piotr walczak plazmidy bakterii mlekowych

Plazmidy bakterii mlekowych

Piotr Walczak

Wydzia³ Biotechnologii i Nauk o ¯ywnoœci, Instytut Technologii Fer-mentacji i Mikrobiologii, Politechnika £ódzka, £ódŸ

Plasmids of lactic acid bacteria

S u m m a r y

The role and significance of natural plasmids existing in lactic acid bacteria(LAB) from genus Lactococcus, Lactobacillus and Leuconostoc in their metabolic di-versity and industrially important properties have been described. Molecular or-ganization of plasmids, their mechanisms of replication and metabolic activitywere discussed in detail with particular stress put on their common featuressuch as structure similarity, segregational and structural stability, biochemicaltraits and the presence of insertion sequences. The role of plasmid borne IS ele-ments on plasmid stability and adaptative properties of LAB were also dis-cussed.

Key words:

lactic acid bacteria, plasmids, RCR, theta.

1. Wstêp

U wielu szczepów bakterii mlekowych, zarówno z rodzajuLactobacillus jak i Lactococcus oraz Leuconostoc, spotyka siê czêstood kilku do kilkunastu plazmidów, których wielkoœæ waha siêw granicach od 2 do 120 tpz. Ma³e plazmidy 2-5 tpz s¹ zazwy-czaj kryptyczne i trudno okreœliæ ich funkcjê w komórkach, nato-miast du¿e zawieraj¹ geny koduj¹ce metabolizm laktozy (1-5),aktywnoœæ proteinazow¹ (6-9), produkcjê bakteriocyn (10-18),opornoœæ na bakteriocyny (19), opornoœæ na antybiotyki i solemetali ciê¿kich (20-22), geny metabolizmu cytrynianu (23,24),syntezê zewn¹trzkomórkowych polisacharydów (25), opornoœæna bakteriofagi (26-30) oraz wiele innych aktywnoœci bioche-micznych. Ze wzglêdu na przemys³owe znaczenie tych bakterii,

P R A C E P R Z E G L ¥ D O W E

Adres do korespondencji

Piotr Walczak,Wydzia³ Biotechnologiii Nauk o ¯ywnoœci,Instytut TechnologiiFermentacjii Mikrobiologii,Politechnika £ódzka,ul Wólczañska 171/173,90-530 £ódŸ;e-mail:[email protected]

3 (70) 118–143 2005

zw³aszcza w przetwórstwie mleka, badanie plazmidów koduj¹cych technologiczniewa¿ne cechy metaboliczne takie, jak asymilacja laktozy i metabolizm cytrynianu,staj¹ siê intensywnie rozwijan¹ dziedzin¹ genetyki i biotechnologii. Nie bez znacze-nia jest fakt, ¿e bakterie mlekowe s¹ uwa¿ane jako genetycznie bezpieczne dlacz³owieka i to sprawia, ¿e podejmowane s¹ próby ich u¿ycia do biosyntezy hetero-logicznych bia³ek, wykorzystywanych jako dodatki do ¿ywnoœci. Dzia³alnoœæ ta wi¹-¿e siê w pierwszym etapie z otrzymaniem wektorów dopuszczonych do stosowaniaw ¿ywnoœci (food grade vectors), których ca³y materia³ genetyczny pochodzi z bakteriimlekowych i nie zawiera genów opornoœci na antybiotyki stosowane w lecznictwiei weterynarii. Posiadanie takiego wektora pozwala na konstruowanie plazmidów za-wieraj¹cych technologicznie wa¿ne geny i ich wprowadzanie do przemys³owychszczepów bakterii mlekowych w celu ulepszania i stabilizacji ich cech produkcyj-nych oraz wytwarzania nowych nie znanych dot¹d produktów. Podejmowane s¹próby konstruowania wektorów, zawieraj¹cych geny amylazowe lub celulazowe,zdolnych do replikacji u Lactobacillus plantarum po to, aby wykorzystaæ tak przygoto-wany szczep jako starter do inokulacji kiszonki roœlinnej, np. z trawy, w celu polep-szenia jej jakoœci i ochrony przed rozwojem niepo¿¹danej mikroflory (31).

2. Charakterystyka plazmidów bakterii mlekowych

Wiele funkcji metabolicznych komórek bakterii mlekowych uzale¿nione jest odobecnoœci plazmidów. Plazmidy bakterii mlekowych cechuj¹ siê niezwyk³¹ pow-szechnoœci¹ i biologicznym zró¿nicowaniem. Mog¹ wystêpowaæ w komórce w ró¿-nej liczbie kopii charakterystycznej dla danego plazmidu i szczepu bakterii. W ko-mórkach bakterii z rodzaju Lactococcus liczba plazmidów mo¿e wahaæ siê zale¿nieod szczepu od 2 do 11, najczêœciej spotyka siê od 4 do 7, o wielkoœci od oko³o2 × 103 par zasad do ponad 1,0 × 105 par zasad. Funkcja plazmidów w komórce za-le¿y od rodzaju genu lub genów jakie zawiera plazmid oraz w mniejszym stopniu,od liczby jego kopii. Nie tylko wielkoœæ ró¿nicuje plazmidy bakterii mlekowych, alerównie¿ sposób replikacji. W plazmidach mo¿e byæ zakodowane oko³o 10% informa-cji genetycznej komórki.

Geny plazmidowe odpowiedzialne s¹ za:– fermentacjê laktozy,– biosyntezê i aktywacjê proteaz oraz peptydaz,– fermentacjê cytrynianu i produkcjê diacetylu,– produkcjê bakteriocyn, np. laktokokcyn A, B, M, laktycyny 3147,– opornoœæ na jony metali ciê¿kich, np. kadmu,– mechanizmy opornoœci na bakteriofagi,– system restrykcji/modyfikacji,– produkcjê zewn¹trzkomórkowych polisacharydów,– opornoœæ na antybiotyki i bakteriocyny.


BIOTECHNOLOGIA 3 (70) 118-143 2005 119

Plazmidy bakterii mlekowych mo¿na podzieliæ na dwie grupy w zale¿noœci odsposobu ich replikacji:

– plazmidy o ma³ych rozmiarach (<5 tpz), replikuj¹ce wg mechanizmu � lubinaczej RCR (Rolling Circle Replication),

– plazmidy o znacznych rozmiarach (>5 tpz) ulegaj¹ce replikacji � (Theta Repli-

cation).Oba typy plazmidów wystêpuj¹ bardzo czêsto równoczeœnie u tych samych

szczepów bakterii mlekowych, przy czym plazmidy sigma s¹ zazwyczaj kryptycznelub zawieraj¹ geny opornoœci na antybiotyki, a plazmidy theta koduj¹ ró¿ne wa¿nemetabolicznie funkcje komórek.

3. Charakterystyka plazmidów typu sigma

W minionym dwudziestoleciu izolowano liczne plazmidy z bakterii gramdodat-nich, które poddano szczegó³owym badaniom. Wiele z nich posiada wspólne cechyzw³aszcza homologiczne sekwencje bia³ek i DNA oraz wspólne funkcje. Charaktery-styczne dla replikacji RCR jest powstawanie jednoniciowego DNA jako produktuprzejœciowego, wykrywanego w lizatach komórkowych i stanowi¹cego kryteriumklasyfikacji do tej grupy. Nagromadzanie siê kolistego ss-DNA odpowiadaj¹cego jed-nej nici monomeru plazmidu zosta³o stwierdzone u wielu plazmidów bakterii z ro-dzajów Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus i Leuconostoc (32,33), jak równie¿u Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus i Streptomyces lividans (34-37). Mechanizm re-plikacji typu tocz¹cego siê ko³a, po raz pierwszy zaproponowano dla bakteriofagówE. coli (38) zawieraj¹cych ss-DNA posiadaj¹cych wiele cech wspólnych z niektórymiplazmidami, a szczególnie homologiê bia³ek replikacyjnych i organizacjê ORI (36).Minus origin replikacji (M-O), ró¿ny od plus origin replikacji, jest miejscem inicjacjikonwersji ss-DNA do ds-DNA. Interesuj¹cym faktem jest, ¿e wiele plazmidówss-DNA jest zdolnych do replikacji w komórkach dwu lub wiêcej gospodarzy(32,39-41), ale ich minus origin (M-O) funkcjonuje jedynie w komórkach organizmumacierzystego. Minus origin (M-O) typu palA plazmidów Staphylococcus pT181, pC194i pE194 oraz M-O plazmidu pLS1 bakterii Streptococcus s¹ nieaktywne u Bacillus subtilis,a M-O typu palA plazmidu pC194 jest nieaktywny u Streptococcus pneumoniae i E. coli

(32). Ze szczepu Staphylococcus aureus wyizolowano plazmid pUB110 i odkryto, ¿ejest zdolny do replikacji u bakterii Bacillus subtilis (38,41). Charakteryzuje siê ondu¿¹ liczb¹ kopii (oko³o 50 na komórkê) oraz stosunkowo wysok¹ stabilnoœci¹u Bacillus subtilis (42). Plazmidy pUB110 i pC194 odznaczaj¹ siê du¿¹ homologi¹ se-kwencji DNA w miejscu plus origin oraz bia³ek replikacyjnych Rep (36). Plus originreplikacji obu plazmidów funkcjonuje podobnie, lecz ich M-O s¹ ca³kowicie nie-zgodne, gdy¿ w przeciwieñstwie do innych plazmidów, minus origin pUB110 funk-cjonuje w komórkach Staphylococcus jak i Bacillus.

Piotr Walczak

120 PRACE PRZEGL¥DOWE

Plazmidy sigma sk³adaj¹ siê z trzech modu³ów strukturalnych:1. Gen rep, koduj¹cy bia³ko inicjatorowe i region DNA rozpoznawany przez

bia³ko Rep. Region ten zawiera miejsce startu replikacji nici prowadz¹cej (nazywanymiejscem startu „+”, lub Double Strand Origin – DSO).

2. Region DNA zawieraj¹cy palindromiczny uk³ad nukleotydów, który stanowimiejsce startu replikacji nici opóŸnionej (nazywany miejscem startu „-”, lub Single

Strand Origin – SSO).3. Jedna lub wiêcej otwartych ramek odczytu koduj¹cych ró¿ne bia³ka odpowie-

dzialne za opornoœæ na antybiotyki, procesy mobilizacji koniugacyjnej lub rekombi-nacji.

Replikacja RCR przebiega w kilku etapach:1. Replikacja rozpoczyna siê w momencie przeciêcia nici (+) w miejscu rozpo-

znawanym przez bia³ko inicjuj¹ce replikacjê (region DSO).2. Koniec 5’ nici (+) po³¹czony z bia³kiem inicjuj¹cym odwija siê, a koniec 3’ ule-

ga przed³u¿aniu dziêki aktywnoœci komórkowej polimerazy DNA (linia przerywanaod miejsca naciêcia). Powstaje intermediat przypominaj¹cy literê sigma.

3. Po ca³kowitej rundzie replikacji nici (-), bia³ko replikacyjne rozpoznaje se-kwencjê koñcow¹ plazmidu pokrywaj¹c¹ siê z sekwencj¹ pocz¹tkow¹ i ³¹czy obakoñce odwiniêtej nici (+), wytwarzaj¹c w ten sposób jednoniciowe DNA nici (+),(ss-DNA).

4. Synteza nici opóŸnionej (-) na matrycy kolistego jednoniciowego DNA nici (+).Inicjacja syntezy odbywa siê w miejscu SSO, rozpoznawanym przez odpowiedniebia³ka komórki gospodarza. Doprowadzaj¹ one do syntezy starterowego RNA, nie-zbêdnego do replikacji DNA. Powstaje forma ds-DNA plazmidowego drugiej cz¹s-teczki plazmidu, która koñczy kompletny cykl replikacyjny. Je¿eli niæ (+) nie jestprzekszta³cana do formy ds-DNA, to replikacja RCR nie jest wydajna poniewa¿ wy-twarzany jest tylko jeden plazmid ds-DNA oraz nastêpuje akumulacja ss-DNA.

5. Zaburzenia etapu 3 i 4 polegaj¹ na tym, ¿e nie ³¹cz¹ siê ze sob¹ koñce 5’ i 3’tej samej nici po dokonaniu pe³nego cyklu replikacji nici (-), mog¹ natomiast prowa-dziæ do powstawania multimerów plazmidów typu „g³owa do ogona” o wysokiejmasie cz¹steczkowej HMW (high-molecular-weight) (43).

Schemat mechanizmu replikacji plazmidów sigma przedstawiono na rysunku 1.Plazmidy replikuj¹ce wed³ug mechanizmu tocz¹cego siê ko³a, tj. pWV01, pWC1,

pCI411, pUB110, pC194, czy pT181, wytwarzj¹ multimery wielkocz¹steczkoweHMW. Tworzenie form HMW jest stymulowane obecnoœci¹ obcego DNA w obrêbieplazmidu. Inserty DNA z E. coli oraz przypadkowe fragmenty chromosomalnego DNAStaphylococcus aureus powoduj¹ powstanie form HMW. W przypadku plazmidu pKTH10,sk³adaj¹cego siê z plazmidu pUB110 z insercj¹ sekwencji nukleotydów koduj¹cych�-amylazê pochodz¹c¹ z genomu B. amyloliquefaciens, równie¿ obserwuje siê po-wstanie form HMW (44). Trawienie multimerów wielkocz¹steczkowych endonuklea-zami restrykcyjnymi prowadzi do powstania form liniowych plazmidu (ds-DNA).


BIOTECHNOLOGIA 3 (70) 118-143 2005 121

Przyjmuje siê, ¿e HMW sk³ada siê z tandemowych multimerów typu „g³owa do ogo-na”, które w nienaruszonych komórkach, najprawdopodobniej przybieraj¹ kszta³t li-tery sigma lub du¿ych kolistych konkatamerów. Oko³o 90% plazmidu mo¿e wystêpo-waæ w formie HMW. Formy HMW powstaj¹, wtedy gdy plazmid replikuje z wytwo-rzeniem ss-DNA (32,45).

4. Charakterystyka plazmidów typu theta

Drug¹ grupê stanowi¹ plazmidy o ma³ej liczbie kopii replikuj¹ce wed³ug jedno-lub dwukierunkowego mechanizmu � (theta). S¹ one bardzo stabilne, liczba ich ko-pii jest dok³adnie kontrolowana i wynosi od jednej do kilku na komórkê. Plazmidytego typu nadaj¹ siê do konstruowania stabilnych wektorów do klonowania genówu bakterii mlekowych. W odró¿nieniu od poprzednich, plazmidy typu � wykazuj¹

Piotr Walczak


Rys. 1. Schemat replikacji plazmidów wed³ug mechani-zmu „obracaj¹cego siê ko³a” (RCR). A, B – plazmidy potom-ne, DSO – double strand origin, SSO – single strand origin.Pozosta³e objaœnienia w tekœcie.

w¹skie spektrum gospodarzy i replikuj¹ jedynie w obrêbie tego samego rodzaju lubblisko spokrewnionych. Do tej grupy nale¿¹ np. pCI305 (46), pCI528 (47), pWVO2(48), pUCL22 (49) i pUCL287 (50).

W odró¿nieniu od replikacji RCR nie powstaje tu jednoniciowy DNA, a miejscastartu nici prowadz¹cej i opóŸnionej s¹ po³o¿one blisko siebie i nie stanowi¹ odrêb-nych modu³ów. Proces replikacji mo¿e przebiegaæ równoczeœnie na obu kowalencyj-nie zamkniêtych niciach DNA. Ci¹g³oœæ nici jest przerywana tylko podczas rozdzia³ukoñcowego produktu replikacji – dimeru w formie dwóch ogniw ³añcucha, dodwóch form monomerycznych. Replikacja theta mo¿e przebiegaæ jedno- lub dwu-kierunkowo. Plazmidy � cechuje ró¿norodnoœæ w wykorzystywaniu ró¿nych czynni-ków komórek gospodarza w procesie inicjacji replikacji. Na tej podstawie plazmidy� podzielono na trzy grupy:

1. Koduj¹ w³asne bia³ko inicjatorowe (Rep) i posiadaj¹ charakterystyczny odci-nek DNA stanowi¹cy region inicjacji replikacji. Replikacja tych plazmidów przypomi-na sposób replikacji chromosomu. Miejsce startu replikacji stanowi charakterystycz-ny uk³ad nukleotydów, tworz¹cy szereg bezpoœrednich powtórzeñ tzw. iteronóworaz jedno lub wiêcej uk³adów nukleotydów tworz¹cych tzw. „DnaA-box”. Inicjacjareplikacji wymaga odpowiedniej interakcji bia³ek Rep i DnaA z rozpoznawanymiprzez nie sekwencjami nukleotydowymi.

2. Nie koduj¹ bia³ka inicjatorowego, nie zawieraj¹ miejsca startu replikacji. Re-plikacja zapocz¹tkowana jest przez odpowiedni¹ obróbkê transkryptu syntetyzowa-nego przez polimerazê RNA gospodarza, który jest nastêpnie u¿yty jako starter re-plikacji DNA nici prowadz¹cej. Replikacjê rozpoczyna polimeraza I DNA, a nastêpniekontynuuje j¹ polimeraza III DNA.

3. Koduj¹ bia³ko inicjatorowe, ale nie zawieraj¹ miejsca startu replikacji. Wyma-gaj¹ do replikacji polimerazy I DNA (33,51).

Schemat mechanizmu replikacji plazmidów theta przedstawiono na rysunku 2.Dotychczas opisane w literaturze plazmidy theta bakterii mlekowych zaliczyæ nale¿ydo pierwszej grupy ze wzglêdu na wystêpowanie sekwencji DnaA-box i iteronów.


BIOTECHNOLOGIA 3 (70) 118-143 2005 123

Rys. 2. Schemat replikacji plazmidów wed³ug mechanizmu theta. 1, 2 – etapy replikacji, 3 – roz-dzia³ plazmidów potomnych.

5. Niestabilnoœæ strukturalna i segregacyjna plazmidów

Dla utrzymania siê plazmidów w bakteryjnych liniach komórkowych s¹ istotnedwa procesy:

a) wierna replikacja plazmidów zachodz¹ca przynajmniej raz w cyklu komórkowym,b) dok³adne rozdzielenie plazmidów miêdzy komórki potomne.W konkretnym gospodarzu i w okreœlonych warunkach wzrostu, ka¿dy plazmid

wystêpuje w specyficznej liczbie kopii na jedn¹ komórkê. Utrzymanie okreœlonejliczby kopii zale¿y przede wszystkim od systemu regulacji replikacji. Plazmidyutrzymywane w jednym egzemplarzu na komórkê s¹ dziedziczone równie stabilnie,jak plazmidy o wysokiej liczbie kopii, co œwiadczy o precyzji mechanizmu zwanegorozdzielaniem (partition). Komórki mog¹ traciæ plazmidy na skutek dzia³ania ró¿-nych czynników. Do przyczyn niestabilnoœci plazmidów zalicza siê:

– powstawanie jednoniciowego DNA podczas replikacji typu sigma,– nierównomierny rozdzia³ plazmidów do komórek potomnych podczas podzia-

³ów komórkowych (partition),– mutacje,– obecnoœæ sekwencji insercyjnych w strukturze plazmidów,– podwy¿szona temperatura (replikony wielu plazmidów s¹ temperaturowra¿li-

we, a wysoka temperatura zatrzymuje replikacjê).Plazmidy mo¿na podzieliæ na grupy niezgodnoœci (incompatibility). Grupa nie-

zgodnoœci sk³ada siê z plazmidów, które nie s¹ zdolne do wspólnego utrzymania siêw tej samej linii komórkowej. Plazmidy nale¿¹ce do tej samej grupy niezgodnoœci s¹zazwyczaj blisko spokrewnione i wykazuj¹ co najmniej czêœciow¹ homologiê DNA.W zjawisku niezgodnoœci plazmidowej najwa¿niejsz¹ rolê odgrywa regulacja repli-kacji. Je¿eli system kontroluj¹cy replikacjê rozpoznaje dwa plazmidy jako identycz-ne, plazmidy te s¹ niezgodne. W przypadku gdy plazmid wystêpuje w 1-2 kopiachna komórkê, mechanizm jest nastêpuj¹cy: po jednym cyklu replikacyjnym plazmidusystem regulacyjny uniemo¿liwia zapocz¹tkowanie nastêpnego cyklu, dopóki nienast¹pi podzia³ komórkowy. Dlatego te¿, ka¿da z komórek siostrzanych mo¿e dzie-dziczyæ tylko jeden z dwóch plazmidów nale¿¹cych do tej samej grupy niezgodno-œci. W tej sytuacji drugi plazmid zostaje bardzo szybko wyeliminowany z linii ko-mórkowej. Drugim systemem odgrywaj¹cym rolê w zjawisku niezgodnoœci jest sys-tem reguluj¹cy dok³adne rozdzielanie plazmidów do komórek potomnych. Gdy dwaplazmidy s¹ rozpoznawane przez ten system jako identyczne, wtedy tylko jedenz nich bêdzie dok³adnie rozdzielony pomiêdzy komórki siostrzane, a rozdzieleniemdrugiego bêdzie rz¹dzi³ przypadek. Koñcowym efektem w tym przypadku bêdzierównie¿ utrata jednego z plazmidów (52).

Cech¹ specyficzn¹ niektórych plazmidów jest ich zdolnoœæ do przenoszeniaw³asnej kopii z komórki gospodarza (dawcy) do komórki, która tego plazmidu niezawiera (biorca). W procesie tym konieczne jest wytworzenie pary koniugacyjnej.W tym celu w bakteriach gramdodatnich plazmidy koniugacyjne determinuj¹ synte-

Piotr Walczak


zê feromonów p³ciowych wywo³uj¹cych zlepianie siê komórek. Nastêpnie obserwu-je siê przeniesienie jednoniciowego DNA (ss-DNA) poprzez porê powstaj¹c¹ w wyni-ku lokalnej fuzji pow³ok obu komórek. Replikacja koniugacyjna zachodzi wed³ugmodelu obracaj¹cego siê ko³a (rolling-circle-replication – RCR) (53,54).

6. Molekularna organizacja plazmidów bakterii mlekowych

6.1. Plazmidy typu RCR

Poni¿ej przedstawiono przyk³ady organizacji strukturalnej plazmidów bakteriimlekowych replikuj¹cych wg mechanizmu RCR.

Jednym z najwczeœniej opisanych plazmidów RCR tych bakterii by³ ma³y plazmidpWV01 (2178 pz), nie koduj¹cy ¿adnych cech obserwowanych fenotypowo (55).

Na rysunku 3A przedstawiono jego organizacjê strukturaln¹. Plazmid zawieraw swojej budowie trzy otwarte ramki odczytu (orfB, orfC, orfD), promotor transkryp-cji (P) zawieraj¹cy regiony -35 i -10, � niezale¿ny terminator transkrypcji oraz regio-ny SSO i DSO.

Na rysunku 3B przedstawiono sekwencjê DNA poprzedzaj¹c¹ gen orfC (repA),która zawiera elementy strukturalno-regulacyjne. Odwrócone powtórzenia wystê-puj¹ce w pozycjach 12-45, 228-250, 301-319, 399-413 mog¹ tworzyæ struktury szpi-lek do w³osów spe³niaj¹ce rolê regulacyjn¹ w procesie replikacji plazmidu.


BIOTECHNOLOGIA 3 (70) 118-143 2005 125

B

1 CGATTTTTTAT TAAAACGTCTCA AAATCGTTTC TGAGACGTTTTA GCGTT

IRL1 IRP1

51 TATTTCGTTT AGTTATCGGC ATAATCGTTA AAACAGGCGT TATCGTAGCG

101 TAAAAGCCCTTG AGCGTAGC GTGGCTTTGC AGCGAAGATG TTGTCTGTTA

DR1

151 GATTATGAAA GCCGATGACT GAATGAAATA ATAAGCGCAG CGCCCTTCTA

201 TTTCGGTTGG AGGAGGCTCAAGGGAGT ATGAGGGAAT GAA ATTCCCTCAT

IRL2 IRP2

251 GGGTTTGATTTTA AAAATTGC TT GCAATTTT GCCGAGCGG TAGCGCTGGA

IRL3 IRP3

301 AAATTTTT GAA AAAAATTTGG AATTTGG AAAAAAATGGGG GGAAAGGAAG

IRL4 IRP4 DR2 start orfB

351 CGAATTTTGC TTCCGTACTA CGACCCCCCA TTAAGTGCCG AGTGCCAATT

401 TTTGTGCCAA AAACGCTCTA TCCCAACTGG CTCAAGGGTT TAAGGGGTTT

451 TTCAATCGCC AACGAAT CGCCAACGTTTT CGCCAACGTTTT TTATAAATC

DR3

501 TATATTTAAG TAGCTTTATT GTTGTTTTTA TGATTACAAAG TGA TACACT

-35 stop -10

551 AACTTTATAA AATTATTTGA TTGGAGTTTT TTAAATGGTG ATTTCAGAAT

RBS start orfC

Piotr Walczak


Rys. 3. A – Organizacja strukturalna plazmidu pWV01 bakterii Lactococcus lactis ssp. lactis.

repA – gen koduj¹cy bia³ko replikacyjne, OrfB, OrfC, OrfD – otwarte ramki odczytu, Ter – termi-nator, P-OrfC – promotor genu OrfC, -35, -10 – sygna³y promotora. B – Struktury poprzedzaj¹ce genrepA (orfC). IRL1, IRP1, IRL2, IRP2, IRL3, IRP3, IRL4, IRP4 – lewe i prawe strony odwróconych powtó-rzeñ, DR1, DR2, DR3 – bezpoœrednie powtórzenia, RBS – miejsce wi¹zania rybosomu, start orfB (orfC),– kodon startowy genu orfB (orfC), OrfB – otwarta ramka odczytu, PR – promotor genu orfC (repA).

Na podstawie (55).

6.2. Plazmidy typu theta

Plazmidy replikuj¹ce wg mechanizmu theta s¹ zwykle wiêksze od plazmidówRCR, a ich wielkoœæ waha siê od ok. 5 tpz do wiêcej ni¿ 100 tpz. Tak du¿e strukturygenetyczne pozwalaj¹ na kodowanie oprócz funkcji podstawowej, któr¹ jest auto-nomiczna replikacja, równie¿ wielu funkcji metaboliczno-fizjologicznych. Za procesreplikacji odpowiada minimalny replikon sk³adaj¹cy siê z odcinka DNA zawie-raj¹cego miejsce startu inicjacji replikacji oraz wszystkie sekwencje fizycznie doniego przylegaj¹ce, które s¹ pod jego kontrol¹ i replikuj¹ siê razem z nim. Replikonmo¿e zawieraæ równie¿ sygna³y koñcz¹ce replikacjê. Minimalny replikon plazmidówtheta zawiera origin replikacji bêd¹cy odcinkiem DNA o d³ugoœci oko³o 300 pz orazgen repB koduj¹cy syntezê bia³ka inicjatorowego, które uczestniczy w procesie„rozplatania” podwójnej nici DNA i tworzenia „oczka replikacyjnego”. Szczegó³y do-tycz¹ce organizacji strukturalnej minimalnego replikonu plazmidów theta przedsta-wione zostan¹ na kilku wybranych przyk³adach.

Jednym z tego typu plazmidów wystêpuj¹cych w komórkach Lactococcus lactis

jest du¿y plazmid proteinazowo-laktozowy pUCL22. Jego minimalny replikon sk³adasiê z sekwencji ORI poprzedzaj¹cej gen repB oraz genu orfX (repC), który prawdopo-dobnie koduje bia³ko regulatorowe procesu replikacji i uczestniczy w regulacji licz-by kopii plazmidu. Na rysunku 4 pokazano fragment tego plazmidu zawieraj¹cy re-gion ori, gen koduj¹cy bia³ko replikacyjne (repB) oraz gen repC (orfX) (49). Istotn¹czêœci¹ minimalnego replikonu jest fragment DNA zawieraj¹cy origin replikacji (ori)– miejsce inicjacji replikacji, w strukturze którego wyró¿nia siê specyficzne se-kwencje do których przy³¹czaj¹ siê bia³ka inicjatorowe. Powoduj¹ one zmianyw strukturze DNA u³atwiaj¹ce otwarcie siê tzw. „oczka” oraz reguluj¹ przy³¹czaniesiê bia³ek replikacyjnych niezbêdnych do rozpoczêcia syntezy DNA.


BIOTECHNOLOGIA 3 (70) 118-143 2005 127

Rys. 4. Fragment plazmidu pUCL22 zawieraj¹cy gen bia³ka replikacyjnego. ori – miejsce inicjacjistartu replikacji nici prowadz¹cej, RR – region prostych powtórzeñ, -35 -10 – sygna³y promotora, IR1,IR2 – odwrócone powtórzenia, rbs – miejsca wi¹zania rybosomów, repB – gen koduj¹cy bia³ko repli-kacyjne, RepC (orfX) – gen koduj¹cy bia³ko regulatorowe procesu replikacji. Na podstawie sekwencjiGenBank Accession X60454.

Kolejnym plazmidem replikuj¹cym wg mechanizmu theta jest plazmid Lactococcus

lactis pJW563 o wielkoœci 11,5 tpz koduj¹cy geny systemu restrykcji/modyfikacj (56).Na rysunku 5A przedstawiono szczegó³y budowy regionu poprzedzaj¹cego gen repB

bia³ka replikacyjnego. Region ten jest bardzo podobny strukturalnie do analogicz-nego regionu plazmidu pUCL22 i zawiera analogiczne struktury. Ró¿nice dotycz¹

Piotr Walczak


Rys. 5. A – Organizacja strukturalna sekwencji DNA plazmidu pJW563 Lactococcus lactis W56 po-przedzaj¹cej gen bia³ka replikacyjnego repB. ori – origin replikacji, DR22-x-nk – proste powtórzenia22 pz., DR15-nk – fragment DR22 o d³. 15 pz., IR7 1-5 – odwrócone powtórzenia o d³. 7 pz., IR12 1-2– odwrócone powtórzenia o d³. 12 pz., -35 i -10 – odpowiednie sygna³y promotora, RBS – miejscewi¹zania rybosomów, AttP – sekwencje AttP fagów bakterii mlekowych, repB – kodon start genu repB.B – Mo¿liwe struktury typu „³ody¿ki z pêtelk¹” w obrêbie promotora genu repB replikonu plazmidupJW563. Na podstawie sekwencji GenBank Accession X96951 (56).

wy³¹cznie kolejnoœci zasad w prostych i odwróconych powtórzeniach, d³ugoœci tychpowtórzeñ, oraz sekwencji promotorowej. Odwrócone powtórzenia tej sekwencjiIR7-4 i IR7-5 oraz IR12-1 i IR12-2 mog¹ tworzyæ drugorzêdowe struktury DNA typu„³ody¿ka z pêtelk¹”; przedstawiono to na rysunku 5B.

Nastêpnym plazmidem replikuj¹cym wed³ug mechanizmu theta jest plazmidpND302 o wielkoœci 8,8 tpz. wystêpuj¹cy u bakterii Lactococcus lactis ssp. lactis M71,który koduje opornoœæ komórek na jony kadmu (57). Strukturê replikonu tego pla-zmidu przedstawiono na rysunku 6A. Region promotorowy plazmidu ró¿ni siê odpoprzednich tym, ¿e nie wystêpuj¹ w nim odwrócone powtórzenia IR10-4 i IR10-5.Powoduje to, ¿e w obrêbie sygna³u -35 promotora nie tworzy siê pierwsza „spinka


BIOTECHNOLOGIA 3 (70) 118-143 2005 129

Rys. 6. A – Organizacja strukturalna sekwencji DNA plazmidu pND302 Lactococcus lactis ssp. lactis

M71 poprzedzaj¹cej gen bia³ka replikacyjnego repB. ori – origin replikacji, ori dr – proste powtórze-nia w obrêbie ori, DR22-x – proste powtórzenia 22 pz., DR15 – fragment DR22 o d³. 15 pz., IR13 1-2 –odwrócone powtórzenia o d³. 13 pz., -35 i -10 – odpowiednie sygna³y promotora, RBS – miejscewi¹zania rybosomów, attP-TUC2009 – sekwencje AttP faga TUC2009 bakterii mlekowych, repB – ko-don start genu repB. B – Mo¿liwa struktura typu „³ody¿ki z pêtelk¹” w obrêbie promotora genu repB re-plikonu plazmidu pND302. Na podstawie sekwencji GenBank Accession U79032.

Piotr Walczak


Ta

be

la1

Pow

tórz

enia

sek

wen

cji

DN

Aw

ystê

pu

j¹ce

ww

ybra

nyc

hre

pli

kon

ach

typ

uth

eta

bak

teri

iLa

ctoco

ccu

sla

ctis

Plaz

mid

DR2

2D

Rx/2

2IR

1IR

2Ac

cess

ion

12

34

56

pC

D4

TTTA

AGGA

CAGA

AAAA

TCGA

TG

TATA

AGGA

CAGA

AAAA

TCGA

TG

TATA

AGGA

CAGA

AAAA

TATA

AGGA

CGC

ATAG

AGAA

ANC

0027

48

pU

CL

22TT

TATC

ACTA

CAAA

AAGC

GATG

TATA

TCAC

TACA

AAAA

GCGA

TG

TATA

TCAC

TACA

AAA

ATCA

CTAC

AGC

ATAG

AGAA

X604

54

pW

V04

TTTA

TAGC

AAGA

AAAA

TCGA

TG

TATA

TAGC

AAGA

AAAA

TCGA

TG

TATA

TAGC

AAGA

AAAA

ATAT

AGCA

AGAA

AGC

ATAG

AGAA

AT–

pW

V05

TTTA

TAGC

AACA

AAAA

ACGA

TG

TATA

TAGC

AACA

AAAA

ACGA

TG

TATA

TAGC

AACA

AAAA

ACTA

TAGC

AACA

AAGC

ATAG

AGAA

–

pIL

7TA

TATA

GCAA

CAAA

AAAC

TGTG

TATA

TAGC

AACA

AAAA

ATA

TAGC

AACA

GACA

TAGA

GAA

Z254

75

pIL

103

TTTA

ACCC

ATAC

AAAA

AACT

GT

TTAT

ACCC

ATAC

AAAA

AACT

GT

TTAT

ACCC

ATAC

AAAA

AAT

ACCC

ATAC

GCAT

AGAG

AAA

AF01

3595

pIL

105

TAAA

CAGT

CACA

AAAA

TCGA

TG

TATA

CAGT

CACA

AAAA

TCGA

TG

TATA

CAGT

TATA

CAGT

ACAG

CATA

GAGA

AAAF

1162

86

pSL

2TA

TACA

GTCA

CAAA

AATC

GATT

TTTG

TGAC

TCTA

TGCA

TCGA

TG

TATA

CGAG

TCAC

AAAA

ATCG

ATG

TACA

CAGT

TACA

CAGT

ACGC

ATAG

AGAA

AX5

6550

pC

I305

TATA

TACC

AACA

AAAA

ACTG

TG

CATA

CACC

AACA

AAAA

ACTG

TG

CATA

TACC

AAC

ATAT

ACCA

ACAA

GCAT

GAAG

AAM

7406

3

pVS

40TA

TAGC

GTAT

GAAA

AAAC

TGTG

TATA

GCGT

ATGA

AAAA

ACT

ATAG

CGTA

TG

TATA

CGGT

AT

GCAT

AGAG

AAA

L029

20

pK

214

TATA

TGCC

GAAA

AAAA

ACTG

TGTA

TATG

CCGA

AAAA

AAAC

TTA

TGCC

GAAA

CATA

GAGA

AAX9

2946

rep

B1

pN

Z40

00TA

TATG

CCGA

AAAA

AAAC

TGTG

TATA

TGCC

GAAA

AAAA

ACT

TATG

CCGA

AAAG

CATA

GAGA

AATT

TAF

0364

85

rep

B2

pN

Z40

00TT

TATA

GCAA

GAAA

AATC

GATG

TATA

TAGC

AAGA

AAAA

TCGA

TG

TATA

TAGC

AAGA

AAAA

ATAT

AGCA

AGAA

AGC

ATAG

AGAA

ATAF

0364

85


BIOTECHNOLOGIA 3 (70) 118-143 2005 131

12

34

56

pC

I528

TATA

TAGC

ATAA

AAAA

ACTG

TG

AATA

TAGC

ATAA

AAAA

ACTG

TG

TATA

TAGC

ATAA

AAAA

AAT

ATAG

CATA

AAA

AAGT

ATGA

AGAA

L062

74

rep

B3

pN

Z40

00AA

TATA

GCAT

AAAA

AAAC

TGTG

TATA

TAGC

ATAA

AAAA

ACTG

TG

TATA

TAGC

ATAA

AAAA

AAT

AGCA

TAAA

AAGT

ATGA

AGAA

AF03

6485

rep

B4

pN

Z40

00TT

TATA

GATA

CTAA

AATC

GATG

TATA

TAGA

TACT

AAAA

TCGA

TG

TATA

TAGA

TACT

TATA

GATA

CTT

GCAT

AGAG

AAAT

AF03

6485

pFV

1201

TATA

TAGA

TACT

AAAA

TCGA

TGTA

TATA

GATA

CTTA

TAGA

TACT

TGC

ATAG

AGAA

ATX9

6949

pN

D30

2TA

TAGG

TGTA

GAAA

AAAC

TGTG

TATA

GGTG

TAGA

AAA

----

----

----

AAGC

ATGA

AGAA

AU7

9032

pAH

82TA

TACC

TAGA

AAAA

ACAA

TGCT

ATAC

CTAG

AAA

TTCT

CTAT

GCT

AGCA

TAGA

GAA

AF24

3383

pSR

Q90

0TA

TAGC

GGTA

CAAA

AAAC

TGTG

TTAG

AAGG

TAC

GACT

TTCT

CTAT

GCA

TAGA

GAAA

ATA

AF00

1314

pJW

563

TATA

GCGG

TACA

AAAA

ACAA

TG

TATA

TCAG

TACA

AAAA

ACAA

TG

TATA

TCAG

TACA

AAAA

ACAA

TT

CATA

CCAG

TACA

AAA

CAGT

ACA

AAGC

ATAG

AGAA

X851

68

kon

sen

sus

TATA

TAGN

NACA

AAAA

ACNA

TG

do w³osów” (rys. 6B). Przeprowadzono analizê 20 replikonów pochodz¹cych z 17ró¿nych plazmidów bakterii z rodzaju Lactococcus, których sekwencje s¹ publiczniedostêpne w internetowych bazach danych. Zestawienie regionów powtórzeñ wystê-puj¹cych w tych replikonach plazmidów Lactococcus lactis, replikuj¹cych wed³ug me-chanizmu theta, przedstawiono w tabeli 1. W tabeli 2 zestawiono sekwencje promo-torowe genu bia³ka replikacyjnego repB wybranych plazmidów bakterii Lactococcus

lactis oraz sekwencje rbs poprzedzaj¹ce kodon START tego genu, a w tabeli 3 zesta-wiono sekwencje (ori) tych replikonów.

T a b e l a 2

Sekwencje promotorów genu bia³ka replikacyjnego repB wybranych plazmidów bakterii Lactococcus lactis

oraz sekwencje rbs

Plazmid -35 -10 RBS Accession

pCD4 TTGAAT TACTGTCCTTATTTTGA TATAAT AAAGGAG NC002748

pUCL22 TTGTAT ATGTAGTGATTAAGTGG TATATG AAAGGAG X60454

pWV04 ACTAAT TTCTTGCTATATTATGA TATAAT AAAGGAG –

pWV05 TTGATT ATGTTGCTATAAATTTG TATAAT AAAGGAG –

pIL7 TTGTCT GTGTTGCTATAATGTGG TACAAT AAAGGAG Z25475

pIL103 TTGAGA TAGTATGGGTATTTTTG TATAAT AAAGGAG AF013595

pIL105 TTGTAT TTGTGTACTGTATATAG TATAAT AAAGGAG AF116286

PSL2 TTGTAT TTGTGTACTGTATATAG TATAAT AAAGGAG X56550

pCI305 TTGTTT CGTTGGTATATAATGA TATAAT AAAGGAG M74063

pVS40 TTGATA GATATACGGTATTCTGA TACAAT AAAGGAG L02920

pK214 TAGAGT GTTTCGGCATAATATGG TATAAT AAAGGAG X92946

repB1 pNZ4000 TAGAGC GTTTCGGCATAATATGG TATAAT AAAGGAG AF036485

repB2 pNZ4000 ACTAAT TTCTTGCTATATTATGA TATAAT AAAGGAG AF036485

pCI528 TCATCA TTTTATGCTATATTATGA TATAAT AGAGGAG L06274

repB3 pNZ4000 TCATCA GTTTATGCTATATTATGA TATAAT AGAGGAG AF036485

repB4 pNZ4000 TTGAAA AAGTATCTATAAATTGA TATAAT AAAGGAG AF036485

pFV1201 TTGAAA AAGTATCTATAAATTGA TATAAT AAAGGAG X96949

pND302 TTCGGA ATACTATACTTGTTTTGA TATAAT AAAGGAG U79032

pAH82 TTGTGT TACTAGGCATATAATGA TATAAT AAGGAG AF243383

pSRQ900 TTGAAC AGGTACCGCTGTTTTGA TATAAT AAAGGAG AF001314

pJW563 TTACGT GTACTGATTAAAGTGA TATAAT AAGGAG X85168

T a b e l a 3

Struktura origin replikacji (ori) wybranych replikonów typu � bakterii Lactococcus lactis

Plazmid Sekwencja ORI Accession

1 2 3

pCD4 TATATCTATTTATCATATATATTTTAATCTTTTGTTCTTTT NC002748

pUCL22 TATTTATATTTATCTTATATATTTTAATCTTTTGTTCTTTT X60454

pWV04 TATATCTATTTATCATATATATTTTAATCTTTTGTTCTTTT –

pWV05 TATTATATATTTATCCTATATATTTTAATCTTTTGTTCTTTT –

Piotr Walczak


1 2 3

pIL7 TATTATATATTTATCATATATATTTTAATCTTTTGTTCTTTT Z25475

pIL103 TATATTAATTTATATTATATATTTTAATCTTTTATCTTTT AF013595

pIL105 TATTATTATTTATCCTATATATTTTAATCTTTTGTTCTTTT AF116286

PSL2 TATTATATATTTATCATATATATTTTAATCTTTTGTTCTTTT X56550

pCI305 TATTATATATTTATCTTATATATTTTAATCTTTTATTCTTTT M74063

pVS40 TATATTAATTTATCATATATATTTTAATCTTTTATTCTTTT L02920

pK214 TATATTAATTTATCTTATATATTTTAATCTTTTATTCTTTT X92946

repB1 pNZ4000 TATATTAATTTATCTTATATATTTTAATCTTTTGTTCTTTT AF036485

repB2 pNZ4000 TATATCTATTTATCATATATATTTTAATCTTTTGTTCTTTT AF036485

pCI528 TATATTAATTTATCATATATATTTTAATCTTTTCTTCTTTT L06274

repB3 pNZ4000 TATATTAATTTATCATATATATTTTAATCTTTTCTTCTTTT AF036485

repB4 pNZ4000 TATTATATATTTATCCTATATATTTTAATCTTTTGTTCTTTT AF036485

pFV1201 TATTATTATTTATCTTATATATTTTAATCTTTTGTTCTTTT X96949

pND302 TATATTAATTTATCATATATATTTTAATCTTTTGTTCTTTT U79032

pAH82 TATTATTATTTATCTTATATATTTTAATCTTTTGTTCTTTT AF243383

pSRQ900 TATATATATATTTATCTTATATATTTTAATCTTTTGTTCTTTT AF001314

pJW563 TTTTATATATTTATCCTATATATTTTAATCTTTTGTTCTTTT X85168

konsensus TATNNATNTATTTATCTTATATATTTTAATCTTTTGTTCTTTT

Analizowane replikony maj¹ bardzo podobn¹ budowê strukturaln¹. Standardo-wy replikon sk³ada siê z regionu ori wraz z obszarem promotorowym genu repB, ele-mentów regulacyjnych procesów replikacji i transkrypcji oraz genów repB i repC,które tworz¹ strukturê operonu. Klasycznym przyk³adem takiego replikonu jest re-plikon plazmidu proteinazowo-laktozowego pUCL22.

Operon repBC ulega transkrypcji pod kontrol¹ wspólnego regulowanego promo-tora. Gen repB koduje bia³ko replikacyjne, które zapocz¹tkowuje proces replikacjiplazmidu poprzez przy³¹czanie siê do sekwencji ori i tworzenie „oczka” replikacyj-nego. Gravesen i wsp. (58), porównuj¹c sekwencjê aminokwasów bia³ka repB po-chodz¹c¹ z wielu ró¿nych plazmidów stwierdzili, ¿e ma ona bardzo konserwatywn¹budowê, a drobne ró¿nice strukturalne wystêpuj¹ jedynie w C-koñcowej czêœci tegobia³ka. Drugi gen operonu repC (orfX) jest równie¿ bardzo konserwatywny, a bia³koRepC zawiera motyw helisa-skrêt-helisa, typowy dla bia³ek wi¹¿¹cych DNA. Uwa¿asiê, ¿e bia³ko to uczestniczy w procesie regulacji liczby kopii plazmidu. U wielu pla-zmidów bakterii mlekowych gen repC wystêpuje w formie przyciêtej (truncated) i dla-tego, jak siê wydaje, nie jest on niezbêdny do replikacji plazmidu.

Przedstawiona analiza wybranych plazmidów replikuj¹cych wed³ug mechanizmutheta wskazuje, ¿e typowy replikon tego rodzaju sk³ada siê z nastêpuj¹cych elemen-tów:

1. Origin (miejsce inicjacji replikacji) o d³ugoœci 41-43 par zasad. Region ten jestbogaty w zasady A+T, a bezpoœrednio przed nim znajduje siê 6-10-nukleotydowasekwencja zasad bogata w G+C.


BIOTECHNOLOGIA 3 (70) 118-143 2005 133

2. Obszaru miêdzy origin a powtórzeniem (3,5 × 22 p.z.) – oko³o 60 – 80 parzasad o zró¿nicowanej sekwencji, przy czym na jego pocz¹tku wystêpuj¹ w przewa-dze zasady A+T.

3. Bezpoœredniego powtórzenia DR22 (iteron), z³o¿onego z trzykrotnie powtó-rzonej sekwencji 22 par zasad oraz z niepe³nego kawa³ka tej sekwencji o d³ugoœci od8 do 19 pz. Sekwencja DR22 na swoim pocz¹tku i koñcu jest bardzo konserwatywna.

4. W regionie 3,5 × DR22 znajduje siê krótsze proste powtórzenie (DR7-13) wy-stêpuj¹ce czterokrotnie. Sekwencja ta jest powtórzona pi¹ty raz w orientacji od-wróconej poza regionem 3,5 × DR22. Czwarte i pi¹te odwrócone powtórzenie tejsekwencji tworzy strukturê „³ody¿ki z pêtelk¹”.

5. W regionie pêtelki tego odwróconego powtórzenia wystêpuje sygna³ – 35promotora genu repB. Poza pierwszym odwróconym powtórzeniem na nici g³ównejDNA znajduje siê sygna³ -10 promotora tego genu. Typowy promotor genu repB manastêpuj¹c¹ strukturê 5’-TTGTNN-16-18 pz.- TATAAT-3’.

6. Za miejscem -10 wystêpuje para odwróconych powtórzeñ o d³ugoœci od 10 do15 pz., tworz¹ca drug¹ strukturê ³ody¿ki z pêtelk¹. W obrêbie tych powtórzeñ wy-stêpuj¹ konserwatywne dziewiêcionukleotydowe sekwencje homologiczne do se-kwencji AttP ró¿nych fagów bakterii mlekowych.

7. Miejsce wi¹zania rybosomu rbs znajduje siê za drug¹ ³ody¿k¹ z pêtelk¹, kilkapar zasad bezpoœrednio przed kodonem startowym genu repB i ma nastêpuj¹c¹strukturê 5’-AAAGGAG-3’.

W analizowanych replikonach znaleziono trzy ró¿ne sekwencje AttP:5’-TATGAAGAA-3’ – fagi sk1, BK5-T, r1t.5’-CATGAAGAA-3’ – fag Tuc2009.5’-CATAGAGAA-3’ – fagi c2, bIL67.

7. Organizacja strukturalna du¿ych plazmidów typu theta

Minimalny replikon to tylko jeden z elementów struktury plazmidów typu theta,którego d³ugoœæ wynosi oko³o 2,2 tpz. Du¿e plazmidy bakterii mlekowych maj¹wielkoœæ dochodz¹c¹ do 130 tpz. Jakie geny wchodz¹ zatem w sk³ad tak du¿ychreplikonów? OdpowidŸ na to pytanie nie jest prosta, gdy¿ plazmidy zawarte w ko-mórkach s¹ bardzo plastyczne i w obrêbie tego samego szczepu mo¿e zmieniaæsiê ich liczba jak i wielkoœæ. Zmiany te spowodowane s¹ zjawiskiem tworzenia ko-integratów miêdzy plazmidami sk³adowymi i chromosomem oraz odwracalnym ichrozpadem. Cecha ta zwi¹zana jest z wystêpowaniem w strukturach plazmidów se-kwencji insercyjnych odpowiedzialnych za transpozycyjne tworzenie kointegra-tów i ich rozpad. Jednym z prostszych przyk³adów plazmidu bakterii mlekowych,który zawiera sekwencje insercyjne jest plazmid pIL105 (59). Na rysunku 7 przed-stawiono jego organizacjê strukturaln¹. Plazmid ten jest odpowiedzialny za me-

Piotr Walczak


chanizm poronnej infekcji fagowej uwarunkowany obecnoœci¹ genu AbiD1. Jest totypowy przyk³ad organizacji strukturalnej plazmidów typu theta, który zawieratrzy podstawowe modu³y genetyczne, minimalny replikon, sekwencjê insercyjn¹,i gen/geny funkcji metaboliczno–fizjologicznych. Taka modularna budowa plazmi-dów wystêpuje w wiêkszoœci znanych i opisanych przyk³adów plazmidów bakteriimlekowych. Ze wzglêdu na mechanizmy rekombinacji transpozycyjnej, bardziejz³o¿one plazmidy sk³adaj¹ siê z tych samych modu³ów nale¿¹cych do plazmidówsk³adowych. W plazmidach z³o¿onych wystêpuj¹ zatem powielone minimalne re-plikony, kilka tych samych lub ró¿nych sekwencji insercyjnych oraz bloki genówfunkcji metabolicznych.

Przyk³adem bardziej z³o¿onego plazmidu jest plazmid pAH82 o wielkoœci ok. 21tpz, warunkuj¹cy opornoœæ komórek na jony kadmu Cd2+, system restrykcji i mody-fikacji R/M, syntezê fosfatazy serynowo/treoninowej bia³ek, funkcje mobilizacyjnei geny o nieznanych funkcjach (60). Na rysunku 8 przedstawiono organizacjê struk-turaln¹ tego plazmidu. Geny orf8, orf9, MobDE I, MatR, MobDE II, repB, oraz orfX sta-nowi¹ fragment plazmidu koniugacyjnego i warunkuj¹ funkcje replikacji oraz koniu-gacyjnego transferu tego plazmidu. Sekwencja insercyjna jest reprezentowanaprzez izo-ISS1. Nie jest znana funkcja genów orf3, orf4, orf5. System restrykcji/mody-fikacji R/M typu I kodowany jest przez trzy geny HsdS, HsdM i HsdR, kontroluj¹ce


BIOTECHNOLOGIA 3 (70) 118-143 2005 135

Rys. 7. Funkcjonalna struktura plazmidu pIL105 bakterii Lactococcus lactis ssp. Lactis.

abiD1 – gen poronnej infekcji fagowej, ORFX – gen niepotrzebny do replikacji, izo-ISS1 – se-kwencja insercyjna, tnpA – gen transpozazy, tnpA# – fragm. genu transpozazy, tnpA-mut-frag. – zmu-towany fragment genu tnpA, IRL i IRR – odwrócone powtórzenia sekwencji insercyjnej, repB – genbia³ka replikacyjnego, DR22-1 do 3 – proste powtórzenia (22 pz.), DR8/22 – fragm. prostego powtó-rzenia (8 pz.). Na podstawie sekwencji GenBank Accession AF116286.

syntezê trzech podjednostek kompleksu enzymatycznego: podjednostki specyficz-noœci, modyfikacji i restrykcji. Geny warunkuj¹ce opornoœæ komórek na jony kadmutworz¹ strukturê operonu sk³adaj¹c¹ siê z dwóch genów cadC i cadA ulegaj¹cychtranskrypcji ze wspólnego promotora. Podobna organizacja genów opornoœci najony kadmu wystêpuje w plazmidzie pND302 bakterii mlekowych (61), oraz w trans-pozonie PsiTn554 Staphylococcus aureus (62) i transpozonie Tn5422 Listeria monocytogenes

(63,64). Z uwagi na niemal 100% homologiê genów cadC i cadA tych trzech orga-nizmów mo¿na s¹dziæ, ¿e cecha ta zosta³a przeniesiona ze Staphylococcus aureus

lub Listeria monocytogenes do Lactococcus lactis na zasadzie poziomego transferu ge-nów.

Interesuj¹c¹ rzecz¹ jest fakt, ¿e w obrêbie genu HsdR wystêpuje sekwencja cos

faga c2 i palindromowa faga Tp901-1 bakterii mlekowych. Ponadto w genie HsdM

znajduje siê sekwencja AttP faga BK5-T (obserwacja w³asna). Fakty te mog¹ wskazy-waæ na fagowe pochodzenie genów Hsd.

Przyk³adem plazmidu bêd¹cego kointegratem czterech plazmidów sk³adowychmo¿e byæ pNZ4000 z Lactococcus lactis NIZO B40 o wielkoœci 42810 pz, warunkuj¹cyprodukcjê zewn¹trzkomórkowego polisacharydu (65). Na rysunku 9 przedstawionoschematycznie jego budowê. Plazmid ten zawiera ca³y operon eps sk³adaj¹cy siêz czternastu genów epsRXABCDEFGHIJKL ulegaj¹cych transkrypcji z jednego polici-

Piotr Walczak


Rys. 8. Mapa funkcjonalna plazmidu pAH82 bakterii Lactococcus lactis ssp. lactis var. diacetylactis

DPC220. CadA – efflux ATPaza jonów kadmu, CadC – regulator opornoœci na jony kadmu (represortranskrypcji), Orf3, Orf4, Orf5 – geny o nieznanej funkcji, TnpA 945 – transpozaza sekwencji insercyj-nej izo-ISS1, Php – fosfataza serynowo/treoninowa bia³ek, Orf8, Orf9 – geny o nieznanej funkcji, Mob-

DE I – relaksaza Mob DEI, MatR – maturaza, MobDE II – relaksaza Mob DEII, RepB – gen bia³ka repli-kacyjnego, OrfX – gen o nieznanej funkcji, HsdR – podjednostka restrykcyjna systemu R/M typu I,HsdM – podjednostka modyfikuj¹ca systemu R/M typu I, HsdS – podjednostka specyficznoœci systemuR/M typu I. Na podstawie sekwencji Gen Bank Accession AF243383.


BIOTECHNOLOGIA 3 (70) 118-143 2005 137

Rys. 9. Organizacja strukturalna plazmidu pNZ4000 warunkuj¹cego produkcjê zewn¹trzkomórko-wych polisacharydów EPS. Objaœnienia w tekœcie. Na podstawie sekwencji GenBank AccessionAF036485.2.

stronowego m-RNA syntetyzowanego pod kontrol¹ promotora poprzedzaj¹cegogen epsR. Bia³ka operonu eps tworz¹ kompleks enzymatyczny syntetyzuj¹cywewn¹trzkomórkowo piêciocukrow¹ jednostkê budulcow¹ polimeru, transportuj¹j¹ przez membranê cytoplazmatyczn¹ i œcianê komórkow¹ oraz do³¹czaj¹ j¹ dozewn¹trzkomórkowej matrycy polimeru. Szczegó³y funkcjonowania systemu bio-syntezy polisacharydów opisano w pracach Kleerebezem i wsp. (66) oraz van Kra-nenburg i wsp. (25). W bezpoœrednim s¹siedztwie genu epsR znajduje siê sekwencjainsercyjna IS982, co wskazuje, ¿e geny te mog³y zostaæ przeniesione do plazmiduz chromosomu na zasadzie wspomaganej sekwencj¹ insercyjn¹ rekombinacji trans-pozycyjnej. Plazmid pNZ4000 zawiera równie¿ geny systemu transportu jonów ko-baltu zgrupowane w strukturze operonu cbiMQO oraz oddzielnie wystêpuj¹cy gencorA, którego produkt uczestniczy w transporcie jonów magnezu. Oprócz funkcjimetabolicznych kodowanych przez ten plazmid zawiera on równie¿ cztery genyrepB, które wraz z sekwencjami poprzedzaj¹cymi te geny tworz¹ w pe³ni funkcjonal-ne replikony repB1, repB2, repB3 i repB4, a ka¿dy z nich nale¿y do innego plazmidusk³adowego. Budowa strukturalna ka¿dego replikonu jest bardzo podobna i wszyst-

Piotr Walczak


Rys. 10. Organizacja strukturalna niskokopiowego plazmidu pSC101 bakterii z rodziny Enterobacteriaceae

warunkuj¹cego opornoœæ na tetracyklinê. Objaœnienia w tekœcie. Kompilacja na podstawie sekwencjiGenBank Accession NC_002056, X00657, K00042, M36272, J01728.

kie warunkuj¹ replikacjê typu theta. Na podstawie podobieñstwa minimalnych repli-konów ustalono, ¿e repB1 jest homologiczny do pVS40, repB2 do pWV04, repB3 dopCI528, a repB4 do pFV1201 (65).

Plazmid pNZ4000 mo¿e byæ ³atwo przeniesiony do innych szczepów Lactococcus

lactis na drodze koniugacji i wykazano, ¿e jest on plazmidem mobilizacyjnym. Zidenty-fikowano w pobli¿u dwóch replikonów (repB2 i repB3) dwa regiony zaanga¿owanew proces mobilizacji plazmidów i wykryto obecnoœæ dwóch sekwencji oriT odpowie-dzialnych za koniugacyjny transfer plazmidu. Wykazano mo¿liwoœæ koniugacyjnej mo-bilizacji plazmidu pNZ124 przez ka¿d¹ z dwóch sekwencji oriT plazmidu pNZ4000. Zajedn¹ z sekwencji oriT wystêpuje gen mobA koduj¹cy bia³ko dzia³aj¹ce in-trans, którezwiêksza³o czêstoœæ koniugacyjnego transferu 100-krotnie. Przewidziana sekwencjaaminokwasów bia³ka MobA i sekwencje oriT wykazywa³y znacz¹ce podobieñstwa od-powiednio do relaksazy i oriT plazmidu R64 bakterii Escherichia coli (65).

Plazmidy bakterii mlekowych replikuj¹ce wg mechanizmu theta nie ró¿ni¹ siêw organizacji strukturalnej regionu ori od naturalnych plazmidów typu theta bakte-rii z rodziny Enterobacteriaceae, Escherichia coli i Salmonella typhimurium. Przyk³ademtego typu plazmidu funkcjonuj¹cego u wymienionych gatunków bakterii jest nisko-kopiowy plazmid pSC101 warunkuj¹cy opornoœæ komórek na tetracyklinê (rys. 10)(67-72). Gen opornoœci na tetracyklinê Tcr z tego plazmidu wykorzystany zosta³ jakomarker selekcyjny do skonstruowania tak znanych wektorów plazmidowych bakteriiEscherichia coli jak pBR322 i pBR325 (73). Oprócz genów opornoœci na tetracyklinê,plazmid ten zawiera równie¿ dwie sekwencje insercyjne IS102 homologiczn¹ doIS903 oraz IS101. Ta ostatnia zawiera niekompletny (przyciêty) gen transpozazyi jest prawdopodobnie nieaktywna. Za funkcje replikacyjne plazmidu odpowiadagen repB poprzedzony regionem ori, elementami regulacyjnymi odpowiedzialnymiza zjawisko niezgodnoœci (incompatibility) i regulowany promotor oraz miejscewi¹zania rybosomów. Organizacjê regionu poprzedzaj¹cego gen repB przedstawio-no na rysunku 11A.

Wystêpowanie regionu oriC oraz trzech prostych powtórzeñ DR22 jest typow¹struktur¹ znajdowan¹ we wszystkich plazmidach replikuj¹cych wg mechanizmu thetabakterii mlekowych. Krótki odcinek DNA pomiêdzy 2 i 3 DR22 spe³nia podobn¹ funk-cjê jak czwarte niekompletne proste powtórzenie w replikonach bakterii mlekowychwyd³u¿aj¹c ten region do ok. 3,5 d³ugoœci prostego powtórzenia DR22. W obrêbiepromotora genu repB wystêpuje odwrócone powtórzenie IR13, które mo¿e powodo-waæ powstawanie struktury ³ody¿ki z pêtelk¹ o budowie przedstawionej na rysunku11B. Odgrywa ona istotn¹ rolê w procesie autoregulacji transkrypcji genu repB.

Porównanie struktury plazmidu pSC101 z analogicznymi strukturami plazmidówbakterii mlekowych pokazuje, ¿e u tych ostatnich wystêpuj¹ zazwyczaj dwie ³ody¿kiz pêtelk¹. Pierwsza z nich obejmuje obszar promotora, a druga wystêpuje bezpo-œrednio przed rbs. U plazmidów bakterii mlekowych sygna³ -35 promotora le¿yw obrêbie pierwszej pêtelki, natomiast obszar -10 na nici g³ównej. W przypadkuplazmidu pSC101 mamy odwrotn¹ sytuacjê, gdy¿ sygna³ -35 promotora le¿y na nici


BIOTECHNOLOGIA 3 (70) 118-143 2005 139

g³ównej natomiast sygna³ -10, w obrêbie pêtelki. Ponadto w obrêbie ³ody¿ki tejstruktury znajduje siê równie¿ miejsce wi¹zania rybosomu. Sekwencja DNA odpo-wiedzialna za replikacjê plazmidu pSC101 jest krótsza o oko³o 20 par zasad ni¿ ana-logiczne sekwencje bakterii mlekowych, co t³umaczy brak drugiej struktury ³ody¿kiz pêtelk¹.

Pomimo przedstawionych ró¿nic w budowie sekwencji odpowiedzialnych za ini-cjacjê procesu replikacji plazmidów typu theta bakterii gramdodatnich i gramujem-nych wydaje siê, ¿e maj¹ one wspólne pochodzenie. Jednak¿e nale¿y podkreœliæ, ¿eplazmidy theta bakterii mlekowych nale¿¹ do grupy o w¹skim zakresie gospodarzy(narrow host range) i mog¹ funkcjonowaæ jedynie w komórkach bakterii z rodzajuLactococcus lub blisko spokrewnionych rodzajów Leuconostoc, Lactobacillus i Pediococcus.U bakterii gramujemnych z rodziny Enterobacteriaceae za specyficznoœæ rodzajow¹plazmidów theta w du¿ej mierze odpowiada sekwencja IHF (integration host factor),

Piotr Walczak


Rys. 11. A – Region poprzedzaj¹cy gen repB plazmidu pSC101. OriC – region homologiczny doOriC E. coli, IHF – miejsce wi¹zania czynnika integracyjnego gospodarza, DR22 – proste powtórzenia,IR13 – odwrócone powtórzenia, -35, -10 – sygna³y promotora, rbs – miejsce wi¹zania rybosomów,repB – pocz¹tek genu bia³ka replikacyjnego. B – Struktura ³ody¿ki z pêtelk¹ w obrêbie promotora i rbsplazmidu pSC101 uczestnicz¹ca w procesie autoregulacji transkrypcji genu repB. Na podstawie sekwen-cji Gen Bank Accession K00042, X00657.

bêd¹ca miejscem wi¹zania czynnika integracyjnego gospodarza. Wystêpuje ona po-miêdzy regionem oriC oraz regionem prostych powtórzeñ (iteronów) i posiada na-stêpuj¹c¹ sekwencjê 5’-YAANNNNTTGATW-3’ (74,75). W pracach tych autorów wy-kazano, ¿e czynnik integracyjny gospodarza Escherichia coli ³¹czy siê specyficzniez sekwencjami attP fagów �80 i P22 oraz odwróconymi powtórzeniami sekwencjiinsercyjnej IS1, jak równie¿ miejscem „hot spot” IS1 w plazmidzie pBR322. Podobnymechanizm kontroli specyficznoœci gatunkowej replikonu, jak siê wydaje, wystêpujerównie¿ u bakterii mlekowych. W tym przypadku rolê czynnika IHF mog¹ odgrywaætranspozazy sekwencji insercyjnych bakterii mlekowych wchodz¹cych w sk³ad struk-tury plazmidu typu theta. Prawdopodobne jest, ¿e replikon theta wraz z towa-rzysz¹c¹ mu specyficzn¹ sekwencj¹ insercyjn¹ stanowi¹ nieroz³¹czny element nie-zbêdny do replikacji plazmidu. Plazmid typu theta bakterii mlekowych mo¿e zatemreplikowaæ jedynie w przypadku, gdy zawiera jednoczeœnie w³aœciw¹ dla danego re-plikonu sekwencjê insercyjn¹ lub ta sekwencja insercyjna wystêpuje w formie zinte-growanej z chromosomem bakterii gospodarza. Plazmid theta pozbawiony towa-rzysz¹cej mu sekwencji insercyjnej mo¿e replikowaæ jedynie w komórkach bakteriizawieraj¹cych chromosomalne kopie tych sekwencji. Teza ta jednak wymaga do-œwiadczalnego udowodnienia.

8. Podsumowanie

Plazmidy bakterii mlekowych ze wzglêdu na budowê strukturaln¹ minimalnychreplikonów stanowi¹ homogenn¹ grupê ruchomych elementów genetycznych przy-czyniaj¹cych siê do znacznego zró¿nicowania biochemiczno–fizjologicznego szcze-pów. S¹ one ponadto przyczyn¹ ogromnej zmiennoœci miêdzyszczepowej bakteriipowodowanej utrat¹ lub nabyciem okreœlonego plazmidu lub jego integracj¹ z chro-mosomem. Wystêpowanie tych samych genów w chromosomie bakterii, jak i w pla-zmidach zawieraj¹cych sekwencje insercyjne œwiadczy o tym, ¿e w komórkach genymog¹ „wêdrowaæ” z chromosomu do plazmidu i odwrotnie na zasadzie transpozycjiwspomaganej sekwencjami insercyjnymi. Ich obecnoœæ jest przyczyn¹ ogromnej pla-stycznoœci genetycznej bakterii mlekowych i ich ³atwoœci przystosowania siê dozmiennych warunków œrodowiska. Wystêpowanie tych samych genów w plazmi-dach, transpozonach lub chromosomach ró¿nych rodzajów blisko spokrewnionychbakterii (Lactococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Listeria) wskazuje, ¿e w œrodowi-sku bytowania bakterii mlekowych zachodz¹ ci¹g³e procesy poziomego transferugenów, a plazmidy odgrywaj¹ rolê wektorów wspomagaj¹cych ten transfer. Przed-stawione w pracy przyk³ady du¿ych plazmidów nie wyczerpuj¹ ró¿norodnoœci gene-tycznej plazmidów spotykanych w komórkach bakterii mlekowych.


BIOTECHNOLOGIA 3 (70) 118-143 2005 141

Literatura

1. de Vos W. M., Gasson M. J., (1989), J. Gen. Microbiol., 135, 1833-1846.2. de Vos W., Boerrigter I., van Rooijen R. J., Reiche B., Hangstenberg W., (1990), J. Biol. Chem., 265,

22554-22560.3. van Rooijen R. J., de Vos W. M., (1990), J. Biol. Chem., 265, 18499-18503.4. van Rooijen R. J., van Schalkwijk S., de Vos W. M., (1991), J. Biol. Chem., 266, 7176-7181.5. van Rooijen R. J., de Vos W. M., (1992), J. Bacteriol., 174, 2273-2280.6. Kok J., (1990), FEMS Microbiol. Rev., 87, 15-42.7. Thomas T. D., Pritchard G. G., (1987), FEMS Microbiol. Rev., 46, 245-268.8. Kok J., Leenhouts C. J., Haandrikman A. J., Ledeboer A. M., Venema G., (1988), Appl. Environ. Micro-

biol., 54, 231-238.9. de Vos W. M., Vos P., de Haard H., Boerrigter I., (1989), Gene, 85, 169-176.

10. Kaletta C., Entian K.-D., (1989), J. Bacteriol., 171, 1597-1601.11. van Belkum M. J., Hayema B. J., Geis A., Kok J., Venema G., (1989), Appl. Environ. Microbiol., 55,

1187-1191.12. van Belkum M. J., Hayema B. J., Jeeninga R. E., Kok J., Venema G., (1991), Appl. Environ. Microbiol.,

57, 492-498.13. van Belkum M. J., Kok J., Venema G., (1992), Appl. Environ. Microbiol., 58, 572-577.14. Marugg J. D., Gonzalez C. F., Kunka B. S., Ledeboer A. M., Pucci M. J., Toonen M. Y., Walker S. A.,

Zoetmulder L. C. M., Vandenbergh P. A., (1992), Appl. Env. Microbiol., 58, 2360-2367.15. Motlagh A. M., Bukhtiyarova M. B., Ray B. R., (1994), Lett. Appl. Microbiol., 18, 305-312.16. Stiles M. E., (1994), J. Dairy Sci., 77(9), 2718-2724.17. Hastings J. W., Sailer M., Johnson K., Roy K. L., Vederas J. C., Stiles M. E., (1991), J. Bacteriol., 173

(23), 7491-7500.18. van Belkum M. J., Stiles M. E., (1995), Appl. Environ. Microbiol., 61 (10), 3573-3579.19. Froseth B. R., McKay L. L., (1991), Appl. Environ. Microbiol., 57, 804-811.20. Efstathiou J. D., McKay L. L., (1977), J. Bacteriol., 130, 257-265.21. Liu C.-Q., Chia G. L., Dunn N. W., (1996), Direct Submission ACCESSION U78967.22. Teuber M., Meile L., Schwarz F., (1999), Antonie van Leeuvenhoek, 76, 115-137.23. Kempler G. M., McKay L. L., (1979), Appl. Environ. Microbiol., 37, 316-323.24. Lopez de Felipe F., Magni C., de Mendoza D., Lopez P., (1995), Mol. Gen. Genet., 246 (5), 590-599.25. van Kranenburg R., van Swam I. I., Marugg J. D., Kleerebezem M., de Vos W. M., (1999), J. Bacteriol.,

181 (1), 338-340.26. de Vos W. M., Underwood H. M., Davies F. L., (1984), FEMS Microbiol. Lett., 23, 175-178.27. Benbadis L., Garel J.-R., Hartley D. L., (1991), Appl. Environ. Microbiol., 57, 3677-3678.28. Hill C., Pierce K., Klaenhammer T. R., (1989), Appl. Environ. Microbiol., 55, 2416-2419.29. Hill C., Miller L. A., Klaenhammer T. R., (1990), Appl. Environ. Microbiol., 56, 2255-2258.30. Hill C., (1993), FEMS Microbiology Reviews, 12, 87-108.31. Scheirlinck T., de Meutter J., Arnaut G., Joos H., Claeyssens M., Michiels F., (1990), Appl. Microbiol.

Biotechnol., 33, 534-541.32. del Solar G., Puyet A., Espinosa M., (1987), Nucleic Acid Res., 15, 5561-5580.33. del Solar G., Giraldo R., Ruiz-Echevarria M. J., Espinosa M., Diaz-Orejaz R., (1998), Microbiol. Mol.

Biol. Rev., 62, 434-464.34. te Riele H., Michel B., Ehrlich S., (1986a), EMBO J., 5, 631-637.35. te Riele H., Michel B., Ehrlich S., (1986b), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 2541-2545.36. Gros M.-F., te Riele H., Ehrlich S. D., (1987), EMBO J., 6, 3863-3869.37. Pigac J., Vajaklija D., Toman Z., Gamulin V., Schrempf H., (1988), Plasmid, 19, 222-230.38. Baas P., Jansz H., (1988), Curr. Top. Microbiol. Immunol., 136, 31-70.39. Ehrlich S. D., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 1680-1682.40. Goze A., Ehrlich S., (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 7333-7337.41. Gryczan T., Contente S., Dubnau D., (1978), J. Bacteriol., 134, 318-329.

Piotr Walczak


42. Polak J., Novick R., (1982), Plasmid, 7, 152-162.43. Gruss A., Ehrlich S. D., (1989), Microbiol. Rev., 53, 231-241.44. Vehmaanperä J. O., Korhola M. P., (1986), Appl. Microbiol. Biotechnol., 23, 456-461.45. Grus A., Ehrlich S. D., (1988), J. Bacteriol., 170, 1183-1190.46. Hayes F., Vos P., Fitzgerald G. F., de Vos W. M., Daly C., (1991), Plasmid, 25 (1), 16-26.47. Lucey M., Daly C., Fitzgerald G., (1993), FEMS Microbiol. Lett., 110 (3), 249-256.48. Kiewiet R., Bron S., de Jonge K., Venema G., Seegers J. F., (1993), Mol. Microbiol., 10, 319.49. Frere J., Novel M., Novel G., (1993), Mol. Microbiol., 10 (5), 1113-1124.50. Benachour A., Frere J., Novel G., (1995), FEMS Microbiol. Lett., 128 (2), 167-175.51. Ceg³owski P., (1995), Post. Mikrobiol., XXXIV (2), 121-141.52. Taylor K., Podhajska A., (1989), w: Biologia molekularna informacja genetyczna, pr. zb., red. Z. Lasota,

PWN, Warszawa, 600-635.53. Dale J. W., (1994), Molecular Genetics of Bacteria, 2nd ed. John Wiley & Sons, Chichester, New York,

Brisbane, Toronto, Singapore, 165-185.54. W³odarczyk M., (2002), Kosmos Problemy Nauk Biologicznych, 51(3), 241-254.55. Leenhouts K. J., Tolner B., Bron S., Kok J., Venema G., Seegers J. F., (1991), Plasmid, 26 (1), 55-66.56. Gravesen A., Josephsen J., von Wright A., Vogensen F. K., (1995), Plasmid, 34, 105-118.57. Khunajakr N., Liu C.-Q., Dunn N. W., (1996), Direct Submission, ACCESSION U79032.58. Gravesen A., von Wright A., Josephsen J., Vogensen F. K., (1997), Plasmid, 38 (2), 115-127.59. Anba J., Bidnenko E., Hillier A., Ehrlich D., Chopin M. C., (1995), J. Bacteriol., 177 (13), 3818-3823.60. O’Sullivan D., Twomey D. P., Coffey A., Hill C., Fitzgerald G. F., Ross P. R., (2000), Mol. Microbiol.,

36 (4), 866-875.61. Liu C.-Q., Chia G. L., Dunn N. W., (1996), Direct Submission. ACCESSION U78967.62. Chikramane S. G., Dubin D. T., (1993), Direct submission ACCESSION L10909.63. Lebrun M., Audurier A., Cossart P., (1994a), J. Bacteriol., 176, 3040-3048.64. Lebrun M., Audurier A., Cossart P., (1994b), J. Bacteriol., 176, 3049-3061.65. van Kranenburg R., de Vos W. M., (1998), J. Bacteriol., 180 (20), 5285-5290.66. Kleerebezem M., van Kranenburg R., Tuinier R., Boels I. C., Zoon P., Looijesteijn E., Hugenholtz J.,

de Vos W. M., (1999), Antonie van Leeuwenhoek, 76, 357-365.67. Bernardi A., Bernardi F., (1981), Nucleic Acids Res., 9, 2905-2911.68. Bernardi A., Bernardi F., (1984), Nucleic Acids Res., 12 (24), 9415-9426.69. Yamaguchi K., Masamune Y., (1985), Mol. Gen. Genet., 200 (3), 362-367.70. Yamaguchi K., Yamaguchi M., (1984a), Gene, 29 (1-2), 211-219.71. Yamaguchi K., Yamaguchi M., (1984b), J. Gen. Appl. Microbiol., 30, 347-358.72. Vocke C., Bastia D., (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80 (21), 6557-6561.73. Brow M. A. D., Pesin R., Sutcliffe J. G., (1985), Mol. Biol. Evol., 2, 1-12.74. Gamas P., Chandler M. G., Prentki P., Galas D. J., (1987), J. Mol. Biol., 195, 261-272.75. Leong J. M., Nunes-Duby S., Lesser C. F., Youderian P., Susskind M. M., Landy A., (1985), J. Biol.

Chem., 260, 4468-4477.


BIOTECHNOLOGIA 3 (70) 118-143 2005 143

piotr walczak plazmidy bakterii mlekowych

Documents