatildeo quando utilizado em baixas
concentraccedilotildees no enraizamento de brotaccedilotildees de
morangueiro framboeseira e goiabeira respectivamente
A diversidade de resultados obtidos com a utilizaccedilatildeo de
carvatildeo ativado deve-se principalmente ao genoacutetipo da
espeacutecie em questatildeo agrave adsorccedilatildeo de algumas substacircncias
quiacutemicas e compostos orgacircnicos aleacutem de metaboacutelitos
toacutexicos liberados no cultivo in vitro (Wang amp Huang 1976)
Este trabalho teve como objetivo verificar efeito de
diferentes concentraccedilotildees de sais de Knudson C e carvatildeo
ativado sobre o crescimento in vitro de placircntulas de
orquiacutedea da espeacutecie Laelia tenebrosa (LA Rolfe) LA Rolfe
MATERIAL E MEacuteTODOS
Placircntulas da espeacutecie Laelia tenebrosa com 1 a 15
cm de comprimento oriundas de sementes germinadas in
vitro e contendo raiacutezes foram inoculadas em frascos
contendo 40 mL do meio de cultura Knudson C nas
concentraccedilotildees de 0 (apenas aacutegua destilada e aacutegar) 50 100
(concentraccedilatildeo da formulaccedilatildeo original) 150 e 200 de sais
minerais combinado com carvatildeo ativado (0 05 1 2 e 4
mg L-1) suplementado com sacarose (20 g L-1)
O pH do meio foi ajustado para 58 plusmn 01 antes da
adiccedilatildeo de aacutegar (6 g L-1) O meio foi vertido em frascos de
vidro com capacidade para 250 cm3 vedados com tampas
plaacutesticas transluacutecidas natildeo perfuradas e autoclavados agrave
pressatildeo de 11 atm e agrave temperatura do 121degC durante 20
minutos Apoacutes a inoculaccedilatildeo os frascos contendo os
explantes foram mantidos em sala de crescimento com
irradiacircncia em torno de 32 mmol m-2 s-1 temperatura de 25 plusmn
1degC e fotoperiacuteodo de 16 horas
O delineamento experimental utilizado foi
inteiramente casualizado em esquema fatorial 5 x 5 com
quatro repeticcedilotildees de cinco placircntulas cada uma Decorridos
150 dias avaliou-se a meacutedia do nuacutemero de folhas nuacutemero
de raiacutezes comprimento da maior raiz comprimento da parte
aeacuterea e massa fresca de placircntulas Os dados foram
comparados por meio de regressatildeo polinomial empregando-
se o programa Sisvar (FERREIRA 2000)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Apenas para a variaacutevel nuacutemero de folhas houve
interaccedilatildeo entre os niacuteveis de sais e carvatildeo ativado Poreacutem
Crescimento in vitro de Laelia tenebrosa (Orchidaceae) 63
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
por meio do teste F somente as concentraccedilotildees de 50 e
100 de sais do meio Knudson C foram significativas em
relaccedilatildeo agraves concentraccedilotildees de carvatildeo ativado
Os melhores resultados (65 e 585) foram
verificados com 50 (metade) dos sais de Knudson C
combinado com 275 g L-1 de carvatildeo ativado e 100 de
sais com 4 g L-1 de carvatildeo respectivamente (Figura 1)
Com o aumento da concentraccedilatildeo do meio de cultura haacute
necessidade de maior concentraccedilatildeo de carvatildeo Sendo
assim o meio com 50 de sais aleacutem de proporcionar
melhores resultados eacute menos oneroso
Estes resultados contradizem os de Silva et al
(2003) que verificaram que a adiccedilatildeo de carvatildeo ativado ao
FIGURA 1 ndash Nuacutemero de folhas em placircntulas de Laeliatenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees de saisde Knudson C e carvatildeo ativado
meio de cultura inibe a formaccedilatildeo de folhas em placircntulas de
Brassocattleya lsquoPastoralrsquo x Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo
O efeito natildeo seletivo do carvatildeo ativado pode proporcionar
resultados negativos na micropropagaccedilatildeo (PAN amp
STADEN 1998)
Agrave medida em que aumentaram as concentraccedilotildees de
sais de Knudson C maiores quantidades de raiacutezes foram
formadas (Figura 2A) Observou-se maior nuacutemero de raiz
(43) com 965 de sais Para o fator carvatildeo ativado as
melhores respostas (395 raiacutezes) foram verificadas com a
utilizaccedilatildeo de 304 g L-1 adicionadas ao meio de cultura
(Figura 2B)
Para muitas espeacutecies o enraizamento eacute favorecido
pela adiccedilatildeo de carvatildeo ativado ao meio de cultura Hazra et
al (2002) relataram o efeito sinergiacutestico do carvatildeo ativado
na multiplicaccedilatildeo e enraizamento de brotaccedilotildees de
algodoeiro O meio MS com metade dos sais minerais
acrescido de 20 g L-1 de sacarose 7 g L-1 de aacutegar e 1 g L-1 de
carvatildeo ativado promoveu maior quantidade de raiacutezes em
placircntulas de Cattleya nobilior Rchb f (REIS et al 2003)
Segundo Paiva et al (2005) aleacutem de um equiliacutebrio
hormonal favoraacutevel agrave formaccedilatildeo de raiacutezes outros fatores
internos tecircm sido relacionados com a iniciaccedilatildeo do processo
de enraizamento como presenccedila de sacarose alta relaccedilatildeo
CN e nutrientes minerais (foacutesforo caacutelcio zinco e boro) O
meio Knudson C natildeo possui micronutrientes apresenta
uma concentraccedilatildeo maior de caacutelcio e tem baixas
FIGURA 2 ndash Nuacutemero de raiacutezes em placircntulas de Laelia tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees de sais deKnudson C (A) e concentraccedilotildees de carvatildeo ativado (B)
ARAUJO A G de et al64
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
concentraccedilotildees de N e K em relaccedilatildeo ao MS e WPM o que
provavelmente favoreceu tanto o nuacutemero quanto o
comprimento de raiacutezes (PASQUAL 2001)
O maior comprimento de raiz (331 cm) foi verificado
com a utilizaccedilatildeo de 100 de sais de Knudson C A partir do
ponto maacuteximo (100) houve diminuiccedilatildeo do comprimento
radicular provavelmente devido ao desbalanccedilo nutricional
(Figura 3A) Com o aumento das concentraccedilotildees de carvatildeo
ativado houve um incremento linear no comprimento de
raiacutezes Melhores resultados foram observados com a
utilizaccedilatildeo de 4 g Lndash1 de carvatildeo ativado (Figura 3B) Como a
relaccedilatildeo foi direta pode-se inferir que o efeito estimulante
do carvatildeo ativado no comprimento da maior raiz continuaria
para concentraccedilotildees superiores a 4 g L-1
A adiccedilatildeo de carvatildeo ativado no meio de cultura foi
beneacutefica promovendo tanto o nuacutemero quanto o
crescimento de raiacutezes O carvatildeo conteacutem impurezas que
podem favorecer o crescimento de raiacutezes jaacute existentes e
induzir emissatildeo de novas raiacutezes (PASQUAL 2001)
Melhores resultados para comprimento da parte
aeacuterea (18 cm) foram observados quando se utilizou o
meio Knudson C na concentraccedilatildeo de 121 de sais (Figura
4A) poreacutem na concentraccedilatildeo de 50 obtiveram-se
explantes com 17 cm de comprimento Essa diferenccedila
observada (01 cm) eacute muito pequena o que natildeo justifica a
utilizaccedilatildeo de um meio mais concentrado mas a reduccedilatildeo
do mesmo agrave sua metade
O enraizamento in vitro pode ser favorecido com o
uso de meio de cultura com a metade ou 75 da
concentraccedilatildeo normal de sais Em algumas espeacutecies altas
concentraccedilotildees de sais principalmente a presenccedila de iacuteons
amocircnio favorecem o desenvolvimento de raiacutezes enquanto
que em outras podem ser inibidoras (PASQUAL et al
2001)
O maior comprimento da parte aeacuterea (19 cm) foi
obtido na presenccedila de 4 g Lndash1 de carvatildeo ativado (Figura
4B) a concentraccedilatildeo de 2 g Lndash1 proporcionou um
comprimento de 18 cm Comparando-se os niacuteveis 4 e 2 g Lndash1
de carvatildeo ativado nota-se pequena diferenccedila (01 cm) o
que justifica a utilizaccedilatildeo de 2 g Lndash1
O carvatildeo ativado conteacutem impurezas que quando
liberadas no meio de cultura podem beneficiar ou natildeo o
crescimento in vitro Simotildees et al (1999) verificaram que a
concentraccedilatildeo de 1 g L-1 de carvatildeo ativado acrescida ao
meio Knudson C proporciona o melhor desenvolvimento
de brotos de Epidendrum sp e Dendrobium sp
Maior massa fresca de placircntulas (0144g) foi
verificada com a utilizaccedilatildeo de 50 de sais de Knudson C
ponto a partir do qual houve diminuiccedilatildeo no peso (Figura
5A) Provavelmente essa reduccedilatildeo ocorreu devido agrave
toxidez
A utilizaccedilatildeo de 4 g L-1 de carvatildeo ativado
proporcionou uma massa de 0185 g nas placircntulas frescas
(Figura 5B)
FIGURA 3 ndash Comprimento da maior raiz em placircntulas de Laelia tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees desais de Knudson C (A) e carvatildeo ativado (B)
Crescimento in vitro de Laelia tenebrosa (Orchidaceae) 65
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
FIGURA 4 ndash Comprimento da parte aeacuterea em placircntulas de Laelia tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees desais de Knudson C (A) e carvatildeo ativado (B)
FIGURA 5 ndash Massa fresca de placircntulas de L tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees de sais de Knudson C(A) e carvatildeo ativado (B)
O carvatildeo ativado eacute comumente utilizado na cultura
de tecidos de plantas Seu efeito eacute atribuiacutedo agrave adsorccedilatildeo de
substacircncias toacutexicas produzidas pelas plantas adsorccedilatildeo
de fitorreguladores do meio e escurecimento do meio onde
se desenvolvem as raiacutezes das plantas (GEORGE 1993)
O melhor desenvolvimento de Phalaenopsis in
vitro ocorreu na presenccedila de carvatildeo ativado na
concentraccedilatildeo de 2 g L-1 indicando que este possa ser um
elemento importante no processo (BRESSAN et al 1999)
Apesar do carvatildeo ativado na concentraccedilatildeo de 4 g
L-1 ter proporcionado melhores resultados verificou-se que
na concentraccedilatildeo de 2 g L-1 os efeitos apresentam uma
diferenccedila miacutenima Embora o carvatildeo ativado natildeo seja o
componente de maior custo no preparo de meio de cultura
a sua reduccedilatildeo juntamente com os sais minerais eacute
economicamente favoraacutevel especialmente para a produccedilatildeo
comercial de mudas
CONCLUSAtildeO
A adiccedilatildeo de 2 g L-1 de carvatildeo ativado ao meio de
cultura Knudson C com metade (50) de sais minerais
promoveu melhor crescimento em placircntulas de Laelia
tenebrosa cultivadas in vitro
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PROPAGACcedilAtildeO IN VITRO DE PLAcircNTULAS DE ORQUIacuteDEA EMDIFERENTES MEIOS DE CULTURA E CONCENTRACcedilOtildeES
DE CITOCININA
IN VITRO PROPAGATION OF ORCHID PLANTLETS CULTIVATED IN DIFFERENTCULTURE MEDIA AND CYTOKININ CONCENTRATIONS
APARECIDA GOMES DE ARAUJO1 MOACIR PASQUAL2 ADRIANO BORTOLOTTI DA SILVA3 FABIacuteOLA VILLA3 HERMIacuteNIO SOUZA ROCHA3 FERNANDA CARVALHO COSTA4
1Doutoranda em AgronomiaFitotecnia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash agaraujo2003yahoocombr2Professor Titular Departamento AgriculturaDAG ndash Universidade Federal de Lavras UFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200000 ndash Lavras MG ndash mpasqualuflabr3Doutorando em Agronomia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200000 ndash Lavras MG4Departamento de AgriculturaDAG ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash fecostapuryahoocombr
RESUMOA taxa de multiplicaccedilatildeo de orquiacutedeas a partir de meacutetodos
convencionais eacute bastante baixa natildeo atendendo as necessidadescomerciais A cultura de tecidos permite maiores taxas demultiplicaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de plantas uniformes e sadiasObjetivou-se estudar a influecircncia da citocinina BAP (6-benzilaminopurina) em diferentes meios de cultura napropagaccedilatildeo in vitro de placircntulas hiacutebridas de BrassocattleyalsquoPastoralrsquox Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo Placircntulas comaproximadamente 15plusmn05 cm de comprimento obtidasassimbioticamente foram transferidas para frascos comcapacidade de 250 cm3 contendo 40 mL das formulaccedilotildees salinasde MS WPM e Knudson C combinados com 0 05 10 20 e40 mg L-1 de BAP acrescidos de 2 g L-1 de carvatildeo ativadosolidificado com 6 g L-1 de aacutegar e pH ajustado para 58plusmn01Apoacutes a inoculaccedilatildeo os frascos foram incubados a 25plusmn2oC 35igravemolm-2s-1 de intensidade luminosa e sob fotoperiacuteodo de 16horas Apoacutes 90 dias observou-se que melhores resultados parapropagaccedilatildeo in vitro em placircntulas de orquiacutedea Bc lsquoPastoralrsquo x LclsquoAmber Glowrsquo satildeo obtidos com o meio WPM A suplementaccedilatildeode 4 mg L-1 de BAP no meio WPM favorece o crescimento invitro Para a multiplicaccedilatildeo maior quantidade de brotos eacuteconseguida em meio MS na ausecircncia de BAP
Termos para indexaccedilatildeo Orquiacutedea crescimento in vitrocitocinina
ABSTRACTThe multiplication rate of orchids by conventional
methods is considerably low and does not attend its commercialneeds Tissue culture results in larger multiplication rates andproduces uniform and healthy orchid plantlets The objective ofthis work was to study the influence of the cytokinin BAP (6-benzilaminopurine) in different culture media for ther in vitropropagation of Brassocattleya lsquoPastoralrsquox Laeliocattleya lsquoAmberGlowrsquo hybrid plantlets Plantlets measuring approximately 15plusmn 05 cm length deriving from in vitro germination were inoculated
in flasks of 250 cm3 volume containing 40 mL MS WPM andKnudson C salt formulations combined with BAP (0 05 1 2and 4 mg L-1) supplemented with 2 g L-1 activated charcoalsolidified with 6 g L-1 agar and pH adjusted for 58 plusmn 01 Afterthe inoculation the plantlets maintained in a growth room at25plusmn2ordmC 35 mMol m-2 s-1 light intensity and 16 hoursphotoperiod After 90 days the best results for the in vitropropagation of orchid plantlets Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquowere obtained with half strength WPM The supplementation of4 mg L-1 BAP to the WPM medium favors in vitro growth Forthe multiplication phase the largest number of sprouts is achievedwith full strength MS medium in the absence of BAP
Index terms Orchid in vitro growth cytokinin
INTRODUCcedilAtildeO
As orquiacutedeas satildeo consideradas as plantas
ornamentais haacute mais tempo cultivadas pelo homem
Pertencem agrave famiacutelia Orchidaceae a maior entre as
monocotiledocircneas e tambeacutem entre as plantas ornamentais
com 600 - 800 gecircneros e 25000-35000 espeacutecies (SHEEHAN
1983) totalizando 7 das plantas ornamentais do mundo
(Van Der PIJL amp DODSON 1966)
A propagaccedilatildeo de orquiacutedeas pode ser tanto
vegetativa quanto por meio de sementes Estas embora
produzidas em grande quantidade natildeo possuem
endosperma funcional prescindindo para tanto da
associaccedilatildeo simbioacutetica com fungos micorriacutezicos dentre os
quais a Rhizoctonia que eacute um dos gecircneros mais importante
(PIERIK 1987 SHEEHAN 1983)
(Recebido em 08 de dezembro de 2005 e aprovado em 10 de julho de 2006)
Propagaccedilatildeo in vitro de placircntulas de orquiacutedea 69
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 68-73 2006
Knudson (1922) observou que era possiacutevel o cultivo
de sementes em meio artificial contendo apenas sais
nutritivos e accediluacutecar na ausecircncia de fungos Posteriormente
em 1946 o mesmo autor aperfeiccediloou este meio de cultura
sendo atualmente um dos mais utilizados comercialmente
na germinaccedilatildeo e desenvolvimento de orquiacutedeas (ARDITTI
amp ERNST 1992) No entanto satildeo necessaacuterios estudos
pois satildeo descritos vaacuterios meios de cultura para muitos
gecircneros e espeacutecies diferentes O meio de cultura mais
utilizado na cultura de tecidos em geral eacute o MS (Murashige
amp Skoog 1962) podendo-se encontrar o uso de outros
meios como Knudson C (1946) e WPM (Wood Plant
Medium) de Loyd amp McCown (1980)
Reguladores de crescimento em diferentes
concentraccedilotildees tecircm sido usados conforme a espeacutecie e a
metodologia utilizada Podem ser necessaacuterios para a
germinaccedilatildeo de sementes formaccedilatildeo de calos e brotaccedilotildees
adventiacutecias (GRATTAPAGLIA amp MACHADO 1998
PASQUAL 2001)
O regulador de crescimento BAP (6-
benzilaminopurina) eacute uma citocinina largamente utilizada
para estimular a induccedilatildeo de brotos em plantas ornamentais
Para o cultivo in vitro de orquiacutedeas do grupo Cattleya a
citocinina BAP geralmente eacute utilizada nas concentraccedilotildees
que variam entre 005 e 10 mg L-1 (CARVALHO 2002)
Martini et al (2001) trabalhando com a orquiacutedea
Gongora quinquenervis observaram que a presenccedila do
BAP inibe a multiplicaccedilatildeo de calos e o potencial
organogecircnico Silva (2003) concluiu que para o estaacutedio de
subcultivo de Brassocattleya lsquoPastoralrsquo x Laeliocattleya
lsquoAmber Glowrsquo natildeo haacute necessidade da adiccedilatildeo de BAP como
estiacutemulo ao desenvolvimento geral do explante Melhor
proliferaccedilatildeo de brotos formaccedilatildeo de raiacutezes nuacutemero de
folhas e comprimento de brotos em Dendrobium foram
obtidos com 25 mg L-1 de BAP + 05 mg L-1 de ANA
adicionados ao meio MS (TALUKDER et al 2003)
Aleacutem do tipo de meio outro aspecto importante na
multiplicaccedilatildeo in vitro estaacute relacionado com o tipo de
citocinina e sua concentraccedilatildeo sendo ambos determinantes
no sucesso da micropropagaccedilatildeo (GRATTAPAGLIA amp
MACHADO 1998)
O maior entrave no processo de micropropagaccedilatildeo
de orquiacutedeas estaacute relacionado ao tempo necessaacuterio para a
produccedilatildeo de mudas a partir de plantas hiacutebridas
selecionadas e a utilizaccedilatildeo de meio de cultura adequado
para cada espeacutecie Assim objetivou-se estudar o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de BAP e formulaccedilotildees de minerais
nutritivos em meios de cultura na propagaccedilatildeo in vitro de
placircntulas de orquiacutedea oriundas do hiacutebrido Brassocattleya
lsquoPastoralrsquo x Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo
MATERIAL E MEacuteTODOS
Placircntulas hiacutebridas oriundas de sementes
germinadas assimbioticamente em meio Knudson C
obtidas do cruzamento entre Brassocattleya lsquoPastoralrsquo x
Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo com aproximadamente
15plusmn05 cm de comprimento foram transferidas para frascos
de 250 cm3 de capacidade contendo 40 mL de meio de
cultura e vedados com tampas plaacutesticas transluacutecidas Os
tratamentos consistiram de diferentes formulaccedilotildees salinas
(MS WPM e Knudson C em suas formulaccedilotildees originais)
combinadas com 0 05 10 20 e 40 mg L-1 de BAP
acrescidos de 2 g L-1 de carvatildeo ativado solidificado com
6 g L-1 de aacutegar e pH ajustado para 58plusmn01 antes da
autoclavagem obtida a 121ordmC e 1 atm por 20 minutos
Posteriormente agrave inoculaccedilatildeo os frascos foram
transferidos para sala de crescimento com temperatura
de 25plusmn2ordmC fotoperiacuteodo de 16 horas e 35 mmolm-2s-1 de
intensidade luminosa fornecida por lacircmpadas do tipo
(Grow-lux) e luz do dia especial O delineamento
experimental utilizado foi inteiramente casualizado no
esquema fatorial 3 x 5 com cinco repeticcedilotildees de quatro
placircntulas cada sendo cada repeticcedilatildeo composta por um
frasco
Apoacutes 90 dias da instalaccedilatildeo do experimento foram
avaliados nuacutemero meacutedio de brotos comprimento meacutedio
da parte aeacuterea nuacutemero meacutedio de raiacutezes nuacutemero meacutedio de
folhas e meacutedia da massa fresca total de placircntulas
ARAUJO A G de et al70
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 68-73 2006
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Para a variaacutevel nuacutemero de folhas natildeo houve
significacircncia dos fatores isolados nem da interaccedilatildeo entre
eles O nuacutemero de raiacutezes e massa fresca total de placircntulas
apresentaram significacircncia apenas para o fator meio de
cultura enquanto que para nuacutemero de brotos e
comprimento da parte aeacuterea a interaccedilatildeo dos fatores foi
significativa (Tabela 1)
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de brotos observou-se
interaccedilatildeo entre os fatores BAP e os meios de cultura
utilizados (Tabela 1) Poreacutem pelo teste F verificou-se que
apenas o meio MS foi significativo em relaccedilatildeo agraves
concentraccedilotildees de BAP (Figura 1)
O maior nuacutemero de brotos (334) foi registrado na
formulaccedilatildeo de MS adicionado de 40 mg L-1 de BAP
Entretanto na ausecircncia dessa citocinina foi observada a
formaccedilatildeo de 304 brotosplanta (Figura 1) Diante da
pequena diferenccedila na quantidade meacutedia de brotos
formados entre a maior concentraccedilatildeo e o tratamento sem
o regulador de crescimento justifica-se a utilizaccedilatildeo do
meio de cultura sem o BAP Estes resultados concordam
com Silva (2003) que obteve maior nuacutemero de brotos (2
brotos) na ausecircncia de BAP para esse mesmo hiacutebrido
poreacutem em meio Knudson C
A natildeo utilizaccedilatildeo de reguladores de crescimento
adicionados ao meio de cultura vai influenciar na
reduccedilatildeo dos custos de produccedilatildeo de mudas jaacute que esse
eacute um dos componentes mais onerosos Isso eacute
extremamente importante principalmente para
laboratoacuterios comerciais
TABELA 1 ndash Resumo da anaacutelise de variacircncia para as caracteriacutesticas meacutedias de nuacutemero de folhas (NF) nuacutemero de raiacutezes(NR) nuacutemero de brotos (NB) comprimento da parte aeacuterea (CPA) e massa fresca total de placircntulas (MFP) e respectivoscoeficientes de variaccedilatildeo (CV)
significativo a 1 e 5 de probabilidade respectivamente pelo teste F
FIGURA 1 ndash Efeito do meio de cultura MS e concentraccedilotildees de BAP no nuacutemero meacutedio de brotos em placircntulas hiacutebridasde Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo apoacutes 90 dias da incubaccedilatildeo
Fontes de variaccedilatildeo GL Quadrados meacutedios
NF NR NB CPA MFP Meios 2 125683 ns 162740 01483 ns 53139 02372 BAP 4 186198 ns 44693 ns 04408 ns 03373 ns 00075 ns
Meio x BAP 8 243984 ns 13417 ns 17417 13579 00459 ns
Resiacuteduo 45 124475 21329 05055 05961 00662 CV () 3467 3081 2801 2443 5100
Propagaccedilatildeo in vitro de placircntulas de orquiacutedea 71
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 68-73 2006
O estiacutemulo agrave brotaccedilatildeo em placircntulas de Spathoglottis
plicata Griff ocorreu em meio MS suplementado com 10
mg L-1 de BAP e 25 mg L-1 de ANA tendo o enraizamento
estimulado com 20 mg L-1 de AIB (NAYAK et al 1999)
TDZ tambeacutem eacute utilizado em associaccedilatildeo com BAP para
regeneraccedilatildeo de brotos de Rhynchostylis (BUI Le al 1999)
e de Anoectochilus (LI et al 1999) todas orquidaceaes
Observou-se interaccedilatildeo entre o tipo de meio de
cultura e o BAP no que diz respeito ao comprimento de
parte aeacuterea das placircntulas (Tabela 1) Pelo teste de F apenas
o meio WPM foi significativo em relaccedilatildeo agraves concentraccedilotildees
de BAP (Figura 2)
O maior comprimento da parte aeacuterea (47 cm) foi
observado quando se utilizou o meio WPM combinado
com 40 mg L-1 de BAP (Figura 2) Como a relaccedilatildeo foi direta
pode-se inferir que o efeito estimulatoacuterio do BAP sobre o
crescimento da parte aeacuterea continuaria mesmo em
concentraccedilotildees maiores que 40 mg L-1 Talukder et al (2003)
obtiveram melhor comprimento de brotos (0472 cm) em
placircntulas de Dendrobium com utilizaccedilatildeo de 25 mg L-1 de
BAP + 05 mg L-1 de ANA adicionados ao meio MS
Relativo ao nuacutemero meacutedio de raiacutezes houve
significacircncia apenas para o fator meio de cultura (Tabela 1)
Na Tabela 2 verifica-se que os maiores valores foram obtidos
com os meios WPM (557) seguido do MS (487) sendo os
menores valores verificados no meio Knudson C (378) A
emissatildeo de novas raiacutezes eacute favorecida pelo caacutelcio e pelo boro
O meio Knudson C apresenta uma concentraccedilatildeo maior de
caacutelcio e menor de boro em relaccedilatildeo aos meios MS e WPM
que possuem concentraccedilotildees semelhantes de ambos
Segundo Pierik (1987) em concentraccedilotildees mais elevadas
(1 a 10 mg L-1) as citocininas podem induzir a formaccedilatildeo de
gemas adventiacutecias quebrando a dominacircncia apical e retardando
a formaccedilatildeo de raiacutezes Talukder et al (2003) encontraram maior
nuacutemero de raiacutezes (193explante) em placircntulas de Dendrobium
com utilizaccedilatildeo de 25 mg L-1 de BAP + 05 mg L-1 de ANA
adicionados ao meio MS O estiacutemulo ao enraizamento em
Spathoglottis plicata ocorreu em meio MS suplementado com
20 mg L-1 de AIB (NAYAK et al 1999)
FIGURA 2 ndash Comprimento meacutedio da parte aeacuterea em placircntulas hiacutebridas Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo cultivadas emmeio de cultura WPM e diferentes concentraccedilotildees de BAP
TABELA 2 ndash Efeito de diferentes meios de cultura sobreo nuacutemero meacutedio de raiacutezes em placircntulas hiacutebridas de BclsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo
Meios de Cultura Nuacutemero meacutedio de raiacutezes
WPM 557 a MS 487 a KC 378 b
Meacutedias seguidas pela mesma letra natildeo diferem entre sipelo teste de Scott-Knott a 5
ARAUJO A G de et al72
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 68-73 2006
O efeito ora inibitoacuterio ora estimulatoacuterio dos
fitorreguladores na formaccedilatildeo de brotos e raiacutezes em
diferentes plantas pode estar associado agrave proacutepria
concentraccedilatildeo bem como a absorccedilatildeo dos reguladores de
crescimento pelo substrato (GEORGE 1996) agrave habituaccedilatildeo
(SANTANA amp PAIVA 2001) ou agrave deficiecircncia de proteiacutena
ligante promotora da atuaccedilatildeo das citocininas (TAIZ amp
ZEIGER 1998)
O nuacutemero de folhas natildeo apresentou diferenccedilas
significativas para os tratamentos estudados
isoladamente nem houve interaccedilatildeo entre eles (Tabela 1)
Talukder et al (2003) obtiveram maior nuacutemero de folhas
(425placircntula) em Dendrobium com utilizaccedilatildeo de 25 mg L-
1 de BAP + 05 mg L-1 de ANA adicionados ao meio MS
Para massa fresca de placircntulas houve significacircncia
apenas para o fator meio de cultura isoladamente (Tabela
1) Atraveacutes do teste de meacutedias constatou-se maior massa
de placircntulas frescas nos meios WPM e MS com 0524 e
0503g respectivamente Resultado inferior (0326g) foi
registrado em meio Knudson C (Tabela 3)
TABELA 3 ndash Efeito do meio de cultura na massa frescatotal de placircntulas do hiacutebrido Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmberGlowrsquo
Meios de Cultura Massa fresca total de placircntulas (g)
WPM 0524 a MS 0503 a KC 0326 b
Meacutedias seguidas pela mesma letra natildeo diferem entre sipelo teste de Scott-Knott a 5
Dignart (2003) estudando a germinaccedilatildeo in vitro
de sementes de Cattleya nobilior Rchbf em diferentes
meios de cultura (MS WPM Knudson C e B5 de
GAMBORG et al 1968) observou que natildeo houve
diferenccedilas entre os meios utilizados O BAP adicionado
ao meio de cultura provocou aumento da taxa de brotaccedilatildeo
a partir de 1 igravemolL
Segundo (PASQUAL 2001) os meios MS e WPM
possuem concentraccedilotildees similares de micronutrientes e satildeo
ricos em nitrogecircnio (N) e potaacutessio (K) Jaacute o meio Knudson C
natildeo possui micronutrientes e tem baixas concentraccedilotildees de
N e K em relaccedilatildeo ao MS e WPM Os melhores resultados
para as variaacuteveis analisadas foram observados em meio WPM
e MS Essa resposta provavelmente deveu-se ao fato de
que o meio Knudson C possui diferentes sais minerais e
embora seja muito utilizado na germinaccedilatildeo de sementes de
orquiacutedeas parece natildeo propiciar condiccedilotildees satisfatoacuterias para
o desenvolvimento de placircntulas de algumas espeacutecies de
orquiacutedeas
Sabe-se que existe uma relaccedilatildeo entre o nuacutemero de
brotos e seu tamanho e nessa relaccedilatildeo quanto maior for o
nuacutemero de brotos menor o tamanho dos mesmos
(GEORGE 1996) Essa relaccedilatildeo fez-se presente ateacute a
concentraccedilatildeo de 20 mg L-1 de BAP em Bc lsquoPastoralrsquo x Lc
lsquoAmber Glowrsquo No entanto em concentraccedilotildees superiores
tanto o nuacutemero quanto o comprimento dos brotos
aumentaram Tal diversidade de resultados estaacute
relacionada principalmente ao genoacutetipo da espeacutecie meio
de cultura e possivelmente agrave interferecircncia na accedilatildeo dos
reguladores de crescimento
Segundo Malaure et al (1991) diferentes efeitos
dos reguladores de crescimento podem ocorrer para
diferentes espeacutecies inclusive variaccedilotildees dentro de uma
mesma espeacutecie Em orquiacutedeas o efeito dos reguladores de
crescimento e de meios de cultura satildeo diversificados
principalmente quando se utiliza um hiacutebrido trigeneacuterico
com alto grau de heterozigose
CONCLUSOtildeES
Melhores resultados para propagaccedilatildeo in vitro de
placircntulas de orquiacutedea Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo satildeo
obtidos com o meio WPM A suplementaccedilatildeo de 4 mg L-1 de
BAP no meio WPM favorece o crescimento in vitro Para
a multiplicaccedilatildeo maior quantidade de brotos eacute conseguida
em meio MS na ausecircncia de BAP
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SILVEIRA D G et al74
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
EFEITO DO VIacuteRUS DAS ESTRIAS DA BANANEIRA NAMICROPROPAGACcedilAtildeO E NO CRESCIMENTO DAS PLANTAS DA
CULTIVAR CAIPIRA DURANTE A ACLIMATIZACcedilAtildeO1
EFFECT OF BANANA STREAK VIRUS ON MICROPROPAGATION AND PLANTGROWTH OF CULTIVAR CAIPIRA DURING ACLIMATIZATION
DANIELA GARCIA SILVEIRA2 ANTOcircNIO DA SILVA SOUZA3 PAULO ERNESTO MEISSNER FILHO3TALES MILER SOARES4 RANULFO CORREA CALDAS3 KAacuteTIA REGINA BARBOSA LEAtildeO5
1Parte da Dissertaccedilatildeo de Mestrado apresentada pelo primeiro autor ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias Agraacuterias da Escola de AgronomiaUFBA ndash Cruz das Almas BA2Doutoranda em Botacircnica ndash Universidade Estadual de Feira de SantanaUEFS ndash Feira de Santana BA ndash danielagsigcombr3Pesquisador da Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical ndash Caixa Postal 007 ndash 44380-000 ndash Cruz das Almas BA4Doutorando da Escola Superior Luis de QueirozEsalq ndash Piracicaba SP ndash tmsoaresesalquspbr5Engenheira Agrocircnoma MSc EBDA ndash Cruz das Almas BA ndash 44380-000 ndash krbleaohotmailcom
(Recebido em 12 de abril de 2006 e aprovado em 28 de agosto de 2006)
RESUMOAvaliaram-se os efeitos da infecccedilatildeo pelo viacuterus das estrias
de bananeira (Banana Streak Virus BSV) no desenvolvimento invitro e no crescimento das plantas da cultivar Caipira durante aaclimatizaccedilatildeo Utilizou-se o delineamento experimentalinteiramente casualizado com dois tratamentos plantas sadias eplantas infectadas pelo BSV com respectivamente 24 e 28repeticcedilotildees Os explantes foram desinfestados e estabelecidos emmeio MS baacutesico suplementado com 30 gL de sacarose solidificadocom 2 gL de lsquoPhytagelrsquo e pH ajustado em 58 Foram efetuadoscinco subcultivos em meio com 4 mgL de BAP (6-benzilaminopurina) e as plantas obtidas foram enraizadas nessemesmo meio de cultura sem reguladores de crescimento Apoacutesessa etapa transferiram-se as plantas para a aclimatizaccedilatildeo emcacircmara uacutemida onde permaneceram por 30 dias Avaliaram-se astaxas de multiplicaccedilatildeo a presenccedila in vitro dos sintomas do BSVnos explantes provenientes das plantas infectadas durante amicropropagaccedilatildeo e aclimatizaccedilatildeo as perdas por contaminaccedilatildeoenvolvendo fungos e bacteacuterias nas fases da micropropagaccedilatildeo e aaltura das plantas na fase da aclimatizaccedilatildeo A infecccedilatildeo pelo BSVnatildeo afetou significativamente a multiplicaccedilatildeo e o crescimento invitro das plantas sendo os sintomas do viacuterus visiacuteveis em todasas fases da micropropagaccedilatildeo e na aclimatizaccedilatildeo das plantasinfectadas A maior porcentagem de contaminaccedilatildeo ocorreu nafase de estabelecimento in vitro dos explantes independentementedos tipos de plantas utilizadas Apoacutes 30 dias de aclimatizaccedilatildeo asplantas com BSV apresentaram altura inferior agraves plantas sadiasA presenccedila do viacuterus natildeo influenciou a taxa de multiplicaccedilatildeo dosexplantes poreacutem afetou o crescimento das plantas infectadas
Termos para indexaccedilatildeo Musa BSV cultura de tecidospropagaccedilatildeo in vitro
ABSTRACTThe effects of the banana streak virus (BSV) infection on
in vitro development of the cultivar Caipira were evaluated The
used experimental design was a completely randomized withtwo treatments healthy plants and plants infected by BSV with24 and 28 replications respectively The explants weredisinfected and established in a basic MS medium supplementedwith 30 gL sucrose solidified with 2 gL lsquoPhytagelrsquo and pHadjusted to 58 Five subcultures were carried out in a mediumcontaining 4 mgL BAP (6-benzylaminopurine) and the plantletswere rooted in the same culture medium without growthregulators Afterwards the plantlets were transferred to a humidchamber for acclimatization during a 30-day periodMultiplication rates presence of BSV symptoms on in vitroexplants obtained from plants infected during themicropropagation and acclimatization periods losses caused byfungal and bacterial contamination and plantlet height at theacclimatization stage were evaluated The infection by BSVpresented no significant effect on the multiplication rate and invitro plant growth although the virus symptoms were visible inall the micropropagation phases and during the acclimatizationof infected plants The highest percentage of contaminationoccurred during the in vitro establishment phase regardless theused plants After 30 days of acclimatization the plants withBSV presented a lower height compared to the healthy plantsAlthough the presence of the virus had no influence on the explantmultiplication rate it affected the growth of infected plants
Index terms Musa BSV tissue culture in vitro propagation
INTRODUCcedilAtildeO
As bananeiras estatildeo sujeitas as vaacuterias doenccedilas
causadas por fungos bacteacuterias nematoacuteides e viacuterus que
satildeo limitantes agrave sua capacidade de produccedilatildeo Entre as
viroses que ocorrem no Brasil destaca-se a causada pelo
viacuterus das estrias da bananeira (Banana streak virus BSV)
Efeito do viacuterus das estrias da bananeira 75
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que eacute particularmente importante para os programas de
melhoramento geneacutetico e de multiplicaccedilatildeo comercial de
cultivares uma vez que pode ser incorporada ao genoma e
transmitida pelas sementes de plantas infectadas
(DANIELLS et al 1995) aleacutem de natildeo existir um meacutetodo
eficiente para limpar uma planta infectada com BSV
(LOCKHART 1994)
Esse viacuterus natildeo eacute transmitido mecanicamente sendo as
mudas infectadas sua principal forma de disseminaccedilatildeo
(LOCKHART amp AUSTREY 1988 LOCKHART 1994) A
transmissatildeo eacute feita de maneira semi-persistente pela cochonilha-
dos-citros Planococcus citri Risso e pela cochonilha-da-cana-
de-accediluacutecar Saccharicoccus sacchari cocherell (LOCKHART
1993 LOCKHART amp AUSTREY 1988)
O BSV inicialmente causa na bananeira um estriado
cloroacutetico de linhas descontiacutenuas dispersas e concentradas
em partes da lacircmina foliar Com o envelhecimento das
folhas o estriado causa necrose de coloraccedilatildeo marrom-cafeacute
a negro (RAMIREZ amp RIVERA 1994) As plantas
infectadas geralmente natildeo mostram sintomas em todas as
folhas (CORDEIRO amp KIMATI 1997 LOCKHART 1986)
Outros sintomas do BSV satildeo a reduccedilatildeo do vigor da planta
e a diminuiccedilatildeo do tamanho dos frutos que tambeacutem ficam
deformados (RAMIREZ amp RIVERA 1994)
Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos
da infecccedilatildeo pelo BSV na multiplicaccedilatildeo in vitro e no
crescimento durante a aclimatizaccedilatildeo das plantas de
bananeira da cultivar Caipira Aleacutem disso avaliou-se a taxa
de contaminaccedilatildeo por fungos e bacteacuterias na etapas da
micropropagaccedilatildeo devido a importacircncia dessa variaacutevel na
multiplicaccedilatildeo in vitro das plantas
MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo dos efeitos do BSV na micropropagaccedilatildeo
da cultivar Caipira (grupo AAA) foi conduzido no
Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos da Embrapa Mandioca
e Fruticultura Tropical Utilizou-se o delineamento
experimental inteiramente casualizado com dois
tratamentos plantas sadias com 24 repeticcedilotildees coletadas
no Banco de Germoplasma de Bananeira da Embrapa
Mandioca e Fruticultura Tropical e plantas infectadas com
BSV com 28 repeticcedilotildees Foram usadas mudas do tipo
chifrinho sendo que as matrizes infectadas com BSV com
altura meacutedia de 12 cm foram infestadas pela cochonilha
vetora Planacoccus citri Risso alimentadas em folhas de
banana lsquoMysorersquo com sintomas de BSV em casa-de-
vegetaccedilatildeo Aproximadamente 15 dias apoacutes a infestaccedilatildeo
todas as 28 plantas estavam com os sintomas da virose
Para o estabelecimento in vitro realizou-se a limpeza
das matrizes por meio de uma seacuterie de cortes removendo-
se parte do rizoma e do pseudocaule ateacute o tamanho
aproximado de 50 cm de altura por 15 cm de diacircmetro
lavando-se com detergente e aacutegua deionizada A
desinfestaccedilatildeo foi feita em cacircmara de fluxo laminar
imergindo os explantes em soluccedilatildeo de aacutelcool 70 por
cinco minutos e em soluccedilatildeo 11 de aacutegua sanitaacuteria comercial
(2 de cloro ativo) com aacutegua deionizada por 30 minutos
Em seguida foram realizadas trecircs lavagens com aacutegua
deionizada esterilizada e reduzidos os explantes ateacute o
tamanho final de 06 cm de altura por 04 cm de diacircmetro
As etapas de estabelecimento multiplicaccedilatildeo e
enraizamento foram realizadas em meio nutritivo MS baacutesico
(MURASHIGE amp SKOOG 1962) suplementado com 30 g
L de sacarose solidificado com 2 gL de ldquoPhytagelrdquo e pH
ajustado para 58 Apenas na fase de multiplicaccedilatildeo o meio
MS foi suplementado com 4 mgL de 6-benzilaminopurina
(BAP) Em todas as etapas os explantes foram dispostos
sobre 25 mL de meio de cultura em frascos com 12 cm de
altura por 5 cm de diacircmetro
A multiplicaccedilatildeo foi realizada em cinco subcultivos
das gemas e brotos sendo efetuada a subdivisatildeo
longitudinal dos explantes sempre que possiacutevel O
estabelecimento e os cinco subcultivos foram realizados
com intervalos de 30 dias Apoacutes os subcultivos as
plantas permaneceram 30 dias em enraizamento O
estudo foi desenvolvido sob condiccedilotildees de temperatura
de 27 plusmn 1ordmC fotoperiacuteodo de 16 horas e intensidade
luminosa de 22 microEm2s
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Apoacutes o enraizamento in vitro 47 plantas sadias e 40
plantas infectadas com BSV foram transferidas para copos
plaacutesticos de 300 cm3 contendo o Plantmaxreg e vermiculita
(21) permanecendo 30 dias sob condiccedilotildees de 85 de umidade
relativa do ar e 60 de sombreamento em casa-de-vegetaccedilatildeo
Na fase de estabelecimento e em cada subcultivo
foram avaliadas as taxas de multiplicaccedilatildeo e a presenccedila dos
sintomas do BSV nos explantes provenientes das plantas
infectadas Na fase de aclimatizaccedilatildeo avaliaram-se a
presenccedila de sintomas nas plantas infectadas e as suas
respectivas alturas As medidas foram tomadas do coleto
ateacute a extremidade apical da folha mais alta
Os dados referentes ao nuacutemero de gemas obtidas
nos cinco subcultivos foram transformados em raiz
quadrada Foi estabelecida uma regressatildeo linear para cada
tratamento em funccedilatildeo dos subcultivos
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
A infecccedilatildeo pelo BSV natildeo afetou significativamente
o crescimento e a multiplicaccedilatildeo das plantas sendo que o
nuacutemero de gemas cresceu linearmente em funccedilatildeo dos
subcultivos em ambos os tratamentos Trabalhando com
plantas micropropagadas de bananeira sadias e infectadas
com o viacuterus do topo em leque (Banana bunchy top virus
BBTV) Thomas et al (1995) observaram que aquela virose
tambeacutem natildeo afetou a capacidade das plantas em crescer e
multiplicar Nas anaacutelises de regressatildeo realizadas para os
dois tratamentos (plantas sadias e plantas com BSV) o
acreacutescimo no nuacutemero de gemas em funccedilatildeo dos subcultivos
pode ser explicado por um modelo de regressatildeo linear
(Figura 1) As estimativas da regressatildeo linear para plantas
com BSV e plantas sadias foram altamente significativas e
os coeficientes de determinaccedilatildeo (R2) proacuteximos de 1 Foi
observado que as linhas determinadas a partir das
equaccedilotildees obtidas satildeo quase superpostas evidenciando
um comportamento semelhante entre os dois tratamentos
com relaccedilatildeo ao nuacutemero de gemas por subcultivo
Em todas as fases da micropropagaccedilatildeo os sintomas
do BSV foram visiacuteveis ocorrendo nas folhas das plantas
infectadas estriados cloroacuteticos com linhas descontiacutenuas e
FIGURA 1 ndash Curvas de regressatildeo linear obtidas a partir dosdados de gemas em cada subcultivo da cultivar de bananeiraCaipira sadias e infectadas com BSV Cruz das Almas (BA)Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical 2006Dados transformados por x
dispersas (Figura 2) Esses mesmos sintomas foram
observados em plantas de bananeira infectadas com BSV
mantidas a campo (RAMIREZ amp RIVERA 1994)
As contaminaccedilotildees que ocorreram nos materiais
in vitro foram tambeacutem avaliadas As maiores taxas de
contaminaccedilatildeo aconteceram na fase de estabelecimento
in vitro dos explantes obtendo-se niacuteveis de 21 e 32
para as plantas sadias e infectadas com BSV
respectivamente (Figura 3) Os elevados iacutendices de perdas
nesta etapa foram causados principalmente por
contaminaccedilatildeo bacteriana Segundo Oliveira amp Silva
(1997) as maiores contaminaccedilotildees bacterianas dos
explantes de bananeira ocorrem na fase de
estabelecimento in vitro do que nos demais subcultivos
Oliveira et al (2000) trabalhando com plantas livres de
viacuterus obtiveram taxas de contaminaccedilatildeo nesta fase entre
10 e 45 as quais estatildeo proacuteximas agraves obtidas neste
trabalho Durante a fase de multiplicaccedilatildeo as perdas por
contaminaccedilatildeo foram menores variando de 14 a 74
para as plantas sadias e de 0 a 121 no caso das plantas
infectadas com BSV sendo que a maior parte do material
foi contaminada por fungos natildeo-patogecircnicos Estes
valores foram bem inferiores agravequeles obtidos por Oliveira
et al (1999) (131) que utilizaram genoacutetipos diploacuteides
triploacuteides e tetraploacuteides de bananeiras sadias
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FIGURA 2 ndash Planta de bananeira lsquoCaipirarsquo infectada com BSV na fase de enraizamento in vitro apresentando estriadoscloroacuteticos com linhas descontiacutenuas e dispersas nas folhas Cruz das Almas (BA) Embrapa Mandioca e FruticulturaTropical 2006
FIGURA 3 ndash Taxas por contaminaccedilatildeo () de explantes dacultivar Caipira na fase de estabelecimento (Est) e ao longode cinco subcultivos (Sub) Cruz das Almas (BA)Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical 2006
Durante o enraizamento in vitro natildeo houve
diferenccedila significativa na altura das plantas Poreacutem com
30 dias de aclimatizaccedilatildeo as plantas com BSV apresentaram
altura significativamente inferior agraves plantas sadias (Tabela 1)
Soares et al (2000) cultivaram mudas de bananeira lsquoCaipirarsquo
sadias e infectadas com BSV durante 141 dias em casa-de-
vegetaccedilatildeo e observaram que a infecccedilatildeo pelo viacuterus implicou
em significativa reduccedilatildeo no crescimento inicial afetando
o porte o desenvolvimento do sistema radicular e a aacuterea
fotossintetizante das plantas Verifica-se assim que a
infecccedilatildeo pelo BSV prejudicou o crescimento inicial das
plantas afetando a altura daquelas infectadas mesmo em
um periacuteodo relativamente curto indicando que em periacuteodos
mais longos o prejuiacutezo com relaccedilatildeo ao crescimento pode
ser ainda maior aconteceu no estudo desenvolvido por
Soares et al (2000)
Os sintomas do BSV permaneceram visiacuteveis em
todas as plantas infectadas durante e apoacutes a fase de
aclimatizaccedilatildeo Esse resultado foi diferente ao obtido por
Dahal et al (1999) quando micropropagaram hiacutebridos de
Musa pois os sintomas soacute foram visiacuteveis em plantas com
trecircs meses apoacutes o enraizamento Provavelmente essa
diferenccedila foi devido agraves condiccedilotildees onde os trabalhos foram
conduzidos casa-de-vegetaccedilatildeo e campo respectivamante
bem como aos genoacutetipos estudados Observaccedilotildees
semelhantes foram tambeacutem efetuadas por Gauhl amp Pasberg-
Gauhl (1995) e Ortiz (1996) ao estudarem a incidecircncia de
viroses em diferentes genoacutetipos de bananeira
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Alturas (cm) Plantas de bananeira lsquoCaipirarsquo
Enraizamento
in vitro 30 dias de
aclimatizaccedilatildeo
Sadias 637 a 2690 a BSV 728 a 2192 b
TABELA 1 ndash Meacutedias das alturas das plantas apoacutes oenraizamento in vitro e 30 dias de aclimatizaccedilatildeo em casa-de-vegetaccedilatildeo Cruz das Almas (BA) Embrapa Mandiocae Fruticultura Tropical 2006
Meacutedias seguidas pelas mesmas letras nas colunas natildeodiferem estatisticamente entre si pelo teste F ao niacutevel de 5 de significacircncia
CONCLUSOtildeES
A infecccedilatildeo pelo BSV natildeo influenciou a taxa de
multiplicaccedilatildeo dos explantes embora os sintomas do viacuterus
tenham sido visiacuteveis em todas as fases da micropropagaccedilatildeo
e durante os primeiros 30 dias da aclimatizaccedilatildeo das plantas
infectadas Todavia o crescimento das plantas infectadas
foi afetado pela presenccedila do viacuterus
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FOGACcedilA L A et al80
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CARACTERIacuteSTICAS MORFOFISIOLOacuteGICAS DE BROTACcedilOtildeES DEAgapanthus umbellatus var minor MULTIPLICADAS EM
BIORREATOR DE IMERSAtildeO TEMPORAacuteRIA1
MORPHOLOGICAL AND PHYSIOLOGICAL CHARACTERISTICS Agapanthus umbellatus varminor OF SHOOTS PROPAGATED IN BIOREACTOR OF TEMPORARY IMMERSION
LUCIANA ALVES FOGACcedilA2 DENILSON DORTZBACH3 ANTONIO CARLOS ALVES4 ENIO LUIZ PEDROTTI5
1Parte da dissertaccedilatildeo de mestrado do primeiro autor junto ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Recursos Geneacuteticos vegetais CCA UFSC ndash Florianoacutepolis SC2Engenheira Agrocircnoma Mestre em Recursos Geneacuteticos Vegetais ndash CCAUFSC ndash UFSC Trindade ndash Florianoacutepolis SC ndash 88040-900 ndash lufogacapopcombr3Empresa Catarinense de Pesquisa Agropecuaacuteria ndash Rodovia Admar Gonzaga 1340 ndash Bairro Itacorubi Florianoacutepolis SC ndash denilsondtbolcombr4Engenheiro Agrocircnomo Professor Dr Departamento Fitotecnia ndash CCAUFSC ndash UFSC ndash alvesccaufscbr5Engenheiro Agrocircnomo Professor Dr Departamento Fitotecnia ndash CCAUFSC ndash UFSC ndashRodovia Admar Gonzaga 1346 ndash 88 040 900 ndash Florianoacutepolis- SC ndash pedrotticcaufscbr
RESUMOCom o presente trabalho objetivou-se estudar alguns
aspectos morfoloacutegicos e fisioloacutegicos de placircntulas de Agapanthusumbellatus LrsquoHeacuter var minor multiplicadas em biorreatores deimersatildeo temporaacuteria (BIT) Foram testadas quatro concentraccedilotildeesde sacarose no meio de cultura e duas intensidades luminosasem um total de oito tratamentos formando um fatorial 2 x 4 Odelineamento experimental utilizado foi inteiramentecasualizado Os resultados obtidos indicaram que as condiccedilotildeesambientais principalmente luz e concentraccedilatildeo de sacarose domeio de cultura influenciaram o desenvolvimento e o crescimentodas placircntulas quando multiplicadas Observou-se que a ausecircnciade sacarose mesmo no niacutevel mais elevado de intensidadeluminosa natildeo estimulou a fotossiacutentese das placircntulas Acombinaccedilatildeo de 30 gL-1 de sacarose e 70 mMm-2s-1 de luzproporcionou maior numero de folhas massa fresca e secaconcentraccedilatildeo de clorofila a b e total fatores estes que tecircmgrande influecircncia na fase de aclimatizaccedilatildeo
Termos para indexaccedilatildeo Plantas ornamentaismicropropagaccedilatildeo sacarose intensidade luminosa
ABSTRACTThe objective of the present work was to study
morphological and physiological characteristics of Agapanthusumbellatus LrsquoHeacuter var minor plantlets propagated in bioreactorof temporary immersion (BIT) Four sucrose concentrationsand two light intensities were analyzed totalizing eighttreatments The experimental design used was a completelyrandomized with a 2 x 4factorial The results indicated that theenvironment conditions mainly light and sucrose concentrationsof the culture medium influenced plantlets development andgrowth It was observed that the absence of sucrose even inthe highest level of light intensity had no stimuli on plantletphotosynthesis The combination of 30 g L-1 sucrose and 70mM m-2 s-1 light had promoted higher leaf number fresh anddry weight concentration of chlorophyll a b and total
parameters that present high influence during theacclimatizationrsquos phase
Index terms Ornamental plants micropropagation sucroselight intensity
INTRODUCcedilAtildeO
Agapanthus umbellatus var minor tambeacutem
conhecida como Agapantho ou Liacuterio do Nilo eacute uma
angiosperma da famiacutelia Amaryllidaceae pertencente agrave
ordem Liliales (BOTANY 2003) eacute uma espeacutecie ornamental
muito utilizada como flor de corte devido agrave sua durabilidade
No entanto o maior interesse econocircmico nesta espeacutecie
decorre do seu uso como forraccedilatildeo em jardins e praccedilas
(LORENZI amp SOUZA 1995)
Sua propagaccedilatildeo eacute tradicionalmente efetuada
atraveacutes da divisatildeo de touceiras No entanto esta teacutecnica
apresenta uma seacuterie de desvantagens visto que a taxa de
propagaccedilatildeo eacute baixa cerca de dez mudas por planta ao ano
aleacutem de possibilitar a dispersatildeo de pragas e doenccedilas que
poderatildeo ocorrer no viveiro de produccedilatildeo Sendo assim a
micropropagaccedilatildeo pode ser uma ferramenta muito
promissora para esta espeacutecie
O processo de micropropagaccedilatildeo induz a um grande
nuacutemero de mudanccedilas anatocircmicas morfoloacutegicas e
fisioloacutegicas que muitas vezes tem limitado o cultivo in vitro
de algumas espeacutecies (DESJARDINS 1993) A
(Recebido em 18 de julho de 2005 e aprovado em 25 de agosto de 2006)
Caracteriacutesticas morfofisioloacutegicas de brotaccedilotildees 81
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heterogeneidade de respostas agraves placircntulas que ocorrem
na cultura de tecidos eacute promovida natildeo soacute por fatores
inerentes ao tecido vegetal (geneacuteticos e fisioloacutegicos) mas
tambeacutem por modificaccedilotildees do ambiente in vitro
As modificaccedilotildees do ambiente in vitro envolvem a
qualidade e intensidade de luz fotoperiacuteodo temperatura
umidade reguladores de crescimento exoacutegenos fonte de
carbono e estresse mecacircnico Estes satildeo determinantes na
morfogecircnese no crescimento e no desenvolvimento de
placircntulas in vitro (GEORGE 1996 KOZAI et al 1990
SALISBURY 1981) Aleacutem disso interferem no nuacutemero de
folhas teor de clorofila densidade estomaacutetica (LIAN et
al 2002 PREECE amp SUTTER 1991) na fotossiacutentese e na
fase de aclimatizaccedilatildeo (DESJARDINS et al 1995)
Um dos principais fatores que causam grande
influecircncia na fotossiacutentese de placircntulas cultivadas in vitro
eacute a intensidade luminosa (GALZY amp COMPAN 1992) A
quantidade e a qualidade da luz bem como o fotoperiacuteodo
podem afetar o crescimento e o desenvolvimento de
placircntulas in vivo (SMITH 1982) e placircntulas in vitro
(ECONOMOU amp READ 1987 VLAHOS et al 1992) Esta
influecircncia se deve ao grande impacto sobre o acuacutemulo de
pigmentos biossiacutentese de clorofila diferenciaccedilatildeo de
cloroplastos e anatomia da folha (DESJARDINS et al 1995)
Outro fator que vem sendo estudado e que pode
determinar um papel importante no controle da atividade
fotossinteacutetica de placircntulas in vitro eacute a utilizaccedilatildeo de
carboidratos exoacutegenos pois o crescimento da maioria das
culturas in vitro eacute sustentado pela sacarose ou outros
accediluacutecares adicionados ao meio de cultura (PREECE amp
SUTTER 1991) Estes podem ser utilizados pelas placircntulas
quando a taxa de fotossiacutentese natildeo permite assegurar um
balanccedilo positivo em carbono definindo assim uma nutriccedilatildeo
mixotroacutefica ou heterotroacutefica (GALZY amp COMPAN 1992)
Baseado na hipoacutetese de que a composiccedilatildeo do meio
de cultura e a intensidade luminosa influenciam a
morfologia e a fisiologia de placircntulas micropropagadas o
presente trabalho teve como objetivo estudar aspectos
morfoloacutegicos e fisioloacutegicos de placircntulas de Agapanthus
umbellatus LrsquoHeacuter var minor multiplicadas em biorreator de
imersatildeo temporaacuteria (BIT) Para tanto foi avaliado o
desenvolvimento e o crescimento desta espeacutecie durante a
fase de multiplicaccedilatildeo em funccedilatildeo da variaccedilatildeo de niacuteveis de
sacarose e intensidade luminosa
MATERIAIS E MEacuteTODOS
Este trabalho foi realizado no Laboratoacuterio de
Morfogecircnese e Bioquiacutemica Vegetal localizado no Centro
de Ciecircncias Agraacuterias da Universidade Federal de Santa
Catarina em Florianoacutepolis - SC
O trabalho consistiu de um ensaio onde foram
utilizadas brotaccedilotildees de Agapanthus umbellatus var minor
obtidas da terceira repicagem mantidas em meio geleificado
MS + 178 mM de BAP Apoacutes serem individualizadas e
padronizadas tendo o seu tamanho variando entre 25 e
30 cm de comprimento as brotaccedilotildees foram transferidas
para o BIT (ETIENNE amp BERTHOULY 2002) contendo 500
mL de meio liacutequido e sais de MS (MURASHIGE amp SKOOG
1962) em condiccedilotildees asseacutepticas suplementado com
concentraccedilatildeo de 89 mM de BAP O pH foi ajustado com
NAOH (1N) em 59 antes da autoclavagem (durante 15
minutos sob 121ordmC e 15 atm de pressatildeo) O delineamento
experimental utilizado no ensaio foi o inteiramente
casualizado Foram testados quatro concentraccedilotildees de
sacarose no meio de cultura (0 15 30 e 45) e duas
intensidades luminosas (70 e 140 mmolm-2s-1) providas
por lacircmpadas brancas fluorescentes (PHILIPS ndash TLT 40W)
em um total de oito tratamentos formando um fatorial 2 x 4
Cada tratamento foi composto por trecircs frascos (repeticcedilatildeo)
contendo 50 plantas cada um
Os frascos foram mantidos em sala de crescimento
com fotoperiacuteodo de 16 horas e temperatura meacutedia de 22ordmC
com variaccedilatildeo de plusmn 2ordmC por um periacuteodo de 60 dias
Apoacutes 60 dias de cultivo foram avaliadas as
seguintes caracteriacutesticas dos explantes nuacutemero e tamanho
das brotaccedilotildees (cm) nuacutemero de folhasbrotaccedilatildeo massa
fresca e seca (g) da parte aeacuterea e raiz utilizando-se amostras
de 25 placircntulas por repeticcedilatildeo escolhidas ao acaso
FOGACcedilA L A et al82
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
A determinaccedilatildeo do conteuacutedo de clorofila ldquoa b e
totalrdquo consistiu na coleta de amostras de 100 mg de massa
fresca As amostras foram incubadas com 70 mL de DMSO
(dimetilsulfoacutexido) sem maceraccedilatildeo por 30 minutos a 65degC
Apoacutes filtragem seu volume foi completado para 10 mL com
DMSO Desses extratos 2 mL foram analisados em
espectrofotocircmetro (UV - visiacutevel SHIMADZU) para os
valores de absorbacircncia entre 645 e 663 nm Os valores obtidos
foram submetidos agrave foacutermula de Arnon (1949) conforme
descrito por Hiscox amp Israelstam (1979) Chl a = (00127 X
D663) ndash (000269 X D645) e Chl b = (00229 X D645) ndash (000468
X D663) A clorofila total foi a soma da ldquoChl a e Chl brdquo de
cada tratamento foram utilizadas 25 amostras
A determinaccedilatildeo da densidade estomaacutetica (nuacutemero
de estocircmatos por mm2 de superfiacutecie foliar) foi realizada nas
amostras das quais extraiu-se a clorofila Apoacutes a extraccedilatildeo
da clorofila as folhas foram cortadas e somente o terccedilo
meacutedio das folhas foi usado para anaacutelise Em seguida foram
fixadas sobre lacircminas histoloacutegicas com a ajuda de uma
lamiacutenula e de algumas gotas de aacutegua esterilizada A
observaccedilatildeo foi realizada na epiderme das faces adaxial e
abaxial da folha com o auxiacutelio de um microscoacutepio oacutetico
(OLYMPUS CH30 ocular WH10 X 22) com um aumento
de 400 vezes e com um campo conhecido de 024 mm2 Para
cada lacircmina foram feitas leituras em cinco campos
Os dados obtidos foram avaliados por meio da
anaacutelise de variacircncia (ANOVA) seguindo o modelo para
experimento bifatorial inteiramente casualizado O nuacutemero
de brotaccedilotildees o nuacutemero de folhas e a densidade estomaacutetica
foram transformados em Oumlx+1 para a anaacutelise As meacutedias
dos tratamentos foram separadas pelo teste de comparaccedilatildeo
de meacutedias de Duncan a 5 de probabilidade conforme
recomendaccedilotildees de Stell amp Torrie (1980)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
A concentraccedilatildeo de sacarose no meio de cultura
apresentou uma accedilatildeo positiva e interativa com a intensidade
luminosa na proliferaccedilatildeo de brotaccedilotildees (Tabela 1) visto
que a ausecircncia de sacarose no meio de cultura resultou
em insucesso no crescimento das placircntulas de Agapantho
principalmente nos primeiros dias Apoacutes o
desenvolvimento inicial (aproximadamente 10 dias) foi
constatada estagnaccedilatildeo no crescimento das placircntulas
seguido de atrofia e necrose das brotaccedilotildees Apoacutes 20 dias
de cultivo ocorreu a morte das brotaccedilotildees Isso mostrou
que folhas de placircntulas de Agapantho natildeo fixaram
carbono suficiente para sustentar seu crescimento na
ausecircncia de sacarose Portanto para a espeacutecie em estudo
foi necessaacuteria a adiccedilatildeo de uma fonte de carbono no meio
de cultura para o seu desenvolvimento in vitro Segundo
Capellades et al (1991) e Desjardins et al (1995) a total
remoccedilatildeo de carboidratos no meio de cultura para algumas
espeacutecies frequumlentemente torna-se prejudicial para o
crescimento das placircntulas o que pode prejudicar o
processo de micropropagaccedilatildeo e aclimatizaccedilatildeo pois
durante o cultivo in vitro as placircntulas perdem
parcialmente o autotrofismo e consequumlentemente
necessitam de uma fonte de carbono
O maior nuacutemero de brotaccedilotildees foi obtido com a
intensidade luminosa de 70 mmolm-2s-1 e a concentraccedilatildeo
de 45 gL-1 de sacarose (Tabela 1) Enquanto que com a
intensidade luminosa de 140 mmolm-2s-1 o maior nuacutemero
de brotaccedilotildees foi obtido com a concentraccedilatildeo de 30 gL-1 de
TABELA 1 ndash Nuacutemero de brotaccedilotildeesexplante de placircntulasde Agapanthus umbellatus var minor multiplicadasbiorreator de imersatildeo temporaacuteria suplementado comdiferentes concentraccedilotildees de sacarose e intensidadesluminosas no periacuteodo de 60 dias
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1)
Concentraccedilatildeo Sacarose (gL-1) 70 1 140 1
0 000 dA 00 dA 15 370 cB 544 cA 30 553 bB 651 aA 45 745 aA 585 bB
CV 67
Meacutedias seguidas pela mesma letra minuacutescula nas colunase maiuacutescula nas linhas natildeo diferem significativamente peloteste de Duncan a 5 de probabilidade1 Observaccedilotildees transformadas segundo ( x+1)
Caracteriacutesticas morfofisioloacutegicas de brotaccedilotildees 83
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
sacarose Isso demonstrou um alto grau de mixotrofia dessa
espeacutecie
O tamanho das brotaccedilotildees e o nuacutemero de folhas
(Tabela 2) foram afetados apenas pelo efeito simples dos
fatores natildeo havendo interaccedilatildeo entre sacarose e luz O
maior tamanho das brotaccedilotildees foi alcanccedilada quando os
explantes foram submetidos a 15 gL-1 de sacarose e 140
mmolm-2s-1 de intensidade luminosa (Tabela 2) Verificou-
se tambeacutem que o aumento da concentraccedilatildeo desse
carboidrato no meio de cultura natildeo favoreceu o
alongamento das brotaccedilotildees Provavelmente o aumento
da intensidade luminosa favoreceu a taxa de fotossiacutentese
das placircntulas permitindo um balanccedilo positivo de carbono
afetando o crescimento e o desenvolvimento de placircntulas
in vitro (LEE et al 1995)
Por outro lado o maior nuacutemero de folhas de
Agapantho foi obtido na concentraccedilatildeo de 30 gL-1 de
sacarose (Tabela 2) A intensidade luminosa natildeo teve
influecircncia sobre essa variaacutevel Contrastando com os dados
obtidos no presente trabalho Konow amp Wang (2001)
determinaram que a intensidade luminosa de 40 mmolm-
2s-1 promoveu um aumento no nuacutemero de folhas de
Phalaenopsis enquanto placircntulas que se desenvolveram
em ambiente com intensidade de 10 e 80 molm-2s-1
apresentaram um menor nuacutemero de folhas Segundo os
autores o aumento no nuacutemero de folhas pode indicar que
TABELA 2 ndash Tamanho de brotaccedilotildees e nuacutemero de folhasbrotaccedilatildeo de placircntulas de Agapanthus umbellatus var minormultiplicadas em biorreator de imersatildeo temporaacuteria suplementado com diferentes concentraccedilotildees de sacarose eintensidades luminosas no periacuteodo de 60 dias
Meacutedias seguidas pela mesma letra nas linhas e colunas natildeo diferem significativamente pelo teste de Duncan a 5 deprobabilidade
houve estiacutemulo da fotossiacutentese in vitro Outro efeito
observado em placircntulas de Agapantho neste trabalho foi
a presenccedila de folhas mais claras e vitrificadas (folhas com
aspecto viacutetreo pouco desenvolvidas aparecircncia suculenta
e translucente) na grande maioria das placircntulas
multiplicadas em meio suplementado com 15 gL-1 de
sacarose e intensidade luminosa de 70 mmolm-2s-1 Estes
resultados podem indicar que o aparato fotossinteacutetico natildeo
tenha se desenvolvido adequadamente (CAPPELADES et
al 1991 DESJARDINS et al 1995) afetando a acumulaccedilatildeo
de massa fresca Possivelmente a presenccedila de folhas
vitrificadas foi influenciada pelo uso de meio liacutequido pois
de acordo com George (1996) e Etienne amp Berthouly (2002)
o meio liacutequido favorece a produccedilatildeo de folhas vitrificadas
quando comparado com meio geleificado No entanto
observou-se que para os demais tratamentos em
concentraccedilotildees maiores de sacarose (30 e 45 gL-1) a
presenccedila de brotaccedilotildees vitrificadas foi rara ou nenhuma
Neste sentido o desenvolvimento de brotaccedilotildees com esta
caracteriacutestica pode estar relacionado agrave concentraccedilatildeo de
sacarose no meio e agrave diferenccedila osmoacutetica entre as brotaccedilotildees
e o meio de cultura (DEBERGH et al 1981) Este resultado
tambeacutem foi obtido na multiplicaccedilatildeo de rosas na qual onde
a reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo de sacarose para 10 gL-1 na
fase de multiplicaccedilatildeo promoveu um aumento significativo
na presenccedila de plantas vitrificadas e quando submetidas
Tamanho de brotaccedilotildees (cm)
Nuacutemero de folhasbrotaccedilatildeo
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1) Concentraccedilatildeo Sacarose
(gL-1) 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia
0 000 000 000 d 000 000 000 d 15 275 396 335 a 407 408 408 b 30 295 295 295 b 414 404 409 a 45 245 220 233 c 400 408 404 c
Meacutedia 204 b 228 a 276 a 275 a
CV 2595 467
FOGACcedilA L A et al84
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
a concentraccedilotildees de 30 e 40 gL-1 a presenccedila de placircntulas
vitrificadas foi rara (LANGFORD amp WAINWRIGHT 1987)
Outro fator que possivelmente pode ter
influenciado a presenccedila de placircntulas vitrificadas in vitro
foi a baixa intensidade luminosa (GEORGE 1996) pois
placircntulas de Agapantho multiplicadas sob intensidade de
140 mmolm-2s-1 e 15 gL-1 de sacarose natildeo apresentaram
caracteriacutestica de vitrificaccedilatildeo Estes dados indicaram que o
aumento da intensidade luminosa evitou a presenccedila de
plantas vitrificadas aleacutem de proporcionar um incremento e
estiacutemulo na atividade fotossinteacutetica (GEORGE 1996)
A produccedilatildeo de massa fresca e seca das brotaccedilotildees
foram influenciadas pela interaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo
de sacarose e a intensidade luminosa (Tabela 3) Placircntulas
de Agapantho multiplicadas sob intensidade de 70
mmolm-2s-1 apresentaram a maior produccedilatildeo de massa
fresca e seca dentro das concentraccedilotildees de 30 gL-1 Nas
concentraccedilotildees de 15 e 45 gL-1 os resultados obtidos
foram inferiores (Tabela 3) Por outro lado quando se
aumentou a intensidade para 140 mmolm-2s-1 a melhor
produccedilatildeo de massa fresca e seca ocorreu dentro da
concentraccedilatildeo de 15 gL-1 de sacarose (Tabela 3) Verificou-
se assim que o aumento da concentraccedilatildeo de sacarose no
meio de cultura proporcionou efeitos negativos na
produccedilatildeo de massa fresca e seca quando as placircntulas
foram submetidas agrave intensidade luminosa mais elevada
TABELA 3 ndash Massa fresca e seca de brotaccedilotildees de Agapanthus umbellatus var minor multiplicadas em biorreator de imersatildeotemporaacuteria suplementado com diferentes concentraccedilotildees de sacarose e intensidades luminosas no periacuteodo de 60 dias
Tais resultados corroboram as afirmaccedilotildees feitas referentes
agrave variaacutevel nuacutemero de brotaccedilotildees em que demonstrou-se
que foi possiacutevel reduzir a concentraccedilatildeo de sacarose em
maiores intensidade luminosas confirmando o grau de
mixotrofia
Ao analisar a concentraccedilatildeo de clorofila em
folhas de Agapantho verificou-se que natildeo houve
interaccedilatildeo significativa entre as concentraccedilotildees de
sacarose e intensidade luminosa Os teores de clorofila
a b e total (Tabela 4) foram maiores nas concentraccedilotildees
de 30 gL-1 sacarose Serret et al (1995) mostraram que
o aumento da concentraccedilatildeo de accediluacutecares (30 gL-1) no
meio de cultura promoveu maior produccedilatildeo de clorofila
impedindo a fotoinibiccedilatildeo realizaccedilatildeo de fotossiacutentese e
aumento do ganho de massa em plantas de Gardecircnia
cultivadas in vitro
Em relaccedilatildeo ao efeito da intensidade luminosa natildeo
houve efeito deste fator sobre essas variaacuteveis ainda que
Economou amp Read (1987) Galzy amp Compan (1992) Vlahos
et al (1992) George (1996) tenham observado que a
intensidade luminosa eacute um fator que estaacute estreitamente
relacionado agrave siacutentese de clorofila No entanto no presente
trabalho sugere-se a menor intensidade 70 mmolm-2s-1 com
o objetivo de que natildeo ocorra um aumento na velocidade
de decomposiccedilatildeo da clorofila com intensidade mais
elevada
Meacutedias seguidas pela mesma letra minuacutescula nas colunas e maiuacutescula nas linhas natildeo diferem significativamente peloteste de Duncan a 5 de probabilidade
Massa fresca (g)
Massa seca (g)
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1) Concentraccedilatildeo
Sacarose (gL-1) 70 140 70 140
0 000 dA 00 dA 000 dA 000 dA 15 067 cB 106 aA 0069 cB 0109 aA 30 082 aA 076 bB 0085 aA 0081 bB 45 075 bA 049 cB 0078 bA 0051 cB
CV 2873 2655
Caracteriacutesticas morfofisioloacutegicas de brotaccedilotildees 85
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
TABELA 4 ndash Concentraccedilotildees de clorofila a b e total (mgg massa fresca) em folhas de Agapanthus umbellatus varminor multiplicadas em biorreator de imersatildeo temporaacuteria por um periacuteodo de 60 dias submetidas a 4 concentraccedilotildees desacarose e dois niacuteveis de intensidade luminosa
Clrofila a (mgg massa fresca)
Clrofila b (mgg massa fresca)
Clrofila total (mgg massa fresca)
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1) Concentraccedilatildeo
Sacarose (gL-1) 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia
0 000 000 000 d 000 000 000 d 000 000 000 d 15 211 248 295 c 089 076 083 c 301 325 313 c 30 502 509 505 a 200 211 205 a 703 721 710 a 45 486 420 453 b 195 179 187 b 682 633 658 b
Meacutedia 299 a 294 a 121 a 116 a 421 a 420 a
CV 740 820 850
Meacutedias seguidas pela mesma letra nas linhas e colunas natildeo diferem significativamente pelo teste de Duncan a 5 deprobabilidade
Em relaccedilatildeo aos estocircmatos atraveacutes de
observaccedilatildeo microscoacutepica foi possiacutevel verificar que o
Agapantho possui folhas com caracteriacutest ica
anfiestomaacutetica caracterizada pela presenccedila de
estocircmatos em ambas as faces (face abaxial e adaxial)
Esta caracteriacutestica tem sido considerada como um
mecanismo adaptativo para maximizar a condutacircncia
de CO2 quando luz e aacutegua satildeo fatores limitantes
(KRAMER 1969)
Atraveacutes da anaacutelise estatiacutestica para densidade
estomaacutetica da face adaxial verificou-se que natildeo houve
interaccedilatildeo entre os fatores sacarose e intensidade
luminosa havendo portanto efeito isolado dos fatores A
maior densidade estomaacutetica da face abaxial foi obtida na
concentraccedilatildeo de 45 gL-1 (Tabela 5) Natildeo houve efeito da
intensidade luminosa para essa variaacutevel Por outro lado
a maior densidade estomaacutetica na face adaxial foi obtida
na concentraccedilatildeo de 45 gL-1 de sacarose e 140 mmolm-2s-1
de intensidade luminosa (Tabela 5) verificando a
influecircncia positiva da intensidade luminosa para essa
variaacutevel
As folhas de placircntulas multiplicadas na
concentraccedilatildeo de 15 gL-1 de sacarose apresentaram menor
densidade estomaacutetica em ambas as faces (Tabela 5) com
formato anormal largos e salientes caracteriacutesticas estas
natildeo desejaacuteveis pois segundo Preece amp Sutter (1991)
uma alteraccedilatildeo a niacutevel estrutural eou morfoloacutegico podem
impedir o funcionamento do aparelho estomaacutetico e grande
parte dos estocircmatos assim formados satildeo incapazes de se
fechar
Possivelmente este resultado se deve agraves
caracteriacutesticas de vitrificaccedilatildeo que as folhas do
tratamento 15 gL-1 de sacarose e 70 mmol m-2s-1 de
intensidade luminosa apresentaram (BLANKE amp
BELCHERL 1989) e a falta de energia armazenada no
explante com a falta de carbono que eacute proveniente da
sacarose adicionada ao meio de cultura (DESJARDINS
et al 1995) Estes resultados corroboram os obtidos
por Vintildea et al (2001) que demonstraram que folhas
vitrificadas de abacateiro apresentaram estocircmatos
grandes com saliecircncia ceacutelulas subsidiaacuterias assimeacutetricas
e deformadas e seu ostiacuteolo completamente aberto Tal
anomalia pode ser atribuiacuteda agrave perda da elasticidade das
paredes das ceacutelulas-guarda o que impediria o seu
movimento de abertura e fechamento que
consequumlentemente afeta o desenvolvimento das
placircntulas ao serem transferidas para condiccedilotildees ex vitro
atraveacutes da excessiva perda de aacutegua
FOGACcedilA L A et al86
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
TABELA 5 ndash Densidade estocircmatica (estocircmatosmm2) da face adaxial e abaxial de folhas de Agapanthus umbellatus varminor multiplicadas em biorreator de imersatildeo temporaacuteria suplementado com diferentes concentraccedilotildees de sacarose eintensidade luminosa por um periacuteodo de 60 dias
Densidade estomaacutetica (estocircmatosmm2) Epiderme da face Adaxial Epiderme da face Abaxial
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1)
Concentraccedilatildeo Sacarose(gL1) 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia
0 000 000 000 d 000 000 000 d 15 2587 3026 2802 c 3408 4752 4053 c 30 6524 5628 6064 b 9977 8584 9268 b 45 5412 7016 6188 a 8809 10807 9783 a
Meacutedia 2856 b 3089 a 4256 a 4705 a CV 1474 1206
Meacutedias seguidas pela mesma letra nas linhas e colunas natildeo diferem significativamente pelo teste de Duncan a 5 deprobabilidade
CONCLUSAtildeO
Condiccedilotildees ambientais tais como intensidade
luminosa e concentraccedilatildeo de sacarose adicionada ao meio
de cultura influenciaram no desenvolvimento e
crescimento das placircntulas de Agapanthus umbellatus
var minor quando multiplicadas em meio liacutequido no BIT
Placircntulas de Agapantho foram incapazes de se
desenvolver em meio sem sacarose sendo portanto
necessaacuteria a adiccedilatildeo de uma fonte de carbono visto que a
espeacutecie em estudo apresentou uma taxa de fotossiacutentese
incapaz de assegurar um balanccedilo positivo em carbono
Houve uma grande variaccedilatildeo nas respostas obtidas
no entanto fazendo uma avaliaccedilatildeo em conjunto das
variaacuteveis recomenda-se 30 gL-1 de sacarose e intensidade
luminosa de 70 mmolm-2s-1 No entanto deve-se ressaltar
que estudos mais aprofundados devem ser conduzidos
para verificar o efeito destas combinaccedilotildees sobre o
desempenho de placircntulas durante a fase de aclimatizaccedilatildeo
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CAPACIDADE DE REGENERACcedilAtildeO IN VITRO DE TOMATEIROCULTIVAR SANTA CLARA
IN VITRO REGENERATION CAPACITY OF TOMATOPLANT CULTIVAR SANTA CLARA
GLAUCIA DE FATIMA MOREIRA VIEIRA E SOUZA1 JOSEacute MAGNO QUEIROZ LUZ2 ALCIONE SILVA ARRUDA3DENISE GARCIA SANTANA2 MARIANA DE SOUZA E SILVA DA COSTA TEIXEIRA4
LUCIANA LONDE5 ADELAIDE SIQUEIRA SILVA6 ELISAcircNGELA RODRIGUES FIGUEIRA7
1Mestranda em Fitotecnia ndash UFU ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash gfmvsyahoocombr2Professor Dr Instituto de Ciecircncias Agraacuterias ndash UFUICIAG ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash jmagnoumuaramaufubr3Dra em Geneacutetica e Bioquiacutemica Professora contratada da UEG ndash Unidade Universitaacuteria de Ipameri ndash Rodovia GO 330 Km 24 ndash Anel Viaacuterio SN ndash 75780-000 ndash Ipameri GO ndash asarrudahotmailcom4Engenheira Agrocircnoma ndash UFU ndash Conab Sede - SGAS 901 Bloco ldquoArdquo Lote 69 - Asa Sul ndash 70390-010 ndash Brasiacutelia DF ndash marisouza81yahoocombr5Dra em Geneacutetica e Bioquiacutemica ndash IGBUFU ndash Av Paraacute 1720 ndash Campus Umuarama ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash llondebolcombr6Mestranda em AgronomiaFitotecnia ndash UFUICIAG ndash Bolsista FAPEMIG ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash adelaidebioyahoocombr7Mestre em AgronomiaFitotecnia ndash UFUICIAG ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash Elis_figueirayahoocombr
RESUMOA cultivar de tomateiro Santa Clara (Lycopersicon
esculentum Mill) foi avaliada quanto ao seu potencial deregeneraccedilatildeo in vitro a partir de trecircs tipos de explantes e trecircsmeios de cultura seguidos de trecircs repicagens Os explantes foramcotileacutedone decapitado cotileacutedone fendido e cotileacutedone aparadonas extremidades Os meios de cultura foram MI macro emicronutrientes do MS vitaminas B5 de Gamborg et al (1968)suplementado com 30 gL de sacarose e de 8 gL de aacutegar pH 58MII meio MI suplementado com 1 mgL de BAP e 30 gL deglicose MIII meio MI suplementado com 25 mgL de BAP e02 mgL de AIA Para as repicagens foi utilizado o meio MIsuplementado com 05 mgL 08 mgL e 10 mgL de BAP paraa primeira segunda e terceira repicagens respectivamente Noenraizamento foi usado o meio MI suplementado com 05 mgL de AIA e as placircntulas enraizadas foram transferidas parasubstrato comercial Plantimax esterilizado e aclimatadas emlaboratoacuterio A maior induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo tanto de calosquanto de brotos foi observada nos meacutetodos cotileacutedone fendidoe cotileacutedone aparado quando colocados no meio MIII no entantoa induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo foi mais raacutepida quando usado cotileacutedonedecapitado indicando um alto potencial de organogecircneseespontacircnea sendo que o meio MI foi o melhor Os resultadosobtidos com as diferentes concentraccedilotildees de BAP nos trecircs ciclosde repicagem natildeo diferiram entre si e 82 das plantas enraizadasaclimataram-se com sucesso
Termos para indexaccedilatildeo Lycopersicon esculentummelhoramento do tomateiro cultura de tecidos
ABSTRACTThe tomato plant cultivar lsquoSanta Clararsquo (Lycopersicon
esculentum Mill) was evaluated as for its in vitro potential ofregeneration using three types of explants and three culture media
following three pricking-outs The explants were as followsdecapitated cotyledon split cotyledon and rim-trimmedcotyledon The culture media were MI MS macro andmicronutrients vitamins B5 of Gamborg et al (1968)supplemented with 30gL sucrose and 8gL agar pH 58 MIImedium MI supplemented with 1 mgL BAP and 30 gL glucoseMIII medium MI supplemented with 25 mgL BAP and 02mgL IAA For the pricking-outs the media MI wassupplemented with 05 mgL 08 mgL and 10 mgL BAP forthe first second and third pricking out respectively As forrooting the MI medium was supplemented with 05 mgL IAAand the rooted seedlings were transplanted to the sterilizedcommercial substrate Plantimax and then acclimatized inlaboratory Higher callus induction and sprout regeneration wasobserved for the methods of split and rim-trimmed cotyledonplaced into medium MIII Nevertheless the induction forregeneration was much faster when the decapitated cotyledonmethod was used indicating a high potential of spontaneousorganogenesis in which the media MI was the best The resultsobtained with the different concentrations of BAP in the threecycles of pricking-out did not differ among themselves and 82of the rooted plants were acclimatized successfully
Index terms Lycopersicon esculentum tomato breeding tissueculture
INTRODUCcedilAtildeO
O tomate pertence ao gecircnero Lycopersicon e a
espeacutecie cultivada cosmopolita eacute botanicamente
denominada de Lycopersicon esculentum (FILGUEIRA
2000) As cultivares atualmente plantadas podem ser
(Recebido em 03 de outubro de 2003 e aprovado em 04 de setembro de 2006)
Capacidade de regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro 89
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
reunidas em cinco grupos Santa Cruz Salada Cereja
Italiano Agroindustrial No presente trabalho foi utilizada
a cultivar Santa Clara do grupo Santa Cruz pois ela continua
sendo a cultivar mais plantada no Brasil
A tomaticultura estaacute associada a seacuterios problemas
fitossanitaacuterios sobretudo viroses aleacutem do ataque de
fungos bacteacuterias e insetos praga Cria-se com isto a
necessidade de se pesquisar novas alternativas ou
obtenccedilatildeo de novos genoacutetipos com resistecircncia muacuteltipla a
doenccedilas e pragas entre essas os estudos sobre
regeneraccedilatildeo e transformaccedilatildeo geneacutetica (FAacuteRI et al 2000)
A engenharia geneacutetica abriu uma nova perspectiva
para o melhoramento geneacutetico do tomateiro a partir do
final da deacutecada de 80 (WIJBRANDI amp BOTH 1993)
visando aumentar a produtividade e melhorar a qualidade
por meio da obtenccedilatildeo de resistecircncia a estresses bioacuteticos e
abioacuteticos A cultura de tecidos destaca-se durante o
processo de realizaccedilatildeo das teacutecnicas de transformaccedilatildeo
geneacutetica pois eacute necessaacuterio induzir gemas vegetativas e
em seguida regenerar brotos alongados e plantas
completas a partir de ceacutelulas ou tecidos geneticamente
modificados
Para a otimizaccedilatildeo de protocolos para o tomateiro
alguns fatores que afetam a eficiecircncia de transformaccedilatildeo
tecircm sido examinados dentre eles o tamanho do explante e
o tipo de explante hipocoacutetilo ou cotileacutedone (FRARY amp
EARLE 1996)
No Brasil haacute poucos trabalhos na aacuterea de
regeneraccedilatildeo in vitro e de transformaccedilatildeo geneacutetica de
cultivares de tomateiro e pouco se conhece sobre a
capacidade de regeneraccedilatildeo das principais cultivares
brasileiras (FAacuteRI et al 2000) Alguns pesquisadores como
Faria amp Illg (1993) analisaram a regeneraccedilatildeo in vitro de
algumas espeacutecies e cultivares de tomateiro observando
uma baixa capacidade morfogecircnica das cultivares se
comparadas com a espeacutecie selvagem Lycopersicon
pimpinellifolium (L) P Miller
Com este trabalho objetivou-se teve como objetivo
avaliar o potencial de regeneraccedilatildeo in vitro da cultivar Santa
Clara do grupo Santa Cruz a partir de diferentes tipos de
explantes e meios de cultura criando e otimizando
protocolos para sua regeneraccedilatildeo in vitro
MATERIAL E MEacuteTODOS
No Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos Vegetais do
Instituto de Geneacutetica e Bioquiacutemica da Universidade Federal
de Uberlacircndia foi avaliada a capacidade de regeneraccedilatildeo
in vitro do tomateiro cultivar Santa Clara usando trecircs
tipos de explantes e trecircs meios de cultura seguido de trecircs
repicagens O experimento foi realizado em delineamento
em blocos casualizados em esquema fatorial (3x3) com trecircs
repeticcedilotildees As plantas regeneradas foram enraizadas e
aclimatadas em laboratoacuterio
Sementes comerciais da cultivar Santa Clara apoacutes
serem desinfestadas por um minuto em aacutelcool etiacutelico a 96
e em hipoclorito de soacutedio comercial a 20 (vv) com duas
gotas de detergente comercial durante 25 minutos foram
enxaguumladas 5 vezes em aacutegua bidestilada esterilizada e
inoculadas em meio MS 100 (MURASHIGE amp SKOOG
1962) solidificado com 7 g L-1 de aacutegarndashaacutegar por sem
reguladores de crescimento O meio foi distribuiacutedo em
frascos de vidro esteacutereis utilizados para cultura de tecidos
com 30 mL de meio MS As culturas foram mantidas em
sala de crescimento com temperatura de 25+2 ordmC
fotoperiacuteodo de 16 horas e luminosidade de 50 mmol m-2s-
1 As placircntulas obtidas aos 14 15 e 20 dias apoacutes a semeadura
foram usadas como fonte de explantes para os blocos 1 2
e 3 respectivamente Os explantes foram inoculados de
acordo com os meacutetodos descritos a seguir em placas de
Petri devidamente esterilizadas e autoclavadas contendo
30 mL de meio de cultura com 16 unidades por tipo de
explante por meio de cultura utilizado Cada 16 explantes
constituiu uma parcela do experimento sendo composta
por duas placas de Petri cada uma com 8 explantes
Os tipos de explantes foram os seguintes
A - que consistiu na decapitaccedilatildeo de placircntulas onde
essa decapitaccedilatildeo ocorreu diretamente abaixo do noacute do
cotileacutedone ficando o hipocoacutetilo com as radiacuteculas
SOUZA G de F M V e et al90
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
B - meacutetodo de cotileacutedones fendidos os cotileacutedones
foram fendidos ao longo da nervura central da extremidade
ateacute sua metade de acordo com o protocolo de Faacuteri et al
(2000)
C - cotileacutedones foram aparados e seguiu-se o
protocolo descrito por Redenbaugh et al (1992) Os
cotileacutedones aparados nas extremidades distal e proximal
(aacutepice e peciacuteolo) foram inoculados com a face abaxial em
contato com o meio
Foram realizadas trecircs repicagens para alongar os
brotos Cerca de 30 dias apoacutes a inoculaccedilatildeo dos explantes
foi realizada a primeira repicagem Os intervalos entre as
repicagens foram em torno de 5 semanas
Os tratamentos consistiram na inoculaccedilatildeo dos trecircs
tipos de explantes descritos nos trecircs meios de cultura
abaixo com trecircs repeticcedilotildees por tratamento
Meio MI macro e micronutrientes de Murashige amp
Skoog (1962) e vitaminas B5 de Gamborg et al (1968)
suplementado com 30 gL de sacarose e de 8 gL de aacutegar-
aacutegar pH 58 meio MII meio de cultura MI suplementado
com 1 mgL de zeatina e 30 gL de glicose conforme
McCormick (1991) meio MIII meio de cultura MI
suplementado com 25 mgL de BAP e 02 mgL de AIA
segundo Rhim et al (1995)
Para as repicagens foi utilizado o meio MI
suplementado com 05 mgL 08 mgL e 10 mgL de BAP
para a primeira segunda e terceira repicagens
respectivamente
Para enraizamento foi usado o meio MI
suplementado com 05 mgL de AIA As placircntulas
enraizadas foram transferidas para substrato comercial
Plantimax esterilizado e aclimatadas em laboratoacuterio
Os brotos com 2 cm de comprimento foram
transferidos para o meio de enraizamento citado e
permaneciam nesse meio durante 15 dias Apoacutes esse periacuteodo
os brotos eram transplantados para substrato comercial
Plantimax autoclavado irrigados com aacutegua uma a duas
vezes por dia ateacute a aclimataccedilatildeo A aclimataccedilatildeo ocorreu em
torno de 20 dias em condiccedilotildees de laboratoacuterio
Avaliou-se a induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo o
alongamento de brotos e o enraizamento e aclimataccedilatildeo
das plantas regeneradas
Os dados de contagem foram transformados para
50x As anaacutelises de normalidade e homogeneidade
foram realizadas pelo software Prophet Os dados obtidos
foram submetidos agrave anaacutelise de variacircncia e as meacutedias
comparadas pelo teste de Tukey ao niacutevel de 5 de
probabilidade pelo software SANEST (ZONTA amp
MACHADO 1989)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Para cotileacutedone decapitado ocorreu um iniacutecio de
formaccedilatildeo de calosidade por volta de 10 dias apoacutes inoculaccedilatildeo
e o surgimento de brotos ocorreu cerca de 12 dias depois da
inoculaccedilatildeo sem a formaccedilatildeo de calos propriamente ditos A
induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo foi mais raacutepida quando usado esse
tipo de explante indicando um alto potencial de
organogecircnese espontacircnea sendo que o meio MI foi o melhor
para a induccedilatildeo e nuacutemero total de brotos (Tabela 1)
No cotileacutedone fendido o iniacutecio de formaccedilatildeo de
calosidade aconteceu com aproximadamente 10 dias apoacutes
inoculaccedilatildeo Por volta de 18 dias depois da inoculaccedilatildeo
iniciou-se o surgimento de brotos e jaacute existiam calos
formados Para esse tipo de explante nos meios MI e MII
ocorreu apenas a formaccedilatildeo de calos enquanto no meio
MIII ocorreu a formaccedilatildeo de calos e calos com brotos sendo
alto o nuacutemero total de brotos (Tabela 1) Supotildee-se que a
maior superfiacutecie de corte tenha influecircncia significativa
sobre esse fenocircmeno onde a maior superfiacutecie de corte do
cotileacutedone resulta em maior capacidade de regeneraccedilatildeo
(FAacuteRI et al 1995b)
No cotileacutedone aparado com cerca de 10 dias apoacutes
inoculaccedilatildeo ocorreu o iniacutecio de formaccedilatildeo de calos e 20 dias
depois da inoculaccedilatildeo ocorreu o surgimento de brotos e jaacute
existiam calos formados Para esse tipo de explante nos
meios MI MII e MIII ocorreu a formaccedilatildeo de calos no
entanto apenas no meio MIII ocorreu a formaccedilatildeo de calos
com brotos (Tabela 1)
Capacidade de regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro 91
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
TABELA 1 ndash Frequumlecircncia de induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo in vitro da cultivar Santa Clara do grupo Santa Cruz UberlacircndiaUFU 2001
Dados seguidos de mesma letra nas colunas (abc) e nas linhas (AB) natildeo diferem entre si a 5 de probabilidade peloteste de TukeyA diferenccedila entre o nordm de explantes de um meacutetodo para outro eacute devida a parcelas (ou parte delas) perdidas
Nos trecircs ciclos de repicagens a capacidade de
alongamento dos brotos foi igual indicando que as
concentraccedilotildees de BAP natildeo diferiram estatisticamente entre
si dentro de cada tipo de explante Em relaccedilatildeo ao nuacutemero
de brotos alongados na primeira e terceira repicagens o
cotileacutedone decapitado apresentou maior nuacutemero jaacute na
segunda repicagem natildeo houve diferenccedila entre os tipos de
explantes (Tabela 2)
As plantas apoacutes serem enraizadas foram
transferidas para aclimataccedilatildeo obtendo-se 82 de plantas
aclimatadas Cerca de 20 dias apoacutes transplantio para o
substrato as plantas jaacute estavam aclimatadas
Apoacutes a terceira repicagem ainda existiam cerca de
334 brotos para serem novamente repicados e 51 brotos
prontos para serem enraizados perfazendo um total geral
de 549 brotos obtidos ateacute a fase estudada
Para o tipo de explante cotileacutedone decapitado foram
obtidos 181 brotos equivalentes a 174 brotos por explante
Para o explante cotileacutedone fendido o nuacutemero de brotos por
Tipos de Explantes Variaacuteveis Meios Cotileacutedone decapitado Cotileacutedone fendido Cotileacutedone aparado
I 396 aA 050 cB 142 bB II 000 bB 632 bA 672 aA Nordm de explantes
com calos III 000 bB 1599 aA 597 bB I 1095 aA 000 bB 000bB II 050 bA 000 bA 000 bA Nordm de explantes
com brotos III 130 bB 1217 aA 850 aA I 396 aA 050 cB 169 cB II 000 bB 632 bA 645 bA Nordm total de
calos III 000 bB 3630 aA 2655 aA I 1850 aA 000 bB 000 bB II 050 bA 000 bA 000 bA Nordm total de
brotos III 130 bB 2760 aA 2934 aA I 48 32 40 II 32 40 32 Nordm de
explantes III 24 40 48 Total de explantes 104 112 120
explante foi igual a 145 e para o cotileacutedone aparado foram
obtidos 170 brotos por explante Esses resultados foram
semelhantes aos obtidos por Faacuteri et al (2000) para as
cultivares IPA-5 e IPA-6 os quais concluiacuteram que a
utilizaccedilatildeo de cotileacutedones fendidos e cotileacutedones aparados
produziram uma regeneraccedilatildeo alta e onde a maior induccedilatildeo
foi conseguida utilizando-se um meio igual ao MIII utilizado
nesse experimento A induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo tambeacutem foi
mais raacutepida quando usado cotileacutedone decapitado indicando
um alto potencial de organogecircnese espontacircnea A cultivar
Santa Clara mostrou-se mais eficiente na formaccedilatildeo de
brotos alongados observados na primeira repicagem
enquanto as cultivares utilizadas por Faacuteri et al (2000) IPA-
5 e IPA-6 necessitaram de duas repicagens para o
alongamento dos brotos no entanto a cultivar IPA-5
mostrou-se mais eficiente na produccedilatildeo de brotos por
explante Faacuteri et al (2000) utilizaram zeatina durante os trecircs
ciclos de repicagem enquanto nesse experimento foi
utilizado BAP
SOUZA G de F M V e et al92
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
TABELA 2 ndash Capacidade de alongamento e enraizamento de brotos da cultivar Santa Clara durante os trecircs ciclos derepicagem Uberlacircndia UFU 2001
Dados seguidos de mesma letra nas colunas (ab) e nas linhas (AB) natildeo diferem entre si a 5 de probabilidade peloteste de TukeyTipos de explantes A - cotileacutedone decapitado B - cotileacutedone fendido C - cotileacutedone aparado
Os resultados aqui obtidos tambeacutem foram
semelhantes aos de Faacuteri et al (1995b) que trabalhando
com transformaccedilatildeo geneacutetica da berinjela (Solanum
melongena L) observaram que a maior superfiacutecie de corte
do cotileacutedone resultou em maior capacidade de
regeneraccedilatildeo Tambeacutem foram obtidos resultados
semelhantes aos de Nogueira et al (2001) que estudando
a regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro Santa Clara utilizando
como explantes cotileacutedones concluiacuteram que o meio com
uma combinaccedilatildeo adequada de auxina e citocinina (10 mg L-
1 de zeatina e 01 mg L-1 de AIA) promoveu uma maior
meacutedia de regeneraccedilatildeo e um maior nuacutemero meacutedio de brotaccedilotildees
por explante Costa et al (2000) trabalhando com as
cultivares IPA-5 e IPA-6 chegaram a uma conclusatildeo
semelhante onde meio suplementado com 10 mg L-1 de
zeatina + 01 mg L-1 de AIA e meio suplementado com 25
mg L-1 de BAP + 02 mg L-1 de AIA determinaram a maior
frequumlecircncia de regeneraccedilatildeo de explantes cotiledonares e
tambeacutem um maior nuacutemero de brotos alongados por explante
McCormick et al (1986) pesquisando a morfogecircnese
in vitro de L esculentum observaram que a presenccedila de 25
mg L-1 de BAP e 10 mg L-1 de AIA ou 10 mg L-1 de BAP e
02 mg L-1 de AIA produziu um maior nuacutemero de ramos por
explante a partir de explantes de cotileacutedones e hipocoacutetilos
Ohki et al (1978) utilizando segmentos de hipocoacutetilos de L
esculentum sugeriram que o efeito positivo da combinaccedilatildeo
de auxinas e citocininas na regeneraccedilatildeo in vitro pode ser
causado por uma maior capacidade das ceacutelulas dessa espeacutecie
em utilizar e adaptar-se agrave combinaccedilatildeo de auxinas e citocininas
de que somente citocininas Para os mesmos autores a
variabilidade observada nas respostas morfogecircnicas in vitro
para diferentes citocininas pode ser causada pela variaccedilatildeo
na razatildeo de degradaccedilatildeo dessas substacircncias nos tecidos
vegetais ou no meio de cultivo Segundo Caldas et al (1999)
uma alta relaccedilatildeo citocininaauxina normalmente leva a maior
induccedilatildeo de parte aeacuterea (brotos) em explantes in vitro
principalmente quando a citocinina usada eacute o BAP que induz
a formaccedilatildeo de grande nuacutemero de brotos e alta taxa de
multiplicaccedilatildeo em muitos sistemas de micropropagaccedilatildeo
Tanto no presente trabalho quanto nos trabalhos acima
citados foram utilizados meios com pelo menos uma
combinaccedilatildeo com alta relaccedilatildeo citocininaauxina e meios
contendo apenas citocinina
CONCLUSOtildeES
A maior induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo tanto de calos
quanto de brotos foi observada nos meacutetodos cotileacutedone
fendido e cotileacutedone aparado quando colocados no meio
com BAP (25 mgL) e AIA (02 mgL) (MIII) Um ciclo de
repicagem foi suficiente para obtenccedilatildeo de brotos
alongados A maior regeneraccedilatildeo de brotos alongados
ocorreu com o meacutetodo cotileacutedone decapitado
Meios M1 + 05 mgL BAP M1 + 08 mgL BAP M1 + 10 mgL BAP
Repicagem 1 Repicagem 2 Repicagem 3
M1+ 05 mgl AIA
Tipos de Explante
s
Nordm total de brotos
Nordm de brotos
alongados
Nordm total de brotos
Nordm de brotos
alongados
Nordm total de brotos
Nordm de brotos
alongados
Nordm total de placircntulas
enraizadas
Nordm total de
plantas aclimatadas
Nordm total geral de brotos
A 3117 bA 899 aA 3684 bA
866 aA 3174 bA
81 aA 80 67 181 B 536 aA 466 bA 6244 aA 633 aA 5158 aA 450 bA 41 33 163 C 3527 bA 400 bA 4368 bA
566 aA 3928 bA
312 bA 43 35 205
Total 164 135 549
Capacidade de regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro 93
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
AGRADECIMENTOS
Ao Instituto de Geneacutetica e Bioquiacutemica e ao Instituto
de Ciecircncias Agraacuterias da Universidade Federal de
Uberlacircndia pelo financiamento deste projeto e a todos
que auxiliaram direta eou indiretamente
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CALLUS INDUCTION FROM ANTHER CULTURE OF COFFEE PLANT (Coffea arabica L) CV CATUAIacute VERMELHO 99 AND 44
ADELAIDE SIQUEIRA SILVA1 JOSEacute MAGNO QUEIROZ LUZ2 DENISE GARCIA SANTANA2 PATRIacuteCIA CRYSTIE VIEIRA MUSTAFA3 MOACIR PASQUAL4 GLAUCIA DE FATIMA MOREIRA VIEIRA E SOUZA2
1Mestranda do Curso de Agronomia ndash Universidade Federal de UberlacircndiaUFU ndash Av Engenheiro Diniz 1178 ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash adelaidebioyahoocombr2Professor Dr ndash Universidade Federal de UberlacircndiaUFU ndash Instituto de Ciecircncias Agraacuterias ndash Curso de Agronomia ndash AV Paraacute Bloco 2E SALA 14campus Umuarana ndash Caixa-Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG3Bioacuteloga Universidade Federal de UberlacircndiaUFU ndash Centro de Ciecircncias Biomeacutedicas ndash Departamento de Agronomia ndash Rua Amazonas snordm - Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos sala 2E-14 ndash Umuarama ndash 38400920 ndash Uberlandia MG ndash patriciacrystiezipmailcombr
4Doutor Departamento de Adgricultura DAG ndash Universidade Federal de Lavras UFLA ndash Campus universitaacuterio ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash mpasqualuflabr
RESUMONo Brasil o cafeacute ainda apresenta poucos progressos com
relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo da cultura de tecidos vegetais tornando-se degrande importacircncia o conhecimento sobre a atuaccedilatildeo dosreguladores de crescimento Com este trabalho avaliou-se ocomportamento de duas cultivares de Coffea arabica L CatuaiacuteVermelho LCH-2077-2-5-99 e LCH-2077-2-5-44 denominadasrespectivamente de Catuaiacute Vermelho 99 e Catuaiacute Vermelho 44quanto agrave ausecircncia e presenccedila de luz e quantificou-se a interaccedilatildeoentre os reguladores de crescimento 24-D e BAP O experimentofoi realizado no Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos Vegetais daUniversidade Federal de Uberlacircndia As anteras das cultivaresCatuaiacute Vermelho 99 e 44 foram inoculadas em meio basal MSsuplementado com quatro concentraccedilotildees de 24-D (905 181271 e 362 mM) e duas concentraccedilotildees de BAP (0 e 89 mM) napresenccedila de luz e ausecircncia de luz As avaliaccedilotildees para a oxidaccedilatildeointumescimento e calosidade foram realizadas aos 30 dias apoacutes ainoculaccedilatildeo no meio de cultura e o diacircmetro dos calos aos 45 diasApoacutes 30 dias de cultivo os calos obtidos foram classificados emfriaacuteveis esverdeados esbranquiccedilados e cinza Os resultadosmostraram que para ocorrer intumescimento das anterasformaccedilatildeo e aumento do tamanho dos calos de ambas cultivares eacutenecessaacuterio que haja interaccedilatildeo entre a auxina (24-D) e a citocinina(BAP) Dentre os tipos de calos os de coloraccedilatildeo cinza foram osque apresentaram maior frequumlecircncia para as duas cultivares
Termos para indexaccedilatildeo Melhoramento calos reguladores decrescimento cafeeiro
ABSTRACTIn Brazil coffee still presents little progress regarding
the application of plant tissue culture which turns important theunderstanding of the action of growth regulators This workevaluated the in vitro performance of two Coffea arabica Lcultivars Catuaiacute Vermelho LCH-2077-2-5-99 and LCH-2077-2-5-44 known as Catuaiacute Vermelho 99 and Catuaiacute Vermelho 44respectively in the presence and absence of light and theinteraction of 24-D and BAP The experiment was carried out at
the Plant Tissue Culture Laboratory of the Universidade Federalde Uberlacircndia Anthers from both cultivars were inoculated inMS basal medium supplemented with four concentrations of24-D (905 181 271 and 362 mM) and two concentrations ofBAP (0 or 89 mM) in the presence and absence of lightOxidation intumescences and callus formation evaluations wereobtained 30 days after inoculation and callus diameter measuredat 45 days of inoculation The observed callus was classified asfriable greenish whitish or gray The results showed that antherintumescences callus formation and growth of both cultivarsdemand the interaction between the auxin (24-D) and thecytokinin (BAP) Callus presenting gray color were the mostfrequent for both cultivars
Index terms Plant breeding callus growth regulators coffee plant
INTRODUCcedilAtildeO
O cafeeiro pertence agrave famiacutelia Rubiaceae na qual o
gecircnero Coffea abrange cerca de 60 espeacutecies sendo as mais
comuns no mercado Coffea araacutebica L e Coffea canephora
Pierre ex Froehn Os programas de melhoramento do cafeacute
demandam aproximadamente 25 anos desde a hibridaccedilatildeo
ateacute a obtenccedilatildeo de uma nova cultivar (PASQUAL et al
2002) A cultura de anteras eacute considerada uma ferramenta
importante pois possibilita a obtenccedilatildeo de linhas
homozigoacuteticas em uma uacutenica etapa (ANDRADE 1998)
acelerando drasticamente o processo de obtenccedilatildeo de novas
cultivares Sendo assim a teacutecnica de cultura de anteras
vem auxiliar no melhoramento da cultura pois permite a
obtenccedilatildeo de haploacuteides em geraccedilotildees segregantes o que
leva agrave raacutepida produccedilatildeo de plantas homozigotas por meio
(Recebido em 14 de outubro de 2003 e aprovado em 29 de outubro de 2006)
Induccedilatildeo de calos a partir de cultura 95
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
da duplicaccedilatildeo do nuacutemero de cromossomos numa uacutenica
etapa substituindo as geraccedilotildees de auto fecundaccedilatildeo
Acrescenta-se a isso o fato de os haploacuteides serem livres
dos problemas de dominacircncia e recessividade por possuir
apenas um alelo em cada loco gecircnico
No Brasil Coffea arabica ainda apresenta poucos
progressos com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo da cultura de anteras
Daiacute a importacircncia de se produzir mais conhecimentos sobre
a atuaccedilatildeo dos reguladores de crescimento na expressatildeo
androgeneacutetica de Coffea arabica identificaccedilatildeo de
genoacutetipos androgecircnicos bem como a determinaccedilatildeo de
condiccedilotildees fiacutesicas mais adequadas agrave incubaccedilatildeo de anteras
nessa espeacutecie
Nos programas de melhoramento as teacutecnicas
convencionais tecircm apresentado resultados promissores
na cultura do cafeacute no que se refere ao aumento de
produtividade e obtenccedilatildeo de novas cultivares Um fator
importante para o sucesso da cultura de anteras eacute conhecer
o estaacutedio ideal de desenvolvimento dos microacutesporos com
o intuito de se obter uma melhor resposta androgeneacutetica
utilizando microacutesporos receacutem-liberados da teacutetrade meioacutetica
ateacute no maacuteximo o estaacutedio binucleado A fase uninucleada
responde positivamente ao processo embriogecircnico porque
nesta fase os microacutesporos apresentam uma parede celular
delgada o que a torna mais receptiva aos fatores externos
Em estaacutedios mais avanccedilados da microsporogecircnese ocorre
um engrossamento da parede celular sendo esta uma
caracteriacutestica do gratildeo de poacutelen maduro do cafeacute
prejudicando o processo de regeneraccedilatildeo (ASCANIO amp
ARCIA 1994) Os autores Grando amp Moraes Fernandes
(1993) sugerem que o potencial embriogecircnico do gratildeo de
poacutelen pode ser determinado tanto no periacuteodo da meiose
quanto no periacuteodo da preacute-mitose do microacutesporo pois
nestes dois momentos o microacutesporo ainda teria
metabolicamente caracteriacutesticas esporofiacuteticas o que
permite a diferenciaccedilatildeo do gratildeo de poacutelen em embriatildeo e
posterior formaccedilatildeo de uma planta
Segundo Mantell et al (1994) satildeo possiacuteveis vaacuterios
tipos de desenvolvimento do microacutesporo in vitro sendo
que tanto o nuacutecleo generativo quanto o vegetativo pode
se dividir continuamente originando um embrioacuteide
haploacuteide ou ainda a primeira mitose produziria dois nuacutecleos
semelhantes e estes se dividiriam repetidamente resultando
na formaccedilatildeo de embrioacuteides haploacuteides
A composiccedilatildeo do meio de cultura tambeacutem eacute de
grande importacircncia para o sucesso da cultura de anteras
natildeo existindo contudo uma recomendaccedilatildeo generalizada
Na maioria das espeacutecies a androgecircnese se verifica em meios
que conteacutem sais minerais sacarose vitaminas reguladores
de crescimento e aacutegar (MORAES FERNANDES 1990) A
consistecircncia do meio normalmente eacute semi-soacutelida mas os
meios liacutequidos estatildeo sendo cada vez mais usados pois
tecircm vantagens no aumento do rendimento pela maior
obtenccedilatildeo de embriotildees e calos (PIERIK 1987) O
presente trabalho teve como objetivo aplicar a teacutecnica da
cultura de anteras em diferentes cultivares de Coffea
arabica verificando os vaacuterios fatores que influenciam a
induccedilatildeo de calos
MATERIAL E MEacuteTODOS
Experimentos de Induccedilatildeo e Regeneraccedilatildeo de Calos
Esta etapa constituiu-se de dois experimentos cada
um com uma cultivar tendo sido conduzidos no laboratoacuterio
de Cultura de Tecidos Vegetais da Universidade Federal
de Uberlacircndia em Uberlacircndia - Minas Gerais no periacuteodo
de setembro de 2002 a janeiro de 2003
Foram utilizados bototildees florais de duas cultivares
de Coffea araacutebica Catuaiacute Vermelho LCH-2077-2-5-99 e
LCH-2077-2-5-44 denominadas respectivamente de Catuaiacute
Vermelho 99 e Catuaiacute Vermelho 44 plantadas na aacuterea
experimental do Campus Umuarama dessa Universidade
Os bototildees florais foram coletados no periacuteodo de 8 agraves 9
horas da manhatilde e armazenados em placas de Petri contendo
papel de filtro umedecido em aacutegua destilada e colocados
dentro de uma caixa de isopor para evitar a desidrataccedilatildeo
ateacute serem conduzidos ao laboratoacuterio
No laboratoacuterio o comprimento dos bototildees foi
medido com o auxiacutelio de um paquiacutemetro e utilizaram-se
SILVA A S et al96
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
bototildees florais entre 45 a 60 mm de comprimento em todos
os experimentos Os bototildees foram envoltos em gaze
previamente autoclavada e desinfestados em uma soluccedilatildeo
de aacutelcool 70 por alguns segundos e por 10 minutos em
soluccedilatildeo de hipoclorito de soacutedio a 02 sob agitaccedilatildeo Em
seguida na cacircmara de fluxo laminar foram lavados 3 vezes
em aacutegua destilada e autoclavada Apoacutes este processo as
anteras foram retiradas dos bototildees com o auxiacutelio de uma
lupa uma pinccedila fina e bisturi nordm 10 sendo os uacuteltimos
flambados para cada botatildeo tomando-se o cuidado para
natildeo ferir as anteras Logo apoacutes as anteras foram imersas
por 1 segundo em soluccedilatildeo de aacutecido ascoacuterbico na
concentraccedilatildeo de 600 mgL-1 hipoclorito de soacutedio 02 e
aacutegua destilada e autoclavada respectivamente
Apoacutes este processo as anteras foram inoculadas
em tubo de ensaio contendo 20 mL do meio MS
(MURASHIGE amp SKOOG 1962) suplementado com aacutecido
24-diclorofenoxiaceacutetico (24-D) e 6- benzilaminopurina
(BAP) em diferentes concentraccedilotildees com pH ajustado para
58 Este meio foi esterilizado em autoclave vertical agrave
temperatura de 121deg C sob pressatildeo de 1 atm por 20 minutos
O delineamento experimental utilizado foi o de
blocos casualizados com 10 repeticcedilotildees em esquema fatorial
4 x 2 x 2 sendo que os fatores foram compostos de quatro
concentraccedilotildees de 24-D (905 181 271 362 mM) duas
concentraccedilotildees de BAP (0 e 89 mM) perfazendo oito
tratamentos incubados na ausecircncia ou presenccedila de luz
em sala de crescimento com temperatura de 25 plusmn 2degC e 16
horas de fotoperiacuteodo Nos dois experimentos cada
tratamento teve 10 repeticcedilotildees sendo um tubo com 10
anteras considerado uma repeticcedilatildeo
Aos 30 dias apoacutes a inoculaccedilatildeo das anteras foram
avaliadas as porcentagens de oxidaccedilatildeo de intumescimento
e de formaccedilatildeo de calos (calosidade) e aos 45 dias foi medido
o diacircmetro dos calos
Os calos obtidos das duas cultivares apoacutes 45 dias
de inoculaccedilatildeo das anteras foram transferidos para o meio
MS suplementado com 30 gL-1 de sacarose 6gL-1 de agar e
de 24-DBAP nas seguintes concentraccedilotildees de 1810 181
2 2710 e 3620 mM com pH ajustado para 58 associando
a ausecircncia e presenccedila de luz
Apoacutes a permanecircncia destes calos no meio de cultura
por 30 dias aqueles provenientes da cultivar Catuaiacute
Vermelho 99 incubados na presenccedila de luz foram
transferidos para o meio de cultura contendo 271 mM de
24-D enquanto que aqueles incubados na ausecircncia de
luz foram transferidos para meio contendo 362 mM de 24-
D Jaacute os calos da cultivar Catuaiacute Vermelho 44 incubados
na presenccedila de luz foram transferidos para meio contendo
181 mM de 24-D e 89 mM de BAP e os incubados na
ausecircncia de luz transferidos para o meio contendo 181
mM de 24-D
Apoacutes 30 dias neste tratamento foram avaliadas as
caracteriacutesticas referentes ao tipo de calo (friaacuteveis
esverdeados esbranquiccedilados e cinza)
Os dados obtidos foram testados quanto agrave
normalidade e agrave homogeneidade necessitando de
transformaccedilatildeo em arco seno para os dados em
porcentagem e raiz quadrada de (x + 05) para os dados
referentes ao diacircmetro dos calos
RESULTADOS
Interaccedilatildeo entre os Reguladores de Crescimento e oFotoperiacuteodo
Para a cultivar Catuaiacute 99 em todas as concentraccedilotildees
de 24-D e independentemente da concentraccedilatildeo de BAP a
oxidaccedilatildeo foi menor na ausecircncia de luz diferindo
estatisticamente da fase em que se tinha presenccedila de luz
No entanto nos calos cultivados nas concentraccedilotildees de
905 e 271 mM de 24-D e 89 mM de BAP na ausecircncia de
luz foi observado um aumento significativo na oxidaccedilatildeo
das anteras o mesmo acontecendo na concentraccedilatildeo de
271 mM de 24-D na presenccedila de luz No entanto resultado
inverso foi observado para a concentraccedilatildeo de 362 mM de
24-D (Tabela 1)
Os resultados do percentual de intumescimento
variaram bastante em funccedilatildeo da luminosidade e
reguladores de crescimento (Tabela 1) Na presenccedila do
Induccedilatildeo de calos a partir de cultura 97
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
BAP e concentraccedilatildeo 89 mM de 24-D tanto na presenccedila
ou ausecircncia de luz o intumescimento dos calos natildeo diferiu
significativamente Jaacute na concentraccedilatildeo de 181 mM de 24-
D na presenccedila de luz se mostrou melhor promovendo um
aumento significativo do intumescimento das anteras
Quanto agraves concentraccedilotildees de 271 e 362 mM de 24-D
cultivados na presenccedila de luz se mostrou melhor ao
intumescimento quando comparado agravequeles cultivados na
ausecircncia de luz (Figura 1)
A presenccedila de calos aumentou significativamente
com a incubaccedilatildeo das anteras na ausecircncia de luz e na
TABELA 1 ndash Meacutedias do nuacutemero de anteras oxidadas intumescidas e com calos e diacircmetro dos calos (mm) em funccedilatildeode diferentes concentraccedilotildees de 24-D e ausecircncia ou presenccedila de BAP em duas condiccedilotildees de luminosidade (presenccedilaou ausecircncia de luz) para anteras do genoacutetipo cv 99
Luminosidade1
Oxidaccedilatildeo () Intumescimento ()
Calosidade () Diacircmetro (mm) 24-D M
BAP M luz Escuro Luz Escuro luz Escuro luz Escuro 0 980 b A 395 a A 000b B 434 a A 000 b A 740 a A 000 b A 309 a A 905
89 999 b A 823 a B 398 a A 327 a B 007 b A 615 a A 000 b A 300 a A 0 999 b A 524 a A 000 b B 447 a A 007 b A 750 a A 000 b B 368 a A
181 89 935 b A 511 a A 614 a A 407 b A 030 b A 720 a A 300 b A 387 a A
0 745 b A 000 a A 534 a A 000 b B 530 a A 000 b B 318 a B 000 b B 271
89 914 b B 590 a B 625 a A 634 a A 708 a A 809 a A 377 a A 298 b A 0 999 b B 440 a A 607 a A 492 b A 097 b B 815 a A 300 a B 277 a A
362 89 813 b A 426 a A 493 a B 527 a A 378 b A 758 a A 398 a A 298 b A
1Meacutedias seguidas por letras diferentes minuacutesculas na linha e maiuacutesculas na coluna dentro de cada concentraccedilatildeo de 2-4-D diferem entre si pelo teste de Tuckey a significacircncia de 5
concentraccedilatildeo de 271 mM de 24-D nas demais
concentraccedilotildees de 24-D independente da concentraccedilatildeo
do BAP a incubaccedilatildeo na ausecircncia de luz apresentou
meacutedias de calosidade significativamente maiores (Figura
2) A presenccedila do BAP promoveu aumento significativo
na calosidade das anteras na concentraccedilatildeo 271 mM de
24-D na ausecircncia de luz e na concentraccedilatildeo de 362 mM
de 24-D na presenccedila de luz Nas demais concentraccedilotildees
natildeo houve diferenccedila significativa entre presenccedila ou
ausecircncia de BAP tanto na ausecircncia ou presenccedila de luz
(Tabela 1)
FIGURA 1 ndash Anteras da cv Catuaiacute Vermelho 99 naconcentraccedilatildeo de 181 M de 24-D na presenccedila de luz
FIGURA 2 ndash Calos de anteras incubadas na ausecircncia deluz e na concentraccedilatildeo de 271 M de 24-D
SILVA A S et al98
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
Quanto ao diacircmetro nas concentraccedilotildees 905 e 181 M
de 24-D a ausecircncia de luz promoveu aumento significativo
no diacircmetro dos calos diferindo-se estatisticamente do
tratamento na presenccedila de luz Somente para a concentraccedilatildeo
de 271 mM de 24-D na ausecircncia do BAP natildeo houve diferenccedila
significativa para a caracteriacutestica independentemente do
fotoperiacuteodo Nas demais concentraccedilotildees de 24-D o tratamento
na presenccedila de luz promoveu um aumento significativo no
diacircmetro dos calos No tratamento em que houve a associaccedilatildeo
da presenccedila de luz e de BAP natildeo diferiu estatisticamente do
tratamento em que houve a ausecircncia de BAP quando a
concentraccedilatildeo de 24-D foi de 905 mM nos demais
proporcionou aumento significativo no diacircmetro dos calos
Para o tratamento na ausecircncia de luz apenas na concentraccedilatildeo
de 271 mM de 24-D a ausecircncia de BAP promoveu diminuiccedilatildeo
significativa no diacircmetro de calos Nas demais concentraccedilotildees
natildeo houve diferenccedila significativa entre presenccedila ou ausecircncia
de BAP (Tabela 1)
Para as variaacuteveis intumescimento e calosidade da
cultivar cv 44 a interaccedilatildeo entre 24-D e BAP natildeo diferiram
estatisticamente quanto presenccedila e ausecircncia de luz nas
concentraccedilotildees 905 e 362 mM de 24-D e que tambeacutem natildeo
difere para o diacircmetro na concentraccedilatildeo de 181 mM de 24-
D Jaacute na concentraccedilatildeo 271 mM de 24-D haacute uma semelhanccedila
quanto ao intumescimento calosidade e diacircmetro que
diferem das demais concentraccedilotildees natildeo apresentando
portanto uma boa interaccedilatildeo
A melhor interaccedilatildeo para intumescimento calosidade
e diacircmetro encontra-se respectivamente na concentraccedilatildeo
905 mM de 24-D na presenccedila de luz na concentraccedilatildeo 181
mM de 24-D na ausecircncia de luz e na concentraccedilatildeo 905
mM de 24-D na ausecircncia de luz Jaacute as piores interaccedilotildees
estatildeo na concentraccedilatildeo 271 mM de 24-D na luz tanto para
o intumescimento quanto para o diacircmetro analisados na
Tabela 2
De acordo com a Tabela 2 observou-se que os
melhores resultados ou seja as interaccedilotildees independem
da presenccedila ou ausecircncia de BAP Na Tabela 3 notou-se
uma maior oxidaccedilatildeo das anteras quando incubadas no claro
estas apresentaram uma maior oxidaccedilatildeo em relaccedilatildeo as que
foram incubadas no escuro tornando-se mais tarde calos
previamente oxidados
TABELA 2 ndash Meacutedias do nuacutemero de anteras intumescidas e com calos diacircmetro dos calos (mm) em funccedilatildeo de diferentesconcentraccedilotildees de 24-D e ausecircncia ou presenccedila de BAP em duas condiccedilotildees de luminosidade (luz e escuro) para anterasdo genoacutetipo cv 44
Luminosidade1
Intumescimento () Calosidade () Diacircmetro (mm) 24-D ( M)
BAP ( M) Luz Escuro Luz Escuro Luz Escuro
0 907 a A 775 a A 779 bA 948 aA 609 bA 800 aA 905 89 843 a A 875 a A 889 aA 946 aA 607 aA 420 bB 0 887 a A 852 a A 939 aA 990 aA 490 aA 466 aA
181 89 906 a A 786 a A 917 aA 959 aA 420 aA 493 aA 0 600 b A 772 a A 694 bA 895 aA 000 bA 373 aA
271 89 022 b B 827 a A 294 bB 837 aA 000 bA 376 aA 0 828 a A 737 a A 928 aA 939 aA 414 bA 595 aA
362 89 866 a A 725 a A 949 aA 866 aA 329 aA 376 aA
1Meacutedias seguidas por letras diferente minuacutesculas na linha e maiuacutesculas na coluna dentro de cada concentraccedilatildeo de 2-4-D diferem entre si pelo teste de Tukey a significacircncia de 5
Induccedilatildeo de calos a partir de cultura 99
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
TABELA 3 ndash Meacutedias de oxidaccedilatildeo das anteras entre asdiferentes concentraccedilotildees de 24-D em duas condiccedilotildeesde luminosidade (luz e escuro) para anteras da cultivarCatuaiacute Vermelho 44
Concentraccedilotildees
24-D ( M ) OXIDACcedilAtildeO ()
Claro Escuro 905 749 a 269 b 181 420 a 270 b 271 999 a 221 b 362 308 a 334 a
1Meacutedias seguidas por letras diferentes minuacutesculas na linhadentro de cada concentraccedilatildeo de 2-4-D diferem entre sipelo teste de Tukey a significacircncia de 5
TABELA 4 ndash Tipos de calos obtidos apoacutes 30 dias em meioMS com 362 M de 24-D na ausecircncia de luz da cultivarCatuaiacute Vermelho 99
Tipos de Calos
Nuacutemero de Calos
Nuacutemero de Calos com diacircmetro acima
de 05 mm Friaacuteveis 03 Esverdeados 13 06 Esbranquiaccedilados
03 Cinza 26
Dados de contagem natildeo transformados O recultivo emmeio MS com 362 M de 24-D na presenccedila de luz teve100 de contaminaccedilatildeo apoacutes sua inoculaccedilatildeo
TABELA 5 ndashTipos de calos obtidos apoacutes 30 dias em meioMS com 181 M de 24D e 89 M de BAP na presenccedilade luz da cultivar Catuaiacute Vermelho 44
TABELA 6 ndash Tipos de calos obtidos apoacutes 30 dias em meioMS com 181 M de 24D na ausecircncia de luz da cultivarCatuaiacute Vermelho 44
Tipos de Calos Nuacutemero de Calos
Nuacutemero de Calos com diacircmetro
acima de 05 mm Friaacuteveis 58 Esverdeados 23 214 Esbranquiaccedilados 94 Cinza 203
Tipos de Calos
Nuacutemero de Calos
Nuacutemero de Calos com diacircmetro
acima de 05 mm Friaacuteveis 25 Esverdeados 11 69 Esbranquiaccedilados 19 Cinza 350
Dados de contagem natildeo transformados Dados de contagem natildeo transformados
Nesta etapa a maioria dos calos encontrados para
as trecircs cultivares apresentaram coloraccedilatildeo cinza (Tabelas 4
5 e 6) A perda gradativa da coloraccedilatildeo natural dos calos
passando de verdes para a cor marrom a diminuiccedilatildeo do
ritmo de crescimento dos mesmos a estagnaccedilatildeo do
processo de formaccedilatildeo de embrioacuteides seguido do
surgimento de aacutereas necrosadas na superfiacutecie satildeo sinais
que caracterizam a senescecircncia da cultura (SILVA 2002)
DISCUSSAtildeO
A resposta das anteras da cultivar Catuaiacute Vermelho 99
com relaccedilatildeo agrave oxidaccedilatildeo indica que a mesma estaacute associada agrave
combinaccedilatildeo entre auxina e citocinina promovendo os menores
iacutendices de oxidaccedilatildeo Agrave medida que se aumentou a
concentraccedilatildeo de 24-D na presenccedila de BAP houve um
aumento gradativo da oxidaccedilatildeo ateacute atingir um ponto maacuteximo
em torno de 80 na dosagem de 271 mM de 24-D Jaacute na
ausecircncia de BAP a oxidaccedilatildeo foi bem maior quando comparada
agrave porcentagem de oxidaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 905 mM de
24-D De acordo com Wang amp Huang (1976) o cultivo in
vitro por um periacuteodo longo induz a formaccedilatildeo de compostos
fenoacutelicos no meio que podem causar necrose e posteriormente
morte dos calos Maciel (2001) e Paluacute (2002) citam que pelos
resultados obtidos para a induccedilatildeo de calogecircnese em anteras
de cafeeiro observa-se que eacute necessaacuteria uma auxina
juntamente com uma citocinina Dentre as auxinas sinteacuteticas
o 24-D eacute sem duacutevida o mais adequado agrave induccedilatildeo e
manutenccedilatildeo do calo (GAMBORG et al 1976)
Para Thomas amp Ravindra (1997) o maior problema
na iniciaccedilatildeo de culturas lenhosas eacute a ocorrecircncia de
compostos fenoacutelicos que estatildeo ligados com processos de
regulaccedilatildeo de crescimento especialmente com as auxinas
que dependendo da sua concentraccedilatildeo endoacutegena no tecido
resulta na induccedilatildeo desses compostos
SILVA A S et al100
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
O fotoperiacuteodo que estas anteras foram submetidas
influenciou tambeacutem na porcentagem de oxidaccedilatildeo sendo
que no escuro e na presenccedila de 24-D (89 mM) a oxidaccedilatildeo
foi miacutenima Agrave medida que foi aumentando a concentraccedilatildeo
da auxina foi aumentando tambeacutem a oxidaccedilatildeo poreacutem este
aumento foi bem menor quando comparado ao cultivo das
anteras na presenccedila de luz
A oxidaccedilatildeo fenoacutelica tem sido controlada em
diferentes espeacutecies lenhosas pela reduccedilatildeo da intensidade
luminosa (MARKS amp SIMPSON 1990) associada com a
substituiccedilatildeo frequumlente do meio de cultura e dessa forma
as chances de se obter sucesso no estabelecimento e
cultivo de explantes de espeacutecies lenhosas satildeo bastante
elevadas (TEIXEIRA 2001)
Em muitas espeacutecies por razotildees natildeo conhecidas a
embriogecircnese direta eacute rara e as plantas tecircm que ser
diferenciadas a partir de calos Para induccedilatildeo destes
geralmente eacute necessaacuteria uma auxina (MAHESHWARI et
al 1982) Segundo Rocha (1998) para a induccedilatildeo e
manutenccedilatildeo do calo a maioria das espeacutecies parece
comportar-se diferentemente natildeo soacute quanto aos
reguladores de crescimento podendo ocorrer
independentemente de auxinas e citocininas dependente
de ambas ou dependente de uma ou de outra mas tambeacutem
quanto agrave presenccedila ou ausecircncia de luminosidade Sharp et
al (1973) obtiveram calos atraveacutes do cultivo de sementes
folhas e anteras de C arabica das cultivares Mundo Novo
e Bourbon Amarelo A induccedilatildeo de calos tambeacutem foi mais
eficiente na ausecircncia de luz Aleacutem disso Ascanio amp Arcia
(1994) citam que para o desenvolvimento do calo as
anteras devem ser mantidas no escuro jaacute para o
desenvolvimento do embriatildeo os calos devem ser mantidos
no claro
Natildeo houve a formaccedilatildeo de embriotildees e isto pode ser
devido agraves doses de reguladores ou mesmo de combinaccedilotildees
que natildeo foram apropriadas para estas cultivares
CONCLUSAtildeO
Os resultados mostraram que para ocorrer
intumescimento das anteras formaccedilatildeo e aumento do
tamanho dos calos de ambas as cultivares eacute necessaacuterio
que haja interaccedilatildeo entre a auxina (24-D) e a citocinina
(BAP) e incubaccedilatildeo no escuro
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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PEREIRA F D et al102
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COMUNICACcedilAtildeO CIENTIacuteFICA
PROLIFERACcedilAtildeO IN VITRO DE BROTOS DE CURAUAacuteUTILIZANDO DIFERENTES VOLUMES DE MEIO DE CULTURA
IN VITRO SHOOT PROLIFERATION OF Ananas erectifolius USING DIFFERENTVOLUMES OF CULTURE MEDIUM
FLAacuteVIA DIONIacuteSIO PEREIRA1 JOSEacute EDUARDO BRASIL PEREIRA PINTO2HELEN CRISTINA DE ARRUDA RODRIGUES3 LUCIANA DOMICIANO SILVA ROSADO3
LUIZ ALBERTO BEIJO4 OSMAR ALVES LAMEIRA5
1Doutoranda em Agronomia ndash Universidade Estadual de Feira de SantanaUEFS ndash Horto Florestal ndash 44055-000 ndash Feira de Santana BA ndash flavia1808hotmailcom
2Doutor em Fisiologia Vegetal ndash Departamento de AgriculturaDAG ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash jeduardouflabr
3Graduanda em Agronomia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG4Doutorado em Agronomia ndash Universidade Federal de AlfenasUNIFAL ndash Departamento de Ciecircncias Exatas ndash Rua Gabriel Monteiro da Silva n deg 714 ndash Centro ndash 37130-000 ndash Alfenas MG ndash luizbeijoyahoocombr5Doutor em Agronomia ndash EMBRAPA ndash Amazocircnia Oriental ndash Trav Dr Eneacuteas Pinheiro sn ndash Bairro Marco ndash 66095-100 ndash Beleacutem PA ndash osmarcpatuembrapabr
RESUMOCurauaacute [Ananas erectifolius LBSm ndash Bromeliaceae] eacute
uma espeacutecie com grande potencial de uso de suas fibras comorevestimento na induacutestria automobiliacutestica Aleacutem disso o poacute dosumo do curauaacute tem sido utilizado no tratamento de cicatrizaccedilatildeode lesotildees cutacircneas Neste trabalho avaliaram-se diferentes volumesde meio MS Os volumes utilizados foram de 10 15 20 25 e 30 mLO delineamento experimental foi inteiramente casualizado (DIC)e cada tratamento continha 19 repeticcedilotildees Aos 30 dias avaliaram-se o nuacutemero e o tamanho de brotaccedilotildees Segundo a anaacutelise devariacircncia houve efeito linear do volume de meio na produccedilatildeo debrotos de curauaacute Agrave medida em que se aumenta o volume domeio aumenta o nuacutemero de brotos Natildeo houve diferenccedilasignificativa nos comprimentos dos brotos
Termos para indexaccedilatildeo Ananas erectifolius fibras vegetaismicropropagaccedilatildeo
ABSTRACTAnanas erectifolius LBSm ndash Bromeliaceae is a species
that presents fibers with great potential to be used as revetmentfor the automobile industry Besides the powder obtained fromits juice has been used in the treatment of skin lesionscicatrisation In this work the effect of different volumes (1015 20 25 and 30 mL) of MS medium during the in vitro cultureof axillary buds was evaluated A completely randomized design(CDR) was used with each treatment containing 19 replicatesAfter 30 days of inoculation shoot number and size wereevaluated The analysis of variance showed a linear effect of theculture medium volume and shoot proliferation Higher shoot
number was observed with the increase of medium volume Nosignificant difference was observed on shoot lenght
Index terms Ananas erectifolius vegetable fibermicropropagation
A produccedilatildeo de fibras vegetais ocupa um papel
relevante na economia agriacutecola mundial mesmo com a
intensa produccedilatildeo de fibras sinteacuteticas Mateacuterias-primas de
origens renovaacuteveis reciclaacuteveis e biodegradaacuteveis satildeo uma
das alternativas para a produccedilatildeo de manufaturados
ecologicamente corretos em consequumlecircncia do acuacutemulo
nos descartes de materiais natildeo biodegradaacuteveis os quais
tendem a aumentar com o crescimento populacional nos
centros urbanos A substituiccedilatildeo de materiais derivados do
petroacuteleo na produccedilatildeo de compostos elastomeacutericos por
mateacuteria-prima renovaacutevel vai ao encontro desses ideais
(ROCHA et al 2003)
As fibras sinteacuteticas destacam-se pela elevada
resistecircncia baixa densidade e elevada produccedilatildeo
Entretanto as fibras animais e vegetais satildeo as de maior
importacircncia principalmente para atender aos apelos
(Recebido em 31 de agosto de 2006 e aprovado em 19 de janeiro de 2007)
Proliferaccedilatildeo in vitro de brotos de curauaacute 103
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 102-106 2006
ecoloacutegicos e pelo nuacutemero de plantas e animais produtores
de fibras (SCHREIBER1998)
As plantas produtoras de fibras utilizaacuteveis foram
quantificadas por vaacuterios autores e em diferentes eacutepocas
tendo sido enumeradas 2000 mil plantas fibrosas e o seu
total estimado em 2300 destacando-se as florestas tropicais
que encerram recursos inesgotaacuteveis em potencial
(MEDINA 1959)
O curauaacute [Ananas erectifolius LBSm ndash
Bromeliaceae] utilizado principalmente na fabricaccedilatildeo de
cordas sacos e utensiacutelios domeacutesticos surge como
sucedacircneo para o aproveitamento de fibras O curauaacute eacute
uma bromeliaacutecea distribuiacuteda nos Estados do Paraacute Acre
Mato grosso Goiaacutes e Amazonas e eacute cultivada
principalmente por pequenos produtores da regiatildeo do
Lago Grande de Curuai no municiacutepio de Santareacutem PA
Estudos recentes tecircm demonstrado o grande potencial do
uso das fibras dessa planta como revestimento na induacutestria
automobiliacutestica devido agrave sua resistecircncia maciez e peso
reduzido O grande problema eacute que natildeo haacute suprimento
suficiente de mateacuteria-prima para atender agrave induacutestria
automobiliacutestica pois o curauaacute eacute fiel agraves suas origens amazocircnicas
e soacute se desenvolve em clima quente e uacutemido criando um
problema para a aquisiccedilatildeo de mudas fora desta regiatildeo que
por tal motivo eacute escassa no mercado (SILVA 2004)
A micropropagaccedilatildeo utilizando teacutecnicas de cultura
de tecido tem sido um valioso instrumento na propagaccedilatildeo
de diversos tipos de plantas Embora este processo envolva
diferentes etapas depois de definido um protocolo de
micropropagaccedilatildeo seja qual for a espeacutecie este pode ser
otimizado no intuito de se obter placircntulas de alta qualidade
e com baixo valor de produccedilatildeo O tipo e tamanho de frasco
e a quantidade de meio satildeo variaacuteveis que tecircm recebido
pouca atenccedilatildeo embora afetem diretamente a aacuterea superficial
da interface meio de cultura-atmosfera o volume de ar sobre
o meio de cultura e a sua profundidade Tais fatores tambeacutem
afetam a composiccedilatildeo da fase gasosa do frasco e
consequumlentemente o crescimento e desenvolvimento das
culturas (GRATTAPAGLIA amp MACHADO 1998)
Rodrigues et al (2005) verificaram maior
proliferaccedilatildeo de brotos de Cattleya persivaliana Hort
em frascos contendo 50 mL de meio quando comparados
com aqueles de 25 75 e 100 mL Nicoloso amp Erig (2002)
trabalhando com Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen
verificaram que 10 mL de meio MS (MURASHIGE amp
SKOOG 1962) proporcionaram o melhor crescimento
das placircntulas em biomassa quando cultivadas em tubos
de 20 cm de altura x 2 cm diacircmetro em comparaccedilatildeo com
os de 25 cm de altura x 2 cm 15 cm de altura x 2 cm
Carvalho et al (1995) estudando a influecircncia de fatores
fiacutesicos no desenvolvimento e crescimento in vitro de
batata-doce (Ipomoea batatas L Poir) verificaram que
10 mL de meio de cultura por frasco com explantes
proporcionaram maior formaccedilatildeo de gemas em relaccedilatildeo
aos volumes de 20 e 30 mL
Sendo assim objetivou-se neste trabalho avaliar
o volume de meio apropriado para a propagaccedilatildeo in vitro
de brotaccedilotildees de curauaacute
As brotaccedilotildees utilizadas como fonte de explante
foram fornecidas pela EMBRAPACPATU situada em
Beleacutem do Paraacute Gemas axilares de curauaacute foram
inoculadas em meio MS completo suplementado com
20 mgL de BAP (6-Benzilaminopurina) Apoacutes 30 dias
estas se desenvolveram e as brotaccedilotildees obtidas foram
transferidas para o meio MS sem regulador de
crescimento por 30 dias
Apoacutes este periacuteodo quatro explantes foram
desfolhados completamente ficando apenas porccedilotildees
basais com aproximadamente 1cm de comprimento que
foram inoculadas em meio de cultura baacutesico MS sem
regulador de crescimento em frasco de 12 cm de altura por
5 cm de diacircmetro (volume interno = 300 mL) com volumes
de 10 15 20 25 30 mL Os explantes foram mantidos em
sala de crescimento a uma temperatura de 26plusmn1degC e
fotoperiacuteodo de 16 horas sob uma Irradiacircncia de foacutetons de
25mmol m-2 s-1
O delineamento experimental foi inteiramente
casualizado (DIC) Cada tratamento continha 19 repeticcedilotildees
PEREIRA F D et al104
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 102-106 2006
(um frasco por repeticcedilatildeo) Aos 30 dias avaliaram-se o
nuacutemero e o comprimento das brotaccedilotildees O programa
utilizado para anaacutelise dos dados foi o software statistica
(SISVAR) tendo sido submetidas agrave anaacutelise de variacircncia
com aplicaccedilatildeo do teste F a 5 de probabilidade
analisando-se as meacutedias por regressatildeo polinomial
O efeito linear foi o mais adequado para explicar
a evoluccedilatildeo da taxa meacutedia de regeneraccedilatildeo do curauaacute Agrave
medida que o volume do meio de cultura aumenta existe
tendecircncia de aumento do nuacutemero de brotos Com 25
mL de meio produziu-se maior nuacutemero de brotos por
frasco (2557) e com 10 mL de meio produziu-se menor
nuacutemero de brotos (1226) O tratamento com 15 mL de
meio produziu 1765 brotos o com 20 mL 1750 e o com
30 mL 2242 (Figura 1) O volume maior de meio
disponibiliza mais nutrientes e diminui tambeacutem a
competiccedilatildeo entre as placircntulas o que explica a tendecircncia
em se obter um maior nuacutemero de brotos agrave medida que
se aumenta a quantidade do meio de cultura Em todos
os tratamentos as brotaccedilotildees obtidas foram vigorosas
com a coloraccedilatildeo verde-escura caracteriacutestica das
plantas matrizes As brotaccedilotildees tinham tambeacutem rigidez
outra caracteriacutestica da espeacutecie o que eacute devido agrave
presenccedila das fibras nas folhas Observou-se maior
concentraccedilatildeo de raiacutezes nas brotaccedilotildees maiores e natildeo
FIGURA 1 ndash Nuacutemero meacutedio de brotos por frasco de curauaacute(Ananas erectifolius) cultivados em diferentes volumesde meio MS completo 10 15 20 25 e 30
foi observada a presenccedila de calos em nenhum dos
tratamentos (Figura 2)
Resultados semelhantes foram obtidos por Reis
Lameira Reis (2004) trabalhando com curauaacute utilizando
volumes de 5 75 10 e 15 mL do meio liacutequido MS suplementados
com 25 mgL-1 de BAP (6-benzilaminopurina) os melhores
resultados sendo com os tratamentos que continham 10 e
15ml produzindo em meacutedia 121 e 154 brotosexplante
respectivamente
Da mesma forma Reis et al(2003) trabalhando com
ipeca (Psychotria ipecacuanha Stokes) em meio MS
acrescido de 15 mg L-1de BAP nos volumes de 10 20 30
e 40 mL obtiveram melhor resultado com os volumes de 30
e 40 mL (7 e 8 brotosfrasco respectivamente)
Quanto ao comprimento dos brotos natildeo houve
diferenccedila significativa Os brotos t iveram um
crescimento meacutedio de 228 cm sendo que no tratamento
com 10 mL de meio foi 257 cm com 15 mL 222 cm
com 20 mL 224 cm com 25 mL 224 cm e o tratamento
com 30 mL 215 cm Embora natildeo se tenham realizado
estudos mais aprofundados uma das hipoacuteteses
sugeridas para explicar tais resultados possivelmente
estaacute relacionada a fatores nutricionais do explante
Segundo Cappelades et al (1991) e Pereira et al (2001)
porccedilotildees basais satildeo mais robustas apresentando maior
quantidade de reservas acumuladas em seus tecidos
o que poderia levar agrave utilizaccedilatildeo dessas reservas pelas
brotaccedilotildees regeneradas para sustentar seu crescimento
Esta seria uma das causas da uniformidade apresentada
no tamanho das brotaccedilotildees em todos os tratamentos
Resultados iguais foram obtidos em estudos feitos por
Rodrigues et al (2005) quando avaliaram comprimento
meacutedio de duas espeacutecies de orquiacutedeas mantidas em meio
de cultura cujos volumes testados eram de 25 50 75 e
100 mL Portanto verifica-se que eacute muito importante
selecionar material com bom estado fisioloacutegico e
tamanho homogecircneo para se obter melhores
resultados na proliferaccedilatildeo das brotaccedilotildees eou na
morfogecircnese
Proliferaccedilatildeo in vitro de brotos de curauaacute 105
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 102-106 2006
FIGURA 2 ndash Brotaccedilotildees de curauaacute (Ananas erectifolius) produzidas in vitro em diferentes volumes de meio MS 1-Repicagem dos brotos 2- 10 mL de meio MS 3- 15 mL de meio MS 4- 20 mL de meio MS 5- 25 mL de meio MS 6- 30mL de meio MS
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NORMAS PARA PUBLICACcedilAtildeO DE ARTIGOS E COMUNICACcedilOtildeES CIENTIacuteFICAS
1 Os conceitos e afirmaccedilotildees contidos nos artigos e comunicaccedilotildeesseratildeo de inteira responsabilidade do(s) autor(es)
2 A revista ldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquo editadasemestralmente pela Editora da Universidade Federal de Lavras(Editora UFLA) publica artigos cientiacuteficos e comunicaccedilotildeescientiacuteficas da aacuterea de cultura de tecidos de plantas elaboradospor membros da comunidade cientiacutefica nacional e internacionalNatildeo eacute cobrada taxa para publicaccedilatildeo de trabalhos Eacute condiccedilatildeofundamental que os artigoscomunicaccedilotildees submetidos agrave apreciaccedilatildeoda revista ldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquo natildeo forame nem seratildeo publicados simultaneamente em outro lugar Com aaceitaccedilatildeo do artigo para publicaccedilatildeo os editores adquirem amplose exclusivos direitos sobre o artigo para todas as liacutenguas e paiacutesesA publicaccedilatildeo de artigoscomunicaccedilotildees dependeraacute da observacircnciadas Normas Editoriais dos pareceres do Corpo Editorial e daComissatildeo ad hoc Todos os pareceres tecircm caraacuteter sigiloso eimparcial e tanto os autores quanto os membros do CorpoEditorial eou Comissatildeo ad hoc natildeo obtecircm informaccedilotildeesidentificadoras entre si
3 Os artigos e comunicaccedilotildees submetidos para publicaccedilatildeo deveratildeoser apresentados em CD utilizando-se o processador de textoMicrosoft Word for Windows (version 98 2000 XP ou 2003)ser escrito em liacutengua portuguesa inglesa ou espanhola e usarsomente nomenclaturas oficiais e abreviaturas consagradas natildeoempregando abreviaturas no tiacutetulo do artigo Juntamente com oCD deveratildeo ser enviadas 4 (QUATRO) vias sendo uma originale as demais coacutepias omitindo os autores e a chamada de rodapeacute daprimeira paacutegina (para serem enviadas aos consultores cientiacuteficos)impressas em papel branco tipo A4 (21cm x 297cm) ou emformulaacuterio contiacutenuo em uma soacute face espaccedilo duplo entre linhasfonte Times New Roman tamanho 12 observada uma margemde 3 cm para o lado esquerdo e de 2 cm para o direito 25 cm paramargem superior e inferior 25 cm para o cabeccedilalho e 25 cm parao rodapeacute Cada trabalho deveraacute ter no maacuteximo 14 paacuteginas ejunto do mesmo deveraacute ser encaminhado ofiacutecio dirigido ao EditorChefe da revista solicitando a publicaccedilatildeo do artigo Esse ofiacuteciodeveraacute ser assinado por todos os autores constar o endereccedilocompleto telefone e e-mail de todos Qualquer inclusatildeo exclusatildeoou alteraccedilatildeo na ordem dos autores deveraacute ser notificada medianteofiacutecio assinado por todos os autores (inclusive do autor excluiacutedo)
4 O artigo cientiacutefico deveraacute conter os seguintes toacutepicos a)TIacuteTULO suficientemente claro conciso e completo evitandopalavras supeacuterfluas Recomenda-se comeccedilar pelo termo querepresente o aspecto mais importante do trabalho com os demais
termos em ordem decrescente de importacircncia b) TIacuteTULO EMINGLEcircS c) NOME(s) DO(s) AUTOR(es) no maacuteximo 6 (seis)em letras maiuacutesculas um apoacutes o outro centralizados e no rodapeacuteda primeira paacutegina deveratildeo vir a formaccedilatildeo acadecircmica e aInstituiccedilatildeo onde trabalham d) RESUMO (de acordo comNBR6028 da ABNT) O resumo natildeo deve ultrapassar a 250(duzentos e cinquumlenta) palavras e natildeo possuir paraacutegrafos Apoacuteso Resumo devem-se incluir TERMOS PARA INDEXACcedilAtildeO(palavraschave) diferentes daqueles constantes do tiacutetulo eseparados por viacutergula Os termos para indexaccedilatildeo devem estardescritos na forma maiuacutescula e minuacutescula serem expressotildees queidentifiquem o conteuacutedo do artigo ser indicadas entre 3 e 5 e sepossiacutevel extraiacutedas do vocabulaacuterio Thesagro ndash Thesaurus AgriacutecolaNacional desenvolvido pela CENAGRI (indicaccedilatildeo da revistaldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquopara evitar o usode vaacuterios sinocircnimos como termos de indexaccedilatildeo) Se natildeo foremencontrados descritores disponiacuteveis para cobrirem a temaacutetica doartigo poderatildeo ser indicados termos ou expressotildees de usoconhecido e) ABSTRACT incluindo em seguida INDEXTERMS f) INTRODUCcedilAtildeO (incluindo a revisatildeo de literatura)g) MATERIAL E MEacuteTODOS h) RESULTADOS EDISCUSSAtildeO (podendo conter tabelas e figuras) i)CONCLUSOtildeES e j) REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
5 A comunicaccedilatildeo deveraacute conter os seguintes toacutepicos a)TIacuteTULO suficientemente claro conciso e completo evitandopalavras supeacuterfluas Recomenda-se comeccedilar pelo termo querepresente o aspecto mais importante do trabalho com os demaistermos em ordem decrescente de importacircncia Deve serapresentada a versatildeo do tiacutetulo para o idioma inglecircs b) TIacuteTULOEM INGLEcircS c) NOME(s) DO(s) AUTOR(es) no maacuteximo 6(seis) em letras maiuacutesculas um apoacutes o outro centralizados e norodapeacute da primeira paacutegina deveratildeo vir a formaccedilatildeo acadecircmica e aInstituiccedilatildeo onde trabalham d) RESUMO (de acordo comNBR6028 da ABNT) O resumo natildeo deve ultrapassar a 250(duzentos cinquumlenta) palavras e natildeo possuir paraacutegrafos Apoacutes oResumo devem-se incluir TERMOS PARA INDEXACcedilAtildeO(palavras-chave) diferentes daqueles constantes do tiacutetulo eseparados por viacutergula Os termos para indexaccedilatildeo devem estardescritos na forma maiuacutescula e minuacutescula serem expressotildees queidentifiquem o conteuacutedo do artigo ser indicadas entre 3 e 5 e)ABSTRACT incluindo em seguida INDEX TERMS f)TEXTO [sem subdivisatildeo poreacutem com introduccedilatildeo material emeacutetodos resultados e discussatildeo e conclusatildeo subtendidos(podendo conter tabelas ou figuras)] e g) REFEREcircNCIASBIBLIOGRAacuteFICAS
6 AGRADECIMENTOS ao fim do texto e antes das ReferecircnciasBibliograacuteficas poderatildeo vir os agradecimentos a pessoas ouinstituiccedilotildees O estilo tambeacutem aqui deve ser soacutebrio e claroindicando as razotildees pelas quais se fazem os agradecimentos
7 TABELAS E QUADROS deveratildeo ser inseridos apoacutes citaccedilatildeodos mesmos dentro do proacuteprio texto
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS as referecircnciasbibliograacuteficas devem ser citadas conforme a NBR60232002 daABNTA exatidatildeo das referecircncias constantes da listagem e a corretacitaccedilatildeo no texto satildeo de responsabilidade do(s) autor(es) doartigo
Orientaccedilotildees gerais- Deve-se apresentar todos os autores do documento cientiacutefico(fonte)- O nome do perioacutedico deve ser descrito por extenso natildeo deveser abreviado- Em todas as referecircncias deve-se apresentar o local de publicaccedilatildeo(cidade) a ser descrito no lugar adequado para cada tipo dedocumento- As referecircncias devem ser ordenadas alfabeticamente
EXEMPLIFICACcedilAtildeO (TIPOS MAIS COMUNS)
ARTIGO DE PERIOacuteDICO
VIEIRA R F RESENDE M A V de Eacutepocas de plantio deervilha em Patos de Minas Uberaba e Janauacuteba Minas GeraisCiecircncia e Agrotecnologia Lavras v 24 n 1 p 74-80 janmar 2000
LIVRO
a) Livro no todo
STEEL R G D TORRIE J H Principles and procedures ofstatistics New York McGraw-Hill Book l960 481 p
b) Parte de livro com autoria especiacutefica
FLEURY J A Anaacutelise ao niacutevel de empresa dos impactos daautomaccedilatildeo sobre a organizaccedilatildeo da produccedilatildeo de trabalho InSOARES R M S M Gestatildeo da empresa Brasiacutelia IPEAIPLAN 1980 p 149-159
c) Parte de livro sem autoria especiacutefica
MARTIM L C T Nutriccedilatildeo de bovino de corte em confinamentoIn ______ Confinamento de bovino de corte 2 ed Satildeo PauloNobel 1986 cap 3 p 29-89
DISSERTACcedilAtildeO E TESE
GONCcedilALVES R A Preservaccedilatildeo da qualidade tecnoloacutegicade trigo (Triticum aestivum L) e controle de Rhyzoperthadominica (F) durante o armazenamento em atmosferacontrolada com Co2 e N2 1997 52 f Dissertaccedilatildeo (Mestradoem Ciecircncia dos Alimentos) ndash Universidade Federal de LavrasLavras 1997
MATIOLI G P Influecircncia do leite proveniente de vacasmastiacuteticas no rendimento de queijo frescal 2000 55 pDissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncias dos Alimentos) - UniversidadeFederal de Lavras Lavras 2000
Nota ldquoA folha eacute composta de duas paacuteginas anverso e versoAlguns trabalhos como teses e dissertaccedilotildees satildeo impressos apenasno anverso e neste caso indica-se frdquo (ABNT NBR60232002p 18)
TRABALHOS DE CONGRESSO E OUTROS EVENTOS
SILVA J N M Possibilidades de produccedilatildeo sustentada de madeiraem floresta densa de terra firme da Amazocircnia brasileira InCONGRESSO FLORESTAL BRASILEIRO 6 1990 Campos doJordatildeo Anais Campos do Jordatildeo SBSSBEF 1990 p 39-45
DOCUMENTOS ELETROcircNICOS
As obras consultadas online satildeo referenciadas conformenormas especiacuteficas para cada tipo de documento (monografia notodo e em parte trabalho apresentado em evento artigo deperioacutedico artigo de jornal etc) acrescidas de informaccedilotildees sobreo endereccedilo eletrocircnico apresentado entre braquetes (lt gt)precedido da expressatildeo ldquoDisponiacutevel emrdquo e da data de acessoao documento precedida da expressatildeo ldquoAcesso emrdquo
Nota ldquoNatildeo se recomenda referenciar material eletrocircnico de curtaduraccedilatildeo nas redesrdquo (ABNT NBR60232000 p 4) Segundopadrotildees internacionais a divisatildeo de endereccedilo eletrocircnico no fimda linha deve ocorrer sempre apoacutes barra ()
Monografia (acesso online)
a) Livro no todo
TAKAHASHI T (Coord) Tecnologia em foco BrasiacuteliaSocinfoMCT 2000 90 p Disponiacutevel em lthttpwwwsocinfoorgbrgt Acesso em 22 ago 2000
b) parte de livro
TAKAHASHI T Mercado trabalho e oportunidades In ______Sociedade da informaccedilatildeo no Brasil livro verde BrasiacuteliaSocinfoMCT 2000 cap 2 p 13-24 Disponiacutevel em lthttpwwwsocinfogovbrgt Acesso em 22 ago 2000
c) Parte de congresso seminaacuterio etc
GIESBRECHT H O Avaliaccedilatildeo de desempenho de institutos depesquisa tecnoloacutegica a experiecircncia de projeto excelecircncia napesquisa tecnoloacutegica In CONGRESSO ABIPTI 2000Fortaleza Gestatildeo de institutos de pesquisa tecnoloacutegicaFortaleza Nutec 2000 Disponiacutevel em lthttpwwwabiptiorgbrgt Acesso em 01 dez 2000
d) Tese
SILVA E M Arbitrariedade do signo a liacutengua brasileira desinais (LIBRAS) 1997 144 p Dissertaccedilatildeo (Mestrado emLinguumliacutestica Aplicada e Estudo de Liacutengua) - Pontifiacutecia UniversidadeCatoacutelica de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 1997 Disponiacutevel em lthttpwwwterracombrvirtualbooks freebookportdid teseshtmgtAcesso em 28 nov 2000
Artigo de perioacutedico (acesso online)
RESENDE A M G Hipertexto tramas e trilhas de um conceitocontemporacircneo Informaccedilatildeo e Sociedade Recife v 10 n 12000 Seccedilatildeo Educaccedilatildeo Disponiacutevel em lthttpwwwinformaccedilatildeoesociedadeufpbbrgt Acesso em 30 nov 2000
CITACcedilAtildeO PELO SISTEMA ALFABEacuteTICO (AUTOR-DATA)(conforme ABNT NBR105202002)Dois autores - Steel amp Torrie (1960) ou (STEEL amp TORRIE1960)Trecircs ou mais autores - Valle et al (l945) ou (VALLE et al 1945)Obs Quando forem citados dois autores de uma mesma obradeve-se separaacute-los pelo sinal amp (comercial)
9 CASO O ARTIGO CONTENHA FOTOGRAFIASGRAacuteFICOS FIGURAS SIacuteMBOLOS E FOacuteRMULASESSAS DEVERAtildeO OBEDECER AgraveS SEGUINTESNORMAS
91 Fotografias deveratildeo ser apresentadas em preto e branconiacutetidas e com contraste inseridas no texto apoacutes a citaccedilatildeo dasmesmas e tambeacutem em um arquivo agrave parte salvas em extensatildeoldquoTIFFrdquo ou ldquoJPEGrdquo com resoluccedilatildeo de 300 dpi
92 Figuras deveratildeo ser apresentadas em preto e branco niacutetidase com contraste inseridas no texto apoacutes a citaccedilatildeo das mesmas etambeacutem em um arquivo agrave parte salvas em extensatildeo ldquoTIFFrdquo ouldquoJPEGrdquo com resoluccedilatildeo de 300 dpi As figuras deveratildeo serelaboradas com letra Times New Roman tamanho 10 semnegrito sem caixa de textos e agrupadas
93 Graacuteficos deveratildeo ser inseridos apoacutes citaccedilatildeo dos mesmosdentro do proacuteprio texto elaborado preferencialmente em Excelcom letra Times New Roman tamanho 10 sem negrito
94 Siacutembolos e Foacutermulas Quiacutemicas deveratildeo ser feitas emprocessador que possibilite a formataccedilatildeo para o programa PageMaker (ex MathType Equation) sem perda de suas formasoriginais
10 O Editor Chefe notificaraacute o autor do recebimento do originale posteriormente o informaraacute sobre sua publicaccedilatildeo Os artigosque necessitarem de modificaccedilotildees seratildeo devolvidos ao autor paraa devida revisatildeo
11 Os artigos natildeo aprovados seratildeo devolvidos
12 Os artigos seratildeo publicados em ordem de aprovaccedilatildeo
13 O natildeo-cumprimento dessas normas implicaraacute na devoluccedilatildeodo artigo ao autor
14 Os casos omissos seratildeo resolvidos pela Comissatildeo Editorial
15 O artigo deveraacute ser enviado para
ABCTPPlant Cell Culture amp MicropropagationUniversidade Federal de LavrasDepartamento de Biologia - Setor de Fisiologia VegetalCaixa Postal 3037Lavras ndash MGCEP 37200-000E-mail abctpuflabr
INSTRUCTIONS FOR AUTHORS
1 Concepts and affirmations included in articles andcommunications are of the entire responsibility of the authors
2 ldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquo a semestral journaledited by Editora UFLA of the Universidade Federal de Lavraspublishes scientific articles and communications in the area ofplant tissue culture elaborated by researchers of the national andinternational scientific community There are no page charges forpublication Submission of a manuscript implies that it is neitherunder consideration for publication elsewhere nor has appearedpreviously in part or in whole On acceptance for publicationauthors assign to the Editors full copyright of the manuscript inall languages and countries Publications will depend on editorialrules and on the review of experts and ad hoc commissionReviewer and editorial opinions will be anonymouslycommunicated to authors
3 The articles and communication submitted for publicationmust be presented in CD using the program Microsoft Wordfor Windows (version 98 2000 XP or 2003) written inPortuguese English or Spanish using only conventionalnomenclature At the time of submission authors are requiredto submit together with the CD 4 (four) hard copies one originaland three copies without the name(s) of the author(s) as well asthe footnote on the first page (to be used by the reviewers)printed on A4 white paper (21 cm x 297cm) or on continuousform typewritten only on one side double spaced using fontTimes New Roman size 12 with a 3 cm margin on the left handside and 20 cm margin on the right hand side 25 cm upper andlower margin 25 cm for the heading and 25 cm for the footnoteThe manuscript must present a maximum of 14 pages At thetime of submission a cover letter must be sent with themanuscript copies to the Editor requesting publication of thearticle This cover letter must be signed by all authors andalso contain the full address telephone number and e-mail ofthe authors Any inclusion exclusion or alteration in the authorsorder must be notified and signed by all authors including theone excluded
4 Each manuscript must be organized in a) TITLE sufficientlyclear conspicuous and complete without superfluous words Itis recommended to initiate with the term that represent the mostimportant aspect with other terms in decreasing of importanceb) TITLE in Portuguese c) FULL NAME(s) OF THEAUTHOR(s) maximum of 6 (six) in capital letters one after theother in the center of the page with the footnote of the first pagecontaining their professional qualification or academic training
and their work institution d) ABSTRACT written continuouslywithout paragraph It must not exceed 250 words Index termsmust be enclosed after the abstract using terms different fromthose used in the title and separated by comma The index terms(3 to 5) must be described in capital and small letters and expressthe content of the article e) ABSTRACT and INDEX TERMSin Portuguese f) INTRODUCTION (including literaturereview) g) MATERIAL AND METHODS h) RESULTS ANDDISCUSSION (it may include tables and figures) i)CONCLUSIONS and j) REFERENCES
5 Communication must have the following topics a) TITLEsufficiently clear conspicuous and complete without superfluouswords It is recommended to initiate with the term that representthe most important aspect with other terms in decreasing ofimportance The PORTUGUESE version of the title has to bepresented b) TITLE in Portuguese c) FULL NAME(s) OFTHE AUTHOR(s) maximum of 6 (six) in capital letters oneafter the other in the center of the page with the footnote of thefirst page containing their professional qualification or academictraining and their work institution d) ABSTRACT writtencontinuously without paragraph It must not exceed 250 wordsIndex terms must be enclosed after the abstract using termsdifferent from those used in the title and separated by commaThe index terms (3 to 5) must be described in capital and smallletters and express the content of the article e) ABSTRACTand INDEX TERMS in Portuguese f) TEXT (with no divisionbut must include introduction material and methods results anddiscussion and conclusion (it may include tables and figures) andg)REFERENCES
6 ACKNOWLEDGEMENTS Acknowledgements to peopleor institutions might be included at the end of the text priorReferences The written style must be serious and clear indicatingthe reasons of the acknowledgements made
7 TABLES AND FIGURES must be included right after theircitation in the text
8 REFERENCES references must be cited according toNBR60232002 of ABNT All references and their correct citationin the text are of the entire responsibility of the author(s)- Some important orientations all authors of the scientificdocument must be presented (source) the journal must be citedusing its full name all references must present the name of thecity where the journal was published all references must be citedalphabetically
9 PHOTOGRAPHS GRAPHS FIGURES SYMBOLS ORFORMULA CONTAINED IN THE ARTICLE SHOULDOBEY THE FOLLOWING RULES
91 Photographs must be presented in black and whiteclear and with contrast inserted in the text after their citationand also in a separate file (on the same diskette as the article)saved in extension ldquoTIFFrdquo or ldquoJPEGrdquo with resolution of300 dpi
92 Figures must be presented in black and white clear andwith contrast inserted in the text after their citation and also in aseparate file (on the same diskette as the article) saved inextension ldquoTIFFrdquo or ldquoJPEGrdquo with resolution of 300 dpiThey must be elaborated using Times New Roman font size10 without bold without text box and arranged
93 Graphs must be inserted in the text after their citationelaborated preferentially in Excel using Times New Romanfont size 10 without bold
94 Symbols and Chemical Formula must be presented usinga word processor that permits a format for Page Maker (exMathType Equation) without loss of its original form
10 The Brazilian Association of Plant Tissue Culture (ABCTP)will inform the author the receipt of the original manuscript andeventually it will also send information regarding its publicationManuscripts that require modifications will be returned to theauthor for the respective revision andcorrections
11 Manuscripts not approved will be returned to the author
12 Articles will be published according to the order of receiptand approval
13 If any of these rules are not attended the manuscript will bereturned to the author
14 Manuscripts should be sent to the following address
ABCTPPlant Cell Culture amp MicropropagationUniversidade Federal de LavrasDepartamento de Biologia - Setor de Fisiologia VegetalCaixa Postal 3037Lavras ndash MGCEP 37200-000BrazilE-mail abctpuflabr
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-106 2006
Plant Cell Culture amp Micropropagation
ISSN 1808-9909
CONTEUacuteDO
01 In vitro propagation of Melissa officinalis L and production of essential oil In vitro propagation of Melissa officinalis L and production of essential oil Simone da Silva Celso Luiz Salgueiro Lage Maria Apparecida Esquibel Rosane Aguiar da Silva San Gil Alice Sato
53
02 Crescimento in vitro de Laelia tenebrosa (ORCHIDACEAE) em diferentes concentraccedilotildees de sais de Knudson C e carvatildeo ativado In vitro growth of Laelia tenebrosa (ORCHIDACEAE) in different concentrations of Knudson C salts and activated charcoal Aparecida Gomes de Araujo Moacir Pasqual Alba Regina Pereira Herminio Souza Rocha 61
03 Propagaccedilatildeo in vitro de placircntulas de orquiacutedea em diferentes meios de cultura e concentraccedilotildees de citocinina In vitro propagation of orchid plantlets cultivated in different culture media and cytokinin concentrations Aparecida Gomes de Araujo Moacir Pasqual Adriano Bortolotti da Silva Fabiacuteola Villa Hermiacutenio Souza Rocha Fernanda Carvalho Costa 68
04 Efeito do viacuterus das estrias da bananeira na micropropagaccedilatildeo e no crescimento das plantas da cultivar caipira durante a aclimatizaccedilatildeo Effect of banana streak virus on micropropagation and plant growth of cultivar caipira during acclimatization Daniela Garcia Silveira Antocircnio da Silva Souza Paulo Ernesto Meissner Filho Tales Miler Soares Ranulfo Correa Caldas Kaacutetia Regina Barbosa Leatildeo 74
05 Caracteriacutesticas morfofisioloacutegicas de brotaccedilotildees de Agapanthus umbellatus var minor multiplicadas em biorreator de imersatildeo temporaacuteria Morphological and physiological characteristics Agapanthus umbellatus var minor of shoots propagated in bioreactor of temporary immersion Luciana Alves Fogaccedila Denilson Dortzbach Antonio Carlos Alves Enio Luiz Pedrotti 80 06 Capacidade de regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro cultivar Santa Clara In vitro regeneration capacity of tomato plant cultivar Santa Clara Glaucia de Fatima Moreira Vieira e Souza Joseacute Magno Queiroz Luz Alcione Silva Arruda Denise Garcia Santana Mariana de Souza e Silva da Costa Teixeira Luciana Londe Adelaide Siqueira Silva Elisacircngela Rodrigues Figueira 88
07 Induccedilatildeo de calos a partir de cultura de anteras de cafeeiro (Coffea arabica L) cv Catuaiacute Vermelho 99 e 44 Callus induction from anther culture of coffee plant (Coffea arabica L) cv Catuaiacute Vermelho 99 and 44 Adelaide Siqueira Silva Joseacute Magno Queiroz Luz Denise Garcia Santana Patriacutecia Crystie Vieira Mustafa Moacir Pasqual Glaucia de Fatima Moreira Vieira e Souza 94
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-106 2006
Plant Cell Culture amp Micropropagation
ISSN 1808-9909
COMUNICACcedilAtildeO CIENTIacuteFICA
08 Proliferaccedilatildeo in vitro de brotos de Curauaacute utilizando diferentes volumes de meio de cultura In vitro shoot proliferation of Ananas erectifolius using different volumes of culture medium Flaacutevia Dioniacutesio Pereira Joseacute Eduardo Brasil Pereira Pinto Helen Cristina de Arruda Rodrigues Luciana Domiciano Silva Rosado Luiz Alberto Beijo Osmar Alves Lameira 102
In vitro propagation of Melissa officinalis L and production 53
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
IN VITRO PROPAGATION OF Melissa officinalis L AND PRODUCTIONOF ESSENTIAL OIL
IN VITRO PROPAGATION OF Melissa officinalis L AND PRODUCTION OFESSENTIAL OIL
SIMONE DA SILVA1 CELSO LUIZ SALGUEIRO LAGE2 MARIA APPARECIDA ESQUIBEL3ROSANE AGUIAR DA SILVA SAN GIL4 ALICE SATO5
1Doutoranda em Biotecnologia Vegetal ndashUFRJIBC Chagas Filho ndash Av Brigadeiro Trompowsky SN Ccs ndash Bloco G ndash Sala G2-050 ndash Cidade Universitaacuteria ndash Laboratoacuterio de Fisiologia Vegetal ndash Ilha do Fundatildeo ndash 21949-900 ndash Rio de Janeiro RJ ndash monybiofufrjbr
2Dr em Biofiacutesica ndashUFRJ ndash Instituto de Biofiacutesica Carlos Chagas Filho ndash Laboratoacuterio de Fisiologia Vegetal ndash Ilha do Fundatildeo ndash 21949-900 ndash Rio de Janeiro RJ ndash clslagebiofufrjbr3Poacutes-Doutorado em Bioeletrogecircnese ndash UFRJ ndash Instituto de Biofiacutesica Carlos Chagas Filho ndash Laboratoacuterio de Fisiologia Vegetal ndash Ilha do Fundatildeo ndash 21949-900 ndash Rio de Janeiro RJ ndash esquibelbiofufrjbr4Dra em Quiacutemica Orgacircnica ndash Ufrj DQO ndash Edifiacutecio do Centro de Tecnologia ndash Bloco A ndash Sala 605 ndash Ilha do Fundatildeo ndash Cidade Universitaacuteria ndash Caixa Postal 068556 ndash 21941-972 ndash Rio de Janeiro RJ ndash rsangilIqufrjbr5Dra em Biotecnologia Vegetal ndash UNIRIODCN ndash Centro de Ciecircncias Bioloacutegicas e da Sauacutede ndash Av Pasteur 458 Preacutedio da ECB ndash 4ordmandar Sala 415 URCA ndash 22290-240 ndash Rio de Janeiro RJ ndash alicesatouniriobr
ABSTRACTThis work presents an efficient protocol for micropropagation
of Melissa officinalis L through axillary bud proliferation obtainedfrom in vitro germinated seeds on basal Murashige amp Skoog medium(MS) The explants were grown on MS supplemented with differentgrowth regulators NAA (05 mM) KIN (05 mM) BA (05 mM)GA
3 (28 microM) and IAA (05 mM) Higher shoot proliferation and
rooting rates were obtained on MS supplemented with 05 microM IAAMicropropagated plants were acclimatized and transferred to soilwith success The essential oil composition in shoots of in vitro andfield-grown (ex vitro) plants was determined by gas chromatographymass spectrometry The major components of essential oils detectedin both plant materials were pujone neral geraniol and geranial Mofficinalis in vitro plantlets developed on MS media showed 14higher proportions of nerol and 41 of geraniol when compared withfield grown plants
Index terms Growth regulators medicinal plant tissue culture
RESUMOEste trabalho apresenta um protocolo raacutepido e eficiente
para propagaccedilatildeo in vitro de Melissa officinalis L atraveacutes daproliferaccedilatildeo de gemas axilares de plantas obtidas de sementesgerminadas em meio basal de Murashige amp Skoog (MS) Os explantesforam cultivados em meio de Murashige amp Skoog (MS) 1962com adiccedilatildeo de diferentes reguladores de crescimento Aacutecido alfa-naftaleno-aceacutetico (ANA ndash 05 mM) Cinetina (KIN ndash 05 mM)Benziladenina (BA ndash 05 mM) Aacutecido Gibereacutelico (GA
3 ndash 28 microM)
e Aacutecido Indolaceacutetico (AIA ndash 05 mM) O alongamento e formaccedilatildeode segmentos nodais maacuteximos foram obtidos com AIA Explantesdesenvolveram 5 novos brotos com 10 cm em meacutedia e 100 deenraizamento em 30 dias de cultura Plantas micropropagadasforam aclimatadas e transferidas para o solo com sucesso Acomposiccedilatildeo do oacuteleo essencial de partes aeacutereas de plantas produzidasin vitro e plantas crescidas em campo (ex vitro) foi determinadapor cromatografia gasosa acoplada agrave espectrometria de massas Os
principais componentes do oacuteleo essencial encontrados em ambosos materiais vegetais foram a pujona neral geraniol e geranial Asplantas de Melissa officinalis desenvolvidas in vitro em MSapresentaram aumento de 14 vezes na proporccedilatildeo do nerol e de 41na de geraniol quando comparadas agraves plantas ex vitro
Termos para indexaccedilatildeo Reguladores de crescimento plantamedicinal cultura de tecidos
INTRODUCTION
Melissa officinalis L (Lamiaceae) is a well-known
herb used to give fragrance to different food and beverage
products It has also been used as a medicinal plant for
treatment of headaches gastrointestinal disorders
nervousness and rheumatism The essential oil is a well-
known antibacterial and antifungal agent and it is also
responsible for the mild depressive and spasmolytic
properties of the plant Literature data pointed out antioxidant
properties of methanolic extracts of Melissa officinalis which
are mostly due to high portion of phenolic acids revealing
significant antimicrobial particularly antibacterial activity of
this essential oil (MIMICA-DUKIC et al 2004)
The chemical composition of the essential oil of
Melissa officinalis leaf (02-1 on dry weight) has been
studied The major compounds (10-40) are citral (neral
and geranial) and these are accompanied by limonene
cineole geraniol szlig-caryophyllene and spathulenol The
(Recebido em 06 de setembro de 2005 e aprovado em 21 de junho de 2006)
SILVA S da et al54
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
leaf also contains polyphenolic compounds
hydroxycinnamic derivatives with verbascoside (53)
flavonoids such as luteolin 7-glucoside and luteolin 7-
diglucuronide (08) These compounds probably
intervene in the antispasmodic activity Iridoid glucosides
were also reported and the infusion contains potassium
(CARNAT et al 1999)
Cultivation of medicinal plants for the purpose of
extraction of active constituents may face certain limitations
such as climate season water availability diseases and
pests and scarcity of naturally growing plants Such
limitations led to the use of tissue culture techniques for
production of the active constituents Tissue culture
provides means of rapid propagation of a large number of
uniform plants while maintaining their genotype Beneficial
uses of tissue culture for the purpose of extraction of
secondary metabolites include avoidance of collection of
endangered wild species production of secondary
metabolites due to rapid growth of cultures in vitro
(ARIKAT et al 2004)
Due to the importance of this plant for multiple
purposes and the difficulty to produce active compounds
in vitro the application of methods that provide higher
number of cloned plants of M officinalis is justified aiming
to select high quality plant lines to extensive culture and
extraction of pharmaceutical products In Brazil M
officinalis is used in phytomedicine by pharmaceutical
industries One of the most critical problems of
phytomedicine is the natural variation of plants chemical
constituents (CURRIER et al 2000) This variation could
be originated from genetical factors or under influence of
environmental characteristics
The use of in vitro systems have been reported as
an effective tool for obtaining genetically uniform plants
which can be the source for less variable pharmaceutical
preparations Plant regeneration of M officinalis has been
achieved using as explants cotyledonary nodes of 10-day-
old Melissa officinalis seedlings (TAVARES et al 1996)
shoot tips from plants cultivated at greenhouse
(MEacuteSZAacuteROS et al 1999) using various types and
concentrations of cytokinins auxins and triacontanol
(TANTOS et al 1999)
The aim of this work is to develop a
micropropagation method in order to obtain a significant
number of monoclonal plants for further field cultivation
comparing the essential oil content and composition
between micropropagated and field-grown plants
MATERIALS AND METHODS
Plant material
Representative specimens from field grown plants
of M officinalis were selected and submitted to Erika Von
Sohsten Medeiros and Angela Vaz (Rio de Janeiro
Botanical Garden) for the taxonomic confirmation A
voucher nordm RB ndash 365926 is deposited at the Herbarium of
Rio de Janeiro Botanic Garden
Melissa officinalis seeds were obtained from
commercial market ISLAR batch Nordm 8250 The seeds were
germinated and grown to the seedling stage in vitro Seeds
were pre-treated by immersion into 2 commercial bleach
solution (Globoacirc) for 20 min and then rinsed thoroughly
in running tap water After that the seeds were surface
sterilized in 70 ethanol for 20 min followed by 15 min in a
20 commercial bleach solution containing 2-3 drops of
Tween 20 under aseptic conditions and rinsed three times
with sterile distilled water The seeds were cultured on MS
(MURASHIGE amp SKOOG 1962) solid medium
supplemented with 30 gL-1 sucrose 148 mM thiamine-
HCl 243 mM pyridoxine-HCl 41 mM nicotinic acid and
06 mM myo-inositol The pH value was adjusted at 58 plusmn
01 before addition of 8 gL-1 of agar and the media were
sterilized in autoclave (120 degC during 15 min) The cultures
were incubed at 25 plusmn 1 degC under a 16 h light 8 h dark
regime at an irradiance of 230 mmolm-sup2s-1 (white light
illumination Sylvaniaacirc fluorescent tubes)
Establishment of in vitro shoot cultures
From in vitro 8-day-old germinated seeds plants
(20-30 cm in length) of three different clones designated
In vitro propagation of Melissa officinalis L and production 55
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
as clones 1 2 e 3 were selected and axillary shoot induction
takes place from nodal segments (1 cm in length)
subcultivated on MS hormone-free media (MS0) These
materials were used as donors of explants to be tested
with different culture media 05mM a-naphthaleneacetic
acid (NAA) 05mM kinetin (KIN) 05mM benzyladenine
(BA) 28 mM gibberellic acid (GA3) and 05mM indole-3-
acetic acid (IAA) Cultures were grown in 300 mL glass
flasks containing 40 ml of media each
Shoot proliferation rate length of both shoots and
roots and calli formation were monitored as growth
parameters Each treatment was replicated 3 times using
100 explants per repetition Subcultures were performed at
30 days intervals
Acclimatization
A total of 60 in vitro rooted microshoots (those grown
on MS + IAA during 30 days with average height of 10 cm
were removed from the medium and the agar washed gently
with tap water They were transferred to 60 cm diameter
plastic pots containing soil and humus (31 vv) and kept at
a greenhouse High humidity environment was provide by
covering the plants with a plastic foil and watering them
one time per day during the first 2 weeks Then plants were
gradually exposed to greenhouse conditions for 1 month
and finally transferred to the field where they were cultivated
during one year until complete life cycle
Extraction
Field-grown and fresh in vitro plantlets aerial parts
(100 g each) were submitted to hydro distillation for 140 h
in a Clevenger type apparatus as recommended by the
Brazilian Pharmacopoeia (1988) in replicate (n = 2) The
time between the isolation and analysis was the same in all
experiments to preclude differences in composition due to
external factors (SILVA et al 2003)
Gas chromatographic and gas chromatography-massspectrometric analysis
Gas chromatography with flame ionization
detection (GCFID) was carried out on a Varian Star Model
3350 instrument using a capillary column coated with DB-
5 (30 m x 025 mm i d 025 mm film thickness J amp W
Scientific Folsom CA USA) The GC oven was heated
using the following program 40 oC to 220 oC at 4 oC min-1
with an initial isothermal period of 1 min splitless The
detector and injector temperatures were held at 280 oC
Hydrogen was used as carrier gas The injection consisted
of 10 microL of distilled oil diluted with hexane The GCMS
analyses were carried out on a Hewlett-Packard (Agilent
Technologies Avondale USA) Model 5972 MSD coupled
to a HP 5890 GC The GC conditions were the same as
above except for the fact that helium was used as carrier
gas The mass spectrometer was operated on electron
impact mode at 70 eV Molecular assignments were
performed with the help of the Wiley 275 standard library
of mass spectra literature data (ADAMS 1995) authentic
geraniol standard (Sigma Part Number G5135) and mass
spectra interpretation besides the comparison with
previously published elution order (KREIS amp MOSAND
1994) Quantification was performed from GC profiles using
area percent since in the literature the FID response factor
for most of monoterpenes is determined as 1 (CARNAT et
al 1999)
Statistical analysis
Data for each experiment were subjected to analysis
of variance (ANOVA) and means were compared using the
Tukey-Kramer test Percent data were submitted to
significance test ndash difference between two percentages
using the Statistica for WindowsTM 50 version A
significance level of 5 was used for all statistical analysis
RESULTS AND DISCUSSION
In vitro multiplication of Melissa officinalis was
followed during four developing cycles Micropropagation
papers usually present an efficient protocol evaluated in
only one developing cycle This kind of protocol however
may fail when the cultures have to be kept during long
time many successive subcultures being necessary in
order to produce large number of clonal plants
SILVA S da et al56
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
In vitro establishment
In this work three different clones of M officinalis
were used and they had shown similar development
responses on in vitro cultures
The clones 1 and 2 had in vitro multiplication rate
lower than the clone 3 which means a decrease in the
absolute number of nodal segments (Fig 1A and B) From
these results the clone 3 was selected to run the tests
The average number of four new nodes was
produced by explant on MS0 after 30 days and this value
was used as a control to evaluate effects of the presence
of growth regulators in the media (Tab 1)
FIGURE 1 ndash Nodal segments development of three clones of Melissa officinalis on MS+ 05 M IAA during 30 daysA) Multiplication rate of in vitro culture from 2nd to 4th subcultures B) Number of nodal segments developed per clone
TABLE 1 ndash Effect of growth regulators in Melissa officinalis axillary segments culture after four weeks of culture
Culture Media
Shoot Explant
xplusmnse
Shoot Length (CM)
Multiplication Rate (ndeg of
Nodal Segment Explant)
Node Plantlet
xplusmnse
Root Frequency
()
Root Number
Explant xplusmnse
Root Length
(CM) xplusmnse
MS0 171B 403 08B 68C 41 B 50 105 11B 30 06B
05 M KIN 111C 349 11C 33D 31 C 50 073 09C 27 07C
28 M GA3 111C 100 03D 22E 21 D 50 071 09C 25 07C
05 M IAA 191B 1000 09A 95B 51 A 100 897 08A 137 08A
05 M NAA
301A 333 16C 90A 31 C 0 0 - 05 M BA 111C 385 54C 33D 31 C 0 0 -
Value are means (x) plusmn standard error (se) n=100 Values in the same column followed by the same letter do not differstatistically at Pdrdquo005
The influence of plant growth regulators and their
interactions on micropropagation of different plant species
have been discussed in detail by Lameira et al (2005) Rout
et al (1989) Rout amp Das (1997ab) Skirvin et al (1990) and
Zieslin et al (1989)
In this work addition of IAA to MS presented the
best results among all tested growth regulators in all
evaluated parameters However to shoot production there
is no statistical difference to the control The analysis of
effects of the other growth regulators shows that only
05mM NAA was able to improve shoot production
although it is not able to promote rhizogenesis
In vitro propagation of Melissa officinalis L and production 57
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
The use of MS plus 05mM Kinetin or 05mM BA
or 05mM NAA promoted the development of three nodal
segments per elongated plant in 30 days culture (Tab
1) However when BA was used these new shoots
exhibited apical necrosis When GA3 (28 mM) was added
to medium there was induction of only one shoot per
explant and after 30 days there were 2 nodes per
elongated shoot
There was no rooting in explants placed on MS
added of NAA and BA In MS medium containing KIN or
GA3
and in basic MS 50 of the shoots developed new
roots in 30 days of culture
The best result of rhizogenesis was presented
by explants cultured in MS plus IAA where 100 of
shoots rooted with more than 8 new roots per explant
(Tab 1) In terms of root length the cultures in MS
supplemented with IAA presented longer roots when
compared with the other media compositions used at
the present work
In short the addition of 05mM of IAA was chosen
as that presenting the best results in all evaluated
parameters (Fig 2A)
The action of IAA on the in vitro plant
development was in accordance to the known effects of
such hormone (CLELAND 1995) Shoot elongation was
obtained concomitantly with rooting in media MS plus
05 mM IAA That is specially interesting once it may
reduce the micropropagation process through nodal
segments explants to only three steps germination
shoot elongation and multiplication concomitant to
rooting this represents gain of time culture medium
and constitutes a quick micropropagation process
Tavares et al (1996) reported a micropropagation
utilizing cotyledonary nodes as explants The highest
average number of shoots in the two inoculations was
obtained with 2 mgL-1 of BA 24 axillary shoots per
explant 7 in the first inoculation and 17 in the second
one Shoots of the two inoculations were excised after
30 and 60 days respectively
Acclimatization
Melissa officinalis leaves are very sensitive to
water loss and this process is irreversible it was necessary
to provide a high humidity environment during the first
acclimatization period plants were covered with a plastic
foil during 2 weeks before being gradually exposed to
greenhouse conditions The acclimatization procedure
used for in vitro plants was successful and a total of 100
survival rate (n=60) was obtained Acclimatized plants
appeared normal and did not exhibit any morphological
abnormalities or variations These results permitted the
soil cultivation (Fig 2B) without chemical defensives
during one year up to the complete vegetative cycle
(flowering)
Essential oils content
Comparative analysis of the chromatographic
profiles showed high percentage of neral and geranial in
relation to nerol and geraniol in field grown (ex vitro)
plantlets and in MS0 (in vitro)
The relative content of the principal components
of essential oil of the aerial parts of M officinalis are
presented as mean peaks area () on Fig 2C geranial
(3813 and 4364) neral (2674 and 317) geraniol (329 and
153) and nerol (116 and 187) in plants cultured ex vitro
and in vitro respectively Plantlets developed in vitro on
MS0 media showed an increase of 14 times in the
proportion of nerol and 41 times of geraniol when
compared with ex vitro cultured plants
Field plants are exposed to considerable more
stressful conditions such as lower relative humidity higher
light levels and herbivory those are the more stressful
The latter conditions tend to favor a greater essential oil
accumulation (TAVARES et al 2004) On other hand
plantlets grown in vitro have been continuously exposed
to a unique microenvironment that has been selected to
provide minimal stress and nearly optimal conditions for
plant multiplication
SILVA S da et al58
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
FIGURE 2 ndash A) In vitro culture of Melissa officinalis on MS + IAA in 30 days of culture B) Ex vitro culture six monthsafter transference to soil maximum height 60 cm C) Composition and percentage of the most abundant essential oilcomponents of Melissa officinalis from aerial parts (100 g Fresh Weight) from in vitro e ex vitro culture
In vitro propagation of Melissa officinalis L and production 59
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
CONCLUSIONS
Melissa officinalis micropropagation can be made
using nodal segments from in vitro plants during 5 weeks
in MS media without growth regulators and posterior
subculture in MS media with 05 mM IAA for a better
development Multiplication rates of 44 and 40 were
obtained at the 3rd and 4th subcultures respectively
It was observed a significant difference between
the effects of auxins IAA and NAA The latter exerted an
unsatisfactory influence on the nodal segment formation
shoot length and rooting when compared with the results
obtained with IAA
The plants produced in vitro were vigorous and
after acclimatization they were well adapted After 1 month
at the greenhouse the survival rate was 100
Considering that the main objective of this work is
to produce monoclonal plants to be used by phytomedicine
industries it is important that the method presents a large
number of buds per explant This result plus an efficient
acclimatization stage can save time and produce
monoclonal plants in sufficient number to be used in
commercial field culture Our results showed a change in
the essential oil composition in the proportion of active
compounds However the characteristics of the oil of in
vitro and ex vitro M officinalis plants were not altered
The manipulation of the culture media composition
is an important biotechnological tool for the optimization
of the essential oils production With this technique this
work developed a protocol for highly production of plants
and productivity in the components (geraniol geranial and
neral) of the oil
ACKNOWLEDGMENTS
This work was supported by ICUNIRIO FAPERJ
and CNPq
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Crescimento in vitro de Laelia tenebrosa (Orchidaceae) 61
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
CRESCIMENTO IN VITRO DE Laelia tenebrosa (ORCHIDACEAE)EM DIFERENTES CONCENTRACcedilOtildeES DE SAIS DE KNUDSON C
E CARVAtildeO ATIVADO
IN VITRO GROWTH OF Laelia tenebrosa (ORCHIDACEAE) IN DIFFERENTCONCENTRATIONS OF KNUDSON C SALTS AND ACTIVATED CHARCOAL
APARECIDA GOMES DE ARAUJO1 MOACIR PASQUAL2 ALBA REGINA PEREIRA3HERMINIO SOUZA ROCHA4
1Doutoranda em AgronomiaFitotecnia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash agaraujo2003yahoocombr2Dr Professor Titular do Departamento de Agricultura ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash LavrasMG ndash mpasqualuflabr3Doutoranda no Jardim Botacircnico do Rio de Janeiro ndash ENBTJBRJ ndash Pacheco Leatildeo 915 ndash 22460-030 ndash Rio de Janeiro RJ4Doutorando em AgronomiaFitopatologia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash herminiouflanetcombr
RESUMOObjetivou-se testar diferentes concentraccedilotildees de carvatildeo
ativado adicionado ao meio Knudson C no crescimento in vitrode orquiacutedeas Placircntulas de Laelia tenebrosa (LA Rolfe) LARolfe com 1 a 15 cm de comprimento e contendo raiacutezes foraminoculadas em frascos contendo 40 mL de meio de cultura Ostratamentos consistiram na combinaccedilatildeo de concentraccedilotildees de carvatildeoativado (0 05 10 20 e 40 g L-1) e sais minerais de Knudson C(0 50 100 150 e 200) acrescidos de sacarose (20 g L-1) Omeio foi solidificado com 6 g L-1de aacutegar e o pH ajustado para58plusmn01 antes da autoclavagem a 121degC e 11 atm por 20 minutosApoacutes a inoculaccedilatildeo os frascos foram mantidos sob 25 plusmn 1degCfotoperiacuteodo de 16 horas e 32 mM m-2 s-1 de irradiacircncia Apoacutes 150dias verificou-se que a adiccedilatildeo de 2g L-1 de carvatildeo ativado ao meiocom metade dos sais de Knudson C promoveu melhor crescimentoin vitro das placircntulas de Laelia tenebrosa
Termos para indexaccedilatildeo Orquiacutedea meio de cultura cultura detecidos
ABSTRACTThe objective of this work was to test the effect of
Knudson C medium supplemented with different concentrationsof activated charcoal on the in vitro growth of orchids Plantletsof the Laelia tenebrosa (LA Rolfe) LA Rolfe measuring 1-15cm in length containing roots were inoculated in flasks containing40 mL of culture medium The treatments consisted of differentconcentrations of activated charcoal (0 05 10 20 and 40 g L-
1) combined with Knudson C salts (0 50 100 150 and 200)supplemented with sucrose (20 g L-1) The medium was solidifiedwith agar (6 g L-1) and pH adjusted to 58plusmn01 before autoclavingat 121ordmC and 11 atm during 20 minutes After inoculation theexplants were transferred to culture rooms with temperaturemaintained at 25plusmn1ordmC during a 16 hours photoperiod with a lightintensity of 32 microM m-2s-1 The best in vitro growth rates of
Laelia tenebrosa plantlets were obtained using Knudson C 50supplemented with 2 g L-1 activated charcoal after 150 days ofculture
Index terms Orchid culture medium tissue culture
INTRODUCcedilAtildeO
A produccedilatildeo de orquiacutedeas a partir germinaccedilatildeo
assimbioacutetica eacute uma alternativa viaacutevel para obtenccedilatildeo de
grande nuacutemero de plantas em curto espaccedilo de tempo
suprindo assim a necessidade dos produtores de
orquiacutedeas na aquisiccedilatildeo de mudas
Na cultura de tecidos os meios de cultura
geralmente satildeo compostos de uma fonte de carboidratos
macro e micronutrientes e outras substacircncias como
vitaminas aminoaacutecidos accediluacutecares agente solidificante
reguladores de crescimento (GEORGE amp SHERRINGTON
1984) e eventualmente aditivos como antibioacuteticos carvatildeo
ativado e componentes complexos
Knudson (1922) observou que era possiacutevel o
cultivo de sementes em meio artificial contendo minerais e
accediluacutecar sem a presenccedila de fungos micorriacutezicos
Posteriormente em 1946 ele aperfeiccediloou esse meio de
cultura sendo atualmente o mais utilizado comercialmente
na germinaccedilatildeo e desenvolvimento de orquiacutedeas (ARDITTI
amp ERNST 1992) No entanto satildeo necessaacuterios estudos
(Recebido em 23 de fevereiro de 2006 e aprovado em 10 de julho de 2006)
supplemented with
ARAUJO A G de et al62
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
pois satildeo descritos vaacuterios meios de cultura para muitos
gecircneros e espeacutecies diferentes
No cultivo e subcultivo de placircntulas do gecircnero
Cattleya George et al (1987) sugerem o meio Knudson C
(1946) ou Reinert amp Mohr (1967) Segundo Arditti amp Ernst
(1992) os meios de propagaccedilatildeo para Cattleya Laelia
Laeliocattleya e Brassocattleya podem ser os mesmos
citados anteriormente Villalobos et al (1994) sugerem o
meio Vacin amp Went (1949) para Cattleya Encyclia e
Oncidium suplementado com 25 de aacutegua de coco e o
meio Knudson C suplementado com 60 g L-1 de polpa de
banana para orquiacutedeas do gecircnero Stanhopea
O carvatildeo ativado normalmente eacute adicionado ao meio
de cultura em concentraccedilotildees que variam de 02 a 3
(BEYL 2000) O seu efeito natildeo-seletivo pode proporcionar
resultados negativos na micropropagaccedilatildeo Pesquisas
relatam a adsorccedilatildeo de tiamina aacutecido nicotiacutenico
(WEATHERHEAD et al 1978) piridoxina aacutecido foacutelico
reguladores de crescimento e quelatos de ferro
(JOHANSSON et al 1990) Entre os efeitos proporcionados
pela adiccedilatildeo do carvatildeo ativado ao meio de cultura
principalmente agrave organogecircnese e agrave embriogecircnese estatildeo
escurecimento do meio de cultura favorecendo o
enraizamento adsorccedilatildeo de substacircncias inibitoacuterias
produzidas pelo proacuteprio meio ou explante adsorccedilatildeo de
reguladores de crescimento e outros compostos orgacircnicos
e liberaccedilatildeo de substacircncias naturalmente presentes no
carvatildeo que beneficiariam o crescimento in vitro das culturas
(PAN amp STADEN 1998)
Arena amp Pastur (2001) citam que a adiccedilatildeo de carvatildeo
ativado ao meio de cultura promoveu alongamento das
brotaccedilotildees de Berberis buxifolia mas reduziu o iacutendice de
multiplicaccedilatildeo Hazra et al (2002) relataram o efeito
sinergiacutestico do carvatildeo ativado na multiplicaccedilatildeo e
enraizamento de brotaccedilotildees de algodoeiro Amin amp Jaiswal
(1987) Anderson (1980) e Damiano (1978) relataram o efeito
favoraacutevel do carvatildeo quando utilizado em baixas
concentraccedilotildees no enraizamento de brotaccedilotildees de
morangueiro framboeseira e goiabeira respectivamente
A diversidade de resultados obtidos com a utilizaccedilatildeo de
carvatildeo ativado deve-se principalmente ao genoacutetipo da
espeacutecie em questatildeo agrave adsorccedilatildeo de algumas substacircncias
quiacutemicas e compostos orgacircnicos aleacutem de metaboacutelitos
toacutexicos liberados no cultivo in vitro (Wang amp Huang 1976)
Este trabalho teve como objetivo verificar efeito de
diferentes concentraccedilotildees de sais de Knudson C e carvatildeo
ativado sobre o crescimento in vitro de placircntulas de
orquiacutedea da espeacutecie Laelia tenebrosa (LA Rolfe) LA Rolfe
MATERIAL E MEacuteTODOS
Placircntulas da espeacutecie Laelia tenebrosa com 1 a 15
cm de comprimento oriundas de sementes germinadas in
vitro e contendo raiacutezes foram inoculadas em frascos
contendo 40 mL do meio de cultura Knudson C nas
concentraccedilotildees de 0 (apenas aacutegua destilada e aacutegar) 50 100
(concentraccedilatildeo da formulaccedilatildeo original) 150 e 200 de sais
minerais combinado com carvatildeo ativado (0 05 1 2 e 4
mg L-1) suplementado com sacarose (20 g L-1)
O pH do meio foi ajustado para 58 plusmn 01 antes da
adiccedilatildeo de aacutegar (6 g L-1) O meio foi vertido em frascos de
vidro com capacidade para 250 cm3 vedados com tampas
plaacutesticas transluacutecidas natildeo perfuradas e autoclavados agrave
pressatildeo de 11 atm e agrave temperatura do 121degC durante 20
minutos Apoacutes a inoculaccedilatildeo os frascos contendo os
explantes foram mantidos em sala de crescimento com
irradiacircncia em torno de 32 mmol m-2 s-1 temperatura de 25 plusmn
1degC e fotoperiacuteodo de 16 horas
O delineamento experimental utilizado foi
inteiramente casualizado em esquema fatorial 5 x 5 com
quatro repeticcedilotildees de cinco placircntulas cada uma Decorridos
150 dias avaliou-se a meacutedia do nuacutemero de folhas nuacutemero
de raiacutezes comprimento da maior raiz comprimento da parte
aeacuterea e massa fresca de placircntulas Os dados foram
comparados por meio de regressatildeo polinomial empregando-
se o programa Sisvar (FERREIRA 2000)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Apenas para a variaacutevel nuacutemero de folhas houve
interaccedilatildeo entre os niacuteveis de sais e carvatildeo ativado Poreacutem
Crescimento in vitro de Laelia tenebrosa (Orchidaceae) 63
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
por meio do teste F somente as concentraccedilotildees de 50 e
100 de sais do meio Knudson C foram significativas em
relaccedilatildeo agraves concentraccedilotildees de carvatildeo ativado
Os melhores resultados (65 e 585) foram
verificados com 50 (metade) dos sais de Knudson C
combinado com 275 g L-1 de carvatildeo ativado e 100 de
sais com 4 g L-1 de carvatildeo respectivamente (Figura 1)
Com o aumento da concentraccedilatildeo do meio de cultura haacute
necessidade de maior concentraccedilatildeo de carvatildeo Sendo
assim o meio com 50 de sais aleacutem de proporcionar
melhores resultados eacute menos oneroso
Estes resultados contradizem os de Silva et al
(2003) que verificaram que a adiccedilatildeo de carvatildeo ativado ao
FIGURA 1 ndash Nuacutemero de folhas em placircntulas de Laeliatenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees de saisde Knudson C e carvatildeo ativado
meio de cultura inibe a formaccedilatildeo de folhas em placircntulas de
Brassocattleya lsquoPastoralrsquo x Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo
O efeito natildeo seletivo do carvatildeo ativado pode proporcionar
resultados negativos na micropropagaccedilatildeo (PAN amp
STADEN 1998)
Agrave medida em que aumentaram as concentraccedilotildees de
sais de Knudson C maiores quantidades de raiacutezes foram
formadas (Figura 2A) Observou-se maior nuacutemero de raiz
(43) com 965 de sais Para o fator carvatildeo ativado as
melhores respostas (395 raiacutezes) foram verificadas com a
utilizaccedilatildeo de 304 g L-1 adicionadas ao meio de cultura
(Figura 2B)
Para muitas espeacutecies o enraizamento eacute favorecido
pela adiccedilatildeo de carvatildeo ativado ao meio de cultura Hazra et
al (2002) relataram o efeito sinergiacutestico do carvatildeo ativado
na multiplicaccedilatildeo e enraizamento de brotaccedilotildees de
algodoeiro O meio MS com metade dos sais minerais
acrescido de 20 g L-1 de sacarose 7 g L-1 de aacutegar e 1 g L-1 de
carvatildeo ativado promoveu maior quantidade de raiacutezes em
placircntulas de Cattleya nobilior Rchb f (REIS et al 2003)
Segundo Paiva et al (2005) aleacutem de um equiliacutebrio
hormonal favoraacutevel agrave formaccedilatildeo de raiacutezes outros fatores
internos tecircm sido relacionados com a iniciaccedilatildeo do processo
de enraizamento como presenccedila de sacarose alta relaccedilatildeo
CN e nutrientes minerais (foacutesforo caacutelcio zinco e boro) O
meio Knudson C natildeo possui micronutrientes apresenta
uma concentraccedilatildeo maior de caacutelcio e tem baixas
FIGURA 2 ndash Nuacutemero de raiacutezes em placircntulas de Laelia tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees de sais deKnudson C (A) e concentraccedilotildees de carvatildeo ativado (B)
ARAUJO A G de et al64
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
concentraccedilotildees de N e K em relaccedilatildeo ao MS e WPM o que
provavelmente favoreceu tanto o nuacutemero quanto o
comprimento de raiacutezes (PASQUAL 2001)
O maior comprimento de raiz (331 cm) foi verificado
com a utilizaccedilatildeo de 100 de sais de Knudson C A partir do
ponto maacuteximo (100) houve diminuiccedilatildeo do comprimento
radicular provavelmente devido ao desbalanccedilo nutricional
(Figura 3A) Com o aumento das concentraccedilotildees de carvatildeo
ativado houve um incremento linear no comprimento de
raiacutezes Melhores resultados foram observados com a
utilizaccedilatildeo de 4 g Lndash1 de carvatildeo ativado (Figura 3B) Como a
relaccedilatildeo foi direta pode-se inferir que o efeito estimulante
do carvatildeo ativado no comprimento da maior raiz continuaria
para concentraccedilotildees superiores a 4 g L-1
A adiccedilatildeo de carvatildeo ativado no meio de cultura foi
beneacutefica promovendo tanto o nuacutemero quanto o
crescimento de raiacutezes O carvatildeo conteacutem impurezas que
podem favorecer o crescimento de raiacutezes jaacute existentes e
induzir emissatildeo de novas raiacutezes (PASQUAL 2001)
Melhores resultados para comprimento da parte
aeacuterea (18 cm) foram observados quando se utilizou o
meio Knudson C na concentraccedilatildeo de 121 de sais (Figura
4A) poreacutem na concentraccedilatildeo de 50 obtiveram-se
explantes com 17 cm de comprimento Essa diferenccedila
observada (01 cm) eacute muito pequena o que natildeo justifica a
utilizaccedilatildeo de um meio mais concentrado mas a reduccedilatildeo
do mesmo agrave sua metade
O enraizamento in vitro pode ser favorecido com o
uso de meio de cultura com a metade ou 75 da
concentraccedilatildeo normal de sais Em algumas espeacutecies altas
concentraccedilotildees de sais principalmente a presenccedila de iacuteons
amocircnio favorecem o desenvolvimento de raiacutezes enquanto
que em outras podem ser inibidoras (PASQUAL et al
2001)
O maior comprimento da parte aeacuterea (19 cm) foi
obtido na presenccedila de 4 g Lndash1 de carvatildeo ativado (Figura
4B) a concentraccedilatildeo de 2 g Lndash1 proporcionou um
comprimento de 18 cm Comparando-se os niacuteveis 4 e 2 g Lndash1
de carvatildeo ativado nota-se pequena diferenccedila (01 cm) o
que justifica a utilizaccedilatildeo de 2 g Lndash1
O carvatildeo ativado conteacutem impurezas que quando
liberadas no meio de cultura podem beneficiar ou natildeo o
crescimento in vitro Simotildees et al (1999) verificaram que a
concentraccedilatildeo de 1 g L-1 de carvatildeo ativado acrescida ao
meio Knudson C proporciona o melhor desenvolvimento
de brotos de Epidendrum sp e Dendrobium sp
Maior massa fresca de placircntulas (0144g) foi
verificada com a utilizaccedilatildeo de 50 de sais de Knudson C
ponto a partir do qual houve diminuiccedilatildeo no peso (Figura
5A) Provavelmente essa reduccedilatildeo ocorreu devido agrave
toxidez
A utilizaccedilatildeo de 4 g L-1 de carvatildeo ativado
proporcionou uma massa de 0185 g nas placircntulas frescas
(Figura 5B)
FIGURA 3 ndash Comprimento da maior raiz em placircntulas de Laelia tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees desais de Knudson C (A) e carvatildeo ativado (B)
Crescimento in vitro de Laelia tenebrosa (Orchidaceae) 65
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
FIGURA 4 ndash Comprimento da parte aeacuterea em placircntulas de Laelia tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees desais de Knudson C (A) e carvatildeo ativado (B)
FIGURA 5 ndash Massa fresca de placircntulas de L tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees de sais de Knudson C(A) e carvatildeo ativado (B)
O carvatildeo ativado eacute comumente utilizado na cultura
de tecidos de plantas Seu efeito eacute atribuiacutedo agrave adsorccedilatildeo de
substacircncias toacutexicas produzidas pelas plantas adsorccedilatildeo
de fitorreguladores do meio e escurecimento do meio onde
se desenvolvem as raiacutezes das plantas (GEORGE 1993)
O melhor desenvolvimento de Phalaenopsis in
vitro ocorreu na presenccedila de carvatildeo ativado na
concentraccedilatildeo de 2 g L-1 indicando que este possa ser um
elemento importante no processo (BRESSAN et al 1999)
Apesar do carvatildeo ativado na concentraccedilatildeo de 4 g
L-1 ter proporcionado melhores resultados verificou-se que
na concentraccedilatildeo de 2 g L-1 os efeitos apresentam uma
diferenccedila miacutenima Embora o carvatildeo ativado natildeo seja o
componente de maior custo no preparo de meio de cultura
a sua reduccedilatildeo juntamente com os sais minerais eacute
economicamente favoraacutevel especialmente para a produccedilatildeo
comercial de mudas
CONCLUSAtildeO
A adiccedilatildeo de 2 g L-1 de carvatildeo ativado ao meio de
cultura Knudson C com metade (50) de sais minerais
promoveu melhor crescimento em placircntulas de Laelia
tenebrosa cultivadas in vitro
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PROPAGACcedilAtildeO IN VITRO DE PLAcircNTULAS DE ORQUIacuteDEA EMDIFERENTES MEIOS DE CULTURA E CONCENTRACcedilOtildeES
DE CITOCININA
IN VITRO PROPAGATION OF ORCHID PLANTLETS CULTIVATED IN DIFFERENTCULTURE MEDIA AND CYTOKININ CONCENTRATIONS
APARECIDA GOMES DE ARAUJO1 MOACIR PASQUAL2 ADRIANO BORTOLOTTI DA SILVA3 FABIacuteOLA VILLA3 HERMIacuteNIO SOUZA ROCHA3 FERNANDA CARVALHO COSTA4
1Doutoranda em AgronomiaFitotecnia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash agaraujo2003yahoocombr2Professor Titular Departamento AgriculturaDAG ndash Universidade Federal de Lavras UFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200000 ndash Lavras MG ndash mpasqualuflabr3Doutorando em Agronomia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200000 ndash Lavras MG4Departamento de AgriculturaDAG ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash fecostapuryahoocombr
RESUMOA taxa de multiplicaccedilatildeo de orquiacutedeas a partir de meacutetodos
convencionais eacute bastante baixa natildeo atendendo as necessidadescomerciais A cultura de tecidos permite maiores taxas demultiplicaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de plantas uniformes e sadiasObjetivou-se estudar a influecircncia da citocinina BAP (6-benzilaminopurina) em diferentes meios de cultura napropagaccedilatildeo in vitro de placircntulas hiacutebridas de BrassocattleyalsquoPastoralrsquox Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo Placircntulas comaproximadamente 15plusmn05 cm de comprimento obtidasassimbioticamente foram transferidas para frascos comcapacidade de 250 cm3 contendo 40 mL das formulaccedilotildees salinasde MS WPM e Knudson C combinados com 0 05 10 20 e40 mg L-1 de BAP acrescidos de 2 g L-1 de carvatildeo ativadosolidificado com 6 g L-1 de aacutegar e pH ajustado para 58plusmn01Apoacutes a inoculaccedilatildeo os frascos foram incubados a 25plusmn2oC 35igravemolm-2s-1 de intensidade luminosa e sob fotoperiacuteodo de 16horas Apoacutes 90 dias observou-se que melhores resultados parapropagaccedilatildeo in vitro em placircntulas de orquiacutedea Bc lsquoPastoralrsquo x LclsquoAmber Glowrsquo satildeo obtidos com o meio WPM A suplementaccedilatildeode 4 mg L-1 de BAP no meio WPM favorece o crescimento invitro Para a multiplicaccedilatildeo maior quantidade de brotos eacuteconseguida em meio MS na ausecircncia de BAP
Termos para indexaccedilatildeo Orquiacutedea crescimento in vitrocitocinina
ABSTRACTThe multiplication rate of orchids by conventional
methods is considerably low and does not attend its commercialneeds Tissue culture results in larger multiplication rates andproduces uniform and healthy orchid plantlets The objective ofthis work was to study the influence of the cytokinin BAP (6-benzilaminopurine) in different culture media for ther in vitropropagation of Brassocattleya lsquoPastoralrsquox Laeliocattleya lsquoAmberGlowrsquo hybrid plantlets Plantlets measuring approximately 15plusmn 05 cm length deriving from in vitro germination were inoculated
in flasks of 250 cm3 volume containing 40 mL MS WPM andKnudson C salt formulations combined with BAP (0 05 1 2and 4 mg L-1) supplemented with 2 g L-1 activated charcoalsolidified with 6 g L-1 agar and pH adjusted for 58 plusmn 01 Afterthe inoculation the plantlets maintained in a growth room at25plusmn2ordmC 35 mMol m-2 s-1 light intensity and 16 hoursphotoperiod After 90 days the best results for the in vitropropagation of orchid plantlets Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquowere obtained with half strength WPM The supplementation of4 mg L-1 BAP to the WPM medium favors in vitro growth Forthe multiplication phase the largest number of sprouts is achievedwith full strength MS medium in the absence of BAP
Index terms Orchid in vitro growth cytokinin
INTRODUCcedilAtildeO
As orquiacutedeas satildeo consideradas as plantas
ornamentais haacute mais tempo cultivadas pelo homem
Pertencem agrave famiacutelia Orchidaceae a maior entre as
monocotiledocircneas e tambeacutem entre as plantas ornamentais
com 600 - 800 gecircneros e 25000-35000 espeacutecies (SHEEHAN
1983) totalizando 7 das plantas ornamentais do mundo
(Van Der PIJL amp DODSON 1966)
A propagaccedilatildeo de orquiacutedeas pode ser tanto
vegetativa quanto por meio de sementes Estas embora
produzidas em grande quantidade natildeo possuem
endosperma funcional prescindindo para tanto da
associaccedilatildeo simbioacutetica com fungos micorriacutezicos dentre os
quais a Rhizoctonia que eacute um dos gecircneros mais importante
(PIERIK 1987 SHEEHAN 1983)
(Recebido em 08 de dezembro de 2005 e aprovado em 10 de julho de 2006)
Propagaccedilatildeo in vitro de placircntulas de orquiacutedea 69
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 68-73 2006
Knudson (1922) observou que era possiacutevel o cultivo
de sementes em meio artificial contendo apenas sais
nutritivos e accediluacutecar na ausecircncia de fungos Posteriormente
em 1946 o mesmo autor aperfeiccediloou este meio de cultura
sendo atualmente um dos mais utilizados comercialmente
na germinaccedilatildeo e desenvolvimento de orquiacutedeas (ARDITTI
amp ERNST 1992) No entanto satildeo necessaacuterios estudos
pois satildeo descritos vaacuterios meios de cultura para muitos
gecircneros e espeacutecies diferentes O meio de cultura mais
utilizado na cultura de tecidos em geral eacute o MS (Murashige
amp Skoog 1962) podendo-se encontrar o uso de outros
meios como Knudson C (1946) e WPM (Wood Plant
Medium) de Loyd amp McCown (1980)
Reguladores de crescimento em diferentes
concentraccedilotildees tecircm sido usados conforme a espeacutecie e a
metodologia utilizada Podem ser necessaacuterios para a
germinaccedilatildeo de sementes formaccedilatildeo de calos e brotaccedilotildees
adventiacutecias (GRATTAPAGLIA amp MACHADO 1998
PASQUAL 2001)
O regulador de crescimento BAP (6-
benzilaminopurina) eacute uma citocinina largamente utilizada
para estimular a induccedilatildeo de brotos em plantas ornamentais
Para o cultivo in vitro de orquiacutedeas do grupo Cattleya a
citocinina BAP geralmente eacute utilizada nas concentraccedilotildees
que variam entre 005 e 10 mg L-1 (CARVALHO 2002)
Martini et al (2001) trabalhando com a orquiacutedea
Gongora quinquenervis observaram que a presenccedila do
BAP inibe a multiplicaccedilatildeo de calos e o potencial
organogecircnico Silva (2003) concluiu que para o estaacutedio de
subcultivo de Brassocattleya lsquoPastoralrsquo x Laeliocattleya
lsquoAmber Glowrsquo natildeo haacute necessidade da adiccedilatildeo de BAP como
estiacutemulo ao desenvolvimento geral do explante Melhor
proliferaccedilatildeo de brotos formaccedilatildeo de raiacutezes nuacutemero de
folhas e comprimento de brotos em Dendrobium foram
obtidos com 25 mg L-1 de BAP + 05 mg L-1 de ANA
adicionados ao meio MS (TALUKDER et al 2003)
Aleacutem do tipo de meio outro aspecto importante na
multiplicaccedilatildeo in vitro estaacute relacionado com o tipo de
citocinina e sua concentraccedilatildeo sendo ambos determinantes
no sucesso da micropropagaccedilatildeo (GRATTAPAGLIA amp
MACHADO 1998)
O maior entrave no processo de micropropagaccedilatildeo
de orquiacutedeas estaacute relacionado ao tempo necessaacuterio para a
produccedilatildeo de mudas a partir de plantas hiacutebridas
selecionadas e a utilizaccedilatildeo de meio de cultura adequado
para cada espeacutecie Assim objetivou-se estudar o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de BAP e formulaccedilotildees de minerais
nutritivos em meios de cultura na propagaccedilatildeo in vitro de
placircntulas de orquiacutedea oriundas do hiacutebrido Brassocattleya
lsquoPastoralrsquo x Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo
MATERIAL E MEacuteTODOS
Placircntulas hiacutebridas oriundas de sementes
germinadas assimbioticamente em meio Knudson C
obtidas do cruzamento entre Brassocattleya lsquoPastoralrsquo x
Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo com aproximadamente
15plusmn05 cm de comprimento foram transferidas para frascos
de 250 cm3 de capacidade contendo 40 mL de meio de
cultura e vedados com tampas plaacutesticas transluacutecidas Os
tratamentos consistiram de diferentes formulaccedilotildees salinas
(MS WPM e Knudson C em suas formulaccedilotildees originais)
combinadas com 0 05 10 20 e 40 mg L-1 de BAP
acrescidos de 2 g L-1 de carvatildeo ativado solidificado com
6 g L-1 de aacutegar e pH ajustado para 58plusmn01 antes da
autoclavagem obtida a 121ordmC e 1 atm por 20 minutos
Posteriormente agrave inoculaccedilatildeo os frascos foram
transferidos para sala de crescimento com temperatura
de 25plusmn2ordmC fotoperiacuteodo de 16 horas e 35 mmolm-2s-1 de
intensidade luminosa fornecida por lacircmpadas do tipo
(Grow-lux) e luz do dia especial O delineamento
experimental utilizado foi inteiramente casualizado no
esquema fatorial 3 x 5 com cinco repeticcedilotildees de quatro
placircntulas cada sendo cada repeticcedilatildeo composta por um
frasco
Apoacutes 90 dias da instalaccedilatildeo do experimento foram
avaliados nuacutemero meacutedio de brotos comprimento meacutedio
da parte aeacuterea nuacutemero meacutedio de raiacutezes nuacutemero meacutedio de
folhas e meacutedia da massa fresca total de placircntulas
ARAUJO A G de et al70
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 68-73 2006
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Para a variaacutevel nuacutemero de folhas natildeo houve
significacircncia dos fatores isolados nem da interaccedilatildeo entre
eles O nuacutemero de raiacutezes e massa fresca total de placircntulas
apresentaram significacircncia apenas para o fator meio de
cultura enquanto que para nuacutemero de brotos e
comprimento da parte aeacuterea a interaccedilatildeo dos fatores foi
significativa (Tabela 1)
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de brotos observou-se
interaccedilatildeo entre os fatores BAP e os meios de cultura
utilizados (Tabela 1) Poreacutem pelo teste F verificou-se que
apenas o meio MS foi significativo em relaccedilatildeo agraves
concentraccedilotildees de BAP (Figura 1)
O maior nuacutemero de brotos (334) foi registrado na
formulaccedilatildeo de MS adicionado de 40 mg L-1 de BAP
Entretanto na ausecircncia dessa citocinina foi observada a
formaccedilatildeo de 304 brotosplanta (Figura 1) Diante da
pequena diferenccedila na quantidade meacutedia de brotos
formados entre a maior concentraccedilatildeo e o tratamento sem
o regulador de crescimento justifica-se a utilizaccedilatildeo do
meio de cultura sem o BAP Estes resultados concordam
com Silva (2003) que obteve maior nuacutemero de brotos (2
brotos) na ausecircncia de BAP para esse mesmo hiacutebrido
poreacutem em meio Knudson C
A natildeo utilizaccedilatildeo de reguladores de crescimento
adicionados ao meio de cultura vai influenciar na
reduccedilatildeo dos custos de produccedilatildeo de mudas jaacute que esse
eacute um dos componentes mais onerosos Isso eacute
extremamente importante principalmente para
laboratoacuterios comerciais
TABELA 1 ndash Resumo da anaacutelise de variacircncia para as caracteriacutesticas meacutedias de nuacutemero de folhas (NF) nuacutemero de raiacutezes(NR) nuacutemero de brotos (NB) comprimento da parte aeacuterea (CPA) e massa fresca total de placircntulas (MFP) e respectivoscoeficientes de variaccedilatildeo (CV)
significativo a 1 e 5 de probabilidade respectivamente pelo teste F
FIGURA 1 ndash Efeito do meio de cultura MS e concentraccedilotildees de BAP no nuacutemero meacutedio de brotos em placircntulas hiacutebridasde Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo apoacutes 90 dias da incubaccedilatildeo
Fontes de variaccedilatildeo GL Quadrados meacutedios
NF NR NB CPA MFP Meios 2 125683 ns 162740 01483 ns 53139 02372 BAP 4 186198 ns 44693 ns 04408 ns 03373 ns 00075 ns
Meio x BAP 8 243984 ns 13417 ns 17417 13579 00459 ns
Resiacuteduo 45 124475 21329 05055 05961 00662 CV () 3467 3081 2801 2443 5100
Propagaccedilatildeo in vitro de placircntulas de orquiacutedea 71
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 68-73 2006
O estiacutemulo agrave brotaccedilatildeo em placircntulas de Spathoglottis
plicata Griff ocorreu em meio MS suplementado com 10
mg L-1 de BAP e 25 mg L-1 de ANA tendo o enraizamento
estimulado com 20 mg L-1 de AIB (NAYAK et al 1999)
TDZ tambeacutem eacute utilizado em associaccedilatildeo com BAP para
regeneraccedilatildeo de brotos de Rhynchostylis (BUI Le al 1999)
e de Anoectochilus (LI et al 1999) todas orquidaceaes
Observou-se interaccedilatildeo entre o tipo de meio de
cultura e o BAP no que diz respeito ao comprimento de
parte aeacuterea das placircntulas (Tabela 1) Pelo teste de F apenas
o meio WPM foi significativo em relaccedilatildeo agraves concentraccedilotildees
de BAP (Figura 2)
O maior comprimento da parte aeacuterea (47 cm) foi
observado quando se utilizou o meio WPM combinado
com 40 mg L-1 de BAP (Figura 2) Como a relaccedilatildeo foi direta
pode-se inferir que o efeito estimulatoacuterio do BAP sobre o
crescimento da parte aeacuterea continuaria mesmo em
concentraccedilotildees maiores que 40 mg L-1 Talukder et al (2003)
obtiveram melhor comprimento de brotos (0472 cm) em
placircntulas de Dendrobium com utilizaccedilatildeo de 25 mg L-1 de
BAP + 05 mg L-1 de ANA adicionados ao meio MS
Relativo ao nuacutemero meacutedio de raiacutezes houve
significacircncia apenas para o fator meio de cultura (Tabela 1)
Na Tabela 2 verifica-se que os maiores valores foram obtidos
com os meios WPM (557) seguido do MS (487) sendo os
menores valores verificados no meio Knudson C (378) A
emissatildeo de novas raiacutezes eacute favorecida pelo caacutelcio e pelo boro
O meio Knudson C apresenta uma concentraccedilatildeo maior de
caacutelcio e menor de boro em relaccedilatildeo aos meios MS e WPM
que possuem concentraccedilotildees semelhantes de ambos
Segundo Pierik (1987) em concentraccedilotildees mais elevadas
(1 a 10 mg L-1) as citocininas podem induzir a formaccedilatildeo de
gemas adventiacutecias quebrando a dominacircncia apical e retardando
a formaccedilatildeo de raiacutezes Talukder et al (2003) encontraram maior
nuacutemero de raiacutezes (193explante) em placircntulas de Dendrobium
com utilizaccedilatildeo de 25 mg L-1 de BAP + 05 mg L-1 de ANA
adicionados ao meio MS O estiacutemulo ao enraizamento em
Spathoglottis plicata ocorreu em meio MS suplementado com
20 mg L-1 de AIB (NAYAK et al 1999)
FIGURA 2 ndash Comprimento meacutedio da parte aeacuterea em placircntulas hiacutebridas Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo cultivadas emmeio de cultura WPM e diferentes concentraccedilotildees de BAP
TABELA 2 ndash Efeito de diferentes meios de cultura sobreo nuacutemero meacutedio de raiacutezes em placircntulas hiacutebridas de BclsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo
Meios de Cultura Nuacutemero meacutedio de raiacutezes
WPM 557 a MS 487 a KC 378 b
Meacutedias seguidas pela mesma letra natildeo diferem entre sipelo teste de Scott-Knott a 5
ARAUJO A G de et al72
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 68-73 2006
O efeito ora inibitoacuterio ora estimulatoacuterio dos
fitorreguladores na formaccedilatildeo de brotos e raiacutezes em
diferentes plantas pode estar associado agrave proacutepria
concentraccedilatildeo bem como a absorccedilatildeo dos reguladores de
crescimento pelo substrato (GEORGE 1996) agrave habituaccedilatildeo
(SANTANA amp PAIVA 2001) ou agrave deficiecircncia de proteiacutena
ligante promotora da atuaccedilatildeo das citocininas (TAIZ amp
ZEIGER 1998)
O nuacutemero de folhas natildeo apresentou diferenccedilas
significativas para os tratamentos estudados
isoladamente nem houve interaccedilatildeo entre eles (Tabela 1)
Talukder et al (2003) obtiveram maior nuacutemero de folhas
(425placircntula) em Dendrobium com utilizaccedilatildeo de 25 mg L-
1 de BAP + 05 mg L-1 de ANA adicionados ao meio MS
Para massa fresca de placircntulas houve significacircncia
apenas para o fator meio de cultura isoladamente (Tabela
1) Atraveacutes do teste de meacutedias constatou-se maior massa
de placircntulas frescas nos meios WPM e MS com 0524 e
0503g respectivamente Resultado inferior (0326g) foi
registrado em meio Knudson C (Tabela 3)
TABELA 3 ndash Efeito do meio de cultura na massa frescatotal de placircntulas do hiacutebrido Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmberGlowrsquo
Meios de Cultura Massa fresca total de placircntulas (g)
WPM 0524 a MS 0503 a KC 0326 b
Meacutedias seguidas pela mesma letra natildeo diferem entre sipelo teste de Scott-Knott a 5
Dignart (2003) estudando a germinaccedilatildeo in vitro
de sementes de Cattleya nobilior Rchbf em diferentes
meios de cultura (MS WPM Knudson C e B5 de
GAMBORG et al 1968) observou que natildeo houve
diferenccedilas entre os meios utilizados O BAP adicionado
ao meio de cultura provocou aumento da taxa de brotaccedilatildeo
a partir de 1 igravemolL
Segundo (PASQUAL 2001) os meios MS e WPM
possuem concentraccedilotildees similares de micronutrientes e satildeo
ricos em nitrogecircnio (N) e potaacutessio (K) Jaacute o meio Knudson C
natildeo possui micronutrientes e tem baixas concentraccedilotildees de
N e K em relaccedilatildeo ao MS e WPM Os melhores resultados
para as variaacuteveis analisadas foram observados em meio WPM
e MS Essa resposta provavelmente deveu-se ao fato de
que o meio Knudson C possui diferentes sais minerais e
embora seja muito utilizado na germinaccedilatildeo de sementes de
orquiacutedeas parece natildeo propiciar condiccedilotildees satisfatoacuterias para
o desenvolvimento de placircntulas de algumas espeacutecies de
orquiacutedeas
Sabe-se que existe uma relaccedilatildeo entre o nuacutemero de
brotos e seu tamanho e nessa relaccedilatildeo quanto maior for o
nuacutemero de brotos menor o tamanho dos mesmos
(GEORGE 1996) Essa relaccedilatildeo fez-se presente ateacute a
concentraccedilatildeo de 20 mg L-1 de BAP em Bc lsquoPastoralrsquo x Lc
lsquoAmber Glowrsquo No entanto em concentraccedilotildees superiores
tanto o nuacutemero quanto o comprimento dos brotos
aumentaram Tal diversidade de resultados estaacute
relacionada principalmente ao genoacutetipo da espeacutecie meio
de cultura e possivelmente agrave interferecircncia na accedilatildeo dos
reguladores de crescimento
Segundo Malaure et al (1991) diferentes efeitos
dos reguladores de crescimento podem ocorrer para
diferentes espeacutecies inclusive variaccedilotildees dentro de uma
mesma espeacutecie Em orquiacutedeas o efeito dos reguladores de
crescimento e de meios de cultura satildeo diversificados
principalmente quando se utiliza um hiacutebrido trigeneacuterico
com alto grau de heterozigose
CONCLUSOtildeES
Melhores resultados para propagaccedilatildeo in vitro de
placircntulas de orquiacutedea Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo satildeo
obtidos com o meio WPM A suplementaccedilatildeo de 4 mg L-1 de
BAP no meio WPM favorece o crescimento in vitro Para
a multiplicaccedilatildeo maior quantidade de brotos eacute conseguida
em meio MS na ausecircncia de BAP
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SILVEIRA D G et al74
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
EFEITO DO VIacuteRUS DAS ESTRIAS DA BANANEIRA NAMICROPROPAGACcedilAtildeO E NO CRESCIMENTO DAS PLANTAS DA
CULTIVAR CAIPIRA DURANTE A ACLIMATIZACcedilAtildeO1
EFFECT OF BANANA STREAK VIRUS ON MICROPROPAGATION AND PLANTGROWTH OF CULTIVAR CAIPIRA DURING ACLIMATIZATION
DANIELA GARCIA SILVEIRA2 ANTOcircNIO DA SILVA SOUZA3 PAULO ERNESTO MEISSNER FILHO3TALES MILER SOARES4 RANULFO CORREA CALDAS3 KAacuteTIA REGINA BARBOSA LEAtildeO5
1Parte da Dissertaccedilatildeo de Mestrado apresentada pelo primeiro autor ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias Agraacuterias da Escola de AgronomiaUFBA ndash Cruz das Almas BA2Doutoranda em Botacircnica ndash Universidade Estadual de Feira de SantanaUEFS ndash Feira de Santana BA ndash danielagsigcombr3Pesquisador da Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical ndash Caixa Postal 007 ndash 44380-000 ndash Cruz das Almas BA4Doutorando da Escola Superior Luis de QueirozEsalq ndash Piracicaba SP ndash tmsoaresesalquspbr5Engenheira Agrocircnoma MSc EBDA ndash Cruz das Almas BA ndash 44380-000 ndash krbleaohotmailcom
(Recebido em 12 de abril de 2006 e aprovado em 28 de agosto de 2006)
RESUMOAvaliaram-se os efeitos da infecccedilatildeo pelo viacuterus das estrias
de bananeira (Banana Streak Virus BSV) no desenvolvimento invitro e no crescimento das plantas da cultivar Caipira durante aaclimatizaccedilatildeo Utilizou-se o delineamento experimentalinteiramente casualizado com dois tratamentos plantas sadias eplantas infectadas pelo BSV com respectivamente 24 e 28repeticcedilotildees Os explantes foram desinfestados e estabelecidos emmeio MS baacutesico suplementado com 30 gL de sacarose solidificadocom 2 gL de lsquoPhytagelrsquo e pH ajustado em 58 Foram efetuadoscinco subcultivos em meio com 4 mgL de BAP (6-benzilaminopurina) e as plantas obtidas foram enraizadas nessemesmo meio de cultura sem reguladores de crescimento Apoacutesessa etapa transferiram-se as plantas para a aclimatizaccedilatildeo emcacircmara uacutemida onde permaneceram por 30 dias Avaliaram-se astaxas de multiplicaccedilatildeo a presenccedila in vitro dos sintomas do BSVnos explantes provenientes das plantas infectadas durante amicropropagaccedilatildeo e aclimatizaccedilatildeo as perdas por contaminaccedilatildeoenvolvendo fungos e bacteacuterias nas fases da micropropagaccedilatildeo e aaltura das plantas na fase da aclimatizaccedilatildeo A infecccedilatildeo pelo BSVnatildeo afetou significativamente a multiplicaccedilatildeo e o crescimento invitro das plantas sendo os sintomas do viacuterus visiacuteveis em todasas fases da micropropagaccedilatildeo e na aclimatizaccedilatildeo das plantasinfectadas A maior porcentagem de contaminaccedilatildeo ocorreu nafase de estabelecimento in vitro dos explantes independentementedos tipos de plantas utilizadas Apoacutes 30 dias de aclimatizaccedilatildeo asplantas com BSV apresentaram altura inferior agraves plantas sadiasA presenccedila do viacuterus natildeo influenciou a taxa de multiplicaccedilatildeo dosexplantes poreacutem afetou o crescimento das plantas infectadas
Termos para indexaccedilatildeo Musa BSV cultura de tecidospropagaccedilatildeo in vitro
ABSTRACTThe effects of the banana streak virus (BSV) infection on
in vitro development of the cultivar Caipira were evaluated The
used experimental design was a completely randomized withtwo treatments healthy plants and plants infected by BSV with24 and 28 replications respectively The explants weredisinfected and established in a basic MS medium supplementedwith 30 gL sucrose solidified with 2 gL lsquoPhytagelrsquo and pHadjusted to 58 Five subcultures were carried out in a mediumcontaining 4 mgL BAP (6-benzylaminopurine) and the plantletswere rooted in the same culture medium without growthregulators Afterwards the plantlets were transferred to a humidchamber for acclimatization during a 30-day periodMultiplication rates presence of BSV symptoms on in vitroexplants obtained from plants infected during themicropropagation and acclimatization periods losses caused byfungal and bacterial contamination and plantlet height at theacclimatization stage were evaluated The infection by BSVpresented no significant effect on the multiplication rate and invitro plant growth although the virus symptoms were visible inall the micropropagation phases and during the acclimatizationof infected plants The highest percentage of contaminationoccurred during the in vitro establishment phase regardless theused plants After 30 days of acclimatization the plants withBSV presented a lower height compared to the healthy plantsAlthough the presence of the virus had no influence on the explantmultiplication rate it affected the growth of infected plants
Index terms Musa BSV tissue culture in vitro propagation
INTRODUCcedilAtildeO
As bananeiras estatildeo sujeitas as vaacuterias doenccedilas
causadas por fungos bacteacuterias nematoacuteides e viacuterus que
satildeo limitantes agrave sua capacidade de produccedilatildeo Entre as
viroses que ocorrem no Brasil destaca-se a causada pelo
viacuterus das estrias da bananeira (Banana streak virus BSV)
Efeito do viacuterus das estrias da bananeira 75
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
que eacute particularmente importante para os programas de
melhoramento geneacutetico e de multiplicaccedilatildeo comercial de
cultivares uma vez que pode ser incorporada ao genoma e
transmitida pelas sementes de plantas infectadas
(DANIELLS et al 1995) aleacutem de natildeo existir um meacutetodo
eficiente para limpar uma planta infectada com BSV
(LOCKHART 1994)
Esse viacuterus natildeo eacute transmitido mecanicamente sendo as
mudas infectadas sua principal forma de disseminaccedilatildeo
(LOCKHART amp AUSTREY 1988 LOCKHART 1994) A
transmissatildeo eacute feita de maneira semi-persistente pela cochonilha-
dos-citros Planococcus citri Risso e pela cochonilha-da-cana-
de-accediluacutecar Saccharicoccus sacchari cocherell (LOCKHART
1993 LOCKHART amp AUSTREY 1988)
O BSV inicialmente causa na bananeira um estriado
cloroacutetico de linhas descontiacutenuas dispersas e concentradas
em partes da lacircmina foliar Com o envelhecimento das
folhas o estriado causa necrose de coloraccedilatildeo marrom-cafeacute
a negro (RAMIREZ amp RIVERA 1994) As plantas
infectadas geralmente natildeo mostram sintomas em todas as
folhas (CORDEIRO amp KIMATI 1997 LOCKHART 1986)
Outros sintomas do BSV satildeo a reduccedilatildeo do vigor da planta
e a diminuiccedilatildeo do tamanho dos frutos que tambeacutem ficam
deformados (RAMIREZ amp RIVERA 1994)
Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos
da infecccedilatildeo pelo BSV na multiplicaccedilatildeo in vitro e no
crescimento durante a aclimatizaccedilatildeo das plantas de
bananeira da cultivar Caipira Aleacutem disso avaliou-se a taxa
de contaminaccedilatildeo por fungos e bacteacuterias na etapas da
micropropagaccedilatildeo devido a importacircncia dessa variaacutevel na
multiplicaccedilatildeo in vitro das plantas
MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo dos efeitos do BSV na micropropagaccedilatildeo
da cultivar Caipira (grupo AAA) foi conduzido no
Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos da Embrapa Mandioca
e Fruticultura Tropical Utilizou-se o delineamento
experimental inteiramente casualizado com dois
tratamentos plantas sadias com 24 repeticcedilotildees coletadas
no Banco de Germoplasma de Bananeira da Embrapa
Mandioca e Fruticultura Tropical e plantas infectadas com
BSV com 28 repeticcedilotildees Foram usadas mudas do tipo
chifrinho sendo que as matrizes infectadas com BSV com
altura meacutedia de 12 cm foram infestadas pela cochonilha
vetora Planacoccus citri Risso alimentadas em folhas de
banana lsquoMysorersquo com sintomas de BSV em casa-de-
vegetaccedilatildeo Aproximadamente 15 dias apoacutes a infestaccedilatildeo
todas as 28 plantas estavam com os sintomas da virose
Para o estabelecimento in vitro realizou-se a limpeza
das matrizes por meio de uma seacuterie de cortes removendo-
se parte do rizoma e do pseudocaule ateacute o tamanho
aproximado de 50 cm de altura por 15 cm de diacircmetro
lavando-se com detergente e aacutegua deionizada A
desinfestaccedilatildeo foi feita em cacircmara de fluxo laminar
imergindo os explantes em soluccedilatildeo de aacutelcool 70 por
cinco minutos e em soluccedilatildeo 11 de aacutegua sanitaacuteria comercial
(2 de cloro ativo) com aacutegua deionizada por 30 minutos
Em seguida foram realizadas trecircs lavagens com aacutegua
deionizada esterilizada e reduzidos os explantes ateacute o
tamanho final de 06 cm de altura por 04 cm de diacircmetro
As etapas de estabelecimento multiplicaccedilatildeo e
enraizamento foram realizadas em meio nutritivo MS baacutesico
(MURASHIGE amp SKOOG 1962) suplementado com 30 g
L de sacarose solidificado com 2 gL de ldquoPhytagelrdquo e pH
ajustado para 58 Apenas na fase de multiplicaccedilatildeo o meio
MS foi suplementado com 4 mgL de 6-benzilaminopurina
(BAP) Em todas as etapas os explantes foram dispostos
sobre 25 mL de meio de cultura em frascos com 12 cm de
altura por 5 cm de diacircmetro
A multiplicaccedilatildeo foi realizada em cinco subcultivos
das gemas e brotos sendo efetuada a subdivisatildeo
longitudinal dos explantes sempre que possiacutevel O
estabelecimento e os cinco subcultivos foram realizados
com intervalos de 30 dias Apoacutes os subcultivos as
plantas permaneceram 30 dias em enraizamento O
estudo foi desenvolvido sob condiccedilotildees de temperatura
de 27 plusmn 1ordmC fotoperiacuteodo de 16 horas e intensidade
luminosa de 22 microEm2s
SILVEIRA D G et al76
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
Apoacutes o enraizamento in vitro 47 plantas sadias e 40
plantas infectadas com BSV foram transferidas para copos
plaacutesticos de 300 cm3 contendo o Plantmaxreg e vermiculita
(21) permanecendo 30 dias sob condiccedilotildees de 85 de umidade
relativa do ar e 60 de sombreamento em casa-de-vegetaccedilatildeo
Na fase de estabelecimento e em cada subcultivo
foram avaliadas as taxas de multiplicaccedilatildeo e a presenccedila dos
sintomas do BSV nos explantes provenientes das plantas
infectadas Na fase de aclimatizaccedilatildeo avaliaram-se a
presenccedila de sintomas nas plantas infectadas e as suas
respectivas alturas As medidas foram tomadas do coleto
ateacute a extremidade apical da folha mais alta
Os dados referentes ao nuacutemero de gemas obtidas
nos cinco subcultivos foram transformados em raiz
quadrada Foi estabelecida uma regressatildeo linear para cada
tratamento em funccedilatildeo dos subcultivos
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
A infecccedilatildeo pelo BSV natildeo afetou significativamente
o crescimento e a multiplicaccedilatildeo das plantas sendo que o
nuacutemero de gemas cresceu linearmente em funccedilatildeo dos
subcultivos em ambos os tratamentos Trabalhando com
plantas micropropagadas de bananeira sadias e infectadas
com o viacuterus do topo em leque (Banana bunchy top virus
BBTV) Thomas et al (1995) observaram que aquela virose
tambeacutem natildeo afetou a capacidade das plantas em crescer e
multiplicar Nas anaacutelises de regressatildeo realizadas para os
dois tratamentos (plantas sadias e plantas com BSV) o
acreacutescimo no nuacutemero de gemas em funccedilatildeo dos subcultivos
pode ser explicado por um modelo de regressatildeo linear
(Figura 1) As estimativas da regressatildeo linear para plantas
com BSV e plantas sadias foram altamente significativas e
os coeficientes de determinaccedilatildeo (R2) proacuteximos de 1 Foi
observado que as linhas determinadas a partir das
equaccedilotildees obtidas satildeo quase superpostas evidenciando
um comportamento semelhante entre os dois tratamentos
com relaccedilatildeo ao nuacutemero de gemas por subcultivo
Em todas as fases da micropropagaccedilatildeo os sintomas
do BSV foram visiacuteveis ocorrendo nas folhas das plantas
infectadas estriados cloroacuteticos com linhas descontiacutenuas e
FIGURA 1 ndash Curvas de regressatildeo linear obtidas a partir dosdados de gemas em cada subcultivo da cultivar de bananeiraCaipira sadias e infectadas com BSV Cruz das Almas (BA)Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical 2006Dados transformados por x
dispersas (Figura 2) Esses mesmos sintomas foram
observados em plantas de bananeira infectadas com BSV
mantidas a campo (RAMIREZ amp RIVERA 1994)
As contaminaccedilotildees que ocorreram nos materiais
in vitro foram tambeacutem avaliadas As maiores taxas de
contaminaccedilatildeo aconteceram na fase de estabelecimento
in vitro dos explantes obtendo-se niacuteveis de 21 e 32
para as plantas sadias e infectadas com BSV
respectivamente (Figura 3) Os elevados iacutendices de perdas
nesta etapa foram causados principalmente por
contaminaccedilatildeo bacteriana Segundo Oliveira amp Silva
(1997) as maiores contaminaccedilotildees bacterianas dos
explantes de bananeira ocorrem na fase de
estabelecimento in vitro do que nos demais subcultivos
Oliveira et al (2000) trabalhando com plantas livres de
viacuterus obtiveram taxas de contaminaccedilatildeo nesta fase entre
10 e 45 as quais estatildeo proacuteximas agraves obtidas neste
trabalho Durante a fase de multiplicaccedilatildeo as perdas por
contaminaccedilatildeo foram menores variando de 14 a 74
para as plantas sadias e de 0 a 121 no caso das plantas
infectadas com BSV sendo que a maior parte do material
foi contaminada por fungos natildeo-patogecircnicos Estes
valores foram bem inferiores agravequeles obtidos por Oliveira
et al (1999) (131) que utilizaram genoacutetipos diploacuteides
triploacuteides e tetraploacuteides de bananeiras sadias
Efeito do viacuterus das estrias da bananeira 77
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
FIGURA 2 ndash Planta de bananeira lsquoCaipirarsquo infectada com BSV na fase de enraizamento in vitro apresentando estriadoscloroacuteticos com linhas descontiacutenuas e dispersas nas folhas Cruz das Almas (BA) Embrapa Mandioca e FruticulturaTropical 2006
FIGURA 3 ndash Taxas por contaminaccedilatildeo () de explantes dacultivar Caipira na fase de estabelecimento (Est) e ao longode cinco subcultivos (Sub) Cruz das Almas (BA)Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical 2006
Durante o enraizamento in vitro natildeo houve
diferenccedila significativa na altura das plantas Poreacutem com
30 dias de aclimatizaccedilatildeo as plantas com BSV apresentaram
altura significativamente inferior agraves plantas sadias (Tabela 1)
Soares et al (2000) cultivaram mudas de bananeira lsquoCaipirarsquo
sadias e infectadas com BSV durante 141 dias em casa-de-
vegetaccedilatildeo e observaram que a infecccedilatildeo pelo viacuterus implicou
em significativa reduccedilatildeo no crescimento inicial afetando
o porte o desenvolvimento do sistema radicular e a aacuterea
fotossintetizante das plantas Verifica-se assim que a
infecccedilatildeo pelo BSV prejudicou o crescimento inicial das
plantas afetando a altura daquelas infectadas mesmo em
um periacuteodo relativamente curto indicando que em periacuteodos
mais longos o prejuiacutezo com relaccedilatildeo ao crescimento pode
ser ainda maior aconteceu no estudo desenvolvido por
Soares et al (2000)
Os sintomas do BSV permaneceram visiacuteveis em
todas as plantas infectadas durante e apoacutes a fase de
aclimatizaccedilatildeo Esse resultado foi diferente ao obtido por
Dahal et al (1999) quando micropropagaram hiacutebridos de
Musa pois os sintomas soacute foram visiacuteveis em plantas com
trecircs meses apoacutes o enraizamento Provavelmente essa
diferenccedila foi devido agraves condiccedilotildees onde os trabalhos foram
conduzidos casa-de-vegetaccedilatildeo e campo respectivamante
bem como aos genoacutetipos estudados Observaccedilotildees
semelhantes foram tambeacutem efetuadas por Gauhl amp Pasberg-
Gauhl (1995) e Ortiz (1996) ao estudarem a incidecircncia de
viroses em diferentes genoacutetipos de bananeira
SILVEIRA D G et al78
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
Alturas (cm) Plantas de bananeira lsquoCaipirarsquo
Enraizamento
in vitro 30 dias de
aclimatizaccedilatildeo
Sadias 637 a 2690 a BSV 728 a 2192 b
TABELA 1 ndash Meacutedias das alturas das plantas apoacutes oenraizamento in vitro e 30 dias de aclimatizaccedilatildeo em casa-de-vegetaccedilatildeo Cruz das Almas (BA) Embrapa Mandiocae Fruticultura Tropical 2006
Meacutedias seguidas pelas mesmas letras nas colunas natildeodiferem estatisticamente entre si pelo teste F ao niacutevel de 5 de significacircncia
CONCLUSOtildeES
A infecccedilatildeo pelo BSV natildeo influenciou a taxa de
multiplicaccedilatildeo dos explantes embora os sintomas do viacuterus
tenham sido visiacuteveis em todas as fases da micropropagaccedilatildeo
e durante os primeiros 30 dias da aclimatizaccedilatildeo das plantas
infectadas Todavia o crescimento das plantas infectadas
foi afetado pela presenccedila do viacuterus
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THOMAS J E SMITH M K KESSLING A G HAMILLS D Incosistent transmission of banana bunchy top virusin micropropagated bananas and its implication forgermplasm screening Australian Journal of AgriculturalResearch Collingwood v 46 n 3 p 663-671 1995
FOGACcedilA L A et al80
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
CARACTERIacuteSTICAS MORFOFISIOLOacuteGICAS DE BROTACcedilOtildeES DEAgapanthus umbellatus var minor MULTIPLICADAS EM
BIORREATOR DE IMERSAtildeO TEMPORAacuteRIA1
MORPHOLOGICAL AND PHYSIOLOGICAL CHARACTERISTICS Agapanthus umbellatus varminor OF SHOOTS PROPAGATED IN BIOREACTOR OF TEMPORARY IMMERSION
LUCIANA ALVES FOGACcedilA2 DENILSON DORTZBACH3 ANTONIO CARLOS ALVES4 ENIO LUIZ PEDROTTI5
1Parte da dissertaccedilatildeo de mestrado do primeiro autor junto ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Recursos Geneacuteticos vegetais CCA UFSC ndash Florianoacutepolis SC2Engenheira Agrocircnoma Mestre em Recursos Geneacuteticos Vegetais ndash CCAUFSC ndash UFSC Trindade ndash Florianoacutepolis SC ndash 88040-900 ndash lufogacapopcombr3Empresa Catarinense de Pesquisa Agropecuaacuteria ndash Rodovia Admar Gonzaga 1340 ndash Bairro Itacorubi Florianoacutepolis SC ndash denilsondtbolcombr4Engenheiro Agrocircnomo Professor Dr Departamento Fitotecnia ndash CCAUFSC ndash UFSC ndash alvesccaufscbr5Engenheiro Agrocircnomo Professor Dr Departamento Fitotecnia ndash CCAUFSC ndash UFSC ndashRodovia Admar Gonzaga 1346 ndash 88 040 900 ndash Florianoacutepolis- SC ndash pedrotticcaufscbr
RESUMOCom o presente trabalho objetivou-se estudar alguns
aspectos morfoloacutegicos e fisioloacutegicos de placircntulas de Agapanthusumbellatus LrsquoHeacuter var minor multiplicadas em biorreatores deimersatildeo temporaacuteria (BIT) Foram testadas quatro concentraccedilotildeesde sacarose no meio de cultura e duas intensidades luminosasem um total de oito tratamentos formando um fatorial 2 x 4 Odelineamento experimental utilizado foi inteiramentecasualizado Os resultados obtidos indicaram que as condiccedilotildeesambientais principalmente luz e concentraccedilatildeo de sacarose domeio de cultura influenciaram o desenvolvimento e o crescimentodas placircntulas quando multiplicadas Observou-se que a ausecircnciade sacarose mesmo no niacutevel mais elevado de intensidadeluminosa natildeo estimulou a fotossiacutentese das placircntulas Acombinaccedilatildeo de 30 gL-1 de sacarose e 70 mMm-2s-1 de luzproporcionou maior numero de folhas massa fresca e secaconcentraccedilatildeo de clorofila a b e total fatores estes que tecircmgrande influecircncia na fase de aclimatizaccedilatildeo
Termos para indexaccedilatildeo Plantas ornamentaismicropropagaccedilatildeo sacarose intensidade luminosa
ABSTRACTThe objective of the present work was to study
morphological and physiological characteristics of Agapanthusumbellatus LrsquoHeacuter var minor plantlets propagated in bioreactorof temporary immersion (BIT) Four sucrose concentrationsand two light intensities were analyzed totalizing eighttreatments The experimental design used was a completelyrandomized with a 2 x 4factorial The results indicated that theenvironment conditions mainly light and sucrose concentrationsof the culture medium influenced plantlets development andgrowth It was observed that the absence of sucrose even inthe highest level of light intensity had no stimuli on plantletphotosynthesis The combination of 30 g L-1 sucrose and 70mM m-2 s-1 light had promoted higher leaf number fresh anddry weight concentration of chlorophyll a b and total
parameters that present high influence during theacclimatizationrsquos phase
Index terms Ornamental plants micropropagation sucroselight intensity
INTRODUCcedilAtildeO
Agapanthus umbellatus var minor tambeacutem
conhecida como Agapantho ou Liacuterio do Nilo eacute uma
angiosperma da famiacutelia Amaryllidaceae pertencente agrave
ordem Liliales (BOTANY 2003) eacute uma espeacutecie ornamental
muito utilizada como flor de corte devido agrave sua durabilidade
No entanto o maior interesse econocircmico nesta espeacutecie
decorre do seu uso como forraccedilatildeo em jardins e praccedilas
(LORENZI amp SOUZA 1995)
Sua propagaccedilatildeo eacute tradicionalmente efetuada
atraveacutes da divisatildeo de touceiras No entanto esta teacutecnica
apresenta uma seacuterie de desvantagens visto que a taxa de
propagaccedilatildeo eacute baixa cerca de dez mudas por planta ao ano
aleacutem de possibilitar a dispersatildeo de pragas e doenccedilas que
poderatildeo ocorrer no viveiro de produccedilatildeo Sendo assim a
micropropagaccedilatildeo pode ser uma ferramenta muito
promissora para esta espeacutecie
O processo de micropropagaccedilatildeo induz a um grande
nuacutemero de mudanccedilas anatocircmicas morfoloacutegicas e
fisioloacutegicas que muitas vezes tem limitado o cultivo in vitro
de algumas espeacutecies (DESJARDINS 1993) A
(Recebido em 18 de julho de 2005 e aprovado em 25 de agosto de 2006)
Caracteriacutesticas morfofisioloacutegicas de brotaccedilotildees 81
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
heterogeneidade de respostas agraves placircntulas que ocorrem
na cultura de tecidos eacute promovida natildeo soacute por fatores
inerentes ao tecido vegetal (geneacuteticos e fisioloacutegicos) mas
tambeacutem por modificaccedilotildees do ambiente in vitro
As modificaccedilotildees do ambiente in vitro envolvem a
qualidade e intensidade de luz fotoperiacuteodo temperatura
umidade reguladores de crescimento exoacutegenos fonte de
carbono e estresse mecacircnico Estes satildeo determinantes na
morfogecircnese no crescimento e no desenvolvimento de
placircntulas in vitro (GEORGE 1996 KOZAI et al 1990
SALISBURY 1981) Aleacutem disso interferem no nuacutemero de
folhas teor de clorofila densidade estomaacutetica (LIAN et
al 2002 PREECE amp SUTTER 1991) na fotossiacutentese e na
fase de aclimatizaccedilatildeo (DESJARDINS et al 1995)
Um dos principais fatores que causam grande
influecircncia na fotossiacutentese de placircntulas cultivadas in vitro
eacute a intensidade luminosa (GALZY amp COMPAN 1992) A
quantidade e a qualidade da luz bem como o fotoperiacuteodo
podem afetar o crescimento e o desenvolvimento de
placircntulas in vivo (SMITH 1982) e placircntulas in vitro
(ECONOMOU amp READ 1987 VLAHOS et al 1992) Esta
influecircncia se deve ao grande impacto sobre o acuacutemulo de
pigmentos biossiacutentese de clorofila diferenciaccedilatildeo de
cloroplastos e anatomia da folha (DESJARDINS et al 1995)
Outro fator que vem sendo estudado e que pode
determinar um papel importante no controle da atividade
fotossinteacutetica de placircntulas in vitro eacute a utilizaccedilatildeo de
carboidratos exoacutegenos pois o crescimento da maioria das
culturas in vitro eacute sustentado pela sacarose ou outros
accediluacutecares adicionados ao meio de cultura (PREECE amp
SUTTER 1991) Estes podem ser utilizados pelas placircntulas
quando a taxa de fotossiacutentese natildeo permite assegurar um
balanccedilo positivo em carbono definindo assim uma nutriccedilatildeo
mixotroacutefica ou heterotroacutefica (GALZY amp COMPAN 1992)
Baseado na hipoacutetese de que a composiccedilatildeo do meio
de cultura e a intensidade luminosa influenciam a
morfologia e a fisiologia de placircntulas micropropagadas o
presente trabalho teve como objetivo estudar aspectos
morfoloacutegicos e fisioloacutegicos de placircntulas de Agapanthus
umbellatus LrsquoHeacuter var minor multiplicadas em biorreator de
imersatildeo temporaacuteria (BIT) Para tanto foi avaliado o
desenvolvimento e o crescimento desta espeacutecie durante a
fase de multiplicaccedilatildeo em funccedilatildeo da variaccedilatildeo de niacuteveis de
sacarose e intensidade luminosa
MATERIAIS E MEacuteTODOS
Este trabalho foi realizado no Laboratoacuterio de
Morfogecircnese e Bioquiacutemica Vegetal localizado no Centro
de Ciecircncias Agraacuterias da Universidade Federal de Santa
Catarina em Florianoacutepolis - SC
O trabalho consistiu de um ensaio onde foram
utilizadas brotaccedilotildees de Agapanthus umbellatus var minor
obtidas da terceira repicagem mantidas em meio geleificado
MS + 178 mM de BAP Apoacutes serem individualizadas e
padronizadas tendo o seu tamanho variando entre 25 e
30 cm de comprimento as brotaccedilotildees foram transferidas
para o BIT (ETIENNE amp BERTHOULY 2002) contendo 500
mL de meio liacutequido e sais de MS (MURASHIGE amp SKOOG
1962) em condiccedilotildees asseacutepticas suplementado com
concentraccedilatildeo de 89 mM de BAP O pH foi ajustado com
NAOH (1N) em 59 antes da autoclavagem (durante 15
minutos sob 121ordmC e 15 atm de pressatildeo) O delineamento
experimental utilizado no ensaio foi o inteiramente
casualizado Foram testados quatro concentraccedilotildees de
sacarose no meio de cultura (0 15 30 e 45) e duas
intensidades luminosas (70 e 140 mmolm-2s-1) providas
por lacircmpadas brancas fluorescentes (PHILIPS ndash TLT 40W)
em um total de oito tratamentos formando um fatorial 2 x 4
Cada tratamento foi composto por trecircs frascos (repeticcedilatildeo)
contendo 50 plantas cada um
Os frascos foram mantidos em sala de crescimento
com fotoperiacuteodo de 16 horas e temperatura meacutedia de 22ordmC
com variaccedilatildeo de plusmn 2ordmC por um periacuteodo de 60 dias
Apoacutes 60 dias de cultivo foram avaliadas as
seguintes caracteriacutesticas dos explantes nuacutemero e tamanho
das brotaccedilotildees (cm) nuacutemero de folhasbrotaccedilatildeo massa
fresca e seca (g) da parte aeacuterea e raiz utilizando-se amostras
de 25 placircntulas por repeticcedilatildeo escolhidas ao acaso
FOGACcedilA L A et al82
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A determinaccedilatildeo do conteuacutedo de clorofila ldquoa b e
totalrdquo consistiu na coleta de amostras de 100 mg de massa
fresca As amostras foram incubadas com 70 mL de DMSO
(dimetilsulfoacutexido) sem maceraccedilatildeo por 30 minutos a 65degC
Apoacutes filtragem seu volume foi completado para 10 mL com
DMSO Desses extratos 2 mL foram analisados em
espectrofotocircmetro (UV - visiacutevel SHIMADZU) para os
valores de absorbacircncia entre 645 e 663 nm Os valores obtidos
foram submetidos agrave foacutermula de Arnon (1949) conforme
descrito por Hiscox amp Israelstam (1979) Chl a = (00127 X
D663) ndash (000269 X D645) e Chl b = (00229 X D645) ndash (000468
X D663) A clorofila total foi a soma da ldquoChl a e Chl brdquo de
cada tratamento foram utilizadas 25 amostras
A determinaccedilatildeo da densidade estomaacutetica (nuacutemero
de estocircmatos por mm2 de superfiacutecie foliar) foi realizada nas
amostras das quais extraiu-se a clorofila Apoacutes a extraccedilatildeo
da clorofila as folhas foram cortadas e somente o terccedilo
meacutedio das folhas foi usado para anaacutelise Em seguida foram
fixadas sobre lacircminas histoloacutegicas com a ajuda de uma
lamiacutenula e de algumas gotas de aacutegua esterilizada A
observaccedilatildeo foi realizada na epiderme das faces adaxial e
abaxial da folha com o auxiacutelio de um microscoacutepio oacutetico
(OLYMPUS CH30 ocular WH10 X 22) com um aumento
de 400 vezes e com um campo conhecido de 024 mm2 Para
cada lacircmina foram feitas leituras em cinco campos
Os dados obtidos foram avaliados por meio da
anaacutelise de variacircncia (ANOVA) seguindo o modelo para
experimento bifatorial inteiramente casualizado O nuacutemero
de brotaccedilotildees o nuacutemero de folhas e a densidade estomaacutetica
foram transformados em Oumlx+1 para a anaacutelise As meacutedias
dos tratamentos foram separadas pelo teste de comparaccedilatildeo
de meacutedias de Duncan a 5 de probabilidade conforme
recomendaccedilotildees de Stell amp Torrie (1980)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
A concentraccedilatildeo de sacarose no meio de cultura
apresentou uma accedilatildeo positiva e interativa com a intensidade
luminosa na proliferaccedilatildeo de brotaccedilotildees (Tabela 1) visto
que a ausecircncia de sacarose no meio de cultura resultou
em insucesso no crescimento das placircntulas de Agapantho
principalmente nos primeiros dias Apoacutes o
desenvolvimento inicial (aproximadamente 10 dias) foi
constatada estagnaccedilatildeo no crescimento das placircntulas
seguido de atrofia e necrose das brotaccedilotildees Apoacutes 20 dias
de cultivo ocorreu a morte das brotaccedilotildees Isso mostrou
que folhas de placircntulas de Agapantho natildeo fixaram
carbono suficiente para sustentar seu crescimento na
ausecircncia de sacarose Portanto para a espeacutecie em estudo
foi necessaacuteria a adiccedilatildeo de uma fonte de carbono no meio
de cultura para o seu desenvolvimento in vitro Segundo
Capellades et al (1991) e Desjardins et al (1995) a total
remoccedilatildeo de carboidratos no meio de cultura para algumas
espeacutecies frequumlentemente torna-se prejudicial para o
crescimento das placircntulas o que pode prejudicar o
processo de micropropagaccedilatildeo e aclimatizaccedilatildeo pois
durante o cultivo in vitro as placircntulas perdem
parcialmente o autotrofismo e consequumlentemente
necessitam de uma fonte de carbono
O maior nuacutemero de brotaccedilotildees foi obtido com a
intensidade luminosa de 70 mmolm-2s-1 e a concentraccedilatildeo
de 45 gL-1 de sacarose (Tabela 1) Enquanto que com a
intensidade luminosa de 140 mmolm-2s-1 o maior nuacutemero
de brotaccedilotildees foi obtido com a concentraccedilatildeo de 30 gL-1 de
TABELA 1 ndash Nuacutemero de brotaccedilotildeesexplante de placircntulasde Agapanthus umbellatus var minor multiplicadasbiorreator de imersatildeo temporaacuteria suplementado comdiferentes concentraccedilotildees de sacarose e intensidadesluminosas no periacuteodo de 60 dias
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1)
Concentraccedilatildeo Sacarose (gL-1) 70 1 140 1
0 000 dA 00 dA 15 370 cB 544 cA 30 553 bB 651 aA 45 745 aA 585 bB
CV 67
Meacutedias seguidas pela mesma letra minuacutescula nas colunase maiuacutescula nas linhas natildeo diferem significativamente peloteste de Duncan a 5 de probabilidade1 Observaccedilotildees transformadas segundo ( x+1)
Caracteriacutesticas morfofisioloacutegicas de brotaccedilotildees 83
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sacarose Isso demonstrou um alto grau de mixotrofia dessa
espeacutecie
O tamanho das brotaccedilotildees e o nuacutemero de folhas
(Tabela 2) foram afetados apenas pelo efeito simples dos
fatores natildeo havendo interaccedilatildeo entre sacarose e luz O
maior tamanho das brotaccedilotildees foi alcanccedilada quando os
explantes foram submetidos a 15 gL-1 de sacarose e 140
mmolm-2s-1 de intensidade luminosa (Tabela 2) Verificou-
se tambeacutem que o aumento da concentraccedilatildeo desse
carboidrato no meio de cultura natildeo favoreceu o
alongamento das brotaccedilotildees Provavelmente o aumento
da intensidade luminosa favoreceu a taxa de fotossiacutentese
das placircntulas permitindo um balanccedilo positivo de carbono
afetando o crescimento e o desenvolvimento de placircntulas
in vitro (LEE et al 1995)
Por outro lado o maior nuacutemero de folhas de
Agapantho foi obtido na concentraccedilatildeo de 30 gL-1 de
sacarose (Tabela 2) A intensidade luminosa natildeo teve
influecircncia sobre essa variaacutevel Contrastando com os dados
obtidos no presente trabalho Konow amp Wang (2001)
determinaram que a intensidade luminosa de 40 mmolm-
2s-1 promoveu um aumento no nuacutemero de folhas de
Phalaenopsis enquanto placircntulas que se desenvolveram
em ambiente com intensidade de 10 e 80 molm-2s-1
apresentaram um menor nuacutemero de folhas Segundo os
autores o aumento no nuacutemero de folhas pode indicar que
TABELA 2 ndash Tamanho de brotaccedilotildees e nuacutemero de folhasbrotaccedilatildeo de placircntulas de Agapanthus umbellatus var minormultiplicadas em biorreator de imersatildeo temporaacuteria suplementado com diferentes concentraccedilotildees de sacarose eintensidades luminosas no periacuteodo de 60 dias
Meacutedias seguidas pela mesma letra nas linhas e colunas natildeo diferem significativamente pelo teste de Duncan a 5 deprobabilidade
houve estiacutemulo da fotossiacutentese in vitro Outro efeito
observado em placircntulas de Agapantho neste trabalho foi
a presenccedila de folhas mais claras e vitrificadas (folhas com
aspecto viacutetreo pouco desenvolvidas aparecircncia suculenta
e translucente) na grande maioria das placircntulas
multiplicadas em meio suplementado com 15 gL-1 de
sacarose e intensidade luminosa de 70 mmolm-2s-1 Estes
resultados podem indicar que o aparato fotossinteacutetico natildeo
tenha se desenvolvido adequadamente (CAPPELADES et
al 1991 DESJARDINS et al 1995) afetando a acumulaccedilatildeo
de massa fresca Possivelmente a presenccedila de folhas
vitrificadas foi influenciada pelo uso de meio liacutequido pois
de acordo com George (1996) e Etienne amp Berthouly (2002)
o meio liacutequido favorece a produccedilatildeo de folhas vitrificadas
quando comparado com meio geleificado No entanto
observou-se que para os demais tratamentos em
concentraccedilotildees maiores de sacarose (30 e 45 gL-1) a
presenccedila de brotaccedilotildees vitrificadas foi rara ou nenhuma
Neste sentido o desenvolvimento de brotaccedilotildees com esta
caracteriacutestica pode estar relacionado agrave concentraccedilatildeo de
sacarose no meio e agrave diferenccedila osmoacutetica entre as brotaccedilotildees
e o meio de cultura (DEBERGH et al 1981) Este resultado
tambeacutem foi obtido na multiplicaccedilatildeo de rosas na qual onde
a reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo de sacarose para 10 gL-1 na
fase de multiplicaccedilatildeo promoveu um aumento significativo
na presenccedila de plantas vitrificadas e quando submetidas
Tamanho de brotaccedilotildees (cm)
Nuacutemero de folhasbrotaccedilatildeo
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1) Concentraccedilatildeo Sacarose
(gL-1) 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia
0 000 000 000 d 000 000 000 d 15 275 396 335 a 407 408 408 b 30 295 295 295 b 414 404 409 a 45 245 220 233 c 400 408 404 c
Meacutedia 204 b 228 a 276 a 275 a
CV 2595 467
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a concentraccedilotildees de 30 e 40 gL-1 a presenccedila de placircntulas
vitrificadas foi rara (LANGFORD amp WAINWRIGHT 1987)
Outro fator que possivelmente pode ter
influenciado a presenccedila de placircntulas vitrificadas in vitro
foi a baixa intensidade luminosa (GEORGE 1996) pois
placircntulas de Agapantho multiplicadas sob intensidade de
140 mmolm-2s-1 e 15 gL-1 de sacarose natildeo apresentaram
caracteriacutestica de vitrificaccedilatildeo Estes dados indicaram que o
aumento da intensidade luminosa evitou a presenccedila de
plantas vitrificadas aleacutem de proporcionar um incremento e
estiacutemulo na atividade fotossinteacutetica (GEORGE 1996)
A produccedilatildeo de massa fresca e seca das brotaccedilotildees
foram influenciadas pela interaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo
de sacarose e a intensidade luminosa (Tabela 3) Placircntulas
de Agapantho multiplicadas sob intensidade de 70
mmolm-2s-1 apresentaram a maior produccedilatildeo de massa
fresca e seca dentro das concentraccedilotildees de 30 gL-1 Nas
concentraccedilotildees de 15 e 45 gL-1 os resultados obtidos
foram inferiores (Tabela 3) Por outro lado quando se
aumentou a intensidade para 140 mmolm-2s-1 a melhor
produccedilatildeo de massa fresca e seca ocorreu dentro da
concentraccedilatildeo de 15 gL-1 de sacarose (Tabela 3) Verificou-
se assim que o aumento da concentraccedilatildeo de sacarose no
meio de cultura proporcionou efeitos negativos na
produccedilatildeo de massa fresca e seca quando as placircntulas
foram submetidas agrave intensidade luminosa mais elevada
TABELA 3 ndash Massa fresca e seca de brotaccedilotildees de Agapanthus umbellatus var minor multiplicadas em biorreator de imersatildeotemporaacuteria suplementado com diferentes concentraccedilotildees de sacarose e intensidades luminosas no periacuteodo de 60 dias
Tais resultados corroboram as afirmaccedilotildees feitas referentes
agrave variaacutevel nuacutemero de brotaccedilotildees em que demonstrou-se
que foi possiacutevel reduzir a concentraccedilatildeo de sacarose em
maiores intensidade luminosas confirmando o grau de
mixotrofia
Ao analisar a concentraccedilatildeo de clorofila em
folhas de Agapantho verificou-se que natildeo houve
interaccedilatildeo significativa entre as concentraccedilotildees de
sacarose e intensidade luminosa Os teores de clorofila
a b e total (Tabela 4) foram maiores nas concentraccedilotildees
de 30 gL-1 sacarose Serret et al (1995) mostraram que
o aumento da concentraccedilatildeo de accediluacutecares (30 gL-1) no
meio de cultura promoveu maior produccedilatildeo de clorofila
impedindo a fotoinibiccedilatildeo realizaccedilatildeo de fotossiacutentese e
aumento do ganho de massa em plantas de Gardecircnia
cultivadas in vitro
Em relaccedilatildeo ao efeito da intensidade luminosa natildeo
houve efeito deste fator sobre essas variaacuteveis ainda que
Economou amp Read (1987) Galzy amp Compan (1992) Vlahos
et al (1992) George (1996) tenham observado que a
intensidade luminosa eacute um fator que estaacute estreitamente
relacionado agrave siacutentese de clorofila No entanto no presente
trabalho sugere-se a menor intensidade 70 mmolm-2s-1 com
o objetivo de que natildeo ocorra um aumento na velocidade
de decomposiccedilatildeo da clorofila com intensidade mais
elevada
Meacutedias seguidas pela mesma letra minuacutescula nas colunas e maiuacutescula nas linhas natildeo diferem significativamente peloteste de Duncan a 5 de probabilidade
Massa fresca (g)
Massa seca (g)
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1) Concentraccedilatildeo
Sacarose (gL-1) 70 140 70 140
0 000 dA 00 dA 000 dA 000 dA 15 067 cB 106 aA 0069 cB 0109 aA 30 082 aA 076 bB 0085 aA 0081 bB 45 075 bA 049 cB 0078 bA 0051 cB
CV 2873 2655
Caracteriacutesticas morfofisioloacutegicas de brotaccedilotildees 85
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TABELA 4 ndash Concentraccedilotildees de clorofila a b e total (mgg massa fresca) em folhas de Agapanthus umbellatus varminor multiplicadas em biorreator de imersatildeo temporaacuteria por um periacuteodo de 60 dias submetidas a 4 concentraccedilotildees desacarose e dois niacuteveis de intensidade luminosa
Clrofila a (mgg massa fresca)
Clrofila b (mgg massa fresca)
Clrofila total (mgg massa fresca)
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1) Concentraccedilatildeo
Sacarose (gL-1) 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia
0 000 000 000 d 000 000 000 d 000 000 000 d 15 211 248 295 c 089 076 083 c 301 325 313 c 30 502 509 505 a 200 211 205 a 703 721 710 a 45 486 420 453 b 195 179 187 b 682 633 658 b
Meacutedia 299 a 294 a 121 a 116 a 421 a 420 a
CV 740 820 850
Meacutedias seguidas pela mesma letra nas linhas e colunas natildeo diferem significativamente pelo teste de Duncan a 5 deprobabilidade
Em relaccedilatildeo aos estocircmatos atraveacutes de
observaccedilatildeo microscoacutepica foi possiacutevel verificar que o
Agapantho possui folhas com caracteriacutest ica
anfiestomaacutetica caracterizada pela presenccedila de
estocircmatos em ambas as faces (face abaxial e adaxial)
Esta caracteriacutestica tem sido considerada como um
mecanismo adaptativo para maximizar a condutacircncia
de CO2 quando luz e aacutegua satildeo fatores limitantes
(KRAMER 1969)
Atraveacutes da anaacutelise estatiacutestica para densidade
estomaacutetica da face adaxial verificou-se que natildeo houve
interaccedilatildeo entre os fatores sacarose e intensidade
luminosa havendo portanto efeito isolado dos fatores A
maior densidade estomaacutetica da face abaxial foi obtida na
concentraccedilatildeo de 45 gL-1 (Tabela 5) Natildeo houve efeito da
intensidade luminosa para essa variaacutevel Por outro lado
a maior densidade estomaacutetica na face adaxial foi obtida
na concentraccedilatildeo de 45 gL-1 de sacarose e 140 mmolm-2s-1
de intensidade luminosa (Tabela 5) verificando a
influecircncia positiva da intensidade luminosa para essa
variaacutevel
As folhas de placircntulas multiplicadas na
concentraccedilatildeo de 15 gL-1 de sacarose apresentaram menor
densidade estomaacutetica em ambas as faces (Tabela 5) com
formato anormal largos e salientes caracteriacutesticas estas
natildeo desejaacuteveis pois segundo Preece amp Sutter (1991)
uma alteraccedilatildeo a niacutevel estrutural eou morfoloacutegico podem
impedir o funcionamento do aparelho estomaacutetico e grande
parte dos estocircmatos assim formados satildeo incapazes de se
fechar
Possivelmente este resultado se deve agraves
caracteriacutesticas de vitrificaccedilatildeo que as folhas do
tratamento 15 gL-1 de sacarose e 70 mmol m-2s-1 de
intensidade luminosa apresentaram (BLANKE amp
BELCHERL 1989) e a falta de energia armazenada no
explante com a falta de carbono que eacute proveniente da
sacarose adicionada ao meio de cultura (DESJARDINS
et al 1995) Estes resultados corroboram os obtidos
por Vintildea et al (2001) que demonstraram que folhas
vitrificadas de abacateiro apresentaram estocircmatos
grandes com saliecircncia ceacutelulas subsidiaacuterias assimeacutetricas
e deformadas e seu ostiacuteolo completamente aberto Tal
anomalia pode ser atribuiacuteda agrave perda da elasticidade das
paredes das ceacutelulas-guarda o que impediria o seu
movimento de abertura e fechamento que
consequumlentemente afeta o desenvolvimento das
placircntulas ao serem transferidas para condiccedilotildees ex vitro
atraveacutes da excessiva perda de aacutegua
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TABELA 5 ndash Densidade estocircmatica (estocircmatosmm2) da face adaxial e abaxial de folhas de Agapanthus umbellatus varminor multiplicadas em biorreator de imersatildeo temporaacuteria suplementado com diferentes concentraccedilotildees de sacarose eintensidade luminosa por um periacuteodo de 60 dias
Densidade estomaacutetica (estocircmatosmm2) Epiderme da face Adaxial Epiderme da face Abaxial
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1)
Concentraccedilatildeo Sacarose(gL1) 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia
0 000 000 000 d 000 000 000 d 15 2587 3026 2802 c 3408 4752 4053 c 30 6524 5628 6064 b 9977 8584 9268 b 45 5412 7016 6188 a 8809 10807 9783 a
Meacutedia 2856 b 3089 a 4256 a 4705 a CV 1474 1206
Meacutedias seguidas pela mesma letra nas linhas e colunas natildeo diferem significativamente pelo teste de Duncan a 5 deprobabilidade
CONCLUSAtildeO
Condiccedilotildees ambientais tais como intensidade
luminosa e concentraccedilatildeo de sacarose adicionada ao meio
de cultura influenciaram no desenvolvimento e
crescimento das placircntulas de Agapanthus umbellatus
var minor quando multiplicadas em meio liacutequido no BIT
Placircntulas de Agapantho foram incapazes de se
desenvolver em meio sem sacarose sendo portanto
necessaacuteria a adiccedilatildeo de uma fonte de carbono visto que a
espeacutecie em estudo apresentou uma taxa de fotossiacutentese
incapaz de assegurar um balanccedilo positivo em carbono
Houve uma grande variaccedilatildeo nas respostas obtidas
no entanto fazendo uma avaliaccedilatildeo em conjunto das
variaacuteveis recomenda-se 30 gL-1 de sacarose e intensidade
luminosa de 70 mmolm-2s-1 No entanto deve-se ressaltar
que estudos mais aprofundados devem ser conduzidos
para verificar o efeito destas combinaccedilotildees sobre o
desempenho de placircntulas durante a fase de aclimatizaccedilatildeo
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SOUZA G de F M V e et al88
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
CAPACIDADE DE REGENERACcedilAtildeO IN VITRO DE TOMATEIROCULTIVAR SANTA CLARA
IN VITRO REGENERATION CAPACITY OF TOMATOPLANT CULTIVAR SANTA CLARA
GLAUCIA DE FATIMA MOREIRA VIEIRA E SOUZA1 JOSEacute MAGNO QUEIROZ LUZ2 ALCIONE SILVA ARRUDA3DENISE GARCIA SANTANA2 MARIANA DE SOUZA E SILVA DA COSTA TEIXEIRA4
LUCIANA LONDE5 ADELAIDE SIQUEIRA SILVA6 ELISAcircNGELA RODRIGUES FIGUEIRA7
1Mestranda em Fitotecnia ndash UFU ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash gfmvsyahoocombr2Professor Dr Instituto de Ciecircncias Agraacuterias ndash UFUICIAG ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash jmagnoumuaramaufubr3Dra em Geneacutetica e Bioquiacutemica Professora contratada da UEG ndash Unidade Universitaacuteria de Ipameri ndash Rodovia GO 330 Km 24 ndash Anel Viaacuterio SN ndash 75780-000 ndash Ipameri GO ndash asarrudahotmailcom4Engenheira Agrocircnoma ndash UFU ndash Conab Sede - SGAS 901 Bloco ldquoArdquo Lote 69 - Asa Sul ndash 70390-010 ndash Brasiacutelia DF ndash marisouza81yahoocombr5Dra em Geneacutetica e Bioquiacutemica ndash IGBUFU ndash Av Paraacute 1720 ndash Campus Umuarama ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash llondebolcombr6Mestranda em AgronomiaFitotecnia ndash UFUICIAG ndash Bolsista FAPEMIG ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash adelaidebioyahoocombr7Mestre em AgronomiaFitotecnia ndash UFUICIAG ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash Elis_figueirayahoocombr
RESUMOA cultivar de tomateiro Santa Clara (Lycopersicon
esculentum Mill) foi avaliada quanto ao seu potencial deregeneraccedilatildeo in vitro a partir de trecircs tipos de explantes e trecircsmeios de cultura seguidos de trecircs repicagens Os explantes foramcotileacutedone decapitado cotileacutedone fendido e cotileacutedone aparadonas extremidades Os meios de cultura foram MI macro emicronutrientes do MS vitaminas B5 de Gamborg et al (1968)suplementado com 30 gL de sacarose e de 8 gL de aacutegar pH 58MII meio MI suplementado com 1 mgL de BAP e 30 gL deglicose MIII meio MI suplementado com 25 mgL de BAP e02 mgL de AIA Para as repicagens foi utilizado o meio MIsuplementado com 05 mgL 08 mgL e 10 mgL de BAP paraa primeira segunda e terceira repicagens respectivamente Noenraizamento foi usado o meio MI suplementado com 05 mgL de AIA e as placircntulas enraizadas foram transferidas parasubstrato comercial Plantimax esterilizado e aclimatadas emlaboratoacuterio A maior induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo tanto de calosquanto de brotos foi observada nos meacutetodos cotileacutedone fendidoe cotileacutedone aparado quando colocados no meio MIII no entantoa induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo foi mais raacutepida quando usado cotileacutedonedecapitado indicando um alto potencial de organogecircneseespontacircnea sendo que o meio MI foi o melhor Os resultadosobtidos com as diferentes concentraccedilotildees de BAP nos trecircs ciclosde repicagem natildeo diferiram entre si e 82 das plantas enraizadasaclimataram-se com sucesso
Termos para indexaccedilatildeo Lycopersicon esculentummelhoramento do tomateiro cultura de tecidos
ABSTRACTThe tomato plant cultivar lsquoSanta Clararsquo (Lycopersicon
esculentum Mill) was evaluated as for its in vitro potential ofregeneration using three types of explants and three culture media
following three pricking-outs The explants were as followsdecapitated cotyledon split cotyledon and rim-trimmedcotyledon The culture media were MI MS macro andmicronutrients vitamins B5 of Gamborg et al (1968)supplemented with 30gL sucrose and 8gL agar pH 58 MIImedium MI supplemented with 1 mgL BAP and 30 gL glucoseMIII medium MI supplemented with 25 mgL BAP and 02mgL IAA For the pricking-outs the media MI wassupplemented with 05 mgL 08 mgL and 10 mgL BAP forthe first second and third pricking out respectively As forrooting the MI medium was supplemented with 05 mgL IAAand the rooted seedlings were transplanted to the sterilizedcommercial substrate Plantimax and then acclimatized inlaboratory Higher callus induction and sprout regeneration wasobserved for the methods of split and rim-trimmed cotyledonplaced into medium MIII Nevertheless the induction forregeneration was much faster when the decapitated cotyledonmethod was used indicating a high potential of spontaneousorganogenesis in which the media MI was the best The resultsobtained with the different concentrations of BAP in the threecycles of pricking-out did not differ among themselves and 82of the rooted plants were acclimatized successfully
Index terms Lycopersicon esculentum tomato breeding tissueculture
INTRODUCcedilAtildeO
O tomate pertence ao gecircnero Lycopersicon e a
espeacutecie cultivada cosmopolita eacute botanicamente
denominada de Lycopersicon esculentum (FILGUEIRA
2000) As cultivares atualmente plantadas podem ser
(Recebido em 03 de outubro de 2003 e aprovado em 04 de setembro de 2006)
Capacidade de regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro 89
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
reunidas em cinco grupos Santa Cruz Salada Cereja
Italiano Agroindustrial No presente trabalho foi utilizada
a cultivar Santa Clara do grupo Santa Cruz pois ela continua
sendo a cultivar mais plantada no Brasil
A tomaticultura estaacute associada a seacuterios problemas
fitossanitaacuterios sobretudo viroses aleacutem do ataque de
fungos bacteacuterias e insetos praga Cria-se com isto a
necessidade de se pesquisar novas alternativas ou
obtenccedilatildeo de novos genoacutetipos com resistecircncia muacuteltipla a
doenccedilas e pragas entre essas os estudos sobre
regeneraccedilatildeo e transformaccedilatildeo geneacutetica (FAacuteRI et al 2000)
A engenharia geneacutetica abriu uma nova perspectiva
para o melhoramento geneacutetico do tomateiro a partir do
final da deacutecada de 80 (WIJBRANDI amp BOTH 1993)
visando aumentar a produtividade e melhorar a qualidade
por meio da obtenccedilatildeo de resistecircncia a estresses bioacuteticos e
abioacuteticos A cultura de tecidos destaca-se durante o
processo de realizaccedilatildeo das teacutecnicas de transformaccedilatildeo
geneacutetica pois eacute necessaacuterio induzir gemas vegetativas e
em seguida regenerar brotos alongados e plantas
completas a partir de ceacutelulas ou tecidos geneticamente
modificados
Para a otimizaccedilatildeo de protocolos para o tomateiro
alguns fatores que afetam a eficiecircncia de transformaccedilatildeo
tecircm sido examinados dentre eles o tamanho do explante e
o tipo de explante hipocoacutetilo ou cotileacutedone (FRARY amp
EARLE 1996)
No Brasil haacute poucos trabalhos na aacuterea de
regeneraccedilatildeo in vitro e de transformaccedilatildeo geneacutetica de
cultivares de tomateiro e pouco se conhece sobre a
capacidade de regeneraccedilatildeo das principais cultivares
brasileiras (FAacuteRI et al 2000) Alguns pesquisadores como
Faria amp Illg (1993) analisaram a regeneraccedilatildeo in vitro de
algumas espeacutecies e cultivares de tomateiro observando
uma baixa capacidade morfogecircnica das cultivares se
comparadas com a espeacutecie selvagem Lycopersicon
pimpinellifolium (L) P Miller
Com este trabalho objetivou-se teve como objetivo
avaliar o potencial de regeneraccedilatildeo in vitro da cultivar Santa
Clara do grupo Santa Cruz a partir de diferentes tipos de
explantes e meios de cultura criando e otimizando
protocolos para sua regeneraccedilatildeo in vitro
MATERIAL E MEacuteTODOS
No Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos Vegetais do
Instituto de Geneacutetica e Bioquiacutemica da Universidade Federal
de Uberlacircndia foi avaliada a capacidade de regeneraccedilatildeo
in vitro do tomateiro cultivar Santa Clara usando trecircs
tipos de explantes e trecircs meios de cultura seguido de trecircs
repicagens O experimento foi realizado em delineamento
em blocos casualizados em esquema fatorial (3x3) com trecircs
repeticcedilotildees As plantas regeneradas foram enraizadas e
aclimatadas em laboratoacuterio
Sementes comerciais da cultivar Santa Clara apoacutes
serem desinfestadas por um minuto em aacutelcool etiacutelico a 96
e em hipoclorito de soacutedio comercial a 20 (vv) com duas
gotas de detergente comercial durante 25 minutos foram
enxaguumladas 5 vezes em aacutegua bidestilada esterilizada e
inoculadas em meio MS 100 (MURASHIGE amp SKOOG
1962) solidificado com 7 g L-1 de aacutegarndashaacutegar por sem
reguladores de crescimento O meio foi distribuiacutedo em
frascos de vidro esteacutereis utilizados para cultura de tecidos
com 30 mL de meio MS As culturas foram mantidas em
sala de crescimento com temperatura de 25+2 ordmC
fotoperiacuteodo de 16 horas e luminosidade de 50 mmol m-2s-
1 As placircntulas obtidas aos 14 15 e 20 dias apoacutes a semeadura
foram usadas como fonte de explantes para os blocos 1 2
e 3 respectivamente Os explantes foram inoculados de
acordo com os meacutetodos descritos a seguir em placas de
Petri devidamente esterilizadas e autoclavadas contendo
30 mL de meio de cultura com 16 unidades por tipo de
explante por meio de cultura utilizado Cada 16 explantes
constituiu uma parcela do experimento sendo composta
por duas placas de Petri cada uma com 8 explantes
Os tipos de explantes foram os seguintes
A - que consistiu na decapitaccedilatildeo de placircntulas onde
essa decapitaccedilatildeo ocorreu diretamente abaixo do noacute do
cotileacutedone ficando o hipocoacutetilo com as radiacuteculas
SOUZA G de F M V e et al90
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
B - meacutetodo de cotileacutedones fendidos os cotileacutedones
foram fendidos ao longo da nervura central da extremidade
ateacute sua metade de acordo com o protocolo de Faacuteri et al
(2000)
C - cotileacutedones foram aparados e seguiu-se o
protocolo descrito por Redenbaugh et al (1992) Os
cotileacutedones aparados nas extremidades distal e proximal
(aacutepice e peciacuteolo) foram inoculados com a face abaxial em
contato com o meio
Foram realizadas trecircs repicagens para alongar os
brotos Cerca de 30 dias apoacutes a inoculaccedilatildeo dos explantes
foi realizada a primeira repicagem Os intervalos entre as
repicagens foram em torno de 5 semanas
Os tratamentos consistiram na inoculaccedilatildeo dos trecircs
tipos de explantes descritos nos trecircs meios de cultura
abaixo com trecircs repeticcedilotildees por tratamento
Meio MI macro e micronutrientes de Murashige amp
Skoog (1962) e vitaminas B5 de Gamborg et al (1968)
suplementado com 30 gL de sacarose e de 8 gL de aacutegar-
aacutegar pH 58 meio MII meio de cultura MI suplementado
com 1 mgL de zeatina e 30 gL de glicose conforme
McCormick (1991) meio MIII meio de cultura MI
suplementado com 25 mgL de BAP e 02 mgL de AIA
segundo Rhim et al (1995)
Para as repicagens foi utilizado o meio MI
suplementado com 05 mgL 08 mgL e 10 mgL de BAP
para a primeira segunda e terceira repicagens
respectivamente
Para enraizamento foi usado o meio MI
suplementado com 05 mgL de AIA As placircntulas
enraizadas foram transferidas para substrato comercial
Plantimax esterilizado e aclimatadas em laboratoacuterio
Os brotos com 2 cm de comprimento foram
transferidos para o meio de enraizamento citado e
permaneciam nesse meio durante 15 dias Apoacutes esse periacuteodo
os brotos eram transplantados para substrato comercial
Plantimax autoclavado irrigados com aacutegua uma a duas
vezes por dia ateacute a aclimataccedilatildeo A aclimataccedilatildeo ocorreu em
torno de 20 dias em condiccedilotildees de laboratoacuterio
Avaliou-se a induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo o
alongamento de brotos e o enraizamento e aclimataccedilatildeo
das plantas regeneradas
Os dados de contagem foram transformados para
50x As anaacutelises de normalidade e homogeneidade
foram realizadas pelo software Prophet Os dados obtidos
foram submetidos agrave anaacutelise de variacircncia e as meacutedias
comparadas pelo teste de Tukey ao niacutevel de 5 de
probabilidade pelo software SANEST (ZONTA amp
MACHADO 1989)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Para cotileacutedone decapitado ocorreu um iniacutecio de
formaccedilatildeo de calosidade por volta de 10 dias apoacutes inoculaccedilatildeo
e o surgimento de brotos ocorreu cerca de 12 dias depois da
inoculaccedilatildeo sem a formaccedilatildeo de calos propriamente ditos A
induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo foi mais raacutepida quando usado esse
tipo de explante indicando um alto potencial de
organogecircnese espontacircnea sendo que o meio MI foi o melhor
para a induccedilatildeo e nuacutemero total de brotos (Tabela 1)
No cotileacutedone fendido o iniacutecio de formaccedilatildeo de
calosidade aconteceu com aproximadamente 10 dias apoacutes
inoculaccedilatildeo Por volta de 18 dias depois da inoculaccedilatildeo
iniciou-se o surgimento de brotos e jaacute existiam calos
formados Para esse tipo de explante nos meios MI e MII
ocorreu apenas a formaccedilatildeo de calos enquanto no meio
MIII ocorreu a formaccedilatildeo de calos e calos com brotos sendo
alto o nuacutemero total de brotos (Tabela 1) Supotildee-se que a
maior superfiacutecie de corte tenha influecircncia significativa
sobre esse fenocircmeno onde a maior superfiacutecie de corte do
cotileacutedone resulta em maior capacidade de regeneraccedilatildeo
(FAacuteRI et al 1995b)
No cotileacutedone aparado com cerca de 10 dias apoacutes
inoculaccedilatildeo ocorreu o iniacutecio de formaccedilatildeo de calos e 20 dias
depois da inoculaccedilatildeo ocorreu o surgimento de brotos e jaacute
existiam calos formados Para esse tipo de explante nos
meios MI MII e MIII ocorreu a formaccedilatildeo de calos no
entanto apenas no meio MIII ocorreu a formaccedilatildeo de calos
com brotos (Tabela 1)
Capacidade de regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro 91
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
TABELA 1 ndash Frequumlecircncia de induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo in vitro da cultivar Santa Clara do grupo Santa Cruz UberlacircndiaUFU 2001
Dados seguidos de mesma letra nas colunas (abc) e nas linhas (AB) natildeo diferem entre si a 5 de probabilidade peloteste de TukeyA diferenccedila entre o nordm de explantes de um meacutetodo para outro eacute devida a parcelas (ou parte delas) perdidas
Nos trecircs ciclos de repicagens a capacidade de
alongamento dos brotos foi igual indicando que as
concentraccedilotildees de BAP natildeo diferiram estatisticamente entre
si dentro de cada tipo de explante Em relaccedilatildeo ao nuacutemero
de brotos alongados na primeira e terceira repicagens o
cotileacutedone decapitado apresentou maior nuacutemero jaacute na
segunda repicagem natildeo houve diferenccedila entre os tipos de
explantes (Tabela 2)
As plantas apoacutes serem enraizadas foram
transferidas para aclimataccedilatildeo obtendo-se 82 de plantas
aclimatadas Cerca de 20 dias apoacutes transplantio para o
substrato as plantas jaacute estavam aclimatadas
Apoacutes a terceira repicagem ainda existiam cerca de
334 brotos para serem novamente repicados e 51 brotos
prontos para serem enraizados perfazendo um total geral
de 549 brotos obtidos ateacute a fase estudada
Para o tipo de explante cotileacutedone decapitado foram
obtidos 181 brotos equivalentes a 174 brotos por explante
Para o explante cotileacutedone fendido o nuacutemero de brotos por
Tipos de Explantes Variaacuteveis Meios Cotileacutedone decapitado Cotileacutedone fendido Cotileacutedone aparado
I 396 aA 050 cB 142 bB II 000 bB 632 bA 672 aA Nordm de explantes
com calos III 000 bB 1599 aA 597 bB I 1095 aA 000 bB 000bB II 050 bA 000 bA 000 bA Nordm de explantes
com brotos III 130 bB 1217 aA 850 aA I 396 aA 050 cB 169 cB II 000 bB 632 bA 645 bA Nordm total de
calos III 000 bB 3630 aA 2655 aA I 1850 aA 000 bB 000 bB II 050 bA 000 bA 000 bA Nordm total de
brotos III 130 bB 2760 aA 2934 aA I 48 32 40 II 32 40 32 Nordm de
explantes III 24 40 48 Total de explantes 104 112 120
explante foi igual a 145 e para o cotileacutedone aparado foram
obtidos 170 brotos por explante Esses resultados foram
semelhantes aos obtidos por Faacuteri et al (2000) para as
cultivares IPA-5 e IPA-6 os quais concluiacuteram que a
utilizaccedilatildeo de cotileacutedones fendidos e cotileacutedones aparados
produziram uma regeneraccedilatildeo alta e onde a maior induccedilatildeo
foi conseguida utilizando-se um meio igual ao MIII utilizado
nesse experimento A induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo tambeacutem foi
mais raacutepida quando usado cotileacutedone decapitado indicando
um alto potencial de organogecircnese espontacircnea A cultivar
Santa Clara mostrou-se mais eficiente na formaccedilatildeo de
brotos alongados observados na primeira repicagem
enquanto as cultivares utilizadas por Faacuteri et al (2000) IPA-
5 e IPA-6 necessitaram de duas repicagens para o
alongamento dos brotos no entanto a cultivar IPA-5
mostrou-se mais eficiente na produccedilatildeo de brotos por
explante Faacuteri et al (2000) utilizaram zeatina durante os trecircs
ciclos de repicagem enquanto nesse experimento foi
utilizado BAP
SOUZA G de F M V e et al92
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
TABELA 2 ndash Capacidade de alongamento e enraizamento de brotos da cultivar Santa Clara durante os trecircs ciclos derepicagem Uberlacircndia UFU 2001
Dados seguidos de mesma letra nas colunas (ab) e nas linhas (AB) natildeo diferem entre si a 5 de probabilidade peloteste de TukeyTipos de explantes A - cotileacutedone decapitado B - cotileacutedone fendido C - cotileacutedone aparado
Os resultados aqui obtidos tambeacutem foram
semelhantes aos de Faacuteri et al (1995b) que trabalhando
com transformaccedilatildeo geneacutetica da berinjela (Solanum
melongena L) observaram que a maior superfiacutecie de corte
do cotileacutedone resultou em maior capacidade de
regeneraccedilatildeo Tambeacutem foram obtidos resultados
semelhantes aos de Nogueira et al (2001) que estudando
a regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro Santa Clara utilizando
como explantes cotileacutedones concluiacuteram que o meio com
uma combinaccedilatildeo adequada de auxina e citocinina (10 mg L-
1 de zeatina e 01 mg L-1 de AIA) promoveu uma maior
meacutedia de regeneraccedilatildeo e um maior nuacutemero meacutedio de brotaccedilotildees
por explante Costa et al (2000) trabalhando com as
cultivares IPA-5 e IPA-6 chegaram a uma conclusatildeo
semelhante onde meio suplementado com 10 mg L-1 de
zeatina + 01 mg L-1 de AIA e meio suplementado com 25
mg L-1 de BAP + 02 mg L-1 de AIA determinaram a maior
frequumlecircncia de regeneraccedilatildeo de explantes cotiledonares e
tambeacutem um maior nuacutemero de brotos alongados por explante
McCormick et al (1986) pesquisando a morfogecircnese
in vitro de L esculentum observaram que a presenccedila de 25
mg L-1 de BAP e 10 mg L-1 de AIA ou 10 mg L-1 de BAP e
02 mg L-1 de AIA produziu um maior nuacutemero de ramos por
explante a partir de explantes de cotileacutedones e hipocoacutetilos
Ohki et al (1978) utilizando segmentos de hipocoacutetilos de L
esculentum sugeriram que o efeito positivo da combinaccedilatildeo
de auxinas e citocininas na regeneraccedilatildeo in vitro pode ser
causado por uma maior capacidade das ceacutelulas dessa espeacutecie
em utilizar e adaptar-se agrave combinaccedilatildeo de auxinas e citocininas
de que somente citocininas Para os mesmos autores a
variabilidade observada nas respostas morfogecircnicas in vitro
para diferentes citocininas pode ser causada pela variaccedilatildeo
na razatildeo de degradaccedilatildeo dessas substacircncias nos tecidos
vegetais ou no meio de cultivo Segundo Caldas et al (1999)
uma alta relaccedilatildeo citocininaauxina normalmente leva a maior
induccedilatildeo de parte aeacuterea (brotos) em explantes in vitro
principalmente quando a citocinina usada eacute o BAP que induz
a formaccedilatildeo de grande nuacutemero de brotos e alta taxa de
multiplicaccedilatildeo em muitos sistemas de micropropagaccedilatildeo
Tanto no presente trabalho quanto nos trabalhos acima
citados foram utilizados meios com pelo menos uma
combinaccedilatildeo com alta relaccedilatildeo citocininaauxina e meios
contendo apenas citocinina
CONCLUSOtildeES
A maior induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo tanto de calos
quanto de brotos foi observada nos meacutetodos cotileacutedone
fendido e cotileacutedone aparado quando colocados no meio
com BAP (25 mgL) e AIA (02 mgL) (MIII) Um ciclo de
repicagem foi suficiente para obtenccedilatildeo de brotos
alongados A maior regeneraccedilatildeo de brotos alongados
ocorreu com o meacutetodo cotileacutedone decapitado
Meios M1 + 05 mgL BAP M1 + 08 mgL BAP M1 + 10 mgL BAP
Repicagem 1 Repicagem 2 Repicagem 3
M1+ 05 mgl AIA
Tipos de Explante
s
Nordm total de brotos
Nordm de brotos
alongados
Nordm total de brotos
Nordm de brotos
alongados
Nordm total de brotos
Nordm de brotos
alongados
Nordm total de placircntulas
enraizadas
Nordm total de
plantas aclimatadas
Nordm total geral de brotos
A 3117 bA 899 aA 3684 bA
866 aA 3174 bA
81 aA 80 67 181 B 536 aA 466 bA 6244 aA 633 aA 5158 aA 450 bA 41 33 163 C 3527 bA 400 bA 4368 bA
566 aA 3928 bA
312 bA 43 35 205
Total 164 135 549
Capacidade de regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro 93
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
AGRADECIMENTOS
Ao Instituto de Geneacutetica e Bioquiacutemica e ao Instituto
de Ciecircncias Agraacuterias da Universidade Federal de
Uberlacircndia pelo financiamento deste projeto e a todos
que auxiliaram direta eou indiretamente
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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SILVA A S et al94
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
INDUCcedilAtildeO DE CALOS A PARTIR DE CULTURA DE ANTERAS DECAFEEIRO (Coffea arabica L) CV CATUAIacute VERMELHO 99 E 44
CALLUS INDUCTION FROM ANTHER CULTURE OF COFFEE PLANT (Coffea arabica L) CV CATUAIacute VERMELHO 99 AND 44
ADELAIDE SIQUEIRA SILVA1 JOSEacute MAGNO QUEIROZ LUZ2 DENISE GARCIA SANTANA2 PATRIacuteCIA CRYSTIE VIEIRA MUSTAFA3 MOACIR PASQUAL4 GLAUCIA DE FATIMA MOREIRA VIEIRA E SOUZA2
1Mestranda do Curso de Agronomia ndash Universidade Federal de UberlacircndiaUFU ndash Av Engenheiro Diniz 1178 ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash adelaidebioyahoocombr2Professor Dr ndash Universidade Federal de UberlacircndiaUFU ndash Instituto de Ciecircncias Agraacuterias ndash Curso de Agronomia ndash AV Paraacute Bloco 2E SALA 14campus Umuarana ndash Caixa-Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG3Bioacuteloga Universidade Federal de UberlacircndiaUFU ndash Centro de Ciecircncias Biomeacutedicas ndash Departamento de Agronomia ndash Rua Amazonas snordm - Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos sala 2E-14 ndash Umuarama ndash 38400920 ndash Uberlandia MG ndash patriciacrystiezipmailcombr
4Doutor Departamento de Adgricultura DAG ndash Universidade Federal de Lavras UFLA ndash Campus universitaacuterio ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash mpasqualuflabr
RESUMONo Brasil o cafeacute ainda apresenta poucos progressos com
relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo da cultura de tecidos vegetais tornando-se degrande importacircncia o conhecimento sobre a atuaccedilatildeo dosreguladores de crescimento Com este trabalho avaliou-se ocomportamento de duas cultivares de Coffea arabica L CatuaiacuteVermelho LCH-2077-2-5-99 e LCH-2077-2-5-44 denominadasrespectivamente de Catuaiacute Vermelho 99 e Catuaiacute Vermelho 44quanto agrave ausecircncia e presenccedila de luz e quantificou-se a interaccedilatildeoentre os reguladores de crescimento 24-D e BAP O experimentofoi realizado no Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos Vegetais daUniversidade Federal de Uberlacircndia As anteras das cultivaresCatuaiacute Vermelho 99 e 44 foram inoculadas em meio basal MSsuplementado com quatro concentraccedilotildees de 24-D (905 181271 e 362 mM) e duas concentraccedilotildees de BAP (0 e 89 mM) napresenccedila de luz e ausecircncia de luz As avaliaccedilotildees para a oxidaccedilatildeointumescimento e calosidade foram realizadas aos 30 dias apoacutes ainoculaccedilatildeo no meio de cultura e o diacircmetro dos calos aos 45 diasApoacutes 30 dias de cultivo os calos obtidos foram classificados emfriaacuteveis esverdeados esbranquiccedilados e cinza Os resultadosmostraram que para ocorrer intumescimento das anterasformaccedilatildeo e aumento do tamanho dos calos de ambas cultivares eacutenecessaacuterio que haja interaccedilatildeo entre a auxina (24-D) e a citocinina(BAP) Dentre os tipos de calos os de coloraccedilatildeo cinza foram osque apresentaram maior frequumlecircncia para as duas cultivares
Termos para indexaccedilatildeo Melhoramento calos reguladores decrescimento cafeeiro
ABSTRACTIn Brazil coffee still presents little progress regarding
the application of plant tissue culture which turns important theunderstanding of the action of growth regulators This workevaluated the in vitro performance of two Coffea arabica Lcultivars Catuaiacute Vermelho LCH-2077-2-5-99 and LCH-2077-2-5-44 known as Catuaiacute Vermelho 99 and Catuaiacute Vermelho 44respectively in the presence and absence of light and theinteraction of 24-D and BAP The experiment was carried out at
the Plant Tissue Culture Laboratory of the Universidade Federalde Uberlacircndia Anthers from both cultivars were inoculated inMS basal medium supplemented with four concentrations of24-D (905 181 271 and 362 mM) and two concentrations ofBAP (0 or 89 mM) in the presence and absence of lightOxidation intumescences and callus formation evaluations wereobtained 30 days after inoculation and callus diameter measuredat 45 days of inoculation The observed callus was classified asfriable greenish whitish or gray The results showed that antherintumescences callus formation and growth of both cultivarsdemand the interaction between the auxin (24-D) and thecytokinin (BAP) Callus presenting gray color were the mostfrequent for both cultivars
Index terms Plant breeding callus growth regulators coffee plant
INTRODUCcedilAtildeO
O cafeeiro pertence agrave famiacutelia Rubiaceae na qual o
gecircnero Coffea abrange cerca de 60 espeacutecies sendo as mais
comuns no mercado Coffea araacutebica L e Coffea canephora
Pierre ex Froehn Os programas de melhoramento do cafeacute
demandam aproximadamente 25 anos desde a hibridaccedilatildeo
ateacute a obtenccedilatildeo de uma nova cultivar (PASQUAL et al
2002) A cultura de anteras eacute considerada uma ferramenta
importante pois possibilita a obtenccedilatildeo de linhas
homozigoacuteticas em uma uacutenica etapa (ANDRADE 1998)
acelerando drasticamente o processo de obtenccedilatildeo de novas
cultivares Sendo assim a teacutecnica de cultura de anteras
vem auxiliar no melhoramento da cultura pois permite a
obtenccedilatildeo de haploacuteides em geraccedilotildees segregantes o que
leva agrave raacutepida produccedilatildeo de plantas homozigotas por meio
(Recebido em 14 de outubro de 2003 e aprovado em 29 de outubro de 2006)
Induccedilatildeo de calos a partir de cultura 95
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
da duplicaccedilatildeo do nuacutemero de cromossomos numa uacutenica
etapa substituindo as geraccedilotildees de auto fecundaccedilatildeo
Acrescenta-se a isso o fato de os haploacuteides serem livres
dos problemas de dominacircncia e recessividade por possuir
apenas um alelo em cada loco gecircnico
No Brasil Coffea arabica ainda apresenta poucos
progressos com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo da cultura de anteras
Daiacute a importacircncia de se produzir mais conhecimentos sobre
a atuaccedilatildeo dos reguladores de crescimento na expressatildeo
androgeneacutetica de Coffea arabica identificaccedilatildeo de
genoacutetipos androgecircnicos bem como a determinaccedilatildeo de
condiccedilotildees fiacutesicas mais adequadas agrave incubaccedilatildeo de anteras
nessa espeacutecie
Nos programas de melhoramento as teacutecnicas
convencionais tecircm apresentado resultados promissores
na cultura do cafeacute no que se refere ao aumento de
produtividade e obtenccedilatildeo de novas cultivares Um fator
importante para o sucesso da cultura de anteras eacute conhecer
o estaacutedio ideal de desenvolvimento dos microacutesporos com
o intuito de se obter uma melhor resposta androgeneacutetica
utilizando microacutesporos receacutem-liberados da teacutetrade meioacutetica
ateacute no maacuteximo o estaacutedio binucleado A fase uninucleada
responde positivamente ao processo embriogecircnico porque
nesta fase os microacutesporos apresentam uma parede celular
delgada o que a torna mais receptiva aos fatores externos
Em estaacutedios mais avanccedilados da microsporogecircnese ocorre
um engrossamento da parede celular sendo esta uma
caracteriacutestica do gratildeo de poacutelen maduro do cafeacute
prejudicando o processo de regeneraccedilatildeo (ASCANIO amp
ARCIA 1994) Os autores Grando amp Moraes Fernandes
(1993) sugerem que o potencial embriogecircnico do gratildeo de
poacutelen pode ser determinado tanto no periacuteodo da meiose
quanto no periacuteodo da preacute-mitose do microacutesporo pois
nestes dois momentos o microacutesporo ainda teria
metabolicamente caracteriacutesticas esporofiacuteticas o que
permite a diferenciaccedilatildeo do gratildeo de poacutelen em embriatildeo e
posterior formaccedilatildeo de uma planta
Segundo Mantell et al (1994) satildeo possiacuteveis vaacuterios
tipos de desenvolvimento do microacutesporo in vitro sendo
que tanto o nuacutecleo generativo quanto o vegetativo pode
se dividir continuamente originando um embrioacuteide
haploacuteide ou ainda a primeira mitose produziria dois nuacutecleos
semelhantes e estes se dividiriam repetidamente resultando
na formaccedilatildeo de embrioacuteides haploacuteides
A composiccedilatildeo do meio de cultura tambeacutem eacute de
grande importacircncia para o sucesso da cultura de anteras
natildeo existindo contudo uma recomendaccedilatildeo generalizada
Na maioria das espeacutecies a androgecircnese se verifica em meios
que conteacutem sais minerais sacarose vitaminas reguladores
de crescimento e aacutegar (MORAES FERNANDES 1990) A
consistecircncia do meio normalmente eacute semi-soacutelida mas os
meios liacutequidos estatildeo sendo cada vez mais usados pois
tecircm vantagens no aumento do rendimento pela maior
obtenccedilatildeo de embriotildees e calos (PIERIK 1987) O
presente trabalho teve como objetivo aplicar a teacutecnica da
cultura de anteras em diferentes cultivares de Coffea
arabica verificando os vaacuterios fatores que influenciam a
induccedilatildeo de calos
MATERIAL E MEacuteTODOS
Experimentos de Induccedilatildeo e Regeneraccedilatildeo de Calos
Esta etapa constituiu-se de dois experimentos cada
um com uma cultivar tendo sido conduzidos no laboratoacuterio
de Cultura de Tecidos Vegetais da Universidade Federal
de Uberlacircndia em Uberlacircndia - Minas Gerais no periacuteodo
de setembro de 2002 a janeiro de 2003
Foram utilizados bototildees florais de duas cultivares
de Coffea araacutebica Catuaiacute Vermelho LCH-2077-2-5-99 e
LCH-2077-2-5-44 denominadas respectivamente de Catuaiacute
Vermelho 99 e Catuaiacute Vermelho 44 plantadas na aacuterea
experimental do Campus Umuarama dessa Universidade
Os bototildees florais foram coletados no periacuteodo de 8 agraves 9
horas da manhatilde e armazenados em placas de Petri contendo
papel de filtro umedecido em aacutegua destilada e colocados
dentro de uma caixa de isopor para evitar a desidrataccedilatildeo
ateacute serem conduzidos ao laboratoacuterio
No laboratoacuterio o comprimento dos bototildees foi
medido com o auxiacutelio de um paquiacutemetro e utilizaram-se
SILVA A S et al96
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
bototildees florais entre 45 a 60 mm de comprimento em todos
os experimentos Os bototildees foram envoltos em gaze
previamente autoclavada e desinfestados em uma soluccedilatildeo
de aacutelcool 70 por alguns segundos e por 10 minutos em
soluccedilatildeo de hipoclorito de soacutedio a 02 sob agitaccedilatildeo Em
seguida na cacircmara de fluxo laminar foram lavados 3 vezes
em aacutegua destilada e autoclavada Apoacutes este processo as
anteras foram retiradas dos bototildees com o auxiacutelio de uma
lupa uma pinccedila fina e bisturi nordm 10 sendo os uacuteltimos
flambados para cada botatildeo tomando-se o cuidado para
natildeo ferir as anteras Logo apoacutes as anteras foram imersas
por 1 segundo em soluccedilatildeo de aacutecido ascoacuterbico na
concentraccedilatildeo de 600 mgL-1 hipoclorito de soacutedio 02 e
aacutegua destilada e autoclavada respectivamente
Apoacutes este processo as anteras foram inoculadas
em tubo de ensaio contendo 20 mL do meio MS
(MURASHIGE amp SKOOG 1962) suplementado com aacutecido
24-diclorofenoxiaceacutetico (24-D) e 6- benzilaminopurina
(BAP) em diferentes concentraccedilotildees com pH ajustado para
58 Este meio foi esterilizado em autoclave vertical agrave
temperatura de 121deg C sob pressatildeo de 1 atm por 20 minutos
O delineamento experimental utilizado foi o de
blocos casualizados com 10 repeticcedilotildees em esquema fatorial
4 x 2 x 2 sendo que os fatores foram compostos de quatro
concentraccedilotildees de 24-D (905 181 271 362 mM) duas
concentraccedilotildees de BAP (0 e 89 mM) perfazendo oito
tratamentos incubados na ausecircncia ou presenccedila de luz
em sala de crescimento com temperatura de 25 plusmn 2degC e 16
horas de fotoperiacuteodo Nos dois experimentos cada
tratamento teve 10 repeticcedilotildees sendo um tubo com 10
anteras considerado uma repeticcedilatildeo
Aos 30 dias apoacutes a inoculaccedilatildeo das anteras foram
avaliadas as porcentagens de oxidaccedilatildeo de intumescimento
e de formaccedilatildeo de calos (calosidade) e aos 45 dias foi medido
o diacircmetro dos calos
Os calos obtidos das duas cultivares apoacutes 45 dias
de inoculaccedilatildeo das anteras foram transferidos para o meio
MS suplementado com 30 gL-1 de sacarose 6gL-1 de agar e
de 24-DBAP nas seguintes concentraccedilotildees de 1810 181
2 2710 e 3620 mM com pH ajustado para 58 associando
a ausecircncia e presenccedila de luz
Apoacutes a permanecircncia destes calos no meio de cultura
por 30 dias aqueles provenientes da cultivar Catuaiacute
Vermelho 99 incubados na presenccedila de luz foram
transferidos para o meio de cultura contendo 271 mM de
24-D enquanto que aqueles incubados na ausecircncia de
luz foram transferidos para meio contendo 362 mM de 24-
D Jaacute os calos da cultivar Catuaiacute Vermelho 44 incubados
na presenccedila de luz foram transferidos para meio contendo
181 mM de 24-D e 89 mM de BAP e os incubados na
ausecircncia de luz transferidos para o meio contendo 181
mM de 24-D
Apoacutes 30 dias neste tratamento foram avaliadas as
caracteriacutesticas referentes ao tipo de calo (friaacuteveis
esverdeados esbranquiccedilados e cinza)
Os dados obtidos foram testados quanto agrave
normalidade e agrave homogeneidade necessitando de
transformaccedilatildeo em arco seno para os dados em
porcentagem e raiz quadrada de (x + 05) para os dados
referentes ao diacircmetro dos calos
RESULTADOS
Interaccedilatildeo entre os Reguladores de Crescimento e oFotoperiacuteodo
Para a cultivar Catuaiacute 99 em todas as concentraccedilotildees
de 24-D e independentemente da concentraccedilatildeo de BAP a
oxidaccedilatildeo foi menor na ausecircncia de luz diferindo
estatisticamente da fase em que se tinha presenccedila de luz
No entanto nos calos cultivados nas concentraccedilotildees de
905 e 271 mM de 24-D e 89 mM de BAP na ausecircncia de
luz foi observado um aumento significativo na oxidaccedilatildeo
das anteras o mesmo acontecendo na concentraccedilatildeo de
271 mM de 24-D na presenccedila de luz No entanto resultado
inverso foi observado para a concentraccedilatildeo de 362 mM de
24-D (Tabela 1)
Os resultados do percentual de intumescimento
variaram bastante em funccedilatildeo da luminosidade e
reguladores de crescimento (Tabela 1) Na presenccedila do
Induccedilatildeo de calos a partir de cultura 97
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
BAP e concentraccedilatildeo 89 mM de 24-D tanto na presenccedila
ou ausecircncia de luz o intumescimento dos calos natildeo diferiu
significativamente Jaacute na concentraccedilatildeo de 181 mM de 24-
D na presenccedila de luz se mostrou melhor promovendo um
aumento significativo do intumescimento das anteras
Quanto agraves concentraccedilotildees de 271 e 362 mM de 24-D
cultivados na presenccedila de luz se mostrou melhor ao
intumescimento quando comparado agravequeles cultivados na
ausecircncia de luz (Figura 1)
A presenccedila de calos aumentou significativamente
com a incubaccedilatildeo das anteras na ausecircncia de luz e na
TABELA 1 ndash Meacutedias do nuacutemero de anteras oxidadas intumescidas e com calos e diacircmetro dos calos (mm) em funccedilatildeode diferentes concentraccedilotildees de 24-D e ausecircncia ou presenccedila de BAP em duas condiccedilotildees de luminosidade (presenccedilaou ausecircncia de luz) para anteras do genoacutetipo cv 99
Luminosidade1
Oxidaccedilatildeo () Intumescimento ()
Calosidade () Diacircmetro (mm) 24-D M
BAP M luz Escuro Luz Escuro luz Escuro luz Escuro 0 980 b A 395 a A 000b B 434 a A 000 b A 740 a A 000 b A 309 a A 905
89 999 b A 823 a B 398 a A 327 a B 007 b A 615 a A 000 b A 300 a A 0 999 b A 524 a A 000 b B 447 a A 007 b A 750 a A 000 b B 368 a A
181 89 935 b A 511 a A 614 a A 407 b A 030 b A 720 a A 300 b A 387 a A
0 745 b A 000 a A 534 a A 000 b B 530 a A 000 b B 318 a B 000 b B 271
89 914 b B 590 a B 625 a A 634 a A 708 a A 809 a A 377 a A 298 b A 0 999 b B 440 a A 607 a A 492 b A 097 b B 815 a A 300 a B 277 a A
362 89 813 b A 426 a A 493 a B 527 a A 378 b A 758 a A 398 a A 298 b A
1Meacutedias seguidas por letras diferentes minuacutesculas na linha e maiuacutesculas na coluna dentro de cada concentraccedilatildeo de 2-4-D diferem entre si pelo teste de Tuckey a significacircncia de 5
concentraccedilatildeo de 271 mM de 24-D nas demais
concentraccedilotildees de 24-D independente da concentraccedilatildeo
do BAP a incubaccedilatildeo na ausecircncia de luz apresentou
meacutedias de calosidade significativamente maiores (Figura
2) A presenccedila do BAP promoveu aumento significativo
na calosidade das anteras na concentraccedilatildeo 271 mM de
24-D na ausecircncia de luz e na concentraccedilatildeo de 362 mM
de 24-D na presenccedila de luz Nas demais concentraccedilotildees
natildeo houve diferenccedila significativa entre presenccedila ou
ausecircncia de BAP tanto na ausecircncia ou presenccedila de luz
(Tabela 1)
FIGURA 1 ndash Anteras da cv Catuaiacute Vermelho 99 naconcentraccedilatildeo de 181 M de 24-D na presenccedila de luz
FIGURA 2 ndash Calos de anteras incubadas na ausecircncia deluz e na concentraccedilatildeo de 271 M de 24-D
SILVA A S et al98
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
Quanto ao diacircmetro nas concentraccedilotildees 905 e 181 M
de 24-D a ausecircncia de luz promoveu aumento significativo
no diacircmetro dos calos diferindo-se estatisticamente do
tratamento na presenccedila de luz Somente para a concentraccedilatildeo
de 271 mM de 24-D na ausecircncia do BAP natildeo houve diferenccedila
significativa para a caracteriacutestica independentemente do
fotoperiacuteodo Nas demais concentraccedilotildees de 24-D o tratamento
na presenccedila de luz promoveu um aumento significativo no
diacircmetro dos calos No tratamento em que houve a associaccedilatildeo
da presenccedila de luz e de BAP natildeo diferiu estatisticamente do
tratamento em que houve a ausecircncia de BAP quando a
concentraccedilatildeo de 24-D foi de 905 mM nos demais
proporcionou aumento significativo no diacircmetro dos calos
Para o tratamento na ausecircncia de luz apenas na concentraccedilatildeo
de 271 mM de 24-D a ausecircncia de BAP promoveu diminuiccedilatildeo
significativa no diacircmetro de calos Nas demais concentraccedilotildees
natildeo houve diferenccedila significativa entre presenccedila ou ausecircncia
de BAP (Tabela 1)
Para as variaacuteveis intumescimento e calosidade da
cultivar cv 44 a interaccedilatildeo entre 24-D e BAP natildeo diferiram
estatisticamente quanto presenccedila e ausecircncia de luz nas
concentraccedilotildees 905 e 362 mM de 24-D e que tambeacutem natildeo
difere para o diacircmetro na concentraccedilatildeo de 181 mM de 24-
D Jaacute na concentraccedilatildeo 271 mM de 24-D haacute uma semelhanccedila
quanto ao intumescimento calosidade e diacircmetro que
diferem das demais concentraccedilotildees natildeo apresentando
portanto uma boa interaccedilatildeo
A melhor interaccedilatildeo para intumescimento calosidade
e diacircmetro encontra-se respectivamente na concentraccedilatildeo
905 mM de 24-D na presenccedila de luz na concentraccedilatildeo 181
mM de 24-D na ausecircncia de luz e na concentraccedilatildeo 905
mM de 24-D na ausecircncia de luz Jaacute as piores interaccedilotildees
estatildeo na concentraccedilatildeo 271 mM de 24-D na luz tanto para
o intumescimento quanto para o diacircmetro analisados na
Tabela 2
De acordo com a Tabela 2 observou-se que os
melhores resultados ou seja as interaccedilotildees independem
da presenccedila ou ausecircncia de BAP Na Tabela 3 notou-se
uma maior oxidaccedilatildeo das anteras quando incubadas no claro
estas apresentaram uma maior oxidaccedilatildeo em relaccedilatildeo as que
foram incubadas no escuro tornando-se mais tarde calos
previamente oxidados
TABELA 2 ndash Meacutedias do nuacutemero de anteras intumescidas e com calos diacircmetro dos calos (mm) em funccedilatildeo de diferentesconcentraccedilotildees de 24-D e ausecircncia ou presenccedila de BAP em duas condiccedilotildees de luminosidade (luz e escuro) para anterasdo genoacutetipo cv 44
Luminosidade1
Intumescimento () Calosidade () Diacircmetro (mm) 24-D ( M)
BAP ( M) Luz Escuro Luz Escuro Luz Escuro
0 907 a A 775 a A 779 bA 948 aA 609 bA 800 aA 905 89 843 a A 875 a A 889 aA 946 aA 607 aA 420 bB 0 887 a A 852 a A 939 aA 990 aA 490 aA 466 aA
181 89 906 a A 786 a A 917 aA 959 aA 420 aA 493 aA 0 600 b A 772 a A 694 bA 895 aA 000 bA 373 aA
271 89 022 b B 827 a A 294 bB 837 aA 000 bA 376 aA 0 828 a A 737 a A 928 aA 939 aA 414 bA 595 aA
362 89 866 a A 725 a A 949 aA 866 aA 329 aA 376 aA
1Meacutedias seguidas por letras diferente minuacutesculas na linha e maiuacutesculas na coluna dentro de cada concentraccedilatildeo de 2-4-D diferem entre si pelo teste de Tukey a significacircncia de 5
Induccedilatildeo de calos a partir de cultura 99
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
TABELA 3 ndash Meacutedias de oxidaccedilatildeo das anteras entre asdiferentes concentraccedilotildees de 24-D em duas condiccedilotildeesde luminosidade (luz e escuro) para anteras da cultivarCatuaiacute Vermelho 44
Concentraccedilotildees
24-D ( M ) OXIDACcedilAtildeO ()
Claro Escuro 905 749 a 269 b 181 420 a 270 b 271 999 a 221 b 362 308 a 334 a
1Meacutedias seguidas por letras diferentes minuacutesculas na linhadentro de cada concentraccedilatildeo de 2-4-D diferem entre sipelo teste de Tukey a significacircncia de 5
TABELA 4 ndash Tipos de calos obtidos apoacutes 30 dias em meioMS com 362 M de 24-D na ausecircncia de luz da cultivarCatuaiacute Vermelho 99
Tipos de Calos
Nuacutemero de Calos
Nuacutemero de Calos com diacircmetro acima
de 05 mm Friaacuteveis 03 Esverdeados 13 06 Esbranquiaccedilados
03 Cinza 26
Dados de contagem natildeo transformados O recultivo emmeio MS com 362 M de 24-D na presenccedila de luz teve100 de contaminaccedilatildeo apoacutes sua inoculaccedilatildeo
TABELA 5 ndashTipos de calos obtidos apoacutes 30 dias em meioMS com 181 M de 24D e 89 M de BAP na presenccedilade luz da cultivar Catuaiacute Vermelho 44
TABELA 6 ndash Tipos de calos obtidos apoacutes 30 dias em meioMS com 181 M de 24D na ausecircncia de luz da cultivarCatuaiacute Vermelho 44
Tipos de Calos Nuacutemero de Calos
Nuacutemero de Calos com diacircmetro
acima de 05 mm Friaacuteveis 58 Esverdeados 23 214 Esbranquiaccedilados 94 Cinza 203
Tipos de Calos
Nuacutemero de Calos
Nuacutemero de Calos com diacircmetro
acima de 05 mm Friaacuteveis 25 Esverdeados 11 69 Esbranquiaccedilados 19 Cinza 350
Dados de contagem natildeo transformados Dados de contagem natildeo transformados
Nesta etapa a maioria dos calos encontrados para
as trecircs cultivares apresentaram coloraccedilatildeo cinza (Tabelas 4
5 e 6) A perda gradativa da coloraccedilatildeo natural dos calos
passando de verdes para a cor marrom a diminuiccedilatildeo do
ritmo de crescimento dos mesmos a estagnaccedilatildeo do
processo de formaccedilatildeo de embrioacuteides seguido do
surgimento de aacutereas necrosadas na superfiacutecie satildeo sinais
que caracterizam a senescecircncia da cultura (SILVA 2002)
DISCUSSAtildeO
A resposta das anteras da cultivar Catuaiacute Vermelho 99
com relaccedilatildeo agrave oxidaccedilatildeo indica que a mesma estaacute associada agrave
combinaccedilatildeo entre auxina e citocinina promovendo os menores
iacutendices de oxidaccedilatildeo Agrave medida que se aumentou a
concentraccedilatildeo de 24-D na presenccedila de BAP houve um
aumento gradativo da oxidaccedilatildeo ateacute atingir um ponto maacuteximo
em torno de 80 na dosagem de 271 mM de 24-D Jaacute na
ausecircncia de BAP a oxidaccedilatildeo foi bem maior quando comparada
agrave porcentagem de oxidaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 905 mM de
24-D De acordo com Wang amp Huang (1976) o cultivo in
vitro por um periacuteodo longo induz a formaccedilatildeo de compostos
fenoacutelicos no meio que podem causar necrose e posteriormente
morte dos calos Maciel (2001) e Paluacute (2002) citam que pelos
resultados obtidos para a induccedilatildeo de calogecircnese em anteras
de cafeeiro observa-se que eacute necessaacuteria uma auxina
juntamente com uma citocinina Dentre as auxinas sinteacuteticas
o 24-D eacute sem duacutevida o mais adequado agrave induccedilatildeo e
manutenccedilatildeo do calo (GAMBORG et al 1976)
Para Thomas amp Ravindra (1997) o maior problema
na iniciaccedilatildeo de culturas lenhosas eacute a ocorrecircncia de
compostos fenoacutelicos que estatildeo ligados com processos de
regulaccedilatildeo de crescimento especialmente com as auxinas
que dependendo da sua concentraccedilatildeo endoacutegena no tecido
resulta na induccedilatildeo desses compostos
SILVA A S et al100
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
O fotoperiacuteodo que estas anteras foram submetidas
influenciou tambeacutem na porcentagem de oxidaccedilatildeo sendo
que no escuro e na presenccedila de 24-D (89 mM) a oxidaccedilatildeo
foi miacutenima Agrave medida que foi aumentando a concentraccedilatildeo
da auxina foi aumentando tambeacutem a oxidaccedilatildeo poreacutem este
aumento foi bem menor quando comparado ao cultivo das
anteras na presenccedila de luz
A oxidaccedilatildeo fenoacutelica tem sido controlada em
diferentes espeacutecies lenhosas pela reduccedilatildeo da intensidade
luminosa (MARKS amp SIMPSON 1990) associada com a
substituiccedilatildeo frequumlente do meio de cultura e dessa forma
as chances de se obter sucesso no estabelecimento e
cultivo de explantes de espeacutecies lenhosas satildeo bastante
elevadas (TEIXEIRA 2001)
Em muitas espeacutecies por razotildees natildeo conhecidas a
embriogecircnese direta eacute rara e as plantas tecircm que ser
diferenciadas a partir de calos Para induccedilatildeo destes
geralmente eacute necessaacuteria uma auxina (MAHESHWARI et
al 1982) Segundo Rocha (1998) para a induccedilatildeo e
manutenccedilatildeo do calo a maioria das espeacutecies parece
comportar-se diferentemente natildeo soacute quanto aos
reguladores de crescimento podendo ocorrer
independentemente de auxinas e citocininas dependente
de ambas ou dependente de uma ou de outra mas tambeacutem
quanto agrave presenccedila ou ausecircncia de luminosidade Sharp et
al (1973) obtiveram calos atraveacutes do cultivo de sementes
folhas e anteras de C arabica das cultivares Mundo Novo
e Bourbon Amarelo A induccedilatildeo de calos tambeacutem foi mais
eficiente na ausecircncia de luz Aleacutem disso Ascanio amp Arcia
(1994) citam que para o desenvolvimento do calo as
anteras devem ser mantidas no escuro jaacute para o
desenvolvimento do embriatildeo os calos devem ser mantidos
no claro
Natildeo houve a formaccedilatildeo de embriotildees e isto pode ser
devido agraves doses de reguladores ou mesmo de combinaccedilotildees
que natildeo foram apropriadas para estas cultivares
CONCLUSAtildeO
Os resultados mostraram que para ocorrer
intumescimento das anteras formaccedilatildeo e aumento do
tamanho dos calos de ambas as cultivares eacute necessaacuterio
que haja interaccedilatildeo entre a auxina (24-D) e a citocinina
(BAP) e incubaccedilatildeo no escuro
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PEREIRA F D et al102
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COMUNICACcedilAtildeO CIENTIacuteFICA
PROLIFERACcedilAtildeO IN VITRO DE BROTOS DE CURAUAacuteUTILIZANDO DIFERENTES VOLUMES DE MEIO DE CULTURA
IN VITRO SHOOT PROLIFERATION OF Ananas erectifolius USING DIFFERENTVOLUMES OF CULTURE MEDIUM
FLAacuteVIA DIONIacuteSIO PEREIRA1 JOSEacute EDUARDO BRASIL PEREIRA PINTO2HELEN CRISTINA DE ARRUDA RODRIGUES3 LUCIANA DOMICIANO SILVA ROSADO3
LUIZ ALBERTO BEIJO4 OSMAR ALVES LAMEIRA5
1Doutoranda em Agronomia ndash Universidade Estadual de Feira de SantanaUEFS ndash Horto Florestal ndash 44055-000 ndash Feira de Santana BA ndash flavia1808hotmailcom
2Doutor em Fisiologia Vegetal ndash Departamento de AgriculturaDAG ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash jeduardouflabr
3Graduanda em Agronomia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG4Doutorado em Agronomia ndash Universidade Federal de AlfenasUNIFAL ndash Departamento de Ciecircncias Exatas ndash Rua Gabriel Monteiro da Silva n deg 714 ndash Centro ndash 37130-000 ndash Alfenas MG ndash luizbeijoyahoocombr5Doutor em Agronomia ndash EMBRAPA ndash Amazocircnia Oriental ndash Trav Dr Eneacuteas Pinheiro sn ndash Bairro Marco ndash 66095-100 ndash Beleacutem PA ndash osmarcpatuembrapabr
RESUMOCurauaacute [Ananas erectifolius LBSm ndash Bromeliaceae] eacute
uma espeacutecie com grande potencial de uso de suas fibras comorevestimento na induacutestria automobiliacutestica Aleacutem disso o poacute dosumo do curauaacute tem sido utilizado no tratamento de cicatrizaccedilatildeode lesotildees cutacircneas Neste trabalho avaliaram-se diferentes volumesde meio MS Os volumes utilizados foram de 10 15 20 25 e 30 mLO delineamento experimental foi inteiramente casualizado (DIC)e cada tratamento continha 19 repeticcedilotildees Aos 30 dias avaliaram-se o nuacutemero e o tamanho de brotaccedilotildees Segundo a anaacutelise devariacircncia houve efeito linear do volume de meio na produccedilatildeo debrotos de curauaacute Agrave medida em que se aumenta o volume domeio aumenta o nuacutemero de brotos Natildeo houve diferenccedilasignificativa nos comprimentos dos brotos
Termos para indexaccedilatildeo Ananas erectifolius fibras vegetaismicropropagaccedilatildeo
ABSTRACTAnanas erectifolius LBSm ndash Bromeliaceae is a species
that presents fibers with great potential to be used as revetmentfor the automobile industry Besides the powder obtained fromits juice has been used in the treatment of skin lesionscicatrisation In this work the effect of different volumes (1015 20 25 and 30 mL) of MS medium during the in vitro cultureof axillary buds was evaluated A completely randomized design(CDR) was used with each treatment containing 19 replicatesAfter 30 days of inoculation shoot number and size wereevaluated The analysis of variance showed a linear effect of theculture medium volume and shoot proliferation Higher shoot
number was observed with the increase of medium volume Nosignificant difference was observed on shoot lenght
Index terms Ananas erectifolius vegetable fibermicropropagation
A produccedilatildeo de fibras vegetais ocupa um papel
relevante na economia agriacutecola mundial mesmo com a
intensa produccedilatildeo de fibras sinteacuteticas Mateacuterias-primas de
origens renovaacuteveis reciclaacuteveis e biodegradaacuteveis satildeo uma
das alternativas para a produccedilatildeo de manufaturados
ecologicamente corretos em consequumlecircncia do acuacutemulo
nos descartes de materiais natildeo biodegradaacuteveis os quais
tendem a aumentar com o crescimento populacional nos
centros urbanos A substituiccedilatildeo de materiais derivados do
petroacuteleo na produccedilatildeo de compostos elastomeacutericos por
mateacuteria-prima renovaacutevel vai ao encontro desses ideais
(ROCHA et al 2003)
As fibras sinteacuteticas destacam-se pela elevada
resistecircncia baixa densidade e elevada produccedilatildeo
Entretanto as fibras animais e vegetais satildeo as de maior
importacircncia principalmente para atender aos apelos
(Recebido em 31 de agosto de 2006 e aprovado em 19 de janeiro de 2007)
Proliferaccedilatildeo in vitro de brotos de curauaacute 103
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 102-106 2006
ecoloacutegicos e pelo nuacutemero de plantas e animais produtores
de fibras (SCHREIBER1998)
As plantas produtoras de fibras utilizaacuteveis foram
quantificadas por vaacuterios autores e em diferentes eacutepocas
tendo sido enumeradas 2000 mil plantas fibrosas e o seu
total estimado em 2300 destacando-se as florestas tropicais
que encerram recursos inesgotaacuteveis em potencial
(MEDINA 1959)
O curauaacute [Ananas erectifolius LBSm ndash
Bromeliaceae] utilizado principalmente na fabricaccedilatildeo de
cordas sacos e utensiacutelios domeacutesticos surge como
sucedacircneo para o aproveitamento de fibras O curauaacute eacute
uma bromeliaacutecea distribuiacuteda nos Estados do Paraacute Acre
Mato grosso Goiaacutes e Amazonas e eacute cultivada
principalmente por pequenos produtores da regiatildeo do
Lago Grande de Curuai no municiacutepio de Santareacutem PA
Estudos recentes tecircm demonstrado o grande potencial do
uso das fibras dessa planta como revestimento na induacutestria
automobiliacutestica devido agrave sua resistecircncia maciez e peso
reduzido O grande problema eacute que natildeo haacute suprimento
suficiente de mateacuteria-prima para atender agrave induacutestria
automobiliacutestica pois o curauaacute eacute fiel agraves suas origens amazocircnicas
e soacute se desenvolve em clima quente e uacutemido criando um
problema para a aquisiccedilatildeo de mudas fora desta regiatildeo que
por tal motivo eacute escassa no mercado (SILVA 2004)
A micropropagaccedilatildeo utilizando teacutecnicas de cultura
de tecido tem sido um valioso instrumento na propagaccedilatildeo
de diversos tipos de plantas Embora este processo envolva
diferentes etapas depois de definido um protocolo de
micropropagaccedilatildeo seja qual for a espeacutecie este pode ser
otimizado no intuito de se obter placircntulas de alta qualidade
e com baixo valor de produccedilatildeo O tipo e tamanho de frasco
e a quantidade de meio satildeo variaacuteveis que tecircm recebido
pouca atenccedilatildeo embora afetem diretamente a aacuterea superficial
da interface meio de cultura-atmosfera o volume de ar sobre
o meio de cultura e a sua profundidade Tais fatores tambeacutem
afetam a composiccedilatildeo da fase gasosa do frasco e
consequumlentemente o crescimento e desenvolvimento das
culturas (GRATTAPAGLIA amp MACHADO 1998)
Rodrigues et al (2005) verificaram maior
proliferaccedilatildeo de brotos de Cattleya persivaliana Hort
em frascos contendo 50 mL de meio quando comparados
com aqueles de 25 75 e 100 mL Nicoloso amp Erig (2002)
trabalhando com Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen
verificaram que 10 mL de meio MS (MURASHIGE amp
SKOOG 1962) proporcionaram o melhor crescimento
das placircntulas em biomassa quando cultivadas em tubos
de 20 cm de altura x 2 cm diacircmetro em comparaccedilatildeo com
os de 25 cm de altura x 2 cm 15 cm de altura x 2 cm
Carvalho et al (1995) estudando a influecircncia de fatores
fiacutesicos no desenvolvimento e crescimento in vitro de
batata-doce (Ipomoea batatas L Poir) verificaram que
10 mL de meio de cultura por frasco com explantes
proporcionaram maior formaccedilatildeo de gemas em relaccedilatildeo
aos volumes de 20 e 30 mL
Sendo assim objetivou-se neste trabalho avaliar
o volume de meio apropriado para a propagaccedilatildeo in vitro
de brotaccedilotildees de curauaacute
As brotaccedilotildees utilizadas como fonte de explante
foram fornecidas pela EMBRAPACPATU situada em
Beleacutem do Paraacute Gemas axilares de curauaacute foram
inoculadas em meio MS completo suplementado com
20 mgL de BAP (6-Benzilaminopurina) Apoacutes 30 dias
estas se desenvolveram e as brotaccedilotildees obtidas foram
transferidas para o meio MS sem regulador de
crescimento por 30 dias
Apoacutes este periacuteodo quatro explantes foram
desfolhados completamente ficando apenas porccedilotildees
basais com aproximadamente 1cm de comprimento que
foram inoculadas em meio de cultura baacutesico MS sem
regulador de crescimento em frasco de 12 cm de altura por
5 cm de diacircmetro (volume interno = 300 mL) com volumes
de 10 15 20 25 30 mL Os explantes foram mantidos em
sala de crescimento a uma temperatura de 26plusmn1degC e
fotoperiacuteodo de 16 horas sob uma Irradiacircncia de foacutetons de
25mmol m-2 s-1
O delineamento experimental foi inteiramente
casualizado (DIC) Cada tratamento continha 19 repeticcedilotildees
PEREIRA F D et al104
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 102-106 2006
(um frasco por repeticcedilatildeo) Aos 30 dias avaliaram-se o
nuacutemero e o comprimento das brotaccedilotildees O programa
utilizado para anaacutelise dos dados foi o software statistica
(SISVAR) tendo sido submetidas agrave anaacutelise de variacircncia
com aplicaccedilatildeo do teste F a 5 de probabilidade
analisando-se as meacutedias por regressatildeo polinomial
O efeito linear foi o mais adequado para explicar
a evoluccedilatildeo da taxa meacutedia de regeneraccedilatildeo do curauaacute Agrave
medida que o volume do meio de cultura aumenta existe
tendecircncia de aumento do nuacutemero de brotos Com 25
mL de meio produziu-se maior nuacutemero de brotos por
frasco (2557) e com 10 mL de meio produziu-se menor
nuacutemero de brotos (1226) O tratamento com 15 mL de
meio produziu 1765 brotos o com 20 mL 1750 e o com
30 mL 2242 (Figura 1) O volume maior de meio
disponibiliza mais nutrientes e diminui tambeacutem a
competiccedilatildeo entre as placircntulas o que explica a tendecircncia
em se obter um maior nuacutemero de brotos agrave medida que
se aumenta a quantidade do meio de cultura Em todos
os tratamentos as brotaccedilotildees obtidas foram vigorosas
com a coloraccedilatildeo verde-escura caracteriacutestica das
plantas matrizes As brotaccedilotildees tinham tambeacutem rigidez
outra caracteriacutestica da espeacutecie o que eacute devido agrave
presenccedila das fibras nas folhas Observou-se maior
concentraccedilatildeo de raiacutezes nas brotaccedilotildees maiores e natildeo
FIGURA 1 ndash Nuacutemero meacutedio de brotos por frasco de curauaacute(Ananas erectifolius) cultivados em diferentes volumesde meio MS completo 10 15 20 25 e 30
foi observada a presenccedila de calos em nenhum dos
tratamentos (Figura 2)
Resultados semelhantes foram obtidos por Reis
Lameira Reis (2004) trabalhando com curauaacute utilizando
volumes de 5 75 10 e 15 mL do meio liacutequido MS suplementados
com 25 mgL-1 de BAP (6-benzilaminopurina) os melhores
resultados sendo com os tratamentos que continham 10 e
15ml produzindo em meacutedia 121 e 154 brotosexplante
respectivamente
Da mesma forma Reis et al(2003) trabalhando com
ipeca (Psychotria ipecacuanha Stokes) em meio MS
acrescido de 15 mg L-1de BAP nos volumes de 10 20 30
e 40 mL obtiveram melhor resultado com os volumes de 30
e 40 mL (7 e 8 brotosfrasco respectivamente)
Quanto ao comprimento dos brotos natildeo houve
diferenccedila significativa Os brotos t iveram um
crescimento meacutedio de 228 cm sendo que no tratamento
com 10 mL de meio foi 257 cm com 15 mL 222 cm
com 20 mL 224 cm com 25 mL 224 cm e o tratamento
com 30 mL 215 cm Embora natildeo se tenham realizado
estudos mais aprofundados uma das hipoacuteteses
sugeridas para explicar tais resultados possivelmente
estaacute relacionada a fatores nutricionais do explante
Segundo Cappelades et al (1991) e Pereira et al (2001)
porccedilotildees basais satildeo mais robustas apresentando maior
quantidade de reservas acumuladas em seus tecidos
o que poderia levar agrave utilizaccedilatildeo dessas reservas pelas
brotaccedilotildees regeneradas para sustentar seu crescimento
Esta seria uma das causas da uniformidade apresentada
no tamanho das brotaccedilotildees em todos os tratamentos
Resultados iguais foram obtidos em estudos feitos por
Rodrigues et al (2005) quando avaliaram comprimento
meacutedio de duas espeacutecies de orquiacutedeas mantidas em meio
de cultura cujos volumes testados eram de 25 50 75 e
100 mL Portanto verifica-se que eacute muito importante
selecionar material com bom estado fisioloacutegico e
tamanho homogecircneo para se obter melhores
resultados na proliferaccedilatildeo das brotaccedilotildees eou na
morfogecircnese
Proliferaccedilatildeo in vitro de brotos de curauaacute 105
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 102-106 2006
FIGURA 2 ndash Brotaccedilotildees de curauaacute (Ananas erectifolius) produzidas in vitro em diferentes volumes de meio MS 1-Repicagem dos brotos 2- 10 mL de meio MS 3- 15 mL de meio MS 4- 20 mL de meio MS 5- 25 mL de meio MS 6- 30mL de meio MS
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REIS Eacute S PINTO J E B P CORREcircA R MPEREIRA F D BERTOLUCCI S K V Influecircncia dosmeios MS e WPM associados a diferentesconcentraccedilotildees de Benzilaminopurina na multiplicaccedilatildeode ipeca (Psychotria ipecacuanha (Brot) Stokes InCONGRESSO BRASILEIRO DE CULTURA DE TECIDOSDE PLANTAS 1 2003 Lavras Anais Lavras UFLA2003 p 273
REIS J N R LAMEIRA O M REIS L R S1Aprimoramento de protocolos de propagaccedilatildeo in vitro de
curauaacute Disponiacutevel lthttpwwwbiologocombrgt Acessoem ago 2004
ROCHA E C GHELER JUacuteNIOR J Aproveitamento deresiacuteduos gerados na aglomeraccedilatildeo de fibras de coco comLaacutetex natural Mateacuteria Teacutecnica Disponiacutevel em lthttpwwwbiologocombrgt Acesso em jun 2003
RODRIGUES J D ARAUacuteJO A G ASSIS F A ACAVALLARI L L PASQUAL M Crescimento in vitro deplacircntulas de orquiacutedeas quantidade de meio de cultura enuacutemero de explantes In CONGRESSO DE INICIACcedilAtildeOCIENTIacuteFICA DA UFLA ndash CICESAL 18 2005 Lavras MGAnais Lavras UFLA 2005 1CD-ROM
SILVA C Paiacutes pesquisa mais fibras naturais para carrosDisponiacutevel em lthttpwwwsebrae_sccombrn o v o s _ d e s t a q u e s o p o r t u n i d a d e mostra_mateacuteriaaspcd_noticia=8356gt Acesso em out 2004
SCHREIBER V (Org) Vias de desenvolvimentosustentaacutevel as dimensotildees do desafio Beleacutem UFBANUMAPOEMAIDESP 1998 495 p (POEMA 6)
NORMAS PARA PUBLICACcedilAtildeO DE ARTIGOS E COMUNICACcedilOtildeES CIENTIacuteFICAS
1 Os conceitos e afirmaccedilotildees contidos nos artigos e comunicaccedilotildeesseratildeo de inteira responsabilidade do(s) autor(es)
2 A revista ldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquo editadasemestralmente pela Editora da Universidade Federal de Lavras(Editora UFLA) publica artigos cientiacuteficos e comunicaccedilotildeescientiacuteficas da aacuterea de cultura de tecidos de plantas elaboradospor membros da comunidade cientiacutefica nacional e internacionalNatildeo eacute cobrada taxa para publicaccedilatildeo de trabalhos Eacute condiccedilatildeofundamental que os artigoscomunicaccedilotildees submetidos agrave apreciaccedilatildeoda revista ldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquo natildeo forame nem seratildeo publicados simultaneamente em outro lugar Com aaceitaccedilatildeo do artigo para publicaccedilatildeo os editores adquirem amplose exclusivos direitos sobre o artigo para todas as liacutenguas e paiacutesesA publicaccedilatildeo de artigoscomunicaccedilotildees dependeraacute da observacircnciadas Normas Editoriais dos pareceres do Corpo Editorial e daComissatildeo ad hoc Todos os pareceres tecircm caraacuteter sigiloso eimparcial e tanto os autores quanto os membros do CorpoEditorial eou Comissatildeo ad hoc natildeo obtecircm informaccedilotildeesidentificadoras entre si
3 Os artigos e comunicaccedilotildees submetidos para publicaccedilatildeo deveratildeoser apresentados em CD utilizando-se o processador de textoMicrosoft Word for Windows (version 98 2000 XP ou 2003)ser escrito em liacutengua portuguesa inglesa ou espanhola e usarsomente nomenclaturas oficiais e abreviaturas consagradas natildeoempregando abreviaturas no tiacutetulo do artigo Juntamente com oCD deveratildeo ser enviadas 4 (QUATRO) vias sendo uma originale as demais coacutepias omitindo os autores e a chamada de rodapeacute daprimeira paacutegina (para serem enviadas aos consultores cientiacuteficos)impressas em papel branco tipo A4 (21cm x 297cm) ou emformulaacuterio contiacutenuo em uma soacute face espaccedilo duplo entre linhasfonte Times New Roman tamanho 12 observada uma margemde 3 cm para o lado esquerdo e de 2 cm para o direito 25 cm paramargem superior e inferior 25 cm para o cabeccedilalho e 25 cm parao rodapeacute Cada trabalho deveraacute ter no maacuteximo 14 paacuteginas ejunto do mesmo deveraacute ser encaminhado ofiacutecio dirigido ao EditorChefe da revista solicitando a publicaccedilatildeo do artigo Esse ofiacuteciodeveraacute ser assinado por todos os autores constar o endereccedilocompleto telefone e e-mail de todos Qualquer inclusatildeo exclusatildeoou alteraccedilatildeo na ordem dos autores deveraacute ser notificada medianteofiacutecio assinado por todos os autores (inclusive do autor excluiacutedo)
4 O artigo cientiacutefico deveraacute conter os seguintes toacutepicos a)TIacuteTULO suficientemente claro conciso e completo evitandopalavras supeacuterfluas Recomenda-se comeccedilar pelo termo querepresente o aspecto mais importante do trabalho com os demais
termos em ordem decrescente de importacircncia b) TIacuteTULO EMINGLEcircS c) NOME(s) DO(s) AUTOR(es) no maacuteximo 6 (seis)em letras maiuacutesculas um apoacutes o outro centralizados e no rodapeacuteda primeira paacutegina deveratildeo vir a formaccedilatildeo acadecircmica e aInstituiccedilatildeo onde trabalham d) RESUMO (de acordo comNBR6028 da ABNT) O resumo natildeo deve ultrapassar a 250(duzentos e cinquumlenta) palavras e natildeo possuir paraacutegrafos Apoacuteso Resumo devem-se incluir TERMOS PARA INDEXACcedilAtildeO(palavraschave) diferentes daqueles constantes do tiacutetulo eseparados por viacutergula Os termos para indexaccedilatildeo devem estardescritos na forma maiuacutescula e minuacutescula serem expressotildees queidentifiquem o conteuacutedo do artigo ser indicadas entre 3 e 5 e sepossiacutevel extraiacutedas do vocabulaacuterio Thesagro ndash Thesaurus AgriacutecolaNacional desenvolvido pela CENAGRI (indicaccedilatildeo da revistaldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquopara evitar o usode vaacuterios sinocircnimos como termos de indexaccedilatildeo) Se natildeo foremencontrados descritores disponiacuteveis para cobrirem a temaacutetica doartigo poderatildeo ser indicados termos ou expressotildees de usoconhecido e) ABSTRACT incluindo em seguida INDEXTERMS f) INTRODUCcedilAtildeO (incluindo a revisatildeo de literatura)g) MATERIAL E MEacuteTODOS h) RESULTADOS EDISCUSSAtildeO (podendo conter tabelas e figuras) i)CONCLUSOtildeES e j) REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
5 A comunicaccedilatildeo deveraacute conter os seguintes toacutepicos a)TIacuteTULO suficientemente claro conciso e completo evitandopalavras supeacuterfluas Recomenda-se comeccedilar pelo termo querepresente o aspecto mais importante do trabalho com os demaistermos em ordem decrescente de importacircncia Deve serapresentada a versatildeo do tiacutetulo para o idioma inglecircs b) TIacuteTULOEM INGLEcircS c) NOME(s) DO(s) AUTOR(es) no maacuteximo 6(seis) em letras maiuacutesculas um apoacutes o outro centralizados e norodapeacute da primeira paacutegina deveratildeo vir a formaccedilatildeo acadecircmica e aInstituiccedilatildeo onde trabalham d) RESUMO (de acordo comNBR6028 da ABNT) O resumo natildeo deve ultrapassar a 250(duzentos cinquumlenta) palavras e natildeo possuir paraacutegrafos Apoacutes oResumo devem-se incluir TERMOS PARA INDEXACcedilAtildeO(palavras-chave) diferentes daqueles constantes do tiacutetulo eseparados por viacutergula Os termos para indexaccedilatildeo devem estardescritos na forma maiuacutescula e minuacutescula serem expressotildees queidentifiquem o conteuacutedo do artigo ser indicadas entre 3 e 5 e)ABSTRACT incluindo em seguida INDEX TERMS f)TEXTO [sem subdivisatildeo poreacutem com introduccedilatildeo material emeacutetodos resultados e discussatildeo e conclusatildeo subtendidos(podendo conter tabelas ou figuras)] e g) REFEREcircNCIASBIBLIOGRAacuteFICAS
6 AGRADECIMENTOS ao fim do texto e antes das ReferecircnciasBibliograacuteficas poderatildeo vir os agradecimentos a pessoas ouinstituiccedilotildees O estilo tambeacutem aqui deve ser soacutebrio e claroindicando as razotildees pelas quais se fazem os agradecimentos
7 TABELAS E QUADROS deveratildeo ser inseridos apoacutes citaccedilatildeodos mesmos dentro do proacuteprio texto
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS as referecircnciasbibliograacuteficas devem ser citadas conforme a NBR60232002 daABNTA exatidatildeo das referecircncias constantes da listagem e a corretacitaccedilatildeo no texto satildeo de responsabilidade do(s) autor(es) doartigo
Orientaccedilotildees gerais- Deve-se apresentar todos os autores do documento cientiacutefico(fonte)- O nome do perioacutedico deve ser descrito por extenso natildeo deveser abreviado- Em todas as referecircncias deve-se apresentar o local de publicaccedilatildeo(cidade) a ser descrito no lugar adequado para cada tipo dedocumento- As referecircncias devem ser ordenadas alfabeticamente
EXEMPLIFICACcedilAtildeO (TIPOS MAIS COMUNS)
ARTIGO DE PERIOacuteDICO
VIEIRA R F RESENDE M A V de Eacutepocas de plantio deervilha em Patos de Minas Uberaba e Janauacuteba Minas GeraisCiecircncia e Agrotecnologia Lavras v 24 n 1 p 74-80 janmar 2000
LIVRO
a) Livro no todo
STEEL R G D TORRIE J H Principles and procedures ofstatistics New York McGraw-Hill Book l960 481 p
b) Parte de livro com autoria especiacutefica
FLEURY J A Anaacutelise ao niacutevel de empresa dos impactos daautomaccedilatildeo sobre a organizaccedilatildeo da produccedilatildeo de trabalho InSOARES R M S M Gestatildeo da empresa Brasiacutelia IPEAIPLAN 1980 p 149-159
c) Parte de livro sem autoria especiacutefica
MARTIM L C T Nutriccedilatildeo de bovino de corte em confinamentoIn ______ Confinamento de bovino de corte 2 ed Satildeo PauloNobel 1986 cap 3 p 29-89
DISSERTACcedilAtildeO E TESE
GONCcedilALVES R A Preservaccedilatildeo da qualidade tecnoloacutegicade trigo (Triticum aestivum L) e controle de Rhyzoperthadominica (F) durante o armazenamento em atmosferacontrolada com Co2 e N2 1997 52 f Dissertaccedilatildeo (Mestradoem Ciecircncia dos Alimentos) ndash Universidade Federal de LavrasLavras 1997
MATIOLI G P Influecircncia do leite proveniente de vacasmastiacuteticas no rendimento de queijo frescal 2000 55 pDissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncias dos Alimentos) - UniversidadeFederal de Lavras Lavras 2000
Nota ldquoA folha eacute composta de duas paacuteginas anverso e versoAlguns trabalhos como teses e dissertaccedilotildees satildeo impressos apenasno anverso e neste caso indica-se frdquo (ABNT NBR60232002p 18)
TRABALHOS DE CONGRESSO E OUTROS EVENTOS
SILVA J N M Possibilidades de produccedilatildeo sustentada de madeiraem floresta densa de terra firme da Amazocircnia brasileira InCONGRESSO FLORESTAL BRASILEIRO 6 1990 Campos doJordatildeo Anais Campos do Jordatildeo SBSSBEF 1990 p 39-45
DOCUMENTOS ELETROcircNICOS
As obras consultadas online satildeo referenciadas conformenormas especiacuteficas para cada tipo de documento (monografia notodo e em parte trabalho apresentado em evento artigo deperioacutedico artigo de jornal etc) acrescidas de informaccedilotildees sobreo endereccedilo eletrocircnico apresentado entre braquetes (lt gt)precedido da expressatildeo ldquoDisponiacutevel emrdquo e da data de acessoao documento precedida da expressatildeo ldquoAcesso emrdquo
Nota ldquoNatildeo se recomenda referenciar material eletrocircnico de curtaduraccedilatildeo nas redesrdquo (ABNT NBR60232000 p 4) Segundopadrotildees internacionais a divisatildeo de endereccedilo eletrocircnico no fimda linha deve ocorrer sempre apoacutes barra ()
Monografia (acesso online)
a) Livro no todo
TAKAHASHI T (Coord) Tecnologia em foco BrasiacuteliaSocinfoMCT 2000 90 p Disponiacutevel em lthttpwwwsocinfoorgbrgt Acesso em 22 ago 2000
b) parte de livro
TAKAHASHI T Mercado trabalho e oportunidades In ______Sociedade da informaccedilatildeo no Brasil livro verde BrasiacuteliaSocinfoMCT 2000 cap 2 p 13-24 Disponiacutevel em lthttpwwwsocinfogovbrgt Acesso em 22 ago 2000
c) Parte de congresso seminaacuterio etc
GIESBRECHT H O Avaliaccedilatildeo de desempenho de institutos depesquisa tecnoloacutegica a experiecircncia de projeto excelecircncia napesquisa tecnoloacutegica In CONGRESSO ABIPTI 2000Fortaleza Gestatildeo de institutos de pesquisa tecnoloacutegicaFortaleza Nutec 2000 Disponiacutevel em lthttpwwwabiptiorgbrgt Acesso em 01 dez 2000
d) Tese
SILVA E M Arbitrariedade do signo a liacutengua brasileira desinais (LIBRAS) 1997 144 p Dissertaccedilatildeo (Mestrado emLinguumliacutestica Aplicada e Estudo de Liacutengua) - Pontifiacutecia UniversidadeCatoacutelica de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 1997 Disponiacutevel em lthttpwwwterracombrvirtualbooks freebookportdid teseshtmgtAcesso em 28 nov 2000
Artigo de perioacutedico (acesso online)
RESENDE A M G Hipertexto tramas e trilhas de um conceitocontemporacircneo Informaccedilatildeo e Sociedade Recife v 10 n 12000 Seccedilatildeo Educaccedilatildeo Disponiacutevel em lthttpwwwinformaccedilatildeoesociedadeufpbbrgt Acesso em 30 nov 2000
CITACcedilAtildeO PELO SISTEMA ALFABEacuteTICO (AUTOR-DATA)(conforme ABNT NBR105202002)Dois autores - Steel amp Torrie (1960) ou (STEEL amp TORRIE1960)Trecircs ou mais autores - Valle et al (l945) ou (VALLE et al 1945)Obs Quando forem citados dois autores de uma mesma obradeve-se separaacute-los pelo sinal amp (comercial)
9 CASO O ARTIGO CONTENHA FOTOGRAFIASGRAacuteFICOS FIGURAS SIacuteMBOLOS E FOacuteRMULASESSAS DEVERAtildeO OBEDECER AgraveS SEGUINTESNORMAS
91 Fotografias deveratildeo ser apresentadas em preto e branconiacutetidas e com contraste inseridas no texto apoacutes a citaccedilatildeo dasmesmas e tambeacutem em um arquivo agrave parte salvas em extensatildeoldquoTIFFrdquo ou ldquoJPEGrdquo com resoluccedilatildeo de 300 dpi
92 Figuras deveratildeo ser apresentadas em preto e branco niacutetidase com contraste inseridas no texto apoacutes a citaccedilatildeo das mesmas etambeacutem em um arquivo agrave parte salvas em extensatildeo ldquoTIFFrdquo ouldquoJPEGrdquo com resoluccedilatildeo de 300 dpi As figuras deveratildeo serelaboradas com letra Times New Roman tamanho 10 semnegrito sem caixa de textos e agrupadas
93 Graacuteficos deveratildeo ser inseridos apoacutes citaccedilatildeo dos mesmosdentro do proacuteprio texto elaborado preferencialmente em Excelcom letra Times New Roman tamanho 10 sem negrito
94 Siacutembolos e Foacutermulas Quiacutemicas deveratildeo ser feitas emprocessador que possibilite a formataccedilatildeo para o programa PageMaker (ex MathType Equation) sem perda de suas formasoriginais
10 O Editor Chefe notificaraacute o autor do recebimento do originale posteriormente o informaraacute sobre sua publicaccedilatildeo Os artigosque necessitarem de modificaccedilotildees seratildeo devolvidos ao autor paraa devida revisatildeo
11 Os artigos natildeo aprovados seratildeo devolvidos
12 Os artigos seratildeo publicados em ordem de aprovaccedilatildeo
13 O natildeo-cumprimento dessas normas implicaraacute na devoluccedilatildeodo artigo ao autor
14 Os casos omissos seratildeo resolvidos pela Comissatildeo Editorial
15 O artigo deveraacute ser enviado para
ABCTPPlant Cell Culture amp MicropropagationUniversidade Federal de LavrasDepartamento de Biologia - Setor de Fisiologia VegetalCaixa Postal 3037Lavras ndash MGCEP 37200-000E-mail abctpuflabr
INSTRUCTIONS FOR AUTHORS
1 Concepts and affirmations included in articles andcommunications are of the entire responsibility of the authors
2 ldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquo a semestral journaledited by Editora UFLA of the Universidade Federal de Lavraspublishes scientific articles and communications in the area ofplant tissue culture elaborated by researchers of the national andinternational scientific community There are no page charges forpublication Submission of a manuscript implies that it is neitherunder consideration for publication elsewhere nor has appearedpreviously in part or in whole On acceptance for publicationauthors assign to the Editors full copyright of the manuscript inall languages and countries Publications will depend on editorialrules and on the review of experts and ad hoc commissionReviewer and editorial opinions will be anonymouslycommunicated to authors
3 The articles and communication submitted for publicationmust be presented in CD using the program Microsoft Wordfor Windows (version 98 2000 XP or 2003) written inPortuguese English or Spanish using only conventionalnomenclature At the time of submission authors are requiredto submit together with the CD 4 (four) hard copies one originaland three copies without the name(s) of the author(s) as well asthe footnote on the first page (to be used by the reviewers)printed on A4 white paper (21 cm x 297cm) or on continuousform typewritten only on one side double spaced using fontTimes New Roman size 12 with a 3 cm margin on the left handside and 20 cm margin on the right hand side 25 cm upper andlower margin 25 cm for the heading and 25 cm for the footnoteThe manuscript must present a maximum of 14 pages At thetime of submission a cover letter must be sent with themanuscript copies to the Editor requesting publication of thearticle This cover letter must be signed by all authors andalso contain the full address telephone number and e-mail ofthe authors Any inclusion exclusion or alteration in the authorsorder must be notified and signed by all authors including theone excluded
4 Each manuscript must be organized in a) TITLE sufficientlyclear conspicuous and complete without superfluous words Itis recommended to initiate with the term that represent the mostimportant aspect with other terms in decreasing of importanceb) TITLE in Portuguese c) FULL NAME(s) OF THEAUTHOR(s) maximum of 6 (six) in capital letters one after theother in the center of the page with the footnote of the first pagecontaining their professional qualification or academic training
and their work institution d) ABSTRACT written continuouslywithout paragraph It must not exceed 250 words Index termsmust be enclosed after the abstract using terms different fromthose used in the title and separated by comma The index terms(3 to 5) must be described in capital and small letters and expressthe content of the article e) ABSTRACT and INDEX TERMSin Portuguese f) INTRODUCTION (including literaturereview) g) MATERIAL AND METHODS h) RESULTS ANDDISCUSSION (it may include tables and figures) i)CONCLUSIONS and j) REFERENCES
5 Communication must have the following topics a) TITLEsufficiently clear conspicuous and complete without superfluouswords It is recommended to initiate with the term that representthe most important aspect with other terms in decreasing ofimportance The PORTUGUESE version of the title has to bepresented b) TITLE in Portuguese c) FULL NAME(s) OFTHE AUTHOR(s) maximum of 6 (six) in capital letters oneafter the other in the center of the page with the footnote of thefirst page containing their professional qualification or academictraining and their work institution d) ABSTRACT writtencontinuously without paragraph It must not exceed 250 wordsIndex terms must be enclosed after the abstract using termsdifferent from those used in the title and separated by commaThe index terms (3 to 5) must be described in capital and smallletters and express the content of the article e) ABSTRACTand INDEX TERMS in Portuguese f) TEXT (with no divisionbut must include introduction material and methods results anddiscussion and conclusion (it may include tables and figures) andg)REFERENCES
6 ACKNOWLEDGEMENTS Acknowledgements to peopleor institutions might be included at the end of the text priorReferences The written style must be serious and clear indicatingthe reasons of the acknowledgements made
7 TABLES AND FIGURES must be included right after theircitation in the text
8 REFERENCES references must be cited according toNBR60232002 of ABNT All references and their correct citationin the text are of the entire responsibility of the author(s)- Some important orientations all authors of the scientificdocument must be presented (source) the journal must be citedusing its full name all references must present the name of thecity where the journal was published all references must be citedalphabetically
9 PHOTOGRAPHS GRAPHS FIGURES SYMBOLS ORFORMULA CONTAINED IN THE ARTICLE SHOULDOBEY THE FOLLOWING RULES
91 Photographs must be presented in black and whiteclear and with contrast inserted in the text after their citationand also in a separate file (on the same diskette as the article)saved in extension ldquoTIFFrdquo or ldquoJPEGrdquo with resolution of300 dpi
92 Figures must be presented in black and white clear andwith contrast inserted in the text after their citation and also in aseparate file (on the same diskette as the article) saved inextension ldquoTIFFrdquo or ldquoJPEGrdquo with resolution of 300 dpiThey must be elaborated using Times New Roman font size10 without bold without text box and arranged
93 Graphs must be inserted in the text after their citationelaborated preferentially in Excel using Times New Romanfont size 10 without bold
94 Symbols and Chemical Formula must be presented usinga word processor that permits a format for Page Maker (exMathType Equation) without loss of its original form
10 The Brazilian Association of Plant Tissue Culture (ABCTP)will inform the author the receipt of the original manuscript andeventually it will also send information regarding its publicationManuscripts that require modifications will be returned to theauthor for the respective revision andcorrections
11 Manuscripts not approved will be returned to the author
12 Articles will be published according to the order of receiptand approval
13 If any of these rules are not attended the manuscript will bereturned to the author
14 Manuscripts should be sent to the following address
ABCTPPlant Cell Culture amp MicropropagationUniversidade Federal de LavrasDepartamento de Biologia - Setor de Fisiologia VegetalCaixa Postal 3037Lavras ndash MGCEP 37200-000BrazilE-mail abctpuflabr
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-106 2006
Plant Cell Culture amp Micropropagation
ISSN 1808-9909
COMUNICACcedilAtildeO CIENTIacuteFICA
08 Proliferaccedilatildeo in vitro de brotos de Curauaacute utilizando diferentes volumes de meio de cultura In vitro shoot proliferation of Ananas erectifolius using different volumes of culture medium Flaacutevia Dioniacutesio Pereira Joseacute Eduardo Brasil Pereira Pinto Helen Cristina de Arruda Rodrigues Luciana Domiciano Silva Rosado Luiz Alberto Beijo Osmar Alves Lameira 102
In vitro propagation of Melissa officinalis L and production 53
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
IN VITRO PROPAGATION OF Melissa officinalis L AND PRODUCTIONOF ESSENTIAL OIL
IN VITRO PROPAGATION OF Melissa officinalis L AND PRODUCTION OFESSENTIAL OIL
SIMONE DA SILVA1 CELSO LUIZ SALGUEIRO LAGE2 MARIA APPARECIDA ESQUIBEL3ROSANE AGUIAR DA SILVA SAN GIL4 ALICE SATO5
1Doutoranda em Biotecnologia Vegetal ndashUFRJIBC Chagas Filho ndash Av Brigadeiro Trompowsky SN Ccs ndash Bloco G ndash Sala G2-050 ndash Cidade Universitaacuteria ndash Laboratoacuterio de Fisiologia Vegetal ndash Ilha do Fundatildeo ndash 21949-900 ndash Rio de Janeiro RJ ndash monybiofufrjbr
2Dr em Biofiacutesica ndashUFRJ ndash Instituto de Biofiacutesica Carlos Chagas Filho ndash Laboratoacuterio de Fisiologia Vegetal ndash Ilha do Fundatildeo ndash 21949-900 ndash Rio de Janeiro RJ ndash clslagebiofufrjbr3Poacutes-Doutorado em Bioeletrogecircnese ndash UFRJ ndash Instituto de Biofiacutesica Carlos Chagas Filho ndash Laboratoacuterio de Fisiologia Vegetal ndash Ilha do Fundatildeo ndash 21949-900 ndash Rio de Janeiro RJ ndash esquibelbiofufrjbr4Dra em Quiacutemica Orgacircnica ndash Ufrj DQO ndash Edifiacutecio do Centro de Tecnologia ndash Bloco A ndash Sala 605 ndash Ilha do Fundatildeo ndash Cidade Universitaacuteria ndash Caixa Postal 068556 ndash 21941-972 ndash Rio de Janeiro RJ ndash rsangilIqufrjbr5Dra em Biotecnologia Vegetal ndash UNIRIODCN ndash Centro de Ciecircncias Bioloacutegicas e da Sauacutede ndash Av Pasteur 458 Preacutedio da ECB ndash 4ordmandar Sala 415 URCA ndash 22290-240 ndash Rio de Janeiro RJ ndash alicesatouniriobr
ABSTRACTThis work presents an efficient protocol for micropropagation
of Melissa officinalis L through axillary bud proliferation obtainedfrom in vitro germinated seeds on basal Murashige amp Skoog medium(MS) The explants were grown on MS supplemented with differentgrowth regulators NAA (05 mM) KIN (05 mM) BA (05 mM)GA
3 (28 microM) and IAA (05 mM) Higher shoot proliferation and
rooting rates were obtained on MS supplemented with 05 microM IAAMicropropagated plants were acclimatized and transferred to soilwith success The essential oil composition in shoots of in vitro andfield-grown (ex vitro) plants was determined by gas chromatographymass spectrometry The major components of essential oils detectedin both plant materials were pujone neral geraniol and geranial Mofficinalis in vitro plantlets developed on MS media showed 14higher proportions of nerol and 41 of geraniol when compared withfield grown plants
Index terms Growth regulators medicinal plant tissue culture
RESUMOEste trabalho apresenta um protocolo raacutepido e eficiente
para propagaccedilatildeo in vitro de Melissa officinalis L atraveacutes daproliferaccedilatildeo de gemas axilares de plantas obtidas de sementesgerminadas em meio basal de Murashige amp Skoog (MS) Os explantesforam cultivados em meio de Murashige amp Skoog (MS) 1962com adiccedilatildeo de diferentes reguladores de crescimento Aacutecido alfa-naftaleno-aceacutetico (ANA ndash 05 mM) Cinetina (KIN ndash 05 mM)Benziladenina (BA ndash 05 mM) Aacutecido Gibereacutelico (GA
3 ndash 28 microM)
e Aacutecido Indolaceacutetico (AIA ndash 05 mM) O alongamento e formaccedilatildeode segmentos nodais maacuteximos foram obtidos com AIA Explantesdesenvolveram 5 novos brotos com 10 cm em meacutedia e 100 deenraizamento em 30 dias de cultura Plantas micropropagadasforam aclimatadas e transferidas para o solo com sucesso Acomposiccedilatildeo do oacuteleo essencial de partes aeacutereas de plantas produzidasin vitro e plantas crescidas em campo (ex vitro) foi determinadapor cromatografia gasosa acoplada agrave espectrometria de massas Os
principais componentes do oacuteleo essencial encontrados em ambosos materiais vegetais foram a pujona neral geraniol e geranial Asplantas de Melissa officinalis desenvolvidas in vitro em MSapresentaram aumento de 14 vezes na proporccedilatildeo do nerol e de 41na de geraniol quando comparadas agraves plantas ex vitro
Termos para indexaccedilatildeo Reguladores de crescimento plantamedicinal cultura de tecidos
INTRODUCTION
Melissa officinalis L (Lamiaceae) is a well-known
herb used to give fragrance to different food and beverage
products It has also been used as a medicinal plant for
treatment of headaches gastrointestinal disorders
nervousness and rheumatism The essential oil is a well-
known antibacterial and antifungal agent and it is also
responsible for the mild depressive and spasmolytic
properties of the plant Literature data pointed out antioxidant
properties of methanolic extracts of Melissa officinalis which
are mostly due to high portion of phenolic acids revealing
significant antimicrobial particularly antibacterial activity of
this essential oil (MIMICA-DUKIC et al 2004)
The chemical composition of the essential oil of
Melissa officinalis leaf (02-1 on dry weight) has been
studied The major compounds (10-40) are citral (neral
and geranial) and these are accompanied by limonene
cineole geraniol szlig-caryophyllene and spathulenol The
(Recebido em 06 de setembro de 2005 e aprovado em 21 de junho de 2006)
SILVA S da et al54
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
leaf also contains polyphenolic compounds
hydroxycinnamic derivatives with verbascoside (53)
flavonoids such as luteolin 7-glucoside and luteolin 7-
diglucuronide (08) These compounds probably
intervene in the antispasmodic activity Iridoid glucosides
were also reported and the infusion contains potassium
(CARNAT et al 1999)
Cultivation of medicinal plants for the purpose of
extraction of active constituents may face certain limitations
such as climate season water availability diseases and
pests and scarcity of naturally growing plants Such
limitations led to the use of tissue culture techniques for
production of the active constituents Tissue culture
provides means of rapid propagation of a large number of
uniform plants while maintaining their genotype Beneficial
uses of tissue culture for the purpose of extraction of
secondary metabolites include avoidance of collection of
endangered wild species production of secondary
metabolites due to rapid growth of cultures in vitro
(ARIKAT et al 2004)
Due to the importance of this plant for multiple
purposes and the difficulty to produce active compounds
in vitro the application of methods that provide higher
number of cloned plants of M officinalis is justified aiming
to select high quality plant lines to extensive culture and
extraction of pharmaceutical products In Brazil M
officinalis is used in phytomedicine by pharmaceutical
industries One of the most critical problems of
phytomedicine is the natural variation of plants chemical
constituents (CURRIER et al 2000) This variation could
be originated from genetical factors or under influence of
environmental characteristics
The use of in vitro systems have been reported as
an effective tool for obtaining genetically uniform plants
which can be the source for less variable pharmaceutical
preparations Plant regeneration of M officinalis has been
achieved using as explants cotyledonary nodes of 10-day-
old Melissa officinalis seedlings (TAVARES et al 1996)
shoot tips from plants cultivated at greenhouse
(MEacuteSZAacuteROS et al 1999) using various types and
concentrations of cytokinins auxins and triacontanol
(TANTOS et al 1999)
The aim of this work is to develop a
micropropagation method in order to obtain a significant
number of monoclonal plants for further field cultivation
comparing the essential oil content and composition
between micropropagated and field-grown plants
MATERIALS AND METHODS
Plant material
Representative specimens from field grown plants
of M officinalis were selected and submitted to Erika Von
Sohsten Medeiros and Angela Vaz (Rio de Janeiro
Botanical Garden) for the taxonomic confirmation A
voucher nordm RB ndash 365926 is deposited at the Herbarium of
Rio de Janeiro Botanic Garden
Melissa officinalis seeds were obtained from
commercial market ISLAR batch Nordm 8250 The seeds were
germinated and grown to the seedling stage in vitro Seeds
were pre-treated by immersion into 2 commercial bleach
solution (Globoacirc) for 20 min and then rinsed thoroughly
in running tap water After that the seeds were surface
sterilized in 70 ethanol for 20 min followed by 15 min in a
20 commercial bleach solution containing 2-3 drops of
Tween 20 under aseptic conditions and rinsed three times
with sterile distilled water The seeds were cultured on MS
(MURASHIGE amp SKOOG 1962) solid medium
supplemented with 30 gL-1 sucrose 148 mM thiamine-
HCl 243 mM pyridoxine-HCl 41 mM nicotinic acid and
06 mM myo-inositol The pH value was adjusted at 58 plusmn
01 before addition of 8 gL-1 of agar and the media were
sterilized in autoclave (120 degC during 15 min) The cultures
were incubed at 25 plusmn 1 degC under a 16 h light 8 h dark
regime at an irradiance of 230 mmolm-sup2s-1 (white light
illumination Sylvaniaacirc fluorescent tubes)
Establishment of in vitro shoot cultures
From in vitro 8-day-old germinated seeds plants
(20-30 cm in length) of three different clones designated
In vitro propagation of Melissa officinalis L and production 55
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
as clones 1 2 e 3 were selected and axillary shoot induction
takes place from nodal segments (1 cm in length)
subcultivated on MS hormone-free media (MS0) These
materials were used as donors of explants to be tested
with different culture media 05mM a-naphthaleneacetic
acid (NAA) 05mM kinetin (KIN) 05mM benzyladenine
(BA) 28 mM gibberellic acid (GA3) and 05mM indole-3-
acetic acid (IAA) Cultures were grown in 300 mL glass
flasks containing 40 ml of media each
Shoot proliferation rate length of both shoots and
roots and calli formation were monitored as growth
parameters Each treatment was replicated 3 times using
100 explants per repetition Subcultures were performed at
30 days intervals
Acclimatization
A total of 60 in vitro rooted microshoots (those grown
on MS + IAA during 30 days with average height of 10 cm
were removed from the medium and the agar washed gently
with tap water They were transferred to 60 cm diameter
plastic pots containing soil and humus (31 vv) and kept at
a greenhouse High humidity environment was provide by
covering the plants with a plastic foil and watering them
one time per day during the first 2 weeks Then plants were
gradually exposed to greenhouse conditions for 1 month
and finally transferred to the field where they were cultivated
during one year until complete life cycle
Extraction
Field-grown and fresh in vitro plantlets aerial parts
(100 g each) were submitted to hydro distillation for 140 h
in a Clevenger type apparatus as recommended by the
Brazilian Pharmacopoeia (1988) in replicate (n = 2) The
time between the isolation and analysis was the same in all
experiments to preclude differences in composition due to
external factors (SILVA et al 2003)
Gas chromatographic and gas chromatography-massspectrometric analysis
Gas chromatography with flame ionization
detection (GCFID) was carried out on a Varian Star Model
3350 instrument using a capillary column coated with DB-
5 (30 m x 025 mm i d 025 mm film thickness J amp W
Scientific Folsom CA USA) The GC oven was heated
using the following program 40 oC to 220 oC at 4 oC min-1
with an initial isothermal period of 1 min splitless The
detector and injector temperatures were held at 280 oC
Hydrogen was used as carrier gas The injection consisted
of 10 microL of distilled oil diluted with hexane The GCMS
analyses were carried out on a Hewlett-Packard (Agilent
Technologies Avondale USA) Model 5972 MSD coupled
to a HP 5890 GC The GC conditions were the same as
above except for the fact that helium was used as carrier
gas The mass spectrometer was operated on electron
impact mode at 70 eV Molecular assignments were
performed with the help of the Wiley 275 standard library
of mass spectra literature data (ADAMS 1995) authentic
geraniol standard (Sigma Part Number G5135) and mass
spectra interpretation besides the comparison with
previously published elution order (KREIS amp MOSAND
1994) Quantification was performed from GC profiles using
area percent since in the literature the FID response factor
for most of monoterpenes is determined as 1 (CARNAT et
al 1999)
Statistical analysis
Data for each experiment were subjected to analysis
of variance (ANOVA) and means were compared using the
Tukey-Kramer test Percent data were submitted to
significance test ndash difference between two percentages
using the Statistica for WindowsTM 50 version A
significance level of 5 was used for all statistical analysis
RESULTS AND DISCUSSION
In vitro multiplication of Melissa officinalis was
followed during four developing cycles Micropropagation
papers usually present an efficient protocol evaluated in
only one developing cycle This kind of protocol however
may fail when the cultures have to be kept during long
time many successive subcultures being necessary in
order to produce large number of clonal plants
SILVA S da et al56
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
In vitro establishment
In this work three different clones of M officinalis
were used and they had shown similar development
responses on in vitro cultures
The clones 1 and 2 had in vitro multiplication rate
lower than the clone 3 which means a decrease in the
absolute number of nodal segments (Fig 1A and B) From
these results the clone 3 was selected to run the tests
The average number of four new nodes was
produced by explant on MS0 after 30 days and this value
was used as a control to evaluate effects of the presence
of growth regulators in the media (Tab 1)
FIGURE 1 ndash Nodal segments development of three clones of Melissa officinalis on MS+ 05 M IAA during 30 daysA) Multiplication rate of in vitro culture from 2nd to 4th subcultures B) Number of nodal segments developed per clone
TABLE 1 ndash Effect of growth regulators in Melissa officinalis axillary segments culture after four weeks of culture
Culture Media
Shoot Explant
xplusmnse
Shoot Length (CM)
Multiplication Rate (ndeg of
Nodal Segment Explant)
Node Plantlet
xplusmnse
Root Frequency
()
Root Number
Explant xplusmnse
Root Length
(CM) xplusmnse
MS0 171B 403 08B 68C 41 B 50 105 11B 30 06B
05 M KIN 111C 349 11C 33D 31 C 50 073 09C 27 07C
28 M GA3 111C 100 03D 22E 21 D 50 071 09C 25 07C
05 M IAA 191B 1000 09A 95B 51 A 100 897 08A 137 08A
05 M NAA
301A 333 16C 90A 31 C 0 0 - 05 M BA 111C 385 54C 33D 31 C 0 0 -
Value are means (x) plusmn standard error (se) n=100 Values in the same column followed by the same letter do not differstatistically at Pdrdquo005
The influence of plant growth regulators and their
interactions on micropropagation of different plant species
have been discussed in detail by Lameira et al (2005) Rout
et al (1989) Rout amp Das (1997ab) Skirvin et al (1990) and
Zieslin et al (1989)
In this work addition of IAA to MS presented the
best results among all tested growth regulators in all
evaluated parameters However to shoot production there
is no statistical difference to the control The analysis of
effects of the other growth regulators shows that only
05mM NAA was able to improve shoot production
although it is not able to promote rhizogenesis
In vitro propagation of Melissa officinalis L and production 57
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
The use of MS plus 05mM Kinetin or 05mM BA
or 05mM NAA promoted the development of three nodal
segments per elongated plant in 30 days culture (Tab
1) However when BA was used these new shoots
exhibited apical necrosis When GA3 (28 mM) was added
to medium there was induction of only one shoot per
explant and after 30 days there were 2 nodes per
elongated shoot
There was no rooting in explants placed on MS
added of NAA and BA In MS medium containing KIN or
GA3
and in basic MS 50 of the shoots developed new
roots in 30 days of culture
The best result of rhizogenesis was presented
by explants cultured in MS plus IAA where 100 of
shoots rooted with more than 8 new roots per explant
(Tab 1) In terms of root length the cultures in MS
supplemented with IAA presented longer roots when
compared with the other media compositions used at
the present work
In short the addition of 05mM of IAA was chosen
as that presenting the best results in all evaluated
parameters (Fig 2A)
The action of IAA on the in vitro plant
development was in accordance to the known effects of
such hormone (CLELAND 1995) Shoot elongation was
obtained concomitantly with rooting in media MS plus
05 mM IAA That is specially interesting once it may
reduce the micropropagation process through nodal
segments explants to only three steps germination
shoot elongation and multiplication concomitant to
rooting this represents gain of time culture medium
and constitutes a quick micropropagation process
Tavares et al (1996) reported a micropropagation
utilizing cotyledonary nodes as explants The highest
average number of shoots in the two inoculations was
obtained with 2 mgL-1 of BA 24 axillary shoots per
explant 7 in the first inoculation and 17 in the second
one Shoots of the two inoculations were excised after
30 and 60 days respectively
Acclimatization
Melissa officinalis leaves are very sensitive to
water loss and this process is irreversible it was necessary
to provide a high humidity environment during the first
acclimatization period plants were covered with a plastic
foil during 2 weeks before being gradually exposed to
greenhouse conditions The acclimatization procedure
used for in vitro plants was successful and a total of 100
survival rate (n=60) was obtained Acclimatized plants
appeared normal and did not exhibit any morphological
abnormalities or variations These results permitted the
soil cultivation (Fig 2B) without chemical defensives
during one year up to the complete vegetative cycle
(flowering)
Essential oils content
Comparative analysis of the chromatographic
profiles showed high percentage of neral and geranial in
relation to nerol and geraniol in field grown (ex vitro)
plantlets and in MS0 (in vitro)
The relative content of the principal components
of essential oil of the aerial parts of M officinalis are
presented as mean peaks area () on Fig 2C geranial
(3813 and 4364) neral (2674 and 317) geraniol (329 and
153) and nerol (116 and 187) in plants cultured ex vitro
and in vitro respectively Plantlets developed in vitro on
MS0 media showed an increase of 14 times in the
proportion of nerol and 41 times of geraniol when
compared with ex vitro cultured plants
Field plants are exposed to considerable more
stressful conditions such as lower relative humidity higher
light levels and herbivory those are the more stressful
The latter conditions tend to favor a greater essential oil
accumulation (TAVARES et al 2004) On other hand
plantlets grown in vitro have been continuously exposed
to a unique microenvironment that has been selected to
provide minimal stress and nearly optimal conditions for
plant multiplication
SILVA S da et al58
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
FIGURE 2 ndash A) In vitro culture of Melissa officinalis on MS + IAA in 30 days of culture B) Ex vitro culture six monthsafter transference to soil maximum height 60 cm C) Composition and percentage of the most abundant essential oilcomponents of Melissa officinalis from aerial parts (100 g Fresh Weight) from in vitro e ex vitro culture
In vitro propagation of Melissa officinalis L and production 59
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
CONCLUSIONS
Melissa officinalis micropropagation can be made
using nodal segments from in vitro plants during 5 weeks
in MS media without growth regulators and posterior
subculture in MS media with 05 mM IAA for a better
development Multiplication rates of 44 and 40 were
obtained at the 3rd and 4th subcultures respectively
It was observed a significant difference between
the effects of auxins IAA and NAA The latter exerted an
unsatisfactory influence on the nodal segment formation
shoot length and rooting when compared with the results
obtained with IAA
The plants produced in vitro were vigorous and
after acclimatization they were well adapted After 1 month
at the greenhouse the survival rate was 100
Considering that the main objective of this work is
to produce monoclonal plants to be used by phytomedicine
industries it is important that the method presents a large
number of buds per explant This result plus an efficient
acclimatization stage can save time and produce
monoclonal plants in sufficient number to be used in
commercial field culture Our results showed a change in
the essential oil composition in the proportion of active
compounds However the characteristics of the oil of in
vitro and ex vitro M officinalis plants were not altered
The manipulation of the culture media composition
is an important biotechnological tool for the optimization
of the essential oils production With this technique this
work developed a protocol for highly production of plants
and productivity in the components (geraniol geranial and
neral) of the oil
ACKNOWLEDGMENTS
This work was supported by ICUNIRIO FAPERJ
and CNPq
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Crescimento in vitro de Laelia tenebrosa (Orchidaceae) 61
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
CRESCIMENTO IN VITRO DE Laelia tenebrosa (ORCHIDACEAE)EM DIFERENTES CONCENTRACcedilOtildeES DE SAIS DE KNUDSON C
E CARVAtildeO ATIVADO
IN VITRO GROWTH OF Laelia tenebrosa (ORCHIDACEAE) IN DIFFERENTCONCENTRATIONS OF KNUDSON C SALTS AND ACTIVATED CHARCOAL
APARECIDA GOMES DE ARAUJO1 MOACIR PASQUAL2 ALBA REGINA PEREIRA3HERMINIO SOUZA ROCHA4
1Doutoranda em AgronomiaFitotecnia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash agaraujo2003yahoocombr2Dr Professor Titular do Departamento de Agricultura ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash LavrasMG ndash mpasqualuflabr3Doutoranda no Jardim Botacircnico do Rio de Janeiro ndash ENBTJBRJ ndash Pacheco Leatildeo 915 ndash 22460-030 ndash Rio de Janeiro RJ4Doutorando em AgronomiaFitopatologia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash herminiouflanetcombr
RESUMOObjetivou-se testar diferentes concentraccedilotildees de carvatildeo
ativado adicionado ao meio Knudson C no crescimento in vitrode orquiacutedeas Placircntulas de Laelia tenebrosa (LA Rolfe) LARolfe com 1 a 15 cm de comprimento e contendo raiacutezes foraminoculadas em frascos contendo 40 mL de meio de cultura Ostratamentos consistiram na combinaccedilatildeo de concentraccedilotildees de carvatildeoativado (0 05 10 20 e 40 g L-1) e sais minerais de Knudson C(0 50 100 150 e 200) acrescidos de sacarose (20 g L-1) Omeio foi solidificado com 6 g L-1de aacutegar e o pH ajustado para58plusmn01 antes da autoclavagem a 121degC e 11 atm por 20 minutosApoacutes a inoculaccedilatildeo os frascos foram mantidos sob 25 plusmn 1degCfotoperiacuteodo de 16 horas e 32 mM m-2 s-1 de irradiacircncia Apoacutes 150dias verificou-se que a adiccedilatildeo de 2g L-1 de carvatildeo ativado ao meiocom metade dos sais de Knudson C promoveu melhor crescimentoin vitro das placircntulas de Laelia tenebrosa
Termos para indexaccedilatildeo Orquiacutedea meio de cultura cultura detecidos
ABSTRACTThe objective of this work was to test the effect of
Knudson C medium supplemented with different concentrationsof activated charcoal on the in vitro growth of orchids Plantletsof the Laelia tenebrosa (LA Rolfe) LA Rolfe measuring 1-15cm in length containing roots were inoculated in flasks containing40 mL of culture medium The treatments consisted of differentconcentrations of activated charcoal (0 05 10 20 and 40 g L-
1) combined with Knudson C salts (0 50 100 150 and 200)supplemented with sucrose (20 g L-1) The medium was solidifiedwith agar (6 g L-1) and pH adjusted to 58plusmn01 before autoclavingat 121ordmC and 11 atm during 20 minutes After inoculation theexplants were transferred to culture rooms with temperaturemaintained at 25plusmn1ordmC during a 16 hours photoperiod with a lightintensity of 32 microM m-2s-1 The best in vitro growth rates of
Laelia tenebrosa plantlets were obtained using Knudson C 50supplemented with 2 g L-1 activated charcoal after 150 days ofculture
Index terms Orchid culture medium tissue culture
INTRODUCcedilAtildeO
A produccedilatildeo de orquiacutedeas a partir germinaccedilatildeo
assimbioacutetica eacute uma alternativa viaacutevel para obtenccedilatildeo de
grande nuacutemero de plantas em curto espaccedilo de tempo
suprindo assim a necessidade dos produtores de
orquiacutedeas na aquisiccedilatildeo de mudas
Na cultura de tecidos os meios de cultura
geralmente satildeo compostos de uma fonte de carboidratos
macro e micronutrientes e outras substacircncias como
vitaminas aminoaacutecidos accediluacutecares agente solidificante
reguladores de crescimento (GEORGE amp SHERRINGTON
1984) e eventualmente aditivos como antibioacuteticos carvatildeo
ativado e componentes complexos
Knudson (1922) observou que era possiacutevel o
cultivo de sementes em meio artificial contendo minerais e
accediluacutecar sem a presenccedila de fungos micorriacutezicos
Posteriormente em 1946 ele aperfeiccediloou esse meio de
cultura sendo atualmente o mais utilizado comercialmente
na germinaccedilatildeo e desenvolvimento de orquiacutedeas (ARDITTI
amp ERNST 1992) No entanto satildeo necessaacuterios estudos
(Recebido em 23 de fevereiro de 2006 e aprovado em 10 de julho de 2006)
supplemented with
ARAUJO A G de et al62
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
pois satildeo descritos vaacuterios meios de cultura para muitos
gecircneros e espeacutecies diferentes
No cultivo e subcultivo de placircntulas do gecircnero
Cattleya George et al (1987) sugerem o meio Knudson C
(1946) ou Reinert amp Mohr (1967) Segundo Arditti amp Ernst
(1992) os meios de propagaccedilatildeo para Cattleya Laelia
Laeliocattleya e Brassocattleya podem ser os mesmos
citados anteriormente Villalobos et al (1994) sugerem o
meio Vacin amp Went (1949) para Cattleya Encyclia e
Oncidium suplementado com 25 de aacutegua de coco e o
meio Knudson C suplementado com 60 g L-1 de polpa de
banana para orquiacutedeas do gecircnero Stanhopea
O carvatildeo ativado normalmente eacute adicionado ao meio
de cultura em concentraccedilotildees que variam de 02 a 3
(BEYL 2000) O seu efeito natildeo-seletivo pode proporcionar
resultados negativos na micropropagaccedilatildeo Pesquisas
relatam a adsorccedilatildeo de tiamina aacutecido nicotiacutenico
(WEATHERHEAD et al 1978) piridoxina aacutecido foacutelico
reguladores de crescimento e quelatos de ferro
(JOHANSSON et al 1990) Entre os efeitos proporcionados
pela adiccedilatildeo do carvatildeo ativado ao meio de cultura
principalmente agrave organogecircnese e agrave embriogecircnese estatildeo
escurecimento do meio de cultura favorecendo o
enraizamento adsorccedilatildeo de substacircncias inibitoacuterias
produzidas pelo proacuteprio meio ou explante adsorccedilatildeo de
reguladores de crescimento e outros compostos orgacircnicos
e liberaccedilatildeo de substacircncias naturalmente presentes no
carvatildeo que beneficiariam o crescimento in vitro das culturas
(PAN amp STADEN 1998)
Arena amp Pastur (2001) citam que a adiccedilatildeo de carvatildeo
ativado ao meio de cultura promoveu alongamento das
brotaccedilotildees de Berberis buxifolia mas reduziu o iacutendice de
multiplicaccedilatildeo Hazra et al (2002) relataram o efeito
sinergiacutestico do carvatildeo ativado na multiplicaccedilatildeo e
enraizamento de brotaccedilotildees de algodoeiro Amin amp Jaiswal
(1987) Anderson (1980) e Damiano (1978) relataram o efeito
favoraacutevel do carvatildeo quando utilizado em baixas
concentraccedilotildees no enraizamento de brotaccedilotildees de
morangueiro framboeseira e goiabeira respectivamente
A diversidade de resultados obtidos com a utilizaccedilatildeo de
carvatildeo ativado deve-se principalmente ao genoacutetipo da
espeacutecie em questatildeo agrave adsorccedilatildeo de algumas substacircncias
quiacutemicas e compostos orgacircnicos aleacutem de metaboacutelitos
toacutexicos liberados no cultivo in vitro (Wang amp Huang 1976)
Este trabalho teve como objetivo verificar efeito de
diferentes concentraccedilotildees de sais de Knudson C e carvatildeo
ativado sobre o crescimento in vitro de placircntulas de
orquiacutedea da espeacutecie Laelia tenebrosa (LA Rolfe) LA Rolfe
MATERIAL E MEacuteTODOS
Placircntulas da espeacutecie Laelia tenebrosa com 1 a 15
cm de comprimento oriundas de sementes germinadas in
vitro e contendo raiacutezes foram inoculadas em frascos
contendo 40 mL do meio de cultura Knudson C nas
concentraccedilotildees de 0 (apenas aacutegua destilada e aacutegar) 50 100
(concentraccedilatildeo da formulaccedilatildeo original) 150 e 200 de sais
minerais combinado com carvatildeo ativado (0 05 1 2 e 4
mg L-1) suplementado com sacarose (20 g L-1)
O pH do meio foi ajustado para 58 plusmn 01 antes da
adiccedilatildeo de aacutegar (6 g L-1) O meio foi vertido em frascos de
vidro com capacidade para 250 cm3 vedados com tampas
plaacutesticas transluacutecidas natildeo perfuradas e autoclavados agrave
pressatildeo de 11 atm e agrave temperatura do 121degC durante 20
minutos Apoacutes a inoculaccedilatildeo os frascos contendo os
explantes foram mantidos em sala de crescimento com
irradiacircncia em torno de 32 mmol m-2 s-1 temperatura de 25 plusmn
1degC e fotoperiacuteodo de 16 horas
O delineamento experimental utilizado foi
inteiramente casualizado em esquema fatorial 5 x 5 com
quatro repeticcedilotildees de cinco placircntulas cada uma Decorridos
150 dias avaliou-se a meacutedia do nuacutemero de folhas nuacutemero
de raiacutezes comprimento da maior raiz comprimento da parte
aeacuterea e massa fresca de placircntulas Os dados foram
comparados por meio de regressatildeo polinomial empregando-
se o programa Sisvar (FERREIRA 2000)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Apenas para a variaacutevel nuacutemero de folhas houve
interaccedilatildeo entre os niacuteveis de sais e carvatildeo ativado Poreacutem
Crescimento in vitro de Laelia tenebrosa (Orchidaceae) 63
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
por meio do teste F somente as concentraccedilotildees de 50 e
100 de sais do meio Knudson C foram significativas em
relaccedilatildeo agraves concentraccedilotildees de carvatildeo ativado
Os melhores resultados (65 e 585) foram
verificados com 50 (metade) dos sais de Knudson C
combinado com 275 g L-1 de carvatildeo ativado e 100 de
sais com 4 g L-1 de carvatildeo respectivamente (Figura 1)
Com o aumento da concentraccedilatildeo do meio de cultura haacute
necessidade de maior concentraccedilatildeo de carvatildeo Sendo
assim o meio com 50 de sais aleacutem de proporcionar
melhores resultados eacute menos oneroso
Estes resultados contradizem os de Silva et al
(2003) que verificaram que a adiccedilatildeo de carvatildeo ativado ao
FIGURA 1 ndash Nuacutemero de folhas em placircntulas de Laeliatenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees de saisde Knudson C e carvatildeo ativado
meio de cultura inibe a formaccedilatildeo de folhas em placircntulas de
Brassocattleya lsquoPastoralrsquo x Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo
O efeito natildeo seletivo do carvatildeo ativado pode proporcionar
resultados negativos na micropropagaccedilatildeo (PAN amp
STADEN 1998)
Agrave medida em que aumentaram as concentraccedilotildees de
sais de Knudson C maiores quantidades de raiacutezes foram
formadas (Figura 2A) Observou-se maior nuacutemero de raiz
(43) com 965 de sais Para o fator carvatildeo ativado as
melhores respostas (395 raiacutezes) foram verificadas com a
utilizaccedilatildeo de 304 g L-1 adicionadas ao meio de cultura
(Figura 2B)
Para muitas espeacutecies o enraizamento eacute favorecido
pela adiccedilatildeo de carvatildeo ativado ao meio de cultura Hazra et
al (2002) relataram o efeito sinergiacutestico do carvatildeo ativado
na multiplicaccedilatildeo e enraizamento de brotaccedilotildees de
algodoeiro O meio MS com metade dos sais minerais
acrescido de 20 g L-1 de sacarose 7 g L-1 de aacutegar e 1 g L-1 de
carvatildeo ativado promoveu maior quantidade de raiacutezes em
placircntulas de Cattleya nobilior Rchb f (REIS et al 2003)
Segundo Paiva et al (2005) aleacutem de um equiliacutebrio
hormonal favoraacutevel agrave formaccedilatildeo de raiacutezes outros fatores
internos tecircm sido relacionados com a iniciaccedilatildeo do processo
de enraizamento como presenccedila de sacarose alta relaccedilatildeo
CN e nutrientes minerais (foacutesforo caacutelcio zinco e boro) O
meio Knudson C natildeo possui micronutrientes apresenta
uma concentraccedilatildeo maior de caacutelcio e tem baixas
FIGURA 2 ndash Nuacutemero de raiacutezes em placircntulas de Laelia tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees de sais deKnudson C (A) e concentraccedilotildees de carvatildeo ativado (B)
ARAUJO A G de et al64
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
concentraccedilotildees de N e K em relaccedilatildeo ao MS e WPM o que
provavelmente favoreceu tanto o nuacutemero quanto o
comprimento de raiacutezes (PASQUAL 2001)
O maior comprimento de raiz (331 cm) foi verificado
com a utilizaccedilatildeo de 100 de sais de Knudson C A partir do
ponto maacuteximo (100) houve diminuiccedilatildeo do comprimento
radicular provavelmente devido ao desbalanccedilo nutricional
(Figura 3A) Com o aumento das concentraccedilotildees de carvatildeo
ativado houve um incremento linear no comprimento de
raiacutezes Melhores resultados foram observados com a
utilizaccedilatildeo de 4 g Lndash1 de carvatildeo ativado (Figura 3B) Como a
relaccedilatildeo foi direta pode-se inferir que o efeito estimulante
do carvatildeo ativado no comprimento da maior raiz continuaria
para concentraccedilotildees superiores a 4 g L-1
A adiccedilatildeo de carvatildeo ativado no meio de cultura foi
beneacutefica promovendo tanto o nuacutemero quanto o
crescimento de raiacutezes O carvatildeo conteacutem impurezas que
podem favorecer o crescimento de raiacutezes jaacute existentes e
induzir emissatildeo de novas raiacutezes (PASQUAL 2001)
Melhores resultados para comprimento da parte
aeacuterea (18 cm) foram observados quando se utilizou o
meio Knudson C na concentraccedilatildeo de 121 de sais (Figura
4A) poreacutem na concentraccedilatildeo de 50 obtiveram-se
explantes com 17 cm de comprimento Essa diferenccedila
observada (01 cm) eacute muito pequena o que natildeo justifica a
utilizaccedilatildeo de um meio mais concentrado mas a reduccedilatildeo
do mesmo agrave sua metade
O enraizamento in vitro pode ser favorecido com o
uso de meio de cultura com a metade ou 75 da
concentraccedilatildeo normal de sais Em algumas espeacutecies altas
concentraccedilotildees de sais principalmente a presenccedila de iacuteons
amocircnio favorecem o desenvolvimento de raiacutezes enquanto
que em outras podem ser inibidoras (PASQUAL et al
2001)
O maior comprimento da parte aeacuterea (19 cm) foi
obtido na presenccedila de 4 g Lndash1 de carvatildeo ativado (Figura
4B) a concentraccedilatildeo de 2 g Lndash1 proporcionou um
comprimento de 18 cm Comparando-se os niacuteveis 4 e 2 g Lndash1
de carvatildeo ativado nota-se pequena diferenccedila (01 cm) o
que justifica a utilizaccedilatildeo de 2 g Lndash1
O carvatildeo ativado conteacutem impurezas que quando
liberadas no meio de cultura podem beneficiar ou natildeo o
crescimento in vitro Simotildees et al (1999) verificaram que a
concentraccedilatildeo de 1 g L-1 de carvatildeo ativado acrescida ao
meio Knudson C proporciona o melhor desenvolvimento
de brotos de Epidendrum sp e Dendrobium sp
Maior massa fresca de placircntulas (0144g) foi
verificada com a utilizaccedilatildeo de 50 de sais de Knudson C
ponto a partir do qual houve diminuiccedilatildeo no peso (Figura
5A) Provavelmente essa reduccedilatildeo ocorreu devido agrave
toxidez
A utilizaccedilatildeo de 4 g L-1 de carvatildeo ativado
proporcionou uma massa de 0185 g nas placircntulas frescas
(Figura 5B)
FIGURA 3 ndash Comprimento da maior raiz em placircntulas de Laelia tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees desais de Knudson C (A) e carvatildeo ativado (B)
Crescimento in vitro de Laelia tenebrosa (Orchidaceae) 65
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
FIGURA 4 ndash Comprimento da parte aeacuterea em placircntulas de Laelia tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees desais de Knudson C (A) e carvatildeo ativado (B)
FIGURA 5 ndash Massa fresca de placircntulas de L tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees de sais de Knudson C(A) e carvatildeo ativado (B)
O carvatildeo ativado eacute comumente utilizado na cultura
de tecidos de plantas Seu efeito eacute atribuiacutedo agrave adsorccedilatildeo de
substacircncias toacutexicas produzidas pelas plantas adsorccedilatildeo
de fitorreguladores do meio e escurecimento do meio onde
se desenvolvem as raiacutezes das plantas (GEORGE 1993)
O melhor desenvolvimento de Phalaenopsis in
vitro ocorreu na presenccedila de carvatildeo ativado na
concentraccedilatildeo de 2 g L-1 indicando que este possa ser um
elemento importante no processo (BRESSAN et al 1999)
Apesar do carvatildeo ativado na concentraccedilatildeo de 4 g
L-1 ter proporcionado melhores resultados verificou-se que
na concentraccedilatildeo de 2 g L-1 os efeitos apresentam uma
diferenccedila miacutenima Embora o carvatildeo ativado natildeo seja o
componente de maior custo no preparo de meio de cultura
a sua reduccedilatildeo juntamente com os sais minerais eacute
economicamente favoraacutevel especialmente para a produccedilatildeo
comercial de mudas
CONCLUSAtildeO
A adiccedilatildeo de 2 g L-1 de carvatildeo ativado ao meio de
cultura Knudson C com metade (50) de sais minerais
promoveu melhor crescimento em placircntulas de Laelia
tenebrosa cultivadas in vitro
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PROPAGACcedilAtildeO IN VITRO DE PLAcircNTULAS DE ORQUIacuteDEA EMDIFERENTES MEIOS DE CULTURA E CONCENTRACcedilOtildeES
DE CITOCININA
IN VITRO PROPAGATION OF ORCHID PLANTLETS CULTIVATED IN DIFFERENTCULTURE MEDIA AND CYTOKININ CONCENTRATIONS
APARECIDA GOMES DE ARAUJO1 MOACIR PASQUAL2 ADRIANO BORTOLOTTI DA SILVA3 FABIacuteOLA VILLA3 HERMIacuteNIO SOUZA ROCHA3 FERNANDA CARVALHO COSTA4
1Doutoranda em AgronomiaFitotecnia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash agaraujo2003yahoocombr2Professor Titular Departamento AgriculturaDAG ndash Universidade Federal de Lavras UFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200000 ndash Lavras MG ndash mpasqualuflabr3Doutorando em Agronomia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200000 ndash Lavras MG4Departamento de AgriculturaDAG ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash fecostapuryahoocombr
RESUMOA taxa de multiplicaccedilatildeo de orquiacutedeas a partir de meacutetodos
convencionais eacute bastante baixa natildeo atendendo as necessidadescomerciais A cultura de tecidos permite maiores taxas demultiplicaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de plantas uniformes e sadiasObjetivou-se estudar a influecircncia da citocinina BAP (6-benzilaminopurina) em diferentes meios de cultura napropagaccedilatildeo in vitro de placircntulas hiacutebridas de BrassocattleyalsquoPastoralrsquox Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo Placircntulas comaproximadamente 15plusmn05 cm de comprimento obtidasassimbioticamente foram transferidas para frascos comcapacidade de 250 cm3 contendo 40 mL das formulaccedilotildees salinasde MS WPM e Knudson C combinados com 0 05 10 20 e40 mg L-1 de BAP acrescidos de 2 g L-1 de carvatildeo ativadosolidificado com 6 g L-1 de aacutegar e pH ajustado para 58plusmn01Apoacutes a inoculaccedilatildeo os frascos foram incubados a 25plusmn2oC 35igravemolm-2s-1 de intensidade luminosa e sob fotoperiacuteodo de 16horas Apoacutes 90 dias observou-se que melhores resultados parapropagaccedilatildeo in vitro em placircntulas de orquiacutedea Bc lsquoPastoralrsquo x LclsquoAmber Glowrsquo satildeo obtidos com o meio WPM A suplementaccedilatildeode 4 mg L-1 de BAP no meio WPM favorece o crescimento invitro Para a multiplicaccedilatildeo maior quantidade de brotos eacuteconseguida em meio MS na ausecircncia de BAP
Termos para indexaccedilatildeo Orquiacutedea crescimento in vitrocitocinina
ABSTRACTThe multiplication rate of orchids by conventional
methods is considerably low and does not attend its commercialneeds Tissue culture results in larger multiplication rates andproduces uniform and healthy orchid plantlets The objective ofthis work was to study the influence of the cytokinin BAP (6-benzilaminopurine) in different culture media for ther in vitropropagation of Brassocattleya lsquoPastoralrsquox Laeliocattleya lsquoAmberGlowrsquo hybrid plantlets Plantlets measuring approximately 15plusmn 05 cm length deriving from in vitro germination were inoculated
in flasks of 250 cm3 volume containing 40 mL MS WPM andKnudson C salt formulations combined with BAP (0 05 1 2and 4 mg L-1) supplemented with 2 g L-1 activated charcoalsolidified with 6 g L-1 agar and pH adjusted for 58 plusmn 01 Afterthe inoculation the plantlets maintained in a growth room at25plusmn2ordmC 35 mMol m-2 s-1 light intensity and 16 hoursphotoperiod After 90 days the best results for the in vitropropagation of orchid plantlets Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquowere obtained with half strength WPM The supplementation of4 mg L-1 BAP to the WPM medium favors in vitro growth Forthe multiplication phase the largest number of sprouts is achievedwith full strength MS medium in the absence of BAP
Index terms Orchid in vitro growth cytokinin
INTRODUCcedilAtildeO
As orquiacutedeas satildeo consideradas as plantas
ornamentais haacute mais tempo cultivadas pelo homem
Pertencem agrave famiacutelia Orchidaceae a maior entre as
monocotiledocircneas e tambeacutem entre as plantas ornamentais
com 600 - 800 gecircneros e 25000-35000 espeacutecies (SHEEHAN
1983) totalizando 7 das plantas ornamentais do mundo
(Van Der PIJL amp DODSON 1966)
A propagaccedilatildeo de orquiacutedeas pode ser tanto
vegetativa quanto por meio de sementes Estas embora
produzidas em grande quantidade natildeo possuem
endosperma funcional prescindindo para tanto da
associaccedilatildeo simbioacutetica com fungos micorriacutezicos dentre os
quais a Rhizoctonia que eacute um dos gecircneros mais importante
(PIERIK 1987 SHEEHAN 1983)
(Recebido em 08 de dezembro de 2005 e aprovado em 10 de julho de 2006)
Propagaccedilatildeo in vitro de placircntulas de orquiacutedea 69
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 68-73 2006
Knudson (1922) observou que era possiacutevel o cultivo
de sementes em meio artificial contendo apenas sais
nutritivos e accediluacutecar na ausecircncia de fungos Posteriormente
em 1946 o mesmo autor aperfeiccediloou este meio de cultura
sendo atualmente um dos mais utilizados comercialmente
na germinaccedilatildeo e desenvolvimento de orquiacutedeas (ARDITTI
amp ERNST 1992) No entanto satildeo necessaacuterios estudos
pois satildeo descritos vaacuterios meios de cultura para muitos
gecircneros e espeacutecies diferentes O meio de cultura mais
utilizado na cultura de tecidos em geral eacute o MS (Murashige
amp Skoog 1962) podendo-se encontrar o uso de outros
meios como Knudson C (1946) e WPM (Wood Plant
Medium) de Loyd amp McCown (1980)
Reguladores de crescimento em diferentes
concentraccedilotildees tecircm sido usados conforme a espeacutecie e a
metodologia utilizada Podem ser necessaacuterios para a
germinaccedilatildeo de sementes formaccedilatildeo de calos e brotaccedilotildees
adventiacutecias (GRATTAPAGLIA amp MACHADO 1998
PASQUAL 2001)
O regulador de crescimento BAP (6-
benzilaminopurina) eacute uma citocinina largamente utilizada
para estimular a induccedilatildeo de brotos em plantas ornamentais
Para o cultivo in vitro de orquiacutedeas do grupo Cattleya a
citocinina BAP geralmente eacute utilizada nas concentraccedilotildees
que variam entre 005 e 10 mg L-1 (CARVALHO 2002)
Martini et al (2001) trabalhando com a orquiacutedea
Gongora quinquenervis observaram que a presenccedila do
BAP inibe a multiplicaccedilatildeo de calos e o potencial
organogecircnico Silva (2003) concluiu que para o estaacutedio de
subcultivo de Brassocattleya lsquoPastoralrsquo x Laeliocattleya
lsquoAmber Glowrsquo natildeo haacute necessidade da adiccedilatildeo de BAP como
estiacutemulo ao desenvolvimento geral do explante Melhor
proliferaccedilatildeo de brotos formaccedilatildeo de raiacutezes nuacutemero de
folhas e comprimento de brotos em Dendrobium foram
obtidos com 25 mg L-1 de BAP + 05 mg L-1 de ANA
adicionados ao meio MS (TALUKDER et al 2003)
Aleacutem do tipo de meio outro aspecto importante na
multiplicaccedilatildeo in vitro estaacute relacionado com o tipo de
citocinina e sua concentraccedilatildeo sendo ambos determinantes
no sucesso da micropropagaccedilatildeo (GRATTAPAGLIA amp
MACHADO 1998)
O maior entrave no processo de micropropagaccedilatildeo
de orquiacutedeas estaacute relacionado ao tempo necessaacuterio para a
produccedilatildeo de mudas a partir de plantas hiacutebridas
selecionadas e a utilizaccedilatildeo de meio de cultura adequado
para cada espeacutecie Assim objetivou-se estudar o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de BAP e formulaccedilotildees de minerais
nutritivos em meios de cultura na propagaccedilatildeo in vitro de
placircntulas de orquiacutedea oriundas do hiacutebrido Brassocattleya
lsquoPastoralrsquo x Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo
MATERIAL E MEacuteTODOS
Placircntulas hiacutebridas oriundas de sementes
germinadas assimbioticamente em meio Knudson C
obtidas do cruzamento entre Brassocattleya lsquoPastoralrsquo x
Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo com aproximadamente
15plusmn05 cm de comprimento foram transferidas para frascos
de 250 cm3 de capacidade contendo 40 mL de meio de
cultura e vedados com tampas plaacutesticas transluacutecidas Os
tratamentos consistiram de diferentes formulaccedilotildees salinas
(MS WPM e Knudson C em suas formulaccedilotildees originais)
combinadas com 0 05 10 20 e 40 mg L-1 de BAP
acrescidos de 2 g L-1 de carvatildeo ativado solidificado com
6 g L-1 de aacutegar e pH ajustado para 58plusmn01 antes da
autoclavagem obtida a 121ordmC e 1 atm por 20 minutos
Posteriormente agrave inoculaccedilatildeo os frascos foram
transferidos para sala de crescimento com temperatura
de 25plusmn2ordmC fotoperiacuteodo de 16 horas e 35 mmolm-2s-1 de
intensidade luminosa fornecida por lacircmpadas do tipo
(Grow-lux) e luz do dia especial O delineamento
experimental utilizado foi inteiramente casualizado no
esquema fatorial 3 x 5 com cinco repeticcedilotildees de quatro
placircntulas cada sendo cada repeticcedilatildeo composta por um
frasco
Apoacutes 90 dias da instalaccedilatildeo do experimento foram
avaliados nuacutemero meacutedio de brotos comprimento meacutedio
da parte aeacuterea nuacutemero meacutedio de raiacutezes nuacutemero meacutedio de
folhas e meacutedia da massa fresca total de placircntulas
ARAUJO A G de et al70
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 68-73 2006
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Para a variaacutevel nuacutemero de folhas natildeo houve
significacircncia dos fatores isolados nem da interaccedilatildeo entre
eles O nuacutemero de raiacutezes e massa fresca total de placircntulas
apresentaram significacircncia apenas para o fator meio de
cultura enquanto que para nuacutemero de brotos e
comprimento da parte aeacuterea a interaccedilatildeo dos fatores foi
significativa (Tabela 1)
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de brotos observou-se
interaccedilatildeo entre os fatores BAP e os meios de cultura
utilizados (Tabela 1) Poreacutem pelo teste F verificou-se que
apenas o meio MS foi significativo em relaccedilatildeo agraves
concentraccedilotildees de BAP (Figura 1)
O maior nuacutemero de brotos (334) foi registrado na
formulaccedilatildeo de MS adicionado de 40 mg L-1 de BAP
Entretanto na ausecircncia dessa citocinina foi observada a
formaccedilatildeo de 304 brotosplanta (Figura 1) Diante da
pequena diferenccedila na quantidade meacutedia de brotos
formados entre a maior concentraccedilatildeo e o tratamento sem
o regulador de crescimento justifica-se a utilizaccedilatildeo do
meio de cultura sem o BAP Estes resultados concordam
com Silva (2003) que obteve maior nuacutemero de brotos (2
brotos) na ausecircncia de BAP para esse mesmo hiacutebrido
poreacutem em meio Knudson C
A natildeo utilizaccedilatildeo de reguladores de crescimento
adicionados ao meio de cultura vai influenciar na
reduccedilatildeo dos custos de produccedilatildeo de mudas jaacute que esse
eacute um dos componentes mais onerosos Isso eacute
extremamente importante principalmente para
laboratoacuterios comerciais
TABELA 1 ndash Resumo da anaacutelise de variacircncia para as caracteriacutesticas meacutedias de nuacutemero de folhas (NF) nuacutemero de raiacutezes(NR) nuacutemero de brotos (NB) comprimento da parte aeacuterea (CPA) e massa fresca total de placircntulas (MFP) e respectivoscoeficientes de variaccedilatildeo (CV)
significativo a 1 e 5 de probabilidade respectivamente pelo teste F
FIGURA 1 ndash Efeito do meio de cultura MS e concentraccedilotildees de BAP no nuacutemero meacutedio de brotos em placircntulas hiacutebridasde Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo apoacutes 90 dias da incubaccedilatildeo
Fontes de variaccedilatildeo GL Quadrados meacutedios
NF NR NB CPA MFP Meios 2 125683 ns 162740 01483 ns 53139 02372 BAP 4 186198 ns 44693 ns 04408 ns 03373 ns 00075 ns
Meio x BAP 8 243984 ns 13417 ns 17417 13579 00459 ns
Resiacuteduo 45 124475 21329 05055 05961 00662 CV () 3467 3081 2801 2443 5100
Propagaccedilatildeo in vitro de placircntulas de orquiacutedea 71
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O estiacutemulo agrave brotaccedilatildeo em placircntulas de Spathoglottis
plicata Griff ocorreu em meio MS suplementado com 10
mg L-1 de BAP e 25 mg L-1 de ANA tendo o enraizamento
estimulado com 20 mg L-1 de AIB (NAYAK et al 1999)
TDZ tambeacutem eacute utilizado em associaccedilatildeo com BAP para
regeneraccedilatildeo de brotos de Rhynchostylis (BUI Le al 1999)
e de Anoectochilus (LI et al 1999) todas orquidaceaes
Observou-se interaccedilatildeo entre o tipo de meio de
cultura e o BAP no que diz respeito ao comprimento de
parte aeacuterea das placircntulas (Tabela 1) Pelo teste de F apenas
o meio WPM foi significativo em relaccedilatildeo agraves concentraccedilotildees
de BAP (Figura 2)
O maior comprimento da parte aeacuterea (47 cm) foi
observado quando se utilizou o meio WPM combinado
com 40 mg L-1 de BAP (Figura 2) Como a relaccedilatildeo foi direta
pode-se inferir que o efeito estimulatoacuterio do BAP sobre o
crescimento da parte aeacuterea continuaria mesmo em
concentraccedilotildees maiores que 40 mg L-1 Talukder et al (2003)
obtiveram melhor comprimento de brotos (0472 cm) em
placircntulas de Dendrobium com utilizaccedilatildeo de 25 mg L-1 de
BAP + 05 mg L-1 de ANA adicionados ao meio MS
Relativo ao nuacutemero meacutedio de raiacutezes houve
significacircncia apenas para o fator meio de cultura (Tabela 1)
Na Tabela 2 verifica-se que os maiores valores foram obtidos
com os meios WPM (557) seguido do MS (487) sendo os
menores valores verificados no meio Knudson C (378) A
emissatildeo de novas raiacutezes eacute favorecida pelo caacutelcio e pelo boro
O meio Knudson C apresenta uma concentraccedilatildeo maior de
caacutelcio e menor de boro em relaccedilatildeo aos meios MS e WPM
que possuem concentraccedilotildees semelhantes de ambos
Segundo Pierik (1987) em concentraccedilotildees mais elevadas
(1 a 10 mg L-1) as citocininas podem induzir a formaccedilatildeo de
gemas adventiacutecias quebrando a dominacircncia apical e retardando
a formaccedilatildeo de raiacutezes Talukder et al (2003) encontraram maior
nuacutemero de raiacutezes (193explante) em placircntulas de Dendrobium
com utilizaccedilatildeo de 25 mg L-1 de BAP + 05 mg L-1 de ANA
adicionados ao meio MS O estiacutemulo ao enraizamento em
Spathoglottis plicata ocorreu em meio MS suplementado com
20 mg L-1 de AIB (NAYAK et al 1999)
FIGURA 2 ndash Comprimento meacutedio da parte aeacuterea em placircntulas hiacutebridas Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo cultivadas emmeio de cultura WPM e diferentes concentraccedilotildees de BAP
TABELA 2 ndash Efeito de diferentes meios de cultura sobreo nuacutemero meacutedio de raiacutezes em placircntulas hiacutebridas de BclsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo
Meios de Cultura Nuacutemero meacutedio de raiacutezes
WPM 557 a MS 487 a KC 378 b
Meacutedias seguidas pela mesma letra natildeo diferem entre sipelo teste de Scott-Knott a 5
ARAUJO A G de et al72
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 68-73 2006
O efeito ora inibitoacuterio ora estimulatoacuterio dos
fitorreguladores na formaccedilatildeo de brotos e raiacutezes em
diferentes plantas pode estar associado agrave proacutepria
concentraccedilatildeo bem como a absorccedilatildeo dos reguladores de
crescimento pelo substrato (GEORGE 1996) agrave habituaccedilatildeo
(SANTANA amp PAIVA 2001) ou agrave deficiecircncia de proteiacutena
ligante promotora da atuaccedilatildeo das citocininas (TAIZ amp
ZEIGER 1998)
O nuacutemero de folhas natildeo apresentou diferenccedilas
significativas para os tratamentos estudados
isoladamente nem houve interaccedilatildeo entre eles (Tabela 1)
Talukder et al (2003) obtiveram maior nuacutemero de folhas
(425placircntula) em Dendrobium com utilizaccedilatildeo de 25 mg L-
1 de BAP + 05 mg L-1 de ANA adicionados ao meio MS
Para massa fresca de placircntulas houve significacircncia
apenas para o fator meio de cultura isoladamente (Tabela
1) Atraveacutes do teste de meacutedias constatou-se maior massa
de placircntulas frescas nos meios WPM e MS com 0524 e
0503g respectivamente Resultado inferior (0326g) foi
registrado em meio Knudson C (Tabela 3)
TABELA 3 ndash Efeito do meio de cultura na massa frescatotal de placircntulas do hiacutebrido Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmberGlowrsquo
Meios de Cultura Massa fresca total de placircntulas (g)
WPM 0524 a MS 0503 a KC 0326 b
Meacutedias seguidas pela mesma letra natildeo diferem entre sipelo teste de Scott-Knott a 5
Dignart (2003) estudando a germinaccedilatildeo in vitro
de sementes de Cattleya nobilior Rchbf em diferentes
meios de cultura (MS WPM Knudson C e B5 de
GAMBORG et al 1968) observou que natildeo houve
diferenccedilas entre os meios utilizados O BAP adicionado
ao meio de cultura provocou aumento da taxa de brotaccedilatildeo
a partir de 1 igravemolL
Segundo (PASQUAL 2001) os meios MS e WPM
possuem concentraccedilotildees similares de micronutrientes e satildeo
ricos em nitrogecircnio (N) e potaacutessio (K) Jaacute o meio Knudson C
natildeo possui micronutrientes e tem baixas concentraccedilotildees de
N e K em relaccedilatildeo ao MS e WPM Os melhores resultados
para as variaacuteveis analisadas foram observados em meio WPM
e MS Essa resposta provavelmente deveu-se ao fato de
que o meio Knudson C possui diferentes sais minerais e
embora seja muito utilizado na germinaccedilatildeo de sementes de
orquiacutedeas parece natildeo propiciar condiccedilotildees satisfatoacuterias para
o desenvolvimento de placircntulas de algumas espeacutecies de
orquiacutedeas
Sabe-se que existe uma relaccedilatildeo entre o nuacutemero de
brotos e seu tamanho e nessa relaccedilatildeo quanto maior for o
nuacutemero de brotos menor o tamanho dos mesmos
(GEORGE 1996) Essa relaccedilatildeo fez-se presente ateacute a
concentraccedilatildeo de 20 mg L-1 de BAP em Bc lsquoPastoralrsquo x Lc
lsquoAmber Glowrsquo No entanto em concentraccedilotildees superiores
tanto o nuacutemero quanto o comprimento dos brotos
aumentaram Tal diversidade de resultados estaacute
relacionada principalmente ao genoacutetipo da espeacutecie meio
de cultura e possivelmente agrave interferecircncia na accedilatildeo dos
reguladores de crescimento
Segundo Malaure et al (1991) diferentes efeitos
dos reguladores de crescimento podem ocorrer para
diferentes espeacutecies inclusive variaccedilotildees dentro de uma
mesma espeacutecie Em orquiacutedeas o efeito dos reguladores de
crescimento e de meios de cultura satildeo diversificados
principalmente quando se utiliza um hiacutebrido trigeneacuterico
com alto grau de heterozigose
CONCLUSOtildeES
Melhores resultados para propagaccedilatildeo in vitro de
placircntulas de orquiacutedea Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo satildeo
obtidos com o meio WPM A suplementaccedilatildeo de 4 mg L-1 de
BAP no meio WPM favorece o crescimento in vitro Para
a multiplicaccedilatildeo maior quantidade de brotos eacute conseguida
em meio MS na ausecircncia de BAP
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SILVEIRA D G et al74
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
EFEITO DO VIacuteRUS DAS ESTRIAS DA BANANEIRA NAMICROPROPAGACcedilAtildeO E NO CRESCIMENTO DAS PLANTAS DA
CULTIVAR CAIPIRA DURANTE A ACLIMATIZACcedilAtildeO1
EFFECT OF BANANA STREAK VIRUS ON MICROPROPAGATION AND PLANTGROWTH OF CULTIVAR CAIPIRA DURING ACLIMATIZATION
DANIELA GARCIA SILVEIRA2 ANTOcircNIO DA SILVA SOUZA3 PAULO ERNESTO MEISSNER FILHO3TALES MILER SOARES4 RANULFO CORREA CALDAS3 KAacuteTIA REGINA BARBOSA LEAtildeO5
1Parte da Dissertaccedilatildeo de Mestrado apresentada pelo primeiro autor ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias Agraacuterias da Escola de AgronomiaUFBA ndash Cruz das Almas BA2Doutoranda em Botacircnica ndash Universidade Estadual de Feira de SantanaUEFS ndash Feira de Santana BA ndash danielagsigcombr3Pesquisador da Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical ndash Caixa Postal 007 ndash 44380-000 ndash Cruz das Almas BA4Doutorando da Escola Superior Luis de QueirozEsalq ndash Piracicaba SP ndash tmsoaresesalquspbr5Engenheira Agrocircnoma MSc EBDA ndash Cruz das Almas BA ndash 44380-000 ndash krbleaohotmailcom
(Recebido em 12 de abril de 2006 e aprovado em 28 de agosto de 2006)
RESUMOAvaliaram-se os efeitos da infecccedilatildeo pelo viacuterus das estrias
de bananeira (Banana Streak Virus BSV) no desenvolvimento invitro e no crescimento das plantas da cultivar Caipira durante aaclimatizaccedilatildeo Utilizou-se o delineamento experimentalinteiramente casualizado com dois tratamentos plantas sadias eplantas infectadas pelo BSV com respectivamente 24 e 28repeticcedilotildees Os explantes foram desinfestados e estabelecidos emmeio MS baacutesico suplementado com 30 gL de sacarose solidificadocom 2 gL de lsquoPhytagelrsquo e pH ajustado em 58 Foram efetuadoscinco subcultivos em meio com 4 mgL de BAP (6-benzilaminopurina) e as plantas obtidas foram enraizadas nessemesmo meio de cultura sem reguladores de crescimento Apoacutesessa etapa transferiram-se as plantas para a aclimatizaccedilatildeo emcacircmara uacutemida onde permaneceram por 30 dias Avaliaram-se astaxas de multiplicaccedilatildeo a presenccedila in vitro dos sintomas do BSVnos explantes provenientes das plantas infectadas durante amicropropagaccedilatildeo e aclimatizaccedilatildeo as perdas por contaminaccedilatildeoenvolvendo fungos e bacteacuterias nas fases da micropropagaccedilatildeo e aaltura das plantas na fase da aclimatizaccedilatildeo A infecccedilatildeo pelo BSVnatildeo afetou significativamente a multiplicaccedilatildeo e o crescimento invitro das plantas sendo os sintomas do viacuterus visiacuteveis em todasas fases da micropropagaccedilatildeo e na aclimatizaccedilatildeo das plantasinfectadas A maior porcentagem de contaminaccedilatildeo ocorreu nafase de estabelecimento in vitro dos explantes independentementedos tipos de plantas utilizadas Apoacutes 30 dias de aclimatizaccedilatildeo asplantas com BSV apresentaram altura inferior agraves plantas sadiasA presenccedila do viacuterus natildeo influenciou a taxa de multiplicaccedilatildeo dosexplantes poreacutem afetou o crescimento das plantas infectadas
Termos para indexaccedilatildeo Musa BSV cultura de tecidospropagaccedilatildeo in vitro
ABSTRACTThe effects of the banana streak virus (BSV) infection on
in vitro development of the cultivar Caipira were evaluated The
used experimental design was a completely randomized withtwo treatments healthy plants and plants infected by BSV with24 and 28 replications respectively The explants weredisinfected and established in a basic MS medium supplementedwith 30 gL sucrose solidified with 2 gL lsquoPhytagelrsquo and pHadjusted to 58 Five subcultures were carried out in a mediumcontaining 4 mgL BAP (6-benzylaminopurine) and the plantletswere rooted in the same culture medium without growthregulators Afterwards the plantlets were transferred to a humidchamber for acclimatization during a 30-day periodMultiplication rates presence of BSV symptoms on in vitroexplants obtained from plants infected during themicropropagation and acclimatization periods losses caused byfungal and bacterial contamination and plantlet height at theacclimatization stage were evaluated The infection by BSVpresented no significant effect on the multiplication rate and invitro plant growth although the virus symptoms were visible inall the micropropagation phases and during the acclimatizationof infected plants The highest percentage of contaminationoccurred during the in vitro establishment phase regardless theused plants After 30 days of acclimatization the plants withBSV presented a lower height compared to the healthy plantsAlthough the presence of the virus had no influence on the explantmultiplication rate it affected the growth of infected plants
Index terms Musa BSV tissue culture in vitro propagation
INTRODUCcedilAtildeO
As bananeiras estatildeo sujeitas as vaacuterias doenccedilas
causadas por fungos bacteacuterias nematoacuteides e viacuterus que
satildeo limitantes agrave sua capacidade de produccedilatildeo Entre as
viroses que ocorrem no Brasil destaca-se a causada pelo
viacuterus das estrias da bananeira (Banana streak virus BSV)
Efeito do viacuterus das estrias da bananeira 75
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
que eacute particularmente importante para os programas de
melhoramento geneacutetico e de multiplicaccedilatildeo comercial de
cultivares uma vez que pode ser incorporada ao genoma e
transmitida pelas sementes de plantas infectadas
(DANIELLS et al 1995) aleacutem de natildeo existir um meacutetodo
eficiente para limpar uma planta infectada com BSV
(LOCKHART 1994)
Esse viacuterus natildeo eacute transmitido mecanicamente sendo as
mudas infectadas sua principal forma de disseminaccedilatildeo
(LOCKHART amp AUSTREY 1988 LOCKHART 1994) A
transmissatildeo eacute feita de maneira semi-persistente pela cochonilha-
dos-citros Planococcus citri Risso e pela cochonilha-da-cana-
de-accediluacutecar Saccharicoccus sacchari cocherell (LOCKHART
1993 LOCKHART amp AUSTREY 1988)
O BSV inicialmente causa na bananeira um estriado
cloroacutetico de linhas descontiacutenuas dispersas e concentradas
em partes da lacircmina foliar Com o envelhecimento das
folhas o estriado causa necrose de coloraccedilatildeo marrom-cafeacute
a negro (RAMIREZ amp RIVERA 1994) As plantas
infectadas geralmente natildeo mostram sintomas em todas as
folhas (CORDEIRO amp KIMATI 1997 LOCKHART 1986)
Outros sintomas do BSV satildeo a reduccedilatildeo do vigor da planta
e a diminuiccedilatildeo do tamanho dos frutos que tambeacutem ficam
deformados (RAMIREZ amp RIVERA 1994)
Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos
da infecccedilatildeo pelo BSV na multiplicaccedilatildeo in vitro e no
crescimento durante a aclimatizaccedilatildeo das plantas de
bananeira da cultivar Caipira Aleacutem disso avaliou-se a taxa
de contaminaccedilatildeo por fungos e bacteacuterias na etapas da
micropropagaccedilatildeo devido a importacircncia dessa variaacutevel na
multiplicaccedilatildeo in vitro das plantas
MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo dos efeitos do BSV na micropropagaccedilatildeo
da cultivar Caipira (grupo AAA) foi conduzido no
Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos da Embrapa Mandioca
e Fruticultura Tropical Utilizou-se o delineamento
experimental inteiramente casualizado com dois
tratamentos plantas sadias com 24 repeticcedilotildees coletadas
no Banco de Germoplasma de Bananeira da Embrapa
Mandioca e Fruticultura Tropical e plantas infectadas com
BSV com 28 repeticcedilotildees Foram usadas mudas do tipo
chifrinho sendo que as matrizes infectadas com BSV com
altura meacutedia de 12 cm foram infestadas pela cochonilha
vetora Planacoccus citri Risso alimentadas em folhas de
banana lsquoMysorersquo com sintomas de BSV em casa-de-
vegetaccedilatildeo Aproximadamente 15 dias apoacutes a infestaccedilatildeo
todas as 28 plantas estavam com os sintomas da virose
Para o estabelecimento in vitro realizou-se a limpeza
das matrizes por meio de uma seacuterie de cortes removendo-
se parte do rizoma e do pseudocaule ateacute o tamanho
aproximado de 50 cm de altura por 15 cm de diacircmetro
lavando-se com detergente e aacutegua deionizada A
desinfestaccedilatildeo foi feita em cacircmara de fluxo laminar
imergindo os explantes em soluccedilatildeo de aacutelcool 70 por
cinco minutos e em soluccedilatildeo 11 de aacutegua sanitaacuteria comercial
(2 de cloro ativo) com aacutegua deionizada por 30 minutos
Em seguida foram realizadas trecircs lavagens com aacutegua
deionizada esterilizada e reduzidos os explantes ateacute o
tamanho final de 06 cm de altura por 04 cm de diacircmetro
As etapas de estabelecimento multiplicaccedilatildeo e
enraizamento foram realizadas em meio nutritivo MS baacutesico
(MURASHIGE amp SKOOG 1962) suplementado com 30 g
L de sacarose solidificado com 2 gL de ldquoPhytagelrdquo e pH
ajustado para 58 Apenas na fase de multiplicaccedilatildeo o meio
MS foi suplementado com 4 mgL de 6-benzilaminopurina
(BAP) Em todas as etapas os explantes foram dispostos
sobre 25 mL de meio de cultura em frascos com 12 cm de
altura por 5 cm de diacircmetro
A multiplicaccedilatildeo foi realizada em cinco subcultivos
das gemas e brotos sendo efetuada a subdivisatildeo
longitudinal dos explantes sempre que possiacutevel O
estabelecimento e os cinco subcultivos foram realizados
com intervalos de 30 dias Apoacutes os subcultivos as
plantas permaneceram 30 dias em enraizamento O
estudo foi desenvolvido sob condiccedilotildees de temperatura
de 27 plusmn 1ordmC fotoperiacuteodo de 16 horas e intensidade
luminosa de 22 microEm2s
SILVEIRA D G et al76
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
Apoacutes o enraizamento in vitro 47 plantas sadias e 40
plantas infectadas com BSV foram transferidas para copos
plaacutesticos de 300 cm3 contendo o Plantmaxreg e vermiculita
(21) permanecendo 30 dias sob condiccedilotildees de 85 de umidade
relativa do ar e 60 de sombreamento em casa-de-vegetaccedilatildeo
Na fase de estabelecimento e em cada subcultivo
foram avaliadas as taxas de multiplicaccedilatildeo e a presenccedila dos
sintomas do BSV nos explantes provenientes das plantas
infectadas Na fase de aclimatizaccedilatildeo avaliaram-se a
presenccedila de sintomas nas plantas infectadas e as suas
respectivas alturas As medidas foram tomadas do coleto
ateacute a extremidade apical da folha mais alta
Os dados referentes ao nuacutemero de gemas obtidas
nos cinco subcultivos foram transformados em raiz
quadrada Foi estabelecida uma regressatildeo linear para cada
tratamento em funccedilatildeo dos subcultivos
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
A infecccedilatildeo pelo BSV natildeo afetou significativamente
o crescimento e a multiplicaccedilatildeo das plantas sendo que o
nuacutemero de gemas cresceu linearmente em funccedilatildeo dos
subcultivos em ambos os tratamentos Trabalhando com
plantas micropropagadas de bananeira sadias e infectadas
com o viacuterus do topo em leque (Banana bunchy top virus
BBTV) Thomas et al (1995) observaram que aquela virose
tambeacutem natildeo afetou a capacidade das plantas em crescer e
multiplicar Nas anaacutelises de regressatildeo realizadas para os
dois tratamentos (plantas sadias e plantas com BSV) o
acreacutescimo no nuacutemero de gemas em funccedilatildeo dos subcultivos
pode ser explicado por um modelo de regressatildeo linear
(Figura 1) As estimativas da regressatildeo linear para plantas
com BSV e plantas sadias foram altamente significativas e
os coeficientes de determinaccedilatildeo (R2) proacuteximos de 1 Foi
observado que as linhas determinadas a partir das
equaccedilotildees obtidas satildeo quase superpostas evidenciando
um comportamento semelhante entre os dois tratamentos
com relaccedilatildeo ao nuacutemero de gemas por subcultivo
Em todas as fases da micropropagaccedilatildeo os sintomas
do BSV foram visiacuteveis ocorrendo nas folhas das plantas
infectadas estriados cloroacuteticos com linhas descontiacutenuas e
FIGURA 1 ndash Curvas de regressatildeo linear obtidas a partir dosdados de gemas em cada subcultivo da cultivar de bananeiraCaipira sadias e infectadas com BSV Cruz das Almas (BA)Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical 2006Dados transformados por x
dispersas (Figura 2) Esses mesmos sintomas foram
observados em plantas de bananeira infectadas com BSV
mantidas a campo (RAMIREZ amp RIVERA 1994)
As contaminaccedilotildees que ocorreram nos materiais
in vitro foram tambeacutem avaliadas As maiores taxas de
contaminaccedilatildeo aconteceram na fase de estabelecimento
in vitro dos explantes obtendo-se niacuteveis de 21 e 32
para as plantas sadias e infectadas com BSV
respectivamente (Figura 3) Os elevados iacutendices de perdas
nesta etapa foram causados principalmente por
contaminaccedilatildeo bacteriana Segundo Oliveira amp Silva
(1997) as maiores contaminaccedilotildees bacterianas dos
explantes de bananeira ocorrem na fase de
estabelecimento in vitro do que nos demais subcultivos
Oliveira et al (2000) trabalhando com plantas livres de
viacuterus obtiveram taxas de contaminaccedilatildeo nesta fase entre
10 e 45 as quais estatildeo proacuteximas agraves obtidas neste
trabalho Durante a fase de multiplicaccedilatildeo as perdas por
contaminaccedilatildeo foram menores variando de 14 a 74
para as plantas sadias e de 0 a 121 no caso das plantas
infectadas com BSV sendo que a maior parte do material
foi contaminada por fungos natildeo-patogecircnicos Estes
valores foram bem inferiores agravequeles obtidos por Oliveira
et al (1999) (131) que utilizaram genoacutetipos diploacuteides
triploacuteides e tetraploacuteides de bananeiras sadias
Efeito do viacuterus das estrias da bananeira 77
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
FIGURA 2 ndash Planta de bananeira lsquoCaipirarsquo infectada com BSV na fase de enraizamento in vitro apresentando estriadoscloroacuteticos com linhas descontiacutenuas e dispersas nas folhas Cruz das Almas (BA) Embrapa Mandioca e FruticulturaTropical 2006
FIGURA 3 ndash Taxas por contaminaccedilatildeo () de explantes dacultivar Caipira na fase de estabelecimento (Est) e ao longode cinco subcultivos (Sub) Cruz das Almas (BA)Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical 2006
Durante o enraizamento in vitro natildeo houve
diferenccedila significativa na altura das plantas Poreacutem com
30 dias de aclimatizaccedilatildeo as plantas com BSV apresentaram
altura significativamente inferior agraves plantas sadias (Tabela 1)
Soares et al (2000) cultivaram mudas de bananeira lsquoCaipirarsquo
sadias e infectadas com BSV durante 141 dias em casa-de-
vegetaccedilatildeo e observaram que a infecccedilatildeo pelo viacuterus implicou
em significativa reduccedilatildeo no crescimento inicial afetando
o porte o desenvolvimento do sistema radicular e a aacuterea
fotossintetizante das plantas Verifica-se assim que a
infecccedilatildeo pelo BSV prejudicou o crescimento inicial das
plantas afetando a altura daquelas infectadas mesmo em
um periacuteodo relativamente curto indicando que em periacuteodos
mais longos o prejuiacutezo com relaccedilatildeo ao crescimento pode
ser ainda maior aconteceu no estudo desenvolvido por
Soares et al (2000)
Os sintomas do BSV permaneceram visiacuteveis em
todas as plantas infectadas durante e apoacutes a fase de
aclimatizaccedilatildeo Esse resultado foi diferente ao obtido por
Dahal et al (1999) quando micropropagaram hiacutebridos de
Musa pois os sintomas soacute foram visiacuteveis em plantas com
trecircs meses apoacutes o enraizamento Provavelmente essa
diferenccedila foi devido agraves condiccedilotildees onde os trabalhos foram
conduzidos casa-de-vegetaccedilatildeo e campo respectivamante
bem como aos genoacutetipos estudados Observaccedilotildees
semelhantes foram tambeacutem efetuadas por Gauhl amp Pasberg-
Gauhl (1995) e Ortiz (1996) ao estudarem a incidecircncia de
viroses em diferentes genoacutetipos de bananeira
SILVEIRA D G et al78
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
Alturas (cm) Plantas de bananeira lsquoCaipirarsquo
Enraizamento
in vitro 30 dias de
aclimatizaccedilatildeo
Sadias 637 a 2690 a BSV 728 a 2192 b
TABELA 1 ndash Meacutedias das alturas das plantas apoacutes oenraizamento in vitro e 30 dias de aclimatizaccedilatildeo em casa-de-vegetaccedilatildeo Cruz das Almas (BA) Embrapa Mandiocae Fruticultura Tropical 2006
Meacutedias seguidas pelas mesmas letras nas colunas natildeodiferem estatisticamente entre si pelo teste F ao niacutevel de 5 de significacircncia
CONCLUSOtildeES
A infecccedilatildeo pelo BSV natildeo influenciou a taxa de
multiplicaccedilatildeo dos explantes embora os sintomas do viacuterus
tenham sido visiacuteveis em todas as fases da micropropagaccedilatildeo
e durante os primeiros 30 dias da aclimatizaccedilatildeo das plantas
infectadas Todavia o crescimento das plantas infectadas
foi afetado pela presenccedila do viacuterus
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FOGACcedilA L A et al80
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
CARACTERIacuteSTICAS MORFOFISIOLOacuteGICAS DE BROTACcedilOtildeES DEAgapanthus umbellatus var minor MULTIPLICADAS EM
BIORREATOR DE IMERSAtildeO TEMPORAacuteRIA1
MORPHOLOGICAL AND PHYSIOLOGICAL CHARACTERISTICS Agapanthus umbellatus varminor OF SHOOTS PROPAGATED IN BIOREACTOR OF TEMPORARY IMMERSION
LUCIANA ALVES FOGACcedilA2 DENILSON DORTZBACH3 ANTONIO CARLOS ALVES4 ENIO LUIZ PEDROTTI5
1Parte da dissertaccedilatildeo de mestrado do primeiro autor junto ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Recursos Geneacuteticos vegetais CCA UFSC ndash Florianoacutepolis SC2Engenheira Agrocircnoma Mestre em Recursos Geneacuteticos Vegetais ndash CCAUFSC ndash UFSC Trindade ndash Florianoacutepolis SC ndash 88040-900 ndash lufogacapopcombr3Empresa Catarinense de Pesquisa Agropecuaacuteria ndash Rodovia Admar Gonzaga 1340 ndash Bairro Itacorubi Florianoacutepolis SC ndash denilsondtbolcombr4Engenheiro Agrocircnomo Professor Dr Departamento Fitotecnia ndash CCAUFSC ndash UFSC ndash alvesccaufscbr5Engenheiro Agrocircnomo Professor Dr Departamento Fitotecnia ndash CCAUFSC ndash UFSC ndashRodovia Admar Gonzaga 1346 ndash 88 040 900 ndash Florianoacutepolis- SC ndash pedrotticcaufscbr
RESUMOCom o presente trabalho objetivou-se estudar alguns
aspectos morfoloacutegicos e fisioloacutegicos de placircntulas de Agapanthusumbellatus LrsquoHeacuter var minor multiplicadas em biorreatores deimersatildeo temporaacuteria (BIT) Foram testadas quatro concentraccedilotildeesde sacarose no meio de cultura e duas intensidades luminosasem um total de oito tratamentos formando um fatorial 2 x 4 Odelineamento experimental utilizado foi inteiramentecasualizado Os resultados obtidos indicaram que as condiccedilotildeesambientais principalmente luz e concentraccedilatildeo de sacarose domeio de cultura influenciaram o desenvolvimento e o crescimentodas placircntulas quando multiplicadas Observou-se que a ausecircnciade sacarose mesmo no niacutevel mais elevado de intensidadeluminosa natildeo estimulou a fotossiacutentese das placircntulas Acombinaccedilatildeo de 30 gL-1 de sacarose e 70 mMm-2s-1 de luzproporcionou maior numero de folhas massa fresca e secaconcentraccedilatildeo de clorofila a b e total fatores estes que tecircmgrande influecircncia na fase de aclimatizaccedilatildeo
Termos para indexaccedilatildeo Plantas ornamentaismicropropagaccedilatildeo sacarose intensidade luminosa
ABSTRACTThe objective of the present work was to study
morphological and physiological characteristics of Agapanthusumbellatus LrsquoHeacuter var minor plantlets propagated in bioreactorof temporary immersion (BIT) Four sucrose concentrationsand two light intensities were analyzed totalizing eighttreatments The experimental design used was a completelyrandomized with a 2 x 4factorial The results indicated that theenvironment conditions mainly light and sucrose concentrationsof the culture medium influenced plantlets development andgrowth It was observed that the absence of sucrose even inthe highest level of light intensity had no stimuli on plantletphotosynthesis The combination of 30 g L-1 sucrose and 70mM m-2 s-1 light had promoted higher leaf number fresh anddry weight concentration of chlorophyll a b and total
parameters that present high influence during theacclimatizationrsquos phase
Index terms Ornamental plants micropropagation sucroselight intensity
INTRODUCcedilAtildeO
Agapanthus umbellatus var minor tambeacutem
conhecida como Agapantho ou Liacuterio do Nilo eacute uma
angiosperma da famiacutelia Amaryllidaceae pertencente agrave
ordem Liliales (BOTANY 2003) eacute uma espeacutecie ornamental
muito utilizada como flor de corte devido agrave sua durabilidade
No entanto o maior interesse econocircmico nesta espeacutecie
decorre do seu uso como forraccedilatildeo em jardins e praccedilas
(LORENZI amp SOUZA 1995)
Sua propagaccedilatildeo eacute tradicionalmente efetuada
atraveacutes da divisatildeo de touceiras No entanto esta teacutecnica
apresenta uma seacuterie de desvantagens visto que a taxa de
propagaccedilatildeo eacute baixa cerca de dez mudas por planta ao ano
aleacutem de possibilitar a dispersatildeo de pragas e doenccedilas que
poderatildeo ocorrer no viveiro de produccedilatildeo Sendo assim a
micropropagaccedilatildeo pode ser uma ferramenta muito
promissora para esta espeacutecie
O processo de micropropagaccedilatildeo induz a um grande
nuacutemero de mudanccedilas anatocircmicas morfoloacutegicas e
fisioloacutegicas que muitas vezes tem limitado o cultivo in vitro
de algumas espeacutecies (DESJARDINS 1993) A
(Recebido em 18 de julho de 2005 e aprovado em 25 de agosto de 2006)
Caracteriacutesticas morfofisioloacutegicas de brotaccedilotildees 81
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
heterogeneidade de respostas agraves placircntulas que ocorrem
na cultura de tecidos eacute promovida natildeo soacute por fatores
inerentes ao tecido vegetal (geneacuteticos e fisioloacutegicos) mas
tambeacutem por modificaccedilotildees do ambiente in vitro
As modificaccedilotildees do ambiente in vitro envolvem a
qualidade e intensidade de luz fotoperiacuteodo temperatura
umidade reguladores de crescimento exoacutegenos fonte de
carbono e estresse mecacircnico Estes satildeo determinantes na
morfogecircnese no crescimento e no desenvolvimento de
placircntulas in vitro (GEORGE 1996 KOZAI et al 1990
SALISBURY 1981) Aleacutem disso interferem no nuacutemero de
folhas teor de clorofila densidade estomaacutetica (LIAN et
al 2002 PREECE amp SUTTER 1991) na fotossiacutentese e na
fase de aclimatizaccedilatildeo (DESJARDINS et al 1995)
Um dos principais fatores que causam grande
influecircncia na fotossiacutentese de placircntulas cultivadas in vitro
eacute a intensidade luminosa (GALZY amp COMPAN 1992) A
quantidade e a qualidade da luz bem como o fotoperiacuteodo
podem afetar o crescimento e o desenvolvimento de
placircntulas in vivo (SMITH 1982) e placircntulas in vitro
(ECONOMOU amp READ 1987 VLAHOS et al 1992) Esta
influecircncia se deve ao grande impacto sobre o acuacutemulo de
pigmentos biossiacutentese de clorofila diferenciaccedilatildeo de
cloroplastos e anatomia da folha (DESJARDINS et al 1995)
Outro fator que vem sendo estudado e que pode
determinar um papel importante no controle da atividade
fotossinteacutetica de placircntulas in vitro eacute a utilizaccedilatildeo de
carboidratos exoacutegenos pois o crescimento da maioria das
culturas in vitro eacute sustentado pela sacarose ou outros
accediluacutecares adicionados ao meio de cultura (PREECE amp
SUTTER 1991) Estes podem ser utilizados pelas placircntulas
quando a taxa de fotossiacutentese natildeo permite assegurar um
balanccedilo positivo em carbono definindo assim uma nutriccedilatildeo
mixotroacutefica ou heterotroacutefica (GALZY amp COMPAN 1992)
Baseado na hipoacutetese de que a composiccedilatildeo do meio
de cultura e a intensidade luminosa influenciam a
morfologia e a fisiologia de placircntulas micropropagadas o
presente trabalho teve como objetivo estudar aspectos
morfoloacutegicos e fisioloacutegicos de placircntulas de Agapanthus
umbellatus LrsquoHeacuter var minor multiplicadas em biorreator de
imersatildeo temporaacuteria (BIT) Para tanto foi avaliado o
desenvolvimento e o crescimento desta espeacutecie durante a
fase de multiplicaccedilatildeo em funccedilatildeo da variaccedilatildeo de niacuteveis de
sacarose e intensidade luminosa
MATERIAIS E MEacuteTODOS
Este trabalho foi realizado no Laboratoacuterio de
Morfogecircnese e Bioquiacutemica Vegetal localizado no Centro
de Ciecircncias Agraacuterias da Universidade Federal de Santa
Catarina em Florianoacutepolis - SC
O trabalho consistiu de um ensaio onde foram
utilizadas brotaccedilotildees de Agapanthus umbellatus var minor
obtidas da terceira repicagem mantidas em meio geleificado
MS + 178 mM de BAP Apoacutes serem individualizadas e
padronizadas tendo o seu tamanho variando entre 25 e
30 cm de comprimento as brotaccedilotildees foram transferidas
para o BIT (ETIENNE amp BERTHOULY 2002) contendo 500
mL de meio liacutequido e sais de MS (MURASHIGE amp SKOOG
1962) em condiccedilotildees asseacutepticas suplementado com
concentraccedilatildeo de 89 mM de BAP O pH foi ajustado com
NAOH (1N) em 59 antes da autoclavagem (durante 15
minutos sob 121ordmC e 15 atm de pressatildeo) O delineamento
experimental utilizado no ensaio foi o inteiramente
casualizado Foram testados quatro concentraccedilotildees de
sacarose no meio de cultura (0 15 30 e 45) e duas
intensidades luminosas (70 e 140 mmolm-2s-1) providas
por lacircmpadas brancas fluorescentes (PHILIPS ndash TLT 40W)
em um total de oito tratamentos formando um fatorial 2 x 4
Cada tratamento foi composto por trecircs frascos (repeticcedilatildeo)
contendo 50 plantas cada um
Os frascos foram mantidos em sala de crescimento
com fotoperiacuteodo de 16 horas e temperatura meacutedia de 22ordmC
com variaccedilatildeo de plusmn 2ordmC por um periacuteodo de 60 dias
Apoacutes 60 dias de cultivo foram avaliadas as
seguintes caracteriacutesticas dos explantes nuacutemero e tamanho
das brotaccedilotildees (cm) nuacutemero de folhasbrotaccedilatildeo massa
fresca e seca (g) da parte aeacuterea e raiz utilizando-se amostras
de 25 placircntulas por repeticcedilatildeo escolhidas ao acaso
FOGACcedilA L A et al82
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
A determinaccedilatildeo do conteuacutedo de clorofila ldquoa b e
totalrdquo consistiu na coleta de amostras de 100 mg de massa
fresca As amostras foram incubadas com 70 mL de DMSO
(dimetilsulfoacutexido) sem maceraccedilatildeo por 30 minutos a 65degC
Apoacutes filtragem seu volume foi completado para 10 mL com
DMSO Desses extratos 2 mL foram analisados em
espectrofotocircmetro (UV - visiacutevel SHIMADZU) para os
valores de absorbacircncia entre 645 e 663 nm Os valores obtidos
foram submetidos agrave foacutermula de Arnon (1949) conforme
descrito por Hiscox amp Israelstam (1979) Chl a = (00127 X
D663) ndash (000269 X D645) e Chl b = (00229 X D645) ndash (000468
X D663) A clorofila total foi a soma da ldquoChl a e Chl brdquo de
cada tratamento foram utilizadas 25 amostras
A determinaccedilatildeo da densidade estomaacutetica (nuacutemero
de estocircmatos por mm2 de superfiacutecie foliar) foi realizada nas
amostras das quais extraiu-se a clorofila Apoacutes a extraccedilatildeo
da clorofila as folhas foram cortadas e somente o terccedilo
meacutedio das folhas foi usado para anaacutelise Em seguida foram
fixadas sobre lacircminas histoloacutegicas com a ajuda de uma
lamiacutenula e de algumas gotas de aacutegua esterilizada A
observaccedilatildeo foi realizada na epiderme das faces adaxial e
abaxial da folha com o auxiacutelio de um microscoacutepio oacutetico
(OLYMPUS CH30 ocular WH10 X 22) com um aumento
de 400 vezes e com um campo conhecido de 024 mm2 Para
cada lacircmina foram feitas leituras em cinco campos
Os dados obtidos foram avaliados por meio da
anaacutelise de variacircncia (ANOVA) seguindo o modelo para
experimento bifatorial inteiramente casualizado O nuacutemero
de brotaccedilotildees o nuacutemero de folhas e a densidade estomaacutetica
foram transformados em Oumlx+1 para a anaacutelise As meacutedias
dos tratamentos foram separadas pelo teste de comparaccedilatildeo
de meacutedias de Duncan a 5 de probabilidade conforme
recomendaccedilotildees de Stell amp Torrie (1980)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
A concentraccedilatildeo de sacarose no meio de cultura
apresentou uma accedilatildeo positiva e interativa com a intensidade
luminosa na proliferaccedilatildeo de brotaccedilotildees (Tabela 1) visto
que a ausecircncia de sacarose no meio de cultura resultou
em insucesso no crescimento das placircntulas de Agapantho
principalmente nos primeiros dias Apoacutes o
desenvolvimento inicial (aproximadamente 10 dias) foi
constatada estagnaccedilatildeo no crescimento das placircntulas
seguido de atrofia e necrose das brotaccedilotildees Apoacutes 20 dias
de cultivo ocorreu a morte das brotaccedilotildees Isso mostrou
que folhas de placircntulas de Agapantho natildeo fixaram
carbono suficiente para sustentar seu crescimento na
ausecircncia de sacarose Portanto para a espeacutecie em estudo
foi necessaacuteria a adiccedilatildeo de uma fonte de carbono no meio
de cultura para o seu desenvolvimento in vitro Segundo
Capellades et al (1991) e Desjardins et al (1995) a total
remoccedilatildeo de carboidratos no meio de cultura para algumas
espeacutecies frequumlentemente torna-se prejudicial para o
crescimento das placircntulas o que pode prejudicar o
processo de micropropagaccedilatildeo e aclimatizaccedilatildeo pois
durante o cultivo in vitro as placircntulas perdem
parcialmente o autotrofismo e consequumlentemente
necessitam de uma fonte de carbono
O maior nuacutemero de brotaccedilotildees foi obtido com a
intensidade luminosa de 70 mmolm-2s-1 e a concentraccedilatildeo
de 45 gL-1 de sacarose (Tabela 1) Enquanto que com a
intensidade luminosa de 140 mmolm-2s-1 o maior nuacutemero
de brotaccedilotildees foi obtido com a concentraccedilatildeo de 30 gL-1 de
TABELA 1 ndash Nuacutemero de brotaccedilotildeesexplante de placircntulasde Agapanthus umbellatus var minor multiplicadasbiorreator de imersatildeo temporaacuteria suplementado comdiferentes concentraccedilotildees de sacarose e intensidadesluminosas no periacuteodo de 60 dias
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1)
Concentraccedilatildeo Sacarose (gL-1) 70 1 140 1
0 000 dA 00 dA 15 370 cB 544 cA 30 553 bB 651 aA 45 745 aA 585 bB
CV 67
Meacutedias seguidas pela mesma letra minuacutescula nas colunase maiuacutescula nas linhas natildeo diferem significativamente peloteste de Duncan a 5 de probabilidade1 Observaccedilotildees transformadas segundo ( x+1)
Caracteriacutesticas morfofisioloacutegicas de brotaccedilotildees 83
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
sacarose Isso demonstrou um alto grau de mixotrofia dessa
espeacutecie
O tamanho das brotaccedilotildees e o nuacutemero de folhas
(Tabela 2) foram afetados apenas pelo efeito simples dos
fatores natildeo havendo interaccedilatildeo entre sacarose e luz O
maior tamanho das brotaccedilotildees foi alcanccedilada quando os
explantes foram submetidos a 15 gL-1 de sacarose e 140
mmolm-2s-1 de intensidade luminosa (Tabela 2) Verificou-
se tambeacutem que o aumento da concentraccedilatildeo desse
carboidrato no meio de cultura natildeo favoreceu o
alongamento das brotaccedilotildees Provavelmente o aumento
da intensidade luminosa favoreceu a taxa de fotossiacutentese
das placircntulas permitindo um balanccedilo positivo de carbono
afetando o crescimento e o desenvolvimento de placircntulas
in vitro (LEE et al 1995)
Por outro lado o maior nuacutemero de folhas de
Agapantho foi obtido na concentraccedilatildeo de 30 gL-1 de
sacarose (Tabela 2) A intensidade luminosa natildeo teve
influecircncia sobre essa variaacutevel Contrastando com os dados
obtidos no presente trabalho Konow amp Wang (2001)
determinaram que a intensidade luminosa de 40 mmolm-
2s-1 promoveu um aumento no nuacutemero de folhas de
Phalaenopsis enquanto placircntulas que se desenvolveram
em ambiente com intensidade de 10 e 80 molm-2s-1
apresentaram um menor nuacutemero de folhas Segundo os
autores o aumento no nuacutemero de folhas pode indicar que
TABELA 2 ndash Tamanho de brotaccedilotildees e nuacutemero de folhasbrotaccedilatildeo de placircntulas de Agapanthus umbellatus var minormultiplicadas em biorreator de imersatildeo temporaacuteria suplementado com diferentes concentraccedilotildees de sacarose eintensidades luminosas no periacuteodo de 60 dias
Meacutedias seguidas pela mesma letra nas linhas e colunas natildeo diferem significativamente pelo teste de Duncan a 5 deprobabilidade
houve estiacutemulo da fotossiacutentese in vitro Outro efeito
observado em placircntulas de Agapantho neste trabalho foi
a presenccedila de folhas mais claras e vitrificadas (folhas com
aspecto viacutetreo pouco desenvolvidas aparecircncia suculenta
e translucente) na grande maioria das placircntulas
multiplicadas em meio suplementado com 15 gL-1 de
sacarose e intensidade luminosa de 70 mmolm-2s-1 Estes
resultados podem indicar que o aparato fotossinteacutetico natildeo
tenha se desenvolvido adequadamente (CAPPELADES et
al 1991 DESJARDINS et al 1995) afetando a acumulaccedilatildeo
de massa fresca Possivelmente a presenccedila de folhas
vitrificadas foi influenciada pelo uso de meio liacutequido pois
de acordo com George (1996) e Etienne amp Berthouly (2002)
o meio liacutequido favorece a produccedilatildeo de folhas vitrificadas
quando comparado com meio geleificado No entanto
observou-se que para os demais tratamentos em
concentraccedilotildees maiores de sacarose (30 e 45 gL-1) a
presenccedila de brotaccedilotildees vitrificadas foi rara ou nenhuma
Neste sentido o desenvolvimento de brotaccedilotildees com esta
caracteriacutestica pode estar relacionado agrave concentraccedilatildeo de
sacarose no meio e agrave diferenccedila osmoacutetica entre as brotaccedilotildees
e o meio de cultura (DEBERGH et al 1981) Este resultado
tambeacutem foi obtido na multiplicaccedilatildeo de rosas na qual onde
a reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo de sacarose para 10 gL-1 na
fase de multiplicaccedilatildeo promoveu um aumento significativo
na presenccedila de plantas vitrificadas e quando submetidas
Tamanho de brotaccedilotildees (cm)
Nuacutemero de folhasbrotaccedilatildeo
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1) Concentraccedilatildeo Sacarose
(gL-1) 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia
0 000 000 000 d 000 000 000 d 15 275 396 335 a 407 408 408 b 30 295 295 295 b 414 404 409 a 45 245 220 233 c 400 408 404 c
Meacutedia 204 b 228 a 276 a 275 a
CV 2595 467
FOGACcedilA L A et al84
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
a concentraccedilotildees de 30 e 40 gL-1 a presenccedila de placircntulas
vitrificadas foi rara (LANGFORD amp WAINWRIGHT 1987)
Outro fator que possivelmente pode ter
influenciado a presenccedila de placircntulas vitrificadas in vitro
foi a baixa intensidade luminosa (GEORGE 1996) pois
placircntulas de Agapantho multiplicadas sob intensidade de
140 mmolm-2s-1 e 15 gL-1 de sacarose natildeo apresentaram
caracteriacutestica de vitrificaccedilatildeo Estes dados indicaram que o
aumento da intensidade luminosa evitou a presenccedila de
plantas vitrificadas aleacutem de proporcionar um incremento e
estiacutemulo na atividade fotossinteacutetica (GEORGE 1996)
A produccedilatildeo de massa fresca e seca das brotaccedilotildees
foram influenciadas pela interaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo
de sacarose e a intensidade luminosa (Tabela 3) Placircntulas
de Agapantho multiplicadas sob intensidade de 70
mmolm-2s-1 apresentaram a maior produccedilatildeo de massa
fresca e seca dentro das concentraccedilotildees de 30 gL-1 Nas
concentraccedilotildees de 15 e 45 gL-1 os resultados obtidos
foram inferiores (Tabela 3) Por outro lado quando se
aumentou a intensidade para 140 mmolm-2s-1 a melhor
produccedilatildeo de massa fresca e seca ocorreu dentro da
concentraccedilatildeo de 15 gL-1 de sacarose (Tabela 3) Verificou-
se assim que o aumento da concentraccedilatildeo de sacarose no
meio de cultura proporcionou efeitos negativos na
produccedilatildeo de massa fresca e seca quando as placircntulas
foram submetidas agrave intensidade luminosa mais elevada
TABELA 3 ndash Massa fresca e seca de brotaccedilotildees de Agapanthus umbellatus var minor multiplicadas em biorreator de imersatildeotemporaacuteria suplementado com diferentes concentraccedilotildees de sacarose e intensidades luminosas no periacuteodo de 60 dias
Tais resultados corroboram as afirmaccedilotildees feitas referentes
agrave variaacutevel nuacutemero de brotaccedilotildees em que demonstrou-se
que foi possiacutevel reduzir a concentraccedilatildeo de sacarose em
maiores intensidade luminosas confirmando o grau de
mixotrofia
Ao analisar a concentraccedilatildeo de clorofila em
folhas de Agapantho verificou-se que natildeo houve
interaccedilatildeo significativa entre as concentraccedilotildees de
sacarose e intensidade luminosa Os teores de clorofila
a b e total (Tabela 4) foram maiores nas concentraccedilotildees
de 30 gL-1 sacarose Serret et al (1995) mostraram que
o aumento da concentraccedilatildeo de accediluacutecares (30 gL-1) no
meio de cultura promoveu maior produccedilatildeo de clorofila
impedindo a fotoinibiccedilatildeo realizaccedilatildeo de fotossiacutentese e
aumento do ganho de massa em plantas de Gardecircnia
cultivadas in vitro
Em relaccedilatildeo ao efeito da intensidade luminosa natildeo
houve efeito deste fator sobre essas variaacuteveis ainda que
Economou amp Read (1987) Galzy amp Compan (1992) Vlahos
et al (1992) George (1996) tenham observado que a
intensidade luminosa eacute um fator que estaacute estreitamente
relacionado agrave siacutentese de clorofila No entanto no presente
trabalho sugere-se a menor intensidade 70 mmolm-2s-1 com
o objetivo de que natildeo ocorra um aumento na velocidade
de decomposiccedilatildeo da clorofila com intensidade mais
elevada
Meacutedias seguidas pela mesma letra minuacutescula nas colunas e maiuacutescula nas linhas natildeo diferem significativamente peloteste de Duncan a 5 de probabilidade
Massa fresca (g)
Massa seca (g)
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1) Concentraccedilatildeo
Sacarose (gL-1) 70 140 70 140
0 000 dA 00 dA 000 dA 000 dA 15 067 cB 106 aA 0069 cB 0109 aA 30 082 aA 076 bB 0085 aA 0081 bB 45 075 bA 049 cB 0078 bA 0051 cB
CV 2873 2655
Caracteriacutesticas morfofisioloacutegicas de brotaccedilotildees 85
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
TABELA 4 ndash Concentraccedilotildees de clorofila a b e total (mgg massa fresca) em folhas de Agapanthus umbellatus varminor multiplicadas em biorreator de imersatildeo temporaacuteria por um periacuteodo de 60 dias submetidas a 4 concentraccedilotildees desacarose e dois niacuteveis de intensidade luminosa
Clrofila a (mgg massa fresca)
Clrofila b (mgg massa fresca)
Clrofila total (mgg massa fresca)
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1) Concentraccedilatildeo
Sacarose (gL-1) 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia
0 000 000 000 d 000 000 000 d 000 000 000 d 15 211 248 295 c 089 076 083 c 301 325 313 c 30 502 509 505 a 200 211 205 a 703 721 710 a 45 486 420 453 b 195 179 187 b 682 633 658 b
Meacutedia 299 a 294 a 121 a 116 a 421 a 420 a
CV 740 820 850
Meacutedias seguidas pela mesma letra nas linhas e colunas natildeo diferem significativamente pelo teste de Duncan a 5 deprobabilidade
Em relaccedilatildeo aos estocircmatos atraveacutes de
observaccedilatildeo microscoacutepica foi possiacutevel verificar que o
Agapantho possui folhas com caracteriacutest ica
anfiestomaacutetica caracterizada pela presenccedila de
estocircmatos em ambas as faces (face abaxial e adaxial)
Esta caracteriacutestica tem sido considerada como um
mecanismo adaptativo para maximizar a condutacircncia
de CO2 quando luz e aacutegua satildeo fatores limitantes
(KRAMER 1969)
Atraveacutes da anaacutelise estatiacutestica para densidade
estomaacutetica da face adaxial verificou-se que natildeo houve
interaccedilatildeo entre os fatores sacarose e intensidade
luminosa havendo portanto efeito isolado dos fatores A
maior densidade estomaacutetica da face abaxial foi obtida na
concentraccedilatildeo de 45 gL-1 (Tabela 5) Natildeo houve efeito da
intensidade luminosa para essa variaacutevel Por outro lado
a maior densidade estomaacutetica na face adaxial foi obtida
na concentraccedilatildeo de 45 gL-1 de sacarose e 140 mmolm-2s-1
de intensidade luminosa (Tabela 5) verificando a
influecircncia positiva da intensidade luminosa para essa
variaacutevel
As folhas de placircntulas multiplicadas na
concentraccedilatildeo de 15 gL-1 de sacarose apresentaram menor
densidade estomaacutetica em ambas as faces (Tabela 5) com
formato anormal largos e salientes caracteriacutesticas estas
natildeo desejaacuteveis pois segundo Preece amp Sutter (1991)
uma alteraccedilatildeo a niacutevel estrutural eou morfoloacutegico podem
impedir o funcionamento do aparelho estomaacutetico e grande
parte dos estocircmatos assim formados satildeo incapazes de se
fechar
Possivelmente este resultado se deve agraves
caracteriacutesticas de vitrificaccedilatildeo que as folhas do
tratamento 15 gL-1 de sacarose e 70 mmol m-2s-1 de
intensidade luminosa apresentaram (BLANKE amp
BELCHERL 1989) e a falta de energia armazenada no
explante com a falta de carbono que eacute proveniente da
sacarose adicionada ao meio de cultura (DESJARDINS
et al 1995) Estes resultados corroboram os obtidos
por Vintildea et al (2001) que demonstraram que folhas
vitrificadas de abacateiro apresentaram estocircmatos
grandes com saliecircncia ceacutelulas subsidiaacuterias assimeacutetricas
e deformadas e seu ostiacuteolo completamente aberto Tal
anomalia pode ser atribuiacuteda agrave perda da elasticidade das
paredes das ceacutelulas-guarda o que impediria o seu
movimento de abertura e fechamento que
consequumlentemente afeta o desenvolvimento das
placircntulas ao serem transferidas para condiccedilotildees ex vitro
atraveacutes da excessiva perda de aacutegua
FOGACcedilA L A et al86
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
TABELA 5 ndash Densidade estocircmatica (estocircmatosmm2) da face adaxial e abaxial de folhas de Agapanthus umbellatus varminor multiplicadas em biorreator de imersatildeo temporaacuteria suplementado com diferentes concentraccedilotildees de sacarose eintensidade luminosa por um periacuteodo de 60 dias
Densidade estomaacutetica (estocircmatosmm2) Epiderme da face Adaxial Epiderme da face Abaxial
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1)
Concentraccedilatildeo Sacarose(gL1) 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia
0 000 000 000 d 000 000 000 d 15 2587 3026 2802 c 3408 4752 4053 c 30 6524 5628 6064 b 9977 8584 9268 b 45 5412 7016 6188 a 8809 10807 9783 a
Meacutedia 2856 b 3089 a 4256 a 4705 a CV 1474 1206
Meacutedias seguidas pela mesma letra nas linhas e colunas natildeo diferem significativamente pelo teste de Duncan a 5 deprobabilidade
CONCLUSAtildeO
Condiccedilotildees ambientais tais como intensidade
luminosa e concentraccedilatildeo de sacarose adicionada ao meio
de cultura influenciaram no desenvolvimento e
crescimento das placircntulas de Agapanthus umbellatus
var minor quando multiplicadas em meio liacutequido no BIT
Placircntulas de Agapantho foram incapazes de se
desenvolver em meio sem sacarose sendo portanto
necessaacuteria a adiccedilatildeo de uma fonte de carbono visto que a
espeacutecie em estudo apresentou uma taxa de fotossiacutentese
incapaz de assegurar um balanccedilo positivo em carbono
Houve uma grande variaccedilatildeo nas respostas obtidas
no entanto fazendo uma avaliaccedilatildeo em conjunto das
variaacuteveis recomenda-se 30 gL-1 de sacarose e intensidade
luminosa de 70 mmolm-2s-1 No entanto deve-se ressaltar
que estudos mais aprofundados devem ser conduzidos
para verificar o efeito destas combinaccedilotildees sobre o
desempenho de placircntulas durante a fase de aclimatizaccedilatildeo
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SOUZA G de F M V e et al88
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
CAPACIDADE DE REGENERACcedilAtildeO IN VITRO DE TOMATEIROCULTIVAR SANTA CLARA
IN VITRO REGENERATION CAPACITY OF TOMATOPLANT CULTIVAR SANTA CLARA
GLAUCIA DE FATIMA MOREIRA VIEIRA E SOUZA1 JOSEacute MAGNO QUEIROZ LUZ2 ALCIONE SILVA ARRUDA3DENISE GARCIA SANTANA2 MARIANA DE SOUZA E SILVA DA COSTA TEIXEIRA4
LUCIANA LONDE5 ADELAIDE SIQUEIRA SILVA6 ELISAcircNGELA RODRIGUES FIGUEIRA7
1Mestranda em Fitotecnia ndash UFU ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash gfmvsyahoocombr2Professor Dr Instituto de Ciecircncias Agraacuterias ndash UFUICIAG ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash jmagnoumuaramaufubr3Dra em Geneacutetica e Bioquiacutemica Professora contratada da UEG ndash Unidade Universitaacuteria de Ipameri ndash Rodovia GO 330 Km 24 ndash Anel Viaacuterio SN ndash 75780-000 ndash Ipameri GO ndash asarrudahotmailcom4Engenheira Agrocircnoma ndash UFU ndash Conab Sede - SGAS 901 Bloco ldquoArdquo Lote 69 - Asa Sul ndash 70390-010 ndash Brasiacutelia DF ndash marisouza81yahoocombr5Dra em Geneacutetica e Bioquiacutemica ndash IGBUFU ndash Av Paraacute 1720 ndash Campus Umuarama ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash llondebolcombr6Mestranda em AgronomiaFitotecnia ndash UFUICIAG ndash Bolsista FAPEMIG ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash adelaidebioyahoocombr7Mestre em AgronomiaFitotecnia ndash UFUICIAG ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash Elis_figueirayahoocombr
RESUMOA cultivar de tomateiro Santa Clara (Lycopersicon
esculentum Mill) foi avaliada quanto ao seu potencial deregeneraccedilatildeo in vitro a partir de trecircs tipos de explantes e trecircsmeios de cultura seguidos de trecircs repicagens Os explantes foramcotileacutedone decapitado cotileacutedone fendido e cotileacutedone aparadonas extremidades Os meios de cultura foram MI macro emicronutrientes do MS vitaminas B5 de Gamborg et al (1968)suplementado com 30 gL de sacarose e de 8 gL de aacutegar pH 58MII meio MI suplementado com 1 mgL de BAP e 30 gL deglicose MIII meio MI suplementado com 25 mgL de BAP e02 mgL de AIA Para as repicagens foi utilizado o meio MIsuplementado com 05 mgL 08 mgL e 10 mgL de BAP paraa primeira segunda e terceira repicagens respectivamente Noenraizamento foi usado o meio MI suplementado com 05 mgL de AIA e as placircntulas enraizadas foram transferidas parasubstrato comercial Plantimax esterilizado e aclimatadas emlaboratoacuterio A maior induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo tanto de calosquanto de brotos foi observada nos meacutetodos cotileacutedone fendidoe cotileacutedone aparado quando colocados no meio MIII no entantoa induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo foi mais raacutepida quando usado cotileacutedonedecapitado indicando um alto potencial de organogecircneseespontacircnea sendo que o meio MI foi o melhor Os resultadosobtidos com as diferentes concentraccedilotildees de BAP nos trecircs ciclosde repicagem natildeo diferiram entre si e 82 das plantas enraizadasaclimataram-se com sucesso
Termos para indexaccedilatildeo Lycopersicon esculentummelhoramento do tomateiro cultura de tecidos
ABSTRACTThe tomato plant cultivar lsquoSanta Clararsquo (Lycopersicon
esculentum Mill) was evaluated as for its in vitro potential ofregeneration using three types of explants and three culture media
following three pricking-outs The explants were as followsdecapitated cotyledon split cotyledon and rim-trimmedcotyledon The culture media were MI MS macro andmicronutrients vitamins B5 of Gamborg et al (1968)supplemented with 30gL sucrose and 8gL agar pH 58 MIImedium MI supplemented with 1 mgL BAP and 30 gL glucoseMIII medium MI supplemented with 25 mgL BAP and 02mgL IAA For the pricking-outs the media MI wassupplemented with 05 mgL 08 mgL and 10 mgL BAP forthe first second and third pricking out respectively As forrooting the MI medium was supplemented with 05 mgL IAAand the rooted seedlings were transplanted to the sterilizedcommercial substrate Plantimax and then acclimatized inlaboratory Higher callus induction and sprout regeneration wasobserved for the methods of split and rim-trimmed cotyledonplaced into medium MIII Nevertheless the induction forregeneration was much faster when the decapitated cotyledonmethod was used indicating a high potential of spontaneousorganogenesis in which the media MI was the best The resultsobtained with the different concentrations of BAP in the threecycles of pricking-out did not differ among themselves and 82of the rooted plants were acclimatized successfully
Index terms Lycopersicon esculentum tomato breeding tissueculture
INTRODUCcedilAtildeO
O tomate pertence ao gecircnero Lycopersicon e a
espeacutecie cultivada cosmopolita eacute botanicamente
denominada de Lycopersicon esculentum (FILGUEIRA
2000) As cultivares atualmente plantadas podem ser
(Recebido em 03 de outubro de 2003 e aprovado em 04 de setembro de 2006)
Capacidade de regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro 89
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
reunidas em cinco grupos Santa Cruz Salada Cereja
Italiano Agroindustrial No presente trabalho foi utilizada
a cultivar Santa Clara do grupo Santa Cruz pois ela continua
sendo a cultivar mais plantada no Brasil
A tomaticultura estaacute associada a seacuterios problemas
fitossanitaacuterios sobretudo viroses aleacutem do ataque de
fungos bacteacuterias e insetos praga Cria-se com isto a
necessidade de se pesquisar novas alternativas ou
obtenccedilatildeo de novos genoacutetipos com resistecircncia muacuteltipla a
doenccedilas e pragas entre essas os estudos sobre
regeneraccedilatildeo e transformaccedilatildeo geneacutetica (FAacuteRI et al 2000)
A engenharia geneacutetica abriu uma nova perspectiva
para o melhoramento geneacutetico do tomateiro a partir do
final da deacutecada de 80 (WIJBRANDI amp BOTH 1993)
visando aumentar a produtividade e melhorar a qualidade
por meio da obtenccedilatildeo de resistecircncia a estresses bioacuteticos e
abioacuteticos A cultura de tecidos destaca-se durante o
processo de realizaccedilatildeo das teacutecnicas de transformaccedilatildeo
geneacutetica pois eacute necessaacuterio induzir gemas vegetativas e
em seguida regenerar brotos alongados e plantas
completas a partir de ceacutelulas ou tecidos geneticamente
modificados
Para a otimizaccedilatildeo de protocolos para o tomateiro
alguns fatores que afetam a eficiecircncia de transformaccedilatildeo
tecircm sido examinados dentre eles o tamanho do explante e
o tipo de explante hipocoacutetilo ou cotileacutedone (FRARY amp
EARLE 1996)
No Brasil haacute poucos trabalhos na aacuterea de
regeneraccedilatildeo in vitro e de transformaccedilatildeo geneacutetica de
cultivares de tomateiro e pouco se conhece sobre a
capacidade de regeneraccedilatildeo das principais cultivares
brasileiras (FAacuteRI et al 2000) Alguns pesquisadores como
Faria amp Illg (1993) analisaram a regeneraccedilatildeo in vitro de
algumas espeacutecies e cultivares de tomateiro observando
uma baixa capacidade morfogecircnica das cultivares se
comparadas com a espeacutecie selvagem Lycopersicon
pimpinellifolium (L) P Miller
Com este trabalho objetivou-se teve como objetivo
avaliar o potencial de regeneraccedilatildeo in vitro da cultivar Santa
Clara do grupo Santa Cruz a partir de diferentes tipos de
explantes e meios de cultura criando e otimizando
protocolos para sua regeneraccedilatildeo in vitro
MATERIAL E MEacuteTODOS
No Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos Vegetais do
Instituto de Geneacutetica e Bioquiacutemica da Universidade Federal
de Uberlacircndia foi avaliada a capacidade de regeneraccedilatildeo
in vitro do tomateiro cultivar Santa Clara usando trecircs
tipos de explantes e trecircs meios de cultura seguido de trecircs
repicagens O experimento foi realizado em delineamento
em blocos casualizados em esquema fatorial (3x3) com trecircs
repeticcedilotildees As plantas regeneradas foram enraizadas e
aclimatadas em laboratoacuterio
Sementes comerciais da cultivar Santa Clara apoacutes
serem desinfestadas por um minuto em aacutelcool etiacutelico a 96
e em hipoclorito de soacutedio comercial a 20 (vv) com duas
gotas de detergente comercial durante 25 minutos foram
enxaguumladas 5 vezes em aacutegua bidestilada esterilizada e
inoculadas em meio MS 100 (MURASHIGE amp SKOOG
1962) solidificado com 7 g L-1 de aacutegarndashaacutegar por sem
reguladores de crescimento O meio foi distribuiacutedo em
frascos de vidro esteacutereis utilizados para cultura de tecidos
com 30 mL de meio MS As culturas foram mantidas em
sala de crescimento com temperatura de 25+2 ordmC
fotoperiacuteodo de 16 horas e luminosidade de 50 mmol m-2s-
1 As placircntulas obtidas aos 14 15 e 20 dias apoacutes a semeadura
foram usadas como fonte de explantes para os blocos 1 2
e 3 respectivamente Os explantes foram inoculados de
acordo com os meacutetodos descritos a seguir em placas de
Petri devidamente esterilizadas e autoclavadas contendo
30 mL de meio de cultura com 16 unidades por tipo de
explante por meio de cultura utilizado Cada 16 explantes
constituiu uma parcela do experimento sendo composta
por duas placas de Petri cada uma com 8 explantes
Os tipos de explantes foram os seguintes
A - que consistiu na decapitaccedilatildeo de placircntulas onde
essa decapitaccedilatildeo ocorreu diretamente abaixo do noacute do
cotileacutedone ficando o hipocoacutetilo com as radiacuteculas
SOUZA G de F M V e et al90
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
B - meacutetodo de cotileacutedones fendidos os cotileacutedones
foram fendidos ao longo da nervura central da extremidade
ateacute sua metade de acordo com o protocolo de Faacuteri et al
(2000)
C - cotileacutedones foram aparados e seguiu-se o
protocolo descrito por Redenbaugh et al (1992) Os
cotileacutedones aparados nas extremidades distal e proximal
(aacutepice e peciacuteolo) foram inoculados com a face abaxial em
contato com o meio
Foram realizadas trecircs repicagens para alongar os
brotos Cerca de 30 dias apoacutes a inoculaccedilatildeo dos explantes
foi realizada a primeira repicagem Os intervalos entre as
repicagens foram em torno de 5 semanas
Os tratamentos consistiram na inoculaccedilatildeo dos trecircs
tipos de explantes descritos nos trecircs meios de cultura
abaixo com trecircs repeticcedilotildees por tratamento
Meio MI macro e micronutrientes de Murashige amp
Skoog (1962) e vitaminas B5 de Gamborg et al (1968)
suplementado com 30 gL de sacarose e de 8 gL de aacutegar-
aacutegar pH 58 meio MII meio de cultura MI suplementado
com 1 mgL de zeatina e 30 gL de glicose conforme
McCormick (1991) meio MIII meio de cultura MI
suplementado com 25 mgL de BAP e 02 mgL de AIA
segundo Rhim et al (1995)
Para as repicagens foi utilizado o meio MI
suplementado com 05 mgL 08 mgL e 10 mgL de BAP
para a primeira segunda e terceira repicagens
respectivamente
Para enraizamento foi usado o meio MI
suplementado com 05 mgL de AIA As placircntulas
enraizadas foram transferidas para substrato comercial
Plantimax esterilizado e aclimatadas em laboratoacuterio
Os brotos com 2 cm de comprimento foram
transferidos para o meio de enraizamento citado e
permaneciam nesse meio durante 15 dias Apoacutes esse periacuteodo
os brotos eram transplantados para substrato comercial
Plantimax autoclavado irrigados com aacutegua uma a duas
vezes por dia ateacute a aclimataccedilatildeo A aclimataccedilatildeo ocorreu em
torno de 20 dias em condiccedilotildees de laboratoacuterio
Avaliou-se a induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo o
alongamento de brotos e o enraizamento e aclimataccedilatildeo
das plantas regeneradas
Os dados de contagem foram transformados para
50x As anaacutelises de normalidade e homogeneidade
foram realizadas pelo software Prophet Os dados obtidos
foram submetidos agrave anaacutelise de variacircncia e as meacutedias
comparadas pelo teste de Tukey ao niacutevel de 5 de
probabilidade pelo software SANEST (ZONTA amp
MACHADO 1989)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Para cotileacutedone decapitado ocorreu um iniacutecio de
formaccedilatildeo de calosidade por volta de 10 dias apoacutes inoculaccedilatildeo
e o surgimento de brotos ocorreu cerca de 12 dias depois da
inoculaccedilatildeo sem a formaccedilatildeo de calos propriamente ditos A
induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo foi mais raacutepida quando usado esse
tipo de explante indicando um alto potencial de
organogecircnese espontacircnea sendo que o meio MI foi o melhor
para a induccedilatildeo e nuacutemero total de brotos (Tabela 1)
No cotileacutedone fendido o iniacutecio de formaccedilatildeo de
calosidade aconteceu com aproximadamente 10 dias apoacutes
inoculaccedilatildeo Por volta de 18 dias depois da inoculaccedilatildeo
iniciou-se o surgimento de brotos e jaacute existiam calos
formados Para esse tipo de explante nos meios MI e MII
ocorreu apenas a formaccedilatildeo de calos enquanto no meio
MIII ocorreu a formaccedilatildeo de calos e calos com brotos sendo
alto o nuacutemero total de brotos (Tabela 1) Supotildee-se que a
maior superfiacutecie de corte tenha influecircncia significativa
sobre esse fenocircmeno onde a maior superfiacutecie de corte do
cotileacutedone resulta em maior capacidade de regeneraccedilatildeo
(FAacuteRI et al 1995b)
No cotileacutedone aparado com cerca de 10 dias apoacutes
inoculaccedilatildeo ocorreu o iniacutecio de formaccedilatildeo de calos e 20 dias
depois da inoculaccedilatildeo ocorreu o surgimento de brotos e jaacute
existiam calos formados Para esse tipo de explante nos
meios MI MII e MIII ocorreu a formaccedilatildeo de calos no
entanto apenas no meio MIII ocorreu a formaccedilatildeo de calos
com brotos (Tabela 1)
Capacidade de regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro 91
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
TABELA 1 ndash Frequumlecircncia de induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo in vitro da cultivar Santa Clara do grupo Santa Cruz UberlacircndiaUFU 2001
Dados seguidos de mesma letra nas colunas (abc) e nas linhas (AB) natildeo diferem entre si a 5 de probabilidade peloteste de TukeyA diferenccedila entre o nordm de explantes de um meacutetodo para outro eacute devida a parcelas (ou parte delas) perdidas
Nos trecircs ciclos de repicagens a capacidade de
alongamento dos brotos foi igual indicando que as
concentraccedilotildees de BAP natildeo diferiram estatisticamente entre
si dentro de cada tipo de explante Em relaccedilatildeo ao nuacutemero
de brotos alongados na primeira e terceira repicagens o
cotileacutedone decapitado apresentou maior nuacutemero jaacute na
segunda repicagem natildeo houve diferenccedila entre os tipos de
explantes (Tabela 2)
As plantas apoacutes serem enraizadas foram
transferidas para aclimataccedilatildeo obtendo-se 82 de plantas
aclimatadas Cerca de 20 dias apoacutes transplantio para o
substrato as plantas jaacute estavam aclimatadas
Apoacutes a terceira repicagem ainda existiam cerca de
334 brotos para serem novamente repicados e 51 brotos
prontos para serem enraizados perfazendo um total geral
de 549 brotos obtidos ateacute a fase estudada
Para o tipo de explante cotileacutedone decapitado foram
obtidos 181 brotos equivalentes a 174 brotos por explante
Para o explante cotileacutedone fendido o nuacutemero de brotos por
Tipos de Explantes Variaacuteveis Meios Cotileacutedone decapitado Cotileacutedone fendido Cotileacutedone aparado
I 396 aA 050 cB 142 bB II 000 bB 632 bA 672 aA Nordm de explantes
com calos III 000 bB 1599 aA 597 bB I 1095 aA 000 bB 000bB II 050 bA 000 bA 000 bA Nordm de explantes
com brotos III 130 bB 1217 aA 850 aA I 396 aA 050 cB 169 cB II 000 bB 632 bA 645 bA Nordm total de
calos III 000 bB 3630 aA 2655 aA I 1850 aA 000 bB 000 bB II 050 bA 000 bA 000 bA Nordm total de
brotos III 130 bB 2760 aA 2934 aA I 48 32 40 II 32 40 32 Nordm de
explantes III 24 40 48 Total de explantes 104 112 120
explante foi igual a 145 e para o cotileacutedone aparado foram
obtidos 170 brotos por explante Esses resultados foram
semelhantes aos obtidos por Faacuteri et al (2000) para as
cultivares IPA-5 e IPA-6 os quais concluiacuteram que a
utilizaccedilatildeo de cotileacutedones fendidos e cotileacutedones aparados
produziram uma regeneraccedilatildeo alta e onde a maior induccedilatildeo
foi conseguida utilizando-se um meio igual ao MIII utilizado
nesse experimento A induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo tambeacutem foi
mais raacutepida quando usado cotileacutedone decapitado indicando
um alto potencial de organogecircnese espontacircnea A cultivar
Santa Clara mostrou-se mais eficiente na formaccedilatildeo de
brotos alongados observados na primeira repicagem
enquanto as cultivares utilizadas por Faacuteri et al (2000) IPA-
5 e IPA-6 necessitaram de duas repicagens para o
alongamento dos brotos no entanto a cultivar IPA-5
mostrou-se mais eficiente na produccedilatildeo de brotos por
explante Faacuteri et al (2000) utilizaram zeatina durante os trecircs
ciclos de repicagem enquanto nesse experimento foi
utilizado BAP
SOUZA G de F M V e et al92
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
TABELA 2 ndash Capacidade de alongamento e enraizamento de brotos da cultivar Santa Clara durante os trecircs ciclos derepicagem Uberlacircndia UFU 2001
Dados seguidos de mesma letra nas colunas (ab) e nas linhas (AB) natildeo diferem entre si a 5 de probabilidade peloteste de TukeyTipos de explantes A - cotileacutedone decapitado B - cotileacutedone fendido C - cotileacutedone aparado
Os resultados aqui obtidos tambeacutem foram
semelhantes aos de Faacuteri et al (1995b) que trabalhando
com transformaccedilatildeo geneacutetica da berinjela (Solanum
melongena L) observaram que a maior superfiacutecie de corte
do cotileacutedone resultou em maior capacidade de
regeneraccedilatildeo Tambeacutem foram obtidos resultados
semelhantes aos de Nogueira et al (2001) que estudando
a regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro Santa Clara utilizando
como explantes cotileacutedones concluiacuteram que o meio com
uma combinaccedilatildeo adequada de auxina e citocinina (10 mg L-
1 de zeatina e 01 mg L-1 de AIA) promoveu uma maior
meacutedia de regeneraccedilatildeo e um maior nuacutemero meacutedio de brotaccedilotildees
por explante Costa et al (2000) trabalhando com as
cultivares IPA-5 e IPA-6 chegaram a uma conclusatildeo
semelhante onde meio suplementado com 10 mg L-1 de
zeatina + 01 mg L-1 de AIA e meio suplementado com 25
mg L-1 de BAP + 02 mg L-1 de AIA determinaram a maior
frequumlecircncia de regeneraccedilatildeo de explantes cotiledonares e
tambeacutem um maior nuacutemero de brotos alongados por explante
McCormick et al (1986) pesquisando a morfogecircnese
in vitro de L esculentum observaram que a presenccedila de 25
mg L-1 de BAP e 10 mg L-1 de AIA ou 10 mg L-1 de BAP e
02 mg L-1 de AIA produziu um maior nuacutemero de ramos por
explante a partir de explantes de cotileacutedones e hipocoacutetilos
Ohki et al (1978) utilizando segmentos de hipocoacutetilos de L
esculentum sugeriram que o efeito positivo da combinaccedilatildeo
de auxinas e citocininas na regeneraccedilatildeo in vitro pode ser
causado por uma maior capacidade das ceacutelulas dessa espeacutecie
em utilizar e adaptar-se agrave combinaccedilatildeo de auxinas e citocininas
de que somente citocininas Para os mesmos autores a
variabilidade observada nas respostas morfogecircnicas in vitro
para diferentes citocininas pode ser causada pela variaccedilatildeo
na razatildeo de degradaccedilatildeo dessas substacircncias nos tecidos
vegetais ou no meio de cultivo Segundo Caldas et al (1999)
uma alta relaccedilatildeo citocininaauxina normalmente leva a maior
induccedilatildeo de parte aeacuterea (brotos) em explantes in vitro
principalmente quando a citocinina usada eacute o BAP que induz
a formaccedilatildeo de grande nuacutemero de brotos e alta taxa de
multiplicaccedilatildeo em muitos sistemas de micropropagaccedilatildeo
Tanto no presente trabalho quanto nos trabalhos acima
citados foram utilizados meios com pelo menos uma
combinaccedilatildeo com alta relaccedilatildeo citocininaauxina e meios
contendo apenas citocinina
CONCLUSOtildeES
A maior induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo tanto de calos
quanto de brotos foi observada nos meacutetodos cotileacutedone
fendido e cotileacutedone aparado quando colocados no meio
com BAP (25 mgL) e AIA (02 mgL) (MIII) Um ciclo de
repicagem foi suficiente para obtenccedilatildeo de brotos
alongados A maior regeneraccedilatildeo de brotos alongados
ocorreu com o meacutetodo cotileacutedone decapitado
Meios M1 + 05 mgL BAP M1 + 08 mgL BAP M1 + 10 mgL BAP
Repicagem 1 Repicagem 2 Repicagem 3
M1+ 05 mgl AIA
Tipos de Explante
s
Nordm total de brotos
Nordm de brotos
alongados
Nordm total de brotos
Nordm de brotos
alongados
Nordm total de brotos
Nordm de brotos
alongados
Nordm total de placircntulas
enraizadas
Nordm total de
plantas aclimatadas
Nordm total geral de brotos
A 3117 bA 899 aA 3684 bA
866 aA 3174 bA
81 aA 80 67 181 B 536 aA 466 bA 6244 aA 633 aA 5158 aA 450 bA 41 33 163 C 3527 bA 400 bA 4368 bA
566 aA 3928 bA
312 bA 43 35 205
Total 164 135 549
Capacidade de regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro 93
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
AGRADECIMENTOS
Ao Instituto de Geneacutetica e Bioquiacutemica e ao Instituto
de Ciecircncias Agraacuterias da Universidade Federal de
Uberlacircndia pelo financiamento deste projeto e a todos
que auxiliaram direta eou indiretamente
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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SILVA A S et al94
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
INDUCcedilAtildeO DE CALOS A PARTIR DE CULTURA DE ANTERAS DECAFEEIRO (Coffea arabica L) CV CATUAIacute VERMELHO 99 E 44
CALLUS INDUCTION FROM ANTHER CULTURE OF COFFEE PLANT (Coffea arabica L) CV CATUAIacute VERMELHO 99 AND 44
ADELAIDE SIQUEIRA SILVA1 JOSEacute MAGNO QUEIROZ LUZ2 DENISE GARCIA SANTANA2 PATRIacuteCIA CRYSTIE VIEIRA MUSTAFA3 MOACIR PASQUAL4 GLAUCIA DE FATIMA MOREIRA VIEIRA E SOUZA2
1Mestranda do Curso de Agronomia ndash Universidade Federal de UberlacircndiaUFU ndash Av Engenheiro Diniz 1178 ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash adelaidebioyahoocombr2Professor Dr ndash Universidade Federal de UberlacircndiaUFU ndash Instituto de Ciecircncias Agraacuterias ndash Curso de Agronomia ndash AV Paraacute Bloco 2E SALA 14campus Umuarana ndash Caixa-Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG3Bioacuteloga Universidade Federal de UberlacircndiaUFU ndash Centro de Ciecircncias Biomeacutedicas ndash Departamento de Agronomia ndash Rua Amazonas snordm - Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos sala 2E-14 ndash Umuarama ndash 38400920 ndash Uberlandia MG ndash patriciacrystiezipmailcombr
4Doutor Departamento de Adgricultura DAG ndash Universidade Federal de Lavras UFLA ndash Campus universitaacuterio ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash mpasqualuflabr
RESUMONo Brasil o cafeacute ainda apresenta poucos progressos com
relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo da cultura de tecidos vegetais tornando-se degrande importacircncia o conhecimento sobre a atuaccedilatildeo dosreguladores de crescimento Com este trabalho avaliou-se ocomportamento de duas cultivares de Coffea arabica L CatuaiacuteVermelho LCH-2077-2-5-99 e LCH-2077-2-5-44 denominadasrespectivamente de Catuaiacute Vermelho 99 e Catuaiacute Vermelho 44quanto agrave ausecircncia e presenccedila de luz e quantificou-se a interaccedilatildeoentre os reguladores de crescimento 24-D e BAP O experimentofoi realizado no Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos Vegetais daUniversidade Federal de Uberlacircndia As anteras das cultivaresCatuaiacute Vermelho 99 e 44 foram inoculadas em meio basal MSsuplementado com quatro concentraccedilotildees de 24-D (905 181271 e 362 mM) e duas concentraccedilotildees de BAP (0 e 89 mM) napresenccedila de luz e ausecircncia de luz As avaliaccedilotildees para a oxidaccedilatildeointumescimento e calosidade foram realizadas aos 30 dias apoacutes ainoculaccedilatildeo no meio de cultura e o diacircmetro dos calos aos 45 diasApoacutes 30 dias de cultivo os calos obtidos foram classificados emfriaacuteveis esverdeados esbranquiccedilados e cinza Os resultadosmostraram que para ocorrer intumescimento das anterasformaccedilatildeo e aumento do tamanho dos calos de ambas cultivares eacutenecessaacuterio que haja interaccedilatildeo entre a auxina (24-D) e a citocinina(BAP) Dentre os tipos de calos os de coloraccedilatildeo cinza foram osque apresentaram maior frequumlecircncia para as duas cultivares
Termos para indexaccedilatildeo Melhoramento calos reguladores decrescimento cafeeiro
ABSTRACTIn Brazil coffee still presents little progress regarding
the application of plant tissue culture which turns important theunderstanding of the action of growth regulators This workevaluated the in vitro performance of two Coffea arabica Lcultivars Catuaiacute Vermelho LCH-2077-2-5-99 and LCH-2077-2-5-44 known as Catuaiacute Vermelho 99 and Catuaiacute Vermelho 44respectively in the presence and absence of light and theinteraction of 24-D and BAP The experiment was carried out at
the Plant Tissue Culture Laboratory of the Universidade Federalde Uberlacircndia Anthers from both cultivars were inoculated inMS basal medium supplemented with four concentrations of24-D (905 181 271 and 362 mM) and two concentrations ofBAP (0 or 89 mM) in the presence and absence of lightOxidation intumescences and callus formation evaluations wereobtained 30 days after inoculation and callus diameter measuredat 45 days of inoculation The observed callus was classified asfriable greenish whitish or gray The results showed that antherintumescences callus formation and growth of both cultivarsdemand the interaction between the auxin (24-D) and thecytokinin (BAP) Callus presenting gray color were the mostfrequent for both cultivars
Index terms Plant breeding callus growth regulators coffee plant
INTRODUCcedilAtildeO
O cafeeiro pertence agrave famiacutelia Rubiaceae na qual o
gecircnero Coffea abrange cerca de 60 espeacutecies sendo as mais
comuns no mercado Coffea araacutebica L e Coffea canephora
Pierre ex Froehn Os programas de melhoramento do cafeacute
demandam aproximadamente 25 anos desde a hibridaccedilatildeo
ateacute a obtenccedilatildeo de uma nova cultivar (PASQUAL et al
2002) A cultura de anteras eacute considerada uma ferramenta
importante pois possibilita a obtenccedilatildeo de linhas
homozigoacuteticas em uma uacutenica etapa (ANDRADE 1998)
acelerando drasticamente o processo de obtenccedilatildeo de novas
cultivares Sendo assim a teacutecnica de cultura de anteras
vem auxiliar no melhoramento da cultura pois permite a
obtenccedilatildeo de haploacuteides em geraccedilotildees segregantes o que
leva agrave raacutepida produccedilatildeo de plantas homozigotas por meio
(Recebido em 14 de outubro de 2003 e aprovado em 29 de outubro de 2006)
Induccedilatildeo de calos a partir de cultura 95
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
da duplicaccedilatildeo do nuacutemero de cromossomos numa uacutenica
etapa substituindo as geraccedilotildees de auto fecundaccedilatildeo
Acrescenta-se a isso o fato de os haploacuteides serem livres
dos problemas de dominacircncia e recessividade por possuir
apenas um alelo em cada loco gecircnico
No Brasil Coffea arabica ainda apresenta poucos
progressos com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo da cultura de anteras
Daiacute a importacircncia de se produzir mais conhecimentos sobre
a atuaccedilatildeo dos reguladores de crescimento na expressatildeo
androgeneacutetica de Coffea arabica identificaccedilatildeo de
genoacutetipos androgecircnicos bem como a determinaccedilatildeo de
condiccedilotildees fiacutesicas mais adequadas agrave incubaccedilatildeo de anteras
nessa espeacutecie
Nos programas de melhoramento as teacutecnicas
convencionais tecircm apresentado resultados promissores
na cultura do cafeacute no que se refere ao aumento de
produtividade e obtenccedilatildeo de novas cultivares Um fator
importante para o sucesso da cultura de anteras eacute conhecer
o estaacutedio ideal de desenvolvimento dos microacutesporos com
o intuito de se obter uma melhor resposta androgeneacutetica
utilizando microacutesporos receacutem-liberados da teacutetrade meioacutetica
ateacute no maacuteximo o estaacutedio binucleado A fase uninucleada
responde positivamente ao processo embriogecircnico porque
nesta fase os microacutesporos apresentam uma parede celular
delgada o que a torna mais receptiva aos fatores externos
Em estaacutedios mais avanccedilados da microsporogecircnese ocorre
um engrossamento da parede celular sendo esta uma
caracteriacutestica do gratildeo de poacutelen maduro do cafeacute
prejudicando o processo de regeneraccedilatildeo (ASCANIO amp
ARCIA 1994) Os autores Grando amp Moraes Fernandes
(1993) sugerem que o potencial embriogecircnico do gratildeo de
poacutelen pode ser determinado tanto no periacuteodo da meiose
quanto no periacuteodo da preacute-mitose do microacutesporo pois
nestes dois momentos o microacutesporo ainda teria
metabolicamente caracteriacutesticas esporofiacuteticas o que
permite a diferenciaccedilatildeo do gratildeo de poacutelen em embriatildeo e
posterior formaccedilatildeo de uma planta
Segundo Mantell et al (1994) satildeo possiacuteveis vaacuterios
tipos de desenvolvimento do microacutesporo in vitro sendo
que tanto o nuacutecleo generativo quanto o vegetativo pode
se dividir continuamente originando um embrioacuteide
haploacuteide ou ainda a primeira mitose produziria dois nuacutecleos
semelhantes e estes se dividiriam repetidamente resultando
na formaccedilatildeo de embrioacuteides haploacuteides
A composiccedilatildeo do meio de cultura tambeacutem eacute de
grande importacircncia para o sucesso da cultura de anteras
natildeo existindo contudo uma recomendaccedilatildeo generalizada
Na maioria das espeacutecies a androgecircnese se verifica em meios
que conteacutem sais minerais sacarose vitaminas reguladores
de crescimento e aacutegar (MORAES FERNANDES 1990) A
consistecircncia do meio normalmente eacute semi-soacutelida mas os
meios liacutequidos estatildeo sendo cada vez mais usados pois
tecircm vantagens no aumento do rendimento pela maior
obtenccedilatildeo de embriotildees e calos (PIERIK 1987) O
presente trabalho teve como objetivo aplicar a teacutecnica da
cultura de anteras em diferentes cultivares de Coffea
arabica verificando os vaacuterios fatores que influenciam a
induccedilatildeo de calos
MATERIAL E MEacuteTODOS
Experimentos de Induccedilatildeo e Regeneraccedilatildeo de Calos
Esta etapa constituiu-se de dois experimentos cada
um com uma cultivar tendo sido conduzidos no laboratoacuterio
de Cultura de Tecidos Vegetais da Universidade Federal
de Uberlacircndia em Uberlacircndia - Minas Gerais no periacuteodo
de setembro de 2002 a janeiro de 2003
Foram utilizados bototildees florais de duas cultivares
de Coffea araacutebica Catuaiacute Vermelho LCH-2077-2-5-99 e
LCH-2077-2-5-44 denominadas respectivamente de Catuaiacute
Vermelho 99 e Catuaiacute Vermelho 44 plantadas na aacuterea
experimental do Campus Umuarama dessa Universidade
Os bototildees florais foram coletados no periacuteodo de 8 agraves 9
horas da manhatilde e armazenados em placas de Petri contendo
papel de filtro umedecido em aacutegua destilada e colocados
dentro de uma caixa de isopor para evitar a desidrataccedilatildeo
ateacute serem conduzidos ao laboratoacuterio
No laboratoacuterio o comprimento dos bototildees foi
medido com o auxiacutelio de um paquiacutemetro e utilizaram-se
SILVA A S et al96
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
bototildees florais entre 45 a 60 mm de comprimento em todos
os experimentos Os bototildees foram envoltos em gaze
previamente autoclavada e desinfestados em uma soluccedilatildeo
de aacutelcool 70 por alguns segundos e por 10 minutos em
soluccedilatildeo de hipoclorito de soacutedio a 02 sob agitaccedilatildeo Em
seguida na cacircmara de fluxo laminar foram lavados 3 vezes
em aacutegua destilada e autoclavada Apoacutes este processo as
anteras foram retiradas dos bototildees com o auxiacutelio de uma
lupa uma pinccedila fina e bisturi nordm 10 sendo os uacuteltimos
flambados para cada botatildeo tomando-se o cuidado para
natildeo ferir as anteras Logo apoacutes as anteras foram imersas
por 1 segundo em soluccedilatildeo de aacutecido ascoacuterbico na
concentraccedilatildeo de 600 mgL-1 hipoclorito de soacutedio 02 e
aacutegua destilada e autoclavada respectivamente
Apoacutes este processo as anteras foram inoculadas
em tubo de ensaio contendo 20 mL do meio MS
(MURASHIGE amp SKOOG 1962) suplementado com aacutecido
24-diclorofenoxiaceacutetico (24-D) e 6- benzilaminopurina
(BAP) em diferentes concentraccedilotildees com pH ajustado para
58 Este meio foi esterilizado em autoclave vertical agrave
temperatura de 121deg C sob pressatildeo de 1 atm por 20 minutos
O delineamento experimental utilizado foi o de
blocos casualizados com 10 repeticcedilotildees em esquema fatorial
4 x 2 x 2 sendo que os fatores foram compostos de quatro
concentraccedilotildees de 24-D (905 181 271 362 mM) duas
concentraccedilotildees de BAP (0 e 89 mM) perfazendo oito
tratamentos incubados na ausecircncia ou presenccedila de luz
em sala de crescimento com temperatura de 25 plusmn 2degC e 16
horas de fotoperiacuteodo Nos dois experimentos cada
tratamento teve 10 repeticcedilotildees sendo um tubo com 10
anteras considerado uma repeticcedilatildeo
Aos 30 dias apoacutes a inoculaccedilatildeo das anteras foram
avaliadas as porcentagens de oxidaccedilatildeo de intumescimento
e de formaccedilatildeo de calos (calosidade) e aos 45 dias foi medido
o diacircmetro dos calos
Os calos obtidos das duas cultivares apoacutes 45 dias
de inoculaccedilatildeo das anteras foram transferidos para o meio
MS suplementado com 30 gL-1 de sacarose 6gL-1 de agar e
de 24-DBAP nas seguintes concentraccedilotildees de 1810 181
2 2710 e 3620 mM com pH ajustado para 58 associando
a ausecircncia e presenccedila de luz
Apoacutes a permanecircncia destes calos no meio de cultura
por 30 dias aqueles provenientes da cultivar Catuaiacute
Vermelho 99 incubados na presenccedila de luz foram
transferidos para o meio de cultura contendo 271 mM de
24-D enquanto que aqueles incubados na ausecircncia de
luz foram transferidos para meio contendo 362 mM de 24-
D Jaacute os calos da cultivar Catuaiacute Vermelho 44 incubados
na presenccedila de luz foram transferidos para meio contendo
181 mM de 24-D e 89 mM de BAP e os incubados na
ausecircncia de luz transferidos para o meio contendo 181
mM de 24-D
Apoacutes 30 dias neste tratamento foram avaliadas as
caracteriacutesticas referentes ao tipo de calo (friaacuteveis
esverdeados esbranquiccedilados e cinza)
Os dados obtidos foram testados quanto agrave
normalidade e agrave homogeneidade necessitando de
transformaccedilatildeo em arco seno para os dados em
porcentagem e raiz quadrada de (x + 05) para os dados
referentes ao diacircmetro dos calos
RESULTADOS
Interaccedilatildeo entre os Reguladores de Crescimento e oFotoperiacuteodo
Para a cultivar Catuaiacute 99 em todas as concentraccedilotildees
de 24-D e independentemente da concentraccedilatildeo de BAP a
oxidaccedilatildeo foi menor na ausecircncia de luz diferindo
estatisticamente da fase em que se tinha presenccedila de luz
No entanto nos calos cultivados nas concentraccedilotildees de
905 e 271 mM de 24-D e 89 mM de BAP na ausecircncia de
luz foi observado um aumento significativo na oxidaccedilatildeo
das anteras o mesmo acontecendo na concentraccedilatildeo de
271 mM de 24-D na presenccedila de luz No entanto resultado
inverso foi observado para a concentraccedilatildeo de 362 mM de
24-D (Tabela 1)
Os resultados do percentual de intumescimento
variaram bastante em funccedilatildeo da luminosidade e
reguladores de crescimento (Tabela 1) Na presenccedila do
Induccedilatildeo de calos a partir de cultura 97
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
BAP e concentraccedilatildeo 89 mM de 24-D tanto na presenccedila
ou ausecircncia de luz o intumescimento dos calos natildeo diferiu
significativamente Jaacute na concentraccedilatildeo de 181 mM de 24-
D na presenccedila de luz se mostrou melhor promovendo um
aumento significativo do intumescimento das anteras
Quanto agraves concentraccedilotildees de 271 e 362 mM de 24-D
cultivados na presenccedila de luz se mostrou melhor ao
intumescimento quando comparado agravequeles cultivados na
ausecircncia de luz (Figura 1)
A presenccedila de calos aumentou significativamente
com a incubaccedilatildeo das anteras na ausecircncia de luz e na
TABELA 1 ndash Meacutedias do nuacutemero de anteras oxidadas intumescidas e com calos e diacircmetro dos calos (mm) em funccedilatildeode diferentes concentraccedilotildees de 24-D e ausecircncia ou presenccedila de BAP em duas condiccedilotildees de luminosidade (presenccedilaou ausecircncia de luz) para anteras do genoacutetipo cv 99
Luminosidade1
Oxidaccedilatildeo () Intumescimento ()
Calosidade () Diacircmetro (mm) 24-D M
BAP M luz Escuro Luz Escuro luz Escuro luz Escuro 0 980 b A 395 a A 000b B 434 a A 000 b A 740 a A 000 b A 309 a A 905
89 999 b A 823 a B 398 a A 327 a B 007 b A 615 a A 000 b A 300 a A 0 999 b A 524 a A 000 b B 447 a A 007 b A 750 a A 000 b B 368 a A
181 89 935 b A 511 a A 614 a A 407 b A 030 b A 720 a A 300 b A 387 a A
0 745 b A 000 a A 534 a A 000 b B 530 a A 000 b B 318 a B 000 b B 271
89 914 b B 590 a B 625 a A 634 a A 708 a A 809 a A 377 a A 298 b A 0 999 b B 440 a A 607 a A 492 b A 097 b B 815 a A 300 a B 277 a A
362 89 813 b A 426 a A 493 a B 527 a A 378 b A 758 a A 398 a A 298 b A
1Meacutedias seguidas por letras diferentes minuacutesculas na linha e maiuacutesculas na coluna dentro de cada concentraccedilatildeo de 2-4-D diferem entre si pelo teste de Tuckey a significacircncia de 5
concentraccedilatildeo de 271 mM de 24-D nas demais
concentraccedilotildees de 24-D independente da concentraccedilatildeo
do BAP a incubaccedilatildeo na ausecircncia de luz apresentou
meacutedias de calosidade significativamente maiores (Figura
2) A presenccedila do BAP promoveu aumento significativo
na calosidade das anteras na concentraccedilatildeo 271 mM de
24-D na ausecircncia de luz e na concentraccedilatildeo de 362 mM
de 24-D na presenccedila de luz Nas demais concentraccedilotildees
natildeo houve diferenccedila significativa entre presenccedila ou
ausecircncia de BAP tanto na ausecircncia ou presenccedila de luz
(Tabela 1)
FIGURA 1 ndash Anteras da cv Catuaiacute Vermelho 99 naconcentraccedilatildeo de 181 M de 24-D na presenccedila de luz
FIGURA 2 ndash Calos de anteras incubadas na ausecircncia deluz e na concentraccedilatildeo de 271 M de 24-D
SILVA A S et al98
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
Quanto ao diacircmetro nas concentraccedilotildees 905 e 181 M
de 24-D a ausecircncia de luz promoveu aumento significativo
no diacircmetro dos calos diferindo-se estatisticamente do
tratamento na presenccedila de luz Somente para a concentraccedilatildeo
de 271 mM de 24-D na ausecircncia do BAP natildeo houve diferenccedila
significativa para a caracteriacutestica independentemente do
fotoperiacuteodo Nas demais concentraccedilotildees de 24-D o tratamento
na presenccedila de luz promoveu um aumento significativo no
diacircmetro dos calos No tratamento em que houve a associaccedilatildeo
da presenccedila de luz e de BAP natildeo diferiu estatisticamente do
tratamento em que houve a ausecircncia de BAP quando a
concentraccedilatildeo de 24-D foi de 905 mM nos demais
proporcionou aumento significativo no diacircmetro dos calos
Para o tratamento na ausecircncia de luz apenas na concentraccedilatildeo
de 271 mM de 24-D a ausecircncia de BAP promoveu diminuiccedilatildeo
significativa no diacircmetro de calos Nas demais concentraccedilotildees
natildeo houve diferenccedila significativa entre presenccedila ou ausecircncia
de BAP (Tabela 1)
Para as variaacuteveis intumescimento e calosidade da
cultivar cv 44 a interaccedilatildeo entre 24-D e BAP natildeo diferiram
estatisticamente quanto presenccedila e ausecircncia de luz nas
concentraccedilotildees 905 e 362 mM de 24-D e que tambeacutem natildeo
difere para o diacircmetro na concentraccedilatildeo de 181 mM de 24-
D Jaacute na concentraccedilatildeo 271 mM de 24-D haacute uma semelhanccedila
quanto ao intumescimento calosidade e diacircmetro que
diferem das demais concentraccedilotildees natildeo apresentando
portanto uma boa interaccedilatildeo
A melhor interaccedilatildeo para intumescimento calosidade
e diacircmetro encontra-se respectivamente na concentraccedilatildeo
905 mM de 24-D na presenccedila de luz na concentraccedilatildeo 181
mM de 24-D na ausecircncia de luz e na concentraccedilatildeo 905
mM de 24-D na ausecircncia de luz Jaacute as piores interaccedilotildees
estatildeo na concentraccedilatildeo 271 mM de 24-D na luz tanto para
o intumescimento quanto para o diacircmetro analisados na
Tabela 2
De acordo com a Tabela 2 observou-se que os
melhores resultados ou seja as interaccedilotildees independem
da presenccedila ou ausecircncia de BAP Na Tabela 3 notou-se
uma maior oxidaccedilatildeo das anteras quando incubadas no claro
estas apresentaram uma maior oxidaccedilatildeo em relaccedilatildeo as que
foram incubadas no escuro tornando-se mais tarde calos
previamente oxidados
TABELA 2 ndash Meacutedias do nuacutemero de anteras intumescidas e com calos diacircmetro dos calos (mm) em funccedilatildeo de diferentesconcentraccedilotildees de 24-D e ausecircncia ou presenccedila de BAP em duas condiccedilotildees de luminosidade (luz e escuro) para anterasdo genoacutetipo cv 44
Luminosidade1
Intumescimento () Calosidade () Diacircmetro (mm) 24-D ( M)
BAP ( M) Luz Escuro Luz Escuro Luz Escuro
0 907 a A 775 a A 779 bA 948 aA 609 bA 800 aA 905 89 843 a A 875 a A 889 aA 946 aA 607 aA 420 bB 0 887 a A 852 a A 939 aA 990 aA 490 aA 466 aA
181 89 906 a A 786 a A 917 aA 959 aA 420 aA 493 aA 0 600 b A 772 a A 694 bA 895 aA 000 bA 373 aA
271 89 022 b B 827 a A 294 bB 837 aA 000 bA 376 aA 0 828 a A 737 a A 928 aA 939 aA 414 bA 595 aA
362 89 866 a A 725 a A 949 aA 866 aA 329 aA 376 aA
1Meacutedias seguidas por letras diferente minuacutesculas na linha e maiuacutesculas na coluna dentro de cada concentraccedilatildeo de 2-4-D diferem entre si pelo teste de Tukey a significacircncia de 5
Induccedilatildeo de calos a partir de cultura 99
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
TABELA 3 ndash Meacutedias de oxidaccedilatildeo das anteras entre asdiferentes concentraccedilotildees de 24-D em duas condiccedilotildeesde luminosidade (luz e escuro) para anteras da cultivarCatuaiacute Vermelho 44
Concentraccedilotildees
24-D ( M ) OXIDACcedilAtildeO ()
Claro Escuro 905 749 a 269 b 181 420 a 270 b 271 999 a 221 b 362 308 a 334 a
1Meacutedias seguidas por letras diferentes minuacutesculas na linhadentro de cada concentraccedilatildeo de 2-4-D diferem entre sipelo teste de Tukey a significacircncia de 5
TABELA 4 ndash Tipos de calos obtidos apoacutes 30 dias em meioMS com 362 M de 24-D na ausecircncia de luz da cultivarCatuaiacute Vermelho 99
Tipos de Calos
Nuacutemero de Calos
Nuacutemero de Calos com diacircmetro acima
de 05 mm Friaacuteveis 03 Esverdeados 13 06 Esbranquiaccedilados
03 Cinza 26
Dados de contagem natildeo transformados O recultivo emmeio MS com 362 M de 24-D na presenccedila de luz teve100 de contaminaccedilatildeo apoacutes sua inoculaccedilatildeo
TABELA 5 ndashTipos de calos obtidos apoacutes 30 dias em meioMS com 181 M de 24D e 89 M de BAP na presenccedilade luz da cultivar Catuaiacute Vermelho 44
TABELA 6 ndash Tipos de calos obtidos apoacutes 30 dias em meioMS com 181 M de 24D na ausecircncia de luz da cultivarCatuaiacute Vermelho 44
Tipos de Calos Nuacutemero de Calos
Nuacutemero de Calos com diacircmetro
acima de 05 mm Friaacuteveis 58 Esverdeados 23 214 Esbranquiaccedilados 94 Cinza 203
Tipos de Calos
Nuacutemero de Calos
Nuacutemero de Calos com diacircmetro
acima de 05 mm Friaacuteveis 25 Esverdeados 11 69 Esbranquiaccedilados 19 Cinza 350
Dados de contagem natildeo transformados Dados de contagem natildeo transformados
Nesta etapa a maioria dos calos encontrados para
as trecircs cultivares apresentaram coloraccedilatildeo cinza (Tabelas 4
5 e 6) A perda gradativa da coloraccedilatildeo natural dos calos
passando de verdes para a cor marrom a diminuiccedilatildeo do
ritmo de crescimento dos mesmos a estagnaccedilatildeo do
processo de formaccedilatildeo de embrioacuteides seguido do
surgimento de aacutereas necrosadas na superfiacutecie satildeo sinais
que caracterizam a senescecircncia da cultura (SILVA 2002)
DISCUSSAtildeO
A resposta das anteras da cultivar Catuaiacute Vermelho 99
com relaccedilatildeo agrave oxidaccedilatildeo indica que a mesma estaacute associada agrave
combinaccedilatildeo entre auxina e citocinina promovendo os menores
iacutendices de oxidaccedilatildeo Agrave medida que se aumentou a
concentraccedilatildeo de 24-D na presenccedila de BAP houve um
aumento gradativo da oxidaccedilatildeo ateacute atingir um ponto maacuteximo
em torno de 80 na dosagem de 271 mM de 24-D Jaacute na
ausecircncia de BAP a oxidaccedilatildeo foi bem maior quando comparada
agrave porcentagem de oxidaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 905 mM de
24-D De acordo com Wang amp Huang (1976) o cultivo in
vitro por um periacuteodo longo induz a formaccedilatildeo de compostos
fenoacutelicos no meio que podem causar necrose e posteriormente
morte dos calos Maciel (2001) e Paluacute (2002) citam que pelos
resultados obtidos para a induccedilatildeo de calogecircnese em anteras
de cafeeiro observa-se que eacute necessaacuteria uma auxina
juntamente com uma citocinina Dentre as auxinas sinteacuteticas
o 24-D eacute sem duacutevida o mais adequado agrave induccedilatildeo e
manutenccedilatildeo do calo (GAMBORG et al 1976)
Para Thomas amp Ravindra (1997) o maior problema
na iniciaccedilatildeo de culturas lenhosas eacute a ocorrecircncia de
compostos fenoacutelicos que estatildeo ligados com processos de
regulaccedilatildeo de crescimento especialmente com as auxinas
que dependendo da sua concentraccedilatildeo endoacutegena no tecido
resulta na induccedilatildeo desses compostos
SILVA A S et al100
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
O fotoperiacuteodo que estas anteras foram submetidas
influenciou tambeacutem na porcentagem de oxidaccedilatildeo sendo
que no escuro e na presenccedila de 24-D (89 mM) a oxidaccedilatildeo
foi miacutenima Agrave medida que foi aumentando a concentraccedilatildeo
da auxina foi aumentando tambeacutem a oxidaccedilatildeo poreacutem este
aumento foi bem menor quando comparado ao cultivo das
anteras na presenccedila de luz
A oxidaccedilatildeo fenoacutelica tem sido controlada em
diferentes espeacutecies lenhosas pela reduccedilatildeo da intensidade
luminosa (MARKS amp SIMPSON 1990) associada com a
substituiccedilatildeo frequumlente do meio de cultura e dessa forma
as chances de se obter sucesso no estabelecimento e
cultivo de explantes de espeacutecies lenhosas satildeo bastante
elevadas (TEIXEIRA 2001)
Em muitas espeacutecies por razotildees natildeo conhecidas a
embriogecircnese direta eacute rara e as plantas tecircm que ser
diferenciadas a partir de calos Para induccedilatildeo destes
geralmente eacute necessaacuteria uma auxina (MAHESHWARI et
al 1982) Segundo Rocha (1998) para a induccedilatildeo e
manutenccedilatildeo do calo a maioria das espeacutecies parece
comportar-se diferentemente natildeo soacute quanto aos
reguladores de crescimento podendo ocorrer
independentemente de auxinas e citocininas dependente
de ambas ou dependente de uma ou de outra mas tambeacutem
quanto agrave presenccedila ou ausecircncia de luminosidade Sharp et
al (1973) obtiveram calos atraveacutes do cultivo de sementes
folhas e anteras de C arabica das cultivares Mundo Novo
e Bourbon Amarelo A induccedilatildeo de calos tambeacutem foi mais
eficiente na ausecircncia de luz Aleacutem disso Ascanio amp Arcia
(1994) citam que para o desenvolvimento do calo as
anteras devem ser mantidas no escuro jaacute para o
desenvolvimento do embriatildeo os calos devem ser mantidos
no claro
Natildeo houve a formaccedilatildeo de embriotildees e isto pode ser
devido agraves doses de reguladores ou mesmo de combinaccedilotildees
que natildeo foram apropriadas para estas cultivares
CONCLUSAtildeO
Os resultados mostraram que para ocorrer
intumescimento das anteras formaccedilatildeo e aumento do
tamanho dos calos de ambas as cultivares eacute necessaacuterio
que haja interaccedilatildeo entre a auxina (24-D) e a citocinina
(BAP) e incubaccedilatildeo no escuro
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PEREIRA F D et al102
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COMUNICACcedilAtildeO CIENTIacuteFICA
PROLIFERACcedilAtildeO IN VITRO DE BROTOS DE CURAUAacuteUTILIZANDO DIFERENTES VOLUMES DE MEIO DE CULTURA
IN VITRO SHOOT PROLIFERATION OF Ananas erectifolius USING DIFFERENTVOLUMES OF CULTURE MEDIUM
FLAacuteVIA DIONIacuteSIO PEREIRA1 JOSEacute EDUARDO BRASIL PEREIRA PINTO2HELEN CRISTINA DE ARRUDA RODRIGUES3 LUCIANA DOMICIANO SILVA ROSADO3
LUIZ ALBERTO BEIJO4 OSMAR ALVES LAMEIRA5
1Doutoranda em Agronomia ndash Universidade Estadual de Feira de SantanaUEFS ndash Horto Florestal ndash 44055-000 ndash Feira de Santana BA ndash flavia1808hotmailcom
2Doutor em Fisiologia Vegetal ndash Departamento de AgriculturaDAG ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash jeduardouflabr
3Graduanda em Agronomia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG4Doutorado em Agronomia ndash Universidade Federal de AlfenasUNIFAL ndash Departamento de Ciecircncias Exatas ndash Rua Gabriel Monteiro da Silva n deg 714 ndash Centro ndash 37130-000 ndash Alfenas MG ndash luizbeijoyahoocombr5Doutor em Agronomia ndash EMBRAPA ndash Amazocircnia Oriental ndash Trav Dr Eneacuteas Pinheiro sn ndash Bairro Marco ndash 66095-100 ndash Beleacutem PA ndash osmarcpatuembrapabr
RESUMOCurauaacute [Ananas erectifolius LBSm ndash Bromeliaceae] eacute
uma espeacutecie com grande potencial de uso de suas fibras comorevestimento na induacutestria automobiliacutestica Aleacutem disso o poacute dosumo do curauaacute tem sido utilizado no tratamento de cicatrizaccedilatildeode lesotildees cutacircneas Neste trabalho avaliaram-se diferentes volumesde meio MS Os volumes utilizados foram de 10 15 20 25 e 30 mLO delineamento experimental foi inteiramente casualizado (DIC)e cada tratamento continha 19 repeticcedilotildees Aos 30 dias avaliaram-se o nuacutemero e o tamanho de brotaccedilotildees Segundo a anaacutelise devariacircncia houve efeito linear do volume de meio na produccedilatildeo debrotos de curauaacute Agrave medida em que se aumenta o volume domeio aumenta o nuacutemero de brotos Natildeo houve diferenccedilasignificativa nos comprimentos dos brotos
Termos para indexaccedilatildeo Ananas erectifolius fibras vegetaismicropropagaccedilatildeo
ABSTRACTAnanas erectifolius LBSm ndash Bromeliaceae is a species
that presents fibers with great potential to be used as revetmentfor the automobile industry Besides the powder obtained fromits juice has been used in the treatment of skin lesionscicatrisation In this work the effect of different volumes (1015 20 25 and 30 mL) of MS medium during the in vitro cultureof axillary buds was evaluated A completely randomized design(CDR) was used with each treatment containing 19 replicatesAfter 30 days of inoculation shoot number and size wereevaluated The analysis of variance showed a linear effect of theculture medium volume and shoot proliferation Higher shoot
number was observed with the increase of medium volume Nosignificant difference was observed on shoot lenght
Index terms Ananas erectifolius vegetable fibermicropropagation
A produccedilatildeo de fibras vegetais ocupa um papel
relevante na economia agriacutecola mundial mesmo com a
intensa produccedilatildeo de fibras sinteacuteticas Mateacuterias-primas de
origens renovaacuteveis reciclaacuteveis e biodegradaacuteveis satildeo uma
das alternativas para a produccedilatildeo de manufaturados
ecologicamente corretos em consequumlecircncia do acuacutemulo
nos descartes de materiais natildeo biodegradaacuteveis os quais
tendem a aumentar com o crescimento populacional nos
centros urbanos A substituiccedilatildeo de materiais derivados do
petroacuteleo na produccedilatildeo de compostos elastomeacutericos por
mateacuteria-prima renovaacutevel vai ao encontro desses ideais
(ROCHA et al 2003)
As fibras sinteacuteticas destacam-se pela elevada
resistecircncia baixa densidade e elevada produccedilatildeo
Entretanto as fibras animais e vegetais satildeo as de maior
importacircncia principalmente para atender aos apelos
(Recebido em 31 de agosto de 2006 e aprovado em 19 de janeiro de 2007)
Proliferaccedilatildeo in vitro de brotos de curauaacute 103
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 102-106 2006
ecoloacutegicos e pelo nuacutemero de plantas e animais produtores
de fibras (SCHREIBER1998)
As plantas produtoras de fibras utilizaacuteveis foram
quantificadas por vaacuterios autores e em diferentes eacutepocas
tendo sido enumeradas 2000 mil plantas fibrosas e o seu
total estimado em 2300 destacando-se as florestas tropicais
que encerram recursos inesgotaacuteveis em potencial
(MEDINA 1959)
O curauaacute [Ananas erectifolius LBSm ndash
Bromeliaceae] utilizado principalmente na fabricaccedilatildeo de
cordas sacos e utensiacutelios domeacutesticos surge como
sucedacircneo para o aproveitamento de fibras O curauaacute eacute
uma bromeliaacutecea distribuiacuteda nos Estados do Paraacute Acre
Mato grosso Goiaacutes e Amazonas e eacute cultivada
principalmente por pequenos produtores da regiatildeo do
Lago Grande de Curuai no municiacutepio de Santareacutem PA
Estudos recentes tecircm demonstrado o grande potencial do
uso das fibras dessa planta como revestimento na induacutestria
automobiliacutestica devido agrave sua resistecircncia maciez e peso
reduzido O grande problema eacute que natildeo haacute suprimento
suficiente de mateacuteria-prima para atender agrave induacutestria
automobiliacutestica pois o curauaacute eacute fiel agraves suas origens amazocircnicas
e soacute se desenvolve em clima quente e uacutemido criando um
problema para a aquisiccedilatildeo de mudas fora desta regiatildeo que
por tal motivo eacute escassa no mercado (SILVA 2004)
A micropropagaccedilatildeo utilizando teacutecnicas de cultura
de tecido tem sido um valioso instrumento na propagaccedilatildeo
de diversos tipos de plantas Embora este processo envolva
diferentes etapas depois de definido um protocolo de
micropropagaccedilatildeo seja qual for a espeacutecie este pode ser
otimizado no intuito de se obter placircntulas de alta qualidade
e com baixo valor de produccedilatildeo O tipo e tamanho de frasco
e a quantidade de meio satildeo variaacuteveis que tecircm recebido
pouca atenccedilatildeo embora afetem diretamente a aacuterea superficial
da interface meio de cultura-atmosfera o volume de ar sobre
o meio de cultura e a sua profundidade Tais fatores tambeacutem
afetam a composiccedilatildeo da fase gasosa do frasco e
consequumlentemente o crescimento e desenvolvimento das
culturas (GRATTAPAGLIA amp MACHADO 1998)
Rodrigues et al (2005) verificaram maior
proliferaccedilatildeo de brotos de Cattleya persivaliana Hort
em frascos contendo 50 mL de meio quando comparados
com aqueles de 25 75 e 100 mL Nicoloso amp Erig (2002)
trabalhando com Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen
verificaram que 10 mL de meio MS (MURASHIGE amp
SKOOG 1962) proporcionaram o melhor crescimento
das placircntulas em biomassa quando cultivadas em tubos
de 20 cm de altura x 2 cm diacircmetro em comparaccedilatildeo com
os de 25 cm de altura x 2 cm 15 cm de altura x 2 cm
Carvalho et al (1995) estudando a influecircncia de fatores
fiacutesicos no desenvolvimento e crescimento in vitro de
batata-doce (Ipomoea batatas L Poir) verificaram que
10 mL de meio de cultura por frasco com explantes
proporcionaram maior formaccedilatildeo de gemas em relaccedilatildeo
aos volumes de 20 e 30 mL
Sendo assim objetivou-se neste trabalho avaliar
o volume de meio apropriado para a propagaccedilatildeo in vitro
de brotaccedilotildees de curauaacute
As brotaccedilotildees utilizadas como fonte de explante
foram fornecidas pela EMBRAPACPATU situada em
Beleacutem do Paraacute Gemas axilares de curauaacute foram
inoculadas em meio MS completo suplementado com
20 mgL de BAP (6-Benzilaminopurina) Apoacutes 30 dias
estas se desenvolveram e as brotaccedilotildees obtidas foram
transferidas para o meio MS sem regulador de
crescimento por 30 dias
Apoacutes este periacuteodo quatro explantes foram
desfolhados completamente ficando apenas porccedilotildees
basais com aproximadamente 1cm de comprimento que
foram inoculadas em meio de cultura baacutesico MS sem
regulador de crescimento em frasco de 12 cm de altura por
5 cm de diacircmetro (volume interno = 300 mL) com volumes
de 10 15 20 25 30 mL Os explantes foram mantidos em
sala de crescimento a uma temperatura de 26plusmn1degC e
fotoperiacuteodo de 16 horas sob uma Irradiacircncia de foacutetons de
25mmol m-2 s-1
O delineamento experimental foi inteiramente
casualizado (DIC) Cada tratamento continha 19 repeticcedilotildees
PEREIRA F D et al104
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 102-106 2006
(um frasco por repeticcedilatildeo) Aos 30 dias avaliaram-se o
nuacutemero e o comprimento das brotaccedilotildees O programa
utilizado para anaacutelise dos dados foi o software statistica
(SISVAR) tendo sido submetidas agrave anaacutelise de variacircncia
com aplicaccedilatildeo do teste F a 5 de probabilidade
analisando-se as meacutedias por regressatildeo polinomial
O efeito linear foi o mais adequado para explicar
a evoluccedilatildeo da taxa meacutedia de regeneraccedilatildeo do curauaacute Agrave
medida que o volume do meio de cultura aumenta existe
tendecircncia de aumento do nuacutemero de brotos Com 25
mL de meio produziu-se maior nuacutemero de brotos por
frasco (2557) e com 10 mL de meio produziu-se menor
nuacutemero de brotos (1226) O tratamento com 15 mL de
meio produziu 1765 brotos o com 20 mL 1750 e o com
30 mL 2242 (Figura 1) O volume maior de meio
disponibiliza mais nutrientes e diminui tambeacutem a
competiccedilatildeo entre as placircntulas o que explica a tendecircncia
em se obter um maior nuacutemero de brotos agrave medida que
se aumenta a quantidade do meio de cultura Em todos
os tratamentos as brotaccedilotildees obtidas foram vigorosas
com a coloraccedilatildeo verde-escura caracteriacutestica das
plantas matrizes As brotaccedilotildees tinham tambeacutem rigidez
outra caracteriacutestica da espeacutecie o que eacute devido agrave
presenccedila das fibras nas folhas Observou-se maior
concentraccedilatildeo de raiacutezes nas brotaccedilotildees maiores e natildeo
FIGURA 1 ndash Nuacutemero meacutedio de brotos por frasco de curauaacute(Ananas erectifolius) cultivados em diferentes volumesde meio MS completo 10 15 20 25 e 30
foi observada a presenccedila de calos em nenhum dos
tratamentos (Figura 2)
Resultados semelhantes foram obtidos por Reis
Lameira Reis (2004) trabalhando com curauaacute utilizando
volumes de 5 75 10 e 15 mL do meio liacutequido MS suplementados
com 25 mgL-1 de BAP (6-benzilaminopurina) os melhores
resultados sendo com os tratamentos que continham 10 e
15ml produzindo em meacutedia 121 e 154 brotosexplante
respectivamente
Da mesma forma Reis et al(2003) trabalhando com
ipeca (Psychotria ipecacuanha Stokes) em meio MS
acrescido de 15 mg L-1de BAP nos volumes de 10 20 30
e 40 mL obtiveram melhor resultado com os volumes de 30
e 40 mL (7 e 8 brotosfrasco respectivamente)
Quanto ao comprimento dos brotos natildeo houve
diferenccedila significativa Os brotos t iveram um
crescimento meacutedio de 228 cm sendo que no tratamento
com 10 mL de meio foi 257 cm com 15 mL 222 cm
com 20 mL 224 cm com 25 mL 224 cm e o tratamento
com 30 mL 215 cm Embora natildeo se tenham realizado
estudos mais aprofundados uma das hipoacuteteses
sugeridas para explicar tais resultados possivelmente
estaacute relacionada a fatores nutricionais do explante
Segundo Cappelades et al (1991) e Pereira et al (2001)
porccedilotildees basais satildeo mais robustas apresentando maior
quantidade de reservas acumuladas em seus tecidos
o que poderia levar agrave utilizaccedilatildeo dessas reservas pelas
brotaccedilotildees regeneradas para sustentar seu crescimento
Esta seria uma das causas da uniformidade apresentada
no tamanho das brotaccedilotildees em todos os tratamentos
Resultados iguais foram obtidos em estudos feitos por
Rodrigues et al (2005) quando avaliaram comprimento
meacutedio de duas espeacutecies de orquiacutedeas mantidas em meio
de cultura cujos volumes testados eram de 25 50 75 e
100 mL Portanto verifica-se que eacute muito importante
selecionar material com bom estado fisioloacutegico e
tamanho homogecircneo para se obter melhores
resultados na proliferaccedilatildeo das brotaccedilotildees eou na
morfogecircnese
Proliferaccedilatildeo in vitro de brotos de curauaacute 105
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 102-106 2006
FIGURA 2 ndash Brotaccedilotildees de curauaacute (Ananas erectifolius) produzidas in vitro em diferentes volumes de meio MS 1-Repicagem dos brotos 2- 10 mL de meio MS 3- 15 mL de meio MS 4- 20 mL de meio MS 5- 25 mL de meio MS 6- 30mL de meio MS
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
CARVALHO R FAVARETTO N PINTO J E B P Influecircnciade fatores fiacutesicos no desenvolvimento e crescimento in vitrode batata-doce (Ipomea batatas (l) Peir Ciecircncia e PraacuteticaLavras v 19 n 2 p 158-164 abrjun 1995
CAPPELADES M LEMEUR R DEBERGH P Effects ofsucrose on starch acumulation and rate of photosyntesisin Rosa cultured in vitro Plant Cell Tissue and OrganCulture Amsterdam v 25 n 1 p 21-26 Apr 1991
GRATTAPAGLIA D MACHADO M A MicropropagaccedilatildeoIn TORRES A C CALDAS L S (Ed) Cultura de tecidos etransformaccedilatildeo geneacutetica de plantas Brasiacutelia EMBRAPA-SPIEMBRAPA-CNPH 1998 p 183-260
MEDINA J C Plantas fibrosas da flora mundialCampinas Instituto agronocircmico 1959 913 p
MURASHIGE T SKOOG F A Revised medium for rapidgrowth and biossays with tobacco tissue cultures PhysiologiaPlantarum Copenhagen v 15 n 3 p 473-479 1962
PEREIRA F D et al106
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 102-106 2006
NICOLOSO F T ERIG A C Efeito do tipo de segmentonodal e tamanho do recipiente no crescimento de plantasde Pfaffia glomerata in vitro Ciecircncia e AgrotecnologiaLavras v 26 p 1499-1506 dez 2002 Ediccedilatildeo especial
PEREIRA F D BRAGA M F SAacute M E L ALCINO OG COLENGHI I C Influecircncia de BAP e NAA namultiplicaccedilatildeo de abacaxi cv Perolera a partir de brotosestiolados in vitro Bioscience Journal Uberlandia v 17n 2 p 49-60 Dec 2001
REIS Eacute S PINTO J E B P CORREcircA R MPEREIRA F D BERTOLUCCI S K V Influecircncia dosmeios MS e WPM associados a diferentesconcentraccedilotildees de Benzilaminopurina na multiplicaccedilatildeode ipeca (Psychotria ipecacuanha (Brot) Stokes InCONGRESSO BRASILEIRO DE CULTURA DE TECIDOSDE PLANTAS 1 2003 Lavras Anais Lavras UFLA2003 p 273
REIS J N R LAMEIRA O M REIS L R S1Aprimoramento de protocolos de propagaccedilatildeo in vitro de
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ROCHA E C GHELER JUacuteNIOR J Aproveitamento deresiacuteduos gerados na aglomeraccedilatildeo de fibras de coco comLaacutetex natural Mateacuteria Teacutecnica Disponiacutevel em lthttpwwwbiologocombrgt Acesso em jun 2003
RODRIGUES J D ARAUacuteJO A G ASSIS F A ACAVALLARI L L PASQUAL M Crescimento in vitro deplacircntulas de orquiacutedeas quantidade de meio de cultura enuacutemero de explantes In CONGRESSO DE INICIACcedilAtildeOCIENTIacuteFICA DA UFLA ndash CICESAL 18 2005 Lavras MGAnais Lavras UFLA 2005 1CD-ROM
SILVA C Paiacutes pesquisa mais fibras naturais para carrosDisponiacutevel em lthttpwwwsebrae_sccombrn o v o s _ d e s t a q u e s o p o r t u n i d a d e mostra_mateacuteriaaspcd_noticia=8356gt Acesso em out 2004
SCHREIBER V (Org) Vias de desenvolvimentosustentaacutevel as dimensotildees do desafio Beleacutem UFBANUMAPOEMAIDESP 1998 495 p (POEMA 6)
NORMAS PARA PUBLICACcedilAtildeO DE ARTIGOS E COMUNICACcedilOtildeES CIENTIacuteFICAS
1 Os conceitos e afirmaccedilotildees contidos nos artigos e comunicaccedilotildeesseratildeo de inteira responsabilidade do(s) autor(es)
2 A revista ldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquo editadasemestralmente pela Editora da Universidade Federal de Lavras(Editora UFLA) publica artigos cientiacuteficos e comunicaccedilotildeescientiacuteficas da aacuterea de cultura de tecidos de plantas elaboradospor membros da comunidade cientiacutefica nacional e internacionalNatildeo eacute cobrada taxa para publicaccedilatildeo de trabalhos Eacute condiccedilatildeofundamental que os artigoscomunicaccedilotildees submetidos agrave apreciaccedilatildeoda revista ldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquo natildeo forame nem seratildeo publicados simultaneamente em outro lugar Com aaceitaccedilatildeo do artigo para publicaccedilatildeo os editores adquirem amplose exclusivos direitos sobre o artigo para todas as liacutenguas e paiacutesesA publicaccedilatildeo de artigoscomunicaccedilotildees dependeraacute da observacircnciadas Normas Editoriais dos pareceres do Corpo Editorial e daComissatildeo ad hoc Todos os pareceres tecircm caraacuteter sigiloso eimparcial e tanto os autores quanto os membros do CorpoEditorial eou Comissatildeo ad hoc natildeo obtecircm informaccedilotildeesidentificadoras entre si
3 Os artigos e comunicaccedilotildees submetidos para publicaccedilatildeo deveratildeoser apresentados em CD utilizando-se o processador de textoMicrosoft Word for Windows (version 98 2000 XP ou 2003)ser escrito em liacutengua portuguesa inglesa ou espanhola e usarsomente nomenclaturas oficiais e abreviaturas consagradas natildeoempregando abreviaturas no tiacutetulo do artigo Juntamente com oCD deveratildeo ser enviadas 4 (QUATRO) vias sendo uma originale as demais coacutepias omitindo os autores e a chamada de rodapeacute daprimeira paacutegina (para serem enviadas aos consultores cientiacuteficos)impressas em papel branco tipo A4 (21cm x 297cm) ou emformulaacuterio contiacutenuo em uma soacute face espaccedilo duplo entre linhasfonte Times New Roman tamanho 12 observada uma margemde 3 cm para o lado esquerdo e de 2 cm para o direito 25 cm paramargem superior e inferior 25 cm para o cabeccedilalho e 25 cm parao rodapeacute Cada trabalho deveraacute ter no maacuteximo 14 paacuteginas ejunto do mesmo deveraacute ser encaminhado ofiacutecio dirigido ao EditorChefe da revista solicitando a publicaccedilatildeo do artigo Esse ofiacuteciodeveraacute ser assinado por todos os autores constar o endereccedilocompleto telefone e e-mail de todos Qualquer inclusatildeo exclusatildeoou alteraccedilatildeo na ordem dos autores deveraacute ser notificada medianteofiacutecio assinado por todos os autores (inclusive do autor excluiacutedo)
4 O artigo cientiacutefico deveraacute conter os seguintes toacutepicos a)TIacuteTULO suficientemente claro conciso e completo evitandopalavras supeacuterfluas Recomenda-se comeccedilar pelo termo querepresente o aspecto mais importante do trabalho com os demais
termos em ordem decrescente de importacircncia b) TIacuteTULO EMINGLEcircS c) NOME(s) DO(s) AUTOR(es) no maacuteximo 6 (seis)em letras maiuacutesculas um apoacutes o outro centralizados e no rodapeacuteda primeira paacutegina deveratildeo vir a formaccedilatildeo acadecircmica e aInstituiccedilatildeo onde trabalham d) RESUMO (de acordo comNBR6028 da ABNT) O resumo natildeo deve ultrapassar a 250(duzentos e cinquumlenta) palavras e natildeo possuir paraacutegrafos Apoacuteso Resumo devem-se incluir TERMOS PARA INDEXACcedilAtildeO(palavraschave) diferentes daqueles constantes do tiacutetulo eseparados por viacutergula Os termos para indexaccedilatildeo devem estardescritos na forma maiuacutescula e minuacutescula serem expressotildees queidentifiquem o conteuacutedo do artigo ser indicadas entre 3 e 5 e sepossiacutevel extraiacutedas do vocabulaacuterio Thesagro ndash Thesaurus AgriacutecolaNacional desenvolvido pela CENAGRI (indicaccedilatildeo da revistaldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquopara evitar o usode vaacuterios sinocircnimos como termos de indexaccedilatildeo) Se natildeo foremencontrados descritores disponiacuteveis para cobrirem a temaacutetica doartigo poderatildeo ser indicados termos ou expressotildees de usoconhecido e) ABSTRACT incluindo em seguida INDEXTERMS f) INTRODUCcedilAtildeO (incluindo a revisatildeo de literatura)g) MATERIAL E MEacuteTODOS h) RESULTADOS EDISCUSSAtildeO (podendo conter tabelas e figuras) i)CONCLUSOtildeES e j) REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
5 A comunicaccedilatildeo deveraacute conter os seguintes toacutepicos a)TIacuteTULO suficientemente claro conciso e completo evitandopalavras supeacuterfluas Recomenda-se comeccedilar pelo termo querepresente o aspecto mais importante do trabalho com os demaistermos em ordem decrescente de importacircncia Deve serapresentada a versatildeo do tiacutetulo para o idioma inglecircs b) TIacuteTULOEM INGLEcircS c) NOME(s) DO(s) AUTOR(es) no maacuteximo 6(seis) em letras maiuacutesculas um apoacutes o outro centralizados e norodapeacute da primeira paacutegina deveratildeo vir a formaccedilatildeo acadecircmica e aInstituiccedilatildeo onde trabalham d) RESUMO (de acordo comNBR6028 da ABNT) O resumo natildeo deve ultrapassar a 250(duzentos cinquumlenta) palavras e natildeo possuir paraacutegrafos Apoacutes oResumo devem-se incluir TERMOS PARA INDEXACcedilAtildeO(palavras-chave) diferentes daqueles constantes do tiacutetulo eseparados por viacutergula Os termos para indexaccedilatildeo devem estardescritos na forma maiuacutescula e minuacutescula serem expressotildees queidentifiquem o conteuacutedo do artigo ser indicadas entre 3 e 5 e)ABSTRACT incluindo em seguida INDEX TERMS f)TEXTO [sem subdivisatildeo poreacutem com introduccedilatildeo material emeacutetodos resultados e discussatildeo e conclusatildeo subtendidos(podendo conter tabelas ou figuras)] e g) REFEREcircNCIASBIBLIOGRAacuteFICAS
6 AGRADECIMENTOS ao fim do texto e antes das ReferecircnciasBibliograacuteficas poderatildeo vir os agradecimentos a pessoas ouinstituiccedilotildees O estilo tambeacutem aqui deve ser soacutebrio e claroindicando as razotildees pelas quais se fazem os agradecimentos
7 TABELAS E QUADROS deveratildeo ser inseridos apoacutes citaccedilatildeodos mesmos dentro do proacuteprio texto
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS as referecircnciasbibliograacuteficas devem ser citadas conforme a NBR60232002 daABNTA exatidatildeo das referecircncias constantes da listagem e a corretacitaccedilatildeo no texto satildeo de responsabilidade do(s) autor(es) doartigo
Orientaccedilotildees gerais- Deve-se apresentar todos os autores do documento cientiacutefico(fonte)- O nome do perioacutedico deve ser descrito por extenso natildeo deveser abreviado- Em todas as referecircncias deve-se apresentar o local de publicaccedilatildeo(cidade) a ser descrito no lugar adequado para cada tipo dedocumento- As referecircncias devem ser ordenadas alfabeticamente
EXEMPLIFICACcedilAtildeO (TIPOS MAIS COMUNS)
ARTIGO DE PERIOacuteDICO
VIEIRA R F RESENDE M A V de Eacutepocas de plantio deervilha em Patos de Minas Uberaba e Janauacuteba Minas GeraisCiecircncia e Agrotecnologia Lavras v 24 n 1 p 74-80 janmar 2000
LIVRO
a) Livro no todo
STEEL R G D TORRIE J H Principles and procedures ofstatistics New York McGraw-Hill Book l960 481 p
b) Parte de livro com autoria especiacutefica
FLEURY J A Anaacutelise ao niacutevel de empresa dos impactos daautomaccedilatildeo sobre a organizaccedilatildeo da produccedilatildeo de trabalho InSOARES R M S M Gestatildeo da empresa Brasiacutelia IPEAIPLAN 1980 p 149-159
c) Parte de livro sem autoria especiacutefica
MARTIM L C T Nutriccedilatildeo de bovino de corte em confinamentoIn ______ Confinamento de bovino de corte 2 ed Satildeo PauloNobel 1986 cap 3 p 29-89
DISSERTACcedilAtildeO E TESE
GONCcedilALVES R A Preservaccedilatildeo da qualidade tecnoloacutegicade trigo (Triticum aestivum L) e controle de Rhyzoperthadominica (F) durante o armazenamento em atmosferacontrolada com Co2 e N2 1997 52 f Dissertaccedilatildeo (Mestradoem Ciecircncia dos Alimentos) ndash Universidade Federal de LavrasLavras 1997
MATIOLI G P Influecircncia do leite proveniente de vacasmastiacuteticas no rendimento de queijo frescal 2000 55 pDissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncias dos Alimentos) - UniversidadeFederal de Lavras Lavras 2000
Nota ldquoA folha eacute composta de duas paacuteginas anverso e versoAlguns trabalhos como teses e dissertaccedilotildees satildeo impressos apenasno anverso e neste caso indica-se frdquo (ABNT NBR60232002p 18)
TRABALHOS DE CONGRESSO E OUTROS EVENTOS
SILVA J N M Possibilidades de produccedilatildeo sustentada de madeiraem floresta densa de terra firme da Amazocircnia brasileira InCONGRESSO FLORESTAL BRASILEIRO 6 1990 Campos doJordatildeo Anais Campos do Jordatildeo SBSSBEF 1990 p 39-45
DOCUMENTOS ELETROcircNICOS
As obras consultadas online satildeo referenciadas conformenormas especiacuteficas para cada tipo de documento (monografia notodo e em parte trabalho apresentado em evento artigo deperioacutedico artigo de jornal etc) acrescidas de informaccedilotildees sobreo endereccedilo eletrocircnico apresentado entre braquetes (lt gt)precedido da expressatildeo ldquoDisponiacutevel emrdquo e da data de acessoao documento precedida da expressatildeo ldquoAcesso emrdquo
Nota ldquoNatildeo se recomenda referenciar material eletrocircnico de curtaduraccedilatildeo nas redesrdquo (ABNT NBR60232000 p 4) Segundopadrotildees internacionais a divisatildeo de endereccedilo eletrocircnico no fimda linha deve ocorrer sempre apoacutes barra ()
Monografia (acesso online)
a) Livro no todo
TAKAHASHI T (Coord) Tecnologia em foco BrasiacuteliaSocinfoMCT 2000 90 p Disponiacutevel em lthttpwwwsocinfoorgbrgt Acesso em 22 ago 2000
b) parte de livro
TAKAHASHI T Mercado trabalho e oportunidades In ______Sociedade da informaccedilatildeo no Brasil livro verde BrasiacuteliaSocinfoMCT 2000 cap 2 p 13-24 Disponiacutevel em lthttpwwwsocinfogovbrgt Acesso em 22 ago 2000
c) Parte de congresso seminaacuterio etc
GIESBRECHT H O Avaliaccedilatildeo de desempenho de institutos depesquisa tecnoloacutegica a experiecircncia de projeto excelecircncia napesquisa tecnoloacutegica In CONGRESSO ABIPTI 2000Fortaleza Gestatildeo de institutos de pesquisa tecnoloacutegicaFortaleza Nutec 2000 Disponiacutevel em lthttpwwwabiptiorgbrgt Acesso em 01 dez 2000
d) Tese
SILVA E M Arbitrariedade do signo a liacutengua brasileira desinais (LIBRAS) 1997 144 p Dissertaccedilatildeo (Mestrado emLinguumliacutestica Aplicada e Estudo de Liacutengua) - Pontifiacutecia UniversidadeCatoacutelica de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 1997 Disponiacutevel em lthttpwwwterracombrvirtualbooks freebookportdid teseshtmgtAcesso em 28 nov 2000
Artigo de perioacutedico (acesso online)
RESENDE A M G Hipertexto tramas e trilhas de um conceitocontemporacircneo Informaccedilatildeo e Sociedade Recife v 10 n 12000 Seccedilatildeo Educaccedilatildeo Disponiacutevel em lthttpwwwinformaccedilatildeoesociedadeufpbbrgt Acesso em 30 nov 2000
CITACcedilAtildeO PELO SISTEMA ALFABEacuteTICO (AUTOR-DATA)(conforme ABNT NBR105202002)Dois autores - Steel amp Torrie (1960) ou (STEEL amp TORRIE1960)Trecircs ou mais autores - Valle et al (l945) ou (VALLE et al 1945)Obs Quando forem citados dois autores de uma mesma obradeve-se separaacute-los pelo sinal amp (comercial)
9 CASO O ARTIGO CONTENHA FOTOGRAFIASGRAacuteFICOS FIGURAS SIacuteMBOLOS E FOacuteRMULASESSAS DEVERAtildeO OBEDECER AgraveS SEGUINTESNORMAS
91 Fotografias deveratildeo ser apresentadas em preto e branconiacutetidas e com contraste inseridas no texto apoacutes a citaccedilatildeo dasmesmas e tambeacutem em um arquivo agrave parte salvas em extensatildeoldquoTIFFrdquo ou ldquoJPEGrdquo com resoluccedilatildeo de 300 dpi
92 Figuras deveratildeo ser apresentadas em preto e branco niacutetidase com contraste inseridas no texto apoacutes a citaccedilatildeo das mesmas etambeacutem em um arquivo agrave parte salvas em extensatildeo ldquoTIFFrdquo ouldquoJPEGrdquo com resoluccedilatildeo de 300 dpi As figuras deveratildeo serelaboradas com letra Times New Roman tamanho 10 semnegrito sem caixa de textos e agrupadas
93 Graacuteficos deveratildeo ser inseridos apoacutes citaccedilatildeo dos mesmosdentro do proacuteprio texto elaborado preferencialmente em Excelcom letra Times New Roman tamanho 10 sem negrito
94 Siacutembolos e Foacutermulas Quiacutemicas deveratildeo ser feitas emprocessador que possibilite a formataccedilatildeo para o programa PageMaker (ex MathType Equation) sem perda de suas formasoriginais
10 O Editor Chefe notificaraacute o autor do recebimento do originale posteriormente o informaraacute sobre sua publicaccedilatildeo Os artigosque necessitarem de modificaccedilotildees seratildeo devolvidos ao autor paraa devida revisatildeo
11 Os artigos natildeo aprovados seratildeo devolvidos
12 Os artigos seratildeo publicados em ordem de aprovaccedilatildeo
13 O natildeo-cumprimento dessas normas implicaraacute na devoluccedilatildeodo artigo ao autor
14 Os casos omissos seratildeo resolvidos pela Comissatildeo Editorial
15 O artigo deveraacute ser enviado para
ABCTPPlant Cell Culture amp MicropropagationUniversidade Federal de LavrasDepartamento de Biologia - Setor de Fisiologia VegetalCaixa Postal 3037Lavras ndash MGCEP 37200-000E-mail abctpuflabr
INSTRUCTIONS FOR AUTHORS
1 Concepts and affirmations included in articles andcommunications are of the entire responsibility of the authors
2 ldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquo a semestral journaledited by Editora UFLA of the Universidade Federal de Lavraspublishes scientific articles and communications in the area ofplant tissue culture elaborated by researchers of the national andinternational scientific community There are no page charges forpublication Submission of a manuscript implies that it is neitherunder consideration for publication elsewhere nor has appearedpreviously in part or in whole On acceptance for publicationauthors assign to the Editors full copyright of the manuscript inall languages and countries Publications will depend on editorialrules and on the review of experts and ad hoc commissionReviewer and editorial opinions will be anonymouslycommunicated to authors
3 The articles and communication submitted for publicationmust be presented in CD using the program Microsoft Wordfor Windows (version 98 2000 XP or 2003) written inPortuguese English or Spanish using only conventionalnomenclature At the time of submission authors are requiredto submit together with the CD 4 (four) hard copies one originaland three copies without the name(s) of the author(s) as well asthe footnote on the first page (to be used by the reviewers)printed on A4 white paper (21 cm x 297cm) or on continuousform typewritten only on one side double spaced using fontTimes New Roman size 12 with a 3 cm margin on the left handside and 20 cm margin on the right hand side 25 cm upper andlower margin 25 cm for the heading and 25 cm for the footnoteThe manuscript must present a maximum of 14 pages At thetime of submission a cover letter must be sent with themanuscript copies to the Editor requesting publication of thearticle This cover letter must be signed by all authors andalso contain the full address telephone number and e-mail ofthe authors Any inclusion exclusion or alteration in the authorsorder must be notified and signed by all authors including theone excluded
4 Each manuscript must be organized in a) TITLE sufficientlyclear conspicuous and complete without superfluous words Itis recommended to initiate with the term that represent the mostimportant aspect with other terms in decreasing of importanceb) TITLE in Portuguese c) FULL NAME(s) OF THEAUTHOR(s) maximum of 6 (six) in capital letters one after theother in the center of the page with the footnote of the first pagecontaining their professional qualification or academic training
and their work institution d) ABSTRACT written continuouslywithout paragraph It must not exceed 250 words Index termsmust be enclosed after the abstract using terms different fromthose used in the title and separated by comma The index terms(3 to 5) must be described in capital and small letters and expressthe content of the article e) ABSTRACT and INDEX TERMSin Portuguese f) INTRODUCTION (including literaturereview) g) MATERIAL AND METHODS h) RESULTS ANDDISCUSSION (it may include tables and figures) i)CONCLUSIONS and j) REFERENCES
5 Communication must have the following topics a) TITLEsufficiently clear conspicuous and complete without superfluouswords It is recommended to initiate with the term that representthe most important aspect with other terms in decreasing ofimportance The PORTUGUESE version of the title has to bepresented b) TITLE in Portuguese c) FULL NAME(s) OFTHE AUTHOR(s) maximum of 6 (six) in capital letters oneafter the other in the center of the page with the footnote of thefirst page containing their professional qualification or academictraining and their work institution d) ABSTRACT writtencontinuously without paragraph It must not exceed 250 wordsIndex terms must be enclosed after the abstract using termsdifferent from those used in the title and separated by commaThe index terms (3 to 5) must be described in capital and smallletters and express the content of the article e) ABSTRACTand INDEX TERMS in Portuguese f) TEXT (with no divisionbut must include introduction material and methods results anddiscussion and conclusion (it may include tables and figures) andg)REFERENCES
6 ACKNOWLEDGEMENTS Acknowledgements to peopleor institutions might be included at the end of the text priorReferences The written style must be serious and clear indicatingthe reasons of the acknowledgements made
7 TABLES AND FIGURES must be included right after theircitation in the text
8 REFERENCES references must be cited according toNBR60232002 of ABNT All references and their correct citationin the text are of the entire responsibility of the author(s)- Some important orientations all authors of the scientificdocument must be presented (source) the journal must be citedusing its full name all references must present the name of thecity where the journal was published all references must be citedalphabetically
9 PHOTOGRAPHS GRAPHS FIGURES SYMBOLS ORFORMULA CONTAINED IN THE ARTICLE SHOULDOBEY THE FOLLOWING RULES
91 Photographs must be presented in black and whiteclear and with contrast inserted in the text after their citationand also in a separate file (on the same diskette as the article)saved in extension ldquoTIFFrdquo or ldquoJPEGrdquo with resolution of300 dpi
92 Figures must be presented in black and white clear andwith contrast inserted in the text after their citation and also in aseparate file (on the same diskette as the article) saved inextension ldquoTIFFrdquo or ldquoJPEGrdquo with resolution of 300 dpiThey must be elaborated using Times New Roman font size10 without bold without text box and arranged
93 Graphs must be inserted in the text after their citationelaborated preferentially in Excel using Times New Romanfont size 10 without bold
94 Symbols and Chemical Formula must be presented usinga word processor that permits a format for Page Maker (exMathType Equation) without loss of its original form
10 The Brazilian Association of Plant Tissue Culture (ABCTP)will inform the author the receipt of the original manuscript andeventually it will also send information regarding its publicationManuscripts that require modifications will be returned to theauthor for the respective revision andcorrections
11 Manuscripts not approved will be returned to the author
12 Articles will be published according to the order of receiptand approval
13 If any of these rules are not attended the manuscript will bereturned to the author
14 Manuscripts should be sent to the following address
ABCTPPlant Cell Culture amp MicropropagationUniversidade Federal de LavrasDepartamento de Biologia - Setor de Fisiologia VegetalCaixa Postal 3037Lavras ndash MGCEP 37200-000BrazilE-mail abctpuflabr
In vitro propagation of Melissa officinalis L and production 53
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
IN VITRO PROPAGATION OF Melissa officinalis L AND PRODUCTIONOF ESSENTIAL OIL
IN VITRO PROPAGATION OF Melissa officinalis L AND PRODUCTION OFESSENTIAL OIL
SIMONE DA SILVA1 CELSO LUIZ SALGUEIRO LAGE2 MARIA APPARECIDA ESQUIBEL3ROSANE AGUIAR DA SILVA SAN GIL4 ALICE SATO5
1Doutoranda em Biotecnologia Vegetal ndashUFRJIBC Chagas Filho ndash Av Brigadeiro Trompowsky SN Ccs ndash Bloco G ndash Sala G2-050 ndash Cidade Universitaacuteria ndash Laboratoacuterio de Fisiologia Vegetal ndash Ilha do Fundatildeo ndash 21949-900 ndash Rio de Janeiro RJ ndash monybiofufrjbr
2Dr em Biofiacutesica ndashUFRJ ndash Instituto de Biofiacutesica Carlos Chagas Filho ndash Laboratoacuterio de Fisiologia Vegetal ndash Ilha do Fundatildeo ndash 21949-900 ndash Rio de Janeiro RJ ndash clslagebiofufrjbr3Poacutes-Doutorado em Bioeletrogecircnese ndash UFRJ ndash Instituto de Biofiacutesica Carlos Chagas Filho ndash Laboratoacuterio de Fisiologia Vegetal ndash Ilha do Fundatildeo ndash 21949-900 ndash Rio de Janeiro RJ ndash esquibelbiofufrjbr4Dra em Quiacutemica Orgacircnica ndash Ufrj DQO ndash Edifiacutecio do Centro de Tecnologia ndash Bloco A ndash Sala 605 ndash Ilha do Fundatildeo ndash Cidade Universitaacuteria ndash Caixa Postal 068556 ndash 21941-972 ndash Rio de Janeiro RJ ndash rsangilIqufrjbr5Dra em Biotecnologia Vegetal ndash UNIRIODCN ndash Centro de Ciecircncias Bioloacutegicas e da Sauacutede ndash Av Pasteur 458 Preacutedio da ECB ndash 4ordmandar Sala 415 URCA ndash 22290-240 ndash Rio de Janeiro RJ ndash alicesatouniriobr
ABSTRACTThis work presents an efficient protocol for micropropagation
of Melissa officinalis L through axillary bud proliferation obtainedfrom in vitro germinated seeds on basal Murashige amp Skoog medium(MS) The explants were grown on MS supplemented with differentgrowth regulators NAA (05 mM) KIN (05 mM) BA (05 mM)GA
3 (28 microM) and IAA (05 mM) Higher shoot proliferation and
rooting rates were obtained on MS supplemented with 05 microM IAAMicropropagated plants were acclimatized and transferred to soilwith success The essential oil composition in shoots of in vitro andfield-grown (ex vitro) plants was determined by gas chromatographymass spectrometry The major components of essential oils detectedin both plant materials were pujone neral geraniol and geranial Mofficinalis in vitro plantlets developed on MS media showed 14higher proportions of nerol and 41 of geraniol when compared withfield grown plants
Index terms Growth regulators medicinal plant tissue culture
RESUMOEste trabalho apresenta um protocolo raacutepido e eficiente
para propagaccedilatildeo in vitro de Melissa officinalis L atraveacutes daproliferaccedilatildeo de gemas axilares de plantas obtidas de sementesgerminadas em meio basal de Murashige amp Skoog (MS) Os explantesforam cultivados em meio de Murashige amp Skoog (MS) 1962com adiccedilatildeo de diferentes reguladores de crescimento Aacutecido alfa-naftaleno-aceacutetico (ANA ndash 05 mM) Cinetina (KIN ndash 05 mM)Benziladenina (BA ndash 05 mM) Aacutecido Gibereacutelico (GA
3 ndash 28 microM)
e Aacutecido Indolaceacutetico (AIA ndash 05 mM) O alongamento e formaccedilatildeode segmentos nodais maacuteximos foram obtidos com AIA Explantesdesenvolveram 5 novos brotos com 10 cm em meacutedia e 100 deenraizamento em 30 dias de cultura Plantas micropropagadasforam aclimatadas e transferidas para o solo com sucesso Acomposiccedilatildeo do oacuteleo essencial de partes aeacutereas de plantas produzidasin vitro e plantas crescidas em campo (ex vitro) foi determinadapor cromatografia gasosa acoplada agrave espectrometria de massas Os
principais componentes do oacuteleo essencial encontrados em ambosos materiais vegetais foram a pujona neral geraniol e geranial Asplantas de Melissa officinalis desenvolvidas in vitro em MSapresentaram aumento de 14 vezes na proporccedilatildeo do nerol e de 41na de geraniol quando comparadas agraves plantas ex vitro
Termos para indexaccedilatildeo Reguladores de crescimento plantamedicinal cultura de tecidos
INTRODUCTION
Melissa officinalis L (Lamiaceae) is a well-known
herb used to give fragrance to different food and beverage
products It has also been used as a medicinal plant for
treatment of headaches gastrointestinal disorders
nervousness and rheumatism The essential oil is a well-
known antibacterial and antifungal agent and it is also
responsible for the mild depressive and spasmolytic
properties of the plant Literature data pointed out antioxidant
properties of methanolic extracts of Melissa officinalis which
are mostly due to high portion of phenolic acids revealing
significant antimicrobial particularly antibacterial activity of
this essential oil (MIMICA-DUKIC et al 2004)
The chemical composition of the essential oil of
Melissa officinalis leaf (02-1 on dry weight) has been
studied The major compounds (10-40) are citral (neral
and geranial) and these are accompanied by limonene
cineole geraniol szlig-caryophyllene and spathulenol The
(Recebido em 06 de setembro de 2005 e aprovado em 21 de junho de 2006)
SILVA S da et al54
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
leaf also contains polyphenolic compounds
hydroxycinnamic derivatives with verbascoside (53)
flavonoids such as luteolin 7-glucoside and luteolin 7-
diglucuronide (08) These compounds probably
intervene in the antispasmodic activity Iridoid glucosides
were also reported and the infusion contains potassium
(CARNAT et al 1999)
Cultivation of medicinal plants for the purpose of
extraction of active constituents may face certain limitations
such as climate season water availability diseases and
pests and scarcity of naturally growing plants Such
limitations led to the use of tissue culture techniques for
production of the active constituents Tissue culture
provides means of rapid propagation of a large number of
uniform plants while maintaining their genotype Beneficial
uses of tissue culture for the purpose of extraction of
secondary metabolites include avoidance of collection of
endangered wild species production of secondary
metabolites due to rapid growth of cultures in vitro
(ARIKAT et al 2004)
Due to the importance of this plant for multiple
purposes and the difficulty to produce active compounds
in vitro the application of methods that provide higher
number of cloned plants of M officinalis is justified aiming
to select high quality plant lines to extensive culture and
extraction of pharmaceutical products In Brazil M
officinalis is used in phytomedicine by pharmaceutical
industries One of the most critical problems of
phytomedicine is the natural variation of plants chemical
constituents (CURRIER et al 2000) This variation could
be originated from genetical factors or under influence of
environmental characteristics
The use of in vitro systems have been reported as
an effective tool for obtaining genetically uniform plants
which can be the source for less variable pharmaceutical
preparations Plant regeneration of M officinalis has been
achieved using as explants cotyledonary nodes of 10-day-
old Melissa officinalis seedlings (TAVARES et al 1996)
shoot tips from plants cultivated at greenhouse
(MEacuteSZAacuteROS et al 1999) using various types and
concentrations of cytokinins auxins and triacontanol
(TANTOS et al 1999)
The aim of this work is to develop a
micropropagation method in order to obtain a significant
number of monoclonal plants for further field cultivation
comparing the essential oil content and composition
between micropropagated and field-grown plants
MATERIALS AND METHODS
Plant material
Representative specimens from field grown plants
of M officinalis were selected and submitted to Erika Von
Sohsten Medeiros and Angela Vaz (Rio de Janeiro
Botanical Garden) for the taxonomic confirmation A
voucher nordm RB ndash 365926 is deposited at the Herbarium of
Rio de Janeiro Botanic Garden
Melissa officinalis seeds were obtained from
commercial market ISLAR batch Nordm 8250 The seeds were
germinated and grown to the seedling stage in vitro Seeds
were pre-treated by immersion into 2 commercial bleach
solution (Globoacirc) for 20 min and then rinsed thoroughly
in running tap water After that the seeds were surface
sterilized in 70 ethanol for 20 min followed by 15 min in a
20 commercial bleach solution containing 2-3 drops of
Tween 20 under aseptic conditions and rinsed three times
with sterile distilled water The seeds were cultured on MS
(MURASHIGE amp SKOOG 1962) solid medium
supplemented with 30 gL-1 sucrose 148 mM thiamine-
HCl 243 mM pyridoxine-HCl 41 mM nicotinic acid and
06 mM myo-inositol The pH value was adjusted at 58 plusmn
01 before addition of 8 gL-1 of agar and the media were
sterilized in autoclave (120 degC during 15 min) The cultures
were incubed at 25 plusmn 1 degC under a 16 h light 8 h dark
regime at an irradiance of 230 mmolm-sup2s-1 (white light
illumination Sylvaniaacirc fluorescent tubes)
Establishment of in vitro shoot cultures
From in vitro 8-day-old germinated seeds plants
(20-30 cm in length) of three different clones designated
In vitro propagation of Melissa officinalis L and production 55
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
as clones 1 2 e 3 were selected and axillary shoot induction
takes place from nodal segments (1 cm in length)
subcultivated on MS hormone-free media (MS0) These
materials were used as donors of explants to be tested
with different culture media 05mM a-naphthaleneacetic
acid (NAA) 05mM kinetin (KIN) 05mM benzyladenine
(BA) 28 mM gibberellic acid (GA3) and 05mM indole-3-
acetic acid (IAA) Cultures were grown in 300 mL glass
flasks containing 40 ml of media each
Shoot proliferation rate length of both shoots and
roots and calli formation were monitored as growth
parameters Each treatment was replicated 3 times using
100 explants per repetition Subcultures were performed at
30 days intervals
Acclimatization
A total of 60 in vitro rooted microshoots (those grown
on MS + IAA during 30 days with average height of 10 cm
were removed from the medium and the agar washed gently
with tap water They were transferred to 60 cm diameter
plastic pots containing soil and humus (31 vv) and kept at
a greenhouse High humidity environment was provide by
covering the plants with a plastic foil and watering them
one time per day during the first 2 weeks Then plants were
gradually exposed to greenhouse conditions for 1 month
and finally transferred to the field where they were cultivated
during one year until complete life cycle
Extraction
Field-grown and fresh in vitro plantlets aerial parts
(100 g each) were submitted to hydro distillation for 140 h
in a Clevenger type apparatus as recommended by the
Brazilian Pharmacopoeia (1988) in replicate (n = 2) The
time between the isolation and analysis was the same in all
experiments to preclude differences in composition due to
external factors (SILVA et al 2003)
Gas chromatographic and gas chromatography-massspectrometric analysis
Gas chromatography with flame ionization
detection (GCFID) was carried out on a Varian Star Model
3350 instrument using a capillary column coated with DB-
5 (30 m x 025 mm i d 025 mm film thickness J amp W
Scientific Folsom CA USA) The GC oven was heated
using the following program 40 oC to 220 oC at 4 oC min-1
with an initial isothermal period of 1 min splitless The
detector and injector temperatures were held at 280 oC
Hydrogen was used as carrier gas The injection consisted
of 10 microL of distilled oil diluted with hexane The GCMS
analyses were carried out on a Hewlett-Packard (Agilent
Technologies Avondale USA) Model 5972 MSD coupled
to a HP 5890 GC The GC conditions were the same as
above except for the fact that helium was used as carrier
gas The mass spectrometer was operated on electron
impact mode at 70 eV Molecular assignments were
performed with the help of the Wiley 275 standard library
of mass spectra literature data (ADAMS 1995) authentic
geraniol standard (Sigma Part Number G5135) and mass
spectra interpretation besides the comparison with
previously published elution order (KREIS amp MOSAND
1994) Quantification was performed from GC profiles using
area percent since in the literature the FID response factor
for most of monoterpenes is determined as 1 (CARNAT et
al 1999)
Statistical analysis
Data for each experiment were subjected to analysis
of variance (ANOVA) and means were compared using the
Tukey-Kramer test Percent data were submitted to
significance test ndash difference between two percentages
using the Statistica for WindowsTM 50 version A
significance level of 5 was used for all statistical analysis
RESULTS AND DISCUSSION
In vitro multiplication of Melissa officinalis was
followed during four developing cycles Micropropagation
papers usually present an efficient protocol evaluated in
only one developing cycle This kind of protocol however
may fail when the cultures have to be kept during long
time many successive subcultures being necessary in
order to produce large number of clonal plants
SILVA S da et al56
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
In vitro establishment
In this work three different clones of M officinalis
were used and they had shown similar development
responses on in vitro cultures
The clones 1 and 2 had in vitro multiplication rate
lower than the clone 3 which means a decrease in the
absolute number of nodal segments (Fig 1A and B) From
these results the clone 3 was selected to run the tests
The average number of four new nodes was
produced by explant on MS0 after 30 days and this value
was used as a control to evaluate effects of the presence
of growth regulators in the media (Tab 1)
FIGURE 1 ndash Nodal segments development of three clones of Melissa officinalis on MS+ 05 M IAA during 30 daysA) Multiplication rate of in vitro culture from 2nd to 4th subcultures B) Number of nodal segments developed per clone
TABLE 1 ndash Effect of growth regulators in Melissa officinalis axillary segments culture after four weeks of culture
Culture Media
Shoot Explant
xplusmnse
Shoot Length (CM)
Multiplication Rate (ndeg of
Nodal Segment Explant)
Node Plantlet
xplusmnse
Root Frequency
()
Root Number
Explant xplusmnse
Root Length
(CM) xplusmnse
MS0 171B 403 08B 68C 41 B 50 105 11B 30 06B
05 M KIN 111C 349 11C 33D 31 C 50 073 09C 27 07C
28 M GA3 111C 100 03D 22E 21 D 50 071 09C 25 07C
05 M IAA 191B 1000 09A 95B 51 A 100 897 08A 137 08A
05 M NAA
301A 333 16C 90A 31 C 0 0 - 05 M BA 111C 385 54C 33D 31 C 0 0 -
Value are means (x) plusmn standard error (se) n=100 Values in the same column followed by the same letter do not differstatistically at Pdrdquo005
The influence of plant growth regulators and their
interactions on micropropagation of different plant species
have been discussed in detail by Lameira et al (2005) Rout
et al (1989) Rout amp Das (1997ab) Skirvin et al (1990) and
Zieslin et al (1989)
In this work addition of IAA to MS presented the
best results among all tested growth regulators in all
evaluated parameters However to shoot production there
is no statistical difference to the control The analysis of
effects of the other growth regulators shows that only
05mM NAA was able to improve shoot production
although it is not able to promote rhizogenesis
In vitro propagation of Melissa officinalis L and production 57
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
The use of MS plus 05mM Kinetin or 05mM BA
or 05mM NAA promoted the development of three nodal
segments per elongated plant in 30 days culture (Tab
1) However when BA was used these new shoots
exhibited apical necrosis When GA3 (28 mM) was added
to medium there was induction of only one shoot per
explant and after 30 days there were 2 nodes per
elongated shoot
There was no rooting in explants placed on MS
added of NAA and BA In MS medium containing KIN or
GA3
and in basic MS 50 of the shoots developed new
roots in 30 days of culture
The best result of rhizogenesis was presented
by explants cultured in MS plus IAA where 100 of
shoots rooted with more than 8 new roots per explant
(Tab 1) In terms of root length the cultures in MS
supplemented with IAA presented longer roots when
compared with the other media compositions used at
the present work
In short the addition of 05mM of IAA was chosen
as that presenting the best results in all evaluated
parameters (Fig 2A)
The action of IAA on the in vitro plant
development was in accordance to the known effects of
such hormone (CLELAND 1995) Shoot elongation was
obtained concomitantly with rooting in media MS plus
05 mM IAA That is specially interesting once it may
reduce the micropropagation process through nodal
segments explants to only three steps germination
shoot elongation and multiplication concomitant to
rooting this represents gain of time culture medium
and constitutes a quick micropropagation process
Tavares et al (1996) reported a micropropagation
utilizing cotyledonary nodes as explants The highest
average number of shoots in the two inoculations was
obtained with 2 mgL-1 of BA 24 axillary shoots per
explant 7 in the first inoculation and 17 in the second
one Shoots of the two inoculations were excised after
30 and 60 days respectively
Acclimatization
Melissa officinalis leaves are very sensitive to
water loss and this process is irreversible it was necessary
to provide a high humidity environment during the first
acclimatization period plants were covered with a plastic
foil during 2 weeks before being gradually exposed to
greenhouse conditions The acclimatization procedure
used for in vitro plants was successful and a total of 100
survival rate (n=60) was obtained Acclimatized plants
appeared normal and did not exhibit any morphological
abnormalities or variations These results permitted the
soil cultivation (Fig 2B) without chemical defensives
during one year up to the complete vegetative cycle
(flowering)
Essential oils content
Comparative analysis of the chromatographic
profiles showed high percentage of neral and geranial in
relation to nerol and geraniol in field grown (ex vitro)
plantlets and in MS0 (in vitro)
The relative content of the principal components
of essential oil of the aerial parts of M officinalis are
presented as mean peaks area () on Fig 2C geranial
(3813 and 4364) neral (2674 and 317) geraniol (329 and
153) and nerol (116 and 187) in plants cultured ex vitro
and in vitro respectively Plantlets developed in vitro on
MS0 media showed an increase of 14 times in the
proportion of nerol and 41 times of geraniol when
compared with ex vitro cultured plants
Field plants are exposed to considerable more
stressful conditions such as lower relative humidity higher
light levels and herbivory those are the more stressful
The latter conditions tend to favor a greater essential oil
accumulation (TAVARES et al 2004) On other hand
plantlets grown in vitro have been continuously exposed
to a unique microenvironment that has been selected to
provide minimal stress and nearly optimal conditions for
plant multiplication
SILVA S da et al58
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
FIGURE 2 ndash A) In vitro culture of Melissa officinalis on MS + IAA in 30 days of culture B) Ex vitro culture six monthsafter transference to soil maximum height 60 cm C) Composition and percentage of the most abundant essential oilcomponents of Melissa officinalis from aerial parts (100 g Fresh Weight) from in vitro e ex vitro culture
In vitro propagation of Melissa officinalis L and production 59
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
CONCLUSIONS
Melissa officinalis micropropagation can be made
using nodal segments from in vitro plants during 5 weeks
in MS media without growth regulators and posterior
subculture in MS media with 05 mM IAA for a better
development Multiplication rates of 44 and 40 were
obtained at the 3rd and 4th subcultures respectively
It was observed a significant difference between
the effects of auxins IAA and NAA The latter exerted an
unsatisfactory influence on the nodal segment formation
shoot length and rooting when compared with the results
obtained with IAA
The plants produced in vitro were vigorous and
after acclimatization they were well adapted After 1 month
at the greenhouse the survival rate was 100
Considering that the main objective of this work is
to produce monoclonal plants to be used by phytomedicine
industries it is important that the method presents a large
number of buds per explant This result plus an efficient
acclimatization stage can save time and produce
monoclonal plants in sufficient number to be used in
commercial field culture Our results showed a change in
the essential oil composition in the proportion of active
compounds However the characteristics of the oil of in
vitro and ex vitro M officinalis plants were not altered
The manipulation of the culture media composition
is an important biotechnological tool for the optimization
of the essential oils production With this technique this
work developed a protocol for highly production of plants
and productivity in the components (geraniol geranial and
neral) of the oil
ACKNOWLEDGMENTS
This work was supported by ICUNIRIO FAPERJ
and CNPq
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Crescimento in vitro de Laelia tenebrosa (Orchidaceae) 61
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
CRESCIMENTO IN VITRO DE Laelia tenebrosa (ORCHIDACEAE)EM DIFERENTES CONCENTRACcedilOtildeES DE SAIS DE KNUDSON C
E CARVAtildeO ATIVADO
IN VITRO GROWTH OF Laelia tenebrosa (ORCHIDACEAE) IN DIFFERENTCONCENTRATIONS OF KNUDSON C SALTS AND ACTIVATED CHARCOAL
APARECIDA GOMES DE ARAUJO1 MOACIR PASQUAL2 ALBA REGINA PEREIRA3HERMINIO SOUZA ROCHA4
1Doutoranda em AgronomiaFitotecnia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash agaraujo2003yahoocombr2Dr Professor Titular do Departamento de Agricultura ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash LavrasMG ndash mpasqualuflabr3Doutoranda no Jardim Botacircnico do Rio de Janeiro ndash ENBTJBRJ ndash Pacheco Leatildeo 915 ndash 22460-030 ndash Rio de Janeiro RJ4Doutorando em AgronomiaFitopatologia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash herminiouflanetcombr
RESUMOObjetivou-se testar diferentes concentraccedilotildees de carvatildeo
ativado adicionado ao meio Knudson C no crescimento in vitrode orquiacutedeas Placircntulas de Laelia tenebrosa (LA Rolfe) LARolfe com 1 a 15 cm de comprimento e contendo raiacutezes foraminoculadas em frascos contendo 40 mL de meio de cultura Ostratamentos consistiram na combinaccedilatildeo de concentraccedilotildees de carvatildeoativado (0 05 10 20 e 40 g L-1) e sais minerais de Knudson C(0 50 100 150 e 200) acrescidos de sacarose (20 g L-1) Omeio foi solidificado com 6 g L-1de aacutegar e o pH ajustado para58plusmn01 antes da autoclavagem a 121degC e 11 atm por 20 minutosApoacutes a inoculaccedilatildeo os frascos foram mantidos sob 25 plusmn 1degCfotoperiacuteodo de 16 horas e 32 mM m-2 s-1 de irradiacircncia Apoacutes 150dias verificou-se que a adiccedilatildeo de 2g L-1 de carvatildeo ativado ao meiocom metade dos sais de Knudson C promoveu melhor crescimentoin vitro das placircntulas de Laelia tenebrosa
Termos para indexaccedilatildeo Orquiacutedea meio de cultura cultura detecidos
ABSTRACTThe objective of this work was to test the effect of
Knudson C medium supplemented with different concentrationsof activated charcoal on the in vitro growth of orchids Plantletsof the Laelia tenebrosa (LA Rolfe) LA Rolfe measuring 1-15cm in length containing roots were inoculated in flasks containing40 mL of culture medium The treatments consisted of differentconcentrations of activated charcoal (0 05 10 20 and 40 g L-
1) combined with Knudson C salts (0 50 100 150 and 200)supplemented with sucrose (20 g L-1) The medium was solidifiedwith agar (6 g L-1) and pH adjusted to 58plusmn01 before autoclavingat 121ordmC and 11 atm during 20 minutes After inoculation theexplants were transferred to culture rooms with temperaturemaintained at 25plusmn1ordmC during a 16 hours photoperiod with a lightintensity of 32 microM m-2s-1 The best in vitro growth rates of
Laelia tenebrosa plantlets were obtained using Knudson C 50supplemented with 2 g L-1 activated charcoal after 150 days ofculture
Index terms Orchid culture medium tissue culture
INTRODUCcedilAtildeO
A produccedilatildeo de orquiacutedeas a partir germinaccedilatildeo
assimbioacutetica eacute uma alternativa viaacutevel para obtenccedilatildeo de
grande nuacutemero de plantas em curto espaccedilo de tempo
suprindo assim a necessidade dos produtores de
orquiacutedeas na aquisiccedilatildeo de mudas
Na cultura de tecidos os meios de cultura
geralmente satildeo compostos de uma fonte de carboidratos
macro e micronutrientes e outras substacircncias como
vitaminas aminoaacutecidos accediluacutecares agente solidificante
reguladores de crescimento (GEORGE amp SHERRINGTON
1984) e eventualmente aditivos como antibioacuteticos carvatildeo
ativado e componentes complexos
Knudson (1922) observou que era possiacutevel o
cultivo de sementes em meio artificial contendo minerais e
accediluacutecar sem a presenccedila de fungos micorriacutezicos
Posteriormente em 1946 ele aperfeiccediloou esse meio de
cultura sendo atualmente o mais utilizado comercialmente
na germinaccedilatildeo e desenvolvimento de orquiacutedeas (ARDITTI
amp ERNST 1992) No entanto satildeo necessaacuterios estudos
(Recebido em 23 de fevereiro de 2006 e aprovado em 10 de julho de 2006)
supplemented with
ARAUJO A G de et al62
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
pois satildeo descritos vaacuterios meios de cultura para muitos
gecircneros e espeacutecies diferentes
No cultivo e subcultivo de placircntulas do gecircnero
Cattleya George et al (1987) sugerem o meio Knudson C
(1946) ou Reinert amp Mohr (1967) Segundo Arditti amp Ernst
(1992) os meios de propagaccedilatildeo para Cattleya Laelia
Laeliocattleya e Brassocattleya podem ser os mesmos
citados anteriormente Villalobos et al (1994) sugerem o
meio Vacin amp Went (1949) para Cattleya Encyclia e
Oncidium suplementado com 25 de aacutegua de coco e o
meio Knudson C suplementado com 60 g L-1 de polpa de
banana para orquiacutedeas do gecircnero Stanhopea
O carvatildeo ativado normalmente eacute adicionado ao meio
de cultura em concentraccedilotildees que variam de 02 a 3
(BEYL 2000) O seu efeito natildeo-seletivo pode proporcionar
resultados negativos na micropropagaccedilatildeo Pesquisas
relatam a adsorccedilatildeo de tiamina aacutecido nicotiacutenico
(WEATHERHEAD et al 1978) piridoxina aacutecido foacutelico
reguladores de crescimento e quelatos de ferro
(JOHANSSON et al 1990) Entre os efeitos proporcionados
pela adiccedilatildeo do carvatildeo ativado ao meio de cultura
principalmente agrave organogecircnese e agrave embriogecircnese estatildeo
escurecimento do meio de cultura favorecendo o
enraizamento adsorccedilatildeo de substacircncias inibitoacuterias
produzidas pelo proacuteprio meio ou explante adsorccedilatildeo de
reguladores de crescimento e outros compostos orgacircnicos
e liberaccedilatildeo de substacircncias naturalmente presentes no
carvatildeo que beneficiariam o crescimento in vitro das culturas
(PAN amp STADEN 1998)
Arena amp Pastur (2001) citam que a adiccedilatildeo de carvatildeo
ativado ao meio de cultura promoveu alongamento das
brotaccedilotildees de Berberis buxifolia mas reduziu o iacutendice de
multiplicaccedilatildeo Hazra et al (2002) relataram o efeito
sinergiacutestico do carvatildeo ativado na multiplicaccedilatildeo e
enraizamento de brotaccedilotildees de algodoeiro Amin amp Jaiswal
(1987) Anderson (1980) e Damiano (1978) relataram o efeito
favoraacutevel do carvatildeo quando utilizado em baixas
concentraccedilotildees no enraizamento de brotaccedilotildees de
morangueiro framboeseira e goiabeira respectivamente
A diversidade de resultados obtidos com a utilizaccedilatildeo de
carvatildeo ativado deve-se principalmente ao genoacutetipo da
espeacutecie em questatildeo agrave adsorccedilatildeo de algumas substacircncias
quiacutemicas e compostos orgacircnicos aleacutem de metaboacutelitos
toacutexicos liberados no cultivo in vitro (Wang amp Huang 1976)
Este trabalho teve como objetivo verificar efeito de
diferentes concentraccedilotildees de sais de Knudson C e carvatildeo
ativado sobre o crescimento in vitro de placircntulas de
orquiacutedea da espeacutecie Laelia tenebrosa (LA Rolfe) LA Rolfe
MATERIAL E MEacuteTODOS
Placircntulas da espeacutecie Laelia tenebrosa com 1 a 15
cm de comprimento oriundas de sementes germinadas in
vitro e contendo raiacutezes foram inoculadas em frascos
contendo 40 mL do meio de cultura Knudson C nas
concentraccedilotildees de 0 (apenas aacutegua destilada e aacutegar) 50 100
(concentraccedilatildeo da formulaccedilatildeo original) 150 e 200 de sais
minerais combinado com carvatildeo ativado (0 05 1 2 e 4
mg L-1) suplementado com sacarose (20 g L-1)
O pH do meio foi ajustado para 58 plusmn 01 antes da
adiccedilatildeo de aacutegar (6 g L-1) O meio foi vertido em frascos de
vidro com capacidade para 250 cm3 vedados com tampas
plaacutesticas transluacutecidas natildeo perfuradas e autoclavados agrave
pressatildeo de 11 atm e agrave temperatura do 121degC durante 20
minutos Apoacutes a inoculaccedilatildeo os frascos contendo os
explantes foram mantidos em sala de crescimento com
irradiacircncia em torno de 32 mmol m-2 s-1 temperatura de 25 plusmn
1degC e fotoperiacuteodo de 16 horas
O delineamento experimental utilizado foi
inteiramente casualizado em esquema fatorial 5 x 5 com
quatro repeticcedilotildees de cinco placircntulas cada uma Decorridos
150 dias avaliou-se a meacutedia do nuacutemero de folhas nuacutemero
de raiacutezes comprimento da maior raiz comprimento da parte
aeacuterea e massa fresca de placircntulas Os dados foram
comparados por meio de regressatildeo polinomial empregando-
se o programa Sisvar (FERREIRA 2000)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Apenas para a variaacutevel nuacutemero de folhas houve
interaccedilatildeo entre os niacuteveis de sais e carvatildeo ativado Poreacutem
Crescimento in vitro de Laelia tenebrosa (Orchidaceae) 63
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
por meio do teste F somente as concentraccedilotildees de 50 e
100 de sais do meio Knudson C foram significativas em
relaccedilatildeo agraves concentraccedilotildees de carvatildeo ativado
Os melhores resultados (65 e 585) foram
verificados com 50 (metade) dos sais de Knudson C
combinado com 275 g L-1 de carvatildeo ativado e 100 de
sais com 4 g L-1 de carvatildeo respectivamente (Figura 1)
Com o aumento da concentraccedilatildeo do meio de cultura haacute
necessidade de maior concentraccedilatildeo de carvatildeo Sendo
assim o meio com 50 de sais aleacutem de proporcionar
melhores resultados eacute menos oneroso
Estes resultados contradizem os de Silva et al
(2003) que verificaram que a adiccedilatildeo de carvatildeo ativado ao
FIGURA 1 ndash Nuacutemero de folhas em placircntulas de Laeliatenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees de saisde Knudson C e carvatildeo ativado
meio de cultura inibe a formaccedilatildeo de folhas em placircntulas de
Brassocattleya lsquoPastoralrsquo x Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo
O efeito natildeo seletivo do carvatildeo ativado pode proporcionar
resultados negativos na micropropagaccedilatildeo (PAN amp
STADEN 1998)
Agrave medida em que aumentaram as concentraccedilotildees de
sais de Knudson C maiores quantidades de raiacutezes foram
formadas (Figura 2A) Observou-se maior nuacutemero de raiz
(43) com 965 de sais Para o fator carvatildeo ativado as
melhores respostas (395 raiacutezes) foram verificadas com a
utilizaccedilatildeo de 304 g L-1 adicionadas ao meio de cultura
(Figura 2B)
Para muitas espeacutecies o enraizamento eacute favorecido
pela adiccedilatildeo de carvatildeo ativado ao meio de cultura Hazra et
al (2002) relataram o efeito sinergiacutestico do carvatildeo ativado
na multiplicaccedilatildeo e enraizamento de brotaccedilotildees de
algodoeiro O meio MS com metade dos sais minerais
acrescido de 20 g L-1 de sacarose 7 g L-1 de aacutegar e 1 g L-1 de
carvatildeo ativado promoveu maior quantidade de raiacutezes em
placircntulas de Cattleya nobilior Rchb f (REIS et al 2003)
Segundo Paiva et al (2005) aleacutem de um equiliacutebrio
hormonal favoraacutevel agrave formaccedilatildeo de raiacutezes outros fatores
internos tecircm sido relacionados com a iniciaccedilatildeo do processo
de enraizamento como presenccedila de sacarose alta relaccedilatildeo
CN e nutrientes minerais (foacutesforo caacutelcio zinco e boro) O
meio Knudson C natildeo possui micronutrientes apresenta
uma concentraccedilatildeo maior de caacutelcio e tem baixas
FIGURA 2 ndash Nuacutemero de raiacutezes em placircntulas de Laelia tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees de sais deKnudson C (A) e concentraccedilotildees de carvatildeo ativado (B)
ARAUJO A G de et al64
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
concentraccedilotildees de N e K em relaccedilatildeo ao MS e WPM o que
provavelmente favoreceu tanto o nuacutemero quanto o
comprimento de raiacutezes (PASQUAL 2001)
O maior comprimento de raiz (331 cm) foi verificado
com a utilizaccedilatildeo de 100 de sais de Knudson C A partir do
ponto maacuteximo (100) houve diminuiccedilatildeo do comprimento
radicular provavelmente devido ao desbalanccedilo nutricional
(Figura 3A) Com o aumento das concentraccedilotildees de carvatildeo
ativado houve um incremento linear no comprimento de
raiacutezes Melhores resultados foram observados com a
utilizaccedilatildeo de 4 g Lndash1 de carvatildeo ativado (Figura 3B) Como a
relaccedilatildeo foi direta pode-se inferir que o efeito estimulante
do carvatildeo ativado no comprimento da maior raiz continuaria
para concentraccedilotildees superiores a 4 g L-1
A adiccedilatildeo de carvatildeo ativado no meio de cultura foi
beneacutefica promovendo tanto o nuacutemero quanto o
crescimento de raiacutezes O carvatildeo conteacutem impurezas que
podem favorecer o crescimento de raiacutezes jaacute existentes e
induzir emissatildeo de novas raiacutezes (PASQUAL 2001)
Melhores resultados para comprimento da parte
aeacuterea (18 cm) foram observados quando se utilizou o
meio Knudson C na concentraccedilatildeo de 121 de sais (Figura
4A) poreacutem na concentraccedilatildeo de 50 obtiveram-se
explantes com 17 cm de comprimento Essa diferenccedila
observada (01 cm) eacute muito pequena o que natildeo justifica a
utilizaccedilatildeo de um meio mais concentrado mas a reduccedilatildeo
do mesmo agrave sua metade
O enraizamento in vitro pode ser favorecido com o
uso de meio de cultura com a metade ou 75 da
concentraccedilatildeo normal de sais Em algumas espeacutecies altas
concentraccedilotildees de sais principalmente a presenccedila de iacuteons
amocircnio favorecem o desenvolvimento de raiacutezes enquanto
que em outras podem ser inibidoras (PASQUAL et al
2001)
O maior comprimento da parte aeacuterea (19 cm) foi
obtido na presenccedila de 4 g Lndash1 de carvatildeo ativado (Figura
4B) a concentraccedilatildeo de 2 g Lndash1 proporcionou um
comprimento de 18 cm Comparando-se os niacuteveis 4 e 2 g Lndash1
de carvatildeo ativado nota-se pequena diferenccedila (01 cm) o
que justifica a utilizaccedilatildeo de 2 g Lndash1
O carvatildeo ativado conteacutem impurezas que quando
liberadas no meio de cultura podem beneficiar ou natildeo o
crescimento in vitro Simotildees et al (1999) verificaram que a
concentraccedilatildeo de 1 g L-1 de carvatildeo ativado acrescida ao
meio Knudson C proporciona o melhor desenvolvimento
de brotos de Epidendrum sp e Dendrobium sp
Maior massa fresca de placircntulas (0144g) foi
verificada com a utilizaccedilatildeo de 50 de sais de Knudson C
ponto a partir do qual houve diminuiccedilatildeo no peso (Figura
5A) Provavelmente essa reduccedilatildeo ocorreu devido agrave
toxidez
A utilizaccedilatildeo de 4 g L-1 de carvatildeo ativado
proporcionou uma massa de 0185 g nas placircntulas frescas
(Figura 5B)
FIGURA 3 ndash Comprimento da maior raiz em placircntulas de Laelia tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees desais de Knudson C (A) e carvatildeo ativado (B)
Crescimento in vitro de Laelia tenebrosa (Orchidaceae) 65
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
FIGURA 4 ndash Comprimento da parte aeacuterea em placircntulas de Laelia tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees desais de Knudson C (A) e carvatildeo ativado (B)
FIGURA 5 ndash Massa fresca de placircntulas de L tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees de sais de Knudson C(A) e carvatildeo ativado (B)
O carvatildeo ativado eacute comumente utilizado na cultura
de tecidos de plantas Seu efeito eacute atribuiacutedo agrave adsorccedilatildeo de
substacircncias toacutexicas produzidas pelas plantas adsorccedilatildeo
de fitorreguladores do meio e escurecimento do meio onde
se desenvolvem as raiacutezes das plantas (GEORGE 1993)
O melhor desenvolvimento de Phalaenopsis in
vitro ocorreu na presenccedila de carvatildeo ativado na
concentraccedilatildeo de 2 g L-1 indicando que este possa ser um
elemento importante no processo (BRESSAN et al 1999)
Apesar do carvatildeo ativado na concentraccedilatildeo de 4 g
L-1 ter proporcionado melhores resultados verificou-se que
na concentraccedilatildeo de 2 g L-1 os efeitos apresentam uma
diferenccedila miacutenima Embora o carvatildeo ativado natildeo seja o
componente de maior custo no preparo de meio de cultura
a sua reduccedilatildeo juntamente com os sais minerais eacute
economicamente favoraacutevel especialmente para a produccedilatildeo
comercial de mudas
CONCLUSAtildeO
A adiccedilatildeo de 2 g L-1 de carvatildeo ativado ao meio de
cultura Knudson C com metade (50) de sais minerais
promoveu melhor crescimento em placircntulas de Laelia
tenebrosa cultivadas in vitro
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PROPAGACcedilAtildeO IN VITRO DE PLAcircNTULAS DE ORQUIacuteDEA EMDIFERENTES MEIOS DE CULTURA E CONCENTRACcedilOtildeES
DE CITOCININA
IN VITRO PROPAGATION OF ORCHID PLANTLETS CULTIVATED IN DIFFERENTCULTURE MEDIA AND CYTOKININ CONCENTRATIONS
APARECIDA GOMES DE ARAUJO1 MOACIR PASQUAL2 ADRIANO BORTOLOTTI DA SILVA3 FABIacuteOLA VILLA3 HERMIacuteNIO SOUZA ROCHA3 FERNANDA CARVALHO COSTA4
1Doutoranda em AgronomiaFitotecnia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash agaraujo2003yahoocombr2Professor Titular Departamento AgriculturaDAG ndash Universidade Federal de Lavras UFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200000 ndash Lavras MG ndash mpasqualuflabr3Doutorando em Agronomia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200000 ndash Lavras MG4Departamento de AgriculturaDAG ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash fecostapuryahoocombr
RESUMOA taxa de multiplicaccedilatildeo de orquiacutedeas a partir de meacutetodos
convencionais eacute bastante baixa natildeo atendendo as necessidadescomerciais A cultura de tecidos permite maiores taxas demultiplicaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de plantas uniformes e sadiasObjetivou-se estudar a influecircncia da citocinina BAP (6-benzilaminopurina) em diferentes meios de cultura napropagaccedilatildeo in vitro de placircntulas hiacutebridas de BrassocattleyalsquoPastoralrsquox Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo Placircntulas comaproximadamente 15plusmn05 cm de comprimento obtidasassimbioticamente foram transferidas para frascos comcapacidade de 250 cm3 contendo 40 mL das formulaccedilotildees salinasde MS WPM e Knudson C combinados com 0 05 10 20 e40 mg L-1 de BAP acrescidos de 2 g L-1 de carvatildeo ativadosolidificado com 6 g L-1 de aacutegar e pH ajustado para 58plusmn01Apoacutes a inoculaccedilatildeo os frascos foram incubados a 25plusmn2oC 35igravemolm-2s-1 de intensidade luminosa e sob fotoperiacuteodo de 16horas Apoacutes 90 dias observou-se que melhores resultados parapropagaccedilatildeo in vitro em placircntulas de orquiacutedea Bc lsquoPastoralrsquo x LclsquoAmber Glowrsquo satildeo obtidos com o meio WPM A suplementaccedilatildeode 4 mg L-1 de BAP no meio WPM favorece o crescimento invitro Para a multiplicaccedilatildeo maior quantidade de brotos eacuteconseguida em meio MS na ausecircncia de BAP
Termos para indexaccedilatildeo Orquiacutedea crescimento in vitrocitocinina
ABSTRACTThe multiplication rate of orchids by conventional
methods is considerably low and does not attend its commercialneeds Tissue culture results in larger multiplication rates andproduces uniform and healthy orchid plantlets The objective ofthis work was to study the influence of the cytokinin BAP (6-benzilaminopurine) in different culture media for ther in vitropropagation of Brassocattleya lsquoPastoralrsquox Laeliocattleya lsquoAmberGlowrsquo hybrid plantlets Plantlets measuring approximately 15plusmn 05 cm length deriving from in vitro germination were inoculated
in flasks of 250 cm3 volume containing 40 mL MS WPM andKnudson C salt formulations combined with BAP (0 05 1 2and 4 mg L-1) supplemented with 2 g L-1 activated charcoalsolidified with 6 g L-1 agar and pH adjusted for 58 plusmn 01 Afterthe inoculation the plantlets maintained in a growth room at25plusmn2ordmC 35 mMol m-2 s-1 light intensity and 16 hoursphotoperiod After 90 days the best results for the in vitropropagation of orchid plantlets Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquowere obtained with half strength WPM The supplementation of4 mg L-1 BAP to the WPM medium favors in vitro growth Forthe multiplication phase the largest number of sprouts is achievedwith full strength MS medium in the absence of BAP
Index terms Orchid in vitro growth cytokinin
INTRODUCcedilAtildeO
As orquiacutedeas satildeo consideradas as plantas
ornamentais haacute mais tempo cultivadas pelo homem
Pertencem agrave famiacutelia Orchidaceae a maior entre as
monocotiledocircneas e tambeacutem entre as plantas ornamentais
com 600 - 800 gecircneros e 25000-35000 espeacutecies (SHEEHAN
1983) totalizando 7 das plantas ornamentais do mundo
(Van Der PIJL amp DODSON 1966)
A propagaccedilatildeo de orquiacutedeas pode ser tanto
vegetativa quanto por meio de sementes Estas embora
produzidas em grande quantidade natildeo possuem
endosperma funcional prescindindo para tanto da
associaccedilatildeo simbioacutetica com fungos micorriacutezicos dentre os
quais a Rhizoctonia que eacute um dos gecircneros mais importante
(PIERIK 1987 SHEEHAN 1983)
(Recebido em 08 de dezembro de 2005 e aprovado em 10 de julho de 2006)
Propagaccedilatildeo in vitro de placircntulas de orquiacutedea 69
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 68-73 2006
Knudson (1922) observou que era possiacutevel o cultivo
de sementes em meio artificial contendo apenas sais
nutritivos e accediluacutecar na ausecircncia de fungos Posteriormente
em 1946 o mesmo autor aperfeiccediloou este meio de cultura
sendo atualmente um dos mais utilizados comercialmente
na germinaccedilatildeo e desenvolvimento de orquiacutedeas (ARDITTI
amp ERNST 1992) No entanto satildeo necessaacuterios estudos
pois satildeo descritos vaacuterios meios de cultura para muitos
gecircneros e espeacutecies diferentes O meio de cultura mais
utilizado na cultura de tecidos em geral eacute o MS (Murashige
amp Skoog 1962) podendo-se encontrar o uso de outros
meios como Knudson C (1946) e WPM (Wood Plant
Medium) de Loyd amp McCown (1980)
Reguladores de crescimento em diferentes
concentraccedilotildees tecircm sido usados conforme a espeacutecie e a
metodologia utilizada Podem ser necessaacuterios para a
germinaccedilatildeo de sementes formaccedilatildeo de calos e brotaccedilotildees
adventiacutecias (GRATTAPAGLIA amp MACHADO 1998
PASQUAL 2001)
O regulador de crescimento BAP (6-
benzilaminopurina) eacute uma citocinina largamente utilizada
para estimular a induccedilatildeo de brotos em plantas ornamentais
Para o cultivo in vitro de orquiacutedeas do grupo Cattleya a
citocinina BAP geralmente eacute utilizada nas concentraccedilotildees
que variam entre 005 e 10 mg L-1 (CARVALHO 2002)
Martini et al (2001) trabalhando com a orquiacutedea
Gongora quinquenervis observaram que a presenccedila do
BAP inibe a multiplicaccedilatildeo de calos e o potencial
organogecircnico Silva (2003) concluiu que para o estaacutedio de
subcultivo de Brassocattleya lsquoPastoralrsquo x Laeliocattleya
lsquoAmber Glowrsquo natildeo haacute necessidade da adiccedilatildeo de BAP como
estiacutemulo ao desenvolvimento geral do explante Melhor
proliferaccedilatildeo de brotos formaccedilatildeo de raiacutezes nuacutemero de
folhas e comprimento de brotos em Dendrobium foram
obtidos com 25 mg L-1 de BAP + 05 mg L-1 de ANA
adicionados ao meio MS (TALUKDER et al 2003)
Aleacutem do tipo de meio outro aspecto importante na
multiplicaccedilatildeo in vitro estaacute relacionado com o tipo de
citocinina e sua concentraccedilatildeo sendo ambos determinantes
no sucesso da micropropagaccedilatildeo (GRATTAPAGLIA amp
MACHADO 1998)
O maior entrave no processo de micropropagaccedilatildeo
de orquiacutedeas estaacute relacionado ao tempo necessaacuterio para a
produccedilatildeo de mudas a partir de plantas hiacutebridas
selecionadas e a utilizaccedilatildeo de meio de cultura adequado
para cada espeacutecie Assim objetivou-se estudar o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de BAP e formulaccedilotildees de minerais
nutritivos em meios de cultura na propagaccedilatildeo in vitro de
placircntulas de orquiacutedea oriundas do hiacutebrido Brassocattleya
lsquoPastoralrsquo x Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo
MATERIAL E MEacuteTODOS
Placircntulas hiacutebridas oriundas de sementes
germinadas assimbioticamente em meio Knudson C
obtidas do cruzamento entre Brassocattleya lsquoPastoralrsquo x
Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo com aproximadamente
15plusmn05 cm de comprimento foram transferidas para frascos
de 250 cm3 de capacidade contendo 40 mL de meio de
cultura e vedados com tampas plaacutesticas transluacutecidas Os
tratamentos consistiram de diferentes formulaccedilotildees salinas
(MS WPM e Knudson C em suas formulaccedilotildees originais)
combinadas com 0 05 10 20 e 40 mg L-1 de BAP
acrescidos de 2 g L-1 de carvatildeo ativado solidificado com
6 g L-1 de aacutegar e pH ajustado para 58plusmn01 antes da
autoclavagem obtida a 121ordmC e 1 atm por 20 minutos
Posteriormente agrave inoculaccedilatildeo os frascos foram
transferidos para sala de crescimento com temperatura
de 25plusmn2ordmC fotoperiacuteodo de 16 horas e 35 mmolm-2s-1 de
intensidade luminosa fornecida por lacircmpadas do tipo
(Grow-lux) e luz do dia especial O delineamento
experimental utilizado foi inteiramente casualizado no
esquema fatorial 3 x 5 com cinco repeticcedilotildees de quatro
placircntulas cada sendo cada repeticcedilatildeo composta por um
frasco
Apoacutes 90 dias da instalaccedilatildeo do experimento foram
avaliados nuacutemero meacutedio de brotos comprimento meacutedio
da parte aeacuterea nuacutemero meacutedio de raiacutezes nuacutemero meacutedio de
folhas e meacutedia da massa fresca total de placircntulas
ARAUJO A G de et al70
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 68-73 2006
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Para a variaacutevel nuacutemero de folhas natildeo houve
significacircncia dos fatores isolados nem da interaccedilatildeo entre
eles O nuacutemero de raiacutezes e massa fresca total de placircntulas
apresentaram significacircncia apenas para o fator meio de
cultura enquanto que para nuacutemero de brotos e
comprimento da parte aeacuterea a interaccedilatildeo dos fatores foi
significativa (Tabela 1)
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de brotos observou-se
interaccedilatildeo entre os fatores BAP e os meios de cultura
utilizados (Tabela 1) Poreacutem pelo teste F verificou-se que
apenas o meio MS foi significativo em relaccedilatildeo agraves
concentraccedilotildees de BAP (Figura 1)
O maior nuacutemero de brotos (334) foi registrado na
formulaccedilatildeo de MS adicionado de 40 mg L-1 de BAP
Entretanto na ausecircncia dessa citocinina foi observada a
formaccedilatildeo de 304 brotosplanta (Figura 1) Diante da
pequena diferenccedila na quantidade meacutedia de brotos
formados entre a maior concentraccedilatildeo e o tratamento sem
o regulador de crescimento justifica-se a utilizaccedilatildeo do
meio de cultura sem o BAP Estes resultados concordam
com Silva (2003) que obteve maior nuacutemero de brotos (2
brotos) na ausecircncia de BAP para esse mesmo hiacutebrido
poreacutem em meio Knudson C
A natildeo utilizaccedilatildeo de reguladores de crescimento
adicionados ao meio de cultura vai influenciar na
reduccedilatildeo dos custos de produccedilatildeo de mudas jaacute que esse
eacute um dos componentes mais onerosos Isso eacute
extremamente importante principalmente para
laboratoacuterios comerciais
TABELA 1 ndash Resumo da anaacutelise de variacircncia para as caracteriacutesticas meacutedias de nuacutemero de folhas (NF) nuacutemero de raiacutezes(NR) nuacutemero de brotos (NB) comprimento da parte aeacuterea (CPA) e massa fresca total de placircntulas (MFP) e respectivoscoeficientes de variaccedilatildeo (CV)
significativo a 1 e 5 de probabilidade respectivamente pelo teste F
FIGURA 1 ndash Efeito do meio de cultura MS e concentraccedilotildees de BAP no nuacutemero meacutedio de brotos em placircntulas hiacutebridasde Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo apoacutes 90 dias da incubaccedilatildeo
Fontes de variaccedilatildeo GL Quadrados meacutedios
NF NR NB CPA MFP Meios 2 125683 ns 162740 01483 ns 53139 02372 BAP 4 186198 ns 44693 ns 04408 ns 03373 ns 00075 ns
Meio x BAP 8 243984 ns 13417 ns 17417 13579 00459 ns
Resiacuteduo 45 124475 21329 05055 05961 00662 CV () 3467 3081 2801 2443 5100
Propagaccedilatildeo in vitro de placircntulas de orquiacutedea 71
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 68-73 2006
O estiacutemulo agrave brotaccedilatildeo em placircntulas de Spathoglottis
plicata Griff ocorreu em meio MS suplementado com 10
mg L-1 de BAP e 25 mg L-1 de ANA tendo o enraizamento
estimulado com 20 mg L-1 de AIB (NAYAK et al 1999)
TDZ tambeacutem eacute utilizado em associaccedilatildeo com BAP para
regeneraccedilatildeo de brotos de Rhynchostylis (BUI Le al 1999)
e de Anoectochilus (LI et al 1999) todas orquidaceaes
Observou-se interaccedilatildeo entre o tipo de meio de
cultura e o BAP no que diz respeito ao comprimento de
parte aeacuterea das placircntulas (Tabela 1) Pelo teste de F apenas
o meio WPM foi significativo em relaccedilatildeo agraves concentraccedilotildees
de BAP (Figura 2)
O maior comprimento da parte aeacuterea (47 cm) foi
observado quando se utilizou o meio WPM combinado
com 40 mg L-1 de BAP (Figura 2) Como a relaccedilatildeo foi direta
pode-se inferir que o efeito estimulatoacuterio do BAP sobre o
crescimento da parte aeacuterea continuaria mesmo em
concentraccedilotildees maiores que 40 mg L-1 Talukder et al (2003)
obtiveram melhor comprimento de brotos (0472 cm) em
placircntulas de Dendrobium com utilizaccedilatildeo de 25 mg L-1 de
BAP + 05 mg L-1 de ANA adicionados ao meio MS
Relativo ao nuacutemero meacutedio de raiacutezes houve
significacircncia apenas para o fator meio de cultura (Tabela 1)
Na Tabela 2 verifica-se que os maiores valores foram obtidos
com os meios WPM (557) seguido do MS (487) sendo os
menores valores verificados no meio Knudson C (378) A
emissatildeo de novas raiacutezes eacute favorecida pelo caacutelcio e pelo boro
O meio Knudson C apresenta uma concentraccedilatildeo maior de
caacutelcio e menor de boro em relaccedilatildeo aos meios MS e WPM
que possuem concentraccedilotildees semelhantes de ambos
Segundo Pierik (1987) em concentraccedilotildees mais elevadas
(1 a 10 mg L-1) as citocininas podem induzir a formaccedilatildeo de
gemas adventiacutecias quebrando a dominacircncia apical e retardando
a formaccedilatildeo de raiacutezes Talukder et al (2003) encontraram maior
nuacutemero de raiacutezes (193explante) em placircntulas de Dendrobium
com utilizaccedilatildeo de 25 mg L-1 de BAP + 05 mg L-1 de ANA
adicionados ao meio MS O estiacutemulo ao enraizamento em
Spathoglottis plicata ocorreu em meio MS suplementado com
20 mg L-1 de AIB (NAYAK et al 1999)
FIGURA 2 ndash Comprimento meacutedio da parte aeacuterea em placircntulas hiacutebridas Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo cultivadas emmeio de cultura WPM e diferentes concentraccedilotildees de BAP
TABELA 2 ndash Efeito de diferentes meios de cultura sobreo nuacutemero meacutedio de raiacutezes em placircntulas hiacutebridas de BclsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo
Meios de Cultura Nuacutemero meacutedio de raiacutezes
WPM 557 a MS 487 a KC 378 b
Meacutedias seguidas pela mesma letra natildeo diferem entre sipelo teste de Scott-Knott a 5
ARAUJO A G de et al72
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 68-73 2006
O efeito ora inibitoacuterio ora estimulatoacuterio dos
fitorreguladores na formaccedilatildeo de brotos e raiacutezes em
diferentes plantas pode estar associado agrave proacutepria
concentraccedilatildeo bem como a absorccedilatildeo dos reguladores de
crescimento pelo substrato (GEORGE 1996) agrave habituaccedilatildeo
(SANTANA amp PAIVA 2001) ou agrave deficiecircncia de proteiacutena
ligante promotora da atuaccedilatildeo das citocininas (TAIZ amp
ZEIGER 1998)
O nuacutemero de folhas natildeo apresentou diferenccedilas
significativas para os tratamentos estudados
isoladamente nem houve interaccedilatildeo entre eles (Tabela 1)
Talukder et al (2003) obtiveram maior nuacutemero de folhas
(425placircntula) em Dendrobium com utilizaccedilatildeo de 25 mg L-
1 de BAP + 05 mg L-1 de ANA adicionados ao meio MS
Para massa fresca de placircntulas houve significacircncia
apenas para o fator meio de cultura isoladamente (Tabela
1) Atraveacutes do teste de meacutedias constatou-se maior massa
de placircntulas frescas nos meios WPM e MS com 0524 e
0503g respectivamente Resultado inferior (0326g) foi
registrado em meio Knudson C (Tabela 3)
TABELA 3 ndash Efeito do meio de cultura na massa frescatotal de placircntulas do hiacutebrido Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmberGlowrsquo
Meios de Cultura Massa fresca total de placircntulas (g)
WPM 0524 a MS 0503 a KC 0326 b
Meacutedias seguidas pela mesma letra natildeo diferem entre sipelo teste de Scott-Knott a 5
Dignart (2003) estudando a germinaccedilatildeo in vitro
de sementes de Cattleya nobilior Rchbf em diferentes
meios de cultura (MS WPM Knudson C e B5 de
GAMBORG et al 1968) observou que natildeo houve
diferenccedilas entre os meios utilizados O BAP adicionado
ao meio de cultura provocou aumento da taxa de brotaccedilatildeo
a partir de 1 igravemolL
Segundo (PASQUAL 2001) os meios MS e WPM
possuem concentraccedilotildees similares de micronutrientes e satildeo
ricos em nitrogecircnio (N) e potaacutessio (K) Jaacute o meio Knudson C
natildeo possui micronutrientes e tem baixas concentraccedilotildees de
N e K em relaccedilatildeo ao MS e WPM Os melhores resultados
para as variaacuteveis analisadas foram observados em meio WPM
e MS Essa resposta provavelmente deveu-se ao fato de
que o meio Knudson C possui diferentes sais minerais e
embora seja muito utilizado na germinaccedilatildeo de sementes de
orquiacutedeas parece natildeo propiciar condiccedilotildees satisfatoacuterias para
o desenvolvimento de placircntulas de algumas espeacutecies de
orquiacutedeas
Sabe-se que existe uma relaccedilatildeo entre o nuacutemero de
brotos e seu tamanho e nessa relaccedilatildeo quanto maior for o
nuacutemero de brotos menor o tamanho dos mesmos
(GEORGE 1996) Essa relaccedilatildeo fez-se presente ateacute a
concentraccedilatildeo de 20 mg L-1 de BAP em Bc lsquoPastoralrsquo x Lc
lsquoAmber Glowrsquo No entanto em concentraccedilotildees superiores
tanto o nuacutemero quanto o comprimento dos brotos
aumentaram Tal diversidade de resultados estaacute
relacionada principalmente ao genoacutetipo da espeacutecie meio
de cultura e possivelmente agrave interferecircncia na accedilatildeo dos
reguladores de crescimento
Segundo Malaure et al (1991) diferentes efeitos
dos reguladores de crescimento podem ocorrer para
diferentes espeacutecies inclusive variaccedilotildees dentro de uma
mesma espeacutecie Em orquiacutedeas o efeito dos reguladores de
crescimento e de meios de cultura satildeo diversificados
principalmente quando se utiliza um hiacutebrido trigeneacuterico
com alto grau de heterozigose
CONCLUSOtildeES
Melhores resultados para propagaccedilatildeo in vitro de
placircntulas de orquiacutedea Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo satildeo
obtidos com o meio WPM A suplementaccedilatildeo de 4 mg L-1 de
BAP no meio WPM favorece o crescimento in vitro Para
a multiplicaccedilatildeo maior quantidade de brotos eacute conseguida
em meio MS na ausecircncia de BAP
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SILVEIRA D G et al74
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
EFEITO DO VIacuteRUS DAS ESTRIAS DA BANANEIRA NAMICROPROPAGACcedilAtildeO E NO CRESCIMENTO DAS PLANTAS DA
CULTIVAR CAIPIRA DURANTE A ACLIMATIZACcedilAtildeO1
EFFECT OF BANANA STREAK VIRUS ON MICROPROPAGATION AND PLANTGROWTH OF CULTIVAR CAIPIRA DURING ACLIMATIZATION
DANIELA GARCIA SILVEIRA2 ANTOcircNIO DA SILVA SOUZA3 PAULO ERNESTO MEISSNER FILHO3TALES MILER SOARES4 RANULFO CORREA CALDAS3 KAacuteTIA REGINA BARBOSA LEAtildeO5
1Parte da Dissertaccedilatildeo de Mestrado apresentada pelo primeiro autor ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias Agraacuterias da Escola de AgronomiaUFBA ndash Cruz das Almas BA2Doutoranda em Botacircnica ndash Universidade Estadual de Feira de SantanaUEFS ndash Feira de Santana BA ndash danielagsigcombr3Pesquisador da Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical ndash Caixa Postal 007 ndash 44380-000 ndash Cruz das Almas BA4Doutorando da Escola Superior Luis de QueirozEsalq ndash Piracicaba SP ndash tmsoaresesalquspbr5Engenheira Agrocircnoma MSc EBDA ndash Cruz das Almas BA ndash 44380-000 ndash krbleaohotmailcom
(Recebido em 12 de abril de 2006 e aprovado em 28 de agosto de 2006)
RESUMOAvaliaram-se os efeitos da infecccedilatildeo pelo viacuterus das estrias
de bananeira (Banana Streak Virus BSV) no desenvolvimento invitro e no crescimento das plantas da cultivar Caipira durante aaclimatizaccedilatildeo Utilizou-se o delineamento experimentalinteiramente casualizado com dois tratamentos plantas sadias eplantas infectadas pelo BSV com respectivamente 24 e 28repeticcedilotildees Os explantes foram desinfestados e estabelecidos emmeio MS baacutesico suplementado com 30 gL de sacarose solidificadocom 2 gL de lsquoPhytagelrsquo e pH ajustado em 58 Foram efetuadoscinco subcultivos em meio com 4 mgL de BAP (6-benzilaminopurina) e as plantas obtidas foram enraizadas nessemesmo meio de cultura sem reguladores de crescimento Apoacutesessa etapa transferiram-se as plantas para a aclimatizaccedilatildeo emcacircmara uacutemida onde permaneceram por 30 dias Avaliaram-se astaxas de multiplicaccedilatildeo a presenccedila in vitro dos sintomas do BSVnos explantes provenientes das plantas infectadas durante amicropropagaccedilatildeo e aclimatizaccedilatildeo as perdas por contaminaccedilatildeoenvolvendo fungos e bacteacuterias nas fases da micropropagaccedilatildeo e aaltura das plantas na fase da aclimatizaccedilatildeo A infecccedilatildeo pelo BSVnatildeo afetou significativamente a multiplicaccedilatildeo e o crescimento invitro das plantas sendo os sintomas do viacuterus visiacuteveis em todasas fases da micropropagaccedilatildeo e na aclimatizaccedilatildeo das plantasinfectadas A maior porcentagem de contaminaccedilatildeo ocorreu nafase de estabelecimento in vitro dos explantes independentementedos tipos de plantas utilizadas Apoacutes 30 dias de aclimatizaccedilatildeo asplantas com BSV apresentaram altura inferior agraves plantas sadiasA presenccedila do viacuterus natildeo influenciou a taxa de multiplicaccedilatildeo dosexplantes poreacutem afetou o crescimento das plantas infectadas
Termos para indexaccedilatildeo Musa BSV cultura de tecidospropagaccedilatildeo in vitro
ABSTRACTThe effects of the banana streak virus (BSV) infection on
in vitro development of the cultivar Caipira were evaluated The
used experimental design was a completely randomized withtwo treatments healthy plants and plants infected by BSV with24 and 28 replications respectively The explants weredisinfected and established in a basic MS medium supplementedwith 30 gL sucrose solidified with 2 gL lsquoPhytagelrsquo and pHadjusted to 58 Five subcultures were carried out in a mediumcontaining 4 mgL BAP (6-benzylaminopurine) and the plantletswere rooted in the same culture medium without growthregulators Afterwards the plantlets were transferred to a humidchamber for acclimatization during a 30-day periodMultiplication rates presence of BSV symptoms on in vitroexplants obtained from plants infected during themicropropagation and acclimatization periods losses caused byfungal and bacterial contamination and plantlet height at theacclimatization stage were evaluated The infection by BSVpresented no significant effect on the multiplication rate and invitro plant growth although the virus symptoms were visible inall the micropropagation phases and during the acclimatizationof infected plants The highest percentage of contaminationoccurred during the in vitro establishment phase regardless theused plants After 30 days of acclimatization the plants withBSV presented a lower height compared to the healthy plantsAlthough the presence of the virus had no influence on the explantmultiplication rate it affected the growth of infected plants
Index terms Musa BSV tissue culture in vitro propagation
INTRODUCcedilAtildeO
As bananeiras estatildeo sujeitas as vaacuterias doenccedilas
causadas por fungos bacteacuterias nematoacuteides e viacuterus que
satildeo limitantes agrave sua capacidade de produccedilatildeo Entre as
viroses que ocorrem no Brasil destaca-se a causada pelo
viacuterus das estrias da bananeira (Banana streak virus BSV)
Efeito do viacuterus das estrias da bananeira 75
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
que eacute particularmente importante para os programas de
melhoramento geneacutetico e de multiplicaccedilatildeo comercial de
cultivares uma vez que pode ser incorporada ao genoma e
transmitida pelas sementes de plantas infectadas
(DANIELLS et al 1995) aleacutem de natildeo existir um meacutetodo
eficiente para limpar uma planta infectada com BSV
(LOCKHART 1994)
Esse viacuterus natildeo eacute transmitido mecanicamente sendo as
mudas infectadas sua principal forma de disseminaccedilatildeo
(LOCKHART amp AUSTREY 1988 LOCKHART 1994) A
transmissatildeo eacute feita de maneira semi-persistente pela cochonilha-
dos-citros Planococcus citri Risso e pela cochonilha-da-cana-
de-accediluacutecar Saccharicoccus sacchari cocherell (LOCKHART
1993 LOCKHART amp AUSTREY 1988)
O BSV inicialmente causa na bananeira um estriado
cloroacutetico de linhas descontiacutenuas dispersas e concentradas
em partes da lacircmina foliar Com o envelhecimento das
folhas o estriado causa necrose de coloraccedilatildeo marrom-cafeacute
a negro (RAMIREZ amp RIVERA 1994) As plantas
infectadas geralmente natildeo mostram sintomas em todas as
folhas (CORDEIRO amp KIMATI 1997 LOCKHART 1986)
Outros sintomas do BSV satildeo a reduccedilatildeo do vigor da planta
e a diminuiccedilatildeo do tamanho dos frutos que tambeacutem ficam
deformados (RAMIREZ amp RIVERA 1994)
Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos
da infecccedilatildeo pelo BSV na multiplicaccedilatildeo in vitro e no
crescimento durante a aclimatizaccedilatildeo das plantas de
bananeira da cultivar Caipira Aleacutem disso avaliou-se a taxa
de contaminaccedilatildeo por fungos e bacteacuterias na etapas da
micropropagaccedilatildeo devido a importacircncia dessa variaacutevel na
multiplicaccedilatildeo in vitro das plantas
MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo dos efeitos do BSV na micropropagaccedilatildeo
da cultivar Caipira (grupo AAA) foi conduzido no
Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos da Embrapa Mandioca
e Fruticultura Tropical Utilizou-se o delineamento
experimental inteiramente casualizado com dois
tratamentos plantas sadias com 24 repeticcedilotildees coletadas
no Banco de Germoplasma de Bananeira da Embrapa
Mandioca e Fruticultura Tropical e plantas infectadas com
BSV com 28 repeticcedilotildees Foram usadas mudas do tipo
chifrinho sendo que as matrizes infectadas com BSV com
altura meacutedia de 12 cm foram infestadas pela cochonilha
vetora Planacoccus citri Risso alimentadas em folhas de
banana lsquoMysorersquo com sintomas de BSV em casa-de-
vegetaccedilatildeo Aproximadamente 15 dias apoacutes a infestaccedilatildeo
todas as 28 plantas estavam com os sintomas da virose
Para o estabelecimento in vitro realizou-se a limpeza
das matrizes por meio de uma seacuterie de cortes removendo-
se parte do rizoma e do pseudocaule ateacute o tamanho
aproximado de 50 cm de altura por 15 cm de diacircmetro
lavando-se com detergente e aacutegua deionizada A
desinfestaccedilatildeo foi feita em cacircmara de fluxo laminar
imergindo os explantes em soluccedilatildeo de aacutelcool 70 por
cinco minutos e em soluccedilatildeo 11 de aacutegua sanitaacuteria comercial
(2 de cloro ativo) com aacutegua deionizada por 30 minutos
Em seguida foram realizadas trecircs lavagens com aacutegua
deionizada esterilizada e reduzidos os explantes ateacute o
tamanho final de 06 cm de altura por 04 cm de diacircmetro
As etapas de estabelecimento multiplicaccedilatildeo e
enraizamento foram realizadas em meio nutritivo MS baacutesico
(MURASHIGE amp SKOOG 1962) suplementado com 30 g
L de sacarose solidificado com 2 gL de ldquoPhytagelrdquo e pH
ajustado para 58 Apenas na fase de multiplicaccedilatildeo o meio
MS foi suplementado com 4 mgL de 6-benzilaminopurina
(BAP) Em todas as etapas os explantes foram dispostos
sobre 25 mL de meio de cultura em frascos com 12 cm de
altura por 5 cm de diacircmetro
A multiplicaccedilatildeo foi realizada em cinco subcultivos
das gemas e brotos sendo efetuada a subdivisatildeo
longitudinal dos explantes sempre que possiacutevel O
estabelecimento e os cinco subcultivos foram realizados
com intervalos de 30 dias Apoacutes os subcultivos as
plantas permaneceram 30 dias em enraizamento O
estudo foi desenvolvido sob condiccedilotildees de temperatura
de 27 plusmn 1ordmC fotoperiacuteodo de 16 horas e intensidade
luminosa de 22 microEm2s
SILVEIRA D G et al76
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
Apoacutes o enraizamento in vitro 47 plantas sadias e 40
plantas infectadas com BSV foram transferidas para copos
plaacutesticos de 300 cm3 contendo o Plantmaxreg e vermiculita
(21) permanecendo 30 dias sob condiccedilotildees de 85 de umidade
relativa do ar e 60 de sombreamento em casa-de-vegetaccedilatildeo
Na fase de estabelecimento e em cada subcultivo
foram avaliadas as taxas de multiplicaccedilatildeo e a presenccedila dos
sintomas do BSV nos explantes provenientes das plantas
infectadas Na fase de aclimatizaccedilatildeo avaliaram-se a
presenccedila de sintomas nas plantas infectadas e as suas
respectivas alturas As medidas foram tomadas do coleto
ateacute a extremidade apical da folha mais alta
Os dados referentes ao nuacutemero de gemas obtidas
nos cinco subcultivos foram transformados em raiz
quadrada Foi estabelecida uma regressatildeo linear para cada
tratamento em funccedilatildeo dos subcultivos
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
A infecccedilatildeo pelo BSV natildeo afetou significativamente
o crescimento e a multiplicaccedilatildeo das plantas sendo que o
nuacutemero de gemas cresceu linearmente em funccedilatildeo dos
subcultivos em ambos os tratamentos Trabalhando com
plantas micropropagadas de bananeira sadias e infectadas
com o viacuterus do topo em leque (Banana bunchy top virus
BBTV) Thomas et al (1995) observaram que aquela virose
tambeacutem natildeo afetou a capacidade das plantas em crescer e
multiplicar Nas anaacutelises de regressatildeo realizadas para os
dois tratamentos (plantas sadias e plantas com BSV) o
acreacutescimo no nuacutemero de gemas em funccedilatildeo dos subcultivos
pode ser explicado por um modelo de regressatildeo linear
(Figura 1) As estimativas da regressatildeo linear para plantas
com BSV e plantas sadias foram altamente significativas e
os coeficientes de determinaccedilatildeo (R2) proacuteximos de 1 Foi
observado que as linhas determinadas a partir das
equaccedilotildees obtidas satildeo quase superpostas evidenciando
um comportamento semelhante entre os dois tratamentos
com relaccedilatildeo ao nuacutemero de gemas por subcultivo
Em todas as fases da micropropagaccedilatildeo os sintomas
do BSV foram visiacuteveis ocorrendo nas folhas das plantas
infectadas estriados cloroacuteticos com linhas descontiacutenuas e
FIGURA 1 ndash Curvas de regressatildeo linear obtidas a partir dosdados de gemas em cada subcultivo da cultivar de bananeiraCaipira sadias e infectadas com BSV Cruz das Almas (BA)Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical 2006Dados transformados por x
dispersas (Figura 2) Esses mesmos sintomas foram
observados em plantas de bananeira infectadas com BSV
mantidas a campo (RAMIREZ amp RIVERA 1994)
As contaminaccedilotildees que ocorreram nos materiais
in vitro foram tambeacutem avaliadas As maiores taxas de
contaminaccedilatildeo aconteceram na fase de estabelecimento
in vitro dos explantes obtendo-se niacuteveis de 21 e 32
para as plantas sadias e infectadas com BSV
respectivamente (Figura 3) Os elevados iacutendices de perdas
nesta etapa foram causados principalmente por
contaminaccedilatildeo bacteriana Segundo Oliveira amp Silva
(1997) as maiores contaminaccedilotildees bacterianas dos
explantes de bananeira ocorrem na fase de
estabelecimento in vitro do que nos demais subcultivos
Oliveira et al (2000) trabalhando com plantas livres de
viacuterus obtiveram taxas de contaminaccedilatildeo nesta fase entre
10 e 45 as quais estatildeo proacuteximas agraves obtidas neste
trabalho Durante a fase de multiplicaccedilatildeo as perdas por
contaminaccedilatildeo foram menores variando de 14 a 74
para as plantas sadias e de 0 a 121 no caso das plantas
infectadas com BSV sendo que a maior parte do material
foi contaminada por fungos natildeo-patogecircnicos Estes
valores foram bem inferiores agravequeles obtidos por Oliveira
et al (1999) (131) que utilizaram genoacutetipos diploacuteides
triploacuteides e tetraploacuteides de bananeiras sadias
Efeito do viacuterus das estrias da bananeira 77
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
FIGURA 2 ndash Planta de bananeira lsquoCaipirarsquo infectada com BSV na fase de enraizamento in vitro apresentando estriadoscloroacuteticos com linhas descontiacutenuas e dispersas nas folhas Cruz das Almas (BA) Embrapa Mandioca e FruticulturaTropical 2006
FIGURA 3 ndash Taxas por contaminaccedilatildeo () de explantes dacultivar Caipira na fase de estabelecimento (Est) e ao longode cinco subcultivos (Sub) Cruz das Almas (BA)Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical 2006
Durante o enraizamento in vitro natildeo houve
diferenccedila significativa na altura das plantas Poreacutem com
30 dias de aclimatizaccedilatildeo as plantas com BSV apresentaram
altura significativamente inferior agraves plantas sadias (Tabela 1)
Soares et al (2000) cultivaram mudas de bananeira lsquoCaipirarsquo
sadias e infectadas com BSV durante 141 dias em casa-de-
vegetaccedilatildeo e observaram que a infecccedilatildeo pelo viacuterus implicou
em significativa reduccedilatildeo no crescimento inicial afetando
o porte o desenvolvimento do sistema radicular e a aacuterea
fotossintetizante das plantas Verifica-se assim que a
infecccedilatildeo pelo BSV prejudicou o crescimento inicial das
plantas afetando a altura daquelas infectadas mesmo em
um periacuteodo relativamente curto indicando que em periacuteodos
mais longos o prejuiacutezo com relaccedilatildeo ao crescimento pode
ser ainda maior aconteceu no estudo desenvolvido por
Soares et al (2000)
Os sintomas do BSV permaneceram visiacuteveis em
todas as plantas infectadas durante e apoacutes a fase de
aclimatizaccedilatildeo Esse resultado foi diferente ao obtido por
Dahal et al (1999) quando micropropagaram hiacutebridos de
Musa pois os sintomas soacute foram visiacuteveis em plantas com
trecircs meses apoacutes o enraizamento Provavelmente essa
diferenccedila foi devido agraves condiccedilotildees onde os trabalhos foram
conduzidos casa-de-vegetaccedilatildeo e campo respectivamante
bem como aos genoacutetipos estudados Observaccedilotildees
semelhantes foram tambeacutem efetuadas por Gauhl amp Pasberg-
Gauhl (1995) e Ortiz (1996) ao estudarem a incidecircncia de
viroses em diferentes genoacutetipos de bananeira
SILVEIRA D G et al78
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
Alturas (cm) Plantas de bananeira lsquoCaipirarsquo
Enraizamento
in vitro 30 dias de
aclimatizaccedilatildeo
Sadias 637 a 2690 a BSV 728 a 2192 b
TABELA 1 ndash Meacutedias das alturas das plantas apoacutes oenraizamento in vitro e 30 dias de aclimatizaccedilatildeo em casa-de-vegetaccedilatildeo Cruz das Almas (BA) Embrapa Mandiocae Fruticultura Tropical 2006
Meacutedias seguidas pelas mesmas letras nas colunas natildeodiferem estatisticamente entre si pelo teste F ao niacutevel de 5 de significacircncia
CONCLUSOtildeES
A infecccedilatildeo pelo BSV natildeo influenciou a taxa de
multiplicaccedilatildeo dos explantes embora os sintomas do viacuterus
tenham sido visiacuteveis em todas as fases da micropropagaccedilatildeo
e durante os primeiros 30 dias da aclimatizaccedilatildeo das plantas
infectadas Todavia o crescimento das plantas infectadas
foi afetado pela presenccedila do viacuterus
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FOGACcedilA L A et al80
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
CARACTERIacuteSTICAS MORFOFISIOLOacuteGICAS DE BROTACcedilOtildeES DEAgapanthus umbellatus var minor MULTIPLICADAS EM
BIORREATOR DE IMERSAtildeO TEMPORAacuteRIA1
MORPHOLOGICAL AND PHYSIOLOGICAL CHARACTERISTICS Agapanthus umbellatus varminor OF SHOOTS PROPAGATED IN BIOREACTOR OF TEMPORARY IMMERSION
LUCIANA ALVES FOGACcedilA2 DENILSON DORTZBACH3 ANTONIO CARLOS ALVES4 ENIO LUIZ PEDROTTI5
1Parte da dissertaccedilatildeo de mestrado do primeiro autor junto ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Recursos Geneacuteticos vegetais CCA UFSC ndash Florianoacutepolis SC2Engenheira Agrocircnoma Mestre em Recursos Geneacuteticos Vegetais ndash CCAUFSC ndash UFSC Trindade ndash Florianoacutepolis SC ndash 88040-900 ndash lufogacapopcombr3Empresa Catarinense de Pesquisa Agropecuaacuteria ndash Rodovia Admar Gonzaga 1340 ndash Bairro Itacorubi Florianoacutepolis SC ndash denilsondtbolcombr4Engenheiro Agrocircnomo Professor Dr Departamento Fitotecnia ndash CCAUFSC ndash UFSC ndash alvesccaufscbr5Engenheiro Agrocircnomo Professor Dr Departamento Fitotecnia ndash CCAUFSC ndash UFSC ndashRodovia Admar Gonzaga 1346 ndash 88 040 900 ndash Florianoacutepolis- SC ndash pedrotticcaufscbr
RESUMOCom o presente trabalho objetivou-se estudar alguns
aspectos morfoloacutegicos e fisioloacutegicos de placircntulas de Agapanthusumbellatus LrsquoHeacuter var minor multiplicadas em biorreatores deimersatildeo temporaacuteria (BIT) Foram testadas quatro concentraccedilotildeesde sacarose no meio de cultura e duas intensidades luminosasem um total de oito tratamentos formando um fatorial 2 x 4 Odelineamento experimental utilizado foi inteiramentecasualizado Os resultados obtidos indicaram que as condiccedilotildeesambientais principalmente luz e concentraccedilatildeo de sacarose domeio de cultura influenciaram o desenvolvimento e o crescimentodas placircntulas quando multiplicadas Observou-se que a ausecircnciade sacarose mesmo no niacutevel mais elevado de intensidadeluminosa natildeo estimulou a fotossiacutentese das placircntulas Acombinaccedilatildeo de 30 gL-1 de sacarose e 70 mMm-2s-1 de luzproporcionou maior numero de folhas massa fresca e secaconcentraccedilatildeo de clorofila a b e total fatores estes que tecircmgrande influecircncia na fase de aclimatizaccedilatildeo
Termos para indexaccedilatildeo Plantas ornamentaismicropropagaccedilatildeo sacarose intensidade luminosa
ABSTRACTThe objective of the present work was to study
morphological and physiological characteristics of Agapanthusumbellatus LrsquoHeacuter var minor plantlets propagated in bioreactorof temporary immersion (BIT) Four sucrose concentrationsand two light intensities were analyzed totalizing eighttreatments The experimental design used was a completelyrandomized with a 2 x 4factorial The results indicated that theenvironment conditions mainly light and sucrose concentrationsof the culture medium influenced plantlets development andgrowth It was observed that the absence of sucrose even inthe highest level of light intensity had no stimuli on plantletphotosynthesis The combination of 30 g L-1 sucrose and 70mM m-2 s-1 light had promoted higher leaf number fresh anddry weight concentration of chlorophyll a b and total
parameters that present high influence during theacclimatizationrsquos phase
Index terms Ornamental plants micropropagation sucroselight intensity
INTRODUCcedilAtildeO
Agapanthus umbellatus var minor tambeacutem
conhecida como Agapantho ou Liacuterio do Nilo eacute uma
angiosperma da famiacutelia Amaryllidaceae pertencente agrave
ordem Liliales (BOTANY 2003) eacute uma espeacutecie ornamental
muito utilizada como flor de corte devido agrave sua durabilidade
No entanto o maior interesse econocircmico nesta espeacutecie
decorre do seu uso como forraccedilatildeo em jardins e praccedilas
(LORENZI amp SOUZA 1995)
Sua propagaccedilatildeo eacute tradicionalmente efetuada
atraveacutes da divisatildeo de touceiras No entanto esta teacutecnica
apresenta uma seacuterie de desvantagens visto que a taxa de
propagaccedilatildeo eacute baixa cerca de dez mudas por planta ao ano
aleacutem de possibilitar a dispersatildeo de pragas e doenccedilas que
poderatildeo ocorrer no viveiro de produccedilatildeo Sendo assim a
micropropagaccedilatildeo pode ser uma ferramenta muito
promissora para esta espeacutecie
O processo de micropropagaccedilatildeo induz a um grande
nuacutemero de mudanccedilas anatocircmicas morfoloacutegicas e
fisioloacutegicas que muitas vezes tem limitado o cultivo in vitro
de algumas espeacutecies (DESJARDINS 1993) A
(Recebido em 18 de julho de 2005 e aprovado em 25 de agosto de 2006)
Caracteriacutesticas morfofisioloacutegicas de brotaccedilotildees 81
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
heterogeneidade de respostas agraves placircntulas que ocorrem
na cultura de tecidos eacute promovida natildeo soacute por fatores
inerentes ao tecido vegetal (geneacuteticos e fisioloacutegicos) mas
tambeacutem por modificaccedilotildees do ambiente in vitro
As modificaccedilotildees do ambiente in vitro envolvem a
qualidade e intensidade de luz fotoperiacuteodo temperatura
umidade reguladores de crescimento exoacutegenos fonte de
carbono e estresse mecacircnico Estes satildeo determinantes na
morfogecircnese no crescimento e no desenvolvimento de
placircntulas in vitro (GEORGE 1996 KOZAI et al 1990
SALISBURY 1981) Aleacutem disso interferem no nuacutemero de
folhas teor de clorofila densidade estomaacutetica (LIAN et
al 2002 PREECE amp SUTTER 1991) na fotossiacutentese e na
fase de aclimatizaccedilatildeo (DESJARDINS et al 1995)
Um dos principais fatores que causam grande
influecircncia na fotossiacutentese de placircntulas cultivadas in vitro
eacute a intensidade luminosa (GALZY amp COMPAN 1992) A
quantidade e a qualidade da luz bem como o fotoperiacuteodo
podem afetar o crescimento e o desenvolvimento de
placircntulas in vivo (SMITH 1982) e placircntulas in vitro
(ECONOMOU amp READ 1987 VLAHOS et al 1992) Esta
influecircncia se deve ao grande impacto sobre o acuacutemulo de
pigmentos biossiacutentese de clorofila diferenciaccedilatildeo de
cloroplastos e anatomia da folha (DESJARDINS et al 1995)
Outro fator que vem sendo estudado e que pode
determinar um papel importante no controle da atividade
fotossinteacutetica de placircntulas in vitro eacute a utilizaccedilatildeo de
carboidratos exoacutegenos pois o crescimento da maioria das
culturas in vitro eacute sustentado pela sacarose ou outros
accediluacutecares adicionados ao meio de cultura (PREECE amp
SUTTER 1991) Estes podem ser utilizados pelas placircntulas
quando a taxa de fotossiacutentese natildeo permite assegurar um
balanccedilo positivo em carbono definindo assim uma nutriccedilatildeo
mixotroacutefica ou heterotroacutefica (GALZY amp COMPAN 1992)
Baseado na hipoacutetese de que a composiccedilatildeo do meio
de cultura e a intensidade luminosa influenciam a
morfologia e a fisiologia de placircntulas micropropagadas o
presente trabalho teve como objetivo estudar aspectos
morfoloacutegicos e fisioloacutegicos de placircntulas de Agapanthus
umbellatus LrsquoHeacuter var minor multiplicadas em biorreator de
imersatildeo temporaacuteria (BIT) Para tanto foi avaliado o
desenvolvimento e o crescimento desta espeacutecie durante a
fase de multiplicaccedilatildeo em funccedilatildeo da variaccedilatildeo de niacuteveis de
sacarose e intensidade luminosa
MATERIAIS E MEacuteTODOS
Este trabalho foi realizado no Laboratoacuterio de
Morfogecircnese e Bioquiacutemica Vegetal localizado no Centro
de Ciecircncias Agraacuterias da Universidade Federal de Santa
Catarina em Florianoacutepolis - SC
O trabalho consistiu de um ensaio onde foram
utilizadas brotaccedilotildees de Agapanthus umbellatus var minor
obtidas da terceira repicagem mantidas em meio geleificado
MS + 178 mM de BAP Apoacutes serem individualizadas e
padronizadas tendo o seu tamanho variando entre 25 e
30 cm de comprimento as brotaccedilotildees foram transferidas
para o BIT (ETIENNE amp BERTHOULY 2002) contendo 500
mL de meio liacutequido e sais de MS (MURASHIGE amp SKOOG
1962) em condiccedilotildees asseacutepticas suplementado com
concentraccedilatildeo de 89 mM de BAP O pH foi ajustado com
NAOH (1N) em 59 antes da autoclavagem (durante 15
minutos sob 121ordmC e 15 atm de pressatildeo) O delineamento
experimental utilizado no ensaio foi o inteiramente
casualizado Foram testados quatro concentraccedilotildees de
sacarose no meio de cultura (0 15 30 e 45) e duas
intensidades luminosas (70 e 140 mmolm-2s-1) providas
por lacircmpadas brancas fluorescentes (PHILIPS ndash TLT 40W)
em um total de oito tratamentos formando um fatorial 2 x 4
Cada tratamento foi composto por trecircs frascos (repeticcedilatildeo)
contendo 50 plantas cada um
Os frascos foram mantidos em sala de crescimento
com fotoperiacuteodo de 16 horas e temperatura meacutedia de 22ordmC
com variaccedilatildeo de plusmn 2ordmC por um periacuteodo de 60 dias
Apoacutes 60 dias de cultivo foram avaliadas as
seguintes caracteriacutesticas dos explantes nuacutemero e tamanho
das brotaccedilotildees (cm) nuacutemero de folhasbrotaccedilatildeo massa
fresca e seca (g) da parte aeacuterea e raiz utilizando-se amostras
de 25 placircntulas por repeticcedilatildeo escolhidas ao acaso
FOGACcedilA L A et al82
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
A determinaccedilatildeo do conteuacutedo de clorofila ldquoa b e
totalrdquo consistiu na coleta de amostras de 100 mg de massa
fresca As amostras foram incubadas com 70 mL de DMSO
(dimetilsulfoacutexido) sem maceraccedilatildeo por 30 minutos a 65degC
Apoacutes filtragem seu volume foi completado para 10 mL com
DMSO Desses extratos 2 mL foram analisados em
espectrofotocircmetro (UV - visiacutevel SHIMADZU) para os
valores de absorbacircncia entre 645 e 663 nm Os valores obtidos
foram submetidos agrave foacutermula de Arnon (1949) conforme
descrito por Hiscox amp Israelstam (1979) Chl a = (00127 X
D663) ndash (000269 X D645) e Chl b = (00229 X D645) ndash (000468
X D663) A clorofila total foi a soma da ldquoChl a e Chl brdquo de
cada tratamento foram utilizadas 25 amostras
A determinaccedilatildeo da densidade estomaacutetica (nuacutemero
de estocircmatos por mm2 de superfiacutecie foliar) foi realizada nas
amostras das quais extraiu-se a clorofila Apoacutes a extraccedilatildeo
da clorofila as folhas foram cortadas e somente o terccedilo
meacutedio das folhas foi usado para anaacutelise Em seguida foram
fixadas sobre lacircminas histoloacutegicas com a ajuda de uma
lamiacutenula e de algumas gotas de aacutegua esterilizada A
observaccedilatildeo foi realizada na epiderme das faces adaxial e
abaxial da folha com o auxiacutelio de um microscoacutepio oacutetico
(OLYMPUS CH30 ocular WH10 X 22) com um aumento
de 400 vezes e com um campo conhecido de 024 mm2 Para
cada lacircmina foram feitas leituras em cinco campos
Os dados obtidos foram avaliados por meio da
anaacutelise de variacircncia (ANOVA) seguindo o modelo para
experimento bifatorial inteiramente casualizado O nuacutemero
de brotaccedilotildees o nuacutemero de folhas e a densidade estomaacutetica
foram transformados em Oumlx+1 para a anaacutelise As meacutedias
dos tratamentos foram separadas pelo teste de comparaccedilatildeo
de meacutedias de Duncan a 5 de probabilidade conforme
recomendaccedilotildees de Stell amp Torrie (1980)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
A concentraccedilatildeo de sacarose no meio de cultura
apresentou uma accedilatildeo positiva e interativa com a intensidade
luminosa na proliferaccedilatildeo de brotaccedilotildees (Tabela 1) visto
que a ausecircncia de sacarose no meio de cultura resultou
em insucesso no crescimento das placircntulas de Agapantho
principalmente nos primeiros dias Apoacutes o
desenvolvimento inicial (aproximadamente 10 dias) foi
constatada estagnaccedilatildeo no crescimento das placircntulas
seguido de atrofia e necrose das brotaccedilotildees Apoacutes 20 dias
de cultivo ocorreu a morte das brotaccedilotildees Isso mostrou
que folhas de placircntulas de Agapantho natildeo fixaram
carbono suficiente para sustentar seu crescimento na
ausecircncia de sacarose Portanto para a espeacutecie em estudo
foi necessaacuteria a adiccedilatildeo de uma fonte de carbono no meio
de cultura para o seu desenvolvimento in vitro Segundo
Capellades et al (1991) e Desjardins et al (1995) a total
remoccedilatildeo de carboidratos no meio de cultura para algumas
espeacutecies frequumlentemente torna-se prejudicial para o
crescimento das placircntulas o que pode prejudicar o
processo de micropropagaccedilatildeo e aclimatizaccedilatildeo pois
durante o cultivo in vitro as placircntulas perdem
parcialmente o autotrofismo e consequumlentemente
necessitam de uma fonte de carbono
O maior nuacutemero de brotaccedilotildees foi obtido com a
intensidade luminosa de 70 mmolm-2s-1 e a concentraccedilatildeo
de 45 gL-1 de sacarose (Tabela 1) Enquanto que com a
intensidade luminosa de 140 mmolm-2s-1 o maior nuacutemero
de brotaccedilotildees foi obtido com a concentraccedilatildeo de 30 gL-1 de
TABELA 1 ndash Nuacutemero de brotaccedilotildeesexplante de placircntulasde Agapanthus umbellatus var minor multiplicadasbiorreator de imersatildeo temporaacuteria suplementado comdiferentes concentraccedilotildees de sacarose e intensidadesluminosas no periacuteodo de 60 dias
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1)
Concentraccedilatildeo Sacarose (gL-1) 70 1 140 1
0 000 dA 00 dA 15 370 cB 544 cA 30 553 bB 651 aA 45 745 aA 585 bB
CV 67
Meacutedias seguidas pela mesma letra minuacutescula nas colunase maiuacutescula nas linhas natildeo diferem significativamente peloteste de Duncan a 5 de probabilidade1 Observaccedilotildees transformadas segundo ( x+1)
Caracteriacutesticas morfofisioloacutegicas de brotaccedilotildees 83
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
sacarose Isso demonstrou um alto grau de mixotrofia dessa
espeacutecie
O tamanho das brotaccedilotildees e o nuacutemero de folhas
(Tabela 2) foram afetados apenas pelo efeito simples dos
fatores natildeo havendo interaccedilatildeo entre sacarose e luz O
maior tamanho das brotaccedilotildees foi alcanccedilada quando os
explantes foram submetidos a 15 gL-1 de sacarose e 140
mmolm-2s-1 de intensidade luminosa (Tabela 2) Verificou-
se tambeacutem que o aumento da concentraccedilatildeo desse
carboidrato no meio de cultura natildeo favoreceu o
alongamento das brotaccedilotildees Provavelmente o aumento
da intensidade luminosa favoreceu a taxa de fotossiacutentese
das placircntulas permitindo um balanccedilo positivo de carbono
afetando o crescimento e o desenvolvimento de placircntulas
in vitro (LEE et al 1995)
Por outro lado o maior nuacutemero de folhas de
Agapantho foi obtido na concentraccedilatildeo de 30 gL-1 de
sacarose (Tabela 2) A intensidade luminosa natildeo teve
influecircncia sobre essa variaacutevel Contrastando com os dados
obtidos no presente trabalho Konow amp Wang (2001)
determinaram que a intensidade luminosa de 40 mmolm-
2s-1 promoveu um aumento no nuacutemero de folhas de
Phalaenopsis enquanto placircntulas que se desenvolveram
em ambiente com intensidade de 10 e 80 molm-2s-1
apresentaram um menor nuacutemero de folhas Segundo os
autores o aumento no nuacutemero de folhas pode indicar que
TABELA 2 ndash Tamanho de brotaccedilotildees e nuacutemero de folhasbrotaccedilatildeo de placircntulas de Agapanthus umbellatus var minormultiplicadas em biorreator de imersatildeo temporaacuteria suplementado com diferentes concentraccedilotildees de sacarose eintensidades luminosas no periacuteodo de 60 dias
Meacutedias seguidas pela mesma letra nas linhas e colunas natildeo diferem significativamente pelo teste de Duncan a 5 deprobabilidade
houve estiacutemulo da fotossiacutentese in vitro Outro efeito
observado em placircntulas de Agapantho neste trabalho foi
a presenccedila de folhas mais claras e vitrificadas (folhas com
aspecto viacutetreo pouco desenvolvidas aparecircncia suculenta
e translucente) na grande maioria das placircntulas
multiplicadas em meio suplementado com 15 gL-1 de
sacarose e intensidade luminosa de 70 mmolm-2s-1 Estes
resultados podem indicar que o aparato fotossinteacutetico natildeo
tenha se desenvolvido adequadamente (CAPPELADES et
al 1991 DESJARDINS et al 1995) afetando a acumulaccedilatildeo
de massa fresca Possivelmente a presenccedila de folhas
vitrificadas foi influenciada pelo uso de meio liacutequido pois
de acordo com George (1996) e Etienne amp Berthouly (2002)
o meio liacutequido favorece a produccedilatildeo de folhas vitrificadas
quando comparado com meio geleificado No entanto
observou-se que para os demais tratamentos em
concentraccedilotildees maiores de sacarose (30 e 45 gL-1) a
presenccedila de brotaccedilotildees vitrificadas foi rara ou nenhuma
Neste sentido o desenvolvimento de brotaccedilotildees com esta
caracteriacutestica pode estar relacionado agrave concentraccedilatildeo de
sacarose no meio e agrave diferenccedila osmoacutetica entre as brotaccedilotildees
e o meio de cultura (DEBERGH et al 1981) Este resultado
tambeacutem foi obtido na multiplicaccedilatildeo de rosas na qual onde
a reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo de sacarose para 10 gL-1 na
fase de multiplicaccedilatildeo promoveu um aumento significativo
na presenccedila de plantas vitrificadas e quando submetidas
Tamanho de brotaccedilotildees (cm)
Nuacutemero de folhasbrotaccedilatildeo
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1) Concentraccedilatildeo Sacarose
(gL-1) 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia
0 000 000 000 d 000 000 000 d 15 275 396 335 a 407 408 408 b 30 295 295 295 b 414 404 409 a 45 245 220 233 c 400 408 404 c
Meacutedia 204 b 228 a 276 a 275 a
CV 2595 467
FOGACcedilA L A et al84
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
a concentraccedilotildees de 30 e 40 gL-1 a presenccedila de placircntulas
vitrificadas foi rara (LANGFORD amp WAINWRIGHT 1987)
Outro fator que possivelmente pode ter
influenciado a presenccedila de placircntulas vitrificadas in vitro
foi a baixa intensidade luminosa (GEORGE 1996) pois
placircntulas de Agapantho multiplicadas sob intensidade de
140 mmolm-2s-1 e 15 gL-1 de sacarose natildeo apresentaram
caracteriacutestica de vitrificaccedilatildeo Estes dados indicaram que o
aumento da intensidade luminosa evitou a presenccedila de
plantas vitrificadas aleacutem de proporcionar um incremento e
estiacutemulo na atividade fotossinteacutetica (GEORGE 1996)
A produccedilatildeo de massa fresca e seca das brotaccedilotildees
foram influenciadas pela interaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo
de sacarose e a intensidade luminosa (Tabela 3) Placircntulas
de Agapantho multiplicadas sob intensidade de 70
mmolm-2s-1 apresentaram a maior produccedilatildeo de massa
fresca e seca dentro das concentraccedilotildees de 30 gL-1 Nas
concentraccedilotildees de 15 e 45 gL-1 os resultados obtidos
foram inferiores (Tabela 3) Por outro lado quando se
aumentou a intensidade para 140 mmolm-2s-1 a melhor
produccedilatildeo de massa fresca e seca ocorreu dentro da
concentraccedilatildeo de 15 gL-1 de sacarose (Tabela 3) Verificou-
se assim que o aumento da concentraccedilatildeo de sacarose no
meio de cultura proporcionou efeitos negativos na
produccedilatildeo de massa fresca e seca quando as placircntulas
foram submetidas agrave intensidade luminosa mais elevada
TABELA 3 ndash Massa fresca e seca de brotaccedilotildees de Agapanthus umbellatus var minor multiplicadas em biorreator de imersatildeotemporaacuteria suplementado com diferentes concentraccedilotildees de sacarose e intensidades luminosas no periacuteodo de 60 dias
Tais resultados corroboram as afirmaccedilotildees feitas referentes
agrave variaacutevel nuacutemero de brotaccedilotildees em que demonstrou-se
que foi possiacutevel reduzir a concentraccedilatildeo de sacarose em
maiores intensidade luminosas confirmando o grau de
mixotrofia
Ao analisar a concentraccedilatildeo de clorofila em
folhas de Agapantho verificou-se que natildeo houve
interaccedilatildeo significativa entre as concentraccedilotildees de
sacarose e intensidade luminosa Os teores de clorofila
a b e total (Tabela 4) foram maiores nas concentraccedilotildees
de 30 gL-1 sacarose Serret et al (1995) mostraram que
o aumento da concentraccedilatildeo de accediluacutecares (30 gL-1) no
meio de cultura promoveu maior produccedilatildeo de clorofila
impedindo a fotoinibiccedilatildeo realizaccedilatildeo de fotossiacutentese e
aumento do ganho de massa em plantas de Gardecircnia
cultivadas in vitro
Em relaccedilatildeo ao efeito da intensidade luminosa natildeo
houve efeito deste fator sobre essas variaacuteveis ainda que
Economou amp Read (1987) Galzy amp Compan (1992) Vlahos
et al (1992) George (1996) tenham observado que a
intensidade luminosa eacute um fator que estaacute estreitamente
relacionado agrave siacutentese de clorofila No entanto no presente
trabalho sugere-se a menor intensidade 70 mmolm-2s-1 com
o objetivo de que natildeo ocorra um aumento na velocidade
de decomposiccedilatildeo da clorofila com intensidade mais
elevada
Meacutedias seguidas pela mesma letra minuacutescula nas colunas e maiuacutescula nas linhas natildeo diferem significativamente peloteste de Duncan a 5 de probabilidade
Massa fresca (g)
Massa seca (g)
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1) Concentraccedilatildeo
Sacarose (gL-1) 70 140 70 140
0 000 dA 00 dA 000 dA 000 dA 15 067 cB 106 aA 0069 cB 0109 aA 30 082 aA 076 bB 0085 aA 0081 bB 45 075 bA 049 cB 0078 bA 0051 cB
CV 2873 2655
Caracteriacutesticas morfofisioloacutegicas de brotaccedilotildees 85
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
TABELA 4 ndash Concentraccedilotildees de clorofila a b e total (mgg massa fresca) em folhas de Agapanthus umbellatus varminor multiplicadas em biorreator de imersatildeo temporaacuteria por um periacuteodo de 60 dias submetidas a 4 concentraccedilotildees desacarose e dois niacuteveis de intensidade luminosa
Clrofila a (mgg massa fresca)
Clrofila b (mgg massa fresca)
Clrofila total (mgg massa fresca)
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1) Concentraccedilatildeo
Sacarose (gL-1) 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia
0 000 000 000 d 000 000 000 d 000 000 000 d 15 211 248 295 c 089 076 083 c 301 325 313 c 30 502 509 505 a 200 211 205 a 703 721 710 a 45 486 420 453 b 195 179 187 b 682 633 658 b
Meacutedia 299 a 294 a 121 a 116 a 421 a 420 a
CV 740 820 850
Meacutedias seguidas pela mesma letra nas linhas e colunas natildeo diferem significativamente pelo teste de Duncan a 5 deprobabilidade
Em relaccedilatildeo aos estocircmatos atraveacutes de
observaccedilatildeo microscoacutepica foi possiacutevel verificar que o
Agapantho possui folhas com caracteriacutest ica
anfiestomaacutetica caracterizada pela presenccedila de
estocircmatos em ambas as faces (face abaxial e adaxial)
Esta caracteriacutestica tem sido considerada como um
mecanismo adaptativo para maximizar a condutacircncia
de CO2 quando luz e aacutegua satildeo fatores limitantes
(KRAMER 1969)
Atraveacutes da anaacutelise estatiacutestica para densidade
estomaacutetica da face adaxial verificou-se que natildeo houve
interaccedilatildeo entre os fatores sacarose e intensidade
luminosa havendo portanto efeito isolado dos fatores A
maior densidade estomaacutetica da face abaxial foi obtida na
concentraccedilatildeo de 45 gL-1 (Tabela 5) Natildeo houve efeito da
intensidade luminosa para essa variaacutevel Por outro lado
a maior densidade estomaacutetica na face adaxial foi obtida
na concentraccedilatildeo de 45 gL-1 de sacarose e 140 mmolm-2s-1
de intensidade luminosa (Tabela 5) verificando a
influecircncia positiva da intensidade luminosa para essa
variaacutevel
As folhas de placircntulas multiplicadas na
concentraccedilatildeo de 15 gL-1 de sacarose apresentaram menor
densidade estomaacutetica em ambas as faces (Tabela 5) com
formato anormal largos e salientes caracteriacutesticas estas
natildeo desejaacuteveis pois segundo Preece amp Sutter (1991)
uma alteraccedilatildeo a niacutevel estrutural eou morfoloacutegico podem
impedir o funcionamento do aparelho estomaacutetico e grande
parte dos estocircmatos assim formados satildeo incapazes de se
fechar
Possivelmente este resultado se deve agraves
caracteriacutesticas de vitrificaccedilatildeo que as folhas do
tratamento 15 gL-1 de sacarose e 70 mmol m-2s-1 de
intensidade luminosa apresentaram (BLANKE amp
BELCHERL 1989) e a falta de energia armazenada no
explante com a falta de carbono que eacute proveniente da
sacarose adicionada ao meio de cultura (DESJARDINS
et al 1995) Estes resultados corroboram os obtidos
por Vintildea et al (2001) que demonstraram que folhas
vitrificadas de abacateiro apresentaram estocircmatos
grandes com saliecircncia ceacutelulas subsidiaacuterias assimeacutetricas
e deformadas e seu ostiacuteolo completamente aberto Tal
anomalia pode ser atribuiacuteda agrave perda da elasticidade das
paredes das ceacutelulas-guarda o que impediria o seu
movimento de abertura e fechamento que
consequumlentemente afeta o desenvolvimento das
placircntulas ao serem transferidas para condiccedilotildees ex vitro
atraveacutes da excessiva perda de aacutegua
FOGACcedilA L A et al86
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
TABELA 5 ndash Densidade estocircmatica (estocircmatosmm2) da face adaxial e abaxial de folhas de Agapanthus umbellatus varminor multiplicadas em biorreator de imersatildeo temporaacuteria suplementado com diferentes concentraccedilotildees de sacarose eintensidade luminosa por um periacuteodo de 60 dias
Densidade estomaacutetica (estocircmatosmm2) Epiderme da face Adaxial Epiderme da face Abaxial
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1)
Concentraccedilatildeo Sacarose(gL1) 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia
0 000 000 000 d 000 000 000 d 15 2587 3026 2802 c 3408 4752 4053 c 30 6524 5628 6064 b 9977 8584 9268 b 45 5412 7016 6188 a 8809 10807 9783 a
Meacutedia 2856 b 3089 a 4256 a 4705 a CV 1474 1206
Meacutedias seguidas pela mesma letra nas linhas e colunas natildeo diferem significativamente pelo teste de Duncan a 5 deprobabilidade
CONCLUSAtildeO
Condiccedilotildees ambientais tais como intensidade
luminosa e concentraccedilatildeo de sacarose adicionada ao meio
de cultura influenciaram no desenvolvimento e
crescimento das placircntulas de Agapanthus umbellatus
var minor quando multiplicadas em meio liacutequido no BIT
Placircntulas de Agapantho foram incapazes de se
desenvolver em meio sem sacarose sendo portanto
necessaacuteria a adiccedilatildeo de uma fonte de carbono visto que a
espeacutecie em estudo apresentou uma taxa de fotossiacutentese
incapaz de assegurar um balanccedilo positivo em carbono
Houve uma grande variaccedilatildeo nas respostas obtidas
no entanto fazendo uma avaliaccedilatildeo em conjunto das
variaacuteveis recomenda-se 30 gL-1 de sacarose e intensidade
luminosa de 70 mmolm-2s-1 No entanto deve-se ressaltar
que estudos mais aprofundados devem ser conduzidos
para verificar o efeito destas combinaccedilotildees sobre o
desempenho de placircntulas durante a fase de aclimatizaccedilatildeo
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SOUZA G de F M V e et al88
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
CAPACIDADE DE REGENERACcedilAtildeO IN VITRO DE TOMATEIROCULTIVAR SANTA CLARA
IN VITRO REGENERATION CAPACITY OF TOMATOPLANT CULTIVAR SANTA CLARA
GLAUCIA DE FATIMA MOREIRA VIEIRA E SOUZA1 JOSEacute MAGNO QUEIROZ LUZ2 ALCIONE SILVA ARRUDA3DENISE GARCIA SANTANA2 MARIANA DE SOUZA E SILVA DA COSTA TEIXEIRA4
LUCIANA LONDE5 ADELAIDE SIQUEIRA SILVA6 ELISAcircNGELA RODRIGUES FIGUEIRA7
1Mestranda em Fitotecnia ndash UFU ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash gfmvsyahoocombr2Professor Dr Instituto de Ciecircncias Agraacuterias ndash UFUICIAG ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash jmagnoumuaramaufubr3Dra em Geneacutetica e Bioquiacutemica Professora contratada da UEG ndash Unidade Universitaacuteria de Ipameri ndash Rodovia GO 330 Km 24 ndash Anel Viaacuterio SN ndash 75780-000 ndash Ipameri GO ndash asarrudahotmailcom4Engenheira Agrocircnoma ndash UFU ndash Conab Sede - SGAS 901 Bloco ldquoArdquo Lote 69 - Asa Sul ndash 70390-010 ndash Brasiacutelia DF ndash marisouza81yahoocombr5Dra em Geneacutetica e Bioquiacutemica ndash IGBUFU ndash Av Paraacute 1720 ndash Campus Umuarama ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash llondebolcombr6Mestranda em AgronomiaFitotecnia ndash UFUICIAG ndash Bolsista FAPEMIG ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash adelaidebioyahoocombr7Mestre em AgronomiaFitotecnia ndash UFUICIAG ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash Elis_figueirayahoocombr
RESUMOA cultivar de tomateiro Santa Clara (Lycopersicon
esculentum Mill) foi avaliada quanto ao seu potencial deregeneraccedilatildeo in vitro a partir de trecircs tipos de explantes e trecircsmeios de cultura seguidos de trecircs repicagens Os explantes foramcotileacutedone decapitado cotileacutedone fendido e cotileacutedone aparadonas extremidades Os meios de cultura foram MI macro emicronutrientes do MS vitaminas B5 de Gamborg et al (1968)suplementado com 30 gL de sacarose e de 8 gL de aacutegar pH 58MII meio MI suplementado com 1 mgL de BAP e 30 gL deglicose MIII meio MI suplementado com 25 mgL de BAP e02 mgL de AIA Para as repicagens foi utilizado o meio MIsuplementado com 05 mgL 08 mgL e 10 mgL de BAP paraa primeira segunda e terceira repicagens respectivamente Noenraizamento foi usado o meio MI suplementado com 05 mgL de AIA e as placircntulas enraizadas foram transferidas parasubstrato comercial Plantimax esterilizado e aclimatadas emlaboratoacuterio A maior induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo tanto de calosquanto de brotos foi observada nos meacutetodos cotileacutedone fendidoe cotileacutedone aparado quando colocados no meio MIII no entantoa induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo foi mais raacutepida quando usado cotileacutedonedecapitado indicando um alto potencial de organogecircneseespontacircnea sendo que o meio MI foi o melhor Os resultadosobtidos com as diferentes concentraccedilotildees de BAP nos trecircs ciclosde repicagem natildeo diferiram entre si e 82 das plantas enraizadasaclimataram-se com sucesso
Termos para indexaccedilatildeo Lycopersicon esculentummelhoramento do tomateiro cultura de tecidos
ABSTRACTThe tomato plant cultivar lsquoSanta Clararsquo (Lycopersicon
esculentum Mill) was evaluated as for its in vitro potential ofregeneration using three types of explants and three culture media
following three pricking-outs The explants were as followsdecapitated cotyledon split cotyledon and rim-trimmedcotyledon The culture media were MI MS macro andmicronutrients vitamins B5 of Gamborg et al (1968)supplemented with 30gL sucrose and 8gL agar pH 58 MIImedium MI supplemented with 1 mgL BAP and 30 gL glucoseMIII medium MI supplemented with 25 mgL BAP and 02mgL IAA For the pricking-outs the media MI wassupplemented with 05 mgL 08 mgL and 10 mgL BAP forthe first second and third pricking out respectively As forrooting the MI medium was supplemented with 05 mgL IAAand the rooted seedlings were transplanted to the sterilizedcommercial substrate Plantimax and then acclimatized inlaboratory Higher callus induction and sprout regeneration wasobserved for the methods of split and rim-trimmed cotyledonplaced into medium MIII Nevertheless the induction forregeneration was much faster when the decapitated cotyledonmethod was used indicating a high potential of spontaneousorganogenesis in which the media MI was the best The resultsobtained with the different concentrations of BAP in the threecycles of pricking-out did not differ among themselves and 82of the rooted plants were acclimatized successfully
Index terms Lycopersicon esculentum tomato breeding tissueculture
INTRODUCcedilAtildeO
O tomate pertence ao gecircnero Lycopersicon e a
espeacutecie cultivada cosmopolita eacute botanicamente
denominada de Lycopersicon esculentum (FILGUEIRA
2000) As cultivares atualmente plantadas podem ser
(Recebido em 03 de outubro de 2003 e aprovado em 04 de setembro de 2006)
Capacidade de regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro 89
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
reunidas em cinco grupos Santa Cruz Salada Cereja
Italiano Agroindustrial No presente trabalho foi utilizada
a cultivar Santa Clara do grupo Santa Cruz pois ela continua
sendo a cultivar mais plantada no Brasil
A tomaticultura estaacute associada a seacuterios problemas
fitossanitaacuterios sobretudo viroses aleacutem do ataque de
fungos bacteacuterias e insetos praga Cria-se com isto a
necessidade de se pesquisar novas alternativas ou
obtenccedilatildeo de novos genoacutetipos com resistecircncia muacuteltipla a
doenccedilas e pragas entre essas os estudos sobre
regeneraccedilatildeo e transformaccedilatildeo geneacutetica (FAacuteRI et al 2000)
A engenharia geneacutetica abriu uma nova perspectiva
para o melhoramento geneacutetico do tomateiro a partir do
final da deacutecada de 80 (WIJBRANDI amp BOTH 1993)
visando aumentar a produtividade e melhorar a qualidade
por meio da obtenccedilatildeo de resistecircncia a estresses bioacuteticos e
abioacuteticos A cultura de tecidos destaca-se durante o
processo de realizaccedilatildeo das teacutecnicas de transformaccedilatildeo
geneacutetica pois eacute necessaacuterio induzir gemas vegetativas e
em seguida regenerar brotos alongados e plantas
completas a partir de ceacutelulas ou tecidos geneticamente
modificados
Para a otimizaccedilatildeo de protocolos para o tomateiro
alguns fatores que afetam a eficiecircncia de transformaccedilatildeo
tecircm sido examinados dentre eles o tamanho do explante e
o tipo de explante hipocoacutetilo ou cotileacutedone (FRARY amp
EARLE 1996)
No Brasil haacute poucos trabalhos na aacuterea de
regeneraccedilatildeo in vitro e de transformaccedilatildeo geneacutetica de
cultivares de tomateiro e pouco se conhece sobre a
capacidade de regeneraccedilatildeo das principais cultivares
brasileiras (FAacuteRI et al 2000) Alguns pesquisadores como
Faria amp Illg (1993) analisaram a regeneraccedilatildeo in vitro de
algumas espeacutecies e cultivares de tomateiro observando
uma baixa capacidade morfogecircnica das cultivares se
comparadas com a espeacutecie selvagem Lycopersicon
pimpinellifolium (L) P Miller
Com este trabalho objetivou-se teve como objetivo
avaliar o potencial de regeneraccedilatildeo in vitro da cultivar Santa
Clara do grupo Santa Cruz a partir de diferentes tipos de
explantes e meios de cultura criando e otimizando
protocolos para sua regeneraccedilatildeo in vitro
MATERIAL E MEacuteTODOS
No Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos Vegetais do
Instituto de Geneacutetica e Bioquiacutemica da Universidade Federal
de Uberlacircndia foi avaliada a capacidade de regeneraccedilatildeo
in vitro do tomateiro cultivar Santa Clara usando trecircs
tipos de explantes e trecircs meios de cultura seguido de trecircs
repicagens O experimento foi realizado em delineamento
em blocos casualizados em esquema fatorial (3x3) com trecircs
repeticcedilotildees As plantas regeneradas foram enraizadas e
aclimatadas em laboratoacuterio
Sementes comerciais da cultivar Santa Clara apoacutes
serem desinfestadas por um minuto em aacutelcool etiacutelico a 96
e em hipoclorito de soacutedio comercial a 20 (vv) com duas
gotas de detergente comercial durante 25 minutos foram
enxaguumladas 5 vezes em aacutegua bidestilada esterilizada e
inoculadas em meio MS 100 (MURASHIGE amp SKOOG
1962) solidificado com 7 g L-1 de aacutegarndashaacutegar por sem
reguladores de crescimento O meio foi distribuiacutedo em
frascos de vidro esteacutereis utilizados para cultura de tecidos
com 30 mL de meio MS As culturas foram mantidas em
sala de crescimento com temperatura de 25+2 ordmC
fotoperiacuteodo de 16 horas e luminosidade de 50 mmol m-2s-
1 As placircntulas obtidas aos 14 15 e 20 dias apoacutes a semeadura
foram usadas como fonte de explantes para os blocos 1 2
e 3 respectivamente Os explantes foram inoculados de
acordo com os meacutetodos descritos a seguir em placas de
Petri devidamente esterilizadas e autoclavadas contendo
30 mL de meio de cultura com 16 unidades por tipo de
explante por meio de cultura utilizado Cada 16 explantes
constituiu uma parcela do experimento sendo composta
por duas placas de Petri cada uma com 8 explantes
Os tipos de explantes foram os seguintes
A - que consistiu na decapitaccedilatildeo de placircntulas onde
essa decapitaccedilatildeo ocorreu diretamente abaixo do noacute do
cotileacutedone ficando o hipocoacutetilo com as radiacuteculas
SOUZA G de F M V e et al90
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
B - meacutetodo de cotileacutedones fendidos os cotileacutedones
foram fendidos ao longo da nervura central da extremidade
ateacute sua metade de acordo com o protocolo de Faacuteri et al
(2000)
C - cotileacutedones foram aparados e seguiu-se o
protocolo descrito por Redenbaugh et al (1992) Os
cotileacutedones aparados nas extremidades distal e proximal
(aacutepice e peciacuteolo) foram inoculados com a face abaxial em
contato com o meio
Foram realizadas trecircs repicagens para alongar os
brotos Cerca de 30 dias apoacutes a inoculaccedilatildeo dos explantes
foi realizada a primeira repicagem Os intervalos entre as
repicagens foram em torno de 5 semanas
Os tratamentos consistiram na inoculaccedilatildeo dos trecircs
tipos de explantes descritos nos trecircs meios de cultura
abaixo com trecircs repeticcedilotildees por tratamento
Meio MI macro e micronutrientes de Murashige amp
Skoog (1962) e vitaminas B5 de Gamborg et al (1968)
suplementado com 30 gL de sacarose e de 8 gL de aacutegar-
aacutegar pH 58 meio MII meio de cultura MI suplementado
com 1 mgL de zeatina e 30 gL de glicose conforme
McCormick (1991) meio MIII meio de cultura MI
suplementado com 25 mgL de BAP e 02 mgL de AIA
segundo Rhim et al (1995)
Para as repicagens foi utilizado o meio MI
suplementado com 05 mgL 08 mgL e 10 mgL de BAP
para a primeira segunda e terceira repicagens
respectivamente
Para enraizamento foi usado o meio MI
suplementado com 05 mgL de AIA As placircntulas
enraizadas foram transferidas para substrato comercial
Plantimax esterilizado e aclimatadas em laboratoacuterio
Os brotos com 2 cm de comprimento foram
transferidos para o meio de enraizamento citado e
permaneciam nesse meio durante 15 dias Apoacutes esse periacuteodo
os brotos eram transplantados para substrato comercial
Plantimax autoclavado irrigados com aacutegua uma a duas
vezes por dia ateacute a aclimataccedilatildeo A aclimataccedilatildeo ocorreu em
torno de 20 dias em condiccedilotildees de laboratoacuterio
Avaliou-se a induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo o
alongamento de brotos e o enraizamento e aclimataccedilatildeo
das plantas regeneradas
Os dados de contagem foram transformados para
50x As anaacutelises de normalidade e homogeneidade
foram realizadas pelo software Prophet Os dados obtidos
foram submetidos agrave anaacutelise de variacircncia e as meacutedias
comparadas pelo teste de Tukey ao niacutevel de 5 de
probabilidade pelo software SANEST (ZONTA amp
MACHADO 1989)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Para cotileacutedone decapitado ocorreu um iniacutecio de
formaccedilatildeo de calosidade por volta de 10 dias apoacutes inoculaccedilatildeo
e o surgimento de brotos ocorreu cerca de 12 dias depois da
inoculaccedilatildeo sem a formaccedilatildeo de calos propriamente ditos A
induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo foi mais raacutepida quando usado esse
tipo de explante indicando um alto potencial de
organogecircnese espontacircnea sendo que o meio MI foi o melhor
para a induccedilatildeo e nuacutemero total de brotos (Tabela 1)
No cotileacutedone fendido o iniacutecio de formaccedilatildeo de
calosidade aconteceu com aproximadamente 10 dias apoacutes
inoculaccedilatildeo Por volta de 18 dias depois da inoculaccedilatildeo
iniciou-se o surgimento de brotos e jaacute existiam calos
formados Para esse tipo de explante nos meios MI e MII
ocorreu apenas a formaccedilatildeo de calos enquanto no meio
MIII ocorreu a formaccedilatildeo de calos e calos com brotos sendo
alto o nuacutemero total de brotos (Tabela 1) Supotildee-se que a
maior superfiacutecie de corte tenha influecircncia significativa
sobre esse fenocircmeno onde a maior superfiacutecie de corte do
cotileacutedone resulta em maior capacidade de regeneraccedilatildeo
(FAacuteRI et al 1995b)
No cotileacutedone aparado com cerca de 10 dias apoacutes
inoculaccedilatildeo ocorreu o iniacutecio de formaccedilatildeo de calos e 20 dias
depois da inoculaccedilatildeo ocorreu o surgimento de brotos e jaacute
existiam calos formados Para esse tipo de explante nos
meios MI MII e MIII ocorreu a formaccedilatildeo de calos no
entanto apenas no meio MIII ocorreu a formaccedilatildeo de calos
com brotos (Tabela 1)
Capacidade de regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro 91
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
TABELA 1 ndash Frequumlecircncia de induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo in vitro da cultivar Santa Clara do grupo Santa Cruz UberlacircndiaUFU 2001
Dados seguidos de mesma letra nas colunas (abc) e nas linhas (AB) natildeo diferem entre si a 5 de probabilidade peloteste de TukeyA diferenccedila entre o nordm de explantes de um meacutetodo para outro eacute devida a parcelas (ou parte delas) perdidas
Nos trecircs ciclos de repicagens a capacidade de
alongamento dos brotos foi igual indicando que as
concentraccedilotildees de BAP natildeo diferiram estatisticamente entre
si dentro de cada tipo de explante Em relaccedilatildeo ao nuacutemero
de brotos alongados na primeira e terceira repicagens o
cotileacutedone decapitado apresentou maior nuacutemero jaacute na
segunda repicagem natildeo houve diferenccedila entre os tipos de
explantes (Tabela 2)
As plantas apoacutes serem enraizadas foram
transferidas para aclimataccedilatildeo obtendo-se 82 de plantas
aclimatadas Cerca de 20 dias apoacutes transplantio para o
substrato as plantas jaacute estavam aclimatadas
Apoacutes a terceira repicagem ainda existiam cerca de
334 brotos para serem novamente repicados e 51 brotos
prontos para serem enraizados perfazendo um total geral
de 549 brotos obtidos ateacute a fase estudada
Para o tipo de explante cotileacutedone decapitado foram
obtidos 181 brotos equivalentes a 174 brotos por explante
Para o explante cotileacutedone fendido o nuacutemero de brotos por
Tipos de Explantes Variaacuteveis Meios Cotileacutedone decapitado Cotileacutedone fendido Cotileacutedone aparado
I 396 aA 050 cB 142 bB II 000 bB 632 bA 672 aA Nordm de explantes
com calos III 000 bB 1599 aA 597 bB I 1095 aA 000 bB 000bB II 050 bA 000 bA 000 bA Nordm de explantes
com brotos III 130 bB 1217 aA 850 aA I 396 aA 050 cB 169 cB II 000 bB 632 bA 645 bA Nordm total de
calos III 000 bB 3630 aA 2655 aA I 1850 aA 000 bB 000 bB II 050 bA 000 bA 000 bA Nordm total de
brotos III 130 bB 2760 aA 2934 aA I 48 32 40 II 32 40 32 Nordm de
explantes III 24 40 48 Total de explantes 104 112 120
explante foi igual a 145 e para o cotileacutedone aparado foram
obtidos 170 brotos por explante Esses resultados foram
semelhantes aos obtidos por Faacuteri et al (2000) para as
cultivares IPA-5 e IPA-6 os quais concluiacuteram que a
utilizaccedilatildeo de cotileacutedones fendidos e cotileacutedones aparados
produziram uma regeneraccedilatildeo alta e onde a maior induccedilatildeo
foi conseguida utilizando-se um meio igual ao MIII utilizado
nesse experimento A induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo tambeacutem foi
mais raacutepida quando usado cotileacutedone decapitado indicando
um alto potencial de organogecircnese espontacircnea A cultivar
Santa Clara mostrou-se mais eficiente na formaccedilatildeo de
brotos alongados observados na primeira repicagem
enquanto as cultivares utilizadas por Faacuteri et al (2000) IPA-
5 e IPA-6 necessitaram de duas repicagens para o
alongamento dos brotos no entanto a cultivar IPA-5
mostrou-se mais eficiente na produccedilatildeo de brotos por
explante Faacuteri et al (2000) utilizaram zeatina durante os trecircs
ciclos de repicagem enquanto nesse experimento foi
utilizado BAP
SOUZA G de F M V e et al92
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
TABELA 2 ndash Capacidade de alongamento e enraizamento de brotos da cultivar Santa Clara durante os trecircs ciclos derepicagem Uberlacircndia UFU 2001
Dados seguidos de mesma letra nas colunas (ab) e nas linhas (AB) natildeo diferem entre si a 5 de probabilidade peloteste de TukeyTipos de explantes A - cotileacutedone decapitado B - cotileacutedone fendido C - cotileacutedone aparado
Os resultados aqui obtidos tambeacutem foram
semelhantes aos de Faacuteri et al (1995b) que trabalhando
com transformaccedilatildeo geneacutetica da berinjela (Solanum
melongena L) observaram que a maior superfiacutecie de corte
do cotileacutedone resultou em maior capacidade de
regeneraccedilatildeo Tambeacutem foram obtidos resultados
semelhantes aos de Nogueira et al (2001) que estudando
a regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro Santa Clara utilizando
como explantes cotileacutedones concluiacuteram que o meio com
uma combinaccedilatildeo adequada de auxina e citocinina (10 mg L-
1 de zeatina e 01 mg L-1 de AIA) promoveu uma maior
meacutedia de regeneraccedilatildeo e um maior nuacutemero meacutedio de brotaccedilotildees
por explante Costa et al (2000) trabalhando com as
cultivares IPA-5 e IPA-6 chegaram a uma conclusatildeo
semelhante onde meio suplementado com 10 mg L-1 de
zeatina + 01 mg L-1 de AIA e meio suplementado com 25
mg L-1 de BAP + 02 mg L-1 de AIA determinaram a maior
frequumlecircncia de regeneraccedilatildeo de explantes cotiledonares e
tambeacutem um maior nuacutemero de brotos alongados por explante
McCormick et al (1986) pesquisando a morfogecircnese
in vitro de L esculentum observaram que a presenccedila de 25
mg L-1 de BAP e 10 mg L-1 de AIA ou 10 mg L-1 de BAP e
02 mg L-1 de AIA produziu um maior nuacutemero de ramos por
explante a partir de explantes de cotileacutedones e hipocoacutetilos
Ohki et al (1978) utilizando segmentos de hipocoacutetilos de L
esculentum sugeriram que o efeito positivo da combinaccedilatildeo
de auxinas e citocininas na regeneraccedilatildeo in vitro pode ser
causado por uma maior capacidade das ceacutelulas dessa espeacutecie
em utilizar e adaptar-se agrave combinaccedilatildeo de auxinas e citocininas
de que somente citocininas Para os mesmos autores a
variabilidade observada nas respostas morfogecircnicas in vitro
para diferentes citocininas pode ser causada pela variaccedilatildeo
na razatildeo de degradaccedilatildeo dessas substacircncias nos tecidos
vegetais ou no meio de cultivo Segundo Caldas et al (1999)
uma alta relaccedilatildeo citocininaauxina normalmente leva a maior
induccedilatildeo de parte aeacuterea (brotos) em explantes in vitro
principalmente quando a citocinina usada eacute o BAP que induz
a formaccedilatildeo de grande nuacutemero de brotos e alta taxa de
multiplicaccedilatildeo em muitos sistemas de micropropagaccedilatildeo
Tanto no presente trabalho quanto nos trabalhos acima
citados foram utilizados meios com pelo menos uma
combinaccedilatildeo com alta relaccedilatildeo citocininaauxina e meios
contendo apenas citocinina
CONCLUSOtildeES
A maior induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo tanto de calos
quanto de brotos foi observada nos meacutetodos cotileacutedone
fendido e cotileacutedone aparado quando colocados no meio
com BAP (25 mgL) e AIA (02 mgL) (MIII) Um ciclo de
repicagem foi suficiente para obtenccedilatildeo de brotos
alongados A maior regeneraccedilatildeo de brotos alongados
ocorreu com o meacutetodo cotileacutedone decapitado
Meios M1 + 05 mgL BAP M1 + 08 mgL BAP M1 + 10 mgL BAP
Repicagem 1 Repicagem 2 Repicagem 3
M1+ 05 mgl AIA
Tipos de Explante
s
Nordm total de brotos
Nordm de brotos
alongados
Nordm total de brotos
Nordm de brotos
alongados
Nordm total de brotos
Nordm de brotos
alongados
Nordm total de placircntulas
enraizadas
Nordm total de
plantas aclimatadas
Nordm total geral de brotos
A 3117 bA 899 aA 3684 bA
866 aA 3174 bA
81 aA 80 67 181 B 536 aA 466 bA 6244 aA 633 aA 5158 aA 450 bA 41 33 163 C 3527 bA 400 bA 4368 bA
566 aA 3928 bA
312 bA 43 35 205
Total 164 135 549
Capacidade de regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro 93
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
AGRADECIMENTOS
Ao Instituto de Geneacutetica e Bioquiacutemica e ao Instituto
de Ciecircncias Agraacuterias da Universidade Federal de
Uberlacircndia pelo financiamento deste projeto e a todos
que auxiliaram direta eou indiretamente
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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SILVA A S et al94
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
INDUCcedilAtildeO DE CALOS A PARTIR DE CULTURA DE ANTERAS DECAFEEIRO (Coffea arabica L) CV CATUAIacute VERMELHO 99 E 44
CALLUS INDUCTION FROM ANTHER CULTURE OF COFFEE PLANT (Coffea arabica L) CV CATUAIacute VERMELHO 99 AND 44
ADELAIDE SIQUEIRA SILVA1 JOSEacute MAGNO QUEIROZ LUZ2 DENISE GARCIA SANTANA2 PATRIacuteCIA CRYSTIE VIEIRA MUSTAFA3 MOACIR PASQUAL4 GLAUCIA DE FATIMA MOREIRA VIEIRA E SOUZA2
1Mestranda do Curso de Agronomia ndash Universidade Federal de UberlacircndiaUFU ndash Av Engenheiro Diniz 1178 ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash adelaidebioyahoocombr2Professor Dr ndash Universidade Federal de UberlacircndiaUFU ndash Instituto de Ciecircncias Agraacuterias ndash Curso de Agronomia ndash AV Paraacute Bloco 2E SALA 14campus Umuarana ndash Caixa-Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG3Bioacuteloga Universidade Federal de UberlacircndiaUFU ndash Centro de Ciecircncias Biomeacutedicas ndash Departamento de Agronomia ndash Rua Amazonas snordm - Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos sala 2E-14 ndash Umuarama ndash 38400920 ndash Uberlandia MG ndash patriciacrystiezipmailcombr
4Doutor Departamento de Adgricultura DAG ndash Universidade Federal de Lavras UFLA ndash Campus universitaacuterio ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash mpasqualuflabr
RESUMONo Brasil o cafeacute ainda apresenta poucos progressos com
relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo da cultura de tecidos vegetais tornando-se degrande importacircncia o conhecimento sobre a atuaccedilatildeo dosreguladores de crescimento Com este trabalho avaliou-se ocomportamento de duas cultivares de Coffea arabica L CatuaiacuteVermelho LCH-2077-2-5-99 e LCH-2077-2-5-44 denominadasrespectivamente de Catuaiacute Vermelho 99 e Catuaiacute Vermelho 44quanto agrave ausecircncia e presenccedila de luz e quantificou-se a interaccedilatildeoentre os reguladores de crescimento 24-D e BAP O experimentofoi realizado no Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos Vegetais daUniversidade Federal de Uberlacircndia As anteras das cultivaresCatuaiacute Vermelho 99 e 44 foram inoculadas em meio basal MSsuplementado com quatro concentraccedilotildees de 24-D (905 181271 e 362 mM) e duas concentraccedilotildees de BAP (0 e 89 mM) napresenccedila de luz e ausecircncia de luz As avaliaccedilotildees para a oxidaccedilatildeointumescimento e calosidade foram realizadas aos 30 dias apoacutes ainoculaccedilatildeo no meio de cultura e o diacircmetro dos calos aos 45 diasApoacutes 30 dias de cultivo os calos obtidos foram classificados emfriaacuteveis esverdeados esbranquiccedilados e cinza Os resultadosmostraram que para ocorrer intumescimento das anterasformaccedilatildeo e aumento do tamanho dos calos de ambas cultivares eacutenecessaacuterio que haja interaccedilatildeo entre a auxina (24-D) e a citocinina(BAP) Dentre os tipos de calos os de coloraccedilatildeo cinza foram osque apresentaram maior frequumlecircncia para as duas cultivares
Termos para indexaccedilatildeo Melhoramento calos reguladores decrescimento cafeeiro
ABSTRACTIn Brazil coffee still presents little progress regarding
the application of plant tissue culture which turns important theunderstanding of the action of growth regulators This workevaluated the in vitro performance of two Coffea arabica Lcultivars Catuaiacute Vermelho LCH-2077-2-5-99 and LCH-2077-2-5-44 known as Catuaiacute Vermelho 99 and Catuaiacute Vermelho 44respectively in the presence and absence of light and theinteraction of 24-D and BAP The experiment was carried out at
the Plant Tissue Culture Laboratory of the Universidade Federalde Uberlacircndia Anthers from both cultivars were inoculated inMS basal medium supplemented with four concentrations of24-D (905 181 271 and 362 mM) and two concentrations ofBAP (0 or 89 mM) in the presence and absence of lightOxidation intumescences and callus formation evaluations wereobtained 30 days after inoculation and callus diameter measuredat 45 days of inoculation The observed callus was classified asfriable greenish whitish or gray The results showed that antherintumescences callus formation and growth of both cultivarsdemand the interaction between the auxin (24-D) and thecytokinin (BAP) Callus presenting gray color were the mostfrequent for both cultivars
Index terms Plant breeding callus growth regulators coffee plant
INTRODUCcedilAtildeO
O cafeeiro pertence agrave famiacutelia Rubiaceae na qual o
gecircnero Coffea abrange cerca de 60 espeacutecies sendo as mais
comuns no mercado Coffea araacutebica L e Coffea canephora
Pierre ex Froehn Os programas de melhoramento do cafeacute
demandam aproximadamente 25 anos desde a hibridaccedilatildeo
ateacute a obtenccedilatildeo de uma nova cultivar (PASQUAL et al
2002) A cultura de anteras eacute considerada uma ferramenta
importante pois possibilita a obtenccedilatildeo de linhas
homozigoacuteticas em uma uacutenica etapa (ANDRADE 1998)
acelerando drasticamente o processo de obtenccedilatildeo de novas
cultivares Sendo assim a teacutecnica de cultura de anteras
vem auxiliar no melhoramento da cultura pois permite a
obtenccedilatildeo de haploacuteides em geraccedilotildees segregantes o que
leva agrave raacutepida produccedilatildeo de plantas homozigotas por meio
(Recebido em 14 de outubro de 2003 e aprovado em 29 de outubro de 2006)
Induccedilatildeo de calos a partir de cultura 95
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
da duplicaccedilatildeo do nuacutemero de cromossomos numa uacutenica
etapa substituindo as geraccedilotildees de auto fecundaccedilatildeo
Acrescenta-se a isso o fato de os haploacuteides serem livres
dos problemas de dominacircncia e recessividade por possuir
apenas um alelo em cada loco gecircnico
No Brasil Coffea arabica ainda apresenta poucos
progressos com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo da cultura de anteras
Daiacute a importacircncia de se produzir mais conhecimentos sobre
a atuaccedilatildeo dos reguladores de crescimento na expressatildeo
androgeneacutetica de Coffea arabica identificaccedilatildeo de
genoacutetipos androgecircnicos bem como a determinaccedilatildeo de
condiccedilotildees fiacutesicas mais adequadas agrave incubaccedilatildeo de anteras
nessa espeacutecie
Nos programas de melhoramento as teacutecnicas
convencionais tecircm apresentado resultados promissores
na cultura do cafeacute no que se refere ao aumento de
produtividade e obtenccedilatildeo de novas cultivares Um fator
importante para o sucesso da cultura de anteras eacute conhecer
o estaacutedio ideal de desenvolvimento dos microacutesporos com
o intuito de se obter uma melhor resposta androgeneacutetica
utilizando microacutesporos receacutem-liberados da teacutetrade meioacutetica
ateacute no maacuteximo o estaacutedio binucleado A fase uninucleada
responde positivamente ao processo embriogecircnico porque
nesta fase os microacutesporos apresentam uma parede celular
delgada o que a torna mais receptiva aos fatores externos
Em estaacutedios mais avanccedilados da microsporogecircnese ocorre
um engrossamento da parede celular sendo esta uma
caracteriacutestica do gratildeo de poacutelen maduro do cafeacute
prejudicando o processo de regeneraccedilatildeo (ASCANIO amp
ARCIA 1994) Os autores Grando amp Moraes Fernandes
(1993) sugerem que o potencial embriogecircnico do gratildeo de
poacutelen pode ser determinado tanto no periacuteodo da meiose
quanto no periacuteodo da preacute-mitose do microacutesporo pois
nestes dois momentos o microacutesporo ainda teria
metabolicamente caracteriacutesticas esporofiacuteticas o que
permite a diferenciaccedilatildeo do gratildeo de poacutelen em embriatildeo e
posterior formaccedilatildeo de uma planta
Segundo Mantell et al (1994) satildeo possiacuteveis vaacuterios
tipos de desenvolvimento do microacutesporo in vitro sendo
que tanto o nuacutecleo generativo quanto o vegetativo pode
se dividir continuamente originando um embrioacuteide
haploacuteide ou ainda a primeira mitose produziria dois nuacutecleos
semelhantes e estes se dividiriam repetidamente resultando
na formaccedilatildeo de embrioacuteides haploacuteides
A composiccedilatildeo do meio de cultura tambeacutem eacute de
grande importacircncia para o sucesso da cultura de anteras
natildeo existindo contudo uma recomendaccedilatildeo generalizada
Na maioria das espeacutecies a androgecircnese se verifica em meios
que conteacutem sais minerais sacarose vitaminas reguladores
de crescimento e aacutegar (MORAES FERNANDES 1990) A
consistecircncia do meio normalmente eacute semi-soacutelida mas os
meios liacutequidos estatildeo sendo cada vez mais usados pois
tecircm vantagens no aumento do rendimento pela maior
obtenccedilatildeo de embriotildees e calos (PIERIK 1987) O
presente trabalho teve como objetivo aplicar a teacutecnica da
cultura de anteras em diferentes cultivares de Coffea
arabica verificando os vaacuterios fatores que influenciam a
induccedilatildeo de calos
MATERIAL E MEacuteTODOS
Experimentos de Induccedilatildeo e Regeneraccedilatildeo de Calos
Esta etapa constituiu-se de dois experimentos cada
um com uma cultivar tendo sido conduzidos no laboratoacuterio
de Cultura de Tecidos Vegetais da Universidade Federal
de Uberlacircndia em Uberlacircndia - Minas Gerais no periacuteodo
de setembro de 2002 a janeiro de 2003
Foram utilizados bototildees florais de duas cultivares
de Coffea araacutebica Catuaiacute Vermelho LCH-2077-2-5-99 e
LCH-2077-2-5-44 denominadas respectivamente de Catuaiacute
Vermelho 99 e Catuaiacute Vermelho 44 plantadas na aacuterea
experimental do Campus Umuarama dessa Universidade
Os bototildees florais foram coletados no periacuteodo de 8 agraves 9
horas da manhatilde e armazenados em placas de Petri contendo
papel de filtro umedecido em aacutegua destilada e colocados
dentro de uma caixa de isopor para evitar a desidrataccedilatildeo
ateacute serem conduzidos ao laboratoacuterio
No laboratoacuterio o comprimento dos bototildees foi
medido com o auxiacutelio de um paquiacutemetro e utilizaram-se
SILVA A S et al96
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
bototildees florais entre 45 a 60 mm de comprimento em todos
os experimentos Os bototildees foram envoltos em gaze
previamente autoclavada e desinfestados em uma soluccedilatildeo
de aacutelcool 70 por alguns segundos e por 10 minutos em
soluccedilatildeo de hipoclorito de soacutedio a 02 sob agitaccedilatildeo Em
seguida na cacircmara de fluxo laminar foram lavados 3 vezes
em aacutegua destilada e autoclavada Apoacutes este processo as
anteras foram retiradas dos bototildees com o auxiacutelio de uma
lupa uma pinccedila fina e bisturi nordm 10 sendo os uacuteltimos
flambados para cada botatildeo tomando-se o cuidado para
natildeo ferir as anteras Logo apoacutes as anteras foram imersas
por 1 segundo em soluccedilatildeo de aacutecido ascoacuterbico na
concentraccedilatildeo de 600 mgL-1 hipoclorito de soacutedio 02 e
aacutegua destilada e autoclavada respectivamente
Apoacutes este processo as anteras foram inoculadas
em tubo de ensaio contendo 20 mL do meio MS
(MURASHIGE amp SKOOG 1962) suplementado com aacutecido
24-diclorofenoxiaceacutetico (24-D) e 6- benzilaminopurina
(BAP) em diferentes concentraccedilotildees com pH ajustado para
58 Este meio foi esterilizado em autoclave vertical agrave
temperatura de 121deg C sob pressatildeo de 1 atm por 20 minutos
O delineamento experimental utilizado foi o de
blocos casualizados com 10 repeticcedilotildees em esquema fatorial
4 x 2 x 2 sendo que os fatores foram compostos de quatro
concentraccedilotildees de 24-D (905 181 271 362 mM) duas
concentraccedilotildees de BAP (0 e 89 mM) perfazendo oito
tratamentos incubados na ausecircncia ou presenccedila de luz
em sala de crescimento com temperatura de 25 plusmn 2degC e 16
horas de fotoperiacuteodo Nos dois experimentos cada
tratamento teve 10 repeticcedilotildees sendo um tubo com 10
anteras considerado uma repeticcedilatildeo
Aos 30 dias apoacutes a inoculaccedilatildeo das anteras foram
avaliadas as porcentagens de oxidaccedilatildeo de intumescimento
e de formaccedilatildeo de calos (calosidade) e aos 45 dias foi medido
o diacircmetro dos calos
Os calos obtidos das duas cultivares apoacutes 45 dias
de inoculaccedilatildeo das anteras foram transferidos para o meio
MS suplementado com 30 gL-1 de sacarose 6gL-1 de agar e
de 24-DBAP nas seguintes concentraccedilotildees de 1810 181
2 2710 e 3620 mM com pH ajustado para 58 associando
a ausecircncia e presenccedila de luz
Apoacutes a permanecircncia destes calos no meio de cultura
por 30 dias aqueles provenientes da cultivar Catuaiacute
Vermelho 99 incubados na presenccedila de luz foram
transferidos para o meio de cultura contendo 271 mM de
24-D enquanto que aqueles incubados na ausecircncia de
luz foram transferidos para meio contendo 362 mM de 24-
D Jaacute os calos da cultivar Catuaiacute Vermelho 44 incubados
na presenccedila de luz foram transferidos para meio contendo
181 mM de 24-D e 89 mM de BAP e os incubados na
ausecircncia de luz transferidos para o meio contendo 181
mM de 24-D
Apoacutes 30 dias neste tratamento foram avaliadas as
caracteriacutesticas referentes ao tipo de calo (friaacuteveis
esverdeados esbranquiccedilados e cinza)
Os dados obtidos foram testados quanto agrave
normalidade e agrave homogeneidade necessitando de
transformaccedilatildeo em arco seno para os dados em
porcentagem e raiz quadrada de (x + 05) para os dados
referentes ao diacircmetro dos calos
RESULTADOS
Interaccedilatildeo entre os Reguladores de Crescimento e oFotoperiacuteodo
Para a cultivar Catuaiacute 99 em todas as concentraccedilotildees
de 24-D e independentemente da concentraccedilatildeo de BAP a
oxidaccedilatildeo foi menor na ausecircncia de luz diferindo
estatisticamente da fase em que se tinha presenccedila de luz
No entanto nos calos cultivados nas concentraccedilotildees de
905 e 271 mM de 24-D e 89 mM de BAP na ausecircncia de
luz foi observado um aumento significativo na oxidaccedilatildeo
das anteras o mesmo acontecendo na concentraccedilatildeo de
271 mM de 24-D na presenccedila de luz No entanto resultado
inverso foi observado para a concentraccedilatildeo de 362 mM de
24-D (Tabela 1)
Os resultados do percentual de intumescimento
variaram bastante em funccedilatildeo da luminosidade e
reguladores de crescimento (Tabela 1) Na presenccedila do
Induccedilatildeo de calos a partir de cultura 97
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
BAP e concentraccedilatildeo 89 mM de 24-D tanto na presenccedila
ou ausecircncia de luz o intumescimento dos calos natildeo diferiu
significativamente Jaacute na concentraccedilatildeo de 181 mM de 24-
D na presenccedila de luz se mostrou melhor promovendo um
aumento significativo do intumescimento das anteras
Quanto agraves concentraccedilotildees de 271 e 362 mM de 24-D
cultivados na presenccedila de luz se mostrou melhor ao
intumescimento quando comparado agravequeles cultivados na
ausecircncia de luz (Figura 1)
A presenccedila de calos aumentou significativamente
com a incubaccedilatildeo das anteras na ausecircncia de luz e na
TABELA 1 ndash Meacutedias do nuacutemero de anteras oxidadas intumescidas e com calos e diacircmetro dos calos (mm) em funccedilatildeode diferentes concentraccedilotildees de 24-D e ausecircncia ou presenccedila de BAP em duas condiccedilotildees de luminosidade (presenccedilaou ausecircncia de luz) para anteras do genoacutetipo cv 99
Luminosidade1
Oxidaccedilatildeo () Intumescimento ()
Calosidade () Diacircmetro (mm) 24-D M
BAP M luz Escuro Luz Escuro luz Escuro luz Escuro 0 980 b A 395 a A 000b B 434 a A 000 b A 740 a A 000 b A 309 a A 905
89 999 b A 823 a B 398 a A 327 a B 007 b A 615 a A 000 b A 300 a A 0 999 b A 524 a A 000 b B 447 a A 007 b A 750 a A 000 b B 368 a A
181 89 935 b A 511 a A 614 a A 407 b A 030 b A 720 a A 300 b A 387 a A
0 745 b A 000 a A 534 a A 000 b B 530 a A 000 b B 318 a B 000 b B 271
89 914 b B 590 a B 625 a A 634 a A 708 a A 809 a A 377 a A 298 b A 0 999 b B 440 a A 607 a A 492 b A 097 b B 815 a A 300 a B 277 a A
362 89 813 b A 426 a A 493 a B 527 a A 378 b A 758 a A 398 a A 298 b A
1Meacutedias seguidas por letras diferentes minuacutesculas na linha e maiuacutesculas na coluna dentro de cada concentraccedilatildeo de 2-4-D diferem entre si pelo teste de Tuckey a significacircncia de 5
concentraccedilatildeo de 271 mM de 24-D nas demais
concentraccedilotildees de 24-D independente da concentraccedilatildeo
do BAP a incubaccedilatildeo na ausecircncia de luz apresentou
meacutedias de calosidade significativamente maiores (Figura
2) A presenccedila do BAP promoveu aumento significativo
na calosidade das anteras na concentraccedilatildeo 271 mM de
24-D na ausecircncia de luz e na concentraccedilatildeo de 362 mM
de 24-D na presenccedila de luz Nas demais concentraccedilotildees
natildeo houve diferenccedila significativa entre presenccedila ou
ausecircncia de BAP tanto na ausecircncia ou presenccedila de luz
(Tabela 1)
FIGURA 1 ndash Anteras da cv Catuaiacute Vermelho 99 naconcentraccedilatildeo de 181 M de 24-D na presenccedila de luz
FIGURA 2 ndash Calos de anteras incubadas na ausecircncia deluz e na concentraccedilatildeo de 271 M de 24-D
SILVA A S et al98
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
Quanto ao diacircmetro nas concentraccedilotildees 905 e 181 M
de 24-D a ausecircncia de luz promoveu aumento significativo
no diacircmetro dos calos diferindo-se estatisticamente do
tratamento na presenccedila de luz Somente para a concentraccedilatildeo
de 271 mM de 24-D na ausecircncia do BAP natildeo houve diferenccedila
significativa para a caracteriacutestica independentemente do
fotoperiacuteodo Nas demais concentraccedilotildees de 24-D o tratamento
na presenccedila de luz promoveu um aumento significativo no
diacircmetro dos calos No tratamento em que houve a associaccedilatildeo
da presenccedila de luz e de BAP natildeo diferiu estatisticamente do
tratamento em que houve a ausecircncia de BAP quando a
concentraccedilatildeo de 24-D foi de 905 mM nos demais
proporcionou aumento significativo no diacircmetro dos calos
Para o tratamento na ausecircncia de luz apenas na concentraccedilatildeo
de 271 mM de 24-D a ausecircncia de BAP promoveu diminuiccedilatildeo
significativa no diacircmetro de calos Nas demais concentraccedilotildees
natildeo houve diferenccedila significativa entre presenccedila ou ausecircncia
de BAP (Tabela 1)
Para as variaacuteveis intumescimento e calosidade da
cultivar cv 44 a interaccedilatildeo entre 24-D e BAP natildeo diferiram
estatisticamente quanto presenccedila e ausecircncia de luz nas
concentraccedilotildees 905 e 362 mM de 24-D e que tambeacutem natildeo
difere para o diacircmetro na concentraccedilatildeo de 181 mM de 24-
D Jaacute na concentraccedilatildeo 271 mM de 24-D haacute uma semelhanccedila
quanto ao intumescimento calosidade e diacircmetro que
diferem das demais concentraccedilotildees natildeo apresentando
portanto uma boa interaccedilatildeo
A melhor interaccedilatildeo para intumescimento calosidade
e diacircmetro encontra-se respectivamente na concentraccedilatildeo
905 mM de 24-D na presenccedila de luz na concentraccedilatildeo 181
mM de 24-D na ausecircncia de luz e na concentraccedilatildeo 905
mM de 24-D na ausecircncia de luz Jaacute as piores interaccedilotildees
estatildeo na concentraccedilatildeo 271 mM de 24-D na luz tanto para
o intumescimento quanto para o diacircmetro analisados na
Tabela 2
De acordo com a Tabela 2 observou-se que os
melhores resultados ou seja as interaccedilotildees independem
da presenccedila ou ausecircncia de BAP Na Tabela 3 notou-se
uma maior oxidaccedilatildeo das anteras quando incubadas no claro
estas apresentaram uma maior oxidaccedilatildeo em relaccedilatildeo as que
foram incubadas no escuro tornando-se mais tarde calos
previamente oxidados
TABELA 2 ndash Meacutedias do nuacutemero de anteras intumescidas e com calos diacircmetro dos calos (mm) em funccedilatildeo de diferentesconcentraccedilotildees de 24-D e ausecircncia ou presenccedila de BAP em duas condiccedilotildees de luminosidade (luz e escuro) para anterasdo genoacutetipo cv 44
Luminosidade1
Intumescimento () Calosidade () Diacircmetro (mm) 24-D ( M)
BAP ( M) Luz Escuro Luz Escuro Luz Escuro
0 907 a A 775 a A 779 bA 948 aA 609 bA 800 aA 905 89 843 a A 875 a A 889 aA 946 aA 607 aA 420 bB 0 887 a A 852 a A 939 aA 990 aA 490 aA 466 aA
181 89 906 a A 786 a A 917 aA 959 aA 420 aA 493 aA 0 600 b A 772 a A 694 bA 895 aA 000 bA 373 aA
271 89 022 b B 827 a A 294 bB 837 aA 000 bA 376 aA 0 828 a A 737 a A 928 aA 939 aA 414 bA 595 aA
362 89 866 a A 725 a A 949 aA 866 aA 329 aA 376 aA
1Meacutedias seguidas por letras diferente minuacutesculas na linha e maiuacutesculas na coluna dentro de cada concentraccedilatildeo de 2-4-D diferem entre si pelo teste de Tukey a significacircncia de 5
Induccedilatildeo de calos a partir de cultura 99
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
TABELA 3 ndash Meacutedias de oxidaccedilatildeo das anteras entre asdiferentes concentraccedilotildees de 24-D em duas condiccedilotildeesde luminosidade (luz e escuro) para anteras da cultivarCatuaiacute Vermelho 44
Concentraccedilotildees
24-D ( M ) OXIDACcedilAtildeO ()
Claro Escuro 905 749 a 269 b 181 420 a 270 b 271 999 a 221 b 362 308 a 334 a
1Meacutedias seguidas por letras diferentes minuacutesculas na linhadentro de cada concentraccedilatildeo de 2-4-D diferem entre sipelo teste de Tukey a significacircncia de 5
TABELA 4 ndash Tipos de calos obtidos apoacutes 30 dias em meioMS com 362 M de 24-D na ausecircncia de luz da cultivarCatuaiacute Vermelho 99
Tipos de Calos
Nuacutemero de Calos
Nuacutemero de Calos com diacircmetro acima
de 05 mm Friaacuteveis 03 Esverdeados 13 06 Esbranquiaccedilados
03 Cinza 26
Dados de contagem natildeo transformados O recultivo emmeio MS com 362 M de 24-D na presenccedila de luz teve100 de contaminaccedilatildeo apoacutes sua inoculaccedilatildeo
TABELA 5 ndashTipos de calos obtidos apoacutes 30 dias em meioMS com 181 M de 24D e 89 M de BAP na presenccedilade luz da cultivar Catuaiacute Vermelho 44
TABELA 6 ndash Tipos de calos obtidos apoacutes 30 dias em meioMS com 181 M de 24D na ausecircncia de luz da cultivarCatuaiacute Vermelho 44
Tipos de Calos Nuacutemero de Calos
Nuacutemero de Calos com diacircmetro
acima de 05 mm Friaacuteveis 58 Esverdeados 23 214 Esbranquiaccedilados 94 Cinza 203
Tipos de Calos
Nuacutemero de Calos
Nuacutemero de Calos com diacircmetro
acima de 05 mm Friaacuteveis 25 Esverdeados 11 69 Esbranquiaccedilados 19 Cinza 350
Dados de contagem natildeo transformados Dados de contagem natildeo transformados
Nesta etapa a maioria dos calos encontrados para
as trecircs cultivares apresentaram coloraccedilatildeo cinza (Tabelas 4
5 e 6) A perda gradativa da coloraccedilatildeo natural dos calos
passando de verdes para a cor marrom a diminuiccedilatildeo do
ritmo de crescimento dos mesmos a estagnaccedilatildeo do
processo de formaccedilatildeo de embrioacuteides seguido do
surgimento de aacutereas necrosadas na superfiacutecie satildeo sinais
que caracterizam a senescecircncia da cultura (SILVA 2002)
DISCUSSAtildeO
A resposta das anteras da cultivar Catuaiacute Vermelho 99
com relaccedilatildeo agrave oxidaccedilatildeo indica que a mesma estaacute associada agrave
combinaccedilatildeo entre auxina e citocinina promovendo os menores
iacutendices de oxidaccedilatildeo Agrave medida que se aumentou a
concentraccedilatildeo de 24-D na presenccedila de BAP houve um
aumento gradativo da oxidaccedilatildeo ateacute atingir um ponto maacuteximo
em torno de 80 na dosagem de 271 mM de 24-D Jaacute na
ausecircncia de BAP a oxidaccedilatildeo foi bem maior quando comparada
agrave porcentagem de oxidaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 905 mM de
24-D De acordo com Wang amp Huang (1976) o cultivo in
vitro por um periacuteodo longo induz a formaccedilatildeo de compostos
fenoacutelicos no meio que podem causar necrose e posteriormente
morte dos calos Maciel (2001) e Paluacute (2002) citam que pelos
resultados obtidos para a induccedilatildeo de calogecircnese em anteras
de cafeeiro observa-se que eacute necessaacuteria uma auxina
juntamente com uma citocinina Dentre as auxinas sinteacuteticas
o 24-D eacute sem duacutevida o mais adequado agrave induccedilatildeo e
manutenccedilatildeo do calo (GAMBORG et al 1976)
Para Thomas amp Ravindra (1997) o maior problema
na iniciaccedilatildeo de culturas lenhosas eacute a ocorrecircncia de
compostos fenoacutelicos que estatildeo ligados com processos de
regulaccedilatildeo de crescimento especialmente com as auxinas
que dependendo da sua concentraccedilatildeo endoacutegena no tecido
resulta na induccedilatildeo desses compostos
SILVA A S et al100
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
O fotoperiacuteodo que estas anteras foram submetidas
influenciou tambeacutem na porcentagem de oxidaccedilatildeo sendo
que no escuro e na presenccedila de 24-D (89 mM) a oxidaccedilatildeo
foi miacutenima Agrave medida que foi aumentando a concentraccedilatildeo
da auxina foi aumentando tambeacutem a oxidaccedilatildeo poreacutem este
aumento foi bem menor quando comparado ao cultivo das
anteras na presenccedila de luz
A oxidaccedilatildeo fenoacutelica tem sido controlada em
diferentes espeacutecies lenhosas pela reduccedilatildeo da intensidade
luminosa (MARKS amp SIMPSON 1990) associada com a
substituiccedilatildeo frequumlente do meio de cultura e dessa forma
as chances de se obter sucesso no estabelecimento e
cultivo de explantes de espeacutecies lenhosas satildeo bastante
elevadas (TEIXEIRA 2001)
Em muitas espeacutecies por razotildees natildeo conhecidas a
embriogecircnese direta eacute rara e as plantas tecircm que ser
diferenciadas a partir de calos Para induccedilatildeo destes
geralmente eacute necessaacuteria uma auxina (MAHESHWARI et
al 1982) Segundo Rocha (1998) para a induccedilatildeo e
manutenccedilatildeo do calo a maioria das espeacutecies parece
comportar-se diferentemente natildeo soacute quanto aos
reguladores de crescimento podendo ocorrer
independentemente de auxinas e citocininas dependente
de ambas ou dependente de uma ou de outra mas tambeacutem
quanto agrave presenccedila ou ausecircncia de luminosidade Sharp et
al (1973) obtiveram calos atraveacutes do cultivo de sementes
folhas e anteras de C arabica das cultivares Mundo Novo
e Bourbon Amarelo A induccedilatildeo de calos tambeacutem foi mais
eficiente na ausecircncia de luz Aleacutem disso Ascanio amp Arcia
(1994) citam que para o desenvolvimento do calo as
anteras devem ser mantidas no escuro jaacute para o
desenvolvimento do embriatildeo os calos devem ser mantidos
no claro
Natildeo houve a formaccedilatildeo de embriotildees e isto pode ser
devido agraves doses de reguladores ou mesmo de combinaccedilotildees
que natildeo foram apropriadas para estas cultivares
CONCLUSAtildeO
Os resultados mostraram que para ocorrer
intumescimento das anteras formaccedilatildeo e aumento do
tamanho dos calos de ambas as cultivares eacute necessaacuterio
que haja interaccedilatildeo entre a auxina (24-D) e a citocinina
(BAP) e incubaccedilatildeo no escuro
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PEREIRA F D et al102
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COMUNICACcedilAtildeO CIENTIacuteFICA
PROLIFERACcedilAtildeO IN VITRO DE BROTOS DE CURAUAacuteUTILIZANDO DIFERENTES VOLUMES DE MEIO DE CULTURA
IN VITRO SHOOT PROLIFERATION OF Ananas erectifolius USING DIFFERENTVOLUMES OF CULTURE MEDIUM
FLAacuteVIA DIONIacuteSIO PEREIRA1 JOSEacute EDUARDO BRASIL PEREIRA PINTO2HELEN CRISTINA DE ARRUDA RODRIGUES3 LUCIANA DOMICIANO SILVA ROSADO3
LUIZ ALBERTO BEIJO4 OSMAR ALVES LAMEIRA5
1Doutoranda em Agronomia ndash Universidade Estadual de Feira de SantanaUEFS ndash Horto Florestal ndash 44055-000 ndash Feira de Santana BA ndash flavia1808hotmailcom
2Doutor em Fisiologia Vegetal ndash Departamento de AgriculturaDAG ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash jeduardouflabr
3Graduanda em Agronomia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG4Doutorado em Agronomia ndash Universidade Federal de AlfenasUNIFAL ndash Departamento de Ciecircncias Exatas ndash Rua Gabriel Monteiro da Silva n deg 714 ndash Centro ndash 37130-000 ndash Alfenas MG ndash luizbeijoyahoocombr5Doutor em Agronomia ndash EMBRAPA ndash Amazocircnia Oriental ndash Trav Dr Eneacuteas Pinheiro sn ndash Bairro Marco ndash 66095-100 ndash Beleacutem PA ndash osmarcpatuembrapabr
RESUMOCurauaacute [Ananas erectifolius LBSm ndash Bromeliaceae] eacute
uma espeacutecie com grande potencial de uso de suas fibras comorevestimento na induacutestria automobiliacutestica Aleacutem disso o poacute dosumo do curauaacute tem sido utilizado no tratamento de cicatrizaccedilatildeode lesotildees cutacircneas Neste trabalho avaliaram-se diferentes volumesde meio MS Os volumes utilizados foram de 10 15 20 25 e 30 mLO delineamento experimental foi inteiramente casualizado (DIC)e cada tratamento continha 19 repeticcedilotildees Aos 30 dias avaliaram-se o nuacutemero e o tamanho de brotaccedilotildees Segundo a anaacutelise devariacircncia houve efeito linear do volume de meio na produccedilatildeo debrotos de curauaacute Agrave medida em que se aumenta o volume domeio aumenta o nuacutemero de brotos Natildeo houve diferenccedilasignificativa nos comprimentos dos brotos
Termos para indexaccedilatildeo Ananas erectifolius fibras vegetaismicropropagaccedilatildeo
ABSTRACTAnanas erectifolius LBSm ndash Bromeliaceae is a species
that presents fibers with great potential to be used as revetmentfor the automobile industry Besides the powder obtained fromits juice has been used in the treatment of skin lesionscicatrisation In this work the effect of different volumes (1015 20 25 and 30 mL) of MS medium during the in vitro cultureof axillary buds was evaluated A completely randomized design(CDR) was used with each treatment containing 19 replicatesAfter 30 days of inoculation shoot number and size wereevaluated The analysis of variance showed a linear effect of theculture medium volume and shoot proliferation Higher shoot
number was observed with the increase of medium volume Nosignificant difference was observed on shoot lenght
Index terms Ananas erectifolius vegetable fibermicropropagation
A produccedilatildeo de fibras vegetais ocupa um papel
relevante na economia agriacutecola mundial mesmo com a
intensa produccedilatildeo de fibras sinteacuteticas Mateacuterias-primas de
origens renovaacuteveis reciclaacuteveis e biodegradaacuteveis satildeo uma
das alternativas para a produccedilatildeo de manufaturados
ecologicamente corretos em consequumlecircncia do acuacutemulo
nos descartes de materiais natildeo biodegradaacuteveis os quais
tendem a aumentar com o crescimento populacional nos
centros urbanos A substituiccedilatildeo de materiais derivados do
petroacuteleo na produccedilatildeo de compostos elastomeacutericos por
mateacuteria-prima renovaacutevel vai ao encontro desses ideais
(ROCHA et al 2003)
As fibras sinteacuteticas destacam-se pela elevada
resistecircncia baixa densidade e elevada produccedilatildeo
Entretanto as fibras animais e vegetais satildeo as de maior
importacircncia principalmente para atender aos apelos
(Recebido em 31 de agosto de 2006 e aprovado em 19 de janeiro de 2007)
Proliferaccedilatildeo in vitro de brotos de curauaacute 103
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 102-106 2006
ecoloacutegicos e pelo nuacutemero de plantas e animais produtores
de fibras (SCHREIBER1998)
As plantas produtoras de fibras utilizaacuteveis foram
quantificadas por vaacuterios autores e em diferentes eacutepocas
tendo sido enumeradas 2000 mil plantas fibrosas e o seu
total estimado em 2300 destacando-se as florestas tropicais
que encerram recursos inesgotaacuteveis em potencial
(MEDINA 1959)
O curauaacute [Ananas erectifolius LBSm ndash
Bromeliaceae] utilizado principalmente na fabricaccedilatildeo de
cordas sacos e utensiacutelios domeacutesticos surge como
sucedacircneo para o aproveitamento de fibras O curauaacute eacute
uma bromeliaacutecea distribuiacuteda nos Estados do Paraacute Acre
Mato grosso Goiaacutes e Amazonas e eacute cultivada
principalmente por pequenos produtores da regiatildeo do
Lago Grande de Curuai no municiacutepio de Santareacutem PA
Estudos recentes tecircm demonstrado o grande potencial do
uso das fibras dessa planta como revestimento na induacutestria
automobiliacutestica devido agrave sua resistecircncia maciez e peso
reduzido O grande problema eacute que natildeo haacute suprimento
suficiente de mateacuteria-prima para atender agrave induacutestria
automobiliacutestica pois o curauaacute eacute fiel agraves suas origens amazocircnicas
e soacute se desenvolve em clima quente e uacutemido criando um
problema para a aquisiccedilatildeo de mudas fora desta regiatildeo que
por tal motivo eacute escassa no mercado (SILVA 2004)
A micropropagaccedilatildeo utilizando teacutecnicas de cultura
de tecido tem sido um valioso instrumento na propagaccedilatildeo
de diversos tipos de plantas Embora este processo envolva
diferentes etapas depois de definido um protocolo de
micropropagaccedilatildeo seja qual for a espeacutecie este pode ser
otimizado no intuito de se obter placircntulas de alta qualidade
e com baixo valor de produccedilatildeo O tipo e tamanho de frasco
e a quantidade de meio satildeo variaacuteveis que tecircm recebido
pouca atenccedilatildeo embora afetem diretamente a aacuterea superficial
da interface meio de cultura-atmosfera o volume de ar sobre
o meio de cultura e a sua profundidade Tais fatores tambeacutem
afetam a composiccedilatildeo da fase gasosa do frasco e
consequumlentemente o crescimento e desenvolvimento das
culturas (GRATTAPAGLIA amp MACHADO 1998)
Rodrigues et al (2005) verificaram maior
proliferaccedilatildeo de brotos de Cattleya persivaliana Hort
em frascos contendo 50 mL de meio quando comparados
com aqueles de 25 75 e 100 mL Nicoloso amp Erig (2002)
trabalhando com Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen
verificaram que 10 mL de meio MS (MURASHIGE amp
SKOOG 1962) proporcionaram o melhor crescimento
das placircntulas em biomassa quando cultivadas em tubos
de 20 cm de altura x 2 cm diacircmetro em comparaccedilatildeo com
os de 25 cm de altura x 2 cm 15 cm de altura x 2 cm
Carvalho et al (1995) estudando a influecircncia de fatores
fiacutesicos no desenvolvimento e crescimento in vitro de
batata-doce (Ipomoea batatas L Poir) verificaram que
10 mL de meio de cultura por frasco com explantes
proporcionaram maior formaccedilatildeo de gemas em relaccedilatildeo
aos volumes de 20 e 30 mL
Sendo assim objetivou-se neste trabalho avaliar
o volume de meio apropriado para a propagaccedilatildeo in vitro
de brotaccedilotildees de curauaacute
As brotaccedilotildees utilizadas como fonte de explante
foram fornecidas pela EMBRAPACPATU situada em
Beleacutem do Paraacute Gemas axilares de curauaacute foram
inoculadas em meio MS completo suplementado com
20 mgL de BAP (6-Benzilaminopurina) Apoacutes 30 dias
estas se desenvolveram e as brotaccedilotildees obtidas foram
transferidas para o meio MS sem regulador de
crescimento por 30 dias
Apoacutes este periacuteodo quatro explantes foram
desfolhados completamente ficando apenas porccedilotildees
basais com aproximadamente 1cm de comprimento que
foram inoculadas em meio de cultura baacutesico MS sem
regulador de crescimento em frasco de 12 cm de altura por
5 cm de diacircmetro (volume interno = 300 mL) com volumes
de 10 15 20 25 30 mL Os explantes foram mantidos em
sala de crescimento a uma temperatura de 26plusmn1degC e
fotoperiacuteodo de 16 horas sob uma Irradiacircncia de foacutetons de
25mmol m-2 s-1
O delineamento experimental foi inteiramente
casualizado (DIC) Cada tratamento continha 19 repeticcedilotildees
PEREIRA F D et al104
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 102-106 2006
(um frasco por repeticcedilatildeo) Aos 30 dias avaliaram-se o
nuacutemero e o comprimento das brotaccedilotildees O programa
utilizado para anaacutelise dos dados foi o software statistica
(SISVAR) tendo sido submetidas agrave anaacutelise de variacircncia
com aplicaccedilatildeo do teste F a 5 de probabilidade
analisando-se as meacutedias por regressatildeo polinomial
O efeito linear foi o mais adequado para explicar
a evoluccedilatildeo da taxa meacutedia de regeneraccedilatildeo do curauaacute Agrave
medida que o volume do meio de cultura aumenta existe
tendecircncia de aumento do nuacutemero de brotos Com 25
mL de meio produziu-se maior nuacutemero de brotos por
frasco (2557) e com 10 mL de meio produziu-se menor
nuacutemero de brotos (1226) O tratamento com 15 mL de
meio produziu 1765 brotos o com 20 mL 1750 e o com
30 mL 2242 (Figura 1) O volume maior de meio
disponibiliza mais nutrientes e diminui tambeacutem a
competiccedilatildeo entre as placircntulas o que explica a tendecircncia
em se obter um maior nuacutemero de brotos agrave medida que
se aumenta a quantidade do meio de cultura Em todos
os tratamentos as brotaccedilotildees obtidas foram vigorosas
com a coloraccedilatildeo verde-escura caracteriacutestica das
plantas matrizes As brotaccedilotildees tinham tambeacutem rigidez
outra caracteriacutestica da espeacutecie o que eacute devido agrave
presenccedila das fibras nas folhas Observou-se maior
concentraccedilatildeo de raiacutezes nas brotaccedilotildees maiores e natildeo
FIGURA 1 ndash Nuacutemero meacutedio de brotos por frasco de curauaacute(Ananas erectifolius) cultivados em diferentes volumesde meio MS completo 10 15 20 25 e 30
foi observada a presenccedila de calos em nenhum dos
tratamentos (Figura 2)
Resultados semelhantes foram obtidos por Reis
Lameira Reis (2004) trabalhando com curauaacute utilizando
volumes de 5 75 10 e 15 mL do meio liacutequido MS suplementados
com 25 mgL-1 de BAP (6-benzilaminopurina) os melhores
resultados sendo com os tratamentos que continham 10 e
15ml produzindo em meacutedia 121 e 154 brotosexplante
respectivamente
Da mesma forma Reis et al(2003) trabalhando com
ipeca (Psychotria ipecacuanha Stokes) em meio MS
acrescido de 15 mg L-1de BAP nos volumes de 10 20 30
e 40 mL obtiveram melhor resultado com os volumes de 30
e 40 mL (7 e 8 brotosfrasco respectivamente)
Quanto ao comprimento dos brotos natildeo houve
diferenccedila significativa Os brotos t iveram um
crescimento meacutedio de 228 cm sendo que no tratamento
com 10 mL de meio foi 257 cm com 15 mL 222 cm
com 20 mL 224 cm com 25 mL 224 cm e o tratamento
com 30 mL 215 cm Embora natildeo se tenham realizado
estudos mais aprofundados uma das hipoacuteteses
sugeridas para explicar tais resultados possivelmente
estaacute relacionada a fatores nutricionais do explante
Segundo Cappelades et al (1991) e Pereira et al (2001)
porccedilotildees basais satildeo mais robustas apresentando maior
quantidade de reservas acumuladas em seus tecidos
o que poderia levar agrave utilizaccedilatildeo dessas reservas pelas
brotaccedilotildees regeneradas para sustentar seu crescimento
Esta seria uma das causas da uniformidade apresentada
no tamanho das brotaccedilotildees em todos os tratamentos
Resultados iguais foram obtidos em estudos feitos por
Rodrigues et al (2005) quando avaliaram comprimento
meacutedio de duas espeacutecies de orquiacutedeas mantidas em meio
de cultura cujos volumes testados eram de 25 50 75 e
100 mL Portanto verifica-se que eacute muito importante
selecionar material com bom estado fisioloacutegico e
tamanho homogecircneo para se obter melhores
resultados na proliferaccedilatildeo das brotaccedilotildees eou na
morfogecircnese
Proliferaccedilatildeo in vitro de brotos de curauaacute 105
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 102-106 2006
FIGURA 2 ndash Brotaccedilotildees de curauaacute (Ananas erectifolius) produzidas in vitro em diferentes volumes de meio MS 1-Repicagem dos brotos 2- 10 mL de meio MS 3- 15 mL de meio MS 4- 20 mL de meio MS 5- 25 mL de meio MS 6- 30mL de meio MS
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
CARVALHO R FAVARETTO N PINTO J E B P Influecircnciade fatores fiacutesicos no desenvolvimento e crescimento in vitrode batata-doce (Ipomea batatas (l) Peir Ciecircncia e PraacuteticaLavras v 19 n 2 p 158-164 abrjun 1995
CAPPELADES M LEMEUR R DEBERGH P Effects ofsucrose on starch acumulation and rate of photosyntesisin Rosa cultured in vitro Plant Cell Tissue and OrganCulture Amsterdam v 25 n 1 p 21-26 Apr 1991
GRATTAPAGLIA D MACHADO M A MicropropagaccedilatildeoIn TORRES A C CALDAS L S (Ed) Cultura de tecidos etransformaccedilatildeo geneacutetica de plantas Brasiacutelia EMBRAPA-SPIEMBRAPA-CNPH 1998 p 183-260
MEDINA J C Plantas fibrosas da flora mundialCampinas Instituto agronocircmico 1959 913 p
MURASHIGE T SKOOG F A Revised medium for rapidgrowth and biossays with tobacco tissue cultures PhysiologiaPlantarum Copenhagen v 15 n 3 p 473-479 1962
PEREIRA F D et al106
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 102-106 2006
NICOLOSO F T ERIG A C Efeito do tipo de segmentonodal e tamanho do recipiente no crescimento de plantasde Pfaffia glomerata in vitro Ciecircncia e AgrotecnologiaLavras v 26 p 1499-1506 dez 2002 Ediccedilatildeo especial
PEREIRA F D BRAGA M F SAacute M E L ALCINO OG COLENGHI I C Influecircncia de BAP e NAA namultiplicaccedilatildeo de abacaxi cv Perolera a partir de brotosestiolados in vitro Bioscience Journal Uberlandia v 17n 2 p 49-60 Dec 2001
REIS Eacute S PINTO J E B P CORREcircA R MPEREIRA F D BERTOLUCCI S K V Influecircncia dosmeios MS e WPM associados a diferentesconcentraccedilotildees de Benzilaminopurina na multiplicaccedilatildeode ipeca (Psychotria ipecacuanha (Brot) Stokes InCONGRESSO BRASILEIRO DE CULTURA DE TECIDOSDE PLANTAS 1 2003 Lavras Anais Lavras UFLA2003 p 273
REIS J N R LAMEIRA O M REIS L R S1Aprimoramento de protocolos de propagaccedilatildeo in vitro de
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ROCHA E C GHELER JUacuteNIOR J Aproveitamento deresiacuteduos gerados na aglomeraccedilatildeo de fibras de coco comLaacutetex natural Mateacuteria Teacutecnica Disponiacutevel em lthttpwwwbiologocombrgt Acesso em jun 2003
RODRIGUES J D ARAUacuteJO A G ASSIS F A ACAVALLARI L L PASQUAL M Crescimento in vitro deplacircntulas de orquiacutedeas quantidade de meio de cultura enuacutemero de explantes In CONGRESSO DE INICIACcedilAtildeOCIENTIacuteFICA DA UFLA ndash CICESAL 18 2005 Lavras MGAnais Lavras UFLA 2005 1CD-ROM
SILVA C Paiacutes pesquisa mais fibras naturais para carrosDisponiacutevel em lthttpwwwsebrae_sccombrn o v o s _ d e s t a q u e s o p o r t u n i d a d e mostra_mateacuteriaaspcd_noticia=8356gt Acesso em out 2004
SCHREIBER V (Org) Vias de desenvolvimentosustentaacutevel as dimensotildees do desafio Beleacutem UFBANUMAPOEMAIDESP 1998 495 p (POEMA 6)
NORMAS PARA PUBLICACcedilAtildeO DE ARTIGOS E COMUNICACcedilOtildeES CIENTIacuteFICAS
1 Os conceitos e afirmaccedilotildees contidos nos artigos e comunicaccedilotildeesseratildeo de inteira responsabilidade do(s) autor(es)
2 A revista ldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquo editadasemestralmente pela Editora da Universidade Federal de Lavras(Editora UFLA) publica artigos cientiacuteficos e comunicaccedilotildeescientiacuteficas da aacuterea de cultura de tecidos de plantas elaboradospor membros da comunidade cientiacutefica nacional e internacionalNatildeo eacute cobrada taxa para publicaccedilatildeo de trabalhos Eacute condiccedilatildeofundamental que os artigoscomunicaccedilotildees submetidos agrave apreciaccedilatildeoda revista ldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquo natildeo forame nem seratildeo publicados simultaneamente em outro lugar Com aaceitaccedilatildeo do artigo para publicaccedilatildeo os editores adquirem amplose exclusivos direitos sobre o artigo para todas as liacutenguas e paiacutesesA publicaccedilatildeo de artigoscomunicaccedilotildees dependeraacute da observacircnciadas Normas Editoriais dos pareceres do Corpo Editorial e daComissatildeo ad hoc Todos os pareceres tecircm caraacuteter sigiloso eimparcial e tanto os autores quanto os membros do CorpoEditorial eou Comissatildeo ad hoc natildeo obtecircm informaccedilotildeesidentificadoras entre si
3 Os artigos e comunicaccedilotildees submetidos para publicaccedilatildeo deveratildeoser apresentados em CD utilizando-se o processador de textoMicrosoft Word for Windows (version 98 2000 XP ou 2003)ser escrito em liacutengua portuguesa inglesa ou espanhola e usarsomente nomenclaturas oficiais e abreviaturas consagradas natildeoempregando abreviaturas no tiacutetulo do artigo Juntamente com oCD deveratildeo ser enviadas 4 (QUATRO) vias sendo uma originale as demais coacutepias omitindo os autores e a chamada de rodapeacute daprimeira paacutegina (para serem enviadas aos consultores cientiacuteficos)impressas em papel branco tipo A4 (21cm x 297cm) ou emformulaacuterio contiacutenuo em uma soacute face espaccedilo duplo entre linhasfonte Times New Roman tamanho 12 observada uma margemde 3 cm para o lado esquerdo e de 2 cm para o direito 25 cm paramargem superior e inferior 25 cm para o cabeccedilalho e 25 cm parao rodapeacute Cada trabalho deveraacute ter no maacuteximo 14 paacuteginas ejunto do mesmo deveraacute ser encaminhado ofiacutecio dirigido ao EditorChefe da revista solicitando a publicaccedilatildeo do artigo Esse ofiacuteciodeveraacute ser assinado por todos os autores constar o endereccedilocompleto telefone e e-mail de todos Qualquer inclusatildeo exclusatildeoou alteraccedilatildeo na ordem dos autores deveraacute ser notificada medianteofiacutecio assinado por todos os autores (inclusive do autor excluiacutedo)
4 O artigo cientiacutefico deveraacute conter os seguintes toacutepicos a)TIacuteTULO suficientemente claro conciso e completo evitandopalavras supeacuterfluas Recomenda-se comeccedilar pelo termo querepresente o aspecto mais importante do trabalho com os demais
termos em ordem decrescente de importacircncia b) TIacuteTULO EMINGLEcircS c) NOME(s) DO(s) AUTOR(es) no maacuteximo 6 (seis)em letras maiuacutesculas um apoacutes o outro centralizados e no rodapeacuteda primeira paacutegina deveratildeo vir a formaccedilatildeo acadecircmica e aInstituiccedilatildeo onde trabalham d) RESUMO (de acordo comNBR6028 da ABNT) O resumo natildeo deve ultrapassar a 250(duzentos e cinquumlenta) palavras e natildeo possuir paraacutegrafos Apoacuteso Resumo devem-se incluir TERMOS PARA INDEXACcedilAtildeO(palavraschave) diferentes daqueles constantes do tiacutetulo eseparados por viacutergula Os termos para indexaccedilatildeo devem estardescritos na forma maiuacutescula e minuacutescula serem expressotildees queidentifiquem o conteuacutedo do artigo ser indicadas entre 3 e 5 e sepossiacutevel extraiacutedas do vocabulaacuterio Thesagro ndash Thesaurus AgriacutecolaNacional desenvolvido pela CENAGRI (indicaccedilatildeo da revistaldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquopara evitar o usode vaacuterios sinocircnimos como termos de indexaccedilatildeo) Se natildeo foremencontrados descritores disponiacuteveis para cobrirem a temaacutetica doartigo poderatildeo ser indicados termos ou expressotildees de usoconhecido e) ABSTRACT incluindo em seguida INDEXTERMS f) INTRODUCcedilAtildeO (incluindo a revisatildeo de literatura)g) MATERIAL E MEacuteTODOS h) RESULTADOS EDISCUSSAtildeO (podendo conter tabelas e figuras) i)CONCLUSOtildeES e j) REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
5 A comunicaccedilatildeo deveraacute conter os seguintes toacutepicos a)TIacuteTULO suficientemente claro conciso e completo evitandopalavras supeacuterfluas Recomenda-se comeccedilar pelo termo querepresente o aspecto mais importante do trabalho com os demaistermos em ordem decrescente de importacircncia Deve serapresentada a versatildeo do tiacutetulo para o idioma inglecircs b) TIacuteTULOEM INGLEcircS c) NOME(s) DO(s) AUTOR(es) no maacuteximo 6(seis) em letras maiuacutesculas um apoacutes o outro centralizados e norodapeacute da primeira paacutegina deveratildeo vir a formaccedilatildeo acadecircmica e aInstituiccedilatildeo onde trabalham d) RESUMO (de acordo comNBR6028 da ABNT) O resumo natildeo deve ultrapassar a 250(duzentos cinquumlenta) palavras e natildeo possuir paraacutegrafos Apoacutes oResumo devem-se incluir TERMOS PARA INDEXACcedilAtildeO(palavras-chave) diferentes daqueles constantes do tiacutetulo eseparados por viacutergula Os termos para indexaccedilatildeo devem estardescritos na forma maiuacutescula e minuacutescula serem expressotildees queidentifiquem o conteuacutedo do artigo ser indicadas entre 3 e 5 e)ABSTRACT incluindo em seguida INDEX TERMS f)TEXTO [sem subdivisatildeo poreacutem com introduccedilatildeo material emeacutetodos resultados e discussatildeo e conclusatildeo subtendidos(podendo conter tabelas ou figuras)] e g) REFEREcircNCIASBIBLIOGRAacuteFICAS
6 AGRADECIMENTOS ao fim do texto e antes das ReferecircnciasBibliograacuteficas poderatildeo vir os agradecimentos a pessoas ouinstituiccedilotildees O estilo tambeacutem aqui deve ser soacutebrio e claroindicando as razotildees pelas quais se fazem os agradecimentos
7 TABELAS E QUADROS deveratildeo ser inseridos apoacutes citaccedilatildeodos mesmos dentro do proacuteprio texto
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS as referecircnciasbibliograacuteficas devem ser citadas conforme a NBR60232002 daABNTA exatidatildeo das referecircncias constantes da listagem e a corretacitaccedilatildeo no texto satildeo de responsabilidade do(s) autor(es) doartigo
Orientaccedilotildees gerais- Deve-se apresentar todos os autores do documento cientiacutefico(fonte)- O nome do perioacutedico deve ser descrito por extenso natildeo deveser abreviado- Em todas as referecircncias deve-se apresentar o local de publicaccedilatildeo(cidade) a ser descrito no lugar adequado para cada tipo dedocumento- As referecircncias devem ser ordenadas alfabeticamente
EXEMPLIFICACcedilAtildeO (TIPOS MAIS COMUNS)
ARTIGO DE PERIOacuteDICO
VIEIRA R F RESENDE M A V de Eacutepocas de plantio deervilha em Patos de Minas Uberaba e Janauacuteba Minas GeraisCiecircncia e Agrotecnologia Lavras v 24 n 1 p 74-80 janmar 2000
LIVRO
a) Livro no todo
STEEL R G D TORRIE J H Principles and procedures ofstatistics New York McGraw-Hill Book l960 481 p
b) Parte de livro com autoria especiacutefica
FLEURY J A Anaacutelise ao niacutevel de empresa dos impactos daautomaccedilatildeo sobre a organizaccedilatildeo da produccedilatildeo de trabalho InSOARES R M S M Gestatildeo da empresa Brasiacutelia IPEAIPLAN 1980 p 149-159
c) Parte de livro sem autoria especiacutefica
MARTIM L C T Nutriccedilatildeo de bovino de corte em confinamentoIn ______ Confinamento de bovino de corte 2 ed Satildeo PauloNobel 1986 cap 3 p 29-89
DISSERTACcedilAtildeO E TESE
GONCcedilALVES R A Preservaccedilatildeo da qualidade tecnoloacutegicade trigo (Triticum aestivum L) e controle de Rhyzoperthadominica (F) durante o armazenamento em atmosferacontrolada com Co2 e N2 1997 52 f Dissertaccedilatildeo (Mestradoem Ciecircncia dos Alimentos) ndash Universidade Federal de LavrasLavras 1997
MATIOLI G P Influecircncia do leite proveniente de vacasmastiacuteticas no rendimento de queijo frescal 2000 55 pDissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncias dos Alimentos) - UniversidadeFederal de Lavras Lavras 2000
Nota ldquoA folha eacute composta de duas paacuteginas anverso e versoAlguns trabalhos como teses e dissertaccedilotildees satildeo impressos apenasno anverso e neste caso indica-se frdquo (ABNT NBR60232002p 18)
TRABALHOS DE CONGRESSO E OUTROS EVENTOS
SILVA J N M Possibilidades de produccedilatildeo sustentada de madeiraem floresta densa de terra firme da Amazocircnia brasileira InCONGRESSO FLORESTAL BRASILEIRO 6 1990 Campos doJordatildeo Anais Campos do Jordatildeo SBSSBEF 1990 p 39-45
DOCUMENTOS ELETROcircNICOS
As obras consultadas online satildeo referenciadas conformenormas especiacuteficas para cada tipo de documento (monografia notodo e em parte trabalho apresentado em evento artigo deperioacutedico artigo de jornal etc) acrescidas de informaccedilotildees sobreo endereccedilo eletrocircnico apresentado entre braquetes (lt gt)precedido da expressatildeo ldquoDisponiacutevel emrdquo e da data de acessoao documento precedida da expressatildeo ldquoAcesso emrdquo
Nota ldquoNatildeo se recomenda referenciar material eletrocircnico de curtaduraccedilatildeo nas redesrdquo (ABNT NBR60232000 p 4) Segundopadrotildees internacionais a divisatildeo de endereccedilo eletrocircnico no fimda linha deve ocorrer sempre apoacutes barra ()
Monografia (acesso online)
a) Livro no todo
TAKAHASHI T (Coord) Tecnologia em foco BrasiacuteliaSocinfoMCT 2000 90 p Disponiacutevel em lthttpwwwsocinfoorgbrgt Acesso em 22 ago 2000
b) parte de livro
TAKAHASHI T Mercado trabalho e oportunidades In ______Sociedade da informaccedilatildeo no Brasil livro verde BrasiacuteliaSocinfoMCT 2000 cap 2 p 13-24 Disponiacutevel em lthttpwwwsocinfogovbrgt Acesso em 22 ago 2000
c) Parte de congresso seminaacuterio etc
GIESBRECHT H O Avaliaccedilatildeo de desempenho de institutos depesquisa tecnoloacutegica a experiecircncia de projeto excelecircncia napesquisa tecnoloacutegica In CONGRESSO ABIPTI 2000Fortaleza Gestatildeo de institutos de pesquisa tecnoloacutegicaFortaleza Nutec 2000 Disponiacutevel em lthttpwwwabiptiorgbrgt Acesso em 01 dez 2000
d) Tese
SILVA E M Arbitrariedade do signo a liacutengua brasileira desinais (LIBRAS) 1997 144 p Dissertaccedilatildeo (Mestrado emLinguumliacutestica Aplicada e Estudo de Liacutengua) - Pontifiacutecia UniversidadeCatoacutelica de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 1997 Disponiacutevel em lthttpwwwterracombrvirtualbooks freebookportdid teseshtmgtAcesso em 28 nov 2000
Artigo de perioacutedico (acesso online)
RESENDE A M G Hipertexto tramas e trilhas de um conceitocontemporacircneo Informaccedilatildeo e Sociedade Recife v 10 n 12000 Seccedilatildeo Educaccedilatildeo Disponiacutevel em lthttpwwwinformaccedilatildeoesociedadeufpbbrgt Acesso em 30 nov 2000
CITACcedilAtildeO PELO SISTEMA ALFABEacuteTICO (AUTOR-DATA)(conforme ABNT NBR105202002)Dois autores - Steel amp Torrie (1960) ou (STEEL amp TORRIE1960)Trecircs ou mais autores - Valle et al (l945) ou (VALLE et al 1945)Obs Quando forem citados dois autores de uma mesma obradeve-se separaacute-los pelo sinal amp (comercial)
9 CASO O ARTIGO CONTENHA FOTOGRAFIASGRAacuteFICOS FIGURAS SIacuteMBOLOS E FOacuteRMULASESSAS DEVERAtildeO OBEDECER AgraveS SEGUINTESNORMAS
91 Fotografias deveratildeo ser apresentadas em preto e branconiacutetidas e com contraste inseridas no texto apoacutes a citaccedilatildeo dasmesmas e tambeacutem em um arquivo agrave parte salvas em extensatildeoldquoTIFFrdquo ou ldquoJPEGrdquo com resoluccedilatildeo de 300 dpi
92 Figuras deveratildeo ser apresentadas em preto e branco niacutetidase com contraste inseridas no texto apoacutes a citaccedilatildeo das mesmas etambeacutem em um arquivo agrave parte salvas em extensatildeo ldquoTIFFrdquo ouldquoJPEGrdquo com resoluccedilatildeo de 300 dpi As figuras deveratildeo serelaboradas com letra Times New Roman tamanho 10 semnegrito sem caixa de textos e agrupadas
93 Graacuteficos deveratildeo ser inseridos apoacutes citaccedilatildeo dos mesmosdentro do proacuteprio texto elaborado preferencialmente em Excelcom letra Times New Roman tamanho 10 sem negrito
94 Siacutembolos e Foacutermulas Quiacutemicas deveratildeo ser feitas emprocessador que possibilite a formataccedilatildeo para o programa PageMaker (ex MathType Equation) sem perda de suas formasoriginais
10 O Editor Chefe notificaraacute o autor do recebimento do originale posteriormente o informaraacute sobre sua publicaccedilatildeo Os artigosque necessitarem de modificaccedilotildees seratildeo devolvidos ao autor paraa devida revisatildeo
11 Os artigos natildeo aprovados seratildeo devolvidos
12 Os artigos seratildeo publicados em ordem de aprovaccedilatildeo
13 O natildeo-cumprimento dessas normas implicaraacute na devoluccedilatildeodo artigo ao autor
14 Os casos omissos seratildeo resolvidos pela Comissatildeo Editorial
15 O artigo deveraacute ser enviado para
ABCTPPlant Cell Culture amp MicropropagationUniversidade Federal de LavrasDepartamento de Biologia - Setor de Fisiologia VegetalCaixa Postal 3037Lavras ndash MGCEP 37200-000E-mail abctpuflabr
INSTRUCTIONS FOR AUTHORS
1 Concepts and affirmations included in articles andcommunications are of the entire responsibility of the authors
2 ldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquo a semestral journaledited by Editora UFLA of the Universidade Federal de Lavraspublishes scientific articles and communications in the area ofplant tissue culture elaborated by researchers of the national andinternational scientific community There are no page charges forpublication Submission of a manuscript implies that it is neitherunder consideration for publication elsewhere nor has appearedpreviously in part or in whole On acceptance for publicationauthors assign to the Editors full copyright of the manuscript inall languages and countries Publications will depend on editorialrules and on the review of experts and ad hoc commissionReviewer and editorial opinions will be anonymouslycommunicated to authors
3 The articles and communication submitted for publicationmust be presented in CD using the program Microsoft Wordfor Windows (version 98 2000 XP or 2003) written inPortuguese English or Spanish using only conventionalnomenclature At the time of submission authors are requiredto submit together with the CD 4 (four) hard copies one originaland three copies without the name(s) of the author(s) as well asthe footnote on the first page (to be used by the reviewers)printed on A4 white paper (21 cm x 297cm) or on continuousform typewritten only on one side double spaced using fontTimes New Roman size 12 with a 3 cm margin on the left handside and 20 cm margin on the right hand side 25 cm upper andlower margin 25 cm for the heading and 25 cm for the footnoteThe manuscript must present a maximum of 14 pages At thetime of submission a cover letter must be sent with themanuscript copies to the Editor requesting publication of thearticle This cover letter must be signed by all authors andalso contain the full address telephone number and e-mail ofthe authors Any inclusion exclusion or alteration in the authorsorder must be notified and signed by all authors including theone excluded
4 Each manuscript must be organized in a) TITLE sufficientlyclear conspicuous and complete without superfluous words Itis recommended to initiate with the term that represent the mostimportant aspect with other terms in decreasing of importanceb) TITLE in Portuguese c) FULL NAME(s) OF THEAUTHOR(s) maximum of 6 (six) in capital letters one after theother in the center of the page with the footnote of the first pagecontaining their professional qualification or academic training
and their work institution d) ABSTRACT written continuouslywithout paragraph It must not exceed 250 words Index termsmust be enclosed after the abstract using terms different fromthose used in the title and separated by comma The index terms(3 to 5) must be described in capital and small letters and expressthe content of the article e) ABSTRACT and INDEX TERMSin Portuguese f) INTRODUCTION (including literaturereview) g) MATERIAL AND METHODS h) RESULTS ANDDISCUSSION (it may include tables and figures) i)CONCLUSIONS and j) REFERENCES
5 Communication must have the following topics a) TITLEsufficiently clear conspicuous and complete without superfluouswords It is recommended to initiate with the term that representthe most important aspect with other terms in decreasing ofimportance The PORTUGUESE version of the title has to bepresented b) TITLE in Portuguese c) FULL NAME(s) OFTHE AUTHOR(s) maximum of 6 (six) in capital letters oneafter the other in the center of the page with the footnote of thefirst page containing their professional qualification or academictraining and their work institution d) ABSTRACT writtencontinuously without paragraph It must not exceed 250 wordsIndex terms must be enclosed after the abstract using termsdifferent from those used in the title and separated by commaThe index terms (3 to 5) must be described in capital and smallletters and express the content of the article e) ABSTRACTand INDEX TERMS in Portuguese f) TEXT (with no divisionbut must include introduction material and methods results anddiscussion and conclusion (it may include tables and figures) andg)REFERENCES
6 ACKNOWLEDGEMENTS Acknowledgements to peopleor institutions might be included at the end of the text priorReferences The written style must be serious and clear indicatingthe reasons of the acknowledgements made
7 TABLES AND FIGURES must be included right after theircitation in the text
8 REFERENCES references must be cited according toNBR60232002 of ABNT All references and their correct citationin the text are of the entire responsibility of the author(s)- Some important orientations all authors of the scientificdocument must be presented (source) the journal must be citedusing its full name all references must present the name of thecity where the journal was published all references must be citedalphabetically
9 PHOTOGRAPHS GRAPHS FIGURES SYMBOLS ORFORMULA CONTAINED IN THE ARTICLE SHOULDOBEY THE FOLLOWING RULES
91 Photographs must be presented in black and whiteclear and with contrast inserted in the text after their citationand also in a separate file (on the same diskette as the article)saved in extension ldquoTIFFrdquo or ldquoJPEGrdquo with resolution of300 dpi
92 Figures must be presented in black and white clear andwith contrast inserted in the text after their citation and also in aseparate file (on the same diskette as the article) saved inextension ldquoTIFFrdquo or ldquoJPEGrdquo with resolution of 300 dpiThey must be elaborated using Times New Roman font size10 without bold without text box and arranged
93 Graphs must be inserted in the text after their citationelaborated preferentially in Excel using Times New Romanfont size 10 without bold
94 Symbols and Chemical Formula must be presented usinga word processor that permits a format for Page Maker (exMathType Equation) without loss of its original form
10 The Brazilian Association of Plant Tissue Culture (ABCTP)will inform the author the receipt of the original manuscript andeventually it will also send information regarding its publicationManuscripts that require modifications will be returned to theauthor for the respective revision andcorrections
11 Manuscripts not approved will be returned to the author
12 Articles will be published according to the order of receiptand approval
13 If any of these rules are not attended the manuscript will bereturned to the author
14 Manuscripts should be sent to the following address
ABCTPPlant Cell Culture amp MicropropagationUniversidade Federal de LavrasDepartamento de Biologia - Setor de Fisiologia VegetalCaixa Postal 3037Lavras ndash MGCEP 37200-000BrazilE-mail abctpuflabr
SILVA S da et al54
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
leaf also contains polyphenolic compounds
hydroxycinnamic derivatives with verbascoside (53)
flavonoids such as luteolin 7-glucoside and luteolin 7-
diglucuronide (08) These compounds probably
intervene in the antispasmodic activity Iridoid glucosides
were also reported and the infusion contains potassium
(CARNAT et al 1999)
Cultivation of medicinal plants for the purpose of
extraction of active constituents may face certain limitations
such as climate season water availability diseases and
pests and scarcity of naturally growing plants Such
limitations led to the use of tissue culture techniques for
production of the active constituents Tissue culture
provides means of rapid propagation of a large number of
uniform plants while maintaining their genotype Beneficial
uses of tissue culture for the purpose of extraction of
secondary metabolites include avoidance of collection of
endangered wild species production of secondary
metabolites due to rapid growth of cultures in vitro
(ARIKAT et al 2004)
Due to the importance of this plant for multiple
purposes and the difficulty to produce active compounds
in vitro the application of methods that provide higher
number of cloned plants of M officinalis is justified aiming
to select high quality plant lines to extensive culture and
extraction of pharmaceutical products In Brazil M
officinalis is used in phytomedicine by pharmaceutical
industries One of the most critical problems of
phytomedicine is the natural variation of plants chemical
constituents (CURRIER et al 2000) This variation could
be originated from genetical factors or under influence of
environmental characteristics
The use of in vitro systems have been reported as
an effective tool for obtaining genetically uniform plants
which can be the source for less variable pharmaceutical
preparations Plant regeneration of M officinalis has been
achieved using as explants cotyledonary nodes of 10-day-
old Melissa officinalis seedlings (TAVARES et al 1996)
shoot tips from plants cultivated at greenhouse
(MEacuteSZAacuteROS et al 1999) using various types and
concentrations of cytokinins auxins and triacontanol
(TANTOS et al 1999)
The aim of this work is to develop a
micropropagation method in order to obtain a significant
number of monoclonal plants for further field cultivation
comparing the essential oil content and composition
between micropropagated and field-grown plants
MATERIALS AND METHODS
Plant material
Representative specimens from field grown plants
of M officinalis were selected and submitted to Erika Von
Sohsten Medeiros and Angela Vaz (Rio de Janeiro
Botanical Garden) for the taxonomic confirmation A
voucher nordm RB ndash 365926 is deposited at the Herbarium of
Rio de Janeiro Botanic Garden
Melissa officinalis seeds were obtained from
commercial market ISLAR batch Nordm 8250 The seeds were
germinated and grown to the seedling stage in vitro Seeds
were pre-treated by immersion into 2 commercial bleach
solution (Globoacirc) for 20 min and then rinsed thoroughly
in running tap water After that the seeds were surface
sterilized in 70 ethanol for 20 min followed by 15 min in a
20 commercial bleach solution containing 2-3 drops of
Tween 20 under aseptic conditions and rinsed three times
with sterile distilled water The seeds were cultured on MS
(MURASHIGE amp SKOOG 1962) solid medium
supplemented with 30 gL-1 sucrose 148 mM thiamine-
HCl 243 mM pyridoxine-HCl 41 mM nicotinic acid and
06 mM myo-inositol The pH value was adjusted at 58 plusmn
01 before addition of 8 gL-1 of agar and the media were
sterilized in autoclave (120 degC during 15 min) The cultures
were incubed at 25 plusmn 1 degC under a 16 h light 8 h dark
regime at an irradiance of 230 mmolm-sup2s-1 (white light
illumination Sylvaniaacirc fluorescent tubes)
Establishment of in vitro shoot cultures
From in vitro 8-day-old germinated seeds plants
(20-30 cm in length) of three different clones designated
In vitro propagation of Melissa officinalis L and production 55
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
as clones 1 2 e 3 were selected and axillary shoot induction
takes place from nodal segments (1 cm in length)
subcultivated on MS hormone-free media (MS0) These
materials were used as donors of explants to be tested
with different culture media 05mM a-naphthaleneacetic
acid (NAA) 05mM kinetin (KIN) 05mM benzyladenine
(BA) 28 mM gibberellic acid (GA3) and 05mM indole-3-
acetic acid (IAA) Cultures were grown in 300 mL glass
flasks containing 40 ml of media each
Shoot proliferation rate length of both shoots and
roots and calli formation were monitored as growth
parameters Each treatment was replicated 3 times using
100 explants per repetition Subcultures were performed at
30 days intervals
Acclimatization
A total of 60 in vitro rooted microshoots (those grown
on MS + IAA during 30 days with average height of 10 cm
were removed from the medium and the agar washed gently
with tap water They were transferred to 60 cm diameter
plastic pots containing soil and humus (31 vv) and kept at
a greenhouse High humidity environment was provide by
covering the plants with a plastic foil and watering them
one time per day during the first 2 weeks Then plants were
gradually exposed to greenhouse conditions for 1 month
and finally transferred to the field where they were cultivated
during one year until complete life cycle
Extraction
Field-grown and fresh in vitro plantlets aerial parts
(100 g each) were submitted to hydro distillation for 140 h
in a Clevenger type apparatus as recommended by the
Brazilian Pharmacopoeia (1988) in replicate (n = 2) The
time between the isolation and analysis was the same in all
experiments to preclude differences in composition due to
external factors (SILVA et al 2003)
Gas chromatographic and gas chromatography-massspectrometric analysis
Gas chromatography with flame ionization
detection (GCFID) was carried out on a Varian Star Model
3350 instrument using a capillary column coated with DB-
5 (30 m x 025 mm i d 025 mm film thickness J amp W
Scientific Folsom CA USA) The GC oven was heated
using the following program 40 oC to 220 oC at 4 oC min-1
with an initial isothermal period of 1 min splitless The
detector and injector temperatures were held at 280 oC
Hydrogen was used as carrier gas The injection consisted
of 10 microL of distilled oil diluted with hexane The GCMS
analyses were carried out on a Hewlett-Packard (Agilent
Technologies Avondale USA) Model 5972 MSD coupled
to a HP 5890 GC The GC conditions were the same as
above except for the fact that helium was used as carrier
gas The mass spectrometer was operated on electron
impact mode at 70 eV Molecular assignments were
performed with the help of the Wiley 275 standard library
of mass spectra literature data (ADAMS 1995) authentic
geraniol standard (Sigma Part Number G5135) and mass
spectra interpretation besides the comparison with
previously published elution order (KREIS amp MOSAND
1994) Quantification was performed from GC profiles using
area percent since in the literature the FID response factor
for most of monoterpenes is determined as 1 (CARNAT et
al 1999)
Statistical analysis
Data for each experiment were subjected to analysis
of variance (ANOVA) and means were compared using the
Tukey-Kramer test Percent data were submitted to
significance test ndash difference between two percentages
using the Statistica for WindowsTM 50 version A
significance level of 5 was used for all statistical analysis
RESULTS AND DISCUSSION
In vitro multiplication of Melissa officinalis was
followed during four developing cycles Micropropagation
papers usually present an efficient protocol evaluated in
only one developing cycle This kind of protocol however
may fail when the cultures have to be kept during long
time many successive subcultures being necessary in
order to produce large number of clonal plants
SILVA S da et al56
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
In vitro establishment
In this work three different clones of M officinalis
were used and they had shown similar development
responses on in vitro cultures
The clones 1 and 2 had in vitro multiplication rate
lower than the clone 3 which means a decrease in the
absolute number of nodal segments (Fig 1A and B) From
these results the clone 3 was selected to run the tests
The average number of four new nodes was
produced by explant on MS0 after 30 days and this value
was used as a control to evaluate effects of the presence
of growth regulators in the media (Tab 1)
FIGURE 1 ndash Nodal segments development of three clones of Melissa officinalis on MS+ 05 M IAA during 30 daysA) Multiplication rate of in vitro culture from 2nd to 4th subcultures B) Number of nodal segments developed per clone
TABLE 1 ndash Effect of growth regulators in Melissa officinalis axillary segments culture after four weeks of culture
Culture Media
Shoot Explant
xplusmnse
Shoot Length (CM)
Multiplication Rate (ndeg of
Nodal Segment Explant)
Node Plantlet
xplusmnse
Root Frequency
()
Root Number
Explant xplusmnse
Root Length
(CM) xplusmnse
MS0 171B 403 08B 68C 41 B 50 105 11B 30 06B
05 M KIN 111C 349 11C 33D 31 C 50 073 09C 27 07C
28 M GA3 111C 100 03D 22E 21 D 50 071 09C 25 07C
05 M IAA 191B 1000 09A 95B 51 A 100 897 08A 137 08A
05 M NAA
301A 333 16C 90A 31 C 0 0 - 05 M BA 111C 385 54C 33D 31 C 0 0 -
Value are means (x) plusmn standard error (se) n=100 Values in the same column followed by the same letter do not differstatistically at Pdrdquo005
The influence of plant growth regulators and their
interactions on micropropagation of different plant species
have been discussed in detail by Lameira et al (2005) Rout
et al (1989) Rout amp Das (1997ab) Skirvin et al (1990) and
Zieslin et al (1989)
In this work addition of IAA to MS presented the
best results among all tested growth regulators in all
evaluated parameters However to shoot production there
is no statistical difference to the control The analysis of
effects of the other growth regulators shows that only
05mM NAA was able to improve shoot production
although it is not able to promote rhizogenesis
In vitro propagation of Melissa officinalis L and production 57
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
The use of MS plus 05mM Kinetin or 05mM BA
or 05mM NAA promoted the development of three nodal
segments per elongated plant in 30 days culture (Tab
1) However when BA was used these new shoots
exhibited apical necrosis When GA3 (28 mM) was added
to medium there was induction of only one shoot per
explant and after 30 days there were 2 nodes per
elongated shoot
There was no rooting in explants placed on MS
added of NAA and BA In MS medium containing KIN or
GA3
and in basic MS 50 of the shoots developed new
roots in 30 days of culture
The best result of rhizogenesis was presented
by explants cultured in MS plus IAA where 100 of
shoots rooted with more than 8 new roots per explant
(Tab 1) In terms of root length the cultures in MS
supplemented with IAA presented longer roots when
compared with the other media compositions used at
the present work
In short the addition of 05mM of IAA was chosen
as that presenting the best results in all evaluated
parameters (Fig 2A)
The action of IAA on the in vitro plant
development was in accordance to the known effects of
such hormone (CLELAND 1995) Shoot elongation was
obtained concomitantly with rooting in media MS plus
05 mM IAA That is specially interesting once it may
reduce the micropropagation process through nodal
segments explants to only three steps germination
shoot elongation and multiplication concomitant to
rooting this represents gain of time culture medium
and constitutes a quick micropropagation process
Tavares et al (1996) reported a micropropagation
utilizing cotyledonary nodes as explants The highest
average number of shoots in the two inoculations was
obtained with 2 mgL-1 of BA 24 axillary shoots per
explant 7 in the first inoculation and 17 in the second
one Shoots of the two inoculations were excised after
30 and 60 days respectively
Acclimatization
Melissa officinalis leaves are very sensitive to
water loss and this process is irreversible it was necessary
to provide a high humidity environment during the first
acclimatization period plants were covered with a plastic
foil during 2 weeks before being gradually exposed to
greenhouse conditions The acclimatization procedure
used for in vitro plants was successful and a total of 100
survival rate (n=60) was obtained Acclimatized plants
appeared normal and did not exhibit any morphological
abnormalities or variations These results permitted the
soil cultivation (Fig 2B) without chemical defensives
during one year up to the complete vegetative cycle
(flowering)
Essential oils content
Comparative analysis of the chromatographic
profiles showed high percentage of neral and geranial in
relation to nerol and geraniol in field grown (ex vitro)
plantlets and in MS0 (in vitro)
The relative content of the principal components
of essential oil of the aerial parts of M officinalis are
presented as mean peaks area () on Fig 2C geranial
(3813 and 4364) neral (2674 and 317) geraniol (329 and
153) and nerol (116 and 187) in plants cultured ex vitro
and in vitro respectively Plantlets developed in vitro on
MS0 media showed an increase of 14 times in the
proportion of nerol and 41 times of geraniol when
compared with ex vitro cultured plants
Field plants are exposed to considerable more
stressful conditions such as lower relative humidity higher
light levels and herbivory those are the more stressful
The latter conditions tend to favor a greater essential oil
accumulation (TAVARES et al 2004) On other hand
plantlets grown in vitro have been continuously exposed
to a unique microenvironment that has been selected to
provide minimal stress and nearly optimal conditions for
plant multiplication
SILVA S da et al58
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
FIGURE 2 ndash A) In vitro culture of Melissa officinalis on MS + IAA in 30 days of culture B) Ex vitro culture six monthsafter transference to soil maximum height 60 cm C) Composition and percentage of the most abundant essential oilcomponents of Melissa officinalis from aerial parts (100 g Fresh Weight) from in vitro e ex vitro culture
In vitro propagation of Melissa officinalis L and production 59
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
CONCLUSIONS
Melissa officinalis micropropagation can be made
using nodal segments from in vitro plants during 5 weeks
in MS media without growth regulators and posterior
subculture in MS media with 05 mM IAA for a better
development Multiplication rates of 44 and 40 were
obtained at the 3rd and 4th subcultures respectively
It was observed a significant difference between
the effects of auxins IAA and NAA The latter exerted an
unsatisfactory influence on the nodal segment formation
shoot length and rooting when compared with the results
obtained with IAA
The plants produced in vitro were vigorous and
after acclimatization they were well adapted After 1 month
at the greenhouse the survival rate was 100
Considering that the main objective of this work is
to produce monoclonal plants to be used by phytomedicine
industries it is important that the method presents a large
number of buds per explant This result plus an efficient
acclimatization stage can save time and produce
monoclonal plants in sufficient number to be used in
commercial field culture Our results showed a change in
the essential oil composition in the proportion of active
compounds However the characteristics of the oil of in
vitro and ex vitro M officinalis plants were not altered
The manipulation of the culture media composition
is an important biotechnological tool for the optimization
of the essential oils production With this technique this
work developed a protocol for highly production of plants
and productivity in the components (geraniol geranial and
neral) of the oil
ACKNOWLEDGMENTS
This work was supported by ICUNIRIO FAPERJ
and CNPq
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Crescimento in vitro de Laelia tenebrosa (Orchidaceae) 61
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
CRESCIMENTO IN VITRO DE Laelia tenebrosa (ORCHIDACEAE)EM DIFERENTES CONCENTRACcedilOtildeES DE SAIS DE KNUDSON C
E CARVAtildeO ATIVADO
IN VITRO GROWTH OF Laelia tenebrosa (ORCHIDACEAE) IN DIFFERENTCONCENTRATIONS OF KNUDSON C SALTS AND ACTIVATED CHARCOAL
APARECIDA GOMES DE ARAUJO1 MOACIR PASQUAL2 ALBA REGINA PEREIRA3HERMINIO SOUZA ROCHA4
1Doutoranda em AgronomiaFitotecnia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash agaraujo2003yahoocombr2Dr Professor Titular do Departamento de Agricultura ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash LavrasMG ndash mpasqualuflabr3Doutoranda no Jardim Botacircnico do Rio de Janeiro ndash ENBTJBRJ ndash Pacheco Leatildeo 915 ndash 22460-030 ndash Rio de Janeiro RJ4Doutorando em AgronomiaFitopatologia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash herminiouflanetcombr
RESUMOObjetivou-se testar diferentes concentraccedilotildees de carvatildeo
ativado adicionado ao meio Knudson C no crescimento in vitrode orquiacutedeas Placircntulas de Laelia tenebrosa (LA Rolfe) LARolfe com 1 a 15 cm de comprimento e contendo raiacutezes foraminoculadas em frascos contendo 40 mL de meio de cultura Ostratamentos consistiram na combinaccedilatildeo de concentraccedilotildees de carvatildeoativado (0 05 10 20 e 40 g L-1) e sais minerais de Knudson C(0 50 100 150 e 200) acrescidos de sacarose (20 g L-1) Omeio foi solidificado com 6 g L-1de aacutegar e o pH ajustado para58plusmn01 antes da autoclavagem a 121degC e 11 atm por 20 minutosApoacutes a inoculaccedilatildeo os frascos foram mantidos sob 25 plusmn 1degCfotoperiacuteodo de 16 horas e 32 mM m-2 s-1 de irradiacircncia Apoacutes 150dias verificou-se que a adiccedilatildeo de 2g L-1 de carvatildeo ativado ao meiocom metade dos sais de Knudson C promoveu melhor crescimentoin vitro das placircntulas de Laelia tenebrosa
Termos para indexaccedilatildeo Orquiacutedea meio de cultura cultura detecidos
ABSTRACTThe objective of this work was to test the effect of
Knudson C medium supplemented with different concentrationsof activated charcoal on the in vitro growth of orchids Plantletsof the Laelia tenebrosa (LA Rolfe) LA Rolfe measuring 1-15cm in length containing roots were inoculated in flasks containing40 mL of culture medium The treatments consisted of differentconcentrations of activated charcoal (0 05 10 20 and 40 g L-
1) combined with Knudson C salts (0 50 100 150 and 200)supplemented with sucrose (20 g L-1) The medium was solidifiedwith agar (6 g L-1) and pH adjusted to 58plusmn01 before autoclavingat 121ordmC and 11 atm during 20 minutes After inoculation theexplants were transferred to culture rooms with temperaturemaintained at 25plusmn1ordmC during a 16 hours photoperiod with a lightintensity of 32 microM m-2s-1 The best in vitro growth rates of
Laelia tenebrosa plantlets were obtained using Knudson C 50supplemented with 2 g L-1 activated charcoal after 150 days ofculture
Index terms Orchid culture medium tissue culture
INTRODUCcedilAtildeO
A produccedilatildeo de orquiacutedeas a partir germinaccedilatildeo
assimbioacutetica eacute uma alternativa viaacutevel para obtenccedilatildeo de
grande nuacutemero de plantas em curto espaccedilo de tempo
suprindo assim a necessidade dos produtores de
orquiacutedeas na aquisiccedilatildeo de mudas
Na cultura de tecidos os meios de cultura
geralmente satildeo compostos de uma fonte de carboidratos
macro e micronutrientes e outras substacircncias como
vitaminas aminoaacutecidos accediluacutecares agente solidificante
reguladores de crescimento (GEORGE amp SHERRINGTON
1984) e eventualmente aditivos como antibioacuteticos carvatildeo
ativado e componentes complexos
Knudson (1922) observou que era possiacutevel o
cultivo de sementes em meio artificial contendo minerais e
accediluacutecar sem a presenccedila de fungos micorriacutezicos
Posteriormente em 1946 ele aperfeiccediloou esse meio de
cultura sendo atualmente o mais utilizado comercialmente
na germinaccedilatildeo e desenvolvimento de orquiacutedeas (ARDITTI
amp ERNST 1992) No entanto satildeo necessaacuterios estudos
(Recebido em 23 de fevereiro de 2006 e aprovado em 10 de julho de 2006)
supplemented with
ARAUJO A G de et al62
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
pois satildeo descritos vaacuterios meios de cultura para muitos
gecircneros e espeacutecies diferentes
No cultivo e subcultivo de placircntulas do gecircnero
Cattleya George et al (1987) sugerem o meio Knudson C
(1946) ou Reinert amp Mohr (1967) Segundo Arditti amp Ernst
(1992) os meios de propagaccedilatildeo para Cattleya Laelia
Laeliocattleya e Brassocattleya podem ser os mesmos
citados anteriormente Villalobos et al (1994) sugerem o
meio Vacin amp Went (1949) para Cattleya Encyclia e
Oncidium suplementado com 25 de aacutegua de coco e o
meio Knudson C suplementado com 60 g L-1 de polpa de
banana para orquiacutedeas do gecircnero Stanhopea
O carvatildeo ativado normalmente eacute adicionado ao meio
de cultura em concentraccedilotildees que variam de 02 a 3
(BEYL 2000) O seu efeito natildeo-seletivo pode proporcionar
resultados negativos na micropropagaccedilatildeo Pesquisas
relatam a adsorccedilatildeo de tiamina aacutecido nicotiacutenico
(WEATHERHEAD et al 1978) piridoxina aacutecido foacutelico
reguladores de crescimento e quelatos de ferro
(JOHANSSON et al 1990) Entre os efeitos proporcionados
pela adiccedilatildeo do carvatildeo ativado ao meio de cultura
principalmente agrave organogecircnese e agrave embriogecircnese estatildeo
escurecimento do meio de cultura favorecendo o
enraizamento adsorccedilatildeo de substacircncias inibitoacuterias
produzidas pelo proacuteprio meio ou explante adsorccedilatildeo de
reguladores de crescimento e outros compostos orgacircnicos
e liberaccedilatildeo de substacircncias naturalmente presentes no
carvatildeo que beneficiariam o crescimento in vitro das culturas
(PAN amp STADEN 1998)
Arena amp Pastur (2001) citam que a adiccedilatildeo de carvatildeo
ativado ao meio de cultura promoveu alongamento das
brotaccedilotildees de Berberis buxifolia mas reduziu o iacutendice de
multiplicaccedilatildeo Hazra et al (2002) relataram o efeito
sinergiacutestico do carvatildeo ativado na multiplicaccedilatildeo e
enraizamento de brotaccedilotildees de algodoeiro Amin amp Jaiswal
(1987) Anderson (1980) e Damiano (1978) relataram o efeito
favoraacutevel do carvatildeo quando utilizado em baixas
concentraccedilotildees no enraizamento de brotaccedilotildees de
morangueiro framboeseira e goiabeira respectivamente
A diversidade de resultados obtidos com a utilizaccedilatildeo de
carvatildeo ativado deve-se principalmente ao genoacutetipo da
espeacutecie em questatildeo agrave adsorccedilatildeo de algumas substacircncias
quiacutemicas e compostos orgacircnicos aleacutem de metaboacutelitos
toacutexicos liberados no cultivo in vitro (Wang amp Huang 1976)
Este trabalho teve como objetivo verificar efeito de
diferentes concentraccedilotildees de sais de Knudson C e carvatildeo
ativado sobre o crescimento in vitro de placircntulas de
orquiacutedea da espeacutecie Laelia tenebrosa (LA Rolfe) LA Rolfe
MATERIAL E MEacuteTODOS
Placircntulas da espeacutecie Laelia tenebrosa com 1 a 15
cm de comprimento oriundas de sementes germinadas in
vitro e contendo raiacutezes foram inoculadas em frascos
contendo 40 mL do meio de cultura Knudson C nas
concentraccedilotildees de 0 (apenas aacutegua destilada e aacutegar) 50 100
(concentraccedilatildeo da formulaccedilatildeo original) 150 e 200 de sais
minerais combinado com carvatildeo ativado (0 05 1 2 e 4
mg L-1) suplementado com sacarose (20 g L-1)
O pH do meio foi ajustado para 58 plusmn 01 antes da
adiccedilatildeo de aacutegar (6 g L-1) O meio foi vertido em frascos de
vidro com capacidade para 250 cm3 vedados com tampas
plaacutesticas transluacutecidas natildeo perfuradas e autoclavados agrave
pressatildeo de 11 atm e agrave temperatura do 121degC durante 20
minutos Apoacutes a inoculaccedilatildeo os frascos contendo os
explantes foram mantidos em sala de crescimento com
irradiacircncia em torno de 32 mmol m-2 s-1 temperatura de 25 plusmn
1degC e fotoperiacuteodo de 16 horas
O delineamento experimental utilizado foi
inteiramente casualizado em esquema fatorial 5 x 5 com
quatro repeticcedilotildees de cinco placircntulas cada uma Decorridos
150 dias avaliou-se a meacutedia do nuacutemero de folhas nuacutemero
de raiacutezes comprimento da maior raiz comprimento da parte
aeacuterea e massa fresca de placircntulas Os dados foram
comparados por meio de regressatildeo polinomial empregando-
se o programa Sisvar (FERREIRA 2000)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Apenas para a variaacutevel nuacutemero de folhas houve
interaccedilatildeo entre os niacuteveis de sais e carvatildeo ativado Poreacutem
Crescimento in vitro de Laelia tenebrosa (Orchidaceae) 63
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
por meio do teste F somente as concentraccedilotildees de 50 e
100 de sais do meio Knudson C foram significativas em
relaccedilatildeo agraves concentraccedilotildees de carvatildeo ativado
Os melhores resultados (65 e 585) foram
verificados com 50 (metade) dos sais de Knudson C
combinado com 275 g L-1 de carvatildeo ativado e 100 de
sais com 4 g L-1 de carvatildeo respectivamente (Figura 1)
Com o aumento da concentraccedilatildeo do meio de cultura haacute
necessidade de maior concentraccedilatildeo de carvatildeo Sendo
assim o meio com 50 de sais aleacutem de proporcionar
melhores resultados eacute menos oneroso
Estes resultados contradizem os de Silva et al
(2003) que verificaram que a adiccedilatildeo de carvatildeo ativado ao
FIGURA 1 ndash Nuacutemero de folhas em placircntulas de Laeliatenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees de saisde Knudson C e carvatildeo ativado
meio de cultura inibe a formaccedilatildeo de folhas em placircntulas de
Brassocattleya lsquoPastoralrsquo x Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo
O efeito natildeo seletivo do carvatildeo ativado pode proporcionar
resultados negativos na micropropagaccedilatildeo (PAN amp
STADEN 1998)
Agrave medida em que aumentaram as concentraccedilotildees de
sais de Knudson C maiores quantidades de raiacutezes foram
formadas (Figura 2A) Observou-se maior nuacutemero de raiz
(43) com 965 de sais Para o fator carvatildeo ativado as
melhores respostas (395 raiacutezes) foram verificadas com a
utilizaccedilatildeo de 304 g L-1 adicionadas ao meio de cultura
(Figura 2B)
Para muitas espeacutecies o enraizamento eacute favorecido
pela adiccedilatildeo de carvatildeo ativado ao meio de cultura Hazra et
al (2002) relataram o efeito sinergiacutestico do carvatildeo ativado
na multiplicaccedilatildeo e enraizamento de brotaccedilotildees de
algodoeiro O meio MS com metade dos sais minerais
acrescido de 20 g L-1 de sacarose 7 g L-1 de aacutegar e 1 g L-1 de
carvatildeo ativado promoveu maior quantidade de raiacutezes em
placircntulas de Cattleya nobilior Rchb f (REIS et al 2003)
Segundo Paiva et al (2005) aleacutem de um equiliacutebrio
hormonal favoraacutevel agrave formaccedilatildeo de raiacutezes outros fatores
internos tecircm sido relacionados com a iniciaccedilatildeo do processo
de enraizamento como presenccedila de sacarose alta relaccedilatildeo
CN e nutrientes minerais (foacutesforo caacutelcio zinco e boro) O
meio Knudson C natildeo possui micronutrientes apresenta
uma concentraccedilatildeo maior de caacutelcio e tem baixas
FIGURA 2 ndash Nuacutemero de raiacutezes em placircntulas de Laelia tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees de sais deKnudson C (A) e concentraccedilotildees de carvatildeo ativado (B)
ARAUJO A G de et al64
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
concentraccedilotildees de N e K em relaccedilatildeo ao MS e WPM o que
provavelmente favoreceu tanto o nuacutemero quanto o
comprimento de raiacutezes (PASQUAL 2001)
O maior comprimento de raiz (331 cm) foi verificado
com a utilizaccedilatildeo de 100 de sais de Knudson C A partir do
ponto maacuteximo (100) houve diminuiccedilatildeo do comprimento
radicular provavelmente devido ao desbalanccedilo nutricional
(Figura 3A) Com o aumento das concentraccedilotildees de carvatildeo
ativado houve um incremento linear no comprimento de
raiacutezes Melhores resultados foram observados com a
utilizaccedilatildeo de 4 g Lndash1 de carvatildeo ativado (Figura 3B) Como a
relaccedilatildeo foi direta pode-se inferir que o efeito estimulante
do carvatildeo ativado no comprimento da maior raiz continuaria
para concentraccedilotildees superiores a 4 g L-1
A adiccedilatildeo de carvatildeo ativado no meio de cultura foi
beneacutefica promovendo tanto o nuacutemero quanto o
crescimento de raiacutezes O carvatildeo conteacutem impurezas que
podem favorecer o crescimento de raiacutezes jaacute existentes e
induzir emissatildeo de novas raiacutezes (PASQUAL 2001)
Melhores resultados para comprimento da parte
aeacuterea (18 cm) foram observados quando se utilizou o
meio Knudson C na concentraccedilatildeo de 121 de sais (Figura
4A) poreacutem na concentraccedilatildeo de 50 obtiveram-se
explantes com 17 cm de comprimento Essa diferenccedila
observada (01 cm) eacute muito pequena o que natildeo justifica a
utilizaccedilatildeo de um meio mais concentrado mas a reduccedilatildeo
do mesmo agrave sua metade
O enraizamento in vitro pode ser favorecido com o
uso de meio de cultura com a metade ou 75 da
concentraccedilatildeo normal de sais Em algumas espeacutecies altas
concentraccedilotildees de sais principalmente a presenccedila de iacuteons
amocircnio favorecem o desenvolvimento de raiacutezes enquanto
que em outras podem ser inibidoras (PASQUAL et al
2001)
O maior comprimento da parte aeacuterea (19 cm) foi
obtido na presenccedila de 4 g Lndash1 de carvatildeo ativado (Figura
4B) a concentraccedilatildeo de 2 g Lndash1 proporcionou um
comprimento de 18 cm Comparando-se os niacuteveis 4 e 2 g Lndash1
de carvatildeo ativado nota-se pequena diferenccedila (01 cm) o
que justifica a utilizaccedilatildeo de 2 g Lndash1
O carvatildeo ativado conteacutem impurezas que quando
liberadas no meio de cultura podem beneficiar ou natildeo o
crescimento in vitro Simotildees et al (1999) verificaram que a
concentraccedilatildeo de 1 g L-1 de carvatildeo ativado acrescida ao
meio Knudson C proporciona o melhor desenvolvimento
de brotos de Epidendrum sp e Dendrobium sp
Maior massa fresca de placircntulas (0144g) foi
verificada com a utilizaccedilatildeo de 50 de sais de Knudson C
ponto a partir do qual houve diminuiccedilatildeo no peso (Figura
5A) Provavelmente essa reduccedilatildeo ocorreu devido agrave
toxidez
A utilizaccedilatildeo de 4 g L-1 de carvatildeo ativado
proporcionou uma massa de 0185 g nas placircntulas frescas
(Figura 5B)
FIGURA 3 ndash Comprimento da maior raiz em placircntulas de Laelia tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees desais de Knudson C (A) e carvatildeo ativado (B)
Crescimento in vitro de Laelia tenebrosa (Orchidaceae) 65
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FIGURA 4 ndash Comprimento da parte aeacuterea em placircntulas de Laelia tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees desais de Knudson C (A) e carvatildeo ativado (B)
FIGURA 5 ndash Massa fresca de placircntulas de L tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees de sais de Knudson C(A) e carvatildeo ativado (B)
O carvatildeo ativado eacute comumente utilizado na cultura
de tecidos de plantas Seu efeito eacute atribuiacutedo agrave adsorccedilatildeo de
substacircncias toacutexicas produzidas pelas plantas adsorccedilatildeo
de fitorreguladores do meio e escurecimento do meio onde
se desenvolvem as raiacutezes das plantas (GEORGE 1993)
O melhor desenvolvimento de Phalaenopsis in
vitro ocorreu na presenccedila de carvatildeo ativado na
concentraccedilatildeo de 2 g L-1 indicando que este possa ser um
elemento importante no processo (BRESSAN et al 1999)
Apesar do carvatildeo ativado na concentraccedilatildeo de 4 g
L-1 ter proporcionado melhores resultados verificou-se que
na concentraccedilatildeo de 2 g L-1 os efeitos apresentam uma
diferenccedila miacutenima Embora o carvatildeo ativado natildeo seja o
componente de maior custo no preparo de meio de cultura
a sua reduccedilatildeo juntamente com os sais minerais eacute
economicamente favoraacutevel especialmente para a produccedilatildeo
comercial de mudas
CONCLUSAtildeO
A adiccedilatildeo de 2 g L-1 de carvatildeo ativado ao meio de
cultura Knudson C com metade (50) de sais minerais
promoveu melhor crescimento em placircntulas de Laelia
tenebrosa cultivadas in vitro
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PROPAGACcedilAtildeO IN VITRO DE PLAcircNTULAS DE ORQUIacuteDEA EMDIFERENTES MEIOS DE CULTURA E CONCENTRACcedilOtildeES
DE CITOCININA
IN VITRO PROPAGATION OF ORCHID PLANTLETS CULTIVATED IN DIFFERENTCULTURE MEDIA AND CYTOKININ CONCENTRATIONS
APARECIDA GOMES DE ARAUJO1 MOACIR PASQUAL2 ADRIANO BORTOLOTTI DA SILVA3 FABIacuteOLA VILLA3 HERMIacuteNIO SOUZA ROCHA3 FERNANDA CARVALHO COSTA4
1Doutoranda em AgronomiaFitotecnia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash agaraujo2003yahoocombr2Professor Titular Departamento AgriculturaDAG ndash Universidade Federal de Lavras UFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200000 ndash Lavras MG ndash mpasqualuflabr3Doutorando em Agronomia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200000 ndash Lavras MG4Departamento de AgriculturaDAG ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash fecostapuryahoocombr
RESUMOA taxa de multiplicaccedilatildeo de orquiacutedeas a partir de meacutetodos
convencionais eacute bastante baixa natildeo atendendo as necessidadescomerciais A cultura de tecidos permite maiores taxas demultiplicaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de plantas uniformes e sadiasObjetivou-se estudar a influecircncia da citocinina BAP (6-benzilaminopurina) em diferentes meios de cultura napropagaccedilatildeo in vitro de placircntulas hiacutebridas de BrassocattleyalsquoPastoralrsquox Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo Placircntulas comaproximadamente 15plusmn05 cm de comprimento obtidasassimbioticamente foram transferidas para frascos comcapacidade de 250 cm3 contendo 40 mL das formulaccedilotildees salinasde MS WPM e Knudson C combinados com 0 05 10 20 e40 mg L-1 de BAP acrescidos de 2 g L-1 de carvatildeo ativadosolidificado com 6 g L-1 de aacutegar e pH ajustado para 58plusmn01Apoacutes a inoculaccedilatildeo os frascos foram incubados a 25plusmn2oC 35igravemolm-2s-1 de intensidade luminosa e sob fotoperiacuteodo de 16horas Apoacutes 90 dias observou-se que melhores resultados parapropagaccedilatildeo in vitro em placircntulas de orquiacutedea Bc lsquoPastoralrsquo x LclsquoAmber Glowrsquo satildeo obtidos com o meio WPM A suplementaccedilatildeode 4 mg L-1 de BAP no meio WPM favorece o crescimento invitro Para a multiplicaccedilatildeo maior quantidade de brotos eacuteconseguida em meio MS na ausecircncia de BAP
Termos para indexaccedilatildeo Orquiacutedea crescimento in vitrocitocinina
ABSTRACTThe multiplication rate of orchids by conventional
methods is considerably low and does not attend its commercialneeds Tissue culture results in larger multiplication rates andproduces uniform and healthy orchid plantlets The objective ofthis work was to study the influence of the cytokinin BAP (6-benzilaminopurine) in different culture media for ther in vitropropagation of Brassocattleya lsquoPastoralrsquox Laeliocattleya lsquoAmberGlowrsquo hybrid plantlets Plantlets measuring approximately 15plusmn 05 cm length deriving from in vitro germination were inoculated
in flasks of 250 cm3 volume containing 40 mL MS WPM andKnudson C salt formulations combined with BAP (0 05 1 2and 4 mg L-1) supplemented with 2 g L-1 activated charcoalsolidified with 6 g L-1 agar and pH adjusted for 58 plusmn 01 Afterthe inoculation the plantlets maintained in a growth room at25plusmn2ordmC 35 mMol m-2 s-1 light intensity and 16 hoursphotoperiod After 90 days the best results for the in vitropropagation of orchid plantlets Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquowere obtained with half strength WPM The supplementation of4 mg L-1 BAP to the WPM medium favors in vitro growth Forthe multiplication phase the largest number of sprouts is achievedwith full strength MS medium in the absence of BAP
Index terms Orchid in vitro growth cytokinin
INTRODUCcedilAtildeO
As orquiacutedeas satildeo consideradas as plantas
ornamentais haacute mais tempo cultivadas pelo homem
Pertencem agrave famiacutelia Orchidaceae a maior entre as
monocotiledocircneas e tambeacutem entre as plantas ornamentais
com 600 - 800 gecircneros e 25000-35000 espeacutecies (SHEEHAN
1983) totalizando 7 das plantas ornamentais do mundo
(Van Der PIJL amp DODSON 1966)
A propagaccedilatildeo de orquiacutedeas pode ser tanto
vegetativa quanto por meio de sementes Estas embora
produzidas em grande quantidade natildeo possuem
endosperma funcional prescindindo para tanto da
associaccedilatildeo simbioacutetica com fungos micorriacutezicos dentre os
quais a Rhizoctonia que eacute um dos gecircneros mais importante
(PIERIK 1987 SHEEHAN 1983)
(Recebido em 08 de dezembro de 2005 e aprovado em 10 de julho de 2006)
Propagaccedilatildeo in vitro de placircntulas de orquiacutedea 69
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 68-73 2006
Knudson (1922) observou que era possiacutevel o cultivo
de sementes em meio artificial contendo apenas sais
nutritivos e accediluacutecar na ausecircncia de fungos Posteriormente
em 1946 o mesmo autor aperfeiccediloou este meio de cultura
sendo atualmente um dos mais utilizados comercialmente
na germinaccedilatildeo e desenvolvimento de orquiacutedeas (ARDITTI
amp ERNST 1992) No entanto satildeo necessaacuterios estudos
pois satildeo descritos vaacuterios meios de cultura para muitos
gecircneros e espeacutecies diferentes O meio de cultura mais
utilizado na cultura de tecidos em geral eacute o MS (Murashige
amp Skoog 1962) podendo-se encontrar o uso de outros
meios como Knudson C (1946) e WPM (Wood Plant
Medium) de Loyd amp McCown (1980)
Reguladores de crescimento em diferentes
concentraccedilotildees tecircm sido usados conforme a espeacutecie e a
metodologia utilizada Podem ser necessaacuterios para a
germinaccedilatildeo de sementes formaccedilatildeo de calos e brotaccedilotildees
adventiacutecias (GRATTAPAGLIA amp MACHADO 1998
PASQUAL 2001)
O regulador de crescimento BAP (6-
benzilaminopurina) eacute uma citocinina largamente utilizada
para estimular a induccedilatildeo de brotos em plantas ornamentais
Para o cultivo in vitro de orquiacutedeas do grupo Cattleya a
citocinina BAP geralmente eacute utilizada nas concentraccedilotildees
que variam entre 005 e 10 mg L-1 (CARVALHO 2002)
Martini et al (2001) trabalhando com a orquiacutedea
Gongora quinquenervis observaram que a presenccedila do
BAP inibe a multiplicaccedilatildeo de calos e o potencial
organogecircnico Silva (2003) concluiu que para o estaacutedio de
subcultivo de Brassocattleya lsquoPastoralrsquo x Laeliocattleya
lsquoAmber Glowrsquo natildeo haacute necessidade da adiccedilatildeo de BAP como
estiacutemulo ao desenvolvimento geral do explante Melhor
proliferaccedilatildeo de brotos formaccedilatildeo de raiacutezes nuacutemero de
folhas e comprimento de brotos em Dendrobium foram
obtidos com 25 mg L-1 de BAP + 05 mg L-1 de ANA
adicionados ao meio MS (TALUKDER et al 2003)
Aleacutem do tipo de meio outro aspecto importante na
multiplicaccedilatildeo in vitro estaacute relacionado com o tipo de
citocinina e sua concentraccedilatildeo sendo ambos determinantes
no sucesso da micropropagaccedilatildeo (GRATTAPAGLIA amp
MACHADO 1998)
O maior entrave no processo de micropropagaccedilatildeo
de orquiacutedeas estaacute relacionado ao tempo necessaacuterio para a
produccedilatildeo de mudas a partir de plantas hiacutebridas
selecionadas e a utilizaccedilatildeo de meio de cultura adequado
para cada espeacutecie Assim objetivou-se estudar o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de BAP e formulaccedilotildees de minerais
nutritivos em meios de cultura na propagaccedilatildeo in vitro de
placircntulas de orquiacutedea oriundas do hiacutebrido Brassocattleya
lsquoPastoralrsquo x Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo
MATERIAL E MEacuteTODOS
Placircntulas hiacutebridas oriundas de sementes
germinadas assimbioticamente em meio Knudson C
obtidas do cruzamento entre Brassocattleya lsquoPastoralrsquo x
Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo com aproximadamente
15plusmn05 cm de comprimento foram transferidas para frascos
de 250 cm3 de capacidade contendo 40 mL de meio de
cultura e vedados com tampas plaacutesticas transluacutecidas Os
tratamentos consistiram de diferentes formulaccedilotildees salinas
(MS WPM e Knudson C em suas formulaccedilotildees originais)
combinadas com 0 05 10 20 e 40 mg L-1 de BAP
acrescidos de 2 g L-1 de carvatildeo ativado solidificado com
6 g L-1 de aacutegar e pH ajustado para 58plusmn01 antes da
autoclavagem obtida a 121ordmC e 1 atm por 20 minutos
Posteriormente agrave inoculaccedilatildeo os frascos foram
transferidos para sala de crescimento com temperatura
de 25plusmn2ordmC fotoperiacuteodo de 16 horas e 35 mmolm-2s-1 de
intensidade luminosa fornecida por lacircmpadas do tipo
(Grow-lux) e luz do dia especial O delineamento
experimental utilizado foi inteiramente casualizado no
esquema fatorial 3 x 5 com cinco repeticcedilotildees de quatro
placircntulas cada sendo cada repeticcedilatildeo composta por um
frasco
Apoacutes 90 dias da instalaccedilatildeo do experimento foram
avaliados nuacutemero meacutedio de brotos comprimento meacutedio
da parte aeacuterea nuacutemero meacutedio de raiacutezes nuacutemero meacutedio de
folhas e meacutedia da massa fresca total de placircntulas
ARAUJO A G de et al70
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 68-73 2006
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Para a variaacutevel nuacutemero de folhas natildeo houve
significacircncia dos fatores isolados nem da interaccedilatildeo entre
eles O nuacutemero de raiacutezes e massa fresca total de placircntulas
apresentaram significacircncia apenas para o fator meio de
cultura enquanto que para nuacutemero de brotos e
comprimento da parte aeacuterea a interaccedilatildeo dos fatores foi
significativa (Tabela 1)
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de brotos observou-se
interaccedilatildeo entre os fatores BAP e os meios de cultura
utilizados (Tabela 1) Poreacutem pelo teste F verificou-se que
apenas o meio MS foi significativo em relaccedilatildeo agraves
concentraccedilotildees de BAP (Figura 1)
O maior nuacutemero de brotos (334) foi registrado na
formulaccedilatildeo de MS adicionado de 40 mg L-1 de BAP
Entretanto na ausecircncia dessa citocinina foi observada a
formaccedilatildeo de 304 brotosplanta (Figura 1) Diante da
pequena diferenccedila na quantidade meacutedia de brotos
formados entre a maior concentraccedilatildeo e o tratamento sem
o regulador de crescimento justifica-se a utilizaccedilatildeo do
meio de cultura sem o BAP Estes resultados concordam
com Silva (2003) que obteve maior nuacutemero de brotos (2
brotos) na ausecircncia de BAP para esse mesmo hiacutebrido
poreacutem em meio Knudson C
A natildeo utilizaccedilatildeo de reguladores de crescimento
adicionados ao meio de cultura vai influenciar na
reduccedilatildeo dos custos de produccedilatildeo de mudas jaacute que esse
eacute um dos componentes mais onerosos Isso eacute
extremamente importante principalmente para
laboratoacuterios comerciais
TABELA 1 ndash Resumo da anaacutelise de variacircncia para as caracteriacutesticas meacutedias de nuacutemero de folhas (NF) nuacutemero de raiacutezes(NR) nuacutemero de brotos (NB) comprimento da parte aeacuterea (CPA) e massa fresca total de placircntulas (MFP) e respectivoscoeficientes de variaccedilatildeo (CV)
significativo a 1 e 5 de probabilidade respectivamente pelo teste F
FIGURA 1 ndash Efeito do meio de cultura MS e concentraccedilotildees de BAP no nuacutemero meacutedio de brotos em placircntulas hiacutebridasde Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo apoacutes 90 dias da incubaccedilatildeo
Fontes de variaccedilatildeo GL Quadrados meacutedios
NF NR NB CPA MFP Meios 2 125683 ns 162740 01483 ns 53139 02372 BAP 4 186198 ns 44693 ns 04408 ns 03373 ns 00075 ns
Meio x BAP 8 243984 ns 13417 ns 17417 13579 00459 ns
Resiacuteduo 45 124475 21329 05055 05961 00662 CV () 3467 3081 2801 2443 5100
Propagaccedilatildeo in vitro de placircntulas de orquiacutedea 71
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 68-73 2006
O estiacutemulo agrave brotaccedilatildeo em placircntulas de Spathoglottis
plicata Griff ocorreu em meio MS suplementado com 10
mg L-1 de BAP e 25 mg L-1 de ANA tendo o enraizamento
estimulado com 20 mg L-1 de AIB (NAYAK et al 1999)
TDZ tambeacutem eacute utilizado em associaccedilatildeo com BAP para
regeneraccedilatildeo de brotos de Rhynchostylis (BUI Le al 1999)
e de Anoectochilus (LI et al 1999) todas orquidaceaes
Observou-se interaccedilatildeo entre o tipo de meio de
cultura e o BAP no que diz respeito ao comprimento de
parte aeacuterea das placircntulas (Tabela 1) Pelo teste de F apenas
o meio WPM foi significativo em relaccedilatildeo agraves concentraccedilotildees
de BAP (Figura 2)
O maior comprimento da parte aeacuterea (47 cm) foi
observado quando se utilizou o meio WPM combinado
com 40 mg L-1 de BAP (Figura 2) Como a relaccedilatildeo foi direta
pode-se inferir que o efeito estimulatoacuterio do BAP sobre o
crescimento da parte aeacuterea continuaria mesmo em
concentraccedilotildees maiores que 40 mg L-1 Talukder et al (2003)
obtiveram melhor comprimento de brotos (0472 cm) em
placircntulas de Dendrobium com utilizaccedilatildeo de 25 mg L-1 de
BAP + 05 mg L-1 de ANA adicionados ao meio MS
Relativo ao nuacutemero meacutedio de raiacutezes houve
significacircncia apenas para o fator meio de cultura (Tabela 1)
Na Tabela 2 verifica-se que os maiores valores foram obtidos
com os meios WPM (557) seguido do MS (487) sendo os
menores valores verificados no meio Knudson C (378) A
emissatildeo de novas raiacutezes eacute favorecida pelo caacutelcio e pelo boro
O meio Knudson C apresenta uma concentraccedilatildeo maior de
caacutelcio e menor de boro em relaccedilatildeo aos meios MS e WPM
que possuem concentraccedilotildees semelhantes de ambos
Segundo Pierik (1987) em concentraccedilotildees mais elevadas
(1 a 10 mg L-1) as citocininas podem induzir a formaccedilatildeo de
gemas adventiacutecias quebrando a dominacircncia apical e retardando
a formaccedilatildeo de raiacutezes Talukder et al (2003) encontraram maior
nuacutemero de raiacutezes (193explante) em placircntulas de Dendrobium
com utilizaccedilatildeo de 25 mg L-1 de BAP + 05 mg L-1 de ANA
adicionados ao meio MS O estiacutemulo ao enraizamento em
Spathoglottis plicata ocorreu em meio MS suplementado com
20 mg L-1 de AIB (NAYAK et al 1999)
FIGURA 2 ndash Comprimento meacutedio da parte aeacuterea em placircntulas hiacutebridas Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo cultivadas emmeio de cultura WPM e diferentes concentraccedilotildees de BAP
TABELA 2 ndash Efeito de diferentes meios de cultura sobreo nuacutemero meacutedio de raiacutezes em placircntulas hiacutebridas de BclsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo
Meios de Cultura Nuacutemero meacutedio de raiacutezes
WPM 557 a MS 487 a KC 378 b
Meacutedias seguidas pela mesma letra natildeo diferem entre sipelo teste de Scott-Knott a 5
ARAUJO A G de et al72
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 68-73 2006
O efeito ora inibitoacuterio ora estimulatoacuterio dos
fitorreguladores na formaccedilatildeo de brotos e raiacutezes em
diferentes plantas pode estar associado agrave proacutepria
concentraccedilatildeo bem como a absorccedilatildeo dos reguladores de
crescimento pelo substrato (GEORGE 1996) agrave habituaccedilatildeo
(SANTANA amp PAIVA 2001) ou agrave deficiecircncia de proteiacutena
ligante promotora da atuaccedilatildeo das citocininas (TAIZ amp
ZEIGER 1998)
O nuacutemero de folhas natildeo apresentou diferenccedilas
significativas para os tratamentos estudados
isoladamente nem houve interaccedilatildeo entre eles (Tabela 1)
Talukder et al (2003) obtiveram maior nuacutemero de folhas
(425placircntula) em Dendrobium com utilizaccedilatildeo de 25 mg L-
1 de BAP + 05 mg L-1 de ANA adicionados ao meio MS
Para massa fresca de placircntulas houve significacircncia
apenas para o fator meio de cultura isoladamente (Tabela
1) Atraveacutes do teste de meacutedias constatou-se maior massa
de placircntulas frescas nos meios WPM e MS com 0524 e
0503g respectivamente Resultado inferior (0326g) foi
registrado em meio Knudson C (Tabela 3)
TABELA 3 ndash Efeito do meio de cultura na massa frescatotal de placircntulas do hiacutebrido Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmberGlowrsquo
Meios de Cultura Massa fresca total de placircntulas (g)
WPM 0524 a MS 0503 a KC 0326 b
Meacutedias seguidas pela mesma letra natildeo diferem entre sipelo teste de Scott-Knott a 5
Dignart (2003) estudando a germinaccedilatildeo in vitro
de sementes de Cattleya nobilior Rchbf em diferentes
meios de cultura (MS WPM Knudson C e B5 de
GAMBORG et al 1968) observou que natildeo houve
diferenccedilas entre os meios utilizados O BAP adicionado
ao meio de cultura provocou aumento da taxa de brotaccedilatildeo
a partir de 1 igravemolL
Segundo (PASQUAL 2001) os meios MS e WPM
possuem concentraccedilotildees similares de micronutrientes e satildeo
ricos em nitrogecircnio (N) e potaacutessio (K) Jaacute o meio Knudson C
natildeo possui micronutrientes e tem baixas concentraccedilotildees de
N e K em relaccedilatildeo ao MS e WPM Os melhores resultados
para as variaacuteveis analisadas foram observados em meio WPM
e MS Essa resposta provavelmente deveu-se ao fato de
que o meio Knudson C possui diferentes sais minerais e
embora seja muito utilizado na germinaccedilatildeo de sementes de
orquiacutedeas parece natildeo propiciar condiccedilotildees satisfatoacuterias para
o desenvolvimento de placircntulas de algumas espeacutecies de
orquiacutedeas
Sabe-se que existe uma relaccedilatildeo entre o nuacutemero de
brotos e seu tamanho e nessa relaccedilatildeo quanto maior for o
nuacutemero de brotos menor o tamanho dos mesmos
(GEORGE 1996) Essa relaccedilatildeo fez-se presente ateacute a
concentraccedilatildeo de 20 mg L-1 de BAP em Bc lsquoPastoralrsquo x Lc
lsquoAmber Glowrsquo No entanto em concentraccedilotildees superiores
tanto o nuacutemero quanto o comprimento dos brotos
aumentaram Tal diversidade de resultados estaacute
relacionada principalmente ao genoacutetipo da espeacutecie meio
de cultura e possivelmente agrave interferecircncia na accedilatildeo dos
reguladores de crescimento
Segundo Malaure et al (1991) diferentes efeitos
dos reguladores de crescimento podem ocorrer para
diferentes espeacutecies inclusive variaccedilotildees dentro de uma
mesma espeacutecie Em orquiacutedeas o efeito dos reguladores de
crescimento e de meios de cultura satildeo diversificados
principalmente quando se utiliza um hiacutebrido trigeneacuterico
com alto grau de heterozigose
CONCLUSOtildeES
Melhores resultados para propagaccedilatildeo in vitro de
placircntulas de orquiacutedea Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo satildeo
obtidos com o meio WPM A suplementaccedilatildeo de 4 mg L-1 de
BAP no meio WPM favorece o crescimento in vitro Para
a multiplicaccedilatildeo maior quantidade de brotos eacute conseguida
em meio MS na ausecircncia de BAP
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SILVEIRA D G et al74
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
EFEITO DO VIacuteRUS DAS ESTRIAS DA BANANEIRA NAMICROPROPAGACcedilAtildeO E NO CRESCIMENTO DAS PLANTAS DA
CULTIVAR CAIPIRA DURANTE A ACLIMATIZACcedilAtildeO1
EFFECT OF BANANA STREAK VIRUS ON MICROPROPAGATION AND PLANTGROWTH OF CULTIVAR CAIPIRA DURING ACLIMATIZATION
DANIELA GARCIA SILVEIRA2 ANTOcircNIO DA SILVA SOUZA3 PAULO ERNESTO MEISSNER FILHO3TALES MILER SOARES4 RANULFO CORREA CALDAS3 KAacuteTIA REGINA BARBOSA LEAtildeO5
1Parte da Dissertaccedilatildeo de Mestrado apresentada pelo primeiro autor ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias Agraacuterias da Escola de AgronomiaUFBA ndash Cruz das Almas BA2Doutoranda em Botacircnica ndash Universidade Estadual de Feira de SantanaUEFS ndash Feira de Santana BA ndash danielagsigcombr3Pesquisador da Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical ndash Caixa Postal 007 ndash 44380-000 ndash Cruz das Almas BA4Doutorando da Escola Superior Luis de QueirozEsalq ndash Piracicaba SP ndash tmsoaresesalquspbr5Engenheira Agrocircnoma MSc EBDA ndash Cruz das Almas BA ndash 44380-000 ndash krbleaohotmailcom
(Recebido em 12 de abril de 2006 e aprovado em 28 de agosto de 2006)
RESUMOAvaliaram-se os efeitos da infecccedilatildeo pelo viacuterus das estrias
de bananeira (Banana Streak Virus BSV) no desenvolvimento invitro e no crescimento das plantas da cultivar Caipira durante aaclimatizaccedilatildeo Utilizou-se o delineamento experimentalinteiramente casualizado com dois tratamentos plantas sadias eplantas infectadas pelo BSV com respectivamente 24 e 28repeticcedilotildees Os explantes foram desinfestados e estabelecidos emmeio MS baacutesico suplementado com 30 gL de sacarose solidificadocom 2 gL de lsquoPhytagelrsquo e pH ajustado em 58 Foram efetuadoscinco subcultivos em meio com 4 mgL de BAP (6-benzilaminopurina) e as plantas obtidas foram enraizadas nessemesmo meio de cultura sem reguladores de crescimento Apoacutesessa etapa transferiram-se as plantas para a aclimatizaccedilatildeo emcacircmara uacutemida onde permaneceram por 30 dias Avaliaram-se astaxas de multiplicaccedilatildeo a presenccedila in vitro dos sintomas do BSVnos explantes provenientes das plantas infectadas durante amicropropagaccedilatildeo e aclimatizaccedilatildeo as perdas por contaminaccedilatildeoenvolvendo fungos e bacteacuterias nas fases da micropropagaccedilatildeo e aaltura das plantas na fase da aclimatizaccedilatildeo A infecccedilatildeo pelo BSVnatildeo afetou significativamente a multiplicaccedilatildeo e o crescimento invitro das plantas sendo os sintomas do viacuterus visiacuteveis em todasas fases da micropropagaccedilatildeo e na aclimatizaccedilatildeo das plantasinfectadas A maior porcentagem de contaminaccedilatildeo ocorreu nafase de estabelecimento in vitro dos explantes independentementedos tipos de plantas utilizadas Apoacutes 30 dias de aclimatizaccedilatildeo asplantas com BSV apresentaram altura inferior agraves plantas sadiasA presenccedila do viacuterus natildeo influenciou a taxa de multiplicaccedilatildeo dosexplantes poreacutem afetou o crescimento das plantas infectadas
Termos para indexaccedilatildeo Musa BSV cultura de tecidospropagaccedilatildeo in vitro
ABSTRACTThe effects of the banana streak virus (BSV) infection on
in vitro development of the cultivar Caipira were evaluated The
used experimental design was a completely randomized withtwo treatments healthy plants and plants infected by BSV with24 and 28 replications respectively The explants weredisinfected and established in a basic MS medium supplementedwith 30 gL sucrose solidified with 2 gL lsquoPhytagelrsquo and pHadjusted to 58 Five subcultures were carried out in a mediumcontaining 4 mgL BAP (6-benzylaminopurine) and the plantletswere rooted in the same culture medium without growthregulators Afterwards the plantlets were transferred to a humidchamber for acclimatization during a 30-day periodMultiplication rates presence of BSV symptoms on in vitroexplants obtained from plants infected during themicropropagation and acclimatization periods losses caused byfungal and bacterial contamination and plantlet height at theacclimatization stage were evaluated The infection by BSVpresented no significant effect on the multiplication rate and invitro plant growth although the virus symptoms were visible inall the micropropagation phases and during the acclimatizationof infected plants The highest percentage of contaminationoccurred during the in vitro establishment phase regardless theused plants After 30 days of acclimatization the plants withBSV presented a lower height compared to the healthy plantsAlthough the presence of the virus had no influence on the explantmultiplication rate it affected the growth of infected plants
Index terms Musa BSV tissue culture in vitro propagation
INTRODUCcedilAtildeO
As bananeiras estatildeo sujeitas as vaacuterias doenccedilas
causadas por fungos bacteacuterias nematoacuteides e viacuterus que
satildeo limitantes agrave sua capacidade de produccedilatildeo Entre as
viroses que ocorrem no Brasil destaca-se a causada pelo
viacuterus das estrias da bananeira (Banana streak virus BSV)
Efeito do viacuterus das estrias da bananeira 75
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
que eacute particularmente importante para os programas de
melhoramento geneacutetico e de multiplicaccedilatildeo comercial de
cultivares uma vez que pode ser incorporada ao genoma e
transmitida pelas sementes de plantas infectadas
(DANIELLS et al 1995) aleacutem de natildeo existir um meacutetodo
eficiente para limpar uma planta infectada com BSV
(LOCKHART 1994)
Esse viacuterus natildeo eacute transmitido mecanicamente sendo as
mudas infectadas sua principal forma de disseminaccedilatildeo
(LOCKHART amp AUSTREY 1988 LOCKHART 1994) A
transmissatildeo eacute feita de maneira semi-persistente pela cochonilha-
dos-citros Planococcus citri Risso e pela cochonilha-da-cana-
de-accediluacutecar Saccharicoccus sacchari cocherell (LOCKHART
1993 LOCKHART amp AUSTREY 1988)
O BSV inicialmente causa na bananeira um estriado
cloroacutetico de linhas descontiacutenuas dispersas e concentradas
em partes da lacircmina foliar Com o envelhecimento das
folhas o estriado causa necrose de coloraccedilatildeo marrom-cafeacute
a negro (RAMIREZ amp RIVERA 1994) As plantas
infectadas geralmente natildeo mostram sintomas em todas as
folhas (CORDEIRO amp KIMATI 1997 LOCKHART 1986)
Outros sintomas do BSV satildeo a reduccedilatildeo do vigor da planta
e a diminuiccedilatildeo do tamanho dos frutos que tambeacutem ficam
deformados (RAMIREZ amp RIVERA 1994)
Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos
da infecccedilatildeo pelo BSV na multiplicaccedilatildeo in vitro e no
crescimento durante a aclimatizaccedilatildeo das plantas de
bananeira da cultivar Caipira Aleacutem disso avaliou-se a taxa
de contaminaccedilatildeo por fungos e bacteacuterias na etapas da
micropropagaccedilatildeo devido a importacircncia dessa variaacutevel na
multiplicaccedilatildeo in vitro das plantas
MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo dos efeitos do BSV na micropropagaccedilatildeo
da cultivar Caipira (grupo AAA) foi conduzido no
Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos da Embrapa Mandioca
e Fruticultura Tropical Utilizou-se o delineamento
experimental inteiramente casualizado com dois
tratamentos plantas sadias com 24 repeticcedilotildees coletadas
no Banco de Germoplasma de Bananeira da Embrapa
Mandioca e Fruticultura Tropical e plantas infectadas com
BSV com 28 repeticcedilotildees Foram usadas mudas do tipo
chifrinho sendo que as matrizes infectadas com BSV com
altura meacutedia de 12 cm foram infestadas pela cochonilha
vetora Planacoccus citri Risso alimentadas em folhas de
banana lsquoMysorersquo com sintomas de BSV em casa-de-
vegetaccedilatildeo Aproximadamente 15 dias apoacutes a infestaccedilatildeo
todas as 28 plantas estavam com os sintomas da virose
Para o estabelecimento in vitro realizou-se a limpeza
das matrizes por meio de uma seacuterie de cortes removendo-
se parte do rizoma e do pseudocaule ateacute o tamanho
aproximado de 50 cm de altura por 15 cm de diacircmetro
lavando-se com detergente e aacutegua deionizada A
desinfestaccedilatildeo foi feita em cacircmara de fluxo laminar
imergindo os explantes em soluccedilatildeo de aacutelcool 70 por
cinco minutos e em soluccedilatildeo 11 de aacutegua sanitaacuteria comercial
(2 de cloro ativo) com aacutegua deionizada por 30 minutos
Em seguida foram realizadas trecircs lavagens com aacutegua
deionizada esterilizada e reduzidos os explantes ateacute o
tamanho final de 06 cm de altura por 04 cm de diacircmetro
As etapas de estabelecimento multiplicaccedilatildeo e
enraizamento foram realizadas em meio nutritivo MS baacutesico
(MURASHIGE amp SKOOG 1962) suplementado com 30 g
L de sacarose solidificado com 2 gL de ldquoPhytagelrdquo e pH
ajustado para 58 Apenas na fase de multiplicaccedilatildeo o meio
MS foi suplementado com 4 mgL de 6-benzilaminopurina
(BAP) Em todas as etapas os explantes foram dispostos
sobre 25 mL de meio de cultura em frascos com 12 cm de
altura por 5 cm de diacircmetro
A multiplicaccedilatildeo foi realizada em cinco subcultivos
das gemas e brotos sendo efetuada a subdivisatildeo
longitudinal dos explantes sempre que possiacutevel O
estabelecimento e os cinco subcultivos foram realizados
com intervalos de 30 dias Apoacutes os subcultivos as
plantas permaneceram 30 dias em enraizamento O
estudo foi desenvolvido sob condiccedilotildees de temperatura
de 27 plusmn 1ordmC fotoperiacuteodo de 16 horas e intensidade
luminosa de 22 microEm2s
SILVEIRA D G et al76
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
Apoacutes o enraizamento in vitro 47 plantas sadias e 40
plantas infectadas com BSV foram transferidas para copos
plaacutesticos de 300 cm3 contendo o Plantmaxreg e vermiculita
(21) permanecendo 30 dias sob condiccedilotildees de 85 de umidade
relativa do ar e 60 de sombreamento em casa-de-vegetaccedilatildeo
Na fase de estabelecimento e em cada subcultivo
foram avaliadas as taxas de multiplicaccedilatildeo e a presenccedila dos
sintomas do BSV nos explantes provenientes das plantas
infectadas Na fase de aclimatizaccedilatildeo avaliaram-se a
presenccedila de sintomas nas plantas infectadas e as suas
respectivas alturas As medidas foram tomadas do coleto
ateacute a extremidade apical da folha mais alta
Os dados referentes ao nuacutemero de gemas obtidas
nos cinco subcultivos foram transformados em raiz
quadrada Foi estabelecida uma regressatildeo linear para cada
tratamento em funccedilatildeo dos subcultivos
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
A infecccedilatildeo pelo BSV natildeo afetou significativamente
o crescimento e a multiplicaccedilatildeo das plantas sendo que o
nuacutemero de gemas cresceu linearmente em funccedilatildeo dos
subcultivos em ambos os tratamentos Trabalhando com
plantas micropropagadas de bananeira sadias e infectadas
com o viacuterus do topo em leque (Banana bunchy top virus
BBTV) Thomas et al (1995) observaram que aquela virose
tambeacutem natildeo afetou a capacidade das plantas em crescer e
multiplicar Nas anaacutelises de regressatildeo realizadas para os
dois tratamentos (plantas sadias e plantas com BSV) o
acreacutescimo no nuacutemero de gemas em funccedilatildeo dos subcultivos
pode ser explicado por um modelo de regressatildeo linear
(Figura 1) As estimativas da regressatildeo linear para plantas
com BSV e plantas sadias foram altamente significativas e
os coeficientes de determinaccedilatildeo (R2) proacuteximos de 1 Foi
observado que as linhas determinadas a partir das
equaccedilotildees obtidas satildeo quase superpostas evidenciando
um comportamento semelhante entre os dois tratamentos
com relaccedilatildeo ao nuacutemero de gemas por subcultivo
Em todas as fases da micropropagaccedilatildeo os sintomas
do BSV foram visiacuteveis ocorrendo nas folhas das plantas
infectadas estriados cloroacuteticos com linhas descontiacutenuas e
FIGURA 1 ndash Curvas de regressatildeo linear obtidas a partir dosdados de gemas em cada subcultivo da cultivar de bananeiraCaipira sadias e infectadas com BSV Cruz das Almas (BA)Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical 2006Dados transformados por x
dispersas (Figura 2) Esses mesmos sintomas foram
observados em plantas de bananeira infectadas com BSV
mantidas a campo (RAMIREZ amp RIVERA 1994)
As contaminaccedilotildees que ocorreram nos materiais
in vitro foram tambeacutem avaliadas As maiores taxas de
contaminaccedilatildeo aconteceram na fase de estabelecimento
in vitro dos explantes obtendo-se niacuteveis de 21 e 32
para as plantas sadias e infectadas com BSV
respectivamente (Figura 3) Os elevados iacutendices de perdas
nesta etapa foram causados principalmente por
contaminaccedilatildeo bacteriana Segundo Oliveira amp Silva
(1997) as maiores contaminaccedilotildees bacterianas dos
explantes de bananeira ocorrem na fase de
estabelecimento in vitro do que nos demais subcultivos
Oliveira et al (2000) trabalhando com plantas livres de
viacuterus obtiveram taxas de contaminaccedilatildeo nesta fase entre
10 e 45 as quais estatildeo proacuteximas agraves obtidas neste
trabalho Durante a fase de multiplicaccedilatildeo as perdas por
contaminaccedilatildeo foram menores variando de 14 a 74
para as plantas sadias e de 0 a 121 no caso das plantas
infectadas com BSV sendo que a maior parte do material
foi contaminada por fungos natildeo-patogecircnicos Estes
valores foram bem inferiores agravequeles obtidos por Oliveira
et al (1999) (131) que utilizaram genoacutetipos diploacuteides
triploacuteides e tetraploacuteides de bananeiras sadias
Efeito do viacuterus das estrias da bananeira 77
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
FIGURA 2 ndash Planta de bananeira lsquoCaipirarsquo infectada com BSV na fase de enraizamento in vitro apresentando estriadoscloroacuteticos com linhas descontiacutenuas e dispersas nas folhas Cruz das Almas (BA) Embrapa Mandioca e FruticulturaTropical 2006
FIGURA 3 ndash Taxas por contaminaccedilatildeo () de explantes dacultivar Caipira na fase de estabelecimento (Est) e ao longode cinco subcultivos (Sub) Cruz das Almas (BA)Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical 2006
Durante o enraizamento in vitro natildeo houve
diferenccedila significativa na altura das plantas Poreacutem com
30 dias de aclimatizaccedilatildeo as plantas com BSV apresentaram
altura significativamente inferior agraves plantas sadias (Tabela 1)
Soares et al (2000) cultivaram mudas de bananeira lsquoCaipirarsquo
sadias e infectadas com BSV durante 141 dias em casa-de-
vegetaccedilatildeo e observaram que a infecccedilatildeo pelo viacuterus implicou
em significativa reduccedilatildeo no crescimento inicial afetando
o porte o desenvolvimento do sistema radicular e a aacuterea
fotossintetizante das plantas Verifica-se assim que a
infecccedilatildeo pelo BSV prejudicou o crescimento inicial das
plantas afetando a altura daquelas infectadas mesmo em
um periacuteodo relativamente curto indicando que em periacuteodos
mais longos o prejuiacutezo com relaccedilatildeo ao crescimento pode
ser ainda maior aconteceu no estudo desenvolvido por
Soares et al (2000)
Os sintomas do BSV permaneceram visiacuteveis em
todas as plantas infectadas durante e apoacutes a fase de
aclimatizaccedilatildeo Esse resultado foi diferente ao obtido por
Dahal et al (1999) quando micropropagaram hiacutebridos de
Musa pois os sintomas soacute foram visiacuteveis em plantas com
trecircs meses apoacutes o enraizamento Provavelmente essa
diferenccedila foi devido agraves condiccedilotildees onde os trabalhos foram
conduzidos casa-de-vegetaccedilatildeo e campo respectivamante
bem como aos genoacutetipos estudados Observaccedilotildees
semelhantes foram tambeacutem efetuadas por Gauhl amp Pasberg-
Gauhl (1995) e Ortiz (1996) ao estudarem a incidecircncia de
viroses em diferentes genoacutetipos de bananeira
SILVEIRA D G et al78
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
Alturas (cm) Plantas de bananeira lsquoCaipirarsquo
Enraizamento
in vitro 30 dias de
aclimatizaccedilatildeo
Sadias 637 a 2690 a BSV 728 a 2192 b
TABELA 1 ndash Meacutedias das alturas das plantas apoacutes oenraizamento in vitro e 30 dias de aclimatizaccedilatildeo em casa-de-vegetaccedilatildeo Cruz das Almas (BA) Embrapa Mandiocae Fruticultura Tropical 2006
Meacutedias seguidas pelas mesmas letras nas colunas natildeodiferem estatisticamente entre si pelo teste F ao niacutevel de 5 de significacircncia
CONCLUSOtildeES
A infecccedilatildeo pelo BSV natildeo influenciou a taxa de
multiplicaccedilatildeo dos explantes embora os sintomas do viacuterus
tenham sido visiacuteveis em todas as fases da micropropagaccedilatildeo
e durante os primeiros 30 dias da aclimatizaccedilatildeo das plantas
infectadas Todavia o crescimento das plantas infectadas
foi afetado pela presenccedila do viacuterus
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Efeito do viacuterus das estrias da bananeira 79
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
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FOGACcedilA L A et al80
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
CARACTERIacuteSTICAS MORFOFISIOLOacuteGICAS DE BROTACcedilOtildeES DEAgapanthus umbellatus var minor MULTIPLICADAS EM
BIORREATOR DE IMERSAtildeO TEMPORAacuteRIA1
MORPHOLOGICAL AND PHYSIOLOGICAL CHARACTERISTICS Agapanthus umbellatus varminor OF SHOOTS PROPAGATED IN BIOREACTOR OF TEMPORARY IMMERSION
LUCIANA ALVES FOGACcedilA2 DENILSON DORTZBACH3 ANTONIO CARLOS ALVES4 ENIO LUIZ PEDROTTI5
1Parte da dissertaccedilatildeo de mestrado do primeiro autor junto ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Recursos Geneacuteticos vegetais CCA UFSC ndash Florianoacutepolis SC2Engenheira Agrocircnoma Mestre em Recursos Geneacuteticos Vegetais ndash CCAUFSC ndash UFSC Trindade ndash Florianoacutepolis SC ndash 88040-900 ndash lufogacapopcombr3Empresa Catarinense de Pesquisa Agropecuaacuteria ndash Rodovia Admar Gonzaga 1340 ndash Bairro Itacorubi Florianoacutepolis SC ndash denilsondtbolcombr4Engenheiro Agrocircnomo Professor Dr Departamento Fitotecnia ndash CCAUFSC ndash UFSC ndash alvesccaufscbr5Engenheiro Agrocircnomo Professor Dr Departamento Fitotecnia ndash CCAUFSC ndash UFSC ndashRodovia Admar Gonzaga 1346 ndash 88 040 900 ndash Florianoacutepolis- SC ndash pedrotticcaufscbr
RESUMOCom o presente trabalho objetivou-se estudar alguns
aspectos morfoloacutegicos e fisioloacutegicos de placircntulas de Agapanthusumbellatus LrsquoHeacuter var minor multiplicadas em biorreatores deimersatildeo temporaacuteria (BIT) Foram testadas quatro concentraccedilotildeesde sacarose no meio de cultura e duas intensidades luminosasem um total de oito tratamentos formando um fatorial 2 x 4 Odelineamento experimental utilizado foi inteiramentecasualizado Os resultados obtidos indicaram que as condiccedilotildeesambientais principalmente luz e concentraccedilatildeo de sacarose domeio de cultura influenciaram o desenvolvimento e o crescimentodas placircntulas quando multiplicadas Observou-se que a ausecircnciade sacarose mesmo no niacutevel mais elevado de intensidadeluminosa natildeo estimulou a fotossiacutentese das placircntulas Acombinaccedilatildeo de 30 gL-1 de sacarose e 70 mMm-2s-1 de luzproporcionou maior numero de folhas massa fresca e secaconcentraccedilatildeo de clorofila a b e total fatores estes que tecircmgrande influecircncia na fase de aclimatizaccedilatildeo
Termos para indexaccedilatildeo Plantas ornamentaismicropropagaccedilatildeo sacarose intensidade luminosa
ABSTRACTThe objective of the present work was to study
morphological and physiological characteristics of Agapanthusumbellatus LrsquoHeacuter var minor plantlets propagated in bioreactorof temporary immersion (BIT) Four sucrose concentrationsand two light intensities were analyzed totalizing eighttreatments The experimental design used was a completelyrandomized with a 2 x 4factorial The results indicated that theenvironment conditions mainly light and sucrose concentrationsof the culture medium influenced plantlets development andgrowth It was observed that the absence of sucrose even inthe highest level of light intensity had no stimuli on plantletphotosynthesis The combination of 30 g L-1 sucrose and 70mM m-2 s-1 light had promoted higher leaf number fresh anddry weight concentration of chlorophyll a b and total
parameters that present high influence during theacclimatizationrsquos phase
Index terms Ornamental plants micropropagation sucroselight intensity
INTRODUCcedilAtildeO
Agapanthus umbellatus var minor tambeacutem
conhecida como Agapantho ou Liacuterio do Nilo eacute uma
angiosperma da famiacutelia Amaryllidaceae pertencente agrave
ordem Liliales (BOTANY 2003) eacute uma espeacutecie ornamental
muito utilizada como flor de corte devido agrave sua durabilidade
No entanto o maior interesse econocircmico nesta espeacutecie
decorre do seu uso como forraccedilatildeo em jardins e praccedilas
(LORENZI amp SOUZA 1995)
Sua propagaccedilatildeo eacute tradicionalmente efetuada
atraveacutes da divisatildeo de touceiras No entanto esta teacutecnica
apresenta uma seacuterie de desvantagens visto que a taxa de
propagaccedilatildeo eacute baixa cerca de dez mudas por planta ao ano
aleacutem de possibilitar a dispersatildeo de pragas e doenccedilas que
poderatildeo ocorrer no viveiro de produccedilatildeo Sendo assim a
micropropagaccedilatildeo pode ser uma ferramenta muito
promissora para esta espeacutecie
O processo de micropropagaccedilatildeo induz a um grande
nuacutemero de mudanccedilas anatocircmicas morfoloacutegicas e
fisioloacutegicas que muitas vezes tem limitado o cultivo in vitro
de algumas espeacutecies (DESJARDINS 1993) A
(Recebido em 18 de julho de 2005 e aprovado em 25 de agosto de 2006)
Caracteriacutesticas morfofisioloacutegicas de brotaccedilotildees 81
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
heterogeneidade de respostas agraves placircntulas que ocorrem
na cultura de tecidos eacute promovida natildeo soacute por fatores
inerentes ao tecido vegetal (geneacuteticos e fisioloacutegicos) mas
tambeacutem por modificaccedilotildees do ambiente in vitro
As modificaccedilotildees do ambiente in vitro envolvem a
qualidade e intensidade de luz fotoperiacuteodo temperatura
umidade reguladores de crescimento exoacutegenos fonte de
carbono e estresse mecacircnico Estes satildeo determinantes na
morfogecircnese no crescimento e no desenvolvimento de
placircntulas in vitro (GEORGE 1996 KOZAI et al 1990
SALISBURY 1981) Aleacutem disso interferem no nuacutemero de
folhas teor de clorofila densidade estomaacutetica (LIAN et
al 2002 PREECE amp SUTTER 1991) na fotossiacutentese e na
fase de aclimatizaccedilatildeo (DESJARDINS et al 1995)
Um dos principais fatores que causam grande
influecircncia na fotossiacutentese de placircntulas cultivadas in vitro
eacute a intensidade luminosa (GALZY amp COMPAN 1992) A
quantidade e a qualidade da luz bem como o fotoperiacuteodo
podem afetar o crescimento e o desenvolvimento de
placircntulas in vivo (SMITH 1982) e placircntulas in vitro
(ECONOMOU amp READ 1987 VLAHOS et al 1992) Esta
influecircncia se deve ao grande impacto sobre o acuacutemulo de
pigmentos biossiacutentese de clorofila diferenciaccedilatildeo de
cloroplastos e anatomia da folha (DESJARDINS et al 1995)
Outro fator que vem sendo estudado e que pode
determinar um papel importante no controle da atividade
fotossinteacutetica de placircntulas in vitro eacute a utilizaccedilatildeo de
carboidratos exoacutegenos pois o crescimento da maioria das
culturas in vitro eacute sustentado pela sacarose ou outros
accediluacutecares adicionados ao meio de cultura (PREECE amp
SUTTER 1991) Estes podem ser utilizados pelas placircntulas
quando a taxa de fotossiacutentese natildeo permite assegurar um
balanccedilo positivo em carbono definindo assim uma nutriccedilatildeo
mixotroacutefica ou heterotroacutefica (GALZY amp COMPAN 1992)
Baseado na hipoacutetese de que a composiccedilatildeo do meio
de cultura e a intensidade luminosa influenciam a
morfologia e a fisiologia de placircntulas micropropagadas o
presente trabalho teve como objetivo estudar aspectos
morfoloacutegicos e fisioloacutegicos de placircntulas de Agapanthus
umbellatus LrsquoHeacuter var minor multiplicadas em biorreator de
imersatildeo temporaacuteria (BIT) Para tanto foi avaliado o
desenvolvimento e o crescimento desta espeacutecie durante a
fase de multiplicaccedilatildeo em funccedilatildeo da variaccedilatildeo de niacuteveis de
sacarose e intensidade luminosa
MATERIAIS E MEacuteTODOS
Este trabalho foi realizado no Laboratoacuterio de
Morfogecircnese e Bioquiacutemica Vegetal localizado no Centro
de Ciecircncias Agraacuterias da Universidade Federal de Santa
Catarina em Florianoacutepolis - SC
O trabalho consistiu de um ensaio onde foram
utilizadas brotaccedilotildees de Agapanthus umbellatus var minor
obtidas da terceira repicagem mantidas em meio geleificado
MS + 178 mM de BAP Apoacutes serem individualizadas e
padronizadas tendo o seu tamanho variando entre 25 e
30 cm de comprimento as brotaccedilotildees foram transferidas
para o BIT (ETIENNE amp BERTHOULY 2002) contendo 500
mL de meio liacutequido e sais de MS (MURASHIGE amp SKOOG
1962) em condiccedilotildees asseacutepticas suplementado com
concentraccedilatildeo de 89 mM de BAP O pH foi ajustado com
NAOH (1N) em 59 antes da autoclavagem (durante 15
minutos sob 121ordmC e 15 atm de pressatildeo) O delineamento
experimental utilizado no ensaio foi o inteiramente
casualizado Foram testados quatro concentraccedilotildees de
sacarose no meio de cultura (0 15 30 e 45) e duas
intensidades luminosas (70 e 140 mmolm-2s-1) providas
por lacircmpadas brancas fluorescentes (PHILIPS ndash TLT 40W)
em um total de oito tratamentos formando um fatorial 2 x 4
Cada tratamento foi composto por trecircs frascos (repeticcedilatildeo)
contendo 50 plantas cada um
Os frascos foram mantidos em sala de crescimento
com fotoperiacuteodo de 16 horas e temperatura meacutedia de 22ordmC
com variaccedilatildeo de plusmn 2ordmC por um periacuteodo de 60 dias
Apoacutes 60 dias de cultivo foram avaliadas as
seguintes caracteriacutesticas dos explantes nuacutemero e tamanho
das brotaccedilotildees (cm) nuacutemero de folhasbrotaccedilatildeo massa
fresca e seca (g) da parte aeacuterea e raiz utilizando-se amostras
de 25 placircntulas por repeticcedilatildeo escolhidas ao acaso
FOGACcedilA L A et al82
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
A determinaccedilatildeo do conteuacutedo de clorofila ldquoa b e
totalrdquo consistiu na coleta de amostras de 100 mg de massa
fresca As amostras foram incubadas com 70 mL de DMSO
(dimetilsulfoacutexido) sem maceraccedilatildeo por 30 minutos a 65degC
Apoacutes filtragem seu volume foi completado para 10 mL com
DMSO Desses extratos 2 mL foram analisados em
espectrofotocircmetro (UV - visiacutevel SHIMADZU) para os
valores de absorbacircncia entre 645 e 663 nm Os valores obtidos
foram submetidos agrave foacutermula de Arnon (1949) conforme
descrito por Hiscox amp Israelstam (1979) Chl a = (00127 X
D663) ndash (000269 X D645) e Chl b = (00229 X D645) ndash (000468
X D663) A clorofila total foi a soma da ldquoChl a e Chl brdquo de
cada tratamento foram utilizadas 25 amostras
A determinaccedilatildeo da densidade estomaacutetica (nuacutemero
de estocircmatos por mm2 de superfiacutecie foliar) foi realizada nas
amostras das quais extraiu-se a clorofila Apoacutes a extraccedilatildeo
da clorofila as folhas foram cortadas e somente o terccedilo
meacutedio das folhas foi usado para anaacutelise Em seguida foram
fixadas sobre lacircminas histoloacutegicas com a ajuda de uma
lamiacutenula e de algumas gotas de aacutegua esterilizada A
observaccedilatildeo foi realizada na epiderme das faces adaxial e
abaxial da folha com o auxiacutelio de um microscoacutepio oacutetico
(OLYMPUS CH30 ocular WH10 X 22) com um aumento
de 400 vezes e com um campo conhecido de 024 mm2 Para
cada lacircmina foram feitas leituras em cinco campos
Os dados obtidos foram avaliados por meio da
anaacutelise de variacircncia (ANOVA) seguindo o modelo para
experimento bifatorial inteiramente casualizado O nuacutemero
de brotaccedilotildees o nuacutemero de folhas e a densidade estomaacutetica
foram transformados em Oumlx+1 para a anaacutelise As meacutedias
dos tratamentos foram separadas pelo teste de comparaccedilatildeo
de meacutedias de Duncan a 5 de probabilidade conforme
recomendaccedilotildees de Stell amp Torrie (1980)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
A concentraccedilatildeo de sacarose no meio de cultura
apresentou uma accedilatildeo positiva e interativa com a intensidade
luminosa na proliferaccedilatildeo de brotaccedilotildees (Tabela 1) visto
que a ausecircncia de sacarose no meio de cultura resultou
em insucesso no crescimento das placircntulas de Agapantho
principalmente nos primeiros dias Apoacutes o
desenvolvimento inicial (aproximadamente 10 dias) foi
constatada estagnaccedilatildeo no crescimento das placircntulas
seguido de atrofia e necrose das brotaccedilotildees Apoacutes 20 dias
de cultivo ocorreu a morte das brotaccedilotildees Isso mostrou
que folhas de placircntulas de Agapantho natildeo fixaram
carbono suficiente para sustentar seu crescimento na
ausecircncia de sacarose Portanto para a espeacutecie em estudo
foi necessaacuteria a adiccedilatildeo de uma fonte de carbono no meio
de cultura para o seu desenvolvimento in vitro Segundo
Capellades et al (1991) e Desjardins et al (1995) a total
remoccedilatildeo de carboidratos no meio de cultura para algumas
espeacutecies frequumlentemente torna-se prejudicial para o
crescimento das placircntulas o que pode prejudicar o
processo de micropropagaccedilatildeo e aclimatizaccedilatildeo pois
durante o cultivo in vitro as placircntulas perdem
parcialmente o autotrofismo e consequumlentemente
necessitam de uma fonte de carbono
O maior nuacutemero de brotaccedilotildees foi obtido com a
intensidade luminosa de 70 mmolm-2s-1 e a concentraccedilatildeo
de 45 gL-1 de sacarose (Tabela 1) Enquanto que com a
intensidade luminosa de 140 mmolm-2s-1 o maior nuacutemero
de brotaccedilotildees foi obtido com a concentraccedilatildeo de 30 gL-1 de
TABELA 1 ndash Nuacutemero de brotaccedilotildeesexplante de placircntulasde Agapanthus umbellatus var minor multiplicadasbiorreator de imersatildeo temporaacuteria suplementado comdiferentes concentraccedilotildees de sacarose e intensidadesluminosas no periacuteodo de 60 dias
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1)
Concentraccedilatildeo Sacarose (gL-1) 70 1 140 1
0 000 dA 00 dA 15 370 cB 544 cA 30 553 bB 651 aA 45 745 aA 585 bB
CV 67
Meacutedias seguidas pela mesma letra minuacutescula nas colunase maiuacutescula nas linhas natildeo diferem significativamente peloteste de Duncan a 5 de probabilidade1 Observaccedilotildees transformadas segundo ( x+1)
Caracteriacutesticas morfofisioloacutegicas de brotaccedilotildees 83
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
sacarose Isso demonstrou um alto grau de mixotrofia dessa
espeacutecie
O tamanho das brotaccedilotildees e o nuacutemero de folhas
(Tabela 2) foram afetados apenas pelo efeito simples dos
fatores natildeo havendo interaccedilatildeo entre sacarose e luz O
maior tamanho das brotaccedilotildees foi alcanccedilada quando os
explantes foram submetidos a 15 gL-1 de sacarose e 140
mmolm-2s-1 de intensidade luminosa (Tabela 2) Verificou-
se tambeacutem que o aumento da concentraccedilatildeo desse
carboidrato no meio de cultura natildeo favoreceu o
alongamento das brotaccedilotildees Provavelmente o aumento
da intensidade luminosa favoreceu a taxa de fotossiacutentese
das placircntulas permitindo um balanccedilo positivo de carbono
afetando o crescimento e o desenvolvimento de placircntulas
in vitro (LEE et al 1995)
Por outro lado o maior nuacutemero de folhas de
Agapantho foi obtido na concentraccedilatildeo de 30 gL-1 de
sacarose (Tabela 2) A intensidade luminosa natildeo teve
influecircncia sobre essa variaacutevel Contrastando com os dados
obtidos no presente trabalho Konow amp Wang (2001)
determinaram que a intensidade luminosa de 40 mmolm-
2s-1 promoveu um aumento no nuacutemero de folhas de
Phalaenopsis enquanto placircntulas que se desenvolveram
em ambiente com intensidade de 10 e 80 molm-2s-1
apresentaram um menor nuacutemero de folhas Segundo os
autores o aumento no nuacutemero de folhas pode indicar que
TABELA 2 ndash Tamanho de brotaccedilotildees e nuacutemero de folhasbrotaccedilatildeo de placircntulas de Agapanthus umbellatus var minormultiplicadas em biorreator de imersatildeo temporaacuteria suplementado com diferentes concentraccedilotildees de sacarose eintensidades luminosas no periacuteodo de 60 dias
Meacutedias seguidas pela mesma letra nas linhas e colunas natildeo diferem significativamente pelo teste de Duncan a 5 deprobabilidade
houve estiacutemulo da fotossiacutentese in vitro Outro efeito
observado em placircntulas de Agapantho neste trabalho foi
a presenccedila de folhas mais claras e vitrificadas (folhas com
aspecto viacutetreo pouco desenvolvidas aparecircncia suculenta
e translucente) na grande maioria das placircntulas
multiplicadas em meio suplementado com 15 gL-1 de
sacarose e intensidade luminosa de 70 mmolm-2s-1 Estes
resultados podem indicar que o aparato fotossinteacutetico natildeo
tenha se desenvolvido adequadamente (CAPPELADES et
al 1991 DESJARDINS et al 1995) afetando a acumulaccedilatildeo
de massa fresca Possivelmente a presenccedila de folhas
vitrificadas foi influenciada pelo uso de meio liacutequido pois
de acordo com George (1996) e Etienne amp Berthouly (2002)
o meio liacutequido favorece a produccedilatildeo de folhas vitrificadas
quando comparado com meio geleificado No entanto
observou-se que para os demais tratamentos em
concentraccedilotildees maiores de sacarose (30 e 45 gL-1) a
presenccedila de brotaccedilotildees vitrificadas foi rara ou nenhuma
Neste sentido o desenvolvimento de brotaccedilotildees com esta
caracteriacutestica pode estar relacionado agrave concentraccedilatildeo de
sacarose no meio e agrave diferenccedila osmoacutetica entre as brotaccedilotildees
e o meio de cultura (DEBERGH et al 1981) Este resultado
tambeacutem foi obtido na multiplicaccedilatildeo de rosas na qual onde
a reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo de sacarose para 10 gL-1 na
fase de multiplicaccedilatildeo promoveu um aumento significativo
na presenccedila de plantas vitrificadas e quando submetidas
Tamanho de brotaccedilotildees (cm)
Nuacutemero de folhasbrotaccedilatildeo
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1) Concentraccedilatildeo Sacarose
(gL-1) 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia
0 000 000 000 d 000 000 000 d 15 275 396 335 a 407 408 408 b 30 295 295 295 b 414 404 409 a 45 245 220 233 c 400 408 404 c
Meacutedia 204 b 228 a 276 a 275 a
CV 2595 467
FOGACcedilA L A et al84
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
a concentraccedilotildees de 30 e 40 gL-1 a presenccedila de placircntulas
vitrificadas foi rara (LANGFORD amp WAINWRIGHT 1987)
Outro fator que possivelmente pode ter
influenciado a presenccedila de placircntulas vitrificadas in vitro
foi a baixa intensidade luminosa (GEORGE 1996) pois
placircntulas de Agapantho multiplicadas sob intensidade de
140 mmolm-2s-1 e 15 gL-1 de sacarose natildeo apresentaram
caracteriacutestica de vitrificaccedilatildeo Estes dados indicaram que o
aumento da intensidade luminosa evitou a presenccedila de
plantas vitrificadas aleacutem de proporcionar um incremento e
estiacutemulo na atividade fotossinteacutetica (GEORGE 1996)
A produccedilatildeo de massa fresca e seca das brotaccedilotildees
foram influenciadas pela interaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo
de sacarose e a intensidade luminosa (Tabela 3) Placircntulas
de Agapantho multiplicadas sob intensidade de 70
mmolm-2s-1 apresentaram a maior produccedilatildeo de massa
fresca e seca dentro das concentraccedilotildees de 30 gL-1 Nas
concentraccedilotildees de 15 e 45 gL-1 os resultados obtidos
foram inferiores (Tabela 3) Por outro lado quando se
aumentou a intensidade para 140 mmolm-2s-1 a melhor
produccedilatildeo de massa fresca e seca ocorreu dentro da
concentraccedilatildeo de 15 gL-1 de sacarose (Tabela 3) Verificou-
se assim que o aumento da concentraccedilatildeo de sacarose no
meio de cultura proporcionou efeitos negativos na
produccedilatildeo de massa fresca e seca quando as placircntulas
foram submetidas agrave intensidade luminosa mais elevada
TABELA 3 ndash Massa fresca e seca de brotaccedilotildees de Agapanthus umbellatus var minor multiplicadas em biorreator de imersatildeotemporaacuteria suplementado com diferentes concentraccedilotildees de sacarose e intensidades luminosas no periacuteodo de 60 dias
Tais resultados corroboram as afirmaccedilotildees feitas referentes
agrave variaacutevel nuacutemero de brotaccedilotildees em que demonstrou-se
que foi possiacutevel reduzir a concentraccedilatildeo de sacarose em
maiores intensidade luminosas confirmando o grau de
mixotrofia
Ao analisar a concentraccedilatildeo de clorofila em
folhas de Agapantho verificou-se que natildeo houve
interaccedilatildeo significativa entre as concentraccedilotildees de
sacarose e intensidade luminosa Os teores de clorofila
a b e total (Tabela 4) foram maiores nas concentraccedilotildees
de 30 gL-1 sacarose Serret et al (1995) mostraram que
o aumento da concentraccedilatildeo de accediluacutecares (30 gL-1) no
meio de cultura promoveu maior produccedilatildeo de clorofila
impedindo a fotoinibiccedilatildeo realizaccedilatildeo de fotossiacutentese e
aumento do ganho de massa em plantas de Gardecircnia
cultivadas in vitro
Em relaccedilatildeo ao efeito da intensidade luminosa natildeo
houve efeito deste fator sobre essas variaacuteveis ainda que
Economou amp Read (1987) Galzy amp Compan (1992) Vlahos
et al (1992) George (1996) tenham observado que a
intensidade luminosa eacute um fator que estaacute estreitamente
relacionado agrave siacutentese de clorofila No entanto no presente
trabalho sugere-se a menor intensidade 70 mmolm-2s-1 com
o objetivo de que natildeo ocorra um aumento na velocidade
de decomposiccedilatildeo da clorofila com intensidade mais
elevada
Meacutedias seguidas pela mesma letra minuacutescula nas colunas e maiuacutescula nas linhas natildeo diferem significativamente peloteste de Duncan a 5 de probabilidade
Massa fresca (g)
Massa seca (g)
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1) Concentraccedilatildeo
Sacarose (gL-1) 70 140 70 140
0 000 dA 00 dA 000 dA 000 dA 15 067 cB 106 aA 0069 cB 0109 aA 30 082 aA 076 bB 0085 aA 0081 bB 45 075 bA 049 cB 0078 bA 0051 cB
CV 2873 2655
Caracteriacutesticas morfofisioloacutegicas de brotaccedilotildees 85
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
TABELA 4 ndash Concentraccedilotildees de clorofila a b e total (mgg massa fresca) em folhas de Agapanthus umbellatus varminor multiplicadas em biorreator de imersatildeo temporaacuteria por um periacuteodo de 60 dias submetidas a 4 concentraccedilotildees desacarose e dois niacuteveis de intensidade luminosa
Clrofila a (mgg massa fresca)
Clrofila b (mgg massa fresca)
Clrofila total (mgg massa fresca)
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1) Concentraccedilatildeo
Sacarose (gL-1) 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia
0 000 000 000 d 000 000 000 d 000 000 000 d 15 211 248 295 c 089 076 083 c 301 325 313 c 30 502 509 505 a 200 211 205 a 703 721 710 a 45 486 420 453 b 195 179 187 b 682 633 658 b
Meacutedia 299 a 294 a 121 a 116 a 421 a 420 a
CV 740 820 850
Meacutedias seguidas pela mesma letra nas linhas e colunas natildeo diferem significativamente pelo teste de Duncan a 5 deprobabilidade
Em relaccedilatildeo aos estocircmatos atraveacutes de
observaccedilatildeo microscoacutepica foi possiacutevel verificar que o
Agapantho possui folhas com caracteriacutest ica
anfiestomaacutetica caracterizada pela presenccedila de
estocircmatos em ambas as faces (face abaxial e adaxial)
Esta caracteriacutestica tem sido considerada como um
mecanismo adaptativo para maximizar a condutacircncia
de CO2 quando luz e aacutegua satildeo fatores limitantes
(KRAMER 1969)
Atraveacutes da anaacutelise estatiacutestica para densidade
estomaacutetica da face adaxial verificou-se que natildeo houve
interaccedilatildeo entre os fatores sacarose e intensidade
luminosa havendo portanto efeito isolado dos fatores A
maior densidade estomaacutetica da face abaxial foi obtida na
concentraccedilatildeo de 45 gL-1 (Tabela 5) Natildeo houve efeito da
intensidade luminosa para essa variaacutevel Por outro lado
a maior densidade estomaacutetica na face adaxial foi obtida
na concentraccedilatildeo de 45 gL-1 de sacarose e 140 mmolm-2s-1
de intensidade luminosa (Tabela 5) verificando a
influecircncia positiva da intensidade luminosa para essa
variaacutevel
As folhas de placircntulas multiplicadas na
concentraccedilatildeo de 15 gL-1 de sacarose apresentaram menor
densidade estomaacutetica em ambas as faces (Tabela 5) com
formato anormal largos e salientes caracteriacutesticas estas
natildeo desejaacuteveis pois segundo Preece amp Sutter (1991)
uma alteraccedilatildeo a niacutevel estrutural eou morfoloacutegico podem
impedir o funcionamento do aparelho estomaacutetico e grande
parte dos estocircmatos assim formados satildeo incapazes de se
fechar
Possivelmente este resultado se deve agraves
caracteriacutesticas de vitrificaccedilatildeo que as folhas do
tratamento 15 gL-1 de sacarose e 70 mmol m-2s-1 de
intensidade luminosa apresentaram (BLANKE amp
BELCHERL 1989) e a falta de energia armazenada no
explante com a falta de carbono que eacute proveniente da
sacarose adicionada ao meio de cultura (DESJARDINS
et al 1995) Estes resultados corroboram os obtidos
por Vintildea et al (2001) que demonstraram que folhas
vitrificadas de abacateiro apresentaram estocircmatos
grandes com saliecircncia ceacutelulas subsidiaacuterias assimeacutetricas
e deformadas e seu ostiacuteolo completamente aberto Tal
anomalia pode ser atribuiacuteda agrave perda da elasticidade das
paredes das ceacutelulas-guarda o que impediria o seu
movimento de abertura e fechamento que
consequumlentemente afeta o desenvolvimento das
placircntulas ao serem transferidas para condiccedilotildees ex vitro
atraveacutes da excessiva perda de aacutegua
FOGACcedilA L A et al86
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
TABELA 5 ndash Densidade estocircmatica (estocircmatosmm2) da face adaxial e abaxial de folhas de Agapanthus umbellatus varminor multiplicadas em biorreator de imersatildeo temporaacuteria suplementado com diferentes concentraccedilotildees de sacarose eintensidade luminosa por um periacuteodo de 60 dias
Densidade estomaacutetica (estocircmatosmm2) Epiderme da face Adaxial Epiderme da face Abaxial
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1)
Concentraccedilatildeo Sacarose(gL1) 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia
0 000 000 000 d 000 000 000 d 15 2587 3026 2802 c 3408 4752 4053 c 30 6524 5628 6064 b 9977 8584 9268 b 45 5412 7016 6188 a 8809 10807 9783 a
Meacutedia 2856 b 3089 a 4256 a 4705 a CV 1474 1206
Meacutedias seguidas pela mesma letra nas linhas e colunas natildeo diferem significativamente pelo teste de Duncan a 5 deprobabilidade
CONCLUSAtildeO
Condiccedilotildees ambientais tais como intensidade
luminosa e concentraccedilatildeo de sacarose adicionada ao meio
de cultura influenciaram no desenvolvimento e
crescimento das placircntulas de Agapanthus umbellatus
var minor quando multiplicadas em meio liacutequido no BIT
Placircntulas de Agapantho foram incapazes de se
desenvolver em meio sem sacarose sendo portanto
necessaacuteria a adiccedilatildeo de uma fonte de carbono visto que a
espeacutecie em estudo apresentou uma taxa de fotossiacutentese
incapaz de assegurar um balanccedilo positivo em carbono
Houve uma grande variaccedilatildeo nas respostas obtidas
no entanto fazendo uma avaliaccedilatildeo em conjunto das
variaacuteveis recomenda-se 30 gL-1 de sacarose e intensidade
luminosa de 70 mmolm-2s-1 No entanto deve-se ressaltar
que estudos mais aprofundados devem ser conduzidos
para verificar o efeito destas combinaccedilotildees sobre o
desempenho de placircntulas durante a fase de aclimatizaccedilatildeo
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SOUZA G de F M V e et al88
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
CAPACIDADE DE REGENERACcedilAtildeO IN VITRO DE TOMATEIROCULTIVAR SANTA CLARA
IN VITRO REGENERATION CAPACITY OF TOMATOPLANT CULTIVAR SANTA CLARA
GLAUCIA DE FATIMA MOREIRA VIEIRA E SOUZA1 JOSEacute MAGNO QUEIROZ LUZ2 ALCIONE SILVA ARRUDA3DENISE GARCIA SANTANA2 MARIANA DE SOUZA E SILVA DA COSTA TEIXEIRA4
LUCIANA LONDE5 ADELAIDE SIQUEIRA SILVA6 ELISAcircNGELA RODRIGUES FIGUEIRA7
1Mestranda em Fitotecnia ndash UFU ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash gfmvsyahoocombr2Professor Dr Instituto de Ciecircncias Agraacuterias ndash UFUICIAG ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash jmagnoumuaramaufubr3Dra em Geneacutetica e Bioquiacutemica Professora contratada da UEG ndash Unidade Universitaacuteria de Ipameri ndash Rodovia GO 330 Km 24 ndash Anel Viaacuterio SN ndash 75780-000 ndash Ipameri GO ndash asarrudahotmailcom4Engenheira Agrocircnoma ndash UFU ndash Conab Sede - SGAS 901 Bloco ldquoArdquo Lote 69 - Asa Sul ndash 70390-010 ndash Brasiacutelia DF ndash marisouza81yahoocombr5Dra em Geneacutetica e Bioquiacutemica ndash IGBUFU ndash Av Paraacute 1720 ndash Campus Umuarama ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash llondebolcombr6Mestranda em AgronomiaFitotecnia ndash UFUICIAG ndash Bolsista FAPEMIG ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash adelaidebioyahoocombr7Mestre em AgronomiaFitotecnia ndash UFUICIAG ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash Elis_figueirayahoocombr
RESUMOA cultivar de tomateiro Santa Clara (Lycopersicon
esculentum Mill) foi avaliada quanto ao seu potencial deregeneraccedilatildeo in vitro a partir de trecircs tipos de explantes e trecircsmeios de cultura seguidos de trecircs repicagens Os explantes foramcotileacutedone decapitado cotileacutedone fendido e cotileacutedone aparadonas extremidades Os meios de cultura foram MI macro emicronutrientes do MS vitaminas B5 de Gamborg et al (1968)suplementado com 30 gL de sacarose e de 8 gL de aacutegar pH 58MII meio MI suplementado com 1 mgL de BAP e 30 gL deglicose MIII meio MI suplementado com 25 mgL de BAP e02 mgL de AIA Para as repicagens foi utilizado o meio MIsuplementado com 05 mgL 08 mgL e 10 mgL de BAP paraa primeira segunda e terceira repicagens respectivamente Noenraizamento foi usado o meio MI suplementado com 05 mgL de AIA e as placircntulas enraizadas foram transferidas parasubstrato comercial Plantimax esterilizado e aclimatadas emlaboratoacuterio A maior induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo tanto de calosquanto de brotos foi observada nos meacutetodos cotileacutedone fendidoe cotileacutedone aparado quando colocados no meio MIII no entantoa induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo foi mais raacutepida quando usado cotileacutedonedecapitado indicando um alto potencial de organogecircneseespontacircnea sendo que o meio MI foi o melhor Os resultadosobtidos com as diferentes concentraccedilotildees de BAP nos trecircs ciclosde repicagem natildeo diferiram entre si e 82 das plantas enraizadasaclimataram-se com sucesso
Termos para indexaccedilatildeo Lycopersicon esculentummelhoramento do tomateiro cultura de tecidos
ABSTRACTThe tomato plant cultivar lsquoSanta Clararsquo (Lycopersicon
esculentum Mill) was evaluated as for its in vitro potential ofregeneration using three types of explants and three culture media
following three pricking-outs The explants were as followsdecapitated cotyledon split cotyledon and rim-trimmedcotyledon The culture media were MI MS macro andmicronutrients vitamins B5 of Gamborg et al (1968)supplemented with 30gL sucrose and 8gL agar pH 58 MIImedium MI supplemented with 1 mgL BAP and 30 gL glucoseMIII medium MI supplemented with 25 mgL BAP and 02mgL IAA For the pricking-outs the media MI wassupplemented with 05 mgL 08 mgL and 10 mgL BAP forthe first second and third pricking out respectively As forrooting the MI medium was supplemented with 05 mgL IAAand the rooted seedlings were transplanted to the sterilizedcommercial substrate Plantimax and then acclimatized inlaboratory Higher callus induction and sprout regeneration wasobserved for the methods of split and rim-trimmed cotyledonplaced into medium MIII Nevertheless the induction forregeneration was much faster when the decapitated cotyledonmethod was used indicating a high potential of spontaneousorganogenesis in which the media MI was the best The resultsobtained with the different concentrations of BAP in the threecycles of pricking-out did not differ among themselves and 82of the rooted plants were acclimatized successfully
Index terms Lycopersicon esculentum tomato breeding tissueculture
INTRODUCcedilAtildeO
O tomate pertence ao gecircnero Lycopersicon e a
espeacutecie cultivada cosmopolita eacute botanicamente
denominada de Lycopersicon esculentum (FILGUEIRA
2000) As cultivares atualmente plantadas podem ser
(Recebido em 03 de outubro de 2003 e aprovado em 04 de setembro de 2006)
Capacidade de regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro 89
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
reunidas em cinco grupos Santa Cruz Salada Cereja
Italiano Agroindustrial No presente trabalho foi utilizada
a cultivar Santa Clara do grupo Santa Cruz pois ela continua
sendo a cultivar mais plantada no Brasil
A tomaticultura estaacute associada a seacuterios problemas
fitossanitaacuterios sobretudo viroses aleacutem do ataque de
fungos bacteacuterias e insetos praga Cria-se com isto a
necessidade de se pesquisar novas alternativas ou
obtenccedilatildeo de novos genoacutetipos com resistecircncia muacuteltipla a
doenccedilas e pragas entre essas os estudos sobre
regeneraccedilatildeo e transformaccedilatildeo geneacutetica (FAacuteRI et al 2000)
A engenharia geneacutetica abriu uma nova perspectiva
para o melhoramento geneacutetico do tomateiro a partir do
final da deacutecada de 80 (WIJBRANDI amp BOTH 1993)
visando aumentar a produtividade e melhorar a qualidade
por meio da obtenccedilatildeo de resistecircncia a estresses bioacuteticos e
abioacuteticos A cultura de tecidos destaca-se durante o
processo de realizaccedilatildeo das teacutecnicas de transformaccedilatildeo
geneacutetica pois eacute necessaacuterio induzir gemas vegetativas e
em seguida regenerar brotos alongados e plantas
completas a partir de ceacutelulas ou tecidos geneticamente
modificados
Para a otimizaccedilatildeo de protocolos para o tomateiro
alguns fatores que afetam a eficiecircncia de transformaccedilatildeo
tecircm sido examinados dentre eles o tamanho do explante e
o tipo de explante hipocoacutetilo ou cotileacutedone (FRARY amp
EARLE 1996)
No Brasil haacute poucos trabalhos na aacuterea de
regeneraccedilatildeo in vitro e de transformaccedilatildeo geneacutetica de
cultivares de tomateiro e pouco se conhece sobre a
capacidade de regeneraccedilatildeo das principais cultivares
brasileiras (FAacuteRI et al 2000) Alguns pesquisadores como
Faria amp Illg (1993) analisaram a regeneraccedilatildeo in vitro de
algumas espeacutecies e cultivares de tomateiro observando
uma baixa capacidade morfogecircnica das cultivares se
comparadas com a espeacutecie selvagem Lycopersicon
pimpinellifolium (L) P Miller
Com este trabalho objetivou-se teve como objetivo
avaliar o potencial de regeneraccedilatildeo in vitro da cultivar Santa
Clara do grupo Santa Cruz a partir de diferentes tipos de
explantes e meios de cultura criando e otimizando
protocolos para sua regeneraccedilatildeo in vitro
MATERIAL E MEacuteTODOS
No Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos Vegetais do
Instituto de Geneacutetica e Bioquiacutemica da Universidade Federal
de Uberlacircndia foi avaliada a capacidade de regeneraccedilatildeo
in vitro do tomateiro cultivar Santa Clara usando trecircs
tipos de explantes e trecircs meios de cultura seguido de trecircs
repicagens O experimento foi realizado em delineamento
em blocos casualizados em esquema fatorial (3x3) com trecircs
repeticcedilotildees As plantas regeneradas foram enraizadas e
aclimatadas em laboratoacuterio
Sementes comerciais da cultivar Santa Clara apoacutes
serem desinfestadas por um minuto em aacutelcool etiacutelico a 96
e em hipoclorito de soacutedio comercial a 20 (vv) com duas
gotas de detergente comercial durante 25 minutos foram
enxaguumladas 5 vezes em aacutegua bidestilada esterilizada e
inoculadas em meio MS 100 (MURASHIGE amp SKOOG
1962) solidificado com 7 g L-1 de aacutegarndashaacutegar por sem
reguladores de crescimento O meio foi distribuiacutedo em
frascos de vidro esteacutereis utilizados para cultura de tecidos
com 30 mL de meio MS As culturas foram mantidas em
sala de crescimento com temperatura de 25+2 ordmC
fotoperiacuteodo de 16 horas e luminosidade de 50 mmol m-2s-
1 As placircntulas obtidas aos 14 15 e 20 dias apoacutes a semeadura
foram usadas como fonte de explantes para os blocos 1 2
e 3 respectivamente Os explantes foram inoculados de
acordo com os meacutetodos descritos a seguir em placas de
Petri devidamente esterilizadas e autoclavadas contendo
30 mL de meio de cultura com 16 unidades por tipo de
explante por meio de cultura utilizado Cada 16 explantes
constituiu uma parcela do experimento sendo composta
por duas placas de Petri cada uma com 8 explantes
Os tipos de explantes foram os seguintes
A - que consistiu na decapitaccedilatildeo de placircntulas onde
essa decapitaccedilatildeo ocorreu diretamente abaixo do noacute do
cotileacutedone ficando o hipocoacutetilo com as radiacuteculas
SOUZA G de F M V e et al90
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
B - meacutetodo de cotileacutedones fendidos os cotileacutedones
foram fendidos ao longo da nervura central da extremidade
ateacute sua metade de acordo com o protocolo de Faacuteri et al
(2000)
C - cotileacutedones foram aparados e seguiu-se o
protocolo descrito por Redenbaugh et al (1992) Os
cotileacutedones aparados nas extremidades distal e proximal
(aacutepice e peciacuteolo) foram inoculados com a face abaxial em
contato com o meio
Foram realizadas trecircs repicagens para alongar os
brotos Cerca de 30 dias apoacutes a inoculaccedilatildeo dos explantes
foi realizada a primeira repicagem Os intervalos entre as
repicagens foram em torno de 5 semanas
Os tratamentos consistiram na inoculaccedilatildeo dos trecircs
tipos de explantes descritos nos trecircs meios de cultura
abaixo com trecircs repeticcedilotildees por tratamento
Meio MI macro e micronutrientes de Murashige amp
Skoog (1962) e vitaminas B5 de Gamborg et al (1968)
suplementado com 30 gL de sacarose e de 8 gL de aacutegar-
aacutegar pH 58 meio MII meio de cultura MI suplementado
com 1 mgL de zeatina e 30 gL de glicose conforme
McCormick (1991) meio MIII meio de cultura MI
suplementado com 25 mgL de BAP e 02 mgL de AIA
segundo Rhim et al (1995)
Para as repicagens foi utilizado o meio MI
suplementado com 05 mgL 08 mgL e 10 mgL de BAP
para a primeira segunda e terceira repicagens
respectivamente
Para enraizamento foi usado o meio MI
suplementado com 05 mgL de AIA As placircntulas
enraizadas foram transferidas para substrato comercial
Plantimax esterilizado e aclimatadas em laboratoacuterio
Os brotos com 2 cm de comprimento foram
transferidos para o meio de enraizamento citado e
permaneciam nesse meio durante 15 dias Apoacutes esse periacuteodo
os brotos eram transplantados para substrato comercial
Plantimax autoclavado irrigados com aacutegua uma a duas
vezes por dia ateacute a aclimataccedilatildeo A aclimataccedilatildeo ocorreu em
torno de 20 dias em condiccedilotildees de laboratoacuterio
Avaliou-se a induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo o
alongamento de brotos e o enraizamento e aclimataccedilatildeo
das plantas regeneradas
Os dados de contagem foram transformados para
50x As anaacutelises de normalidade e homogeneidade
foram realizadas pelo software Prophet Os dados obtidos
foram submetidos agrave anaacutelise de variacircncia e as meacutedias
comparadas pelo teste de Tukey ao niacutevel de 5 de
probabilidade pelo software SANEST (ZONTA amp
MACHADO 1989)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Para cotileacutedone decapitado ocorreu um iniacutecio de
formaccedilatildeo de calosidade por volta de 10 dias apoacutes inoculaccedilatildeo
e o surgimento de brotos ocorreu cerca de 12 dias depois da
inoculaccedilatildeo sem a formaccedilatildeo de calos propriamente ditos A
induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo foi mais raacutepida quando usado esse
tipo de explante indicando um alto potencial de
organogecircnese espontacircnea sendo que o meio MI foi o melhor
para a induccedilatildeo e nuacutemero total de brotos (Tabela 1)
No cotileacutedone fendido o iniacutecio de formaccedilatildeo de
calosidade aconteceu com aproximadamente 10 dias apoacutes
inoculaccedilatildeo Por volta de 18 dias depois da inoculaccedilatildeo
iniciou-se o surgimento de brotos e jaacute existiam calos
formados Para esse tipo de explante nos meios MI e MII
ocorreu apenas a formaccedilatildeo de calos enquanto no meio
MIII ocorreu a formaccedilatildeo de calos e calos com brotos sendo
alto o nuacutemero total de brotos (Tabela 1) Supotildee-se que a
maior superfiacutecie de corte tenha influecircncia significativa
sobre esse fenocircmeno onde a maior superfiacutecie de corte do
cotileacutedone resulta em maior capacidade de regeneraccedilatildeo
(FAacuteRI et al 1995b)
No cotileacutedone aparado com cerca de 10 dias apoacutes
inoculaccedilatildeo ocorreu o iniacutecio de formaccedilatildeo de calos e 20 dias
depois da inoculaccedilatildeo ocorreu o surgimento de brotos e jaacute
existiam calos formados Para esse tipo de explante nos
meios MI MII e MIII ocorreu a formaccedilatildeo de calos no
entanto apenas no meio MIII ocorreu a formaccedilatildeo de calos
com brotos (Tabela 1)
Capacidade de regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro 91
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
TABELA 1 ndash Frequumlecircncia de induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo in vitro da cultivar Santa Clara do grupo Santa Cruz UberlacircndiaUFU 2001
Dados seguidos de mesma letra nas colunas (abc) e nas linhas (AB) natildeo diferem entre si a 5 de probabilidade peloteste de TukeyA diferenccedila entre o nordm de explantes de um meacutetodo para outro eacute devida a parcelas (ou parte delas) perdidas
Nos trecircs ciclos de repicagens a capacidade de
alongamento dos brotos foi igual indicando que as
concentraccedilotildees de BAP natildeo diferiram estatisticamente entre
si dentro de cada tipo de explante Em relaccedilatildeo ao nuacutemero
de brotos alongados na primeira e terceira repicagens o
cotileacutedone decapitado apresentou maior nuacutemero jaacute na
segunda repicagem natildeo houve diferenccedila entre os tipos de
explantes (Tabela 2)
As plantas apoacutes serem enraizadas foram
transferidas para aclimataccedilatildeo obtendo-se 82 de plantas
aclimatadas Cerca de 20 dias apoacutes transplantio para o
substrato as plantas jaacute estavam aclimatadas
Apoacutes a terceira repicagem ainda existiam cerca de
334 brotos para serem novamente repicados e 51 brotos
prontos para serem enraizados perfazendo um total geral
de 549 brotos obtidos ateacute a fase estudada
Para o tipo de explante cotileacutedone decapitado foram
obtidos 181 brotos equivalentes a 174 brotos por explante
Para o explante cotileacutedone fendido o nuacutemero de brotos por
Tipos de Explantes Variaacuteveis Meios Cotileacutedone decapitado Cotileacutedone fendido Cotileacutedone aparado
I 396 aA 050 cB 142 bB II 000 bB 632 bA 672 aA Nordm de explantes
com calos III 000 bB 1599 aA 597 bB I 1095 aA 000 bB 000bB II 050 bA 000 bA 000 bA Nordm de explantes
com brotos III 130 bB 1217 aA 850 aA I 396 aA 050 cB 169 cB II 000 bB 632 bA 645 bA Nordm total de
calos III 000 bB 3630 aA 2655 aA I 1850 aA 000 bB 000 bB II 050 bA 000 bA 000 bA Nordm total de
brotos III 130 bB 2760 aA 2934 aA I 48 32 40 II 32 40 32 Nordm de
explantes III 24 40 48 Total de explantes 104 112 120
explante foi igual a 145 e para o cotileacutedone aparado foram
obtidos 170 brotos por explante Esses resultados foram
semelhantes aos obtidos por Faacuteri et al (2000) para as
cultivares IPA-5 e IPA-6 os quais concluiacuteram que a
utilizaccedilatildeo de cotileacutedones fendidos e cotileacutedones aparados
produziram uma regeneraccedilatildeo alta e onde a maior induccedilatildeo
foi conseguida utilizando-se um meio igual ao MIII utilizado
nesse experimento A induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo tambeacutem foi
mais raacutepida quando usado cotileacutedone decapitado indicando
um alto potencial de organogecircnese espontacircnea A cultivar
Santa Clara mostrou-se mais eficiente na formaccedilatildeo de
brotos alongados observados na primeira repicagem
enquanto as cultivares utilizadas por Faacuteri et al (2000) IPA-
5 e IPA-6 necessitaram de duas repicagens para o
alongamento dos brotos no entanto a cultivar IPA-5
mostrou-se mais eficiente na produccedilatildeo de brotos por
explante Faacuteri et al (2000) utilizaram zeatina durante os trecircs
ciclos de repicagem enquanto nesse experimento foi
utilizado BAP
SOUZA G de F M V e et al92
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
TABELA 2 ndash Capacidade de alongamento e enraizamento de brotos da cultivar Santa Clara durante os trecircs ciclos derepicagem Uberlacircndia UFU 2001
Dados seguidos de mesma letra nas colunas (ab) e nas linhas (AB) natildeo diferem entre si a 5 de probabilidade peloteste de TukeyTipos de explantes A - cotileacutedone decapitado B - cotileacutedone fendido C - cotileacutedone aparado
Os resultados aqui obtidos tambeacutem foram
semelhantes aos de Faacuteri et al (1995b) que trabalhando
com transformaccedilatildeo geneacutetica da berinjela (Solanum
melongena L) observaram que a maior superfiacutecie de corte
do cotileacutedone resultou em maior capacidade de
regeneraccedilatildeo Tambeacutem foram obtidos resultados
semelhantes aos de Nogueira et al (2001) que estudando
a regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro Santa Clara utilizando
como explantes cotileacutedones concluiacuteram que o meio com
uma combinaccedilatildeo adequada de auxina e citocinina (10 mg L-
1 de zeatina e 01 mg L-1 de AIA) promoveu uma maior
meacutedia de regeneraccedilatildeo e um maior nuacutemero meacutedio de brotaccedilotildees
por explante Costa et al (2000) trabalhando com as
cultivares IPA-5 e IPA-6 chegaram a uma conclusatildeo
semelhante onde meio suplementado com 10 mg L-1 de
zeatina + 01 mg L-1 de AIA e meio suplementado com 25
mg L-1 de BAP + 02 mg L-1 de AIA determinaram a maior
frequumlecircncia de regeneraccedilatildeo de explantes cotiledonares e
tambeacutem um maior nuacutemero de brotos alongados por explante
McCormick et al (1986) pesquisando a morfogecircnese
in vitro de L esculentum observaram que a presenccedila de 25
mg L-1 de BAP e 10 mg L-1 de AIA ou 10 mg L-1 de BAP e
02 mg L-1 de AIA produziu um maior nuacutemero de ramos por
explante a partir de explantes de cotileacutedones e hipocoacutetilos
Ohki et al (1978) utilizando segmentos de hipocoacutetilos de L
esculentum sugeriram que o efeito positivo da combinaccedilatildeo
de auxinas e citocininas na regeneraccedilatildeo in vitro pode ser
causado por uma maior capacidade das ceacutelulas dessa espeacutecie
em utilizar e adaptar-se agrave combinaccedilatildeo de auxinas e citocininas
de que somente citocininas Para os mesmos autores a
variabilidade observada nas respostas morfogecircnicas in vitro
para diferentes citocininas pode ser causada pela variaccedilatildeo
na razatildeo de degradaccedilatildeo dessas substacircncias nos tecidos
vegetais ou no meio de cultivo Segundo Caldas et al (1999)
uma alta relaccedilatildeo citocininaauxina normalmente leva a maior
induccedilatildeo de parte aeacuterea (brotos) em explantes in vitro
principalmente quando a citocinina usada eacute o BAP que induz
a formaccedilatildeo de grande nuacutemero de brotos e alta taxa de
multiplicaccedilatildeo em muitos sistemas de micropropagaccedilatildeo
Tanto no presente trabalho quanto nos trabalhos acima
citados foram utilizados meios com pelo menos uma
combinaccedilatildeo com alta relaccedilatildeo citocininaauxina e meios
contendo apenas citocinina
CONCLUSOtildeES
A maior induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo tanto de calos
quanto de brotos foi observada nos meacutetodos cotileacutedone
fendido e cotileacutedone aparado quando colocados no meio
com BAP (25 mgL) e AIA (02 mgL) (MIII) Um ciclo de
repicagem foi suficiente para obtenccedilatildeo de brotos
alongados A maior regeneraccedilatildeo de brotos alongados
ocorreu com o meacutetodo cotileacutedone decapitado
Meios M1 + 05 mgL BAP M1 + 08 mgL BAP M1 + 10 mgL BAP
Repicagem 1 Repicagem 2 Repicagem 3
M1+ 05 mgl AIA
Tipos de Explante
s
Nordm total de brotos
Nordm de brotos
alongados
Nordm total de brotos
Nordm de brotos
alongados
Nordm total de brotos
Nordm de brotos
alongados
Nordm total de placircntulas
enraizadas
Nordm total de
plantas aclimatadas
Nordm total geral de brotos
A 3117 bA 899 aA 3684 bA
866 aA 3174 bA
81 aA 80 67 181 B 536 aA 466 bA 6244 aA 633 aA 5158 aA 450 bA 41 33 163 C 3527 bA 400 bA 4368 bA
566 aA 3928 bA
312 bA 43 35 205
Total 164 135 549
Capacidade de regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro 93
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
AGRADECIMENTOS
Ao Instituto de Geneacutetica e Bioquiacutemica e ao Instituto
de Ciecircncias Agraacuterias da Universidade Federal de
Uberlacircndia pelo financiamento deste projeto e a todos
que auxiliaram direta eou indiretamente
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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SILVA A S et al94
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
INDUCcedilAtildeO DE CALOS A PARTIR DE CULTURA DE ANTERAS DECAFEEIRO (Coffea arabica L) CV CATUAIacute VERMELHO 99 E 44
CALLUS INDUCTION FROM ANTHER CULTURE OF COFFEE PLANT (Coffea arabica L) CV CATUAIacute VERMELHO 99 AND 44
ADELAIDE SIQUEIRA SILVA1 JOSEacute MAGNO QUEIROZ LUZ2 DENISE GARCIA SANTANA2 PATRIacuteCIA CRYSTIE VIEIRA MUSTAFA3 MOACIR PASQUAL4 GLAUCIA DE FATIMA MOREIRA VIEIRA E SOUZA2
1Mestranda do Curso de Agronomia ndash Universidade Federal de UberlacircndiaUFU ndash Av Engenheiro Diniz 1178 ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash adelaidebioyahoocombr2Professor Dr ndash Universidade Federal de UberlacircndiaUFU ndash Instituto de Ciecircncias Agraacuterias ndash Curso de Agronomia ndash AV Paraacute Bloco 2E SALA 14campus Umuarana ndash Caixa-Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG3Bioacuteloga Universidade Federal de UberlacircndiaUFU ndash Centro de Ciecircncias Biomeacutedicas ndash Departamento de Agronomia ndash Rua Amazonas snordm - Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos sala 2E-14 ndash Umuarama ndash 38400920 ndash Uberlandia MG ndash patriciacrystiezipmailcombr
4Doutor Departamento de Adgricultura DAG ndash Universidade Federal de Lavras UFLA ndash Campus universitaacuterio ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash mpasqualuflabr
RESUMONo Brasil o cafeacute ainda apresenta poucos progressos com
relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo da cultura de tecidos vegetais tornando-se degrande importacircncia o conhecimento sobre a atuaccedilatildeo dosreguladores de crescimento Com este trabalho avaliou-se ocomportamento de duas cultivares de Coffea arabica L CatuaiacuteVermelho LCH-2077-2-5-99 e LCH-2077-2-5-44 denominadasrespectivamente de Catuaiacute Vermelho 99 e Catuaiacute Vermelho 44quanto agrave ausecircncia e presenccedila de luz e quantificou-se a interaccedilatildeoentre os reguladores de crescimento 24-D e BAP O experimentofoi realizado no Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos Vegetais daUniversidade Federal de Uberlacircndia As anteras das cultivaresCatuaiacute Vermelho 99 e 44 foram inoculadas em meio basal MSsuplementado com quatro concentraccedilotildees de 24-D (905 181271 e 362 mM) e duas concentraccedilotildees de BAP (0 e 89 mM) napresenccedila de luz e ausecircncia de luz As avaliaccedilotildees para a oxidaccedilatildeointumescimento e calosidade foram realizadas aos 30 dias apoacutes ainoculaccedilatildeo no meio de cultura e o diacircmetro dos calos aos 45 diasApoacutes 30 dias de cultivo os calos obtidos foram classificados emfriaacuteveis esverdeados esbranquiccedilados e cinza Os resultadosmostraram que para ocorrer intumescimento das anterasformaccedilatildeo e aumento do tamanho dos calos de ambas cultivares eacutenecessaacuterio que haja interaccedilatildeo entre a auxina (24-D) e a citocinina(BAP) Dentre os tipos de calos os de coloraccedilatildeo cinza foram osque apresentaram maior frequumlecircncia para as duas cultivares
Termos para indexaccedilatildeo Melhoramento calos reguladores decrescimento cafeeiro
ABSTRACTIn Brazil coffee still presents little progress regarding
the application of plant tissue culture which turns important theunderstanding of the action of growth regulators This workevaluated the in vitro performance of two Coffea arabica Lcultivars Catuaiacute Vermelho LCH-2077-2-5-99 and LCH-2077-2-5-44 known as Catuaiacute Vermelho 99 and Catuaiacute Vermelho 44respectively in the presence and absence of light and theinteraction of 24-D and BAP The experiment was carried out at
the Plant Tissue Culture Laboratory of the Universidade Federalde Uberlacircndia Anthers from both cultivars were inoculated inMS basal medium supplemented with four concentrations of24-D (905 181 271 and 362 mM) and two concentrations ofBAP (0 or 89 mM) in the presence and absence of lightOxidation intumescences and callus formation evaluations wereobtained 30 days after inoculation and callus diameter measuredat 45 days of inoculation The observed callus was classified asfriable greenish whitish or gray The results showed that antherintumescences callus formation and growth of both cultivarsdemand the interaction between the auxin (24-D) and thecytokinin (BAP) Callus presenting gray color were the mostfrequent for both cultivars
Index terms Plant breeding callus growth regulators coffee plant
INTRODUCcedilAtildeO
O cafeeiro pertence agrave famiacutelia Rubiaceae na qual o
gecircnero Coffea abrange cerca de 60 espeacutecies sendo as mais
comuns no mercado Coffea araacutebica L e Coffea canephora
Pierre ex Froehn Os programas de melhoramento do cafeacute
demandam aproximadamente 25 anos desde a hibridaccedilatildeo
ateacute a obtenccedilatildeo de uma nova cultivar (PASQUAL et al
2002) A cultura de anteras eacute considerada uma ferramenta
importante pois possibilita a obtenccedilatildeo de linhas
homozigoacuteticas em uma uacutenica etapa (ANDRADE 1998)
acelerando drasticamente o processo de obtenccedilatildeo de novas
cultivares Sendo assim a teacutecnica de cultura de anteras
vem auxiliar no melhoramento da cultura pois permite a
obtenccedilatildeo de haploacuteides em geraccedilotildees segregantes o que
leva agrave raacutepida produccedilatildeo de plantas homozigotas por meio
(Recebido em 14 de outubro de 2003 e aprovado em 29 de outubro de 2006)
Induccedilatildeo de calos a partir de cultura 95
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
da duplicaccedilatildeo do nuacutemero de cromossomos numa uacutenica
etapa substituindo as geraccedilotildees de auto fecundaccedilatildeo
Acrescenta-se a isso o fato de os haploacuteides serem livres
dos problemas de dominacircncia e recessividade por possuir
apenas um alelo em cada loco gecircnico
No Brasil Coffea arabica ainda apresenta poucos
progressos com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo da cultura de anteras
Daiacute a importacircncia de se produzir mais conhecimentos sobre
a atuaccedilatildeo dos reguladores de crescimento na expressatildeo
androgeneacutetica de Coffea arabica identificaccedilatildeo de
genoacutetipos androgecircnicos bem como a determinaccedilatildeo de
condiccedilotildees fiacutesicas mais adequadas agrave incubaccedilatildeo de anteras
nessa espeacutecie
Nos programas de melhoramento as teacutecnicas
convencionais tecircm apresentado resultados promissores
na cultura do cafeacute no que se refere ao aumento de
produtividade e obtenccedilatildeo de novas cultivares Um fator
importante para o sucesso da cultura de anteras eacute conhecer
o estaacutedio ideal de desenvolvimento dos microacutesporos com
o intuito de se obter uma melhor resposta androgeneacutetica
utilizando microacutesporos receacutem-liberados da teacutetrade meioacutetica
ateacute no maacuteximo o estaacutedio binucleado A fase uninucleada
responde positivamente ao processo embriogecircnico porque
nesta fase os microacutesporos apresentam uma parede celular
delgada o que a torna mais receptiva aos fatores externos
Em estaacutedios mais avanccedilados da microsporogecircnese ocorre
um engrossamento da parede celular sendo esta uma
caracteriacutestica do gratildeo de poacutelen maduro do cafeacute
prejudicando o processo de regeneraccedilatildeo (ASCANIO amp
ARCIA 1994) Os autores Grando amp Moraes Fernandes
(1993) sugerem que o potencial embriogecircnico do gratildeo de
poacutelen pode ser determinado tanto no periacuteodo da meiose
quanto no periacuteodo da preacute-mitose do microacutesporo pois
nestes dois momentos o microacutesporo ainda teria
metabolicamente caracteriacutesticas esporofiacuteticas o que
permite a diferenciaccedilatildeo do gratildeo de poacutelen em embriatildeo e
posterior formaccedilatildeo de uma planta
Segundo Mantell et al (1994) satildeo possiacuteveis vaacuterios
tipos de desenvolvimento do microacutesporo in vitro sendo
que tanto o nuacutecleo generativo quanto o vegetativo pode
se dividir continuamente originando um embrioacuteide
haploacuteide ou ainda a primeira mitose produziria dois nuacutecleos
semelhantes e estes se dividiriam repetidamente resultando
na formaccedilatildeo de embrioacuteides haploacuteides
A composiccedilatildeo do meio de cultura tambeacutem eacute de
grande importacircncia para o sucesso da cultura de anteras
natildeo existindo contudo uma recomendaccedilatildeo generalizada
Na maioria das espeacutecies a androgecircnese se verifica em meios
que conteacutem sais minerais sacarose vitaminas reguladores
de crescimento e aacutegar (MORAES FERNANDES 1990) A
consistecircncia do meio normalmente eacute semi-soacutelida mas os
meios liacutequidos estatildeo sendo cada vez mais usados pois
tecircm vantagens no aumento do rendimento pela maior
obtenccedilatildeo de embriotildees e calos (PIERIK 1987) O
presente trabalho teve como objetivo aplicar a teacutecnica da
cultura de anteras em diferentes cultivares de Coffea
arabica verificando os vaacuterios fatores que influenciam a
induccedilatildeo de calos
MATERIAL E MEacuteTODOS
Experimentos de Induccedilatildeo e Regeneraccedilatildeo de Calos
Esta etapa constituiu-se de dois experimentos cada
um com uma cultivar tendo sido conduzidos no laboratoacuterio
de Cultura de Tecidos Vegetais da Universidade Federal
de Uberlacircndia em Uberlacircndia - Minas Gerais no periacuteodo
de setembro de 2002 a janeiro de 2003
Foram utilizados bototildees florais de duas cultivares
de Coffea araacutebica Catuaiacute Vermelho LCH-2077-2-5-99 e
LCH-2077-2-5-44 denominadas respectivamente de Catuaiacute
Vermelho 99 e Catuaiacute Vermelho 44 plantadas na aacuterea
experimental do Campus Umuarama dessa Universidade
Os bototildees florais foram coletados no periacuteodo de 8 agraves 9
horas da manhatilde e armazenados em placas de Petri contendo
papel de filtro umedecido em aacutegua destilada e colocados
dentro de uma caixa de isopor para evitar a desidrataccedilatildeo
ateacute serem conduzidos ao laboratoacuterio
No laboratoacuterio o comprimento dos bototildees foi
medido com o auxiacutelio de um paquiacutemetro e utilizaram-se
SILVA A S et al96
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
bototildees florais entre 45 a 60 mm de comprimento em todos
os experimentos Os bototildees foram envoltos em gaze
previamente autoclavada e desinfestados em uma soluccedilatildeo
de aacutelcool 70 por alguns segundos e por 10 minutos em
soluccedilatildeo de hipoclorito de soacutedio a 02 sob agitaccedilatildeo Em
seguida na cacircmara de fluxo laminar foram lavados 3 vezes
em aacutegua destilada e autoclavada Apoacutes este processo as
anteras foram retiradas dos bototildees com o auxiacutelio de uma
lupa uma pinccedila fina e bisturi nordm 10 sendo os uacuteltimos
flambados para cada botatildeo tomando-se o cuidado para
natildeo ferir as anteras Logo apoacutes as anteras foram imersas
por 1 segundo em soluccedilatildeo de aacutecido ascoacuterbico na
concentraccedilatildeo de 600 mgL-1 hipoclorito de soacutedio 02 e
aacutegua destilada e autoclavada respectivamente
Apoacutes este processo as anteras foram inoculadas
em tubo de ensaio contendo 20 mL do meio MS
(MURASHIGE amp SKOOG 1962) suplementado com aacutecido
24-diclorofenoxiaceacutetico (24-D) e 6- benzilaminopurina
(BAP) em diferentes concentraccedilotildees com pH ajustado para
58 Este meio foi esterilizado em autoclave vertical agrave
temperatura de 121deg C sob pressatildeo de 1 atm por 20 minutos
O delineamento experimental utilizado foi o de
blocos casualizados com 10 repeticcedilotildees em esquema fatorial
4 x 2 x 2 sendo que os fatores foram compostos de quatro
concentraccedilotildees de 24-D (905 181 271 362 mM) duas
concentraccedilotildees de BAP (0 e 89 mM) perfazendo oito
tratamentos incubados na ausecircncia ou presenccedila de luz
em sala de crescimento com temperatura de 25 plusmn 2degC e 16
horas de fotoperiacuteodo Nos dois experimentos cada
tratamento teve 10 repeticcedilotildees sendo um tubo com 10
anteras considerado uma repeticcedilatildeo
Aos 30 dias apoacutes a inoculaccedilatildeo das anteras foram
avaliadas as porcentagens de oxidaccedilatildeo de intumescimento
e de formaccedilatildeo de calos (calosidade) e aos 45 dias foi medido
o diacircmetro dos calos
Os calos obtidos das duas cultivares apoacutes 45 dias
de inoculaccedilatildeo das anteras foram transferidos para o meio
MS suplementado com 30 gL-1 de sacarose 6gL-1 de agar e
de 24-DBAP nas seguintes concentraccedilotildees de 1810 181
2 2710 e 3620 mM com pH ajustado para 58 associando
a ausecircncia e presenccedila de luz
Apoacutes a permanecircncia destes calos no meio de cultura
por 30 dias aqueles provenientes da cultivar Catuaiacute
Vermelho 99 incubados na presenccedila de luz foram
transferidos para o meio de cultura contendo 271 mM de
24-D enquanto que aqueles incubados na ausecircncia de
luz foram transferidos para meio contendo 362 mM de 24-
D Jaacute os calos da cultivar Catuaiacute Vermelho 44 incubados
na presenccedila de luz foram transferidos para meio contendo
181 mM de 24-D e 89 mM de BAP e os incubados na
ausecircncia de luz transferidos para o meio contendo 181
mM de 24-D
Apoacutes 30 dias neste tratamento foram avaliadas as
caracteriacutesticas referentes ao tipo de calo (friaacuteveis
esverdeados esbranquiccedilados e cinza)
Os dados obtidos foram testados quanto agrave
normalidade e agrave homogeneidade necessitando de
transformaccedilatildeo em arco seno para os dados em
porcentagem e raiz quadrada de (x + 05) para os dados
referentes ao diacircmetro dos calos
RESULTADOS
Interaccedilatildeo entre os Reguladores de Crescimento e oFotoperiacuteodo
Para a cultivar Catuaiacute 99 em todas as concentraccedilotildees
de 24-D e independentemente da concentraccedilatildeo de BAP a
oxidaccedilatildeo foi menor na ausecircncia de luz diferindo
estatisticamente da fase em que se tinha presenccedila de luz
No entanto nos calos cultivados nas concentraccedilotildees de
905 e 271 mM de 24-D e 89 mM de BAP na ausecircncia de
luz foi observado um aumento significativo na oxidaccedilatildeo
das anteras o mesmo acontecendo na concentraccedilatildeo de
271 mM de 24-D na presenccedila de luz No entanto resultado
inverso foi observado para a concentraccedilatildeo de 362 mM de
24-D (Tabela 1)
Os resultados do percentual de intumescimento
variaram bastante em funccedilatildeo da luminosidade e
reguladores de crescimento (Tabela 1) Na presenccedila do
Induccedilatildeo de calos a partir de cultura 97
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
BAP e concentraccedilatildeo 89 mM de 24-D tanto na presenccedila
ou ausecircncia de luz o intumescimento dos calos natildeo diferiu
significativamente Jaacute na concentraccedilatildeo de 181 mM de 24-
D na presenccedila de luz se mostrou melhor promovendo um
aumento significativo do intumescimento das anteras
Quanto agraves concentraccedilotildees de 271 e 362 mM de 24-D
cultivados na presenccedila de luz se mostrou melhor ao
intumescimento quando comparado agravequeles cultivados na
ausecircncia de luz (Figura 1)
A presenccedila de calos aumentou significativamente
com a incubaccedilatildeo das anteras na ausecircncia de luz e na
TABELA 1 ndash Meacutedias do nuacutemero de anteras oxidadas intumescidas e com calos e diacircmetro dos calos (mm) em funccedilatildeode diferentes concentraccedilotildees de 24-D e ausecircncia ou presenccedila de BAP em duas condiccedilotildees de luminosidade (presenccedilaou ausecircncia de luz) para anteras do genoacutetipo cv 99
Luminosidade1
Oxidaccedilatildeo () Intumescimento ()
Calosidade () Diacircmetro (mm) 24-D M
BAP M luz Escuro Luz Escuro luz Escuro luz Escuro 0 980 b A 395 a A 000b B 434 a A 000 b A 740 a A 000 b A 309 a A 905
89 999 b A 823 a B 398 a A 327 a B 007 b A 615 a A 000 b A 300 a A 0 999 b A 524 a A 000 b B 447 a A 007 b A 750 a A 000 b B 368 a A
181 89 935 b A 511 a A 614 a A 407 b A 030 b A 720 a A 300 b A 387 a A
0 745 b A 000 a A 534 a A 000 b B 530 a A 000 b B 318 a B 000 b B 271
89 914 b B 590 a B 625 a A 634 a A 708 a A 809 a A 377 a A 298 b A 0 999 b B 440 a A 607 a A 492 b A 097 b B 815 a A 300 a B 277 a A
362 89 813 b A 426 a A 493 a B 527 a A 378 b A 758 a A 398 a A 298 b A
1Meacutedias seguidas por letras diferentes minuacutesculas na linha e maiuacutesculas na coluna dentro de cada concentraccedilatildeo de 2-4-D diferem entre si pelo teste de Tuckey a significacircncia de 5
concentraccedilatildeo de 271 mM de 24-D nas demais
concentraccedilotildees de 24-D independente da concentraccedilatildeo
do BAP a incubaccedilatildeo na ausecircncia de luz apresentou
meacutedias de calosidade significativamente maiores (Figura
2) A presenccedila do BAP promoveu aumento significativo
na calosidade das anteras na concentraccedilatildeo 271 mM de
24-D na ausecircncia de luz e na concentraccedilatildeo de 362 mM
de 24-D na presenccedila de luz Nas demais concentraccedilotildees
natildeo houve diferenccedila significativa entre presenccedila ou
ausecircncia de BAP tanto na ausecircncia ou presenccedila de luz
(Tabela 1)
FIGURA 1 ndash Anteras da cv Catuaiacute Vermelho 99 naconcentraccedilatildeo de 181 M de 24-D na presenccedila de luz
FIGURA 2 ndash Calos de anteras incubadas na ausecircncia deluz e na concentraccedilatildeo de 271 M de 24-D
SILVA A S et al98
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
Quanto ao diacircmetro nas concentraccedilotildees 905 e 181 M
de 24-D a ausecircncia de luz promoveu aumento significativo
no diacircmetro dos calos diferindo-se estatisticamente do
tratamento na presenccedila de luz Somente para a concentraccedilatildeo
de 271 mM de 24-D na ausecircncia do BAP natildeo houve diferenccedila
significativa para a caracteriacutestica independentemente do
fotoperiacuteodo Nas demais concentraccedilotildees de 24-D o tratamento
na presenccedila de luz promoveu um aumento significativo no
diacircmetro dos calos No tratamento em que houve a associaccedilatildeo
da presenccedila de luz e de BAP natildeo diferiu estatisticamente do
tratamento em que houve a ausecircncia de BAP quando a
concentraccedilatildeo de 24-D foi de 905 mM nos demais
proporcionou aumento significativo no diacircmetro dos calos
Para o tratamento na ausecircncia de luz apenas na concentraccedilatildeo
de 271 mM de 24-D a ausecircncia de BAP promoveu diminuiccedilatildeo
significativa no diacircmetro de calos Nas demais concentraccedilotildees
natildeo houve diferenccedila significativa entre presenccedila ou ausecircncia
de BAP (Tabela 1)
Para as variaacuteveis intumescimento e calosidade da
cultivar cv 44 a interaccedilatildeo entre 24-D e BAP natildeo diferiram
estatisticamente quanto presenccedila e ausecircncia de luz nas
concentraccedilotildees 905 e 362 mM de 24-D e que tambeacutem natildeo
difere para o diacircmetro na concentraccedilatildeo de 181 mM de 24-
D Jaacute na concentraccedilatildeo 271 mM de 24-D haacute uma semelhanccedila
quanto ao intumescimento calosidade e diacircmetro que
diferem das demais concentraccedilotildees natildeo apresentando
portanto uma boa interaccedilatildeo
A melhor interaccedilatildeo para intumescimento calosidade
e diacircmetro encontra-se respectivamente na concentraccedilatildeo
905 mM de 24-D na presenccedila de luz na concentraccedilatildeo 181
mM de 24-D na ausecircncia de luz e na concentraccedilatildeo 905
mM de 24-D na ausecircncia de luz Jaacute as piores interaccedilotildees
estatildeo na concentraccedilatildeo 271 mM de 24-D na luz tanto para
o intumescimento quanto para o diacircmetro analisados na
Tabela 2
De acordo com a Tabela 2 observou-se que os
melhores resultados ou seja as interaccedilotildees independem
da presenccedila ou ausecircncia de BAP Na Tabela 3 notou-se
uma maior oxidaccedilatildeo das anteras quando incubadas no claro
estas apresentaram uma maior oxidaccedilatildeo em relaccedilatildeo as que
foram incubadas no escuro tornando-se mais tarde calos
previamente oxidados
TABELA 2 ndash Meacutedias do nuacutemero de anteras intumescidas e com calos diacircmetro dos calos (mm) em funccedilatildeo de diferentesconcentraccedilotildees de 24-D e ausecircncia ou presenccedila de BAP em duas condiccedilotildees de luminosidade (luz e escuro) para anterasdo genoacutetipo cv 44
Luminosidade1
Intumescimento () Calosidade () Diacircmetro (mm) 24-D ( M)
BAP ( M) Luz Escuro Luz Escuro Luz Escuro
0 907 a A 775 a A 779 bA 948 aA 609 bA 800 aA 905 89 843 a A 875 a A 889 aA 946 aA 607 aA 420 bB 0 887 a A 852 a A 939 aA 990 aA 490 aA 466 aA
181 89 906 a A 786 a A 917 aA 959 aA 420 aA 493 aA 0 600 b A 772 a A 694 bA 895 aA 000 bA 373 aA
271 89 022 b B 827 a A 294 bB 837 aA 000 bA 376 aA 0 828 a A 737 a A 928 aA 939 aA 414 bA 595 aA
362 89 866 a A 725 a A 949 aA 866 aA 329 aA 376 aA
1Meacutedias seguidas por letras diferente minuacutesculas na linha e maiuacutesculas na coluna dentro de cada concentraccedilatildeo de 2-4-D diferem entre si pelo teste de Tukey a significacircncia de 5
Induccedilatildeo de calos a partir de cultura 99
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
TABELA 3 ndash Meacutedias de oxidaccedilatildeo das anteras entre asdiferentes concentraccedilotildees de 24-D em duas condiccedilotildeesde luminosidade (luz e escuro) para anteras da cultivarCatuaiacute Vermelho 44
Concentraccedilotildees
24-D ( M ) OXIDACcedilAtildeO ()
Claro Escuro 905 749 a 269 b 181 420 a 270 b 271 999 a 221 b 362 308 a 334 a
1Meacutedias seguidas por letras diferentes minuacutesculas na linhadentro de cada concentraccedilatildeo de 2-4-D diferem entre sipelo teste de Tukey a significacircncia de 5
TABELA 4 ndash Tipos de calos obtidos apoacutes 30 dias em meioMS com 362 M de 24-D na ausecircncia de luz da cultivarCatuaiacute Vermelho 99
Tipos de Calos
Nuacutemero de Calos
Nuacutemero de Calos com diacircmetro acima
de 05 mm Friaacuteveis 03 Esverdeados 13 06 Esbranquiaccedilados
03 Cinza 26
Dados de contagem natildeo transformados O recultivo emmeio MS com 362 M de 24-D na presenccedila de luz teve100 de contaminaccedilatildeo apoacutes sua inoculaccedilatildeo
TABELA 5 ndashTipos de calos obtidos apoacutes 30 dias em meioMS com 181 M de 24D e 89 M de BAP na presenccedilade luz da cultivar Catuaiacute Vermelho 44
TABELA 6 ndash Tipos de calos obtidos apoacutes 30 dias em meioMS com 181 M de 24D na ausecircncia de luz da cultivarCatuaiacute Vermelho 44
Tipos de Calos Nuacutemero de Calos
Nuacutemero de Calos com diacircmetro
acima de 05 mm Friaacuteveis 58 Esverdeados 23 214 Esbranquiaccedilados 94 Cinza 203
Tipos de Calos
Nuacutemero de Calos
Nuacutemero de Calos com diacircmetro
acima de 05 mm Friaacuteveis 25 Esverdeados 11 69 Esbranquiaccedilados 19 Cinza 350
Dados de contagem natildeo transformados Dados de contagem natildeo transformados
Nesta etapa a maioria dos calos encontrados para
as trecircs cultivares apresentaram coloraccedilatildeo cinza (Tabelas 4
5 e 6) A perda gradativa da coloraccedilatildeo natural dos calos
passando de verdes para a cor marrom a diminuiccedilatildeo do
ritmo de crescimento dos mesmos a estagnaccedilatildeo do
processo de formaccedilatildeo de embrioacuteides seguido do
surgimento de aacutereas necrosadas na superfiacutecie satildeo sinais
que caracterizam a senescecircncia da cultura (SILVA 2002)
DISCUSSAtildeO
A resposta das anteras da cultivar Catuaiacute Vermelho 99
com relaccedilatildeo agrave oxidaccedilatildeo indica que a mesma estaacute associada agrave
combinaccedilatildeo entre auxina e citocinina promovendo os menores
iacutendices de oxidaccedilatildeo Agrave medida que se aumentou a
concentraccedilatildeo de 24-D na presenccedila de BAP houve um
aumento gradativo da oxidaccedilatildeo ateacute atingir um ponto maacuteximo
em torno de 80 na dosagem de 271 mM de 24-D Jaacute na
ausecircncia de BAP a oxidaccedilatildeo foi bem maior quando comparada
agrave porcentagem de oxidaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 905 mM de
24-D De acordo com Wang amp Huang (1976) o cultivo in
vitro por um periacuteodo longo induz a formaccedilatildeo de compostos
fenoacutelicos no meio que podem causar necrose e posteriormente
morte dos calos Maciel (2001) e Paluacute (2002) citam que pelos
resultados obtidos para a induccedilatildeo de calogecircnese em anteras
de cafeeiro observa-se que eacute necessaacuteria uma auxina
juntamente com uma citocinina Dentre as auxinas sinteacuteticas
o 24-D eacute sem duacutevida o mais adequado agrave induccedilatildeo e
manutenccedilatildeo do calo (GAMBORG et al 1976)
Para Thomas amp Ravindra (1997) o maior problema
na iniciaccedilatildeo de culturas lenhosas eacute a ocorrecircncia de
compostos fenoacutelicos que estatildeo ligados com processos de
regulaccedilatildeo de crescimento especialmente com as auxinas
que dependendo da sua concentraccedilatildeo endoacutegena no tecido
resulta na induccedilatildeo desses compostos
SILVA A S et al100
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
O fotoperiacuteodo que estas anteras foram submetidas
influenciou tambeacutem na porcentagem de oxidaccedilatildeo sendo
que no escuro e na presenccedila de 24-D (89 mM) a oxidaccedilatildeo
foi miacutenima Agrave medida que foi aumentando a concentraccedilatildeo
da auxina foi aumentando tambeacutem a oxidaccedilatildeo poreacutem este
aumento foi bem menor quando comparado ao cultivo das
anteras na presenccedila de luz
A oxidaccedilatildeo fenoacutelica tem sido controlada em
diferentes espeacutecies lenhosas pela reduccedilatildeo da intensidade
luminosa (MARKS amp SIMPSON 1990) associada com a
substituiccedilatildeo frequumlente do meio de cultura e dessa forma
as chances de se obter sucesso no estabelecimento e
cultivo de explantes de espeacutecies lenhosas satildeo bastante
elevadas (TEIXEIRA 2001)
Em muitas espeacutecies por razotildees natildeo conhecidas a
embriogecircnese direta eacute rara e as plantas tecircm que ser
diferenciadas a partir de calos Para induccedilatildeo destes
geralmente eacute necessaacuteria uma auxina (MAHESHWARI et
al 1982) Segundo Rocha (1998) para a induccedilatildeo e
manutenccedilatildeo do calo a maioria das espeacutecies parece
comportar-se diferentemente natildeo soacute quanto aos
reguladores de crescimento podendo ocorrer
independentemente de auxinas e citocininas dependente
de ambas ou dependente de uma ou de outra mas tambeacutem
quanto agrave presenccedila ou ausecircncia de luminosidade Sharp et
al (1973) obtiveram calos atraveacutes do cultivo de sementes
folhas e anteras de C arabica das cultivares Mundo Novo
e Bourbon Amarelo A induccedilatildeo de calos tambeacutem foi mais
eficiente na ausecircncia de luz Aleacutem disso Ascanio amp Arcia
(1994) citam que para o desenvolvimento do calo as
anteras devem ser mantidas no escuro jaacute para o
desenvolvimento do embriatildeo os calos devem ser mantidos
no claro
Natildeo houve a formaccedilatildeo de embriotildees e isto pode ser
devido agraves doses de reguladores ou mesmo de combinaccedilotildees
que natildeo foram apropriadas para estas cultivares
CONCLUSAtildeO
Os resultados mostraram que para ocorrer
intumescimento das anteras formaccedilatildeo e aumento do
tamanho dos calos de ambas as cultivares eacute necessaacuterio
que haja interaccedilatildeo entre a auxina (24-D) e a citocinina
(BAP) e incubaccedilatildeo no escuro
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PEREIRA F D et al102
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COMUNICACcedilAtildeO CIENTIacuteFICA
PROLIFERACcedilAtildeO IN VITRO DE BROTOS DE CURAUAacuteUTILIZANDO DIFERENTES VOLUMES DE MEIO DE CULTURA
IN VITRO SHOOT PROLIFERATION OF Ananas erectifolius USING DIFFERENTVOLUMES OF CULTURE MEDIUM
FLAacuteVIA DIONIacuteSIO PEREIRA1 JOSEacute EDUARDO BRASIL PEREIRA PINTO2HELEN CRISTINA DE ARRUDA RODRIGUES3 LUCIANA DOMICIANO SILVA ROSADO3
LUIZ ALBERTO BEIJO4 OSMAR ALVES LAMEIRA5
1Doutoranda em Agronomia ndash Universidade Estadual de Feira de SantanaUEFS ndash Horto Florestal ndash 44055-000 ndash Feira de Santana BA ndash flavia1808hotmailcom
2Doutor em Fisiologia Vegetal ndash Departamento de AgriculturaDAG ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash jeduardouflabr
3Graduanda em Agronomia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG4Doutorado em Agronomia ndash Universidade Federal de AlfenasUNIFAL ndash Departamento de Ciecircncias Exatas ndash Rua Gabriel Monteiro da Silva n deg 714 ndash Centro ndash 37130-000 ndash Alfenas MG ndash luizbeijoyahoocombr5Doutor em Agronomia ndash EMBRAPA ndash Amazocircnia Oriental ndash Trav Dr Eneacuteas Pinheiro sn ndash Bairro Marco ndash 66095-100 ndash Beleacutem PA ndash osmarcpatuembrapabr
RESUMOCurauaacute [Ananas erectifolius LBSm ndash Bromeliaceae] eacute
uma espeacutecie com grande potencial de uso de suas fibras comorevestimento na induacutestria automobiliacutestica Aleacutem disso o poacute dosumo do curauaacute tem sido utilizado no tratamento de cicatrizaccedilatildeode lesotildees cutacircneas Neste trabalho avaliaram-se diferentes volumesde meio MS Os volumes utilizados foram de 10 15 20 25 e 30 mLO delineamento experimental foi inteiramente casualizado (DIC)e cada tratamento continha 19 repeticcedilotildees Aos 30 dias avaliaram-se o nuacutemero e o tamanho de brotaccedilotildees Segundo a anaacutelise devariacircncia houve efeito linear do volume de meio na produccedilatildeo debrotos de curauaacute Agrave medida em que se aumenta o volume domeio aumenta o nuacutemero de brotos Natildeo houve diferenccedilasignificativa nos comprimentos dos brotos
Termos para indexaccedilatildeo Ananas erectifolius fibras vegetaismicropropagaccedilatildeo
ABSTRACTAnanas erectifolius LBSm ndash Bromeliaceae is a species
that presents fibers with great potential to be used as revetmentfor the automobile industry Besides the powder obtained fromits juice has been used in the treatment of skin lesionscicatrisation In this work the effect of different volumes (1015 20 25 and 30 mL) of MS medium during the in vitro cultureof axillary buds was evaluated A completely randomized design(CDR) was used with each treatment containing 19 replicatesAfter 30 days of inoculation shoot number and size wereevaluated The analysis of variance showed a linear effect of theculture medium volume and shoot proliferation Higher shoot
number was observed with the increase of medium volume Nosignificant difference was observed on shoot lenght
Index terms Ananas erectifolius vegetable fibermicropropagation
A produccedilatildeo de fibras vegetais ocupa um papel
relevante na economia agriacutecola mundial mesmo com a
intensa produccedilatildeo de fibras sinteacuteticas Mateacuterias-primas de
origens renovaacuteveis reciclaacuteveis e biodegradaacuteveis satildeo uma
das alternativas para a produccedilatildeo de manufaturados
ecologicamente corretos em consequumlecircncia do acuacutemulo
nos descartes de materiais natildeo biodegradaacuteveis os quais
tendem a aumentar com o crescimento populacional nos
centros urbanos A substituiccedilatildeo de materiais derivados do
petroacuteleo na produccedilatildeo de compostos elastomeacutericos por
mateacuteria-prima renovaacutevel vai ao encontro desses ideais
(ROCHA et al 2003)
As fibras sinteacuteticas destacam-se pela elevada
resistecircncia baixa densidade e elevada produccedilatildeo
Entretanto as fibras animais e vegetais satildeo as de maior
importacircncia principalmente para atender aos apelos
(Recebido em 31 de agosto de 2006 e aprovado em 19 de janeiro de 2007)
Proliferaccedilatildeo in vitro de brotos de curauaacute 103
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 102-106 2006
ecoloacutegicos e pelo nuacutemero de plantas e animais produtores
de fibras (SCHREIBER1998)
As plantas produtoras de fibras utilizaacuteveis foram
quantificadas por vaacuterios autores e em diferentes eacutepocas
tendo sido enumeradas 2000 mil plantas fibrosas e o seu
total estimado em 2300 destacando-se as florestas tropicais
que encerram recursos inesgotaacuteveis em potencial
(MEDINA 1959)
O curauaacute [Ananas erectifolius LBSm ndash
Bromeliaceae] utilizado principalmente na fabricaccedilatildeo de
cordas sacos e utensiacutelios domeacutesticos surge como
sucedacircneo para o aproveitamento de fibras O curauaacute eacute
uma bromeliaacutecea distribuiacuteda nos Estados do Paraacute Acre
Mato grosso Goiaacutes e Amazonas e eacute cultivada
principalmente por pequenos produtores da regiatildeo do
Lago Grande de Curuai no municiacutepio de Santareacutem PA
Estudos recentes tecircm demonstrado o grande potencial do
uso das fibras dessa planta como revestimento na induacutestria
automobiliacutestica devido agrave sua resistecircncia maciez e peso
reduzido O grande problema eacute que natildeo haacute suprimento
suficiente de mateacuteria-prima para atender agrave induacutestria
automobiliacutestica pois o curauaacute eacute fiel agraves suas origens amazocircnicas
e soacute se desenvolve em clima quente e uacutemido criando um
problema para a aquisiccedilatildeo de mudas fora desta regiatildeo que
por tal motivo eacute escassa no mercado (SILVA 2004)
A micropropagaccedilatildeo utilizando teacutecnicas de cultura
de tecido tem sido um valioso instrumento na propagaccedilatildeo
de diversos tipos de plantas Embora este processo envolva
diferentes etapas depois de definido um protocolo de
micropropagaccedilatildeo seja qual for a espeacutecie este pode ser
otimizado no intuito de se obter placircntulas de alta qualidade
e com baixo valor de produccedilatildeo O tipo e tamanho de frasco
e a quantidade de meio satildeo variaacuteveis que tecircm recebido
pouca atenccedilatildeo embora afetem diretamente a aacuterea superficial
da interface meio de cultura-atmosfera o volume de ar sobre
o meio de cultura e a sua profundidade Tais fatores tambeacutem
afetam a composiccedilatildeo da fase gasosa do frasco e
consequumlentemente o crescimento e desenvolvimento das
culturas (GRATTAPAGLIA amp MACHADO 1998)
Rodrigues et al (2005) verificaram maior
proliferaccedilatildeo de brotos de Cattleya persivaliana Hort
em frascos contendo 50 mL de meio quando comparados
com aqueles de 25 75 e 100 mL Nicoloso amp Erig (2002)
trabalhando com Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen
verificaram que 10 mL de meio MS (MURASHIGE amp
SKOOG 1962) proporcionaram o melhor crescimento
das placircntulas em biomassa quando cultivadas em tubos
de 20 cm de altura x 2 cm diacircmetro em comparaccedilatildeo com
os de 25 cm de altura x 2 cm 15 cm de altura x 2 cm
Carvalho et al (1995) estudando a influecircncia de fatores
fiacutesicos no desenvolvimento e crescimento in vitro de
batata-doce (Ipomoea batatas L Poir) verificaram que
10 mL de meio de cultura por frasco com explantes
proporcionaram maior formaccedilatildeo de gemas em relaccedilatildeo
aos volumes de 20 e 30 mL
Sendo assim objetivou-se neste trabalho avaliar
o volume de meio apropriado para a propagaccedilatildeo in vitro
de brotaccedilotildees de curauaacute
As brotaccedilotildees utilizadas como fonte de explante
foram fornecidas pela EMBRAPACPATU situada em
Beleacutem do Paraacute Gemas axilares de curauaacute foram
inoculadas em meio MS completo suplementado com
20 mgL de BAP (6-Benzilaminopurina) Apoacutes 30 dias
estas se desenvolveram e as brotaccedilotildees obtidas foram
transferidas para o meio MS sem regulador de
crescimento por 30 dias
Apoacutes este periacuteodo quatro explantes foram
desfolhados completamente ficando apenas porccedilotildees
basais com aproximadamente 1cm de comprimento que
foram inoculadas em meio de cultura baacutesico MS sem
regulador de crescimento em frasco de 12 cm de altura por
5 cm de diacircmetro (volume interno = 300 mL) com volumes
de 10 15 20 25 30 mL Os explantes foram mantidos em
sala de crescimento a uma temperatura de 26plusmn1degC e
fotoperiacuteodo de 16 horas sob uma Irradiacircncia de foacutetons de
25mmol m-2 s-1
O delineamento experimental foi inteiramente
casualizado (DIC) Cada tratamento continha 19 repeticcedilotildees
PEREIRA F D et al104
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 102-106 2006
(um frasco por repeticcedilatildeo) Aos 30 dias avaliaram-se o
nuacutemero e o comprimento das brotaccedilotildees O programa
utilizado para anaacutelise dos dados foi o software statistica
(SISVAR) tendo sido submetidas agrave anaacutelise de variacircncia
com aplicaccedilatildeo do teste F a 5 de probabilidade
analisando-se as meacutedias por regressatildeo polinomial
O efeito linear foi o mais adequado para explicar
a evoluccedilatildeo da taxa meacutedia de regeneraccedilatildeo do curauaacute Agrave
medida que o volume do meio de cultura aumenta existe
tendecircncia de aumento do nuacutemero de brotos Com 25
mL de meio produziu-se maior nuacutemero de brotos por
frasco (2557) e com 10 mL de meio produziu-se menor
nuacutemero de brotos (1226) O tratamento com 15 mL de
meio produziu 1765 brotos o com 20 mL 1750 e o com
30 mL 2242 (Figura 1) O volume maior de meio
disponibiliza mais nutrientes e diminui tambeacutem a
competiccedilatildeo entre as placircntulas o que explica a tendecircncia
em se obter um maior nuacutemero de brotos agrave medida que
se aumenta a quantidade do meio de cultura Em todos
os tratamentos as brotaccedilotildees obtidas foram vigorosas
com a coloraccedilatildeo verde-escura caracteriacutestica das
plantas matrizes As brotaccedilotildees tinham tambeacutem rigidez
outra caracteriacutestica da espeacutecie o que eacute devido agrave
presenccedila das fibras nas folhas Observou-se maior
concentraccedilatildeo de raiacutezes nas brotaccedilotildees maiores e natildeo
FIGURA 1 ndash Nuacutemero meacutedio de brotos por frasco de curauaacute(Ananas erectifolius) cultivados em diferentes volumesde meio MS completo 10 15 20 25 e 30
foi observada a presenccedila de calos em nenhum dos
tratamentos (Figura 2)
Resultados semelhantes foram obtidos por Reis
Lameira Reis (2004) trabalhando com curauaacute utilizando
volumes de 5 75 10 e 15 mL do meio liacutequido MS suplementados
com 25 mgL-1 de BAP (6-benzilaminopurina) os melhores
resultados sendo com os tratamentos que continham 10 e
15ml produzindo em meacutedia 121 e 154 brotosexplante
respectivamente
Da mesma forma Reis et al(2003) trabalhando com
ipeca (Psychotria ipecacuanha Stokes) em meio MS
acrescido de 15 mg L-1de BAP nos volumes de 10 20 30
e 40 mL obtiveram melhor resultado com os volumes de 30
e 40 mL (7 e 8 brotosfrasco respectivamente)
Quanto ao comprimento dos brotos natildeo houve
diferenccedila significativa Os brotos t iveram um
crescimento meacutedio de 228 cm sendo que no tratamento
com 10 mL de meio foi 257 cm com 15 mL 222 cm
com 20 mL 224 cm com 25 mL 224 cm e o tratamento
com 30 mL 215 cm Embora natildeo se tenham realizado
estudos mais aprofundados uma das hipoacuteteses
sugeridas para explicar tais resultados possivelmente
estaacute relacionada a fatores nutricionais do explante
Segundo Cappelades et al (1991) e Pereira et al (2001)
porccedilotildees basais satildeo mais robustas apresentando maior
quantidade de reservas acumuladas em seus tecidos
o que poderia levar agrave utilizaccedilatildeo dessas reservas pelas
brotaccedilotildees regeneradas para sustentar seu crescimento
Esta seria uma das causas da uniformidade apresentada
no tamanho das brotaccedilotildees em todos os tratamentos
Resultados iguais foram obtidos em estudos feitos por
Rodrigues et al (2005) quando avaliaram comprimento
meacutedio de duas espeacutecies de orquiacutedeas mantidas em meio
de cultura cujos volumes testados eram de 25 50 75 e
100 mL Portanto verifica-se que eacute muito importante
selecionar material com bom estado fisioloacutegico e
tamanho homogecircneo para se obter melhores
resultados na proliferaccedilatildeo das brotaccedilotildees eou na
morfogecircnese
Proliferaccedilatildeo in vitro de brotos de curauaacute 105
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 102-106 2006
FIGURA 2 ndash Brotaccedilotildees de curauaacute (Ananas erectifolius) produzidas in vitro em diferentes volumes de meio MS 1-Repicagem dos brotos 2- 10 mL de meio MS 3- 15 mL de meio MS 4- 20 mL de meio MS 5- 25 mL de meio MS 6- 30mL de meio MS
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GRATTAPAGLIA D MACHADO M A MicropropagaccedilatildeoIn TORRES A C CALDAS L S (Ed) Cultura de tecidos etransformaccedilatildeo geneacutetica de plantas Brasiacutelia EMBRAPA-SPIEMBRAPA-CNPH 1998 p 183-260
MEDINA J C Plantas fibrosas da flora mundialCampinas Instituto agronocircmico 1959 913 p
MURASHIGE T SKOOG F A Revised medium for rapidgrowth and biossays with tobacco tissue cultures PhysiologiaPlantarum Copenhagen v 15 n 3 p 473-479 1962
PEREIRA F D et al106
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 102-106 2006
NICOLOSO F T ERIG A C Efeito do tipo de segmentonodal e tamanho do recipiente no crescimento de plantasde Pfaffia glomerata in vitro Ciecircncia e AgrotecnologiaLavras v 26 p 1499-1506 dez 2002 Ediccedilatildeo especial
PEREIRA F D BRAGA M F SAacute M E L ALCINO OG COLENGHI I C Influecircncia de BAP e NAA namultiplicaccedilatildeo de abacaxi cv Perolera a partir de brotosestiolados in vitro Bioscience Journal Uberlandia v 17n 2 p 49-60 Dec 2001
REIS Eacute S PINTO J E B P CORREcircA R MPEREIRA F D BERTOLUCCI S K V Influecircncia dosmeios MS e WPM associados a diferentesconcentraccedilotildees de Benzilaminopurina na multiplicaccedilatildeode ipeca (Psychotria ipecacuanha (Brot) Stokes InCONGRESSO BRASILEIRO DE CULTURA DE TECIDOSDE PLANTAS 1 2003 Lavras Anais Lavras UFLA2003 p 273
REIS J N R LAMEIRA O M REIS L R S1Aprimoramento de protocolos de propagaccedilatildeo in vitro de
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ROCHA E C GHELER JUacuteNIOR J Aproveitamento deresiacuteduos gerados na aglomeraccedilatildeo de fibras de coco comLaacutetex natural Mateacuteria Teacutecnica Disponiacutevel em lthttpwwwbiologocombrgt Acesso em jun 2003
RODRIGUES J D ARAUacuteJO A G ASSIS F A ACAVALLARI L L PASQUAL M Crescimento in vitro deplacircntulas de orquiacutedeas quantidade de meio de cultura enuacutemero de explantes In CONGRESSO DE INICIACcedilAtildeOCIENTIacuteFICA DA UFLA ndash CICESAL 18 2005 Lavras MGAnais Lavras UFLA 2005 1CD-ROM
SILVA C Paiacutes pesquisa mais fibras naturais para carrosDisponiacutevel em lthttpwwwsebrae_sccombrn o v o s _ d e s t a q u e s o p o r t u n i d a d e mostra_mateacuteriaaspcd_noticia=8356gt Acesso em out 2004
SCHREIBER V (Org) Vias de desenvolvimentosustentaacutevel as dimensotildees do desafio Beleacutem UFBANUMAPOEMAIDESP 1998 495 p (POEMA 6)
NORMAS PARA PUBLICACcedilAtildeO DE ARTIGOS E COMUNICACcedilOtildeES CIENTIacuteFICAS
1 Os conceitos e afirmaccedilotildees contidos nos artigos e comunicaccedilotildeesseratildeo de inteira responsabilidade do(s) autor(es)
2 A revista ldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquo editadasemestralmente pela Editora da Universidade Federal de Lavras(Editora UFLA) publica artigos cientiacuteficos e comunicaccedilotildeescientiacuteficas da aacuterea de cultura de tecidos de plantas elaboradospor membros da comunidade cientiacutefica nacional e internacionalNatildeo eacute cobrada taxa para publicaccedilatildeo de trabalhos Eacute condiccedilatildeofundamental que os artigoscomunicaccedilotildees submetidos agrave apreciaccedilatildeoda revista ldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquo natildeo forame nem seratildeo publicados simultaneamente em outro lugar Com aaceitaccedilatildeo do artigo para publicaccedilatildeo os editores adquirem amplose exclusivos direitos sobre o artigo para todas as liacutenguas e paiacutesesA publicaccedilatildeo de artigoscomunicaccedilotildees dependeraacute da observacircnciadas Normas Editoriais dos pareceres do Corpo Editorial e daComissatildeo ad hoc Todos os pareceres tecircm caraacuteter sigiloso eimparcial e tanto os autores quanto os membros do CorpoEditorial eou Comissatildeo ad hoc natildeo obtecircm informaccedilotildeesidentificadoras entre si
3 Os artigos e comunicaccedilotildees submetidos para publicaccedilatildeo deveratildeoser apresentados em CD utilizando-se o processador de textoMicrosoft Word for Windows (version 98 2000 XP ou 2003)ser escrito em liacutengua portuguesa inglesa ou espanhola e usarsomente nomenclaturas oficiais e abreviaturas consagradas natildeoempregando abreviaturas no tiacutetulo do artigo Juntamente com oCD deveratildeo ser enviadas 4 (QUATRO) vias sendo uma originale as demais coacutepias omitindo os autores e a chamada de rodapeacute daprimeira paacutegina (para serem enviadas aos consultores cientiacuteficos)impressas em papel branco tipo A4 (21cm x 297cm) ou emformulaacuterio contiacutenuo em uma soacute face espaccedilo duplo entre linhasfonte Times New Roman tamanho 12 observada uma margemde 3 cm para o lado esquerdo e de 2 cm para o direito 25 cm paramargem superior e inferior 25 cm para o cabeccedilalho e 25 cm parao rodapeacute Cada trabalho deveraacute ter no maacuteximo 14 paacuteginas ejunto do mesmo deveraacute ser encaminhado ofiacutecio dirigido ao EditorChefe da revista solicitando a publicaccedilatildeo do artigo Esse ofiacuteciodeveraacute ser assinado por todos os autores constar o endereccedilocompleto telefone e e-mail de todos Qualquer inclusatildeo exclusatildeoou alteraccedilatildeo na ordem dos autores deveraacute ser notificada medianteofiacutecio assinado por todos os autores (inclusive do autor excluiacutedo)
4 O artigo cientiacutefico deveraacute conter os seguintes toacutepicos a)TIacuteTULO suficientemente claro conciso e completo evitandopalavras supeacuterfluas Recomenda-se comeccedilar pelo termo querepresente o aspecto mais importante do trabalho com os demais
termos em ordem decrescente de importacircncia b) TIacuteTULO EMINGLEcircS c) NOME(s) DO(s) AUTOR(es) no maacuteximo 6 (seis)em letras maiuacutesculas um apoacutes o outro centralizados e no rodapeacuteda primeira paacutegina deveratildeo vir a formaccedilatildeo acadecircmica e aInstituiccedilatildeo onde trabalham d) RESUMO (de acordo comNBR6028 da ABNT) O resumo natildeo deve ultrapassar a 250(duzentos e cinquumlenta) palavras e natildeo possuir paraacutegrafos Apoacuteso Resumo devem-se incluir TERMOS PARA INDEXACcedilAtildeO(palavraschave) diferentes daqueles constantes do tiacutetulo eseparados por viacutergula Os termos para indexaccedilatildeo devem estardescritos na forma maiuacutescula e minuacutescula serem expressotildees queidentifiquem o conteuacutedo do artigo ser indicadas entre 3 e 5 e sepossiacutevel extraiacutedas do vocabulaacuterio Thesagro ndash Thesaurus AgriacutecolaNacional desenvolvido pela CENAGRI (indicaccedilatildeo da revistaldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquopara evitar o usode vaacuterios sinocircnimos como termos de indexaccedilatildeo) Se natildeo foremencontrados descritores disponiacuteveis para cobrirem a temaacutetica doartigo poderatildeo ser indicados termos ou expressotildees de usoconhecido e) ABSTRACT incluindo em seguida INDEXTERMS f) INTRODUCcedilAtildeO (incluindo a revisatildeo de literatura)g) MATERIAL E MEacuteTODOS h) RESULTADOS EDISCUSSAtildeO (podendo conter tabelas e figuras) i)CONCLUSOtildeES e j) REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
5 A comunicaccedilatildeo deveraacute conter os seguintes toacutepicos a)TIacuteTULO suficientemente claro conciso e completo evitandopalavras supeacuterfluas Recomenda-se comeccedilar pelo termo querepresente o aspecto mais importante do trabalho com os demaistermos em ordem decrescente de importacircncia Deve serapresentada a versatildeo do tiacutetulo para o idioma inglecircs b) TIacuteTULOEM INGLEcircS c) NOME(s) DO(s) AUTOR(es) no maacuteximo 6(seis) em letras maiuacutesculas um apoacutes o outro centralizados e norodapeacute da primeira paacutegina deveratildeo vir a formaccedilatildeo acadecircmica e aInstituiccedilatildeo onde trabalham d) RESUMO (de acordo comNBR6028 da ABNT) O resumo natildeo deve ultrapassar a 250(duzentos cinquumlenta) palavras e natildeo possuir paraacutegrafos Apoacutes oResumo devem-se incluir TERMOS PARA INDEXACcedilAtildeO(palavras-chave) diferentes daqueles constantes do tiacutetulo eseparados por viacutergula Os termos para indexaccedilatildeo devem estardescritos na forma maiuacutescula e minuacutescula serem expressotildees queidentifiquem o conteuacutedo do artigo ser indicadas entre 3 e 5 e)ABSTRACT incluindo em seguida INDEX TERMS f)TEXTO [sem subdivisatildeo poreacutem com introduccedilatildeo material emeacutetodos resultados e discussatildeo e conclusatildeo subtendidos(podendo conter tabelas ou figuras)] e g) REFEREcircNCIASBIBLIOGRAacuteFICAS
6 AGRADECIMENTOS ao fim do texto e antes das ReferecircnciasBibliograacuteficas poderatildeo vir os agradecimentos a pessoas ouinstituiccedilotildees O estilo tambeacutem aqui deve ser soacutebrio e claroindicando as razotildees pelas quais se fazem os agradecimentos
7 TABELAS E QUADROS deveratildeo ser inseridos apoacutes citaccedilatildeodos mesmos dentro do proacuteprio texto
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS as referecircnciasbibliograacuteficas devem ser citadas conforme a NBR60232002 daABNTA exatidatildeo das referecircncias constantes da listagem e a corretacitaccedilatildeo no texto satildeo de responsabilidade do(s) autor(es) doartigo
Orientaccedilotildees gerais- Deve-se apresentar todos os autores do documento cientiacutefico(fonte)- O nome do perioacutedico deve ser descrito por extenso natildeo deveser abreviado- Em todas as referecircncias deve-se apresentar o local de publicaccedilatildeo(cidade) a ser descrito no lugar adequado para cada tipo dedocumento- As referecircncias devem ser ordenadas alfabeticamente
EXEMPLIFICACcedilAtildeO (TIPOS MAIS COMUNS)
ARTIGO DE PERIOacuteDICO
VIEIRA R F RESENDE M A V de Eacutepocas de plantio deervilha em Patos de Minas Uberaba e Janauacuteba Minas GeraisCiecircncia e Agrotecnologia Lavras v 24 n 1 p 74-80 janmar 2000
LIVRO
a) Livro no todo
STEEL R G D TORRIE J H Principles and procedures ofstatistics New York McGraw-Hill Book l960 481 p
b) Parte de livro com autoria especiacutefica
FLEURY J A Anaacutelise ao niacutevel de empresa dos impactos daautomaccedilatildeo sobre a organizaccedilatildeo da produccedilatildeo de trabalho InSOARES R M S M Gestatildeo da empresa Brasiacutelia IPEAIPLAN 1980 p 149-159
c) Parte de livro sem autoria especiacutefica
MARTIM L C T Nutriccedilatildeo de bovino de corte em confinamentoIn ______ Confinamento de bovino de corte 2 ed Satildeo PauloNobel 1986 cap 3 p 29-89
DISSERTACcedilAtildeO E TESE
GONCcedilALVES R A Preservaccedilatildeo da qualidade tecnoloacutegicade trigo (Triticum aestivum L) e controle de Rhyzoperthadominica (F) durante o armazenamento em atmosferacontrolada com Co2 e N2 1997 52 f Dissertaccedilatildeo (Mestradoem Ciecircncia dos Alimentos) ndash Universidade Federal de LavrasLavras 1997
MATIOLI G P Influecircncia do leite proveniente de vacasmastiacuteticas no rendimento de queijo frescal 2000 55 pDissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncias dos Alimentos) - UniversidadeFederal de Lavras Lavras 2000
Nota ldquoA folha eacute composta de duas paacuteginas anverso e versoAlguns trabalhos como teses e dissertaccedilotildees satildeo impressos apenasno anverso e neste caso indica-se frdquo (ABNT NBR60232002p 18)
TRABALHOS DE CONGRESSO E OUTROS EVENTOS
SILVA J N M Possibilidades de produccedilatildeo sustentada de madeiraem floresta densa de terra firme da Amazocircnia brasileira InCONGRESSO FLORESTAL BRASILEIRO 6 1990 Campos doJordatildeo Anais Campos do Jordatildeo SBSSBEF 1990 p 39-45
DOCUMENTOS ELETROcircNICOS
As obras consultadas online satildeo referenciadas conformenormas especiacuteficas para cada tipo de documento (monografia notodo e em parte trabalho apresentado em evento artigo deperioacutedico artigo de jornal etc) acrescidas de informaccedilotildees sobreo endereccedilo eletrocircnico apresentado entre braquetes (lt gt)precedido da expressatildeo ldquoDisponiacutevel emrdquo e da data de acessoao documento precedida da expressatildeo ldquoAcesso emrdquo
Nota ldquoNatildeo se recomenda referenciar material eletrocircnico de curtaduraccedilatildeo nas redesrdquo (ABNT NBR60232000 p 4) Segundopadrotildees internacionais a divisatildeo de endereccedilo eletrocircnico no fimda linha deve ocorrer sempre apoacutes barra ()
Monografia (acesso online)
a) Livro no todo
TAKAHASHI T (Coord) Tecnologia em foco BrasiacuteliaSocinfoMCT 2000 90 p Disponiacutevel em lthttpwwwsocinfoorgbrgt Acesso em 22 ago 2000
b) parte de livro
TAKAHASHI T Mercado trabalho e oportunidades In ______Sociedade da informaccedilatildeo no Brasil livro verde BrasiacuteliaSocinfoMCT 2000 cap 2 p 13-24 Disponiacutevel em lthttpwwwsocinfogovbrgt Acesso em 22 ago 2000
c) Parte de congresso seminaacuterio etc
GIESBRECHT H O Avaliaccedilatildeo de desempenho de institutos depesquisa tecnoloacutegica a experiecircncia de projeto excelecircncia napesquisa tecnoloacutegica In CONGRESSO ABIPTI 2000Fortaleza Gestatildeo de institutos de pesquisa tecnoloacutegicaFortaleza Nutec 2000 Disponiacutevel em lthttpwwwabiptiorgbrgt Acesso em 01 dez 2000
d) Tese
SILVA E M Arbitrariedade do signo a liacutengua brasileira desinais (LIBRAS) 1997 144 p Dissertaccedilatildeo (Mestrado emLinguumliacutestica Aplicada e Estudo de Liacutengua) - Pontifiacutecia UniversidadeCatoacutelica de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 1997 Disponiacutevel em lthttpwwwterracombrvirtualbooks freebookportdid teseshtmgtAcesso em 28 nov 2000
Artigo de perioacutedico (acesso online)
RESENDE A M G Hipertexto tramas e trilhas de um conceitocontemporacircneo Informaccedilatildeo e Sociedade Recife v 10 n 12000 Seccedilatildeo Educaccedilatildeo Disponiacutevel em lthttpwwwinformaccedilatildeoesociedadeufpbbrgt Acesso em 30 nov 2000
CITACcedilAtildeO PELO SISTEMA ALFABEacuteTICO (AUTOR-DATA)(conforme ABNT NBR105202002)Dois autores - Steel amp Torrie (1960) ou (STEEL amp TORRIE1960)Trecircs ou mais autores - Valle et al (l945) ou (VALLE et al 1945)Obs Quando forem citados dois autores de uma mesma obradeve-se separaacute-los pelo sinal amp (comercial)
9 CASO O ARTIGO CONTENHA FOTOGRAFIASGRAacuteFICOS FIGURAS SIacuteMBOLOS E FOacuteRMULASESSAS DEVERAtildeO OBEDECER AgraveS SEGUINTESNORMAS
91 Fotografias deveratildeo ser apresentadas em preto e branconiacutetidas e com contraste inseridas no texto apoacutes a citaccedilatildeo dasmesmas e tambeacutem em um arquivo agrave parte salvas em extensatildeoldquoTIFFrdquo ou ldquoJPEGrdquo com resoluccedilatildeo de 300 dpi
92 Figuras deveratildeo ser apresentadas em preto e branco niacutetidase com contraste inseridas no texto apoacutes a citaccedilatildeo das mesmas etambeacutem em um arquivo agrave parte salvas em extensatildeo ldquoTIFFrdquo ouldquoJPEGrdquo com resoluccedilatildeo de 300 dpi As figuras deveratildeo serelaboradas com letra Times New Roman tamanho 10 semnegrito sem caixa de textos e agrupadas
93 Graacuteficos deveratildeo ser inseridos apoacutes citaccedilatildeo dos mesmosdentro do proacuteprio texto elaborado preferencialmente em Excelcom letra Times New Roman tamanho 10 sem negrito
94 Siacutembolos e Foacutermulas Quiacutemicas deveratildeo ser feitas emprocessador que possibilite a formataccedilatildeo para o programa PageMaker (ex MathType Equation) sem perda de suas formasoriginais
10 O Editor Chefe notificaraacute o autor do recebimento do originale posteriormente o informaraacute sobre sua publicaccedilatildeo Os artigosque necessitarem de modificaccedilotildees seratildeo devolvidos ao autor paraa devida revisatildeo
11 Os artigos natildeo aprovados seratildeo devolvidos
12 Os artigos seratildeo publicados em ordem de aprovaccedilatildeo
13 O natildeo-cumprimento dessas normas implicaraacute na devoluccedilatildeodo artigo ao autor
14 Os casos omissos seratildeo resolvidos pela Comissatildeo Editorial
15 O artigo deveraacute ser enviado para
ABCTPPlant Cell Culture amp MicropropagationUniversidade Federal de LavrasDepartamento de Biologia - Setor de Fisiologia VegetalCaixa Postal 3037Lavras ndash MGCEP 37200-000E-mail abctpuflabr
INSTRUCTIONS FOR AUTHORS
1 Concepts and affirmations included in articles andcommunications are of the entire responsibility of the authors
2 ldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquo a semestral journaledited by Editora UFLA of the Universidade Federal de Lavraspublishes scientific articles and communications in the area ofplant tissue culture elaborated by researchers of the national andinternational scientific community There are no page charges forpublication Submission of a manuscript implies that it is neitherunder consideration for publication elsewhere nor has appearedpreviously in part or in whole On acceptance for publicationauthors assign to the Editors full copyright of the manuscript inall languages and countries Publications will depend on editorialrules and on the review of experts and ad hoc commissionReviewer and editorial opinions will be anonymouslycommunicated to authors
3 The articles and communication submitted for publicationmust be presented in CD using the program Microsoft Wordfor Windows (version 98 2000 XP or 2003) written inPortuguese English or Spanish using only conventionalnomenclature At the time of submission authors are requiredto submit together with the CD 4 (four) hard copies one originaland three copies without the name(s) of the author(s) as well asthe footnote on the first page (to be used by the reviewers)printed on A4 white paper (21 cm x 297cm) or on continuousform typewritten only on one side double spaced using fontTimes New Roman size 12 with a 3 cm margin on the left handside and 20 cm margin on the right hand side 25 cm upper andlower margin 25 cm for the heading and 25 cm for the footnoteThe manuscript must present a maximum of 14 pages At thetime of submission a cover letter must be sent with themanuscript copies to the Editor requesting publication of thearticle This cover letter must be signed by all authors andalso contain the full address telephone number and e-mail ofthe authors Any inclusion exclusion or alteration in the authorsorder must be notified and signed by all authors including theone excluded
4 Each manuscript must be organized in a) TITLE sufficientlyclear conspicuous and complete without superfluous words Itis recommended to initiate with the term that represent the mostimportant aspect with other terms in decreasing of importanceb) TITLE in Portuguese c) FULL NAME(s) OF THEAUTHOR(s) maximum of 6 (six) in capital letters one after theother in the center of the page with the footnote of the first pagecontaining their professional qualification or academic training
and their work institution d) ABSTRACT written continuouslywithout paragraph It must not exceed 250 words Index termsmust be enclosed after the abstract using terms different fromthose used in the title and separated by comma The index terms(3 to 5) must be described in capital and small letters and expressthe content of the article e) ABSTRACT and INDEX TERMSin Portuguese f) INTRODUCTION (including literaturereview) g) MATERIAL AND METHODS h) RESULTS ANDDISCUSSION (it may include tables and figures) i)CONCLUSIONS and j) REFERENCES
5 Communication must have the following topics a) TITLEsufficiently clear conspicuous and complete without superfluouswords It is recommended to initiate with the term that representthe most important aspect with other terms in decreasing ofimportance The PORTUGUESE version of the title has to bepresented b) TITLE in Portuguese c) FULL NAME(s) OFTHE AUTHOR(s) maximum of 6 (six) in capital letters oneafter the other in the center of the page with the footnote of thefirst page containing their professional qualification or academictraining and their work institution d) ABSTRACT writtencontinuously without paragraph It must not exceed 250 wordsIndex terms must be enclosed after the abstract using termsdifferent from those used in the title and separated by commaThe index terms (3 to 5) must be described in capital and smallletters and express the content of the article e) ABSTRACTand INDEX TERMS in Portuguese f) TEXT (with no divisionbut must include introduction material and methods results anddiscussion and conclusion (it may include tables and figures) andg)REFERENCES
6 ACKNOWLEDGEMENTS Acknowledgements to peopleor institutions might be included at the end of the text priorReferences The written style must be serious and clear indicatingthe reasons of the acknowledgements made
7 TABLES AND FIGURES must be included right after theircitation in the text
8 REFERENCES references must be cited according toNBR60232002 of ABNT All references and their correct citationin the text are of the entire responsibility of the author(s)- Some important orientations all authors of the scientificdocument must be presented (source) the journal must be citedusing its full name all references must present the name of thecity where the journal was published all references must be citedalphabetically
9 PHOTOGRAPHS GRAPHS FIGURES SYMBOLS ORFORMULA CONTAINED IN THE ARTICLE SHOULDOBEY THE FOLLOWING RULES
91 Photographs must be presented in black and whiteclear and with contrast inserted in the text after their citationand also in a separate file (on the same diskette as the article)saved in extension ldquoTIFFrdquo or ldquoJPEGrdquo with resolution of300 dpi
92 Figures must be presented in black and white clear andwith contrast inserted in the text after their citation and also in aseparate file (on the same diskette as the article) saved inextension ldquoTIFFrdquo or ldquoJPEGrdquo with resolution of 300 dpiThey must be elaborated using Times New Roman font size10 without bold without text box and arranged
93 Graphs must be inserted in the text after their citationelaborated preferentially in Excel using Times New Romanfont size 10 without bold
94 Symbols and Chemical Formula must be presented usinga word processor that permits a format for Page Maker (exMathType Equation) without loss of its original form
10 The Brazilian Association of Plant Tissue Culture (ABCTP)will inform the author the receipt of the original manuscript andeventually it will also send information regarding its publicationManuscripts that require modifications will be returned to theauthor for the respective revision andcorrections
11 Manuscripts not approved will be returned to the author
12 Articles will be published according to the order of receiptand approval
13 If any of these rules are not attended the manuscript will bereturned to the author
14 Manuscripts should be sent to the following address
ABCTPPlant Cell Culture amp MicropropagationUniversidade Federal de LavrasDepartamento de Biologia - Setor de Fisiologia VegetalCaixa Postal 3037Lavras ndash MGCEP 37200-000BrazilE-mail abctpuflabr
In vitro propagation of Melissa officinalis L and production 55
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
as clones 1 2 e 3 were selected and axillary shoot induction
takes place from nodal segments (1 cm in length)
subcultivated on MS hormone-free media (MS0) These
materials were used as donors of explants to be tested
with different culture media 05mM a-naphthaleneacetic
acid (NAA) 05mM kinetin (KIN) 05mM benzyladenine
(BA) 28 mM gibberellic acid (GA3) and 05mM indole-3-
acetic acid (IAA) Cultures were grown in 300 mL glass
flasks containing 40 ml of media each
Shoot proliferation rate length of both shoots and
roots and calli formation were monitored as growth
parameters Each treatment was replicated 3 times using
100 explants per repetition Subcultures were performed at
30 days intervals
Acclimatization
A total of 60 in vitro rooted microshoots (those grown
on MS + IAA during 30 days with average height of 10 cm
were removed from the medium and the agar washed gently
with tap water They were transferred to 60 cm diameter
plastic pots containing soil and humus (31 vv) and kept at
a greenhouse High humidity environment was provide by
covering the plants with a plastic foil and watering them
one time per day during the first 2 weeks Then plants were
gradually exposed to greenhouse conditions for 1 month
and finally transferred to the field where they were cultivated
during one year until complete life cycle
Extraction
Field-grown and fresh in vitro plantlets aerial parts
(100 g each) were submitted to hydro distillation for 140 h
in a Clevenger type apparatus as recommended by the
Brazilian Pharmacopoeia (1988) in replicate (n = 2) The
time between the isolation and analysis was the same in all
experiments to preclude differences in composition due to
external factors (SILVA et al 2003)
Gas chromatographic and gas chromatography-massspectrometric analysis
Gas chromatography with flame ionization
detection (GCFID) was carried out on a Varian Star Model
3350 instrument using a capillary column coated with DB-
5 (30 m x 025 mm i d 025 mm film thickness J amp W
Scientific Folsom CA USA) The GC oven was heated
using the following program 40 oC to 220 oC at 4 oC min-1
with an initial isothermal period of 1 min splitless The
detector and injector temperatures were held at 280 oC
Hydrogen was used as carrier gas The injection consisted
of 10 microL of distilled oil diluted with hexane The GCMS
analyses were carried out on a Hewlett-Packard (Agilent
Technologies Avondale USA) Model 5972 MSD coupled
to a HP 5890 GC The GC conditions were the same as
above except for the fact that helium was used as carrier
gas The mass spectrometer was operated on electron
impact mode at 70 eV Molecular assignments were
performed with the help of the Wiley 275 standard library
of mass spectra literature data (ADAMS 1995) authentic
geraniol standard (Sigma Part Number G5135) and mass
spectra interpretation besides the comparison with
previously published elution order (KREIS amp MOSAND
1994) Quantification was performed from GC profiles using
area percent since in the literature the FID response factor
for most of monoterpenes is determined as 1 (CARNAT et
al 1999)
Statistical analysis
Data for each experiment were subjected to analysis
of variance (ANOVA) and means were compared using the
Tukey-Kramer test Percent data were submitted to
significance test ndash difference between two percentages
using the Statistica for WindowsTM 50 version A
significance level of 5 was used for all statistical analysis
RESULTS AND DISCUSSION
In vitro multiplication of Melissa officinalis was
followed during four developing cycles Micropropagation
papers usually present an efficient protocol evaluated in
only one developing cycle This kind of protocol however
may fail when the cultures have to be kept during long
time many successive subcultures being necessary in
order to produce large number of clonal plants
SILVA S da et al56
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
In vitro establishment
In this work three different clones of M officinalis
were used and they had shown similar development
responses on in vitro cultures
The clones 1 and 2 had in vitro multiplication rate
lower than the clone 3 which means a decrease in the
absolute number of nodal segments (Fig 1A and B) From
these results the clone 3 was selected to run the tests
The average number of four new nodes was
produced by explant on MS0 after 30 days and this value
was used as a control to evaluate effects of the presence
of growth regulators in the media (Tab 1)
FIGURE 1 ndash Nodal segments development of three clones of Melissa officinalis on MS+ 05 M IAA during 30 daysA) Multiplication rate of in vitro culture from 2nd to 4th subcultures B) Number of nodal segments developed per clone
TABLE 1 ndash Effect of growth regulators in Melissa officinalis axillary segments culture after four weeks of culture
Culture Media
Shoot Explant
xplusmnse
Shoot Length (CM)
Multiplication Rate (ndeg of
Nodal Segment Explant)
Node Plantlet
xplusmnse
Root Frequency
()
Root Number
Explant xplusmnse
Root Length
(CM) xplusmnse
MS0 171B 403 08B 68C 41 B 50 105 11B 30 06B
05 M KIN 111C 349 11C 33D 31 C 50 073 09C 27 07C
28 M GA3 111C 100 03D 22E 21 D 50 071 09C 25 07C
05 M IAA 191B 1000 09A 95B 51 A 100 897 08A 137 08A
05 M NAA
301A 333 16C 90A 31 C 0 0 - 05 M BA 111C 385 54C 33D 31 C 0 0 -
Value are means (x) plusmn standard error (se) n=100 Values in the same column followed by the same letter do not differstatistically at Pdrdquo005
The influence of plant growth regulators and their
interactions on micropropagation of different plant species
have been discussed in detail by Lameira et al (2005) Rout
et al (1989) Rout amp Das (1997ab) Skirvin et al (1990) and
Zieslin et al (1989)
In this work addition of IAA to MS presented the
best results among all tested growth regulators in all
evaluated parameters However to shoot production there
is no statistical difference to the control The analysis of
effects of the other growth regulators shows that only
05mM NAA was able to improve shoot production
although it is not able to promote rhizogenesis
In vitro propagation of Melissa officinalis L and production 57
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
The use of MS plus 05mM Kinetin or 05mM BA
or 05mM NAA promoted the development of three nodal
segments per elongated plant in 30 days culture (Tab
1) However when BA was used these new shoots
exhibited apical necrosis When GA3 (28 mM) was added
to medium there was induction of only one shoot per
explant and after 30 days there were 2 nodes per
elongated shoot
There was no rooting in explants placed on MS
added of NAA and BA In MS medium containing KIN or
GA3
and in basic MS 50 of the shoots developed new
roots in 30 days of culture
The best result of rhizogenesis was presented
by explants cultured in MS plus IAA where 100 of
shoots rooted with more than 8 new roots per explant
(Tab 1) In terms of root length the cultures in MS
supplemented with IAA presented longer roots when
compared with the other media compositions used at
the present work
In short the addition of 05mM of IAA was chosen
as that presenting the best results in all evaluated
parameters (Fig 2A)
The action of IAA on the in vitro plant
development was in accordance to the known effects of
such hormone (CLELAND 1995) Shoot elongation was
obtained concomitantly with rooting in media MS plus
05 mM IAA That is specially interesting once it may
reduce the micropropagation process through nodal
segments explants to only three steps germination
shoot elongation and multiplication concomitant to
rooting this represents gain of time culture medium
and constitutes a quick micropropagation process
Tavares et al (1996) reported a micropropagation
utilizing cotyledonary nodes as explants The highest
average number of shoots in the two inoculations was
obtained with 2 mgL-1 of BA 24 axillary shoots per
explant 7 in the first inoculation and 17 in the second
one Shoots of the two inoculations were excised after
30 and 60 days respectively
Acclimatization
Melissa officinalis leaves are very sensitive to
water loss and this process is irreversible it was necessary
to provide a high humidity environment during the first
acclimatization period plants were covered with a plastic
foil during 2 weeks before being gradually exposed to
greenhouse conditions The acclimatization procedure
used for in vitro plants was successful and a total of 100
survival rate (n=60) was obtained Acclimatized plants
appeared normal and did not exhibit any morphological
abnormalities or variations These results permitted the
soil cultivation (Fig 2B) without chemical defensives
during one year up to the complete vegetative cycle
(flowering)
Essential oils content
Comparative analysis of the chromatographic
profiles showed high percentage of neral and geranial in
relation to nerol and geraniol in field grown (ex vitro)
plantlets and in MS0 (in vitro)
The relative content of the principal components
of essential oil of the aerial parts of M officinalis are
presented as mean peaks area () on Fig 2C geranial
(3813 and 4364) neral (2674 and 317) geraniol (329 and
153) and nerol (116 and 187) in plants cultured ex vitro
and in vitro respectively Plantlets developed in vitro on
MS0 media showed an increase of 14 times in the
proportion of nerol and 41 times of geraniol when
compared with ex vitro cultured plants
Field plants are exposed to considerable more
stressful conditions such as lower relative humidity higher
light levels and herbivory those are the more stressful
The latter conditions tend to favor a greater essential oil
accumulation (TAVARES et al 2004) On other hand
plantlets grown in vitro have been continuously exposed
to a unique microenvironment that has been selected to
provide minimal stress and nearly optimal conditions for
plant multiplication
SILVA S da et al58
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
FIGURE 2 ndash A) In vitro culture of Melissa officinalis on MS + IAA in 30 days of culture B) Ex vitro culture six monthsafter transference to soil maximum height 60 cm C) Composition and percentage of the most abundant essential oilcomponents of Melissa officinalis from aerial parts (100 g Fresh Weight) from in vitro e ex vitro culture
In vitro propagation of Melissa officinalis L and production 59
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 53-60 2006
CONCLUSIONS
Melissa officinalis micropropagation can be made
using nodal segments from in vitro plants during 5 weeks
in MS media without growth regulators and posterior
subculture in MS media with 05 mM IAA for a better
development Multiplication rates of 44 and 40 were
obtained at the 3rd and 4th subcultures respectively
It was observed a significant difference between
the effects of auxins IAA and NAA The latter exerted an
unsatisfactory influence on the nodal segment formation
shoot length and rooting when compared with the results
obtained with IAA
The plants produced in vitro were vigorous and
after acclimatization they were well adapted After 1 month
at the greenhouse the survival rate was 100
Considering that the main objective of this work is
to produce monoclonal plants to be used by phytomedicine
industries it is important that the method presents a large
number of buds per explant This result plus an efficient
acclimatization stage can save time and produce
monoclonal plants in sufficient number to be used in
commercial field culture Our results showed a change in
the essential oil composition in the proportion of active
compounds However the characteristics of the oil of in
vitro and ex vitro M officinalis plants were not altered
The manipulation of the culture media composition
is an important biotechnological tool for the optimization
of the essential oils production With this technique this
work developed a protocol for highly production of plants
and productivity in the components (geraniol geranial and
neral) of the oil
ACKNOWLEDGMENTS
This work was supported by ICUNIRIO FAPERJ
and CNPq
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Crescimento in vitro de Laelia tenebrosa (Orchidaceae) 61
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
CRESCIMENTO IN VITRO DE Laelia tenebrosa (ORCHIDACEAE)EM DIFERENTES CONCENTRACcedilOtildeES DE SAIS DE KNUDSON C
E CARVAtildeO ATIVADO
IN VITRO GROWTH OF Laelia tenebrosa (ORCHIDACEAE) IN DIFFERENTCONCENTRATIONS OF KNUDSON C SALTS AND ACTIVATED CHARCOAL
APARECIDA GOMES DE ARAUJO1 MOACIR PASQUAL2 ALBA REGINA PEREIRA3HERMINIO SOUZA ROCHA4
1Doutoranda em AgronomiaFitotecnia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash agaraujo2003yahoocombr2Dr Professor Titular do Departamento de Agricultura ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash LavrasMG ndash mpasqualuflabr3Doutoranda no Jardim Botacircnico do Rio de Janeiro ndash ENBTJBRJ ndash Pacheco Leatildeo 915 ndash 22460-030 ndash Rio de Janeiro RJ4Doutorando em AgronomiaFitopatologia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash herminiouflanetcombr
RESUMOObjetivou-se testar diferentes concentraccedilotildees de carvatildeo
ativado adicionado ao meio Knudson C no crescimento in vitrode orquiacutedeas Placircntulas de Laelia tenebrosa (LA Rolfe) LARolfe com 1 a 15 cm de comprimento e contendo raiacutezes foraminoculadas em frascos contendo 40 mL de meio de cultura Ostratamentos consistiram na combinaccedilatildeo de concentraccedilotildees de carvatildeoativado (0 05 10 20 e 40 g L-1) e sais minerais de Knudson C(0 50 100 150 e 200) acrescidos de sacarose (20 g L-1) Omeio foi solidificado com 6 g L-1de aacutegar e o pH ajustado para58plusmn01 antes da autoclavagem a 121degC e 11 atm por 20 minutosApoacutes a inoculaccedilatildeo os frascos foram mantidos sob 25 plusmn 1degCfotoperiacuteodo de 16 horas e 32 mM m-2 s-1 de irradiacircncia Apoacutes 150dias verificou-se que a adiccedilatildeo de 2g L-1 de carvatildeo ativado ao meiocom metade dos sais de Knudson C promoveu melhor crescimentoin vitro das placircntulas de Laelia tenebrosa
Termos para indexaccedilatildeo Orquiacutedea meio de cultura cultura detecidos
ABSTRACTThe objective of this work was to test the effect of
Knudson C medium supplemented with different concentrationsof activated charcoal on the in vitro growth of orchids Plantletsof the Laelia tenebrosa (LA Rolfe) LA Rolfe measuring 1-15cm in length containing roots were inoculated in flasks containing40 mL of culture medium The treatments consisted of differentconcentrations of activated charcoal (0 05 10 20 and 40 g L-
1) combined with Knudson C salts (0 50 100 150 and 200)supplemented with sucrose (20 g L-1) The medium was solidifiedwith agar (6 g L-1) and pH adjusted to 58plusmn01 before autoclavingat 121ordmC and 11 atm during 20 minutes After inoculation theexplants were transferred to culture rooms with temperaturemaintained at 25plusmn1ordmC during a 16 hours photoperiod with a lightintensity of 32 microM m-2s-1 The best in vitro growth rates of
Laelia tenebrosa plantlets were obtained using Knudson C 50supplemented with 2 g L-1 activated charcoal after 150 days ofculture
Index terms Orchid culture medium tissue culture
INTRODUCcedilAtildeO
A produccedilatildeo de orquiacutedeas a partir germinaccedilatildeo
assimbioacutetica eacute uma alternativa viaacutevel para obtenccedilatildeo de
grande nuacutemero de plantas em curto espaccedilo de tempo
suprindo assim a necessidade dos produtores de
orquiacutedeas na aquisiccedilatildeo de mudas
Na cultura de tecidos os meios de cultura
geralmente satildeo compostos de uma fonte de carboidratos
macro e micronutrientes e outras substacircncias como
vitaminas aminoaacutecidos accediluacutecares agente solidificante
reguladores de crescimento (GEORGE amp SHERRINGTON
1984) e eventualmente aditivos como antibioacuteticos carvatildeo
ativado e componentes complexos
Knudson (1922) observou que era possiacutevel o
cultivo de sementes em meio artificial contendo minerais e
accediluacutecar sem a presenccedila de fungos micorriacutezicos
Posteriormente em 1946 ele aperfeiccediloou esse meio de
cultura sendo atualmente o mais utilizado comercialmente
na germinaccedilatildeo e desenvolvimento de orquiacutedeas (ARDITTI
amp ERNST 1992) No entanto satildeo necessaacuterios estudos
(Recebido em 23 de fevereiro de 2006 e aprovado em 10 de julho de 2006)
supplemented with
ARAUJO A G de et al62
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
pois satildeo descritos vaacuterios meios de cultura para muitos
gecircneros e espeacutecies diferentes
No cultivo e subcultivo de placircntulas do gecircnero
Cattleya George et al (1987) sugerem o meio Knudson C
(1946) ou Reinert amp Mohr (1967) Segundo Arditti amp Ernst
(1992) os meios de propagaccedilatildeo para Cattleya Laelia
Laeliocattleya e Brassocattleya podem ser os mesmos
citados anteriormente Villalobos et al (1994) sugerem o
meio Vacin amp Went (1949) para Cattleya Encyclia e
Oncidium suplementado com 25 de aacutegua de coco e o
meio Knudson C suplementado com 60 g L-1 de polpa de
banana para orquiacutedeas do gecircnero Stanhopea
O carvatildeo ativado normalmente eacute adicionado ao meio
de cultura em concentraccedilotildees que variam de 02 a 3
(BEYL 2000) O seu efeito natildeo-seletivo pode proporcionar
resultados negativos na micropropagaccedilatildeo Pesquisas
relatam a adsorccedilatildeo de tiamina aacutecido nicotiacutenico
(WEATHERHEAD et al 1978) piridoxina aacutecido foacutelico
reguladores de crescimento e quelatos de ferro
(JOHANSSON et al 1990) Entre os efeitos proporcionados
pela adiccedilatildeo do carvatildeo ativado ao meio de cultura
principalmente agrave organogecircnese e agrave embriogecircnese estatildeo
escurecimento do meio de cultura favorecendo o
enraizamento adsorccedilatildeo de substacircncias inibitoacuterias
produzidas pelo proacuteprio meio ou explante adsorccedilatildeo de
reguladores de crescimento e outros compostos orgacircnicos
e liberaccedilatildeo de substacircncias naturalmente presentes no
carvatildeo que beneficiariam o crescimento in vitro das culturas
(PAN amp STADEN 1998)
Arena amp Pastur (2001) citam que a adiccedilatildeo de carvatildeo
ativado ao meio de cultura promoveu alongamento das
brotaccedilotildees de Berberis buxifolia mas reduziu o iacutendice de
multiplicaccedilatildeo Hazra et al (2002) relataram o efeito
sinergiacutestico do carvatildeo ativado na multiplicaccedilatildeo e
enraizamento de brotaccedilotildees de algodoeiro Amin amp Jaiswal
(1987) Anderson (1980) e Damiano (1978) relataram o efeito
favoraacutevel do carvatildeo quando utilizado em baixas
concentraccedilotildees no enraizamento de brotaccedilotildees de
morangueiro framboeseira e goiabeira respectivamente
A diversidade de resultados obtidos com a utilizaccedilatildeo de
carvatildeo ativado deve-se principalmente ao genoacutetipo da
espeacutecie em questatildeo agrave adsorccedilatildeo de algumas substacircncias
quiacutemicas e compostos orgacircnicos aleacutem de metaboacutelitos
toacutexicos liberados no cultivo in vitro (Wang amp Huang 1976)
Este trabalho teve como objetivo verificar efeito de
diferentes concentraccedilotildees de sais de Knudson C e carvatildeo
ativado sobre o crescimento in vitro de placircntulas de
orquiacutedea da espeacutecie Laelia tenebrosa (LA Rolfe) LA Rolfe
MATERIAL E MEacuteTODOS
Placircntulas da espeacutecie Laelia tenebrosa com 1 a 15
cm de comprimento oriundas de sementes germinadas in
vitro e contendo raiacutezes foram inoculadas em frascos
contendo 40 mL do meio de cultura Knudson C nas
concentraccedilotildees de 0 (apenas aacutegua destilada e aacutegar) 50 100
(concentraccedilatildeo da formulaccedilatildeo original) 150 e 200 de sais
minerais combinado com carvatildeo ativado (0 05 1 2 e 4
mg L-1) suplementado com sacarose (20 g L-1)
O pH do meio foi ajustado para 58 plusmn 01 antes da
adiccedilatildeo de aacutegar (6 g L-1) O meio foi vertido em frascos de
vidro com capacidade para 250 cm3 vedados com tampas
plaacutesticas transluacutecidas natildeo perfuradas e autoclavados agrave
pressatildeo de 11 atm e agrave temperatura do 121degC durante 20
minutos Apoacutes a inoculaccedilatildeo os frascos contendo os
explantes foram mantidos em sala de crescimento com
irradiacircncia em torno de 32 mmol m-2 s-1 temperatura de 25 plusmn
1degC e fotoperiacuteodo de 16 horas
O delineamento experimental utilizado foi
inteiramente casualizado em esquema fatorial 5 x 5 com
quatro repeticcedilotildees de cinco placircntulas cada uma Decorridos
150 dias avaliou-se a meacutedia do nuacutemero de folhas nuacutemero
de raiacutezes comprimento da maior raiz comprimento da parte
aeacuterea e massa fresca de placircntulas Os dados foram
comparados por meio de regressatildeo polinomial empregando-
se o programa Sisvar (FERREIRA 2000)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Apenas para a variaacutevel nuacutemero de folhas houve
interaccedilatildeo entre os niacuteveis de sais e carvatildeo ativado Poreacutem
Crescimento in vitro de Laelia tenebrosa (Orchidaceae) 63
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
por meio do teste F somente as concentraccedilotildees de 50 e
100 de sais do meio Knudson C foram significativas em
relaccedilatildeo agraves concentraccedilotildees de carvatildeo ativado
Os melhores resultados (65 e 585) foram
verificados com 50 (metade) dos sais de Knudson C
combinado com 275 g L-1 de carvatildeo ativado e 100 de
sais com 4 g L-1 de carvatildeo respectivamente (Figura 1)
Com o aumento da concentraccedilatildeo do meio de cultura haacute
necessidade de maior concentraccedilatildeo de carvatildeo Sendo
assim o meio com 50 de sais aleacutem de proporcionar
melhores resultados eacute menos oneroso
Estes resultados contradizem os de Silva et al
(2003) que verificaram que a adiccedilatildeo de carvatildeo ativado ao
FIGURA 1 ndash Nuacutemero de folhas em placircntulas de Laeliatenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees de saisde Knudson C e carvatildeo ativado
meio de cultura inibe a formaccedilatildeo de folhas em placircntulas de
Brassocattleya lsquoPastoralrsquo x Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo
O efeito natildeo seletivo do carvatildeo ativado pode proporcionar
resultados negativos na micropropagaccedilatildeo (PAN amp
STADEN 1998)
Agrave medida em que aumentaram as concentraccedilotildees de
sais de Knudson C maiores quantidades de raiacutezes foram
formadas (Figura 2A) Observou-se maior nuacutemero de raiz
(43) com 965 de sais Para o fator carvatildeo ativado as
melhores respostas (395 raiacutezes) foram verificadas com a
utilizaccedilatildeo de 304 g L-1 adicionadas ao meio de cultura
(Figura 2B)
Para muitas espeacutecies o enraizamento eacute favorecido
pela adiccedilatildeo de carvatildeo ativado ao meio de cultura Hazra et
al (2002) relataram o efeito sinergiacutestico do carvatildeo ativado
na multiplicaccedilatildeo e enraizamento de brotaccedilotildees de
algodoeiro O meio MS com metade dos sais minerais
acrescido de 20 g L-1 de sacarose 7 g L-1 de aacutegar e 1 g L-1 de
carvatildeo ativado promoveu maior quantidade de raiacutezes em
placircntulas de Cattleya nobilior Rchb f (REIS et al 2003)
Segundo Paiva et al (2005) aleacutem de um equiliacutebrio
hormonal favoraacutevel agrave formaccedilatildeo de raiacutezes outros fatores
internos tecircm sido relacionados com a iniciaccedilatildeo do processo
de enraizamento como presenccedila de sacarose alta relaccedilatildeo
CN e nutrientes minerais (foacutesforo caacutelcio zinco e boro) O
meio Knudson C natildeo possui micronutrientes apresenta
uma concentraccedilatildeo maior de caacutelcio e tem baixas
FIGURA 2 ndash Nuacutemero de raiacutezes em placircntulas de Laelia tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees de sais deKnudson C (A) e concentraccedilotildees de carvatildeo ativado (B)
ARAUJO A G de et al64
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
concentraccedilotildees de N e K em relaccedilatildeo ao MS e WPM o que
provavelmente favoreceu tanto o nuacutemero quanto o
comprimento de raiacutezes (PASQUAL 2001)
O maior comprimento de raiz (331 cm) foi verificado
com a utilizaccedilatildeo de 100 de sais de Knudson C A partir do
ponto maacuteximo (100) houve diminuiccedilatildeo do comprimento
radicular provavelmente devido ao desbalanccedilo nutricional
(Figura 3A) Com o aumento das concentraccedilotildees de carvatildeo
ativado houve um incremento linear no comprimento de
raiacutezes Melhores resultados foram observados com a
utilizaccedilatildeo de 4 g Lndash1 de carvatildeo ativado (Figura 3B) Como a
relaccedilatildeo foi direta pode-se inferir que o efeito estimulante
do carvatildeo ativado no comprimento da maior raiz continuaria
para concentraccedilotildees superiores a 4 g L-1
A adiccedilatildeo de carvatildeo ativado no meio de cultura foi
beneacutefica promovendo tanto o nuacutemero quanto o
crescimento de raiacutezes O carvatildeo conteacutem impurezas que
podem favorecer o crescimento de raiacutezes jaacute existentes e
induzir emissatildeo de novas raiacutezes (PASQUAL 2001)
Melhores resultados para comprimento da parte
aeacuterea (18 cm) foram observados quando se utilizou o
meio Knudson C na concentraccedilatildeo de 121 de sais (Figura
4A) poreacutem na concentraccedilatildeo de 50 obtiveram-se
explantes com 17 cm de comprimento Essa diferenccedila
observada (01 cm) eacute muito pequena o que natildeo justifica a
utilizaccedilatildeo de um meio mais concentrado mas a reduccedilatildeo
do mesmo agrave sua metade
O enraizamento in vitro pode ser favorecido com o
uso de meio de cultura com a metade ou 75 da
concentraccedilatildeo normal de sais Em algumas espeacutecies altas
concentraccedilotildees de sais principalmente a presenccedila de iacuteons
amocircnio favorecem o desenvolvimento de raiacutezes enquanto
que em outras podem ser inibidoras (PASQUAL et al
2001)
O maior comprimento da parte aeacuterea (19 cm) foi
obtido na presenccedila de 4 g Lndash1 de carvatildeo ativado (Figura
4B) a concentraccedilatildeo de 2 g Lndash1 proporcionou um
comprimento de 18 cm Comparando-se os niacuteveis 4 e 2 g Lndash1
de carvatildeo ativado nota-se pequena diferenccedila (01 cm) o
que justifica a utilizaccedilatildeo de 2 g Lndash1
O carvatildeo ativado conteacutem impurezas que quando
liberadas no meio de cultura podem beneficiar ou natildeo o
crescimento in vitro Simotildees et al (1999) verificaram que a
concentraccedilatildeo de 1 g L-1 de carvatildeo ativado acrescida ao
meio Knudson C proporciona o melhor desenvolvimento
de brotos de Epidendrum sp e Dendrobium sp
Maior massa fresca de placircntulas (0144g) foi
verificada com a utilizaccedilatildeo de 50 de sais de Knudson C
ponto a partir do qual houve diminuiccedilatildeo no peso (Figura
5A) Provavelmente essa reduccedilatildeo ocorreu devido agrave
toxidez
A utilizaccedilatildeo de 4 g L-1 de carvatildeo ativado
proporcionou uma massa de 0185 g nas placircntulas frescas
(Figura 5B)
FIGURA 3 ndash Comprimento da maior raiz em placircntulas de Laelia tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees desais de Knudson C (A) e carvatildeo ativado (B)
Crescimento in vitro de Laelia tenebrosa (Orchidaceae) 65
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 61-67 2006
FIGURA 4 ndash Comprimento da parte aeacuterea em placircntulas de Laelia tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees desais de Knudson C (A) e carvatildeo ativado (B)
FIGURA 5 ndash Massa fresca de placircntulas de L tenebrosa cultivadas em diferentes concentraccedilotildees de sais de Knudson C(A) e carvatildeo ativado (B)
O carvatildeo ativado eacute comumente utilizado na cultura
de tecidos de plantas Seu efeito eacute atribuiacutedo agrave adsorccedilatildeo de
substacircncias toacutexicas produzidas pelas plantas adsorccedilatildeo
de fitorreguladores do meio e escurecimento do meio onde
se desenvolvem as raiacutezes das plantas (GEORGE 1993)
O melhor desenvolvimento de Phalaenopsis in
vitro ocorreu na presenccedila de carvatildeo ativado na
concentraccedilatildeo de 2 g L-1 indicando que este possa ser um
elemento importante no processo (BRESSAN et al 1999)
Apesar do carvatildeo ativado na concentraccedilatildeo de 4 g
L-1 ter proporcionado melhores resultados verificou-se que
na concentraccedilatildeo de 2 g L-1 os efeitos apresentam uma
diferenccedila miacutenima Embora o carvatildeo ativado natildeo seja o
componente de maior custo no preparo de meio de cultura
a sua reduccedilatildeo juntamente com os sais minerais eacute
economicamente favoraacutevel especialmente para a produccedilatildeo
comercial de mudas
CONCLUSAtildeO
A adiccedilatildeo de 2 g L-1 de carvatildeo ativado ao meio de
cultura Knudson C com metade (50) de sais minerais
promoveu melhor crescimento em placircntulas de Laelia
tenebrosa cultivadas in vitro
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PROPAGACcedilAtildeO IN VITRO DE PLAcircNTULAS DE ORQUIacuteDEA EMDIFERENTES MEIOS DE CULTURA E CONCENTRACcedilOtildeES
DE CITOCININA
IN VITRO PROPAGATION OF ORCHID PLANTLETS CULTIVATED IN DIFFERENTCULTURE MEDIA AND CYTOKININ CONCENTRATIONS
APARECIDA GOMES DE ARAUJO1 MOACIR PASQUAL2 ADRIANO BORTOLOTTI DA SILVA3 FABIacuteOLA VILLA3 HERMIacuteNIO SOUZA ROCHA3 FERNANDA CARVALHO COSTA4
1Doutoranda em AgronomiaFitotecnia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash agaraujo2003yahoocombr2Professor Titular Departamento AgriculturaDAG ndash Universidade Federal de Lavras UFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200000 ndash Lavras MG ndash mpasqualuflabr3Doutorando em Agronomia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200000 ndash Lavras MG4Departamento de AgriculturaDAG ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash fecostapuryahoocombr
RESUMOA taxa de multiplicaccedilatildeo de orquiacutedeas a partir de meacutetodos
convencionais eacute bastante baixa natildeo atendendo as necessidadescomerciais A cultura de tecidos permite maiores taxas demultiplicaccedilatildeo e obtenccedilatildeo de plantas uniformes e sadiasObjetivou-se estudar a influecircncia da citocinina BAP (6-benzilaminopurina) em diferentes meios de cultura napropagaccedilatildeo in vitro de placircntulas hiacutebridas de BrassocattleyalsquoPastoralrsquox Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo Placircntulas comaproximadamente 15plusmn05 cm de comprimento obtidasassimbioticamente foram transferidas para frascos comcapacidade de 250 cm3 contendo 40 mL das formulaccedilotildees salinasde MS WPM e Knudson C combinados com 0 05 10 20 e40 mg L-1 de BAP acrescidos de 2 g L-1 de carvatildeo ativadosolidificado com 6 g L-1 de aacutegar e pH ajustado para 58plusmn01Apoacutes a inoculaccedilatildeo os frascos foram incubados a 25plusmn2oC 35igravemolm-2s-1 de intensidade luminosa e sob fotoperiacuteodo de 16horas Apoacutes 90 dias observou-se que melhores resultados parapropagaccedilatildeo in vitro em placircntulas de orquiacutedea Bc lsquoPastoralrsquo x LclsquoAmber Glowrsquo satildeo obtidos com o meio WPM A suplementaccedilatildeode 4 mg L-1 de BAP no meio WPM favorece o crescimento invitro Para a multiplicaccedilatildeo maior quantidade de brotos eacuteconseguida em meio MS na ausecircncia de BAP
Termos para indexaccedilatildeo Orquiacutedea crescimento in vitrocitocinina
ABSTRACTThe multiplication rate of orchids by conventional
methods is considerably low and does not attend its commercialneeds Tissue culture results in larger multiplication rates andproduces uniform and healthy orchid plantlets The objective ofthis work was to study the influence of the cytokinin BAP (6-benzilaminopurine) in different culture media for ther in vitropropagation of Brassocattleya lsquoPastoralrsquox Laeliocattleya lsquoAmberGlowrsquo hybrid plantlets Plantlets measuring approximately 15plusmn 05 cm length deriving from in vitro germination were inoculated
in flasks of 250 cm3 volume containing 40 mL MS WPM andKnudson C salt formulations combined with BAP (0 05 1 2and 4 mg L-1) supplemented with 2 g L-1 activated charcoalsolidified with 6 g L-1 agar and pH adjusted for 58 plusmn 01 Afterthe inoculation the plantlets maintained in a growth room at25plusmn2ordmC 35 mMol m-2 s-1 light intensity and 16 hoursphotoperiod After 90 days the best results for the in vitropropagation of orchid plantlets Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquowere obtained with half strength WPM The supplementation of4 mg L-1 BAP to the WPM medium favors in vitro growth Forthe multiplication phase the largest number of sprouts is achievedwith full strength MS medium in the absence of BAP
Index terms Orchid in vitro growth cytokinin
INTRODUCcedilAtildeO
As orquiacutedeas satildeo consideradas as plantas
ornamentais haacute mais tempo cultivadas pelo homem
Pertencem agrave famiacutelia Orchidaceae a maior entre as
monocotiledocircneas e tambeacutem entre as plantas ornamentais
com 600 - 800 gecircneros e 25000-35000 espeacutecies (SHEEHAN
1983) totalizando 7 das plantas ornamentais do mundo
(Van Der PIJL amp DODSON 1966)
A propagaccedilatildeo de orquiacutedeas pode ser tanto
vegetativa quanto por meio de sementes Estas embora
produzidas em grande quantidade natildeo possuem
endosperma funcional prescindindo para tanto da
associaccedilatildeo simbioacutetica com fungos micorriacutezicos dentre os
quais a Rhizoctonia que eacute um dos gecircneros mais importante
(PIERIK 1987 SHEEHAN 1983)
(Recebido em 08 de dezembro de 2005 e aprovado em 10 de julho de 2006)
Propagaccedilatildeo in vitro de placircntulas de orquiacutedea 69
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 68-73 2006
Knudson (1922) observou que era possiacutevel o cultivo
de sementes em meio artificial contendo apenas sais
nutritivos e accediluacutecar na ausecircncia de fungos Posteriormente
em 1946 o mesmo autor aperfeiccediloou este meio de cultura
sendo atualmente um dos mais utilizados comercialmente
na germinaccedilatildeo e desenvolvimento de orquiacutedeas (ARDITTI
amp ERNST 1992) No entanto satildeo necessaacuterios estudos
pois satildeo descritos vaacuterios meios de cultura para muitos
gecircneros e espeacutecies diferentes O meio de cultura mais
utilizado na cultura de tecidos em geral eacute o MS (Murashige
amp Skoog 1962) podendo-se encontrar o uso de outros
meios como Knudson C (1946) e WPM (Wood Plant
Medium) de Loyd amp McCown (1980)
Reguladores de crescimento em diferentes
concentraccedilotildees tecircm sido usados conforme a espeacutecie e a
metodologia utilizada Podem ser necessaacuterios para a
germinaccedilatildeo de sementes formaccedilatildeo de calos e brotaccedilotildees
adventiacutecias (GRATTAPAGLIA amp MACHADO 1998
PASQUAL 2001)
O regulador de crescimento BAP (6-
benzilaminopurina) eacute uma citocinina largamente utilizada
para estimular a induccedilatildeo de brotos em plantas ornamentais
Para o cultivo in vitro de orquiacutedeas do grupo Cattleya a
citocinina BAP geralmente eacute utilizada nas concentraccedilotildees
que variam entre 005 e 10 mg L-1 (CARVALHO 2002)
Martini et al (2001) trabalhando com a orquiacutedea
Gongora quinquenervis observaram que a presenccedila do
BAP inibe a multiplicaccedilatildeo de calos e o potencial
organogecircnico Silva (2003) concluiu que para o estaacutedio de
subcultivo de Brassocattleya lsquoPastoralrsquo x Laeliocattleya
lsquoAmber Glowrsquo natildeo haacute necessidade da adiccedilatildeo de BAP como
estiacutemulo ao desenvolvimento geral do explante Melhor
proliferaccedilatildeo de brotos formaccedilatildeo de raiacutezes nuacutemero de
folhas e comprimento de brotos em Dendrobium foram
obtidos com 25 mg L-1 de BAP + 05 mg L-1 de ANA
adicionados ao meio MS (TALUKDER et al 2003)
Aleacutem do tipo de meio outro aspecto importante na
multiplicaccedilatildeo in vitro estaacute relacionado com o tipo de
citocinina e sua concentraccedilatildeo sendo ambos determinantes
no sucesso da micropropagaccedilatildeo (GRATTAPAGLIA amp
MACHADO 1998)
O maior entrave no processo de micropropagaccedilatildeo
de orquiacutedeas estaacute relacionado ao tempo necessaacuterio para a
produccedilatildeo de mudas a partir de plantas hiacutebridas
selecionadas e a utilizaccedilatildeo de meio de cultura adequado
para cada espeacutecie Assim objetivou-se estudar o efeito de
diferentes concentraccedilotildees de BAP e formulaccedilotildees de minerais
nutritivos em meios de cultura na propagaccedilatildeo in vitro de
placircntulas de orquiacutedea oriundas do hiacutebrido Brassocattleya
lsquoPastoralrsquo x Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo
MATERIAL E MEacuteTODOS
Placircntulas hiacutebridas oriundas de sementes
germinadas assimbioticamente em meio Knudson C
obtidas do cruzamento entre Brassocattleya lsquoPastoralrsquo x
Laeliocattleya lsquoAmber Glowrsquo com aproximadamente
15plusmn05 cm de comprimento foram transferidas para frascos
de 250 cm3 de capacidade contendo 40 mL de meio de
cultura e vedados com tampas plaacutesticas transluacutecidas Os
tratamentos consistiram de diferentes formulaccedilotildees salinas
(MS WPM e Knudson C em suas formulaccedilotildees originais)
combinadas com 0 05 10 20 e 40 mg L-1 de BAP
acrescidos de 2 g L-1 de carvatildeo ativado solidificado com
6 g L-1 de aacutegar e pH ajustado para 58plusmn01 antes da
autoclavagem obtida a 121ordmC e 1 atm por 20 minutos
Posteriormente agrave inoculaccedilatildeo os frascos foram
transferidos para sala de crescimento com temperatura
de 25plusmn2ordmC fotoperiacuteodo de 16 horas e 35 mmolm-2s-1 de
intensidade luminosa fornecida por lacircmpadas do tipo
(Grow-lux) e luz do dia especial O delineamento
experimental utilizado foi inteiramente casualizado no
esquema fatorial 3 x 5 com cinco repeticcedilotildees de quatro
placircntulas cada sendo cada repeticcedilatildeo composta por um
frasco
Apoacutes 90 dias da instalaccedilatildeo do experimento foram
avaliados nuacutemero meacutedio de brotos comprimento meacutedio
da parte aeacuterea nuacutemero meacutedio de raiacutezes nuacutemero meacutedio de
folhas e meacutedia da massa fresca total de placircntulas
ARAUJO A G de et al70
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 68-73 2006
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Para a variaacutevel nuacutemero de folhas natildeo houve
significacircncia dos fatores isolados nem da interaccedilatildeo entre
eles O nuacutemero de raiacutezes e massa fresca total de placircntulas
apresentaram significacircncia apenas para o fator meio de
cultura enquanto que para nuacutemero de brotos e
comprimento da parte aeacuterea a interaccedilatildeo dos fatores foi
significativa (Tabela 1)
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de brotos observou-se
interaccedilatildeo entre os fatores BAP e os meios de cultura
utilizados (Tabela 1) Poreacutem pelo teste F verificou-se que
apenas o meio MS foi significativo em relaccedilatildeo agraves
concentraccedilotildees de BAP (Figura 1)
O maior nuacutemero de brotos (334) foi registrado na
formulaccedilatildeo de MS adicionado de 40 mg L-1 de BAP
Entretanto na ausecircncia dessa citocinina foi observada a
formaccedilatildeo de 304 brotosplanta (Figura 1) Diante da
pequena diferenccedila na quantidade meacutedia de brotos
formados entre a maior concentraccedilatildeo e o tratamento sem
o regulador de crescimento justifica-se a utilizaccedilatildeo do
meio de cultura sem o BAP Estes resultados concordam
com Silva (2003) que obteve maior nuacutemero de brotos (2
brotos) na ausecircncia de BAP para esse mesmo hiacutebrido
poreacutem em meio Knudson C
A natildeo utilizaccedilatildeo de reguladores de crescimento
adicionados ao meio de cultura vai influenciar na
reduccedilatildeo dos custos de produccedilatildeo de mudas jaacute que esse
eacute um dos componentes mais onerosos Isso eacute
extremamente importante principalmente para
laboratoacuterios comerciais
TABELA 1 ndash Resumo da anaacutelise de variacircncia para as caracteriacutesticas meacutedias de nuacutemero de folhas (NF) nuacutemero de raiacutezes(NR) nuacutemero de brotos (NB) comprimento da parte aeacuterea (CPA) e massa fresca total de placircntulas (MFP) e respectivoscoeficientes de variaccedilatildeo (CV)
significativo a 1 e 5 de probabilidade respectivamente pelo teste F
FIGURA 1 ndash Efeito do meio de cultura MS e concentraccedilotildees de BAP no nuacutemero meacutedio de brotos em placircntulas hiacutebridasde Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo apoacutes 90 dias da incubaccedilatildeo
Fontes de variaccedilatildeo GL Quadrados meacutedios
NF NR NB CPA MFP Meios 2 125683 ns 162740 01483 ns 53139 02372 BAP 4 186198 ns 44693 ns 04408 ns 03373 ns 00075 ns
Meio x BAP 8 243984 ns 13417 ns 17417 13579 00459 ns
Resiacuteduo 45 124475 21329 05055 05961 00662 CV () 3467 3081 2801 2443 5100
Propagaccedilatildeo in vitro de placircntulas de orquiacutedea 71
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 68-73 2006
O estiacutemulo agrave brotaccedilatildeo em placircntulas de Spathoglottis
plicata Griff ocorreu em meio MS suplementado com 10
mg L-1 de BAP e 25 mg L-1 de ANA tendo o enraizamento
estimulado com 20 mg L-1 de AIB (NAYAK et al 1999)
TDZ tambeacutem eacute utilizado em associaccedilatildeo com BAP para
regeneraccedilatildeo de brotos de Rhynchostylis (BUI Le al 1999)
e de Anoectochilus (LI et al 1999) todas orquidaceaes
Observou-se interaccedilatildeo entre o tipo de meio de
cultura e o BAP no que diz respeito ao comprimento de
parte aeacuterea das placircntulas (Tabela 1) Pelo teste de F apenas
o meio WPM foi significativo em relaccedilatildeo agraves concentraccedilotildees
de BAP (Figura 2)
O maior comprimento da parte aeacuterea (47 cm) foi
observado quando se utilizou o meio WPM combinado
com 40 mg L-1 de BAP (Figura 2) Como a relaccedilatildeo foi direta
pode-se inferir que o efeito estimulatoacuterio do BAP sobre o
crescimento da parte aeacuterea continuaria mesmo em
concentraccedilotildees maiores que 40 mg L-1 Talukder et al (2003)
obtiveram melhor comprimento de brotos (0472 cm) em
placircntulas de Dendrobium com utilizaccedilatildeo de 25 mg L-1 de
BAP + 05 mg L-1 de ANA adicionados ao meio MS
Relativo ao nuacutemero meacutedio de raiacutezes houve
significacircncia apenas para o fator meio de cultura (Tabela 1)
Na Tabela 2 verifica-se que os maiores valores foram obtidos
com os meios WPM (557) seguido do MS (487) sendo os
menores valores verificados no meio Knudson C (378) A
emissatildeo de novas raiacutezes eacute favorecida pelo caacutelcio e pelo boro
O meio Knudson C apresenta uma concentraccedilatildeo maior de
caacutelcio e menor de boro em relaccedilatildeo aos meios MS e WPM
que possuem concentraccedilotildees semelhantes de ambos
Segundo Pierik (1987) em concentraccedilotildees mais elevadas
(1 a 10 mg L-1) as citocininas podem induzir a formaccedilatildeo de
gemas adventiacutecias quebrando a dominacircncia apical e retardando
a formaccedilatildeo de raiacutezes Talukder et al (2003) encontraram maior
nuacutemero de raiacutezes (193explante) em placircntulas de Dendrobium
com utilizaccedilatildeo de 25 mg L-1 de BAP + 05 mg L-1 de ANA
adicionados ao meio MS O estiacutemulo ao enraizamento em
Spathoglottis plicata ocorreu em meio MS suplementado com
20 mg L-1 de AIB (NAYAK et al 1999)
FIGURA 2 ndash Comprimento meacutedio da parte aeacuterea em placircntulas hiacutebridas Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo cultivadas emmeio de cultura WPM e diferentes concentraccedilotildees de BAP
TABELA 2 ndash Efeito de diferentes meios de cultura sobreo nuacutemero meacutedio de raiacutezes em placircntulas hiacutebridas de BclsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo
Meios de Cultura Nuacutemero meacutedio de raiacutezes
WPM 557 a MS 487 a KC 378 b
Meacutedias seguidas pela mesma letra natildeo diferem entre sipelo teste de Scott-Knott a 5
ARAUJO A G de et al72
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O efeito ora inibitoacuterio ora estimulatoacuterio dos
fitorreguladores na formaccedilatildeo de brotos e raiacutezes em
diferentes plantas pode estar associado agrave proacutepria
concentraccedilatildeo bem como a absorccedilatildeo dos reguladores de
crescimento pelo substrato (GEORGE 1996) agrave habituaccedilatildeo
(SANTANA amp PAIVA 2001) ou agrave deficiecircncia de proteiacutena
ligante promotora da atuaccedilatildeo das citocininas (TAIZ amp
ZEIGER 1998)
O nuacutemero de folhas natildeo apresentou diferenccedilas
significativas para os tratamentos estudados
isoladamente nem houve interaccedilatildeo entre eles (Tabela 1)
Talukder et al (2003) obtiveram maior nuacutemero de folhas
(425placircntula) em Dendrobium com utilizaccedilatildeo de 25 mg L-
1 de BAP + 05 mg L-1 de ANA adicionados ao meio MS
Para massa fresca de placircntulas houve significacircncia
apenas para o fator meio de cultura isoladamente (Tabela
1) Atraveacutes do teste de meacutedias constatou-se maior massa
de placircntulas frescas nos meios WPM e MS com 0524 e
0503g respectivamente Resultado inferior (0326g) foi
registrado em meio Knudson C (Tabela 3)
TABELA 3 ndash Efeito do meio de cultura na massa frescatotal de placircntulas do hiacutebrido Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmberGlowrsquo
Meios de Cultura Massa fresca total de placircntulas (g)
WPM 0524 a MS 0503 a KC 0326 b
Meacutedias seguidas pela mesma letra natildeo diferem entre sipelo teste de Scott-Knott a 5
Dignart (2003) estudando a germinaccedilatildeo in vitro
de sementes de Cattleya nobilior Rchbf em diferentes
meios de cultura (MS WPM Knudson C e B5 de
GAMBORG et al 1968) observou que natildeo houve
diferenccedilas entre os meios utilizados O BAP adicionado
ao meio de cultura provocou aumento da taxa de brotaccedilatildeo
a partir de 1 igravemolL
Segundo (PASQUAL 2001) os meios MS e WPM
possuem concentraccedilotildees similares de micronutrientes e satildeo
ricos em nitrogecircnio (N) e potaacutessio (K) Jaacute o meio Knudson C
natildeo possui micronutrientes e tem baixas concentraccedilotildees de
N e K em relaccedilatildeo ao MS e WPM Os melhores resultados
para as variaacuteveis analisadas foram observados em meio WPM
e MS Essa resposta provavelmente deveu-se ao fato de
que o meio Knudson C possui diferentes sais minerais e
embora seja muito utilizado na germinaccedilatildeo de sementes de
orquiacutedeas parece natildeo propiciar condiccedilotildees satisfatoacuterias para
o desenvolvimento de placircntulas de algumas espeacutecies de
orquiacutedeas
Sabe-se que existe uma relaccedilatildeo entre o nuacutemero de
brotos e seu tamanho e nessa relaccedilatildeo quanto maior for o
nuacutemero de brotos menor o tamanho dos mesmos
(GEORGE 1996) Essa relaccedilatildeo fez-se presente ateacute a
concentraccedilatildeo de 20 mg L-1 de BAP em Bc lsquoPastoralrsquo x Lc
lsquoAmber Glowrsquo No entanto em concentraccedilotildees superiores
tanto o nuacutemero quanto o comprimento dos brotos
aumentaram Tal diversidade de resultados estaacute
relacionada principalmente ao genoacutetipo da espeacutecie meio
de cultura e possivelmente agrave interferecircncia na accedilatildeo dos
reguladores de crescimento
Segundo Malaure et al (1991) diferentes efeitos
dos reguladores de crescimento podem ocorrer para
diferentes espeacutecies inclusive variaccedilotildees dentro de uma
mesma espeacutecie Em orquiacutedeas o efeito dos reguladores de
crescimento e de meios de cultura satildeo diversificados
principalmente quando se utiliza um hiacutebrido trigeneacuterico
com alto grau de heterozigose
CONCLUSOtildeES
Melhores resultados para propagaccedilatildeo in vitro de
placircntulas de orquiacutedea Bc lsquoPastoralrsquo x Lc lsquoAmber Glowrsquo satildeo
obtidos com o meio WPM A suplementaccedilatildeo de 4 mg L-1 de
BAP no meio WPM favorece o crescimento in vitro Para
a multiplicaccedilatildeo maior quantidade de brotos eacute conseguida
em meio MS na ausecircncia de BAP
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SILVEIRA D G et al74
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
EFEITO DO VIacuteRUS DAS ESTRIAS DA BANANEIRA NAMICROPROPAGACcedilAtildeO E NO CRESCIMENTO DAS PLANTAS DA
CULTIVAR CAIPIRA DURANTE A ACLIMATIZACcedilAtildeO1
EFFECT OF BANANA STREAK VIRUS ON MICROPROPAGATION AND PLANTGROWTH OF CULTIVAR CAIPIRA DURING ACLIMATIZATION
DANIELA GARCIA SILVEIRA2 ANTOcircNIO DA SILVA SOUZA3 PAULO ERNESTO MEISSNER FILHO3TALES MILER SOARES4 RANULFO CORREA CALDAS3 KAacuteTIA REGINA BARBOSA LEAtildeO5
1Parte da Dissertaccedilatildeo de Mestrado apresentada pelo primeiro autor ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias Agraacuterias da Escola de AgronomiaUFBA ndash Cruz das Almas BA2Doutoranda em Botacircnica ndash Universidade Estadual de Feira de SantanaUEFS ndash Feira de Santana BA ndash danielagsigcombr3Pesquisador da Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical ndash Caixa Postal 007 ndash 44380-000 ndash Cruz das Almas BA4Doutorando da Escola Superior Luis de QueirozEsalq ndash Piracicaba SP ndash tmsoaresesalquspbr5Engenheira Agrocircnoma MSc EBDA ndash Cruz das Almas BA ndash 44380-000 ndash krbleaohotmailcom
(Recebido em 12 de abril de 2006 e aprovado em 28 de agosto de 2006)
RESUMOAvaliaram-se os efeitos da infecccedilatildeo pelo viacuterus das estrias
de bananeira (Banana Streak Virus BSV) no desenvolvimento invitro e no crescimento das plantas da cultivar Caipira durante aaclimatizaccedilatildeo Utilizou-se o delineamento experimentalinteiramente casualizado com dois tratamentos plantas sadias eplantas infectadas pelo BSV com respectivamente 24 e 28repeticcedilotildees Os explantes foram desinfestados e estabelecidos emmeio MS baacutesico suplementado com 30 gL de sacarose solidificadocom 2 gL de lsquoPhytagelrsquo e pH ajustado em 58 Foram efetuadoscinco subcultivos em meio com 4 mgL de BAP (6-benzilaminopurina) e as plantas obtidas foram enraizadas nessemesmo meio de cultura sem reguladores de crescimento Apoacutesessa etapa transferiram-se as plantas para a aclimatizaccedilatildeo emcacircmara uacutemida onde permaneceram por 30 dias Avaliaram-se astaxas de multiplicaccedilatildeo a presenccedila in vitro dos sintomas do BSVnos explantes provenientes das plantas infectadas durante amicropropagaccedilatildeo e aclimatizaccedilatildeo as perdas por contaminaccedilatildeoenvolvendo fungos e bacteacuterias nas fases da micropropagaccedilatildeo e aaltura das plantas na fase da aclimatizaccedilatildeo A infecccedilatildeo pelo BSVnatildeo afetou significativamente a multiplicaccedilatildeo e o crescimento invitro das plantas sendo os sintomas do viacuterus visiacuteveis em todasas fases da micropropagaccedilatildeo e na aclimatizaccedilatildeo das plantasinfectadas A maior porcentagem de contaminaccedilatildeo ocorreu nafase de estabelecimento in vitro dos explantes independentementedos tipos de plantas utilizadas Apoacutes 30 dias de aclimatizaccedilatildeo asplantas com BSV apresentaram altura inferior agraves plantas sadiasA presenccedila do viacuterus natildeo influenciou a taxa de multiplicaccedilatildeo dosexplantes poreacutem afetou o crescimento das plantas infectadas
Termos para indexaccedilatildeo Musa BSV cultura de tecidospropagaccedilatildeo in vitro
ABSTRACTThe effects of the banana streak virus (BSV) infection on
in vitro development of the cultivar Caipira were evaluated The
used experimental design was a completely randomized withtwo treatments healthy plants and plants infected by BSV with24 and 28 replications respectively The explants weredisinfected and established in a basic MS medium supplementedwith 30 gL sucrose solidified with 2 gL lsquoPhytagelrsquo and pHadjusted to 58 Five subcultures were carried out in a mediumcontaining 4 mgL BAP (6-benzylaminopurine) and the plantletswere rooted in the same culture medium without growthregulators Afterwards the plantlets were transferred to a humidchamber for acclimatization during a 30-day periodMultiplication rates presence of BSV symptoms on in vitroexplants obtained from plants infected during themicropropagation and acclimatization periods losses caused byfungal and bacterial contamination and plantlet height at theacclimatization stage were evaluated The infection by BSVpresented no significant effect on the multiplication rate and invitro plant growth although the virus symptoms were visible inall the micropropagation phases and during the acclimatizationof infected plants The highest percentage of contaminationoccurred during the in vitro establishment phase regardless theused plants After 30 days of acclimatization the plants withBSV presented a lower height compared to the healthy plantsAlthough the presence of the virus had no influence on the explantmultiplication rate it affected the growth of infected plants
Index terms Musa BSV tissue culture in vitro propagation
INTRODUCcedilAtildeO
As bananeiras estatildeo sujeitas as vaacuterias doenccedilas
causadas por fungos bacteacuterias nematoacuteides e viacuterus que
satildeo limitantes agrave sua capacidade de produccedilatildeo Entre as
viroses que ocorrem no Brasil destaca-se a causada pelo
viacuterus das estrias da bananeira (Banana streak virus BSV)
Efeito do viacuterus das estrias da bananeira 75
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
que eacute particularmente importante para os programas de
melhoramento geneacutetico e de multiplicaccedilatildeo comercial de
cultivares uma vez que pode ser incorporada ao genoma e
transmitida pelas sementes de plantas infectadas
(DANIELLS et al 1995) aleacutem de natildeo existir um meacutetodo
eficiente para limpar uma planta infectada com BSV
(LOCKHART 1994)
Esse viacuterus natildeo eacute transmitido mecanicamente sendo as
mudas infectadas sua principal forma de disseminaccedilatildeo
(LOCKHART amp AUSTREY 1988 LOCKHART 1994) A
transmissatildeo eacute feita de maneira semi-persistente pela cochonilha-
dos-citros Planococcus citri Risso e pela cochonilha-da-cana-
de-accediluacutecar Saccharicoccus sacchari cocherell (LOCKHART
1993 LOCKHART amp AUSTREY 1988)
O BSV inicialmente causa na bananeira um estriado
cloroacutetico de linhas descontiacutenuas dispersas e concentradas
em partes da lacircmina foliar Com o envelhecimento das
folhas o estriado causa necrose de coloraccedilatildeo marrom-cafeacute
a negro (RAMIREZ amp RIVERA 1994) As plantas
infectadas geralmente natildeo mostram sintomas em todas as
folhas (CORDEIRO amp KIMATI 1997 LOCKHART 1986)
Outros sintomas do BSV satildeo a reduccedilatildeo do vigor da planta
e a diminuiccedilatildeo do tamanho dos frutos que tambeacutem ficam
deformados (RAMIREZ amp RIVERA 1994)
Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos
da infecccedilatildeo pelo BSV na multiplicaccedilatildeo in vitro e no
crescimento durante a aclimatizaccedilatildeo das plantas de
bananeira da cultivar Caipira Aleacutem disso avaliou-se a taxa
de contaminaccedilatildeo por fungos e bacteacuterias na etapas da
micropropagaccedilatildeo devido a importacircncia dessa variaacutevel na
multiplicaccedilatildeo in vitro das plantas
MATERIAL E MEacuteTODOS
O estudo dos efeitos do BSV na micropropagaccedilatildeo
da cultivar Caipira (grupo AAA) foi conduzido no
Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos da Embrapa Mandioca
e Fruticultura Tropical Utilizou-se o delineamento
experimental inteiramente casualizado com dois
tratamentos plantas sadias com 24 repeticcedilotildees coletadas
no Banco de Germoplasma de Bananeira da Embrapa
Mandioca e Fruticultura Tropical e plantas infectadas com
BSV com 28 repeticcedilotildees Foram usadas mudas do tipo
chifrinho sendo que as matrizes infectadas com BSV com
altura meacutedia de 12 cm foram infestadas pela cochonilha
vetora Planacoccus citri Risso alimentadas em folhas de
banana lsquoMysorersquo com sintomas de BSV em casa-de-
vegetaccedilatildeo Aproximadamente 15 dias apoacutes a infestaccedilatildeo
todas as 28 plantas estavam com os sintomas da virose
Para o estabelecimento in vitro realizou-se a limpeza
das matrizes por meio de uma seacuterie de cortes removendo-
se parte do rizoma e do pseudocaule ateacute o tamanho
aproximado de 50 cm de altura por 15 cm de diacircmetro
lavando-se com detergente e aacutegua deionizada A
desinfestaccedilatildeo foi feita em cacircmara de fluxo laminar
imergindo os explantes em soluccedilatildeo de aacutelcool 70 por
cinco minutos e em soluccedilatildeo 11 de aacutegua sanitaacuteria comercial
(2 de cloro ativo) com aacutegua deionizada por 30 minutos
Em seguida foram realizadas trecircs lavagens com aacutegua
deionizada esterilizada e reduzidos os explantes ateacute o
tamanho final de 06 cm de altura por 04 cm de diacircmetro
As etapas de estabelecimento multiplicaccedilatildeo e
enraizamento foram realizadas em meio nutritivo MS baacutesico
(MURASHIGE amp SKOOG 1962) suplementado com 30 g
L de sacarose solidificado com 2 gL de ldquoPhytagelrdquo e pH
ajustado para 58 Apenas na fase de multiplicaccedilatildeo o meio
MS foi suplementado com 4 mgL de 6-benzilaminopurina
(BAP) Em todas as etapas os explantes foram dispostos
sobre 25 mL de meio de cultura em frascos com 12 cm de
altura por 5 cm de diacircmetro
A multiplicaccedilatildeo foi realizada em cinco subcultivos
das gemas e brotos sendo efetuada a subdivisatildeo
longitudinal dos explantes sempre que possiacutevel O
estabelecimento e os cinco subcultivos foram realizados
com intervalos de 30 dias Apoacutes os subcultivos as
plantas permaneceram 30 dias em enraizamento O
estudo foi desenvolvido sob condiccedilotildees de temperatura
de 27 plusmn 1ordmC fotoperiacuteodo de 16 horas e intensidade
luminosa de 22 microEm2s
SILVEIRA D G et al76
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
Apoacutes o enraizamento in vitro 47 plantas sadias e 40
plantas infectadas com BSV foram transferidas para copos
plaacutesticos de 300 cm3 contendo o Plantmaxreg e vermiculita
(21) permanecendo 30 dias sob condiccedilotildees de 85 de umidade
relativa do ar e 60 de sombreamento em casa-de-vegetaccedilatildeo
Na fase de estabelecimento e em cada subcultivo
foram avaliadas as taxas de multiplicaccedilatildeo e a presenccedila dos
sintomas do BSV nos explantes provenientes das plantas
infectadas Na fase de aclimatizaccedilatildeo avaliaram-se a
presenccedila de sintomas nas plantas infectadas e as suas
respectivas alturas As medidas foram tomadas do coleto
ateacute a extremidade apical da folha mais alta
Os dados referentes ao nuacutemero de gemas obtidas
nos cinco subcultivos foram transformados em raiz
quadrada Foi estabelecida uma regressatildeo linear para cada
tratamento em funccedilatildeo dos subcultivos
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
A infecccedilatildeo pelo BSV natildeo afetou significativamente
o crescimento e a multiplicaccedilatildeo das plantas sendo que o
nuacutemero de gemas cresceu linearmente em funccedilatildeo dos
subcultivos em ambos os tratamentos Trabalhando com
plantas micropropagadas de bananeira sadias e infectadas
com o viacuterus do topo em leque (Banana bunchy top virus
BBTV) Thomas et al (1995) observaram que aquela virose
tambeacutem natildeo afetou a capacidade das plantas em crescer e
multiplicar Nas anaacutelises de regressatildeo realizadas para os
dois tratamentos (plantas sadias e plantas com BSV) o
acreacutescimo no nuacutemero de gemas em funccedilatildeo dos subcultivos
pode ser explicado por um modelo de regressatildeo linear
(Figura 1) As estimativas da regressatildeo linear para plantas
com BSV e plantas sadias foram altamente significativas e
os coeficientes de determinaccedilatildeo (R2) proacuteximos de 1 Foi
observado que as linhas determinadas a partir das
equaccedilotildees obtidas satildeo quase superpostas evidenciando
um comportamento semelhante entre os dois tratamentos
com relaccedilatildeo ao nuacutemero de gemas por subcultivo
Em todas as fases da micropropagaccedilatildeo os sintomas
do BSV foram visiacuteveis ocorrendo nas folhas das plantas
infectadas estriados cloroacuteticos com linhas descontiacutenuas e
FIGURA 1 ndash Curvas de regressatildeo linear obtidas a partir dosdados de gemas em cada subcultivo da cultivar de bananeiraCaipira sadias e infectadas com BSV Cruz das Almas (BA)Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical 2006Dados transformados por x
dispersas (Figura 2) Esses mesmos sintomas foram
observados em plantas de bananeira infectadas com BSV
mantidas a campo (RAMIREZ amp RIVERA 1994)
As contaminaccedilotildees que ocorreram nos materiais
in vitro foram tambeacutem avaliadas As maiores taxas de
contaminaccedilatildeo aconteceram na fase de estabelecimento
in vitro dos explantes obtendo-se niacuteveis de 21 e 32
para as plantas sadias e infectadas com BSV
respectivamente (Figura 3) Os elevados iacutendices de perdas
nesta etapa foram causados principalmente por
contaminaccedilatildeo bacteriana Segundo Oliveira amp Silva
(1997) as maiores contaminaccedilotildees bacterianas dos
explantes de bananeira ocorrem na fase de
estabelecimento in vitro do que nos demais subcultivos
Oliveira et al (2000) trabalhando com plantas livres de
viacuterus obtiveram taxas de contaminaccedilatildeo nesta fase entre
10 e 45 as quais estatildeo proacuteximas agraves obtidas neste
trabalho Durante a fase de multiplicaccedilatildeo as perdas por
contaminaccedilatildeo foram menores variando de 14 a 74
para as plantas sadias e de 0 a 121 no caso das plantas
infectadas com BSV sendo que a maior parte do material
foi contaminada por fungos natildeo-patogecircnicos Estes
valores foram bem inferiores agravequeles obtidos por Oliveira
et al (1999) (131) que utilizaram genoacutetipos diploacuteides
triploacuteides e tetraploacuteides de bananeiras sadias
Efeito do viacuterus das estrias da bananeira 77
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FIGURA 2 ndash Planta de bananeira lsquoCaipirarsquo infectada com BSV na fase de enraizamento in vitro apresentando estriadoscloroacuteticos com linhas descontiacutenuas e dispersas nas folhas Cruz das Almas (BA) Embrapa Mandioca e FruticulturaTropical 2006
FIGURA 3 ndash Taxas por contaminaccedilatildeo () de explantes dacultivar Caipira na fase de estabelecimento (Est) e ao longode cinco subcultivos (Sub) Cruz das Almas (BA)Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical 2006
Durante o enraizamento in vitro natildeo houve
diferenccedila significativa na altura das plantas Poreacutem com
30 dias de aclimatizaccedilatildeo as plantas com BSV apresentaram
altura significativamente inferior agraves plantas sadias (Tabela 1)
Soares et al (2000) cultivaram mudas de bananeira lsquoCaipirarsquo
sadias e infectadas com BSV durante 141 dias em casa-de-
vegetaccedilatildeo e observaram que a infecccedilatildeo pelo viacuterus implicou
em significativa reduccedilatildeo no crescimento inicial afetando
o porte o desenvolvimento do sistema radicular e a aacuterea
fotossintetizante das plantas Verifica-se assim que a
infecccedilatildeo pelo BSV prejudicou o crescimento inicial das
plantas afetando a altura daquelas infectadas mesmo em
um periacuteodo relativamente curto indicando que em periacuteodos
mais longos o prejuiacutezo com relaccedilatildeo ao crescimento pode
ser ainda maior aconteceu no estudo desenvolvido por
Soares et al (2000)
Os sintomas do BSV permaneceram visiacuteveis em
todas as plantas infectadas durante e apoacutes a fase de
aclimatizaccedilatildeo Esse resultado foi diferente ao obtido por
Dahal et al (1999) quando micropropagaram hiacutebridos de
Musa pois os sintomas soacute foram visiacuteveis em plantas com
trecircs meses apoacutes o enraizamento Provavelmente essa
diferenccedila foi devido agraves condiccedilotildees onde os trabalhos foram
conduzidos casa-de-vegetaccedilatildeo e campo respectivamante
bem como aos genoacutetipos estudados Observaccedilotildees
semelhantes foram tambeacutem efetuadas por Gauhl amp Pasberg-
Gauhl (1995) e Ortiz (1996) ao estudarem a incidecircncia de
viroses em diferentes genoacutetipos de bananeira
SILVEIRA D G et al78
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 74-79 2006
Alturas (cm) Plantas de bananeira lsquoCaipirarsquo
Enraizamento
in vitro 30 dias de
aclimatizaccedilatildeo
Sadias 637 a 2690 a BSV 728 a 2192 b
TABELA 1 ndash Meacutedias das alturas das plantas apoacutes oenraizamento in vitro e 30 dias de aclimatizaccedilatildeo em casa-de-vegetaccedilatildeo Cruz das Almas (BA) Embrapa Mandiocae Fruticultura Tropical 2006
Meacutedias seguidas pelas mesmas letras nas colunas natildeodiferem estatisticamente entre si pelo teste F ao niacutevel de 5 de significacircncia
CONCLUSOtildeES
A infecccedilatildeo pelo BSV natildeo influenciou a taxa de
multiplicaccedilatildeo dos explantes embora os sintomas do viacuterus
tenham sido visiacuteveis em todas as fases da micropropagaccedilatildeo
e durante os primeiros 30 dias da aclimatizaccedilatildeo das plantas
infectadas Todavia o crescimento das plantas infectadas
foi afetado pela presenccedila do viacuterus
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CARACTERIacuteSTICAS MORFOFISIOLOacuteGICAS DE BROTACcedilOtildeES DEAgapanthus umbellatus var minor MULTIPLICADAS EM
BIORREATOR DE IMERSAtildeO TEMPORAacuteRIA1
MORPHOLOGICAL AND PHYSIOLOGICAL CHARACTERISTICS Agapanthus umbellatus varminor OF SHOOTS PROPAGATED IN BIOREACTOR OF TEMPORARY IMMERSION
LUCIANA ALVES FOGACcedilA2 DENILSON DORTZBACH3 ANTONIO CARLOS ALVES4 ENIO LUIZ PEDROTTI5
1Parte da dissertaccedilatildeo de mestrado do primeiro autor junto ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Recursos Geneacuteticos vegetais CCA UFSC ndash Florianoacutepolis SC2Engenheira Agrocircnoma Mestre em Recursos Geneacuteticos Vegetais ndash CCAUFSC ndash UFSC Trindade ndash Florianoacutepolis SC ndash 88040-900 ndash lufogacapopcombr3Empresa Catarinense de Pesquisa Agropecuaacuteria ndash Rodovia Admar Gonzaga 1340 ndash Bairro Itacorubi Florianoacutepolis SC ndash denilsondtbolcombr4Engenheiro Agrocircnomo Professor Dr Departamento Fitotecnia ndash CCAUFSC ndash UFSC ndash alvesccaufscbr5Engenheiro Agrocircnomo Professor Dr Departamento Fitotecnia ndash CCAUFSC ndash UFSC ndashRodovia Admar Gonzaga 1346 ndash 88 040 900 ndash Florianoacutepolis- SC ndash pedrotticcaufscbr
RESUMOCom o presente trabalho objetivou-se estudar alguns
aspectos morfoloacutegicos e fisioloacutegicos de placircntulas de Agapanthusumbellatus LrsquoHeacuter var minor multiplicadas em biorreatores deimersatildeo temporaacuteria (BIT) Foram testadas quatro concentraccedilotildeesde sacarose no meio de cultura e duas intensidades luminosasem um total de oito tratamentos formando um fatorial 2 x 4 Odelineamento experimental utilizado foi inteiramentecasualizado Os resultados obtidos indicaram que as condiccedilotildeesambientais principalmente luz e concentraccedilatildeo de sacarose domeio de cultura influenciaram o desenvolvimento e o crescimentodas placircntulas quando multiplicadas Observou-se que a ausecircnciade sacarose mesmo no niacutevel mais elevado de intensidadeluminosa natildeo estimulou a fotossiacutentese das placircntulas Acombinaccedilatildeo de 30 gL-1 de sacarose e 70 mMm-2s-1 de luzproporcionou maior numero de folhas massa fresca e secaconcentraccedilatildeo de clorofila a b e total fatores estes que tecircmgrande influecircncia na fase de aclimatizaccedilatildeo
Termos para indexaccedilatildeo Plantas ornamentaismicropropagaccedilatildeo sacarose intensidade luminosa
ABSTRACTThe objective of the present work was to study
morphological and physiological characteristics of Agapanthusumbellatus LrsquoHeacuter var minor plantlets propagated in bioreactorof temporary immersion (BIT) Four sucrose concentrationsand two light intensities were analyzed totalizing eighttreatments The experimental design used was a completelyrandomized with a 2 x 4factorial The results indicated that theenvironment conditions mainly light and sucrose concentrationsof the culture medium influenced plantlets development andgrowth It was observed that the absence of sucrose even inthe highest level of light intensity had no stimuli on plantletphotosynthesis The combination of 30 g L-1 sucrose and 70mM m-2 s-1 light had promoted higher leaf number fresh anddry weight concentration of chlorophyll a b and total
parameters that present high influence during theacclimatizationrsquos phase
Index terms Ornamental plants micropropagation sucroselight intensity
INTRODUCcedilAtildeO
Agapanthus umbellatus var minor tambeacutem
conhecida como Agapantho ou Liacuterio do Nilo eacute uma
angiosperma da famiacutelia Amaryllidaceae pertencente agrave
ordem Liliales (BOTANY 2003) eacute uma espeacutecie ornamental
muito utilizada como flor de corte devido agrave sua durabilidade
No entanto o maior interesse econocircmico nesta espeacutecie
decorre do seu uso como forraccedilatildeo em jardins e praccedilas
(LORENZI amp SOUZA 1995)
Sua propagaccedilatildeo eacute tradicionalmente efetuada
atraveacutes da divisatildeo de touceiras No entanto esta teacutecnica
apresenta uma seacuterie de desvantagens visto que a taxa de
propagaccedilatildeo eacute baixa cerca de dez mudas por planta ao ano
aleacutem de possibilitar a dispersatildeo de pragas e doenccedilas que
poderatildeo ocorrer no viveiro de produccedilatildeo Sendo assim a
micropropagaccedilatildeo pode ser uma ferramenta muito
promissora para esta espeacutecie
O processo de micropropagaccedilatildeo induz a um grande
nuacutemero de mudanccedilas anatocircmicas morfoloacutegicas e
fisioloacutegicas que muitas vezes tem limitado o cultivo in vitro
de algumas espeacutecies (DESJARDINS 1993) A
(Recebido em 18 de julho de 2005 e aprovado em 25 de agosto de 2006)
Caracteriacutesticas morfofisioloacutegicas de brotaccedilotildees 81
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
heterogeneidade de respostas agraves placircntulas que ocorrem
na cultura de tecidos eacute promovida natildeo soacute por fatores
inerentes ao tecido vegetal (geneacuteticos e fisioloacutegicos) mas
tambeacutem por modificaccedilotildees do ambiente in vitro
As modificaccedilotildees do ambiente in vitro envolvem a
qualidade e intensidade de luz fotoperiacuteodo temperatura
umidade reguladores de crescimento exoacutegenos fonte de
carbono e estresse mecacircnico Estes satildeo determinantes na
morfogecircnese no crescimento e no desenvolvimento de
placircntulas in vitro (GEORGE 1996 KOZAI et al 1990
SALISBURY 1981) Aleacutem disso interferem no nuacutemero de
folhas teor de clorofila densidade estomaacutetica (LIAN et
al 2002 PREECE amp SUTTER 1991) na fotossiacutentese e na
fase de aclimatizaccedilatildeo (DESJARDINS et al 1995)
Um dos principais fatores que causam grande
influecircncia na fotossiacutentese de placircntulas cultivadas in vitro
eacute a intensidade luminosa (GALZY amp COMPAN 1992) A
quantidade e a qualidade da luz bem como o fotoperiacuteodo
podem afetar o crescimento e o desenvolvimento de
placircntulas in vivo (SMITH 1982) e placircntulas in vitro
(ECONOMOU amp READ 1987 VLAHOS et al 1992) Esta
influecircncia se deve ao grande impacto sobre o acuacutemulo de
pigmentos biossiacutentese de clorofila diferenciaccedilatildeo de
cloroplastos e anatomia da folha (DESJARDINS et al 1995)
Outro fator que vem sendo estudado e que pode
determinar um papel importante no controle da atividade
fotossinteacutetica de placircntulas in vitro eacute a utilizaccedilatildeo de
carboidratos exoacutegenos pois o crescimento da maioria das
culturas in vitro eacute sustentado pela sacarose ou outros
accediluacutecares adicionados ao meio de cultura (PREECE amp
SUTTER 1991) Estes podem ser utilizados pelas placircntulas
quando a taxa de fotossiacutentese natildeo permite assegurar um
balanccedilo positivo em carbono definindo assim uma nutriccedilatildeo
mixotroacutefica ou heterotroacutefica (GALZY amp COMPAN 1992)
Baseado na hipoacutetese de que a composiccedilatildeo do meio
de cultura e a intensidade luminosa influenciam a
morfologia e a fisiologia de placircntulas micropropagadas o
presente trabalho teve como objetivo estudar aspectos
morfoloacutegicos e fisioloacutegicos de placircntulas de Agapanthus
umbellatus LrsquoHeacuter var minor multiplicadas em biorreator de
imersatildeo temporaacuteria (BIT) Para tanto foi avaliado o
desenvolvimento e o crescimento desta espeacutecie durante a
fase de multiplicaccedilatildeo em funccedilatildeo da variaccedilatildeo de niacuteveis de
sacarose e intensidade luminosa
MATERIAIS E MEacuteTODOS
Este trabalho foi realizado no Laboratoacuterio de
Morfogecircnese e Bioquiacutemica Vegetal localizado no Centro
de Ciecircncias Agraacuterias da Universidade Federal de Santa
Catarina em Florianoacutepolis - SC
O trabalho consistiu de um ensaio onde foram
utilizadas brotaccedilotildees de Agapanthus umbellatus var minor
obtidas da terceira repicagem mantidas em meio geleificado
MS + 178 mM de BAP Apoacutes serem individualizadas e
padronizadas tendo o seu tamanho variando entre 25 e
30 cm de comprimento as brotaccedilotildees foram transferidas
para o BIT (ETIENNE amp BERTHOULY 2002) contendo 500
mL de meio liacutequido e sais de MS (MURASHIGE amp SKOOG
1962) em condiccedilotildees asseacutepticas suplementado com
concentraccedilatildeo de 89 mM de BAP O pH foi ajustado com
NAOH (1N) em 59 antes da autoclavagem (durante 15
minutos sob 121ordmC e 15 atm de pressatildeo) O delineamento
experimental utilizado no ensaio foi o inteiramente
casualizado Foram testados quatro concentraccedilotildees de
sacarose no meio de cultura (0 15 30 e 45) e duas
intensidades luminosas (70 e 140 mmolm-2s-1) providas
por lacircmpadas brancas fluorescentes (PHILIPS ndash TLT 40W)
em um total de oito tratamentos formando um fatorial 2 x 4
Cada tratamento foi composto por trecircs frascos (repeticcedilatildeo)
contendo 50 plantas cada um
Os frascos foram mantidos em sala de crescimento
com fotoperiacuteodo de 16 horas e temperatura meacutedia de 22ordmC
com variaccedilatildeo de plusmn 2ordmC por um periacuteodo de 60 dias
Apoacutes 60 dias de cultivo foram avaliadas as
seguintes caracteriacutesticas dos explantes nuacutemero e tamanho
das brotaccedilotildees (cm) nuacutemero de folhasbrotaccedilatildeo massa
fresca e seca (g) da parte aeacuterea e raiz utilizando-se amostras
de 25 placircntulas por repeticcedilatildeo escolhidas ao acaso
FOGACcedilA L A et al82
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
A determinaccedilatildeo do conteuacutedo de clorofila ldquoa b e
totalrdquo consistiu na coleta de amostras de 100 mg de massa
fresca As amostras foram incubadas com 70 mL de DMSO
(dimetilsulfoacutexido) sem maceraccedilatildeo por 30 minutos a 65degC
Apoacutes filtragem seu volume foi completado para 10 mL com
DMSO Desses extratos 2 mL foram analisados em
espectrofotocircmetro (UV - visiacutevel SHIMADZU) para os
valores de absorbacircncia entre 645 e 663 nm Os valores obtidos
foram submetidos agrave foacutermula de Arnon (1949) conforme
descrito por Hiscox amp Israelstam (1979) Chl a = (00127 X
D663) ndash (000269 X D645) e Chl b = (00229 X D645) ndash (000468
X D663) A clorofila total foi a soma da ldquoChl a e Chl brdquo de
cada tratamento foram utilizadas 25 amostras
A determinaccedilatildeo da densidade estomaacutetica (nuacutemero
de estocircmatos por mm2 de superfiacutecie foliar) foi realizada nas
amostras das quais extraiu-se a clorofila Apoacutes a extraccedilatildeo
da clorofila as folhas foram cortadas e somente o terccedilo
meacutedio das folhas foi usado para anaacutelise Em seguida foram
fixadas sobre lacircminas histoloacutegicas com a ajuda de uma
lamiacutenula e de algumas gotas de aacutegua esterilizada A
observaccedilatildeo foi realizada na epiderme das faces adaxial e
abaxial da folha com o auxiacutelio de um microscoacutepio oacutetico
(OLYMPUS CH30 ocular WH10 X 22) com um aumento
de 400 vezes e com um campo conhecido de 024 mm2 Para
cada lacircmina foram feitas leituras em cinco campos
Os dados obtidos foram avaliados por meio da
anaacutelise de variacircncia (ANOVA) seguindo o modelo para
experimento bifatorial inteiramente casualizado O nuacutemero
de brotaccedilotildees o nuacutemero de folhas e a densidade estomaacutetica
foram transformados em Oumlx+1 para a anaacutelise As meacutedias
dos tratamentos foram separadas pelo teste de comparaccedilatildeo
de meacutedias de Duncan a 5 de probabilidade conforme
recomendaccedilotildees de Stell amp Torrie (1980)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
A concentraccedilatildeo de sacarose no meio de cultura
apresentou uma accedilatildeo positiva e interativa com a intensidade
luminosa na proliferaccedilatildeo de brotaccedilotildees (Tabela 1) visto
que a ausecircncia de sacarose no meio de cultura resultou
em insucesso no crescimento das placircntulas de Agapantho
principalmente nos primeiros dias Apoacutes o
desenvolvimento inicial (aproximadamente 10 dias) foi
constatada estagnaccedilatildeo no crescimento das placircntulas
seguido de atrofia e necrose das brotaccedilotildees Apoacutes 20 dias
de cultivo ocorreu a morte das brotaccedilotildees Isso mostrou
que folhas de placircntulas de Agapantho natildeo fixaram
carbono suficiente para sustentar seu crescimento na
ausecircncia de sacarose Portanto para a espeacutecie em estudo
foi necessaacuteria a adiccedilatildeo de uma fonte de carbono no meio
de cultura para o seu desenvolvimento in vitro Segundo
Capellades et al (1991) e Desjardins et al (1995) a total
remoccedilatildeo de carboidratos no meio de cultura para algumas
espeacutecies frequumlentemente torna-se prejudicial para o
crescimento das placircntulas o que pode prejudicar o
processo de micropropagaccedilatildeo e aclimatizaccedilatildeo pois
durante o cultivo in vitro as placircntulas perdem
parcialmente o autotrofismo e consequumlentemente
necessitam de uma fonte de carbono
O maior nuacutemero de brotaccedilotildees foi obtido com a
intensidade luminosa de 70 mmolm-2s-1 e a concentraccedilatildeo
de 45 gL-1 de sacarose (Tabela 1) Enquanto que com a
intensidade luminosa de 140 mmolm-2s-1 o maior nuacutemero
de brotaccedilotildees foi obtido com a concentraccedilatildeo de 30 gL-1 de
TABELA 1 ndash Nuacutemero de brotaccedilotildeesexplante de placircntulasde Agapanthus umbellatus var minor multiplicadasbiorreator de imersatildeo temporaacuteria suplementado comdiferentes concentraccedilotildees de sacarose e intensidadesluminosas no periacuteodo de 60 dias
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1)
Concentraccedilatildeo Sacarose (gL-1) 70 1 140 1
0 000 dA 00 dA 15 370 cB 544 cA 30 553 bB 651 aA 45 745 aA 585 bB
CV 67
Meacutedias seguidas pela mesma letra minuacutescula nas colunase maiuacutescula nas linhas natildeo diferem significativamente peloteste de Duncan a 5 de probabilidade1 Observaccedilotildees transformadas segundo ( x+1)
Caracteriacutesticas morfofisioloacutegicas de brotaccedilotildees 83
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
sacarose Isso demonstrou um alto grau de mixotrofia dessa
espeacutecie
O tamanho das brotaccedilotildees e o nuacutemero de folhas
(Tabela 2) foram afetados apenas pelo efeito simples dos
fatores natildeo havendo interaccedilatildeo entre sacarose e luz O
maior tamanho das brotaccedilotildees foi alcanccedilada quando os
explantes foram submetidos a 15 gL-1 de sacarose e 140
mmolm-2s-1 de intensidade luminosa (Tabela 2) Verificou-
se tambeacutem que o aumento da concentraccedilatildeo desse
carboidrato no meio de cultura natildeo favoreceu o
alongamento das brotaccedilotildees Provavelmente o aumento
da intensidade luminosa favoreceu a taxa de fotossiacutentese
das placircntulas permitindo um balanccedilo positivo de carbono
afetando o crescimento e o desenvolvimento de placircntulas
in vitro (LEE et al 1995)
Por outro lado o maior nuacutemero de folhas de
Agapantho foi obtido na concentraccedilatildeo de 30 gL-1 de
sacarose (Tabela 2) A intensidade luminosa natildeo teve
influecircncia sobre essa variaacutevel Contrastando com os dados
obtidos no presente trabalho Konow amp Wang (2001)
determinaram que a intensidade luminosa de 40 mmolm-
2s-1 promoveu um aumento no nuacutemero de folhas de
Phalaenopsis enquanto placircntulas que se desenvolveram
em ambiente com intensidade de 10 e 80 molm-2s-1
apresentaram um menor nuacutemero de folhas Segundo os
autores o aumento no nuacutemero de folhas pode indicar que
TABELA 2 ndash Tamanho de brotaccedilotildees e nuacutemero de folhasbrotaccedilatildeo de placircntulas de Agapanthus umbellatus var minormultiplicadas em biorreator de imersatildeo temporaacuteria suplementado com diferentes concentraccedilotildees de sacarose eintensidades luminosas no periacuteodo de 60 dias
Meacutedias seguidas pela mesma letra nas linhas e colunas natildeo diferem significativamente pelo teste de Duncan a 5 deprobabilidade
houve estiacutemulo da fotossiacutentese in vitro Outro efeito
observado em placircntulas de Agapantho neste trabalho foi
a presenccedila de folhas mais claras e vitrificadas (folhas com
aspecto viacutetreo pouco desenvolvidas aparecircncia suculenta
e translucente) na grande maioria das placircntulas
multiplicadas em meio suplementado com 15 gL-1 de
sacarose e intensidade luminosa de 70 mmolm-2s-1 Estes
resultados podem indicar que o aparato fotossinteacutetico natildeo
tenha se desenvolvido adequadamente (CAPPELADES et
al 1991 DESJARDINS et al 1995) afetando a acumulaccedilatildeo
de massa fresca Possivelmente a presenccedila de folhas
vitrificadas foi influenciada pelo uso de meio liacutequido pois
de acordo com George (1996) e Etienne amp Berthouly (2002)
o meio liacutequido favorece a produccedilatildeo de folhas vitrificadas
quando comparado com meio geleificado No entanto
observou-se que para os demais tratamentos em
concentraccedilotildees maiores de sacarose (30 e 45 gL-1) a
presenccedila de brotaccedilotildees vitrificadas foi rara ou nenhuma
Neste sentido o desenvolvimento de brotaccedilotildees com esta
caracteriacutestica pode estar relacionado agrave concentraccedilatildeo de
sacarose no meio e agrave diferenccedila osmoacutetica entre as brotaccedilotildees
e o meio de cultura (DEBERGH et al 1981) Este resultado
tambeacutem foi obtido na multiplicaccedilatildeo de rosas na qual onde
a reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo de sacarose para 10 gL-1 na
fase de multiplicaccedilatildeo promoveu um aumento significativo
na presenccedila de plantas vitrificadas e quando submetidas
Tamanho de brotaccedilotildees (cm)
Nuacutemero de folhasbrotaccedilatildeo
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1) Concentraccedilatildeo Sacarose
(gL-1) 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia
0 000 000 000 d 000 000 000 d 15 275 396 335 a 407 408 408 b 30 295 295 295 b 414 404 409 a 45 245 220 233 c 400 408 404 c
Meacutedia 204 b 228 a 276 a 275 a
CV 2595 467
FOGACcedilA L A et al84
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
a concentraccedilotildees de 30 e 40 gL-1 a presenccedila de placircntulas
vitrificadas foi rara (LANGFORD amp WAINWRIGHT 1987)
Outro fator que possivelmente pode ter
influenciado a presenccedila de placircntulas vitrificadas in vitro
foi a baixa intensidade luminosa (GEORGE 1996) pois
placircntulas de Agapantho multiplicadas sob intensidade de
140 mmolm-2s-1 e 15 gL-1 de sacarose natildeo apresentaram
caracteriacutestica de vitrificaccedilatildeo Estes dados indicaram que o
aumento da intensidade luminosa evitou a presenccedila de
plantas vitrificadas aleacutem de proporcionar um incremento e
estiacutemulo na atividade fotossinteacutetica (GEORGE 1996)
A produccedilatildeo de massa fresca e seca das brotaccedilotildees
foram influenciadas pela interaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo
de sacarose e a intensidade luminosa (Tabela 3) Placircntulas
de Agapantho multiplicadas sob intensidade de 70
mmolm-2s-1 apresentaram a maior produccedilatildeo de massa
fresca e seca dentro das concentraccedilotildees de 30 gL-1 Nas
concentraccedilotildees de 15 e 45 gL-1 os resultados obtidos
foram inferiores (Tabela 3) Por outro lado quando se
aumentou a intensidade para 140 mmolm-2s-1 a melhor
produccedilatildeo de massa fresca e seca ocorreu dentro da
concentraccedilatildeo de 15 gL-1 de sacarose (Tabela 3) Verificou-
se assim que o aumento da concentraccedilatildeo de sacarose no
meio de cultura proporcionou efeitos negativos na
produccedilatildeo de massa fresca e seca quando as placircntulas
foram submetidas agrave intensidade luminosa mais elevada
TABELA 3 ndash Massa fresca e seca de brotaccedilotildees de Agapanthus umbellatus var minor multiplicadas em biorreator de imersatildeotemporaacuteria suplementado com diferentes concentraccedilotildees de sacarose e intensidades luminosas no periacuteodo de 60 dias
Tais resultados corroboram as afirmaccedilotildees feitas referentes
agrave variaacutevel nuacutemero de brotaccedilotildees em que demonstrou-se
que foi possiacutevel reduzir a concentraccedilatildeo de sacarose em
maiores intensidade luminosas confirmando o grau de
mixotrofia
Ao analisar a concentraccedilatildeo de clorofila em
folhas de Agapantho verificou-se que natildeo houve
interaccedilatildeo significativa entre as concentraccedilotildees de
sacarose e intensidade luminosa Os teores de clorofila
a b e total (Tabela 4) foram maiores nas concentraccedilotildees
de 30 gL-1 sacarose Serret et al (1995) mostraram que
o aumento da concentraccedilatildeo de accediluacutecares (30 gL-1) no
meio de cultura promoveu maior produccedilatildeo de clorofila
impedindo a fotoinibiccedilatildeo realizaccedilatildeo de fotossiacutentese e
aumento do ganho de massa em plantas de Gardecircnia
cultivadas in vitro
Em relaccedilatildeo ao efeito da intensidade luminosa natildeo
houve efeito deste fator sobre essas variaacuteveis ainda que
Economou amp Read (1987) Galzy amp Compan (1992) Vlahos
et al (1992) George (1996) tenham observado que a
intensidade luminosa eacute um fator que estaacute estreitamente
relacionado agrave siacutentese de clorofila No entanto no presente
trabalho sugere-se a menor intensidade 70 mmolm-2s-1 com
o objetivo de que natildeo ocorra um aumento na velocidade
de decomposiccedilatildeo da clorofila com intensidade mais
elevada
Meacutedias seguidas pela mesma letra minuacutescula nas colunas e maiuacutescula nas linhas natildeo diferem significativamente peloteste de Duncan a 5 de probabilidade
Massa fresca (g)
Massa seca (g)
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1) Concentraccedilatildeo
Sacarose (gL-1) 70 140 70 140
0 000 dA 00 dA 000 dA 000 dA 15 067 cB 106 aA 0069 cB 0109 aA 30 082 aA 076 bB 0085 aA 0081 bB 45 075 bA 049 cB 0078 bA 0051 cB
CV 2873 2655
Caracteriacutesticas morfofisioloacutegicas de brotaccedilotildees 85
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
TABELA 4 ndash Concentraccedilotildees de clorofila a b e total (mgg massa fresca) em folhas de Agapanthus umbellatus varminor multiplicadas em biorreator de imersatildeo temporaacuteria por um periacuteodo de 60 dias submetidas a 4 concentraccedilotildees desacarose e dois niacuteveis de intensidade luminosa
Clrofila a (mgg massa fresca)
Clrofila b (mgg massa fresca)
Clrofila total (mgg massa fresca)
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1) Concentraccedilatildeo
Sacarose (gL-1) 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia
0 000 000 000 d 000 000 000 d 000 000 000 d 15 211 248 295 c 089 076 083 c 301 325 313 c 30 502 509 505 a 200 211 205 a 703 721 710 a 45 486 420 453 b 195 179 187 b 682 633 658 b
Meacutedia 299 a 294 a 121 a 116 a 421 a 420 a
CV 740 820 850
Meacutedias seguidas pela mesma letra nas linhas e colunas natildeo diferem significativamente pelo teste de Duncan a 5 deprobabilidade
Em relaccedilatildeo aos estocircmatos atraveacutes de
observaccedilatildeo microscoacutepica foi possiacutevel verificar que o
Agapantho possui folhas com caracteriacutest ica
anfiestomaacutetica caracterizada pela presenccedila de
estocircmatos em ambas as faces (face abaxial e adaxial)
Esta caracteriacutestica tem sido considerada como um
mecanismo adaptativo para maximizar a condutacircncia
de CO2 quando luz e aacutegua satildeo fatores limitantes
(KRAMER 1969)
Atraveacutes da anaacutelise estatiacutestica para densidade
estomaacutetica da face adaxial verificou-se que natildeo houve
interaccedilatildeo entre os fatores sacarose e intensidade
luminosa havendo portanto efeito isolado dos fatores A
maior densidade estomaacutetica da face abaxial foi obtida na
concentraccedilatildeo de 45 gL-1 (Tabela 5) Natildeo houve efeito da
intensidade luminosa para essa variaacutevel Por outro lado
a maior densidade estomaacutetica na face adaxial foi obtida
na concentraccedilatildeo de 45 gL-1 de sacarose e 140 mmolm-2s-1
de intensidade luminosa (Tabela 5) verificando a
influecircncia positiva da intensidade luminosa para essa
variaacutevel
As folhas de placircntulas multiplicadas na
concentraccedilatildeo de 15 gL-1 de sacarose apresentaram menor
densidade estomaacutetica em ambas as faces (Tabela 5) com
formato anormal largos e salientes caracteriacutesticas estas
natildeo desejaacuteveis pois segundo Preece amp Sutter (1991)
uma alteraccedilatildeo a niacutevel estrutural eou morfoloacutegico podem
impedir o funcionamento do aparelho estomaacutetico e grande
parte dos estocircmatos assim formados satildeo incapazes de se
fechar
Possivelmente este resultado se deve agraves
caracteriacutesticas de vitrificaccedilatildeo que as folhas do
tratamento 15 gL-1 de sacarose e 70 mmol m-2s-1 de
intensidade luminosa apresentaram (BLANKE amp
BELCHERL 1989) e a falta de energia armazenada no
explante com a falta de carbono que eacute proveniente da
sacarose adicionada ao meio de cultura (DESJARDINS
et al 1995) Estes resultados corroboram os obtidos
por Vintildea et al (2001) que demonstraram que folhas
vitrificadas de abacateiro apresentaram estocircmatos
grandes com saliecircncia ceacutelulas subsidiaacuterias assimeacutetricas
e deformadas e seu ostiacuteolo completamente aberto Tal
anomalia pode ser atribuiacuteda agrave perda da elasticidade das
paredes das ceacutelulas-guarda o que impediria o seu
movimento de abertura e fechamento que
consequumlentemente afeta o desenvolvimento das
placircntulas ao serem transferidas para condiccedilotildees ex vitro
atraveacutes da excessiva perda de aacutegua
FOGACcedilA L A et al86
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 80-87 2006
TABELA 5 ndash Densidade estocircmatica (estocircmatosmm2) da face adaxial e abaxial de folhas de Agapanthus umbellatus varminor multiplicadas em biorreator de imersatildeo temporaacuteria suplementado com diferentes concentraccedilotildees de sacarose eintensidade luminosa por um periacuteodo de 60 dias
Densidade estomaacutetica (estocircmatosmm2) Epiderme da face Adaxial Epiderme da face Abaxial
Intensidade Luminosa ( molm-2s-1)
Concentraccedilatildeo Sacarose(gL1) 70 140 Meacutedia 70 140 Meacutedia
0 000 000 000 d 000 000 000 d 15 2587 3026 2802 c 3408 4752 4053 c 30 6524 5628 6064 b 9977 8584 9268 b 45 5412 7016 6188 a 8809 10807 9783 a
Meacutedia 2856 b 3089 a 4256 a 4705 a CV 1474 1206
Meacutedias seguidas pela mesma letra nas linhas e colunas natildeo diferem significativamente pelo teste de Duncan a 5 deprobabilidade
CONCLUSAtildeO
Condiccedilotildees ambientais tais como intensidade
luminosa e concentraccedilatildeo de sacarose adicionada ao meio
de cultura influenciaram no desenvolvimento e
crescimento das placircntulas de Agapanthus umbellatus
var minor quando multiplicadas em meio liacutequido no BIT
Placircntulas de Agapantho foram incapazes de se
desenvolver em meio sem sacarose sendo portanto
necessaacuteria a adiccedilatildeo de uma fonte de carbono visto que a
espeacutecie em estudo apresentou uma taxa de fotossiacutentese
incapaz de assegurar um balanccedilo positivo em carbono
Houve uma grande variaccedilatildeo nas respostas obtidas
no entanto fazendo uma avaliaccedilatildeo em conjunto das
variaacuteveis recomenda-se 30 gL-1 de sacarose e intensidade
luminosa de 70 mmolm-2s-1 No entanto deve-se ressaltar
que estudos mais aprofundados devem ser conduzidos
para verificar o efeito destas combinaccedilotildees sobre o
desempenho de placircntulas durante a fase de aclimatizaccedilatildeo
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SOUZA G de F M V e et al88
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
CAPACIDADE DE REGENERACcedilAtildeO IN VITRO DE TOMATEIROCULTIVAR SANTA CLARA
IN VITRO REGENERATION CAPACITY OF TOMATOPLANT CULTIVAR SANTA CLARA
GLAUCIA DE FATIMA MOREIRA VIEIRA E SOUZA1 JOSEacute MAGNO QUEIROZ LUZ2 ALCIONE SILVA ARRUDA3DENISE GARCIA SANTANA2 MARIANA DE SOUZA E SILVA DA COSTA TEIXEIRA4
LUCIANA LONDE5 ADELAIDE SIQUEIRA SILVA6 ELISAcircNGELA RODRIGUES FIGUEIRA7
1Mestranda em Fitotecnia ndash UFU ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash gfmvsyahoocombr2Professor Dr Instituto de Ciecircncias Agraacuterias ndash UFUICIAG ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash jmagnoumuaramaufubr3Dra em Geneacutetica e Bioquiacutemica Professora contratada da UEG ndash Unidade Universitaacuteria de Ipameri ndash Rodovia GO 330 Km 24 ndash Anel Viaacuterio SN ndash 75780-000 ndash Ipameri GO ndash asarrudahotmailcom4Engenheira Agrocircnoma ndash UFU ndash Conab Sede - SGAS 901 Bloco ldquoArdquo Lote 69 - Asa Sul ndash 70390-010 ndash Brasiacutelia DF ndash marisouza81yahoocombr5Dra em Geneacutetica e Bioquiacutemica ndash IGBUFU ndash Av Paraacute 1720 ndash Campus Umuarama ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash llondebolcombr6Mestranda em AgronomiaFitotecnia ndash UFUICIAG ndash Bolsista FAPEMIG ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash adelaidebioyahoocombr7Mestre em AgronomiaFitotecnia ndash UFUICIAG ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash Elis_figueirayahoocombr
RESUMOA cultivar de tomateiro Santa Clara (Lycopersicon
esculentum Mill) foi avaliada quanto ao seu potencial deregeneraccedilatildeo in vitro a partir de trecircs tipos de explantes e trecircsmeios de cultura seguidos de trecircs repicagens Os explantes foramcotileacutedone decapitado cotileacutedone fendido e cotileacutedone aparadonas extremidades Os meios de cultura foram MI macro emicronutrientes do MS vitaminas B5 de Gamborg et al (1968)suplementado com 30 gL de sacarose e de 8 gL de aacutegar pH 58MII meio MI suplementado com 1 mgL de BAP e 30 gL deglicose MIII meio MI suplementado com 25 mgL de BAP e02 mgL de AIA Para as repicagens foi utilizado o meio MIsuplementado com 05 mgL 08 mgL e 10 mgL de BAP paraa primeira segunda e terceira repicagens respectivamente Noenraizamento foi usado o meio MI suplementado com 05 mgL de AIA e as placircntulas enraizadas foram transferidas parasubstrato comercial Plantimax esterilizado e aclimatadas emlaboratoacuterio A maior induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo tanto de calosquanto de brotos foi observada nos meacutetodos cotileacutedone fendidoe cotileacutedone aparado quando colocados no meio MIII no entantoa induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo foi mais raacutepida quando usado cotileacutedonedecapitado indicando um alto potencial de organogecircneseespontacircnea sendo que o meio MI foi o melhor Os resultadosobtidos com as diferentes concentraccedilotildees de BAP nos trecircs ciclosde repicagem natildeo diferiram entre si e 82 das plantas enraizadasaclimataram-se com sucesso
Termos para indexaccedilatildeo Lycopersicon esculentummelhoramento do tomateiro cultura de tecidos
ABSTRACTThe tomato plant cultivar lsquoSanta Clararsquo (Lycopersicon
esculentum Mill) was evaluated as for its in vitro potential ofregeneration using three types of explants and three culture media
following three pricking-outs The explants were as followsdecapitated cotyledon split cotyledon and rim-trimmedcotyledon The culture media were MI MS macro andmicronutrients vitamins B5 of Gamborg et al (1968)supplemented with 30gL sucrose and 8gL agar pH 58 MIImedium MI supplemented with 1 mgL BAP and 30 gL glucoseMIII medium MI supplemented with 25 mgL BAP and 02mgL IAA For the pricking-outs the media MI wassupplemented with 05 mgL 08 mgL and 10 mgL BAP forthe first second and third pricking out respectively As forrooting the MI medium was supplemented with 05 mgL IAAand the rooted seedlings were transplanted to the sterilizedcommercial substrate Plantimax and then acclimatized inlaboratory Higher callus induction and sprout regeneration wasobserved for the methods of split and rim-trimmed cotyledonplaced into medium MIII Nevertheless the induction forregeneration was much faster when the decapitated cotyledonmethod was used indicating a high potential of spontaneousorganogenesis in which the media MI was the best The resultsobtained with the different concentrations of BAP in the threecycles of pricking-out did not differ among themselves and 82of the rooted plants were acclimatized successfully
Index terms Lycopersicon esculentum tomato breeding tissueculture
INTRODUCcedilAtildeO
O tomate pertence ao gecircnero Lycopersicon e a
espeacutecie cultivada cosmopolita eacute botanicamente
denominada de Lycopersicon esculentum (FILGUEIRA
2000) As cultivares atualmente plantadas podem ser
(Recebido em 03 de outubro de 2003 e aprovado em 04 de setembro de 2006)
Capacidade de regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro 89
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
reunidas em cinco grupos Santa Cruz Salada Cereja
Italiano Agroindustrial No presente trabalho foi utilizada
a cultivar Santa Clara do grupo Santa Cruz pois ela continua
sendo a cultivar mais plantada no Brasil
A tomaticultura estaacute associada a seacuterios problemas
fitossanitaacuterios sobretudo viroses aleacutem do ataque de
fungos bacteacuterias e insetos praga Cria-se com isto a
necessidade de se pesquisar novas alternativas ou
obtenccedilatildeo de novos genoacutetipos com resistecircncia muacuteltipla a
doenccedilas e pragas entre essas os estudos sobre
regeneraccedilatildeo e transformaccedilatildeo geneacutetica (FAacuteRI et al 2000)
A engenharia geneacutetica abriu uma nova perspectiva
para o melhoramento geneacutetico do tomateiro a partir do
final da deacutecada de 80 (WIJBRANDI amp BOTH 1993)
visando aumentar a produtividade e melhorar a qualidade
por meio da obtenccedilatildeo de resistecircncia a estresses bioacuteticos e
abioacuteticos A cultura de tecidos destaca-se durante o
processo de realizaccedilatildeo das teacutecnicas de transformaccedilatildeo
geneacutetica pois eacute necessaacuterio induzir gemas vegetativas e
em seguida regenerar brotos alongados e plantas
completas a partir de ceacutelulas ou tecidos geneticamente
modificados
Para a otimizaccedilatildeo de protocolos para o tomateiro
alguns fatores que afetam a eficiecircncia de transformaccedilatildeo
tecircm sido examinados dentre eles o tamanho do explante e
o tipo de explante hipocoacutetilo ou cotileacutedone (FRARY amp
EARLE 1996)
No Brasil haacute poucos trabalhos na aacuterea de
regeneraccedilatildeo in vitro e de transformaccedilatildeo geneacutetica de
cultivares de tomateiro e pouco se conhece sobre a
capacidade de regeneraccedilatildeo das principais cultivares
brasileiras (FAacuteRI et al 2000) Alguns pesquisadores como
Faria amp Illg (1993) analisaram a regeneraccedilatildeo in vitro de
algumas espeacutecies e cultivares de tomateiro observando
uma baixa capacidade morfogecircnica das cultivares se
comparadas com a espeacutecie selvagem Lycopersicon
pimpinellifolium (L) P Miller
Com este trabalho objetivou-se teve como objetivo
avaliar o potencial de regeneraccedilatildeo in vitro da cultivar Santa
Clara do grupo Santa Cruz a partir de diferentes tipos de
explantes e meios de cultura criando e otimizando
protocolos para sua regeneraccedilatildeo in vitro
MATERIAL E MEacuteTODOS
No Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos Vegetais do
Instituto de Geneacutetica e Bioquiacutemica da Universidade Federal
de Uberlacircndia foi avaliada a capacidade de regeneraccedilatildeo
in vitro do tomateiro cultivar Santa Clara usando trecircs
tipos de explantes e trecircs meios de cultura seguido de trecircs
repicagens O experimento foi realizado em delineamento
em blocos casualizados em esquema fatorial (3x3) com trecircs
repeticcedilotildees As plantas regeneradas foram enraizadas e
aclimatadas em laboratoacuterio
Sementes comerciais da cultivar Santa Clara apoacutes
serem desinfestadas por um minuto em aacutelcool etiacutelico a 96
e em hipoclorito de soacutedio comercial a 20 (vv) com duas
gotas de detergente comercial durante 25 minutos foram
enxaguumladas 5 vezes em aacutegua bidestilada esterilizada e
inoculadas em meio MS 100 (MURASHIGE amp SKOOG
1962) solidificado com 7 g L-1 de aacutegarndashaacutegar por sem
reguladores de crescimento O meio foi distribuiacutedo em
frascos de vidro esteacutereis utilizados para cultura de tecidos
com 30 mL de meio MS As culturas foram mantidas em
sala de crescimento com temperatura de 25+2 ordmC
fotoperiacuteodo de 16 horas e luminosidade de 50 mmol m-2s-
1 As placircntulas obtidas aos 14 15 e 20 dias apoacutes a semeadura
foram usadas como fonte de explantes para os blocos 1 2
e 3 respectivamente Os explantes foram inoculados de
acordo com os meacutetodos descritos a seguir em placas de
Petri devidamente esterilizadas e autoclavadas contendo
30 mL de meio de cultura com 16 unidades por tipo de
explante por meio de cultura utilizado Cada 16 explantes
constituiu uma parcela do experimento sendo composta
por duas placas de Petri cada uma com 8 explantes
Os tipos de explantes foram os seguintes
A - que consistiu na decapitaccedilatildeo de placircntulas onde
essa decapitaccedilatildeo ocorreu diretamente abaixo do noacute do
cotileacutedone ficando o hipocoacutetilo com as radiacuteculas
SOUZA G de F M V e et al90
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
B - meacutetodo de cotileacutedones fendidos os cotileacutedones
foram fendidos ao longo da nervura central da extremidade
ateacute sua metade de acordo com o protocolo de Faacuteri et al
(2000)
C - cotileacutedones foram aparados e seguiu-se o
protocolo descrito por Redenbaugh et al (1992) Os
cotileacutedones aparados nas extremidades distal e proximal
(aacutepice e peciacuteolo) foram inoculados com a face abaxial em
contato com o meio
Foram realizadas trecircs repicagens para alongar os
brotos Cerca de 30 dias apoacutes a inoculaccedilatildeo dos explantes
foi realizada a primeira repicagem Os intervalos entre as
repicagens foram em torno de 5 semanas
Os tratamentos consistiram na inoculaccedilatildeo dos trecircs
tipos de explantes descritos nos trecircs meios de cultura
abaixo com trecircs repeticcedilotildees por tratamento
Meio MI macro e micronutrientes de Murashige amp
Skoog (1962) e vitaminas B5 de Gamborg et al (1968)
suplementado com 30 gL de sacarose e de 8 gL de aacutegar-
aacutegar pH 58 meio MII meio de cultura MI suplementado
com 1 mgL de zeatina e 30 gL de glicose conforme
McCormick (1991) meio MIII meio de cultura MI
suplementado com 25 mgL de BAP e 02 mgL de AIA
segundo Rhim et al (1995)
Para as repicagens foi utilizado o meio MI
suplementado com 05 mgL 08 mgL e 10 mgL de BAP
para a primeira segunda e terceira repicagens
respectivamente
Para enraizamento foi usado o meio MI
suplementado com 05 mgL de AIA As placircntulas
enraizadas foram transferidas para substrato comercial
Plantimax esterilizado e aclimatadas em laboratoacuterio
Os brotos com 2 cm de comprimento foram
transferidos para o meio de enraizamento citado e
permaneciam nesse meio durante 15 dias Apoacutes esse periacuteodo
os brotos eram transplantados para substrato comercial
Plantimax autoclavado irrigados com aacutegua uma a duas
vezes por dia ateacute a aclimataccedilatildeo A aclimataccedilatildeo ocorreu em
torno de 20 dias em condiccedilotildees de laboratoacuterio
Avaliou-se a induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo o
alongamento de brotos e o enraizamento e aclimataccedilatildeo
das plantas regeneradas
Os dados de contagem foram transformados para
50x As anaacutelises de normalidade e homogeneidade
foram realizadas pelo software Prophet Os dados obtidos
foram submetidos agrave anaacutelise de variacircncia e as meacutedias
comparadas pelo teste de Tukey ao niacutevel de 5 de
probabilidade pelo software SANEST (ZONTA amp
MACHADO 1989)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Para cotileacutedone decapitado ocorreu um iniacutecio de
formaccedilatildeo de calosidade por volta de 10 dias apoacutes inoculaccedilatildeo
e o surgimento de brotos ocorreu cerca de 12 dias depois da
inoculaccedilatildeo sem a formaccedilatildeo de calos propriamente ditos A
induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo foi mais raacutepida quando usado esse
tipo de explante indicando um alto potencial de
organogecircnese espontacircnea sendo que o meio MI foi o melhor
para a induccedilatildeo e nuacutemero total de brotos (Tabela 1)
No cotileacutedone fendido o iniacutecio de formaccedilatildeo de
calosidade aconteceu com aproximadamente 10 dias apoacutes
inoculaccedilatildeo Por volta de 18 dias depois da inoculaccedilatildeo
iniciou-se o surgimento de brotos e jaacute existiam calos
formados Para esse tipo de explante nos meios MI e MII
ocorreu apenas a formaccedilatildeo de calos enquanto no meio
MIII ocorreu a formaccedilatildeo de calos e calos com brotos sendo
alto o nuacutemero total de brotos (Tabela 1) Supotildee-se que a
maior superfiacutecie de corte tenha influecircncia significativa
sobre esse fenocircmeno onde a maior superfiacutecie de corte do
cotileacutedone resulta em maior capacidade de regeneraccedilatildeo
(FAacuteRI et al 1995b)
No cotileacutedone aparado com cerca de 10 dias apoacutes
inoculaccedilatildeo ocorreu o iniacutecio de formaccedilatildeo de calos e 20 dias
depois da inoculaccedilatildeo ocorreu o surgimento de brotos e jaacute
existiam calos formados Para esse tipo de explante nos
meios MI MII e MIII ocorreu a formaccedilatildeo de calos no
entanto apenas no meio MIII ocorreu a formaccedilatildeo de calos
com brotos (Tabela 1)
Capacidade de regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro 91
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
TABELA 1 ndash Frequumlecircncia de induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo in vitro da cultivar Santa Clara do grupo Santa Cruz UberlacircndiaUFU 2001
Dados seguidos de mesma letra nas colunas (abc) e nas linhas (AB) natildeo diferem entre si a 5 de probabilidade peloteste de TukeyA diferenccedila entre o nordm de explantes de um meacutetodo para outro eacute devida a parcelas (ou parte delas) perdidas
Nos trecircs ciclos de repicagens a capacidade de
alongamento dos brotos foi igual indicando que as
concentraccedilotildees de BAP natildeo diferiram estatisticamente entre
si dentro de cada tipo de explante Em relaccedilatildeo ao nuacutemero
de brotos alongados na primeira e terceira repicagens o
cotileacutedone decapitado apresentou maior nuacutemero jaacute na
segunda repicagem natildeo houve diferenccedila entre os tipos de
explantes (Tabela 2)
As plantas apoacutes serem enraizadas foram
transferidas para aclimataccedilatildeo obtendo-se 82 de plantas
aclimatadas Cerca de 20 dias apoacutes transplantio para o
substrato as plantas jaacute estavam aclimatadas
Apoacutes a terceira repicagem ainda existiam cerca de
334 brotos para serem novamente repicados e 51 brotos
prontos para serem enraizados perfazendo um total geral
de 549 brotos obtidos ateacute a fase estudada
Para o tipo de explante cotileacutedone decapitado foram
obtidos 181 brotos equivalentes a 174 brotos por explante
Para o explante cotileacutedone fendido o nuacutemero de brotos por
Tipos de Explantes Variaacuteveis Meios Cotileacutedone decapitado Cotileacutedone fendido Cotileacutedone aparado
I 396 aA 050 cB 142 bB II 000 bB 632 bA 672 aA Nordm de explantes
com calos III 000 bB 1599 aA 597 bB I 1095 aA 000 bB 000bB II 050 bA 000 bA 000 bA Nordm de explantes
com brotos III 130 bB 1217 aA 850 aA I 396 aA 050 cB 169 cB II 000 bB 632 bA 645 bA Nordm total de
calos III 000 bB 3630 aA 2655 aA I 1850 aA 000 bB 000 bB II 050 bA 000 bA 000 bA Nordm total de
brotos III 130 bB 2760 aA 2934 aA I 48 32 40 II 32 40 32 Nordm de
explantes III 24 40 48 Total de explantes 104 112 120
explante foi igual a 145 e para o cotileacutedone aparado foram
obtidos 170 brotos por explante Esses resultados foram
semelhantes aos obtidos por Faacuteri et al (2000) para as
cultivares IPA-5 e IPA-6 os quais concluiacuteram que a
utilizaccedilatildeo de cotileacutedones fendidos e cotileacutedones aparados
produziram uma regeneraccedilatildeo alta e onde a maior induccedilatildeo
foi conseguida utilizando-se um meio igual ao MIII utilizado
nesse experimento A induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo tambeacutem foi
mais raacutepida quando usado cotileacutedone decapitado indicando
um alto potencial de organogecircnese espontacircnea A cultivar
Santa Clara mostrou-se mais eficiente na formaccedilatildeo de
brotos alongados observados na primeira repicagem
enquanto as cultivares utilizadas por Faacuteri et al (2000) IPA-
5 e IPA-6 necessitaram de duas repicagens para o
alongamento dos brotos no entanto a cultivar IPA-5
mostrou-se mais eficiente na produccedilatildeo de brotos por
explante Faacuteri et al (2000) utilizaram zeatina durante os trecircs
ciclos de repicagem enquanto nesse experimento foi
utilizado BAP
SOUZA G de F M V e et al92
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
TABELA 2 ndash Capacidade de alongamento e enraizamento de brotos da cultivar Santa Clara durante os trecircs ciclos derepicagem Uberlacircndia UFU 2001
Dados seguidos de mesma letra nas colunas (ab) e nas linhas (AB) natildeo diferem entre si a 5 de probabilidade peloteste de TukeyTipos de explantes A - cotileacutedone decapitado B - cotileacutedone fendido C - cotileacutedone aparado
Os resultados aqui obtidos tambeacutem foram
semelhantes aos de Faacuteri et al (1995b) que trabalhando
com transformaccedilatildeo geneacutetica da berinjela (Solanum
melongena L) observaram que a maior superfiacutecie de corte
do cotileacutedone resultou em maior capacidade de
regeneraccedilatildeo Tambeacutem foram obtidos resultados
semelhantes aos de Nogueira et al (2001) que estudando
a regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro Santa Clara utilizando
como explantes cotileacutedones concluiacuteram que o meio com
uma combinaccedilatildeo adequada de auxina e citocinina (10 mg L-
1 de zeatina e 01 mg L-1 de AIA) promoveu uma maior
meacutedia de regeneraccedilatildeo e um maior nuacutemero meacutedio de brotaccedilotildees
por explante Costa et al (2000) trabalhando com as
cultivares IPA-5 e IPA-6 chegaram a uma conclusatildeo
semelhante onde meio suplementado com 10 mg L-1 de
zeatina + 01 mg L-1 de AIA e meio suplementado com 25
mg L-1 de BAP + 02 mg L-1 de AIA determinaram a maior
frequumlecircncia de regeneraccedilatildeo de explantes cotiledonares e
tambeacutem um maior nuacutemero de brotos alongados por explante
McCormick et al (1986) pesquisando a morfogecircnese
in vitro de L esculentum observaram que a presenccedila de 25
mg L-1 de BAP e 10 mg L-1 de AIA ou 10 mg L-1 de BAP e
02 mg L-1 de AIA produziu um maior nuacutemero de ramos por
explante a partir de explantes de cotileacutedones e hipocoacutetilos
Ohki et al (1978) utilizando segmentos de hipocoacutetilos de L
esculentum sugeriram que o efeito positivo da combinaccedilatildeo
de auxinas e citocininas na regeneraccedilatildeo in vitro pode ser
causado por uma maior capacidade das ceacutelulas dessa espeacutecie
em utilizar e adaptar-se agrave combinaccedilatildeo de auxinas e citocininas
de que somente citocininas Para os mesmos autores a
variabilidade observada nas respostas morfogecircnicas in vitro
para diferentes citocininas pode ser causada pela variaccedilatildeo
na razatildeo de degradaccedilatildeo dessas substacircncias nos tecidos
vegetais ou no meio de cultivo Segundo Caldas et al (1999)
uma alta relaccedilatildeo citocininaauxina normalmente leva a maior
induccedilatildeo de parte aeacuterea (brotos) em explantes in vitro
principalmente quando a citocinina usada eacute o BAP que induz
a formaccedilatildeo de grande nuacutemero de brotos e alta taxa de
multiplicaccedilatildeo em muitos sistemas de micropropagaccedilatildeo
Tanto no presente trabalho quanto nos trabalhos acima
citados foram utilizados meios com pelo menos uma
combinaccedilatildeo com alta relaccedilatildeo citocininaauxina e meios
contendo apenas citocinina
CONCLUSOtildeES
A maior induccedilatildeo de regeneraccedilatildeo tanto de calos
quanto de brotos foi observada nos meacutetodos cotileacutedone
fendido e cotileacutedone aparado quando colocados no meio
com BAP (25 mgL) e AIA (02 mgL) (MIII) Um ciclo de
repicagem foi suficiente para obtenccedilatildeo de brotos
alongados A maior regeneraccedilatildeo de brotos alongados
ocorreu com o meacutetodo cotileacutedone decapitado
Meios M1 + 05 mgL BAP M1 + 08 mgL BAP M1 + 10 mgL BAP
Repicagem 1 Repicagem 2 Repicagem 3
M1+ 05 mgl AIA
Tipos de Explante
s
Nordm total de brotos
Nordm de brotos
alongados
Nordm total de brotos
Nordm de brotos
alongados
Nordm total de brotos
Nordm de brotos
alongados
Nordm total de placircntulas
enraizadas
Nordm total de
plantas aclimatadas
Nordm total geral de brotos
A 3117 bA 899 aA 3684 bA
866 aA 3174 bA
81 aA 80 67 181 B 536 aA 466 bA 6244 aA 633 aA 5158 aA 450 bA 41 33 163 C 3527 bA 400 bA 4368 bA
566 aA 3928 bA
312 bA 43 35 205
Total 164 135 549
Capacidade de regeneraccedilatildeo in vitro de tomateiro 93
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 88-93 2006
AGRADECIMENTOS
Ao Instituto de Geneacutetica e Bioquiacutemica e ao Instituto
de Ciecircncias Agraacuterias da Universidade Federal de
Uberlacircndia pelo financiamento deste projeto e a todos
que auxiliaram direta eou indiretamente
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SILVA A S et al94
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
INDUCcedilAtildeO DE CALOS A PARTIR DE CULTURA DE ANTERAS DECAFEEIRO (Coffea arabica L) CV CATUAIacute VERMELHO 99 E 44
CALLUS INDUCTION FROM ANTHER CULTURE OF COFFEE PLANT (Coffea arabica L) CV CATUAIacute VERMELHO 99 AND 44
ADELAIDE SIQUEIRA SILVA1 JOSEacute MAGNO QUEIROZ LUZ2 DENISE GARCIA SANTANA2 PATRIacuteCIA CRYSTIE VIEIRA MUSTAFA3 MOACIR PASQUAL4 GLAUCIA DE FATIMA MOREIRA VIEIRA E SOUZA2
1Mestranda do Curso de Agronomia ndash Universidade Federal de UberlacircndiaUFU ndash Av Engenheiro Diniz 1178 ndash Caixa Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG ndash adelaidebioyahoocombr2Professor Dr ndash Universidade Federal de UberlacircndiaUFU ndash Instituto de Ciecircncias Agraacuterias ndash Curso de Agronomia ndash AV Paraacute Bloco 2E SALA 14campus Umuarana ndash Caixa-Postal 593 ndash 38400-902 ndash Uberlacircndia MG3Bioacuteloga Universidade Federal de UberlacircndiaUFU ndash Centro de Ciecircncias Biomeacutedicas ndash Departamento de Agronomia ndash Rua Amazonas snordm - Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos sala 2E-14 ndash Umuarama ndash 38400920 ndash Uberlandia MG ndash patriciacrystiezipmailcombr
4Doutor Departamento de Adgricultura DAG ndash Universidade Federal de Lavras UFLA ndash Campus universitaacuterio ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash mpasqualuflabr
RESUMONo Brasil o cafeacute ainda apresenta poucos progressos com
relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo da cultura de tecidos vegetais tornando-se degrande importacircncia o conhecimento sobre a atuaccedilatildeo dosreguladores de crescimento Com este trabalho avaliou-se ocomportamento de duas cultivares de Coffea arabica L CatuaiacuteVermelho LCH-2077-2-5-99 e LCH-2077-2-5-44 denominadasrespectivamente de Catuaiacute Vermelho 99 e Catuaiacute Vermelho 44quanto agrave ausecircncia e presenccedila de luz e quantificou-se a interaccedilatildeoentre os reguladores de crescimento 24-D e BAP O experimentofoi realizado no Laboratoacuterio de Cultura de Tecidos Vegetais daUniversidade Federal de Uberlacircndia As anteras das cultivaresCatuaiacute Vermelho 99 e 44 foram inoculadas em meio basal MSsuplementado com quatro concentraccedilotildees de 24-D (905 181271 e 362 mM) e duas concentraccedilotildees de BAP (0 e 89 mM) napresenccedila de luz e ausecircncia de luz As avaliaccedilotildees para a oxidaccedilatildeointumescimento e calosidade foram realizadas aos 30 dias apoacutes ainoculaccedilatildeo no meio de cultura e o diacircmetro dos calos aos 45 diasApoacutes 30 dias de cultivo os calos obtidos foram classificados emfriaacuteveis esverdeados esbranquiccedilados e cinza Os resultadosmostraram que para ocorrer intumescimento das anterasformaccedilatildeo e aumento do tamanho dos calos de ambas cultivares eacutenecessaacuterio que haja interaccedilatildeo entre a auxina (24-D) e a citocinina(BAP) Dentre os tipos de calos os de coloraccedilatildeo cinza foram osque apresentaram maior frequumlecircncia para as duas cultivares
Termos para indexaccedilatildeo Melhoramento calos reguladores decrescimento cafeeiro
ABSTRACTIn Brazil coffee still presents little progress regarding
the application of plant tissue culture which turns important theunderstanding of the action of growth regulators This workevaluated the in vitro performance of two Coffea arabica Lcultivars Catuaiacute Vermelho LCH-2077-2-5-99 and LCH-2077-2-5-44 known as Catuaiacute Vermelho 99 and Catuaiacute Vermelho 44respectively in the presence and absence of light and theinteraction of 24-D and BAP The experiment was carried out at
the Plant Tissue Culture Laboratory of the Universidade Federalde Uberlacircndia Anthers from both cultivars were inoculated inMS basal medium supplemented with four concentrations of24-D (905 181 271 and 362 mM) and two concentrations ofBAP (0 or 89 mM) in the presence and absence of lightOxidation intumescences and callus formation evaluations wereobtained 30 days after inoculation and callus diameter measuredat 45 days of inoculation The observed callus was classified asfriable greenish whitish or gray The results showed that antherintumescences callus formation and growth of both cultivarsdemand the interaction between the auxin (24-D) and thecytokinin (BAP) Callus presenting gray color were the mostfrequent for both cultivars
Index terms Plant breeding callus growth regulators coffee plant
INTRODUCcedilAtildeO
O cafeeiro pertence agrave famiacutelia Rubiaceae na qual o
gecircnero Coffea abrange cerca de 60 espeacutecies sendo as mais
comuns no mercado Coffea araacutebica L e Coffea canephora
Pierre ex Froehn Os programas de melhoramento do cafeacute
demandam aproximadamente 25 anos desde a hibridaccedilatildeo
ateacute a obtenccedilatildeo de uma nova cultivar (PASQUAL et al
2002) A cultura de anteras eacute considerada uma ferramenta
importante pois possibilita a obtenccedilatildeo de linhas
homozigoacuteticas em uma uacutenica etapa (ANDRADE 1998)
acelerando drasticamente o processo de obtenccedilatildeo de novas
cultivares Sendo assim a teacutecnica de cultura de anteras
vem auxiliar no melhoramento da cultura pois permite a
obtenccedilatildeo de haploacuteides em geraccedilotildees segregantes o que
leva agrave raacutepida produccedilatildeo de plantas homozigotas por meio
(Recebido em 14 de outubro de 2003 e aprovado em 29 de outubro de 2006)
Induccedilatildeo de calos a partir de cultura 95
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
da duplicaccedilatildeo do nuacutemero de cromossomos numa uacutenica
etapa substituindo as geraccedilotildees de auto fecundaccedilatildeo
Acrescenta-se a isso o fato de os haploacuteides serem livres
dos problemas de dominacircncia e recessividade por possuir
apenas um alelo em cada loco gecircnico
No Brasil Coffea arabica ainda apresenta poucos
progressos com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo da cultura de anteras
Daiacute a importacircncia de se produzir mais conhecimentos sobre
a atuaccedilatildeo dos reguladores de crescimento na expressatildeo
androgeneacutetica de Coffea arabica identificaccedilatildeo de
genoacutetipos androgecircnicos bem como a determinaccedilatildeo de
condiccedilotildees fiacutesicas mais adequadas agrave incubaccedilatildeo de anteras
nessa espeacutecie
Nos programas de melhoramento as teacutecnicas
convencionais tecircm apresentado resultados promissores
na cultura do cafeacute no que se refere ao aumento de
produtividade e obtenccedilatildeo de novas cultivares Um fator
importante para o sucesso da cultura de anteras eacute conhecer
o estaacutedio ideal de desenvolvimento dos microacutesporos com
o intuito de se obter uma melhor resposta androgeneacutetica
utilizando microacutesporos receacutem-liberados da teacutetrade meioacutetica
ateacute no maacuteximo o estaacutedio binucleado A fase uninucleada
responde positivamente ao processo embriogecircnico porque
nesta fase os microacutesporos apresentam uma parede celular
delgada o que a torna mais receptiva aos fatores externos
Em estaacutedios mais avanccedilados da microsporogecircnese ocorre
um engrossamento da parede celular sendo esta uma
caracteriacutestica do gratildeo de poacutelen maduro do cafeacute
prejudicando o processo de regeneraccedilatildeo (ASCANIO amp
ARCIA 1994) Os autores Grando amp Moraes Fernandes
(1993) sugerem que o potencial embriogecircnico do gratildeo de
poacutelen pode ser determinado tanto no periacuteodo da meiose
quanto no periacuteodo da preacute-mitose do microacutesporo pois
nestes dois momentos o microacutesporo ainda teria
metabolicamente caracteriacutesticas esporofiacuteticas o que
permite a diferenciaccedilatildeo do gratildeo de poacutelen em embriatildeo e
posterior formaccedilatildeo de uma planta
Segundo Mantell et al (1994) satildeo possiacuteveis vaacuterios
tipos de desenvolvimento do microacutesporo in vitro sendo
que tanto o nuacutecleo generativo quanto o vegetativo pode
se dividir continuamente originando um embrioacuteide
haploacuteide ou ainda a primeira mitose produziria dois nuacutecleos
semelhantes e estes se dividiriam repetidamente resultando
na formaccedilatildeo de embrioacuteides haploacuteides
A composiccedilatildeo do meio de cultura tambeacutem eacute de
grande importacircncia para o sucesso da cultura de anteras
natildeo existindo contudo uma recomendaccedilatildeo generalizada
Na maioria das espeacutecies a androgecircnese se verifica em meios
que conteacutem sais minerais sacarose vitaminas reguladores
de crescimento e aacutegar (MORAES FERNANDES 1990) A
consistecircncia do meio normalmente eacute semi-soacutelida mas os
meios liacutequidos estatildeo sendo cada vez mais usados pois
tecircm vantagens no aumento do rendimento pela maior
obtenccedilatildeo de embriotildees e calos (PIERIK 1987) O
presente trabalho teve como objetivo aplicar a teacutecnica da
cultura de anteras em diferentes cultivares de Coffea
arabica verificando os vaacuterios fatores que influenciam a
induccedilatildeo de calos
MATERIAL E MEacuteTODOS
Experimentos de Induccedilatildeo e Regeneraccedilatildeo de Calos
Esta etapa constituiu-se de dois experimentos cada
um com uma cultivar tendo sido conduzidos no laboratoacuterio
de Cultura de Tecidos Vegetais da Universidade Federal
de Uberlacircndia em Uberlacircndia - Minas Gerais no periacuteodo
de setembro de 2002 a janeiro de 2003
Foram utilizados bototildees florais de duas cultivares
de Coffea araacutebica Catuaiacute Vermelho LCH-2077-2-5-99 e
LCH-2077-2-5-44 denominadas respectivamente de Catuaiacute
Vermelho 99 e Catuaiacute Vermelho 44 plantadas na aacuterea
experimental do Campus Umuarama dessa Universidade
Os bototildees florais foram coletados no periacuteodo de 8 agraves 9
horas da manhatilde e armazenados em placas de Petri contendo
papel de filtro umedecido em aacutegua destilada e colocados
dentro de uma caixa de isopor para evitar a desidrataccedilatildeo
ateacute serem conduzidos ao laboratoacuterio
No laboratoacuterio o comprimento dos bototildees foi
medido com o auxiacutelio de um paquiacutemetro e utilizaram-se
SILVA A S et al96
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
bototildees florais entre 45 a 60 mm de comprimento em todos
os experimentos Os bototildees foram envoltos em gaze
previamente autoclavada e desinfestados em uma soluccedilatildeo
de aacutelcool 70 por alguns segundos e por 10 minutos em
soluccedilatildeo de hipoclorito de soacutedio a 02 sob agitaccedilatildeo Em
seguida na cacircmara de fluxo laminar foram lavados 3 vezes
em aacutegua destilada e autoclavada Apoacutes este processo as
anteras foram retiradas dos bototildees com o auxiacutelio de uma
lupa uma pinccedila fina e bisturi nordm 10 sendo os uacuteltimos
flambados para cada botatildeo tomando-se o cuidado para
natildeo ferir as anteras Logo apoacutes as anteras foram imersas
por 1 segundo em soluccedilatildeo de aacutecido ascoacuterbico na
concentraccedilatildeo de 600 mgL-1 hipoclorito de soacutedio 02 e
aacutegua destilada e autoclavada respectivamente
Apoacutes este processo as anteras foram inoculadas
em tubo de ensaio contendo 20 mL do meio MS
(MURASHIGE amp SKOOG 1962) suplementado com aacutecido
24-diclorofenoxiaceacutetico (24-D) e 6- benzilaminopurina
(BAP) em diferentes concentraccedilotildees com pH ajustado para
58 Este meio foi esterilizado em autoclave vertical agrave
temperatura de 121deg C sob pressatildeo de 1 atm por 20 minutos
O delineamento experimental utilizado foi o de
blocos casualizados com 10 repeticcedilotildees em esquema fatorial
4 x 2 x 2 sendo que os fatores foram compostos de quatro
concentraccedilotildees de 24-D (905 181 271 362 mM) duas
concentraccedilotildees de BAP (0 e 89 mM) perfazendo oito
tratamentos incubados na ausecircncia ou presenccedila de luz
em sala de crescimento com temperatura de 25 plusmn 2degC e 16
horas de fotoperiacuteodo Nos dois experimentos cada
tratamento teve 10 repeticcedilotildees sendo um tubo com 10
anteras considerado uma repeticcedilatildeo
Aos 30 dias apoacutes a inoculaccedilatildeo das anteras foram
avaliadas as porcentagens de oxidaccedilatildeo de intumescimento
e de formaccedilatildeo de calos (calosidade) e aos 45 dias foi medido
o diacircmetro dos calos
Os calos obtidos das duas cultivares apoacutes 45 dias
de inoculaccedilatildeo das anteras foram transferidos para o meio
MS suplementado com 30 gL-1 de sacarose 6gL-1 de agar e
de 24-DBAP nas seguintes concentraccedilotildees de 1810 181
2 2710 e 3620 mM com pH ajustado para 58 associando
a ausecircncia e presenccedila de luz
Apoacutes a permanecircncia destes calos no meio de cultura
por 30 dias aqueles provenientes da cultivar Catuaiacute
Vermelho 99 incubados na presenccedila de luz foram
transferidos para o meio de cultura contendo 271 mM de
24-D enquanto que aqueles incubados na ausecircncia de
luz foram transferidos para meio contendo 362 mM de 24-
D Jaacute os calos da cultivar Catuaiacute Vermelho 44 incubados
na presenccedila de luz foram transferidos para meio contendo
181 mM de 24-D e 89 mM de BAP e os incubados na
ausecircncia de luz transferidos para o meio contendo 181
mM de 24-D
Apoacutes 30 dias neste tratamento foram avaliadas as
caracteriacutesticas referentes ao tipo de calo (friaacuteveis
esverdeados esbranquiccedilados e cinza)
Os dados obtidos foram testados quanto agrave
normalidade e agrave homogeneidade necessitando de
transformaccedilatildeo em arco seno para os dados em
porcentagem e raiz quadrada de (x + 05) para os dados
referentes ao diacircmetro dos calos
RESULTADOS
Interaccedilatildeo entre os Reguladores de Crescimento e oFotoperiacuteodo
Para a cultivar Catuaiacute 99 em todas as concentraccedilotildees
de 24-D e independentemente da concentraccedilatildeo de BAP a
oxidaccedilatildeo foi menor na ausecircncia de luz diferindo
estatisticamente da fase em que se tinha presenccedila de luz
No entanto nos calos cultivados nas concentraccedilotildees de
905 e 271 mM de 24-D e 89 mM de BAP na ausecircncia de
luz foi observado um aumento significativo na oxidaccedilatildeo
das anteras o mesmo acontecendo na concentraccedilatildeo de
271 mM de 24-D na presenccedila de luz No entanto resultado
inverso foi observado para a concentraccedilatildeo de 362 mM de
24-D (Tabela 1)
Os resultados do percentual de intumescimento
variaram bastante em funccedilatildeo da luminosidade e
reguladores de crescimento (Tabela 1) Na presenccedila do
Induccedilatildeo de calos a partir de cultura 97
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
BAP e concentraccedilatildeo 89 mM de 24-D tanto na presenccedila
ou ausecircncia de luz o intumescimento dos calos natildeo diferiu
significativamente Jaacute na concentraccedilatildeo de 181 mM de 24-
D na presenccedila de luz se mostrou melhor promovendo um
aumento significativo do intumescimento das anteras
Quanto agraves concentraccedilotildees de 271 e 362 mM de 24-D
cultivados na presenccedila de luz se mostrou melhor ao
intumescimento quando comparado agravequeles cultivados na
ausecircncia de luz (Figura 1)
A presenccedila de calos aumentou significativamente
com a incubaccedilatildeo das anteras na ausecircncia de luz e na
TABELA 1 ndash Meacutedias do nuacutemero de anteras oxidadas intumescidas e com calos e diacircmetro dos calos (mm) em funccedilatildeode diferentes concentraccedilotildees de 24-D e ausecircncia ou presenccedila de BAP em duas condiccedilotildees de luminosidade (presenccedilaou ausecircncia de luz) para anteras do genoacutetipo cv 99
Luminosidade1
Oxidaccedilatildeo () Intumescimento ()
Calosidade () Diacircmetro (mm) 24-D M
BAP M luz Escuro Luz Escuro luz Escuro luz Escuro 0 980 b A 395 a A 000b B 434 a A 000 b A 740 a A 000 b A 309 a A 905
89 999 b A 823 a B 398 a A 327 a B 007 b A 615 a A 000 b A 300 a A 0 999 b A 524 a A 000 b B 447 a A 007 b A 750 a A 000 b B 368 a A
181 89 935 b A 511 a A 614 a A 407 b A 030 b A 720 a A 300 b A 387 a A
0 745 b A 000 a A 534 a A 000 b B 530 a A 000 b B 318 a B 000 b B 271
89 914 b B 590 a B 625 a A 634 a A 708 a A 809 a A 377 a A 298 b A 0 999 b B 440 a A 607 a A 492 b A 097 b B 815 a A 300 a B 277 a A
362 89 813 b A 426 a A 493 a B 527 a A 378 b A 758 a A 398 a A 298 b A
1Meacutedias seguidas por letras diferentes minuacutesculas na linha e maiuacutesculas na coluna dentro de cada concentraccedilatildeo de 2-4-D diferem entre si pelo teste de Tuckey a significacircncia de 5
concentraccedilatildeo de 271 mM de 24-D nas demais
concentraccedilotildees de 24-D independente da concentraccedilatildeo
do BAP a incubaccedilatildeo na ausecircncia de luz apresentou
meacutedias de calosidade significativamente maiores (Figura
2) A presenccedila do BAP promoveu aumento significativo
na calosidade das anteras na concentraccedilatildeo 271 mM de
24-D na ausecircncia de luz e na concentraccedilatildeo de 362 mM
de 24-D na presenccedila de luz Nas demais concentraccedilotildees
natildeo houve diferenccedila significativa entre presenccedila ou
ausecircncia de BAP tanto na ausecircncia ou presenccedila de luz
(Tabela 1)
FIGURA 1 ndash Anteras da cv Catuaiacute Vermelho 99 naconcentraccedilatildeo de 181 M de 24-D na presenccedila de luz
FIGURA 2 ndash Calos de anteras incubadas na ausecircncia deluz e na concentraccedilatildeo de 271 M de 24-D
SILVA A S et al98
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
Quanto ao diacircmetro nas concentraccedilotildees 905 e 181 M
de 24-D a ausecircncia de luz promoveu aumento significativo
no diacircmetro dos calos diferindo-se estatisticamente do
tratamento na presenccedila de luz Somente para a concentraccedilatildeo
de 271 mM de 24-D na ausecircncia do BAP natildeo houve diferenccedila
significativa para a caracteriacutestica independentemente do
fotoperiacuteodo Nas demais concentraccedilotildees de 24-D o tratamento
na presenccedila de luz promoveu um aumento significativo no
diacircmetro dos calos No tratamento em que houve a associaccedilatildeo
da presenccedila de luz e de BAP natildeo diferiu estatisticamente do
tratamento em que houve a ausecircncia de BAP quando a
concentraccedilatildeo de 24-D foi de 905 mM nos demais
proporcionou aumento significativo no diacircmetro dos calos
Para o tratamento na ausecircncia de luz apenas na concentraccedilatildeo
de 271 mM de 24-D a ausecircncia de BAP promoveu diminuiccedilatildeo
significativa no diacircmetro de calos Nas demais concentraccedilotildees
natildeo houve diferenccedila significativa entre presenccedila ou ausecircncia
de BAP (Tabela 1)
Para as variaacuteveis intumescimento e calosidade da
cultivar cv 44 a interaccedilatildeo entre 24-D e BAP natildeo diferiram
estatisticamente quanto presenccedila e ausecircncia de luz nas
concentraccedilotildees 905 e 362 mM de 24-D e que tambeacutem natildeo
difere para o diacircmetro na concentraccedilatildeo de 181 mM de 24-
D Jaacute na concentraccedilatildeo 271 mM de 24-D haacute uma semelhanccedila
quanto ao intumescimento calosidade e diacircmetro que
diferem das demais concentraccedilotildees natildeo apresentando
portanto uma boa interaccedilatildeo
A melhor interaccedilatildeo para intumescimento calosidade
e diacircmetro encontra-se respectivamente na concentraccedilatildeo
905 mM de 24-D na presenccedila de luz na concentraccedilatildeo 181
mM de 24-D na ausecircncia de luz e na concentraccedilatildeo 905
mM de 24-D na ausecircncia de luz Jaacute as piores interaccedilotildees
estatildeo na concentraccedilatildeo 271 mM de 24-D na luz tanto para
o intumescimento quanto para o diacircmetro analisados na
Tabela 2
De acordo com a Tabela 2 observou-se que os
melhores resultados ou seja as interaccedilotildees independem
da presenccedila ou ausecircncia de BAP Na Tabela 3 notou-se
uma maior oxidaccedilatildeo das anteras quando incubadas no claro
estas apresentaram uma maior oxidaccedilatildeo em relaccedilatildeo as que
foram incubadas no escuro tornando-se mais tarde calos
previamente oxidados
TABELA 2 ndash Meacutedias do nuacutemero de anteras intumescidas e com calos diacircmetro dos calos (mm) em funccedilatildeo de diferentesconcentraccedilotildees de 24-D e ausecircncia ou presenccedila de BAP em duas condiccedilotildees de luminosidade (luz e escuro) para anterasdo genoacutetipo cv 44
Luminosidade1
Intumescimento () Calosidade () Diacircmetro (mm) 24-D ( M)
BAP ( M) Luz Escuro Luz Escuro Luz Escuro
0 907 a A 775 a A 779 bA 948 aA 609 bA 800 aA 905 89 843 a A 875 a A 889 aA 946 aA 607 aA 420 bB 0 887 a A 852 a A 939 aA 990 aA 490 aA 466 aA
181 89 906 a A 786 a A 917 aA 959 aA 420 aA 493 aA 0 600 b A 772 a A 694 bA 895 aA 000 bA 373 aA
271 89 022 b B 827 a A 294 bB 837 aA 000 bA 376 aA 0 828 a A 737 a A 928 aA 939 aA 414 bA 595 aA
362 89 866 a A 725 a A 949 aA 866 aA 329 aA 376 aA
1Meacutedias seguidas por letras diferente minuacutesculas na linha e maiuacutesculas na coluna dentro de cada concentraccedilatildeo de 2-4-D diferem entre si pelo teste de Tukey a significacircncia de 5
Induccedilatildeo de calos a partir de cultura 99
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
TABELA 3 ndash Meacutedias de oxidaccedilatildeo das anteras entre asdiferentes concentraccedilotildees de 24-D em duas condiccedilotildeesde luminosidade (luz e escuro) para anteras da cultivarCatuaiacute Vermelho 44
Concentraccedilotildees
24-D ( M ) OXIDACcedilAtildeO ()
Claro Escuro 905 749 a 269 b 181 420 a 270 b 271 999 a 221 b 362 308 a 334 a
1Meacutedias seguidas por letras diferentes minuacutesculas na linhadentro de cada concentraccedilatildeo de 2-4-D diferem entre sipelo teste de Tukey a significacircncia de 5
TABELA 4 ndash Tipos de calos obtidos apoacutes 30 dias em meioMS com 362 M de 24-D na ausecircncia de luz da cultivarCatuaiacute Vermelho 99
Tipos de Calos
Nuacutemero de Calos
Nuacutemero de Calos com diacircmetro acima
de 05 mm Friaacuteveis 03 Esverdeados 13 06 Esbranquiaccedilados
03 Cinza 26
Dados de contagem natildeo transformados O recultivo emmeio MS com 362 M de 24-D na presenccedila de luz teve100 de contaminaccedilatildeo apoacutes sua inoculaccedilatildeo
TABELA 5 ndashTipos de calos obtidos apoacutes 30 dias em meioMS com 181 M de 24D e 89 M de BAP na presenccedilade luz da cultivar Catuaiacute Vermelho 44
TABELA 6 ndash Tipos de calos obtidos apoacutes 30 dias em meioMS com 181 M de 24D na ausecircncia de luz da cultivarCatuaiacute Vermelho 44
Tipos de Calos Nuacutemero de Calos
Nuacutemero de Calos com diacircmetro
acima de 05 mm Friaacuteveis 58 Esverdeados 23 214 Esbranquiaccedilados 94 Cinza 203
Tipos de Calos
Nuacutemero de Calos
Nuacutemero de Calos com diacircmetro
acima de 05 mm Friaacuteveis 25 Esverdeados 11 69 Esbranquiaccedilados 19 Cinza 350
Dados de contagem natildeo transformados Dados de contagem natildeo transformados
Nesta etapa a maioria dos calos encontrados para
as trecircs cultivares apresentaram coloraccedilatildeo cinza (Tabelas 4
5 e 6) A perda gradativa da coloraccedilatildeo natural dos calos
passando de verdes para a cor marrom a diminuiccedilatildeo do
ritmo de crescimento dos mesmos a estagnaccedilatildeo do
processo de formaccedilatildeo de embrioacuteides seguido do
surgimento de aacutereas necrosadas na superfiacutecie satildeo sinais
que caracterizam a senescecircncia da cultura (SILVA 2002)
DISCUSSAtildeO
A resposta das anteras da cultivar Catuaiacute Vermelho 99
com relaccedilatildeo agrave oxidaccedilatildeo indica que a mesma estaacute associada agrave
combinaccedilatildeo entre auxina e citocinina promovendo os menores
iacutendices de oxidaccedilatildeo Agrave medida que se aumentou a
concentraccedilatildeo de 24-D na presenccedila de BAP houve um
aumento gradativo da oxidaccedilatildeo ateacute atingir um ponto maacuteximo
em torno de 80 na dosagem de 271 mM de 24-D Jaacute na
ausecircncia de BAP a oxidaccedilatildeo foi bem maior quando comparada
agrave porcentagem de oxidaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 905 mM de
24-D De acordo com Wang amp Huang (1976) o cultivo in
vitro por um periacuteodo longo induz a formaccedilatildeo de compostos
fenoacutelicos no meio que podem causar necrose e posteriormente
morte dos calos Maciel (2001) e Paluacute (2002) citam que pelos
resultados obtidos para a induccedilatildeo de calogecircnese em anteras
de cafeeiro observa-se que eacute necessaacuteria uma auxina
juntamente com uma citocinina Dentre as auxinas sinteacuteticas
o 24-D eacute sem duacutevida o mais adequado agrave induccedilatildeo e
manutenccedilatildeo do calo (GAMBORG et al 1976)
Para Thomas amp Ravindra (1997) o maior problema
na iniciaccedilatildeo de culturas lenhosas eacute a ocorrecircncia de
compostos fenoacutelicos que estatildeo ligados com processos de
regulaccedilatildeo de crescimento especialmente com as auxinas
que dependendo da sua concentraccedilatildeo endoacutegena no tecido
resulta na induccedilatildeo desses compostos
SILVA A S et al100
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 94-101 2006
O fotoperiacuteodo que estas anteras foram submetidas
influenciou tambeacutem na porcentagem de oxidaccedilatildeo sendo
que no escuro e na presenccedila de 24-D (89 mM) a oxidaccedilatildeo
foi miacutenima Agrave medida que foi aumentando a concentraccedilatildeo
da auxina foi aumentando tambeacutem a oxidaccedilatildeo poreacutem este
aumento foi bem menor quando comparado ao cultivo das
anteras na presenccedila de luz
A oxidaccedilatildeo fenoacutelica tem sido controlada em
diferentes espeacutecies lenhosas pela reduccedilatildeo da intensidade
luminosa (MARKS amp SIMPSON 1990) associada com a
substituiccedilatildeo frequumlente do meio de cultura e dessa forma
as chances de se obter sucesso no estabelecimento e
cultivo de explantes de espeacutecies lenhosas satildeo bastante
elevadas (TEIXEIRA 2001)
Em muitas espeacutecies por razotildees natildeo conhecidas a
embriogecircnese direta eacute rara e as plantas tecircm que ser
diferenciadas a partir de calos Para induccedilatildeo destes
geralmente eacute necessaacuteria uma auxina (MAHESHWARI et
al 1982) Segundo Rocha (1998) para a induccedilatildeo e
manutenccedilatildeo do calo a maioria das espeacutecies parece
comportar-se diferentemente natildeo soacute quanto aos
reguladores de crescimento podendo ocorrer
independentemente de auxinas e citocininas dependente
de ambas ou dependente de uma ou de outra mas tambeacutem
quanto agrave presenccedila ou ausecircncia de luminosidade Sharp et
al (1973) obtiveram calos atraveacutes do cultivo de sementes
folhas e anteras de C arabica das cultivares Mundo Novo
e Bourbon Amarelo A induccedilatildeo de calos tambeacutem foi mais
eficiente na ausecircncia de luz Aleacutem disso Ascanio amp Arcia
(1994) citam que para o desenvolvimento do calo as
anteras devem ser mantidas no escuro jaacute para o
desenvolvimento do embriatildeo os calos devem ser mantidos
no claro
Natildeo houve a formaccedilatildeo de embriotildees e isto pode ser
devido agraves doses de reguladores ou mesmo de combinaccedilotildees
que natildeo foram apropriadas para estas cultivares
CONCLUSAtildeO
Os resultados mostraram que para ocorrer
intumescimento das anteras formaccedilatildeo e aumento do
tamanho dos calos de ambas as cultivares eacute necessaacuterio
que haja interaccedilatildeo entre a auxina (24-D) e a citocinina
(BAP) e incubaccedilatildeo no escuro
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PEREIRA F D et al102
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 102-106 2006
COMUNICACcedilAtildeO CIENTIacuteFICA
PROLIFERACcedilAtildeO IN VITRO DE BROTOS DE CURAUAacuteUTILIZANDO DIFERENTES VOLUMES DE MEIO DE CULTURA
IN VITRO SHOOT PROLIFERATION OF Ananas erectifolius USING DIFFERENTVOLUMES OF CULTURE MEDIUM
FLAacuteVIA DIONIacuteSIO PEREIRA1 JOSEacute EDUARDO BRASIL PEREIRA PINTO2HELEN CRISTINA DE ARRUDA RODRIGUES3 LUCIANA DOMICIANO SILVA ROSADO3
LUIZ ALBERTO BEIJO4 OSMAR ALVES LAMEIRA5
1Doutoranda em Agronomia ndash Universidade Estadual de Feira de SantanaUEFS ndash Horto Florestal ndash 44055-000 ndash Feira de Santana BA ndash flavia1808hotmailcom
2Doutor em Fisiologia Vegetal ndash Departamento de AgriculturaDAG ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG ndash jeduardouflabr
3Graduanda em Agronomia ndash Universidade Federal de LavrasUFLA ndash Caixa Postal 3037 ndash 37200-000 ndash Lavras MG4Doutorado em Agronomia ndash Universidade Federal de AlfenasUNIFAL ndash Departamento de Ciecircncias Exatas ndash Rua Gabriel Monteiro da Silva n deg 714 ndash Centro ndash 37130-000 ndash Alfenas MG ndash luizbeijoyahoocombr5Doutor em Agronomia ndash EMBRAPA ndash Amazocircnia Oriental ndash Trav Dr Eneacuteas Pinheiro sn ndash Bairro Marco ndash 66095-100 ndash Beleacutem PA ndash osmarcpatuembrapabr
RESUMOCurauaacute [Ananas erectifolius LBSm ndash Bromeliaceae] eacute
uma espeacutecie com grande potencial de uso de suas fibras comorevestimento na induacutestria automobiliacutestica Aleacutem disso o poacute dosumo do curauaacute tem sido utilizado no tratamento de cicatrizaccedilatildeode lesotildees cutacircneas Neste trabalho avaliaram-se diferentes volumesde meio MS Os volumes utilizados foram de 10 15 20 25 e 30 mLO delineamento experimental foi inteiramente casualizado (DIC)e cada tratamento continha 19 repeticcedilotildees Aos 30 dias avaliaram-se o nuacutemero e o tamanho de brotaccedilotildees Segundo a anaacutelise devariacircncia houve efeito linear do volume de meio na produccedilatildeo debrotos de curauaacute Agrave medida em que se aumenta o volume domeio aumenta o nuacutemero de brotos Natildeo houve diferenccedilasignificativa nos comprimentos dos brotos
Termos para indexaccedilatildeo Ananas erectifolius fibras vegetaismicropropagaccedilatildeo
ABSTRACTAnanas erectifolius LBSm ndash Bromeliaceae is a species
that presents fibers with great potential to be used as revetmentfor the automobile industry Besides the powder obtained fromits juice has been used in the treatment of skin lesionscicatrisation In this work the effect of different volumes (1015 20 25 and 30 mL) of MS medium during the in vitro cultureof axillary buds was evaluated A completely randomized design(CDR) was used with each treatment containing 19 replicatesAfter 30 days of inoculation shoot number and size wereevaluated The analysis of variance showed a linear effect of theculture medium volume and shoot proliferation Higher shoot
number was observed with the increase of medium volume Nosignificant difference was observed on shoot lenght
Index terms Ananas erectifolius vegetable fibermicropropagation
A produccedilatildeo de fibras vegetais ocupa um papel
relevante na economia agriacutecola mundial mesmo com a
intensa produccedilatildeo de fibras sinteacuteticas Mateacuterias-primas de
origens renovaacuteveis reciclaacuteveis e biodegradaacuteveis satildeo uma
das alternativas para a produccedilatildeo de manufaturados
ecologicamente corretos em consequumlecircncia do acuacutemulo
nos descartes de materiais natildeo biodegradaacuteveis os quais
tendem a aumentar com o crescimento populacional nos
centros urbanos A substituiccedilatildeo de materiais derivados do
petroacuteleo na produccedilatildeo de compostos elastomeacutericos por
mateacuteria-prima renovaacutevel vai ao encontro desses ideais
(ROCHA et al 2003)
As fibras sinteacuteticas destacam-se pela elevada
resistecircncia baixa densidade e elevada produccedilatildeo
Entretanto as fibras animais e vegetais satildeo as de maior
importacircncia principalmente para atender aos apelos
(Recebido em 31 de agosto de 2006 e aprovado em 19 de janeiro de 2007)
Proliferaccedilatildeo in vitro de brotos de curauaacute 103
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 102-106 2006
ecoloacutegicos e pelo nuacutemero de plantas e animais produtores
de fibras (SCHREIBER1998)
As plantas produtoras de fibras utilizaacuteveis foram
quantificadas por vaacuterios autores e em diferentes eacutepocas
tendo sido enumeradas 2000 mil plantas fibrosas e o seu
total estimado em 2300 destacando-se as florestas tropicais
que encerram recursos inesgotaacuteveis em potencial
(MEDINA 1959)
O curauaacute [Ananas erectifolius LBSm ndash
Bromeliaceae] utilizado principalmente na fabricaccedilatildeo de
cordas sacos e utensiacutelios domeacutesticos surge como
sucedacircneo para o aproveitamento de fibras O curauaacute eacute
uma bromeliaacutecea distribuiacuteda nos Estados do Paraacute Acre
Mato grosso Goiaacutes e Amazonas e eacute cultivada
principalmente por pequenos produtores da regiatildeo do
Lago Grande de Curuai no municiacutepio de Santareacutem PA
Estudos recentes tecircm demonstrado o grande potencial do
uso das fibras dessa planta como revestimento na induacutestria
automobiliacutestica devido agrave sua resistecircncia maciez e peso
reduzido O grande problema eacute que natildeo haacute suprimento
suficiente de mateacuteria-prima para atender agrave induacutestria
automobiliacutestica pois o curauaacute eacute fiel agraves suas origens amazocircnicas
e soacute se desenvolve em clima quente e uacutemido criando um
problema para a aquisiccedilatildeo de mudas fora desta regiatildeo que
por tal motivo eacute escassa no mercado (SILVA 2004)
A micropropagaccedilatildeo utilizando teacutecnicas de cultura
de tecido tem sido um valioso instrumento na propagaccedilatildeo
de diversos tipos de plantas Embora este processo envolva
diferentes etapas depois de definido um protocolo de
micropropagaccedilatildeo seja qual for a espeacutecie este pode ser
otimizado no intuito de se obter placircntulas de alta qualidade
e com baixo valor de produccedilatildeo O tipo e tamanho de frasco
e a quantidade de meio satildeo variaacuteveis que tecircm recebido
pouca atenccedilatildeo embora afetem diretamente a aacuterea superficial
da interface meio de cultura-atmosfera o volume de ar sobre
o meio de cultura e a sua profundidade Tais fatores tambeacutem
afetam a composiccedilatildeo da fase gasosa do frasco e
consequumlentemente o crescimento e desenvolvimento das
culturas (GRATTAPAGLIA amp MACHADO 1998)
Rodrigues et al (2005) verificaram maior
proliferaccedilatildeo de brotos de Cattleya persivaliana Hort
em frascos contendo 50 mL de meio quando comparados
com aqueles de 25 75 e 100 mL Nicoloso amp Erig (2002)
trabalhando com Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen
verificaram que 10 mL de meio MS (MURASHIGE amp
SKOOG 1962) proporcionaram o melhor crescimento
das placircntulas em biomassa quando cultivadas em tubos
de 20 cm de altura x 2 cm diacircmetro em comparaccedilatildeo com
os de 25 cm de altura x 2 cm 15 cm de altura x 2 cm
Carvalho et al (1995) estudando a influecircncia de fatores
fiacutesicos no desenvolvimento e crescimento in vitro de
batata-doce (Ipomoea batatas L Poir) verificaram que
10 mL de meio de cultura por frasco com explantes
proporcionaram maior formaccedilatildeo de gemas em relaccedilatildeo
aos volumes de 20 e 30 mL
Sendo assim objetivou-se neste trabalho avaliar
o volume de meio apropriado para a propagaccedilatildeo in vitro
de brotaccedilotildees de curauaacute
As brotaccedilotildees utilizadas como fonte de explante
foram fornecidas pela EMBRAPACPATU situada em
Beleacutem do Paraacute Gemas axilares de curauaacute foram
inoculadas em meio MS completo suplementado com
20 mgL de BAP (6-Benzilaminopurina) Apoacutes 30 dias
estas se desenvolveram e as brotaccedilotildees obtidas foram
transferidas para o meio MS sem regulador de
crescimento por 30 dias
Apoacutes este periacuteodo quatro explantes foram
desfolhados completamente ficando apenas porccedilotildees
basais com aproximadamente 1cm de comprimento que
foram inoculadas em meio de cultura baacutesico MS sem
regulador de crescimento em frasco de 12 cm de altura por
5 cm de diacircmetro (volume interno = 300 mL) com volumes
de 10 15 20 25 30 mL Os explantes foram mantidos em
sala de crescimento a uma temperatura de 26plusmn1degC e
fotoperiacuteodo de 16 horas sob uma Irradiacircncia de foacutetons de
25mmol m-2 s-1
O delineamento experimental foi inteiramente
casualizado (DIC) Cada tratamento continha 19 repeticcedilotildees
PEREIRA F D et al104
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 102-106 2006
(um frasco por repeticcedilatildeo) Aos 30 dias avaliaram-se o
nuacutemero e o comprimento das brotaccedilotildees O programa
utilizado para anaacutelise dos dados foi o software statistica
(SISVAR) tendo sido submetidas agrave anaacutelise de variacircncia
com aplicaccedilatildeo do teste F a 5 de probabilidade
analisando-se as meacutedias por regressatildeo polinomial
O efeito linear foi o mais adequado para explicar
a evoluccedilatildeo da taxa meacutedia de regeneraccedilatildeo do curauaacute Agrave
medida que o volume do meio de cultura aumenta existe
tendecircncia de aumento do nuacutemero de brotos Com 25
mL de meio produziu-se maior nuacutemero de brotos por
frasco (2557) e com 10 mL de meio produziu-se menor
nuacutemero de brotos (1226) O tratamento com 15 mL de
meio produziu 1765 brotos o com 20 mL 1750 e o com
30 mL 2242 (Figura 1) O volume maior de meio
disponibiliza mais nutrientes e diminui tambeacutem a
competiccedilatildeo entre as placircntulas o que explica a tendecircncia
em se obter um maior nuacutemero de brotos agrave medida que
se aumenta a quantidade do meio de cultura Em todos
os tratamentos as brotaccedilotildees obtidas foram vigorosas
com a coloraccedilatildeo verde-escura caracteriacutestica das
plantas matrizes As brotaccedilotildees tinham tambeacutem rigidez
outra caracteriacutestica da espeacutecie o que eacute devido agrave
presenccedila das fibras nas folhas Observou-se maior
concentraccedilatildeo de raiacutezes nas brotaccedilotildees maiores e natildeo
FIGURA 1 ndash Nuacutemero meacutedio de brotos por frasco de curauaacute(Ananas erectifolius) cultivados em diferentes volumesde meio MS completo 10 15 20 25 e 30
foi observada a presenccedila de calos em nenhum dos
tratamentos (Figura 2)
Resultados semelhantes foram obtidos por Reis
Lameira Reis (2004) trabalhando com curauaacute utilizando
volumes de 5 75 10 e 15 mL do meio liacutequido MS suplementados
com 25 mgL-1 de BAP (6-benzilaminopurina) os melhores
resultados sendo com os tratamentos que continham 10 e
15ml produzindo em meacutedia 121 e 154 brotosexplante
respectivamente
Da mesma forma Reis et al(2003) trabalhando com
ipeca (Psychotria ipecacuanha Stokes) em meio MS
acrescido de 15 mg L-1de BAP nos volumes de 10 20 30
e 40 mL obtiveram melhor resultado com os volumes de 30
e 40 mL (7 e 8 brotosfrasco respectivamente)
Quanto ao comprimento dos brotos natildeo houve
diferenccedila significativa Os brotos t iveram um
crescimento meacutedio de 228 cm sendo que no tratamento
com 10 mL de meio foi 257 cm com 15 mL 222 cm
com 20 mL 224 cm com 25 mL 224 cm e o tratamento
com 30 mL 215 cm Embora natildeo se tenham realizado
estudos mais aprofundados uma das hipoacuteteses
sugeridas para explicar tais resultados possivelmente
estaacute relacionada a fatores nutricionais do explante
Segundo Cappelades et al (1991) e Pereira et al (2001)
porccedilotildees basais satildeo mais robustas apresentando maior
quantidade de reservas acumuladas em seus tecidos
o que poderia levar agrave utilizaccedilatildeo dessas reservas pelas
brotaccedilotildees regeneradas para sustentar seu crescimento
Esta seria uma das causas da uniformidade apresentada
no tamanho das brotaccedilotildees em todos os tratamentos
Resultados iguais foram obtidos em estudos feitos por
Rodrigues et al (2005) quando avaliaram comprimento
meacutedio de duas espeacutecies de orquiacutedeas mantidas em meio
de cultura cujos volumes testados eram de 25 50 75 e
100 mL Portanto verifica-se que eacute muito importante
selecionar material com bom estado fisioloacutegico e
tamanho homogecircneo para se obter melhores
resultados na proliferaccedilatildeo das brotaccedilotildees eou na
morfogecircnese
Proliferaccedilatildeo in vitro de brotos de curauaacute 105
Plant Cell Cult Micropropag Lavras v 2 n 2 p 102-106 2006
FIGURA 2 ndash Brotaccedilotildees de curauaacute (Ananas erectifolius) produzidas in vitro em diferentes volumes de meio MS 1-Repicagem dos brotos 2- 10 mL de meio MS 3- 15 mL de meio MS 4- 20 mL de meio MS 5- 25 mL de meio MS 6- 30mL de meio MS
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NORMAS PARA PUBLICACcedilAtildeO DE ARTIGOS E COMUNICACcedilOtildeES CIENTIacuteFICAS
1 Os conceitos e afirmaccedilotildees contidos nos artigos e comunicaccedilotildeesseratildeo de inteira responsabilidade do(s) autor(es)
2 A revista ldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquo editadasemestralmente pela Editora da Universidade Federal de Lavras(Editora UFLA) publica artigos cientiacuteficos e comunicaccedilotildeescientiacuteficas da aacuterea de cultura de tecidos de plantas elaboradospor membros da comunidade cientiacutefica nacional e internacionalNatildeo eacute cobrada taxa para publicaccedilatildeo de trabalhos Eacute condiccedilatildeofundamental que os artigoscomunicaccedilotildees submetidos agrave apreciaccedilatildeoda revista ldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquo natildeo forame nem seratildeo publicados simultaneamente em outro lugar Com aaceitaccedilatildeo do artigo para publicaccedilatildeo os editores adquirem amplose exclusivos direitos sobre o artigo para todas as liacutenguas e paiacutesesA publicaccedilatildeo de artigoscomunicaccedilotildees dependeraacute da observacircnciadas Normas Editoriais dos pareceres do Corpo Editorial e daComissatildeo ad hoc Todos os pareceres tecircm caraacuteter sigiloso eimparcial e tanto os autores quanto os membros do CorpoEditorial eou Comissatildeo ad hoc natildeo obtecircm informaccedilotildeesidentificadoras entre si
3 Os artigos e comunicaccedilotildees submetidos para publicaccedilatildeo deveratildeoser apresentados em CD utilizando-se o processador de textoMicrosoft Word for Windows (version 98 2000 XP ou 2003)ser escrito em liacutengua portuguesa inglesa ou espanhola e usarsomente nomenclaturas oficiais e abreviaturas consagradas natildeoempregando abreviaturas no tiacutetulo do artigo Juntamente com oCD deveratildeo ser enviadas 4 (QUATRO) vias sendo uma originale as demais coacutepias omitindo os autores e a chamada de rodapeacute daprimeira paacutegina (para serem enviadas aos consultores cientiacuteficos)impressas em papel branco tipo A4 (21cm x 297cm) ou emformulaacuterio contiacutenuo em uma soacute face espaccedilo duplo entre linhasfonte Times New Roman tamanho 12 observada uma margemde 3 cm para o lado esquerdo e de 2 cm para o direito 25 cm paramargem superior e inferior 25 cm para o cabeccedilalho e 25 cm parao rodapeacute Cada trabalho deveraacute ter no maacuteximo 14 paacuteginas ejunto do mesmo deveraacute ser encaminhado ofiacutecio dirigido ao EditorChefe da revista solicitando a publicaccedilatildeo do artigo Esse ofiacuteciodeveraacute ser assinado por todos os autores constar o endereccedilocompleto telefone e e-mail de todos Qualquer inclusatildeo exclusatildeoou alteraccedilatildeo na ordem dos autores deveraacute ser notificada medianteofiacutecio assinado por todos os autores (inclusive do autor excluiacutedo)
4 O artigo cientiacutefico deveraacute conter os seguintes toacutepicos a)TIacuteTULO suficientemente claro conciso e completo evitandopalavras supeacuterfluas Recomenda-se comeccedilar pelo termo querepresente o aspecto mais importante do trabalho com os demais
termos em ordem decrescente de importacircncia b) TIacuteTULO EMINGLEcircS c) NOME(s) DO(s) AUTOR(es) no maacuteximo 6 (seis)em letras maiuacutesculas um apoacutes o outro centralizados e no rodapeacuteda primeira paacutegina deveratildeo vir a formaccedilatildeo acadecircmica e aInstituiccedilatildeo onde trabalham d) RESUMO (de acordo comNBR6028 da ABNT) O resumo natildeo deve ultrapassar a 250(duzentos e cinquumlenta) palavras e natildeo possuir paraacutegrafos Apoacuteso Resumo devem-se incluir TERMOS PARA INDEXACcedilAtildeO(palavraschave) diferentes daqueles constantes do tiacutetulo eseparados por viacutergula Os termos para indexaccedilatildeo devem estardescritos na forma maiuacutescula e minuacutescula serem expressotildees queidentifiquem o conteuacutedo do artigo ser indicadas entre 3 e 5 e sepossiacutevel extraiacutedas do vocabulaacuterio Thesagro ndash Thesaurus AgriacutecolaNacional desenvolvido pela CENAGRI (indicaccedilatildeo da revistaldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquopara evitar o usode vaacuterios sinocircnimos como termos de indexaccedilatildeo) Se natildeo foremencontrados descritores disponiacuteveis para cobrirem a temaacutetica doartigo poderatildeo ser indicados termos ou expressotildees de usoconhecido e) ABSTRACT incluindo em seguida INDEXTERMS f) INTRODUCcedilAtildeO (incluindo a revisatildeo de literatura)g) MATERIAL E MEacuteTODOS h) RESULTADOS EDISCUSSAtildeO (podendo conter tabelas e figuras) i)CONCLUSOtildeES e j) REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
5 A comunicaccedilatildeo deveraacute conter os seguintes toacutepicos a)TIacuteTULO suficientemente claro conciso e completo evitandopalavras supeacuterfluas Recomenda-se comeccedilar pelo termo querepresente o aspecto mais importante do trabalho com os demaistermos em ordem decrescente de importacircncia Deve serapresentada a versatildeo do tiacutetulo para o idioma inglecircs b) TIacuteTULOEM INGLEcircS c) NOME(s) DO(s) AUTOR(es) no maacuteximo 6(seis) em letras maiuacutesculas um apoacutes o outro centralizados e norodapeacute da primeira paacutegina deveratildeo vir a formaccedilatildeo acadecircmica e aInstituiccedilatildeo onde trabalham d) RESUMO (de acordo comNBR6028 da ABNT) O resumo natildeo deve ultrapassar a 250(duzentos cinquumlenta) palavras e natildeo possuir paraacutegrafos Apoacutes oResumo devem-se incluir TERMOS PARA INDEXACcedilAtildeO(palavras-chave) diferentes daqueles constantes do tiacutetulo eseparados por viacutergula Os termos para indexaccedilatildeo devem estardescritos na forma maiuacutescula e minuacutescula serem expressotildees queidentifiquem o conteuacutedo do artigo ser indicadas entre 3 e 5 e)ABSTRACT incluindo em seguida INDEX TERMS f)TEXTO [sem subdivisatildeo poreacutem com introduccedilatildeo material emeacutetodos resultados e discussatildeo e conclusatildeo subtendidos(podendo conter tabelas ou figuras)] e g) REFEREcircNCIASBIBLIOGRAacuteFICAS
6 AGRADECIMENTOS ao fim do texto e antes das ReferecircnciasBibliograacuteficas poderatildeo vir os agradecimentos a pessoas ouinstituiccedilotildees O estilo tambeacutem aqui deve ser soacutebrio e claroindicando as razotildees pelas quais se fazem os agradecimentos
7 TABELAS E QUADROS deveratildeo ser inseridos apoacutes citaccedilatildeodos mesmos dentro do proacuteprio texto
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS as referecircnciasbibliograacuteficas devem ser citadas conforme a NBR60232002 daABNTA exatidatildeo das referecircncias constantes da listagem e a corretacitaccedilatildeo no texto satildeo de responsabilidade do(s) autor(es) doartigo
Orientaccedilotildees gerais- Deve-se apresentar todos os autores do documento cientiacutefico(fonte)- O nome do perioacutedico deve ser descrito por extenso natildeo deveser abreviado- Em todas as referecircncias deve-se apresentar o local de publicaccedilatildeo(cidade) a ser descrito no lugar adequado para cada tipo dedocumento- As referecircncias devem ser ordenadas alfabeticamente
EXEMPLIFICACcedilAtildeO (TIPOS MAIS COMUNS)
ARTIGO DE PERIOacuteDICO
VIEIRA R F RESENDE M A V de Eacutepocas de plantio deervilha em Patos de Minas Uberaba e Janauacuteba Minas GeraisCiecircncia e Agrotecnologia Lavras v 24 n 1 p 74-80 janmar 2000
LIVRO
a) Livro no todo
STEEL R G D TORRIE J H Principles and procedures ofstatistics New York McGraw-Hill Book l960 481 p
b) Parte de livro com autoria especiacutefica
FLEURY J A Anaacutelise ao niacutevel de empresa dos impactos daautomaccedilatildeo sobre a organizaccedilatildeo da produccedilatildeo de trabalho InSOARES R M S M Gestatildeo da empresa Brasiacutelia IPEAIPLAN 1980 p 149-159
c) Parte de livro sem autoria especiacutefica
MARTIM L C T Nutriccedilatildeo de bovino de corte em confinamentoIn ______ Confinamento de bovino de corte 2 ed Satildeo PauloNobel 1986 cap 3 p 29-89
DISSERTACcedilAtildeO E TESE
GONCcedilALVES R A Preservaccedilatildeo da qualidade tecnoloacutegicade trigo (Triticum aestivum L) e controle de Rhyzoperthadominica (F) durante o armazenamento em atmosferacontrolada com Co2 e N2 1997 52 f Dissertaccedilatildeo (Mestradoem Ciecircncia dos Alimentos) ndash Universidade Federal de LavrasLavras 1997
MATIOLI G P Influecircncia do leite proveniente de vacasmastiacuteticas no rendimento de queijo frescal 2000 55 pDissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncias dos Alimentos) - UniversidadeFederal de Lavras Lavras 2000
Nota ldquoA folha eacute composta de duas paacuteginas anverso e versoAlguns trabalhos como teses e dissertaccedilotildees satildeo impressos apenasno anverso e neste caso indica-se frdquo (ABNT NBR60232002p 18)
TRABALHOS DE CONGRESSO E OUTROS EVENTOS
SILVA J N M Possibilidades de produccedilatildeo sustentada de madeiraem floresta densa de terra firme da Amazocircnia brasileira InCONGRESSO FLORESTAL BRASILEIRO 6 1990 Campos doJordatildeo Anais Campos do Jordatildeo SBSSBEF 1990 p 39-45
DOCUMENTOS ELETROcircNICOS
As obras consultadas online satildeo referenciadas conformenormas especiacuteficas para cada tipo de documento (monografia notodo e em parte trabalho apresentado em evento artigo deperioacutedico artigo de jornal etc) acrescidas de informaccedilotildees sobreo endereccedilo eletrocircnico apresentado entre braquetes (lt gt)precedido da expressatildeo ldquoDisponiacutevel emrdquo e da data de acessoao documento precedida da expressatildeo ldquoAcesso emrdquo
Nota ldquoNatildeo se recomenda referenciar material eletrocircnico de curtaduraccedilatildeo nas redesrdquo (ABNT NBR60232000 p 4) Segundopadrotildees internacionais a divisatildeo de endereccedilo eletrocircnico no fimda linha deve ocorrer sempre apoacutes barra ()
Monografia (acesso online)
a) Livro no todo
TAKAHASHI T (Coord) Tecnologia em foco BrasiacuteliaSocinfoMCT 2000 90 p Disponiacutevel em lthttpwwwsocinfoorgbrgt Acesso em 22 ago 2000
b) parte de livro
TAKAHASHI T Mercado trabalho e oportunidades In ______Sociedade da informaccedilatildeo no Brasil livro verde BrasiacuteliaSocinfoMCT 2000 cap 2 p 13-24 Disponiacutevel em lthttpwwwsocinfogovbrgt Acesso em 22 ago 2000
c) Parte de congresso seminaacuterio etc
GIESBRECHT H O Avaliaccedilatildeo de desempenho de institutos depesquisa tecnoloacutegica a experiecircncia de projeto excelecircncia napesquisa tecnoloacutegica In CONGRESSO ABIPTI 2000Fortaleza Gestatildeo de institutos de pesquisa tecnoloacutegicaFortaleza Nutec 2000 Disponiacutevel em lthttpwwwabiptiorgbrgt Acesso em 01 dez 2000
d) Tese
SILVA E M Arbitrariedade do signo a liacutengua brasileira desinais (LIBRAS) 1997 144 p Dissertaccedilatildeo (Mestrado emLinguumliacutestica Aplicada e Estudo de Liacutengua) - Pontifiacutecia UniversidadeCatoacutelica de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 1997 Disponiacutevel em lthttpwwwterracombrvirtualbooks freebookportdid teseshtmgtAcesso em 28 nov 2000
Artigo de perioacutedico (acesso online)
RESENDE A M G Hipertexto tramas e trilhas de um conceitocontemporacircneo Informaccedilatildeo e Sociedade Recife v 10 n 12000 Seccedilatildeo Educaccedilatildeo Disponiacutevel em lthttpwwwinformaccedilatildeoesociedadeufpbbrgt Acesso em 30 nov 2000
CITACcedilAtildeO PELO SISTEMA ALFABEacuteTICO (AUTOR-DATA)(conforme ABNT NBR105202002)Dois autores - Steel amp Torrie (1960) ou (STEEL amp TORRIE1960)Trecircs ou mais autores - Valle et al (l945) ou (VALLE et al 1945)Obs Quando forem citados dois autores de uma mesma obradeve-se separaacute-los pelo sinal amp (comercial)
9 CASO O ARTIGO CONTENHA FOTOGRAFIASGRAacuteFICOS FIGURAS SIacuteMBOLOS E FOacuteRMULASESSAS DEVERAtildeO OBEDECER AgraveS SEGUINTESNORMAS
91 Fotografias deveratildeo ser apresentadas em preto e branconiacutetidas e com contraste inseridas no texto apoacutes a citaccedilatildeo dasmesmas e tambeacutem em um arquivo agrave parte salvas em extensatildeoldquoTIFFrdquo ou ldquoJPEGrdquo com resoluccedilatildeo de 300 dpi
92 Figuras deveratildeo ser apresentadas em preto e branco niacutetidase com contraste inseridas no texto apoacutes a citaccedilatildeo das mesmas etambeacutem em um arquivo agrave parte salvas em extensatildeo ldquoTIFFrdquo ouldquoJPEGrdquo com resoluccedilatildeo de 300 dpi As figuras deveratildeo serelaboradas com letra Times New Roman tamanho 10 semnegrito sem caixa de textos e agrupadas
93 Graacuteficos deveratildeo ser inseridos apoacutes citaccedilatildeo dos mesmosdentro do proacuteprio texto elaborado preferencialmente em Excelcom letra Times New Roman tamanho 10 sem negrito
94 Siacutembolos e Foacutermulas Quiacutemicas deveratildeo ser feitas emprocessador que possibilite a formataccedilatildeo para o programa PageMaker (ex MathType Equation) sem perda de suas formasoriginais
10 O Editor Chefe notificaraacute o autor do recebimento do originale posteriormente o informaraacute sobre sua publicaccedilatildeo Os artigosque necessitarem de modificaccedilotildees seratildeo devolvidos ao autor paraa devida revisatildeo
11 Os artigos natildeo aprovados seratildeo devolvidos
12 Os artigos seratildeo publicados em ordem de aprovaccedilatildeo
13 O natildeo-cumprimento dessas normas implicaraacute na devoluccedilatildeodo artigo ao autor
14 Os casos omissos seratildeo resolvidos pela Comissatildeo Editorial
15 O artigo deveraacute ser enviado para
ABCTPPlant Cell Culture amp MicropropagationUniversidade Federal de LavrasDepartamento de Biologia - Setor de Fisiologia VegetalCaixa Postal 3037Lavras ndash MGCEP 37200-000E-mail abctpuflabr
INSTRUCTIONS FOR AUTHORS
1 Concepts and affirmations included in articles andcommunications are of the entire responsibility of the authors
2 ldquoPlant Cell Culture amp Micropropagationrdquo a semestral journaledited by Editora UFLA of the Universidade Federal de Lavraspublishes scientific articles and communications in the area ofplant tissue culture elaborated by researchers of the national andinternational scientific community There are no page charges forpublication Submission of a manuscript implies that it is neitherunder consideration for publication elsewhere nor has appearedpreviously in part or in whole On acceptance for publicationauthors assign to the Editors full copyright of the manuscript inall languages and countries Publications will depend on editorialrules and on the review of experts and ad hoc commissionReviewer and editorial opinions will be anonymouslycommunicated to authors
3 The articles and communication submitted for publicationmust be presented in CD using the program Microsoft Wordfor Windows (version 98 2000 XP or 2003) written inPortuguese English or Spanish using only conventionalnomenclature At the time of submission authors are requiredto submit together with the CD 4 (four) hard copies one originaland three copies without the name(s) of the author(s) as well asthe footnote on the first page (to be used by the reviewers)printed on A4 white paper (21 cm x 297cm) or on continuousform typewritten only on one side double spaced using fontTimes New Roman size 12 with a 3 cm margin on the left handside and 20 cm margin on the right hand side 25 cm upper andlower margin 25 cm for the heading and 25 cm for the footnoteThe manuscript must present a maximum of 14 pages At thetime of submission a cover letter must be sent with themanuscript copies to the Editor requesting publication of thearticle This cover letter must be signed by all authors andalso contain the full address telephone number and e-mail ofthe authors Any inclusion exclusion or alteration in the authorsorder must be notified and signed by all authors including theone excluded
4 Each manuscript must be organized in a) TITLE sufficientlyclear conspicuous and complete without superfluous words Itis recommended to initiate with the term that represent the mostimportant aspect with other terms in decreasing of importanceb) TITLE in Portuguese c) FULL NAME(s) OF THEAUTHOR(s) maximum of 6 (six) in capital letters one after theother in the center of the page with the footnote of the first pagecontaining their professional qualification or academic training
and their work institution d) ABSTRACT written continuouslywithout paragraph It must not exceed 250 words Index termsmust be enclosed after the abstract using terms different fromthose used in the title and separated by comma The index terms(3 to 5) must be described in capital and small letters and expressthe content of the article e) ABSTRACT and INDEX TERMSin Portuguese f) INTRODUCTION (including literaturereview) g) MATERIAL AND METHODS h) RESULTS ANDDISCUSSION (it may include tables and figures) i)CONCLUSIONS and j) REFERENCES
5 Communication must have the following topics a) TITLEsufficiently clear conspicuous and complete without superfluouswords It is recommended to initiate with the term that representthe most important aspect with other terms in decreasing ofimportance The PORTUGUESE version of the title has to bepresented b) TITLE in Portuguese c) FULL NAME(s) OFTHE AUTHOR(s) maximum of 6 (six) in capital letters oneafter the other in the center of the page with the footnote of thefirst page containing their professional qualification or academictraining and their work institution d) ABSTRACT writtencontinuously without paragraph It must not exceed 250 wordsIndex terms must be enclosed after the abstract using termsdifferent from those used in the title and separated by commaThe index terms (3 to 5) must be described in capital and smallletters and express the content of the article e) ABSTRACTand INDEX TERMS in Portuguese f) TEXT (with no divisionbut must include introduction material and methods results anddiscussion and conclusion (it may include tables and figures) andg)REFERENCES
6 ACKNOWLEDGEMENTS Acknowledgements to peopleor institutions might be included at the end of the text priorReferences The written style must be serious and clear indicatingthe reasons of the acknowledgements made
7 TABLES AND FIGURES must be included right after theircitation in the text
8 REFERENCES references must be cited according toNBR60232002 of ABNT All references and their correct citationin the text are of the entire responsibility of the author(s)- Some important orientations all authors of the scientificdocument must be presented (source) the journal must be citedusing its full name all references must present the name of thecity where the journal was published all references must be citedalphabetically
9 PHOTOGRAPHS GRAPHS FIGURES SYMBOLS ORFORMULA CONTAINED IN THE ARTICLE SHOULDOBEY THE FOLLOWING RULES
91 Photographs must be presented in black and whiteclear and with contrast inserted in the text after their citationand also in a separate file (on the same diskette as the article)saved in extension ldquoTIFFrdquo or ldquoJPEGrdquo with resolution of300 dpi
92 Figures must be presented in black and white clear andwith contrast inserted in the text after their citation and also in aseparate file (on the same diskette as the article) saved inextension ldquoTIFFrdquo or ldquoJPEGrdquo with resolution of 300 dpiThey must be elaborated using Times New Roman font size10 without bold without text box and arranged
93 Graphs must be inserted in the text after their citationelaborated preferentially in Excel using Times New Romanfont size 10 without bold
94 Symbols and Chemical Formula must be presented usinga word processor that permits a format for Page Maker (exMathType Equation) without loss of its original form
10 The Brazilian Association of Plant Tissue Culture (ABCTP)will inform the author the receipt of the original manuscript andeventually it will also send information regarding its publicationManuscripts that require modifications will be returned to theauthor for the respective revision andcorrections
11 Manuscripts not approved will be returned to the author
12 Articles will be published according to the order of receiptand approval
13 If any of these rules are not attended the manuscript will bereturned to the author
14 Manuscripts should be sent to the following address
ABCTPPlant Cell Culture amp MicropropagationUniversidade Federal de LavrasDepartamento de Biologia - Setor de Fisiologia VegetalCaixa Postal 3037Lavras ndash MGCEP 37200-000BrazilE-mail abctpuflabr