1 Test per tube

                Product Catalog No: 25239­00

    ReaPan 34845         Reagent

                                                                     

      Manufactured by 

                                        

2

ReaPan 34845 ReagentINTENDED USE

The ReaPan 34845 reagent is a four color immunofluorescence stain for the   labeling   and   identification   of   helper/inducer   (CD4+) cytotoxic/suppressor   (CD8+)   cells   and   total   T­lymphocytes   (CD3+) combined with a precise number of fluorescent counting beads for absolute and   percentages   of   CD4+,   CD8+   and   CD3+   T­Cells   and   absolute lymphocyte counts. This reagent is intended to be used in a “lyse­no wash” protocol   for   flow   cytometry   analysis   of   erythrocyte­lysed   human   whole blood. 

SUMMARY AND EXPLANATION

The ReaPan 34845 reagent contains fluorescently labeled antibodies that bind   to   CD45,   CD3,   CD4   and   CD8   antigens   found   on   the   surface   of circulating leukocytes. 

The CD3 antigen is a complex of at least six proteins known collectively as 3

the T­cell receptor (TCR) complex. The antibody used in this reagent binds to the 20kDa ε  chain of this complex (1).

4

The CD4 antigen is a 59kDa protein. It interacts with class II molecules of the major histocompatibility  complex and  is  the primary receptor  for  the Human Immunodeficiency Virus (HIV) (2, 3).

The CD8 antigen is a complex consisting of two disulfide linked subunits. The antibody used  in  this  reagent binds  to  the 32kDa   subunit  of   theα  complex.   CD8   interacts   with   class   I   major   histocompatibility   complex molecules (2,3).

The CD45 antigen is a complex 180­220kDa transmembrane glycoprotein which   is   expressed   in   high   levels   on   leukocyte   cell   surfaces   and   its presence distinguishes leukocytes from non­haematopoietic cells (1).

Clinical RelevanceCells   that   are   both   CD3+   and   CD4+   are   identified   as   helper/inducer lymphocytes. Decreased CD4+CD3+ T­cell counts have been associated with some forms of immunodeficiency (such as HIV). Suppressor/cytotoxic lymphocytes are the subset of cells that have both CD3 and CD8 receptors (5­7).   Increased  CD8+CD3+ T­cell   counts  have  been observed   in  some 

5

cases of immunodeficiency (8)

PRINCIPLE OF THE PROCEDURE

The ReaPan 34845 reagent consists of murine monoclonal antibodies that specifically  recognize  the human leukocyte surface antigens CD3, CD4, CD8 and CD45. Each of the monoclonal antibodies is labeled with a unique fluorochrome.   Specific cell subsets are stained when blood is combined with the reagent and each monoclonal antibody binds to the binds to the cell  determinant molecules on the cell  surface. Specific cell  subsets are identified when passed through a flow cytometer laser beam.

The ReaPan 34845 reagent also contains a precise number of fluorescent beads. When the reagent is combined with a known volume of blood the reagent provides for the single platform determination of the absolute cell concentrations of the stained subsets. The volume of sample analyzed can be determined by multiplication of the total sample volume by the fraction of total beads that were detected during the analysis.

REAGENT6

The ReaPan 34845 reagent is formulated in buffered saline with sodium azide and stabilizer. It contains Allophycocyanin (APC)– labeled anti­CD4 monoclonal  antibody,  clone RPA­T4;  R­Phycoerythrin(PE)–  labeled anti­CD8   monoclonal   antibody,   clone   LT8;   Atto™488–   labeled   anti­CD3 monoclonal   antibody,   clone   UCHT1;   and   Peridinin­chlorophyll­protein Complex   (PerCP)–   labeled   anti­CD45   monoclonal   antibody,   clone HI30.The monoclonal antibodies used in the ReaPan 34845 were assigned these specificities at the 8th International Workshop on Human Leukocyte Differentiation   Antigens  (9).   A   precise   number   of   fluorescent   counting beads are included in the ReaPan 34845 reagent to allow single­platform determination   of   absolute   CD4+,   CD8+,   CD3+   T­cell   and   absolute lymphocyte counts.  The ReaPan 34845 reagent is provided in dried form and dispensed in flow cytometer compatible sample tubes with each tube containing   one   ready­to­use   test.  Fifty   (50)   tests   are   supplied   in   each ReaPan 34845 reagent package.

Precautions

1. Warning: The ReaPan 34845 reagent contains Sodium azide. 7

Sodium   azide   is   harmful   if   swallowed  (R22).   Wear   suitable protective   clothing  (S36).   If   swallowed,   seek   medical   advice immediately (S46). Contact with acids liberates toxic gas (R32). Azides should be flushed with large amounts of water during disposal to avoid deposits in lead or copper plumbing.

2. Warning:   All   blood   specimens   are   considered   biohazards. Handle   them as  if   they are  capable of   transmitting  infection and dispose off with proper precautions and accordance with governmental regulations.

3. The addition of the precise volume of blood is critical to obtain correct results. Use a calibrated pipette and operate according to the manufacturer’s instructions.

Storage and Handling 

1. Store the reagent at room temperature in a dry place. Do not use the reagent after the expiry date mentioned on the label.

2. Do not freeze or refrigerate the ReaPan 34845 reagent.3. The ReaPan 34845 reagent is light sensitive. Do not expose to 

direct light either during storage or when mixed with blood.8

4. Use the zip lock to reseal the reagent pouch after you have removed the desired number of  tests. Do not use the tubes beyond the expiration date indicated on the packaging.

Indication of Instability

The ReaPan 34845 reagent  is a dry glassy coating at the bottom of the reaction tube.   Do not use if  the reagents appears to be moist or  it  has become dislodged from the bottom of the reaction tube.

INSTRUMENT

The   ReaPan   34845   reagent   is   designed   for   use   on   a   flow   cytometer equipped   with   appropriate   computer   hardware   and   software.   ReaMetrix recommends the BD FACSCalibur™ or Accuri™ flow cytometer; however, results can be achieved using other platforms. The flow cytometer must be equipped with 488 nm and 635 nm lasers and must be capable of detecting light scatter (forward and side) and four­color fluorescence with emission detectable in four ranges: 515–545 nm, 562–607 nm, >650 nm, and 652–668 nm. It must be able to threshold or discriminate using the >650 nm 

9

channel.  Instrument  should  be  calibrated  by  setting  photomultiplier   tube voltages,  fluorescence compensation, and checking instrument sensitivity before use according to the manufacturer’s guidelines.

The user is responsible to optimize the performance of the reagent for use in   flow   cytometers   other   than   that   mentioned   above.  For   other   flow cytometers,   set  up   the  cytometer   for   four­color  acquisition   following   the manufacturer’s recommendations. Setup should include setting or checking PMT voltages, fluorescence compensation, and instrument sensitivity.

SPECIMEN COLLECTION

The blood sample  should  be collected  in  a  sterile  blood  collection   tube containing K3EDTA. Follow the collection tube manufacturer’s guidelines for the minimum volume of blood to be collected.

The anti­coagulated blood must  be stored at   room temperature  (20°C ­ 25°C) and should be stained and analyzed within 24 hours of draw.  

Interfering conditions10

Refrigerated   or   previously   fixed   blood   specimens   can   yield   erroneous results and should be rejected. Hemolyzed, aged, or partially clotted blood specimens can affect flow cytometer performance.

PROCEDURE

Reagent ProvidedReaPan 34845 reagent in a dried format

Reagents and materials required but not provided1. Blood collection tube containing K3EDTA2. Calibrated pipettes3. Vortex mixer4. Lysing SolutionA or similar blood fix/lyse solution 5. Sheath fluidB

6. 0.2µm filtered, deionized distilled water or Milli­Q waterC

7. Flow cytometer Calibration BeadsD

11

A. ReaLyse Lysing solution: ReaMetrix Catalog No: 25237­00

B. Sheath fluid: BD Catalog No.342003

C. Accuri Flow cytometer uses Milli­Q water/Distilled deionized water instead of Sheath fluid 

D. Calibration Beads: BD Catalog No. 340486

Assay Protocol

1. Mix blood sample  (invert  blood  tube at   least  10  times)  and reverse pipette 50µL of blood into the correctly labeled tube that contains the dry down reagent.

2. Gently vortex each tube for 30 seconds. Incubate for 30 minutes at room temperature.  Protect  the tube from direct light.

3. Add 450µL of 1X ReaLyse lysing solution  to each tube and vortex for 10 seconds. Return tubes to the dark for at least 15 minutes.

4. Vortex sample tube thoroughly (at low speed) and load onto cytometer for analysis.

12

Quality ControlCommercially available quality control whole blood control cells can be run each day. Established values can be used to assess reagent and system performance.

FLOW CYTOMETER ACQUISITION AND ANALYSIS

Start flow cytometer according to manufacturer’s instructions  (In the case of  FACSCalibur™,   the  instrument should be setup and calibrated using CaliBRITE™   beads   and   FACSComp™   software;   For   Accuri™   flow cytometer   instruments,   the   performance   of   the   instrument   should   be checked by Validation beads provided by Accuri.)

For BD FACSCalibur™ Flow Cytometer Instruments

1. Draw five dot­plot views – Refer Figure 1• View 1: Anti­CD45 PerCP (FL3) versus side scatter (SSC– 

Linear scale) 

13

• View 2:  Anti­CD3 Atto488  fluorescence  (FL1)  versus side scatter (SSC– Linear scale) of events gated as CD45+ (R1) from the View 1. 

• View   3:  CD4   APC  (FL4)   versus   CD3   Atto   488   (FL1)   of events gated as CD45+ (R1) from the View 1.

• View 4: CD8 PE (FL2) versus CD3 Atto 488 (FL1) of events gated as CD45+ (R1) from the View 1.

• View 5: Anti­CD8 PE (FL2) versus Anti­CD3 Atto488 (FL1). View­5   will   have   a   gate   (R3)   to   capture   the   fluorescent reference beads.  The beads have a high FL1 and FL2 Mean Fluorescence Intensity

2. Before acquisition adjust the FL3 threshold to minimize debris.3. Set the number of events to capture at 3000 for R­3 gate (View 

5) and start data acquisition. When 3000 beads are acquired in the gate R3, acquisition stops.

4. Gate  the brightest  CD45+ cell  cluster   in  View­1 and gate   the population   as   R1.   This   CD45+   cell   cluster   is   that   population which   has   the   lower   SSC   intensity   and   higher   FL3   mean 

14

fluorescence intensity. It represents the lymphocyte population. The Gate R1 is applied on View 2, 3 & 4.

5. Total CD3+ events can be identified in View 2 in R2.6. The CD4+ and CD8+ cell populations can be identified in View 3 

and View 4 in the upper right quadrants.7. The absolute count for each cell type can be calculated using the 

following equation, 

)µL in Volume(Test x Count) Bead (Gatedtest) per Count (Bead x Count) Cell (Gated

µL / Count Cell Absolute =

Where the Gated Cell count and Bead count are obtained from the Flow Cytometer analysis, and the Bead count per test from the test kit provided.

Example:If   the bead count  per  ReaPan 34845  test   is  50,000,  the volume of blood tested is 50µl,   the number of gated beads is 3,000 (Figure 1, View 5, R3 gated events), and the number of gated CD4+ T­cells is 1,500 (Figure 1, View 3, UR quadrant) then the absolute CD4+ T­cell count is 500 cell/µl.

15

µL / cells 50050 x 3000

50000 x 1500Count Cell CD4 Absolute ==

16

View 1 View 2

View 5

Figure 1. Dot plot views:  View 1: CD45 PerCP fluorescence (FL3 ­ log scale) versus side scatter (SSC – Linear scale) View 2: CD3 Atto488 fluorescence (FL1­ log scale) versus side scatter (SSC– Linear scale) View 3: CD4 APC fluorescence (FL4– log scale) versus CD3 Atto 488 (FL1– log scale) of events gated as CD45+ from View 1 View 4:  CD8 PE fluorescence (FL2­ log scale) versus CD3 Atto488 (FL1­ log scale) of events gated as CD45+ from View 1. View 5:  CD8 PE fluorescence (FL2­  log scale)  versus CD3 Atto488 (FL1 ­log scale).  R3 captures the fluorescent reference beads

For Accuri™ Flow Cytometer Instruments

1. Draw five dot­plot views – Refer Figure 2.

• View 1: CD45 PerCP (FL3­Log scale) versus side scatter (SSC – Linear scale)

17

View 3 View 4

• View 2: CD3 Atto488 fluorescence (FL1­Log scale) versus side scatter   (SSC – Linear scale) of  events gated as CD45+ (P1) from the View 1.

• View 3:  CD4 APC (FL4­ Log scale) versus CD3 Atto 488 (FL1­ Log scale) of events gated as CD45+ (P1) from the View 1.

• View 4:  CD8 PE (FL2­ Log scale)  versus CD3 Atto 488 (FL1­ Log scale) of events gated as CD45+ (P1) from the View 1.

• View  5:  CD8   PE   (FL2­   Log   scale)   versus   CD3   Atto488 (FL1­ Log scale) of all events from View 1. View­5 will have a gate (P2) to capture the fluorescent reference ReaCount beads.

Following table (Table­1) represents the Plot Specification Value to set the scales:

Table­1: Dot Plot View X & Y­Axis Scale Specifications

Dot Plot Views Axis Scale Min Value Max valueView 1 X­Axis FL3­Log scale 500 200,000

18

Y­Axis SSC­Linear scale 0 175,000

View 2X­Axis FL1­Log scale 500 500,000Y­Axis SSC­Linear scale 0 120,000

View 3X­Axis FL4­Log scale 50 1,000,000Y­Axis FL1­Log scale 200 1,000,000

View 4X­Axis FL1­Log scale 50 500,000Y­Axis FL2­Log scale 500 500,000

View 5X­Axis FL1­Log scale 50 500,000Y­Axis FL2­Log scale 500 500,000

2. In the Run Limit section of the Instrument template panel, set the instrument   Threshold   on   FL3   and   set   the   value   to   1000. Before/After acquisition adjust the FL3 Threshold value to minimize debris.

3. Click on the Set Colour Compensation to open the compensation matrix and set the compensation values as per Figure 3.

4. In the Run Limit section of the Instrument template panel, set the fluidics Flow rate on MEDIUM. Set the number of events to capture at 3000 for P2 gate bead events (Figure 2; View 5)

19

5. Vortex sample  tube  thoroughly  at   low speed and  load onto   flow cytometer for acquisition. When 3000 bead events are acquired in the gate P2, acquisition stops.

6. Gate the brightest CD45+ cell cluster in View­1 and adjust the P1 gate around the lymphocyte population. This CD45+ cell cluster is that population which has the lower SSC intensity and higher FL3 mean   fluorescence   intensity.   It   represents   the   lymphocyte population. The Gate P1 is applied on View 2, 3 and 4.

7. CD3+ cell clusters are separated using gate R1 (View­2, Figure 2). The CD3+ cell population has the lower SSC intensity and higher FL1 mean fluorescence intensity.

8. In View­3 (Figure 2) cell clusters are separated using quadrant gate Q1. The CD4+CD3+ cell  populations can be  identified  in  View­3 (Figure 2) in the upper right quadrant Q1­UR as double positives.

9. In View­4 (Figure 2) cell clusters are separated using quadrant gate Q1. The CD8+CD3+ cell  populations can be  identified  in  View­4 (Figure 2) in the upper right quadrant Q1­UR as double positives

10. View­5 (Figure 2); fluorescent reference beads are separated using gate P2. The beads have a high FL1 and FL2 Mean Fluorescence 

20

Intensity.11. The absolute count for each cell type can be calculated using the 

following equation.

)µL in Volume(Test x Count) Bead (Gatedtest) per Count (Bead x Count) Cell (Gated

µL / Count Cell Absolute =

Where the Gated Cell count and Bead count are obtained from the Flow Cytometer analysis and the Bead count per test from the test kit provided.Example:If the bead count per ReaPan 34845 test is 50,000, the volume of blood tested is 50µl, the number of gated beads is 3,000 (Figure 2, View 5, P2 gated events), and the number of gated CD4+ T­cells is 1,500 (Figure 2, View 3,  Q1­UR quadrant)   then   the  absolute  CD4+  T­cell   count   is  500 cell/µl.

µL / cells 50050 x 3000

50000 x 1500Count Cell CD4 Absolute ==

21

View 1 View 2

22View 3 View 4

View 5

Figure 2.  Dot  plot  views:  View 1:  CD45 PerCP  fluorescence  (FL3  ­   log  scale) 

versus side scatter (SSC – Linear scale); View 2: CD3 Atto488 fluorescence (FL1­ 

log scale) versus side scatter (SSC– Linear scale) of events gated as CD45+ (P1) 

from the View 1;  View 3: CD4 APC fluorescence (FL4– log scale) versus CD3 Atto 

488 (FL1– log scale) of events gated as CD45+ (P1) from the View 1; View 4: CD8 

PE fluorescence (FL2­  log scale) versus CD3 Atto488 (FL1­  log scale)  of events 

gated as CD45+ (P1) from the View 1;  View 5:  CD8 PE fluorescence (FL2­  log 

scale) versus CD3 Atto488 (FL1 ­log scale). R3 captures the fluorescent reference beads

23

Figure 3: Accuri Flow cytometer Compensation settings for ReaPan 34845 Reagent24

PERFORMANCE CHARACTERISTICS

The performance data for ReaPan 34845  reagent was generated by undertaking clinical validation.

Accuracy

The absolute counts for CD4+, CD8+ and CD3+ T­Cells determined using ReaPan 34845 reagent  were compared with Dry­Tri  T­STAT CD3/CD4/CD8 reagents (Figure 4, Figure 5 and Figure 6 ) using a BD FACSCalibur™ flow cytometer.

The absolute counts for CD45+ (Absolute Lymphocyte Count – ALC) determined by the ReaPan 34845 were compared with a hematology counter (Figure 7). 

25

Figure4:  Correlation of  absolute CD4+ T­Cell  counts  determined using ReaPan 26

34845   compared   to   a   commercially   available   reagent   Dry   Tri   T­STAT CD3/CD4/CD8

27

Figure   5:   Correlation   of   absolute   CD8+   T­Cell   counts   determined   using   the 

ReaPan 34845 compared to a commercially available reagent Dry Tri T­STAT CD3/CD4/CD8

28

Figure 6: Correlation of absolute CD3+ T­Cell counts (Total T­Cells) determined 

using the ReaPan 34845 compared to a commercially available reagent Dry Tri T­STAT CD3/CD4/CD8

29

Figure 7:  Correlation of CD45+ cell counts (ALC) determined using the ReaPan 

34845 compared to the lymphocyte count obtained from a Hematology analyzer

Specificity

The antigen specificities  for  the CD3, CD4, CD8 and CD45 monoclonal antibodies   used   in   the   ReaPan   34845   reagent   were  confirmed   by   the Human   Leukocyte   Differentiation   Antigens   (HLDA)   Workshops.   After conjugation of the antibodies no additional cross­reactivity was observed.

LIMITATIONS

1. The ReaPan 34845 reagent has only been validated with K3EDTA treated whole blood.

2. Laboratories   should   establish   their   own   reference   ranges   for   the absolute counts obtained using the ReaPan 34845 reagent.

BIBLIOGRAPHY30

1. Knapp W, Dorken B, Gilks WR, Rieber EP, Schmidt RE, Stein H, & von   dem   BorneAEGKr,   eds.  Leukocyte   typing   IV.     White   cell differentiation antigens.  Oxford university press 1989

2. Reinherz  EL,  Meuer SC,  and Schlossman SF.  The delineation of antigen   receptors   on   human   T   lymphocytes.   Immunology   Today, 1983, 4:5­8.

3. Fauci AS: The human deficiency virus: Infectivity and mechanism of pathogenesis. Science, 1988, 239:617­622.

4. Reinherz EL and Schlossman SF. The differentiation and function of human T lymphocytes. Cell, 1980, 19:821­827.

5. Phillips A, Lee C, Elford J, et al.  Serial CD4 lymphocyte counts and the development of AIDS.  Lancet 1991, 337:389­392.

6. Nicholson J.   Use of flow cytometry in the evaluation and diagnosis of primary and secondary immunodeficiency diseases.  Arch. Pathol. Lab. Med.  1989, 113:598­605

7. Yarchoan R, Venzon D, Pluda J, et al.   CD4 count and the risk of death  in patients  infected with HIV receiving antiretroviral   therapy. 1991, 115:184­189.

31

8. Giorgi   J   &   Detels   R.     T­cell   subset   alterations   in   HIV­infected homosexual   men:   NIAID   multicenter   AIDS   cohort   study.     1989, 52:10­18.

9. Heddy   Z,   Swart   B,   Nicholson   I,   &   Voss   E,   eds.   Leukocyte   and stromal cell molecules; the CD markers.  John Wiley & Sons 2007.

WARRANTY

This  product   is warranted only  to  conform  to  the quantity  and contents stated on the label at the time of delivery to the customer. There are no warranties, expressed or implied, that extend beyond the description on the label of the product. ReaMetrix’s sole liability is limited to replacement of the product. ReaMetrix is not liable for property damage, personal injury, or economic loss caused by the product. Note:   FACSCalibur,   CaliBRITE,   FACSComp   are   all   registered   trade   names   of  Becton­Dickinson; Accuri C6 flow cytometer is the trade name of Accuri.

32

33

Manufactured by ReaMetrix India Pvt. Ltd.Manufacturing License Number: KTK/25/519/200650­B, II Phase, Peenya Industrial AreaPeenya, Bangalore 560058, IndiaPh: +91­80­28378693/5, Fax: +91­80­41172451E­mail: info@reametrix.com, www.reametrix.com

Rev No. 3.0,  22­Sep­09

34