PIPETAS AUTOMÁTICAS

Las pipetas son dispositivos que se caracterizan por

carecer de depósito y que se utilizan para medir o transvasar

pequeños volúmenes de líquido de un recipiente a otro con gran

exactitud. Inicialmente se fabricaron en vidrio pero hoy en día

existen una gran variedad de opciones. Podríamos hacer una

primera división en pipetas de volumen fijo y pipetas de volumen

variable. Las de volumen fijo son más precisas que las de

volumen variable, aunque cuando en un análisis se usa una de

volumen variable habiendo ajustado el volumen requerido y sin

variarlo más, su precisión es comparable a la de una pipeta de

vidrio graduada de clase A.

También podríamos dividirlas en pipetas manuales y

electrónicas, aunque estas últimas son mucho menos abundantes

debido fundamentalmente a su precio mucho más elevado, por lo

que nos centraremos en las manuales. A su vez también

podríamos distinguir entre pipetas monocanal y multicanal.

La pipeta mecánica o de pistón funciona generalmente

transmitiendo la fuerza que un operador, de forma manual, ejerce

sobre un émbolo que se encuentra unido a un pistón mediante un

eje que lo desplaza a lo largo de un cilindro de longitud fija,

forzando un volumen predefinido de líquido fuera de la pipeta.

Las pipetas a pistón son en general de dos tipos como

hemos visto antes: las de volumen fijo, que dispensan un volumen

predeterminado de líquido, el cual es conocido como volumen

nominal (Vn) y las de volumen variable que permiten ajustar el

volumen dispensado dentro de un rango determinado en las

especificaciones de la pipeta. La variación en el volumen se logra

modificando la longitud de la carrera del pistón dentro del émbolo

mediante un micrómetro. En estas de volumen variable el

volumen nominal es el límite superior del rango de volumen de la

pipeta, de acuerdo con las especificaciones dadas por el

fabricante.

Cada uno de los tipos mencionados se pueden

subdividir en dos subtipos: A y B. Las pipetas del subtipo A se

denominan pipetas de desplazamiento por aire o neumáticas,

debido a que existe un volumen de aire entre la cabeza del pistón

y el líquido en el cilindro (este es el tipo más corriente). A las

pipetas del subtipo B se les denomina pipetas de desplazamiento

positivo o de desplazamiento directo porque el pistón se

encuentra en contacto directo con el líquido.

Las pipetas de desplazamiento directo se recomiendan

para líquidos con alta densidad, alta viscosidad o alta presión de

vapor. Presentan el inconveniente de que las puntas a utilizar son

mucho más caras puesto que cada punta lleva su pistón

incorporado (a la manera de una jeringuilla). Es por esta

característica que también evitan contaminaciones cruzadas

provenientes de la pipeta o de aerosoles y muestras. Las pipetas

neumáticas usan puntas mucho más baratas pero no son tan

exactas como las de desplazamiento positivo cuando se trabaja

con volúmenes muy pequeños de líquido debido a la

compresibilidad del aire.

Todas las pipetas de pistón disponen de puntas

desechables para minimizar los riesgos de contaminación. Para

facilitar el uso del tipo de punta adecuado los fabricantes han

adoptado un código de color según el volumen a dispensar y que

en las de uso más general coincide con el color de las puntas

utilizadas.

Instrucciones para el manejo de una pipeta automática

Ajustar el volumen girando la rueda hasta que en la

escala aparezca el volumen deseado.

Colocar una punta de plástico (adecuada) en la punta de la

pipeta haciendo una leve presión para lograr un buen ajuste.

1. Oprimir el botón pulsador con el dedo pulgar,

hasta el primer tope y sin soltarlo introducir

verticalmente la pipeta, hasta que la punta se

sumerja de 2 a 5 mm dentro del líquido.

2. Liberar lentamente la presión sobre el botón.

Después de 2–3 segundos retirar, siempre

verticalmente, la pipeta del líquido deslizando la

punta contra la pared del recipiente.

3. Apoyando la punta contra la pared del recipiente

donde se quiere colocar el líquido, presionar

lentamente el botón pulsador hasta el primer

tope. Después de un segundo, y sin soltar el

botón pulsador, terminar de vaciar la pipeta

presionando hasta el segundo tope.

4. Retirar la pipeta deslizando la punta contra la

pared del recipiente.

RECOMENDACIONES GENERALES AL PIPETEAR

El empleo de una buena técnica al utilizar las pipetas puede

incrementar la exactitud hasta en un 5 %. Hay tanto aspectos

instrumentales y de condiciones ambientales como de técnica de

manejo de la pipeta.

EN LA TÉCNICA EMPLEADA

+ PROFUNDIDAD DE INMERSIÓN DE LA PUNTA

La profundidad de inmersión de la punta es especialmente

importante en el uso de volúmenes pequeños. Si la punta se

sumerge demasiado, se aspirará más líquido debido al aumento de

la presión. Si por el contrario, la punta no se sumerge lo

suficiente, se puede cargar aire con las consiguientes burbujas y

volumen inadecuado. Sumergir la punta a una profundidad

adecuada puede mejorar la precisión hasta un 5%.

+ UNIFORMIDAD AL PIPETEAR

Es fundamental mantener un ritmo, velocidad y técnica

adecuada al mover el émbolo. Una aspiración demasiado rápida e

incontrolada puede llevar a la formación de aerosoles,

salpicaduras y posible contaminación del eje y del pistón,

pudiéndose producir incluso pérdida de volumen de la muestra.

Una velocidad de pipeteo uniforme puede mejorar la precisión

también hasta un 5%.

+ ANGULO DE INMERSION VERTICAL

Se ha de procurar mantener el ángulo de inmersión de la

pipeta lo más cercano a la vertical posible. De otra forma, la

columna vertical de líquido será más pequeña y se aspirará

demasiada muestra. Por el contrario, al dispensar el líquido, la

punta se ha de mantener en un ligero ángulo frente a la pared del

vaso para asegurar un correcto vaciado. Se estima que pipetear de

forma vertical o como máximo dentro de un ángulo menor de 20º

de ésta, puede mejorar la precisión hasta en un 2,5%.

+ TÉCNICA DE DISPENSACIÓN

Para la mayoría de aplicaciones se recomienda dispensar

con el extremo de la punta apoyado contra la pared del recipiente.

Así se reduce o elimina el hecho de que se quede algo de muestra

en el interior de la punta después de acabar la dispensación.

Retirad la pipeta deslizando el extremo de la punta hacia arriba

por la pared lateral para liberar cualquier gotícula restante en el

orificio de la punta. Esta técnica puede mejorar la precisión hasta

en un 1%.

Otra técnica consiste en dosificar directamente en la

superficie del líquido. Es crucial usar una punta de pared fina para

que no quede ninguna gotícula en el interior de la punta. Si se

dispensa directamente dentro del líquido tendremos que sacar la

pipeta manteniéndola en el segundo tope para evitar una toma de

muestra después de la dispensación.

+ ENJUAGE PREVIO DE PUNTAS

Se recomienda enjuagar previamente las puntas como

mínimo dos veces con el líquido a pipetear para compensar la

película de líquido en el interior de la punta. El enjuage previo

también tiene otras ventajas: ayuda a neutralizar los efectos de

capilaridad e iguala la temperatura y humedad del aire del interior

de la pipeta con la temperatura y humedad de la muestra.

Todo esto puede suponer una mejora de hasta el 0,2% de la

precisión.(No es necesaria en pipetas a pistón de desplazamiento

positivo).

OTROS FACTORES QUE TAMBIÉN AFECTAN A LOS

RESULTADOS DEL PIPETEO

+ TRABAJAR SIN CAMBIOS BRUSCOS DE

TEMPERATURA

Procurad pipetear a una temperatura constante. La

temperatura óptima sería: que como veremos después

sería también adecuada para calibrarlas. Debemos evitar

repentinos o grandes cambios de temperatura ya que el aire del

interior de la pipeta no se puede adaptar rápidamente y esto puede

afectar al volumen. Pipetear a una temperatura constante puede

mejorar la precisión hasta en un 5%. Es por este motivo que

cuando pipeteamos durante un largo rato nuestra mano puede

calentar el aire del interior de la pipeta, expandiéndose y pudiendo

reducir la precisión hasta en un 1%. Es por esta razón que se

recomienda no sostener continuamente la pipeta en las manos y

entre ciclos, dejarla en su soporte o en la mesa.

+UTILIZACIÓN DE UNA PIPETA ADECUADA PARA EL

VOLUMEN QUE SE ASPIRA

La aspiración al 50% del volumen nominal de las puntas

consigue mejores resultados. Se recomienda trabajar entre el 35%

y el 100% del volumen máximo de la pipeta. Seguir este consejo

puede hacernos mejorar los resultados hasta en un 1%.

Cometemos mucho mayor error trabajando por debajo del 10%

del volumen nominal de la pipeta que estamos utilizando.

+ AJUSTE CORRECTO DEL MICROMETRO PARA EVITAR

LOS EFECTOS DEBIDOS A LA HOLGURA MECANICA

Cuando cambiemos el volumen de uno superior a otro

inferior simplemente hay que girar la rueda del micrómetro hacia

abajo hasta el volumen deseado. Por el contrario, cuando

incrementamos el volumen a pipetear, hay que subir la rueda

ligeramente por encima del volumen deseado para luego bajarla

hasta el deseado. Esto evitará el juego mecánico de las piezas y

contribuirá a una mejora del 0,5% en la precisión.

+ FACTORES ERGONÓMICOS

Para todos aquellos que pipeteen de forma repetitiva la

mayor parte de la jornada se recomienda usar pipetas

especialmente suaves de accionamiento porque es fundamental

que las manos estén lo más descansadas posibles. Normalmente

cada fabricante importante tiene en su gama algún modelo de este

tipo.

PARTE PRÁCTICA.

Nos centraremos en los dos tipos más comunes de

pipetas que podemos encontrar en los laboratorios, que son

pipetas tipo Gilson o tipo Eppendorf. Cada tipo tiene sus

particularidades, pero el procedimiento de calibración es el mismo

para ambas.

Partes especificadas:

A.- Botón de control

B.- Tuerca de conexión

C.- Junta de teflón

D.- Anillo de goma (O-ring)

E.- Caña

F.- Expulsor de la punta

Como diferencia fundamental las de tipo Gilson tienen el

pistón de acero inoxidable, una junta de teflón (C) y un anillo de

goma (D) que son los que garantizan el sello hermético. En las de

tipo Eppendorf, el émbolo es de un polímero orgánico (Fortron)

altamente resistente al calor, ácidos y bases, envejecimiento y

abrasión, y no lleva ni junta de teflón ni anillo de goma. Es una

ligera capa de silicona de vacío alrededor del émbolo la que

asegura la estanqueidad en este caso.

Para el caso en que pipeteemos ácidos es mejor usar una

de tipo Eppendorf puesto que sólo se nos deteriora con el tiempo

la capa de grasa. En una de tipo Gilson, acaba corroyéndose el

émbolo a pesar de acero (ver foto) con lo que tendremos que

sustituirlo para que la pipeta no gotee. Para evitar en lo posible

este efecto de los ácidos, Gilson ha sacado un kit de protección

anticorrosión para la P 1000 que consiste en una caña especial que

lleva acoplado un filtro antiácidos, siendo éste intercambiable (al

igual que el filtro de protección anti-salpicaduras de las P 5000).

Si no disponemos de este kit especial la casa recomienda una vez

después de haber usado la pipeta con líquidos ácidos o corrosivos

que emitan vapores, desmontar la caña y lavar el pistón, el anillo

de goma y la junta de teflón con agua destilada y una vez

completamente secas montar y comprobar funcionamiento.

Por calibración de pipetas se entiende la comparación entre

el volumen real y el volumen teórico. El volumen real se

determina por vía gravimétrica por lo que necesitaremos agua

destilada o desionizada y una balanza adecuada.

Para realizar la calibración de una pipeta seguiremos las

directrices dadas por la norma ISO 8655 (aparatos volumétricos

operados por pistón). Los premisas pricipales de dicha norma se

centran en 3 puntos fundamentales:

1º.- Condiciones ambientales

2º.- Utilizar una balanza adecuada

3º.-Minimizar el efecto de la evaporación en volúmenes inferiores

a 50 microlitros o tomar medidas adicionales para evitarla.

- CONDICIONES AMBIENTALES

Las calibraciones se deben realizar en una sala sin

corrientes de aire y con una temperatura comprendida entre 20ºC

y 25ºC sin variar más de Cº5,0 mientras dure el ensayo.

Asimismo se necesita una humedad relativa mayor del 50%. Con

anterioridad a la calibración se deberá dejar al menos 2 horas todo

el material a emplear para que alcance un equilibrio térmico con

la temperatura de la sala. Nunca deberá estar expuesto al sol

directamente. Necesitaremos disponer de un termómetro y

también un barómetro si calibramos pipetas de menos de 50 l y

debemos realizar ajustes por el efecto de la evaporación.

- UTILIZAR UNA BALANZA ADECUADA

Para el caso de calibraciones de pipetas de 10 l o

inferiores habrá de emplearse una balanza analítica de 5

decimales. Para pipetas de volúmenes más grandes es suficiente

utilizar una balanza de 4 decimales. Se aconseja el uso de vasos

de vidrio para minimizar los efectos de las cargas electrostáticas,

más importantes cuanto más pequeños son los volúmenes que

estamos midiendo.

- MINIMIZAR EL EFECTO DE LA EVAPORACIÓN

Para volúmenes pequeños (menores de 50 l ) podemos

usar algún recipiente específico de vidrio con tapa o situar un

vaso de precipitados pequeño con 10 ml de agua en el interior de

la balanza para inhibir la evaporación. Es más cómodo emplear el

recipiente especial porque nos simplificará los cálculos después.

Existen marcas que comercializan su propio juego de recipientes

para efectuar las calibraciones de sus distintos modelos.

PROCEDIMIENTO DE CALIBRACIÓN

Abriremos la pipeta para comprobar el estado de la junta

de teflón y el anillo de goma (Gilson). Si éstos presentan juego,

los sustituiremos. También verificaremos que la caña no esté

doblada y en buenas condiciones. En caso contrario, también la

cambiaremos.

Para el caso de las Eppendorf, retiraremos la grasa vieja

del pistón y procederemos a reengrasarlo ligeramente de nuevo

(es importante no poner demasiada).

Tras el enjuage previo de la punta al menos dos veces con

agua destilada, haremos un chequeo rápido con 3 medidas del

volumen nominal que nos darán una primera aproximación del

volumen que dispensa la pipeta. Si éste se desvía bastante del

esperado, procederemos al ajuste del micrómetro con la

herramienta adecuada para cada pipeta (en el caso de Eppendorf

se nos suministra al comprarla pero en Gilson tenemos que

adquirirla) y volveremos a hacer otra tanda de 3 medidas hasta

que éstas ya sean más cercanas a lo esperado. Posteriormente y

después del cambio de punta y enjuages previos de ésta al menos

dos veces, realizaremos ya la calibración propiamente dicha con

tandas de 10 medidas (4 mediciones sería el número mínimo

necesario para calcular la exactitud y precisión de una pipeta) de

las siguientes series de volúmenes:

+ volumen nominal (máximo admitido por la pipeta)

+ volumen inferior (mínimo o 10% del nominal – según

especificaciones del fabricante)

+ volumen medio (del 50% del valor nominal)

Para cada serie de valores obtenidos pasaremos a

calcular el error sistemático que nos dará la Exactitud

(proximidad de la medida a su valor real) y el error aleatorio,

que nos expresará la Precisión (grado de reproducibilidad de las

medidas) de la pipeta.

Exactitud

Es posible tener datos muy consistentes aunque estén

consistentemente equivocados. La inexactitud es la diferencia

numérica entre el valor medio de una serie de medidas y el valor

real. Una elevada exactitud (o pequeña inexactitud) significaría

que existiera poquísima diferencia entre el valor medio y el real.

La exactitud se consigue con una cuidadosa calibración de un

instrumento preciso.

Precisión

La precisión consistiría en la existencia de un buen

grado de reproducibilidad de las medidas realizadas. La precisión

no tiene un valor numérico, se cuantifica por la imprecisión. Así

una alta precisión (o pequeña imprecisión) significaría que

existiese muy poca variación entre medidas repetidas de la misma

muestra. Para conseguir un instrumento preciso se necesita una

buena técnica de manejo.

Exacto Preciso Exacto Impreciso

Preciso Inexacto Impreciso Inexacto

- Cálculo del Error Sistemático ( Exactitud )

Para el caso en que trabajemos con volúmenes inferiores a

50 l deberemos tener en cuenta los efectos de la evaporación

sustituyendo en las anteriores fórmulas Xi por: Xi . Z , donde Z es

un factor de corrección dependiente de la temperatura y la presión

y cuyos valores podemos obtener de la tabla de la siguiente

página ( Equivalencia: 1000 mbar = 100 kPa ).

Para poder comparar adecuadamente con los datos

facilitados por el fabricante debemos expresar los valores

obtenidos en la balanza en microlitros.

- Cálculo del Error Aleatorio ( Precisión )

Comparando los datos obtenidos con los errores

tolerados para las pipetas ensayadas podemos saber si nuestras

pipetas se encuentran dentro de las tolerancias especificadas por

el fabricante en cuanto a Exactitud y Precisión y por tanto siguen

siendo perfectamente utilizables . Lo más conveniente es llevar

una anotación de las calibraciones efectuadas y ponerle algún

adhesivo pequeño a la pipeta que nos indique la fecha de su

última revisión o calibración.

Podemos ajustar una pipeta para un líquido diferente al

agua pero en este caso deja de ser una pipeta de volumen variable

y pasa a ser una de volumen fijo empleado en la calibración y

solamente válida para ese líquido, por lo que si se realiza, hay que

marcar la pipeta convenientemente para que luego no existan

confusiones. Este procedimiento no es válido para líquidos con

presión de vapor elevada por lo que en estos casos, como se ha

indicado previamente, es aconsejable el empleo de una pipeta de

desplazamiento positivo o directo. De todas formas, cuando esto

no sea posible y para minimizar todo lo posible el error cometido

si usamos una pipeta neumática, se recomienda saturar la cámara

de aire de la pipeta aspirando y dispensando repetidamente el

solvente antes de aspirar la muestra y luego operando rápidamente

porque aunque nuestra pipeta habitualmente no gotee con

soluciones acuosas sí que es muy fácil que lo haga si trabajamos

con un líquido de menor densidad que ésta.

Actualmente lo más avanzado en el tema de las

calibraciones es el sistema de identificación por radiofrecuencia

que ha sacado Rainin en que la pipeta lleva un chip con el que se

puede seguir toda la vida de cada pipeta como nº de serie, fecha

de calibración, usuario al que pertenece, para qué se utiliza o

cualquier dato que queramos incluir.

Existen varios fabricantes de balanzas que ofrecen en

sus gamas de balanzas analíticas alguna especialmente adaptada

para la calibración de micropipetas como es el caso de la

mostrada a continuación que sirve para pipetas de hasta 1 µl (tara:

22g, resolución 1 µg), tiene apertura motorizada mediante célula

fotoeléctrica y presenta colector de evaporación integrado y

recipiente para residuos de 10 ml de capacidad para pipetear de

forma rápida y sin interrupciones.