Phytotoxische Wirkungen von gelöster organischer Substanz (DOM) mit Paraquat, 2,4-D und Naphthalin

vorgelegt von Diplom-Ingenieurin, Master of Science,

Cornelia Andersohn

von der Fakultät VII - Architektur Umwelt Gesellschaft der Technischen Universität Berlin

zur Erlangung des akademischen Grades Doktorin der Naturwissenschaften

- Dr. rer. nat. -

genehmigte Dissertation

Berichter: Prof. Dr. agr. Dr. rer. nat. habil. Berndt-Michael Wilke Berichter: Prof. Dr. agr. Dr. agr. habil. Wilfried Pestemer Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 22.01.2002

Berlin 2002 D 83

Danksagung Ich danke ...

Prof. Wilke für die Überlassung des Themas, das eine Herausforderung für mich war und die personelle Unterstützung, die er mir zukommen ließ. Prof. Pestemer für die unerläßliche Hilfestellung bei dem Know-how der Pflanzentests und für sein Wohlwollen, das er mir über die ganze Strecke dieser Arbeit entgegengebracht hat. Prof. Pestemer und Frau Dr. Gabriela Reese-Stähler für die ermöglichte Teilnahme an dem FuE-Vorhaben "Praxisgerechte Möglichkeiten und Verfahren zur Vermeidung des Entrags von Pflanzenschutzmitteln in Oberflächenbewässer durch Abtrift und Abschwemmung", Standort Klostergut Lamspringe, Frau Dr. Gabriela Reese-Stähler für die Organisation der Probenahme und die fachliche und moralische Unterstützung. Herrn Dr. Bernd Rodemann für die Probenahme in Lamspringe. Herrn Dr. Norbert Litz vom UBA, der die Nutzung des TOC-Gerätes ermöglichte und der AG Szewzyk, insbesondere Wolfgang Wenzel, dass er mir das Fluoreszenzspektrometer zur Verfügung stellte. Dr. Bernd Raber für die Einweisung und Methodendetails in die DOM-Fraktionierung nach Leenheer (1981). Herrn York Hilger für die Hilfestellung bei der statistischen Auswertung. des weiteren Prof. Bornkamm, Frau Dr. Gabriela Reese-Stähler und meinen Betreuern für die kritisch-konstruktive Durchsicht des Manuskriptes. Maike Fuchs für das schöne digitale Titelbild und die Abbildung 7. meiner Tochter Helen, die mich im Tal bitterer Niederlage erreichte und mir viel Kraft, Freude, Mut gegeben und mir Abstand verschafft hat, von den alltäglichen Forschersorgen. Cornelia Krämer, die mir geholfen hat, mit all dem privaten Druck fertig zu werden. Ohne sie und die unvergleichliche, stetige und selbstlose Hilfe meiner Kollegen, insbesondere Ruth See, Maike Fuchs, Regina Seyed-Mansouri, Susanne Fleischmann und Volker Jessen hätte ich es wohl nicht geschafft, weder meinen Umzug noch diese Arbeit.

Maike Fuchs und Regina Seyed-Mansouri möchte ich nochmals erwähnen, denn sie haben mir mit all ihrer Erfahrung, ihrem Talent und viel Ausdauer zur Seite gestanden und ihnen verdanke ich das Zustandekommen und Gelingen dieser Arbeit in besonderem Maße.

Abstract The combined effect of dissolved organic matter (DOM) from grassland top soil (0-10 cm) and wheat straw with two herbicides, the cationic, bivalent Paraquat and the acid 2,4-D as well as the two-ring polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH), Naphthalene, was studied on turnip (Brassica rapa ssp. rapa) with 5 day growth tests in hydroculture in a phytotron for 16 hours at 22°C and daylight and for 8 hours at 16°C in the dark. The humic hydrophobic fraction (fulvic and humic acids) was determined using XAD-8 resin. An interaction between the xenobiotics and DOM was detected by fluorescence quenching. Using two-factor analysis of variance, the influence of xenobiotic-concentration, source and concentration of DOM on the combined effect was determined. The following findings can be stated: A qualitative variability, responsible for the potential of interaction with xenobiotics could not be detected by defining the quantity of humic substances bound to XAD-8 resin at pH 2. No identical DOM solutions could be prepared using the same materials and procedure at different times. The time of acquirement of grassland soil for DOM preparation is evident for its effect on plant growth. Paraquat and 2,4-D has been complexed by both DOM sources, but 2,4-D to a much lower extend. Naphthalene was not always complexed by straw-DOM, but was never complexed by grassland soil-DOM. A significant effect of the xenobiotic concentration and DOM in the combined effect could only be proved for 2,4-D and Naphthalin. Beside the factors xenobiotic concentration and DOM for the explanation of the combined effect another factor of on average 33% couldn't be explained yet. The combined effects of all xenobiotics were fairly similar. It dominated the antagonistic effect with on average 42%, followed by the synergistic negative effect (38%), the synergistic positive effect (12%) and the additive effect (10%). Due to the high individual variability of identically extracted DOM, the effect of DOM on the phytotoxicity of an organic xenobiotic cannot be predicted from its quantitative humic content. In a surplus study DOM from a soil of conventional field was examined for its phytotoxicity. Results show, that xenobiotics might be captured within the soil layer for a period longer than its expected effective time and then be mobilized by DOM after a series of erosive rainfalls, remaining ecotoxicologically active. In Hydrokultur wurde an Herbstrübe (Brassica rapa ssp. rapa) die Kombinationswirkung von löslicher organischer Substanz (DOM) aus Grünlandoberboden (0-10 cm) und aus Weizenstroh mit zwei Herbiziden, dem kationischen, zweiwertigen Paraquat und der Säure 2,4-D sowie einem zweiringigen polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoff (PAK), Naphthalin, mittels Wachstumstests von 5 Tagen im Klimaschrank, bei 22 °C für 16 Stunden hell und bei 16 °C für 8 Stunden dunkel, gestestet. In DOM wurde der Anteil von hochmolekularen, hydrophoben Bestandteilen (Fulvo- und Huminsäuren) durch XAD-8 Fraktionierung bestimmt. Eine Interaktion zwischen Xenobiotikum und DOM wurde mittels Fluoreszenzquenching untersucht. Mithilfe einer zweifaktoriellen Varianzanalyse wurden die Einflüsse von Xenobiotikum-Konzentration und von Herkunft und Konzentration von DOM auf die Kombinationswirkung ermittelt. Es ließen sich folgende Schlüsse ziehen: Eine qualitative interaktionsrelevante Variabilität von DOM ließ sich durch den Anteil der Huminstoff-Fraktion, die bei pH 2 an das XAD-8 Harz gebunden wird, nicht feststellen. Es lassen sich aus demselben Material und mit denselben Methoden zu verschiedenen Terminen nicht identische DOM herstellen. Der Zeitpunkt der Grünlandbodengewinnung ist entscheidend für die Wirkung des aus ihm gewonnenen DOM auf das Pflanzenwachstum. Paraquat und 2,4-D wurden von beiden DOM-Quellen komplexiert, aber 2,4-D in einem viel geringeren Maße. Naphthalin wurde nicht immer durch Stroh-DOM komplexiert, von Grünlandboden-DOM dagegen gar nicht. Ein signifikanter Einfluß von Xenobiotika-Konzentration und DOM auf die Kombinationswirkung konnte für 2,4-D und Naphthalin

nachgewiesen werden. Neben den genannten Einflußfaktoren Xenobiotika-Konzentration und DOM für die Kombinationseffekte konnte ein Einflußfaktor von durchschnittlich 33 % bisher nicht erklärt werden. Die Auswertung der Kombinationswirkung sieht bei allen Xenobiotika etwa gleich aus. Durchschnittlich fielen die Kombinationswirkungen überwiegend antagonistisch aus (42 %), direkt gefolgt von synergistisch negativ (38 %), 12 % fielen synergistisch positiv und 10 % additiv aus. Durch die Verschiedenartigkeit der Zusammensetzung der identisch extrahierten DOM, läßt sich eine Kombinationswirkung durch vorherige quantitative Analyse der Huminstoffe allein jedoch nicht prognostizieren. Zusätzlich wurde eine Studie an DOM aus konventionell bewirtschaftetem Ackerboden durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass Xenobiotika über den erwarteten Wirkungszeitraum hinaus im Boden eingeschlossen oder gebunden sein können und nach einer Serie von erosiven Regenfällen durch DOM wieder mobilisiert werden können und zwar als aktiv ökotoxische Substanzen.

INHALTSVERZEICHNIS Verzeichnis der Abkürzungen.................................................................................................... 3 Verzeichnis der Abbildungen..................................................................................................... 4 Verzeichnis der Tabellen............................................................................................................ 5 1 Problemstellung.................................................................................................................. 6 2 Stand der Forschung........................................................................................................... 7

2.1 Gelöste organische Substanz (DOM)............................................................................. 7 2.1.1 Definition................................................................................................................ 7 2.1.2 Gewinnung ............................................................................................................. 8 2.1.3 Charakterisierung von DOM ................................................................................. 9 2.1.4 Ökologische Bedeutung........................................................................................ 10

2.2 Phytotoxizität ............................................................................................................... 18 2.2.1 Definition.............................................................................................................. 18 2.2.2 Testmethoden........................................................................................................ 18 2.2.3 Statistische Auswertung........................................................................................ 20

2.3 Kombinationswirkungen .............................................................................................. 20 2.4 Wirkung von DOM auf Pflanzen ................................................................................. 21 2.5 Wechselwirkungen von DOM und organischen Xenobiotika auf Pflanzen ................ 22 2.6 Wirkung von Paraquat, 2,4-D und Naphthalin auf Pflanzen........................................ 23

3 Experimentelle Arbeit ...................................................................................................... 24 3.1 Materialien und Methoden ........................................................................................... 24

3.1.1 Extraktion von DOM ............................................................................................ 24 3.1.2 Bestimmung von DOC (dissolved organic carbon).............................................. 24 3.1.3 Charakterisierung von DOM ............................................................................... 25 3.1.4 Kriterien zur Auswahl der verwendeten DOM-Quellen....................................... 30

Angaben in (%), Standardabweichung in Klammern unter den Werten (n=5)........................ 30 3.1.5 Kriterien zur Auswahl der organischen Xenobiotika........................................... 31 3.1.6 Kriterien zur Auswahl der zu testenden Konzentrationen.................................... 33 3.1.7 Bindungstests von DOM mit organischen Xenobiotika........................................ 33 3.1.8 Pflanzentestdesign................................................................................................ 34 3.1.9 Kriterien zur Auswahl der Testpflanzen............................................................... 38 3.1.10 Kombinationspflanzentest von DOM und organischen Xenobiotika ................... 42 3.1.11 Statistische Auswertung........................................................................................ 43

3.2 Ergebnisse .................................................................................................................... 43 3.2.1 Charakterisierung von DOM ............................................................................... 43 3.2.2 Bindungstests von DOM mit organischen Xenobiotika........................................ 45 3.2.3 Konzentrations-Wirkungskurven der Prüfsubstanzen mit Herbstrübe (Brassica

rapa ssp. rapa) ..................................................................................................... 52 3.2.4 Kombinationspflanzentests von DOM und organischen Xenobiotika.................. 53

3.3 Exkurs: Pflanzentests an mit Pflanzenschutzmitteln behandelter Ackerboden-DOM. 61 3.3.1 Problemstellung, Material und Methoden ........................................................... 61 3.3.2 Ergebnisse ............................................................................................................ 63

4 Diskussion ........................................................................................................................ 69 4.1 Bindung von DOM an organische Xenobiotika........................................................... 69 4.2 Kombinationspflanzentests von DOM und organischen Xenobiotika......................... 70 4.3 Bedeutung der Ergebnisse für natürliche Bedingungen............................................... 72

5 Ausblick ........................................................................................................................... 73

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Anhang 1 Physikalische und chemische Eigenschaften der Böden und des Leitungswassers ...............................................................................................................................75 Anhang 2 Fluoreszenzspektren ............................................................................................. 76 Leitungswasser ......................................................................................................................... 77 Grünlandboden-DOM .............................................................................................................. 78 Stroh-DOM............................................................................................................................... 79 Literaturverzeichnis.................................................................................................................. 88 Lebenslauf .............................................................................................................................. 108

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Verzeichnis der Abkürzungen C-Quelle Kohlenstoff als Nährstoffquelle C/N Kohlenstoff-Stickstoff-Verhältnis DOM engl. dissolved organic matter, deutsch: lösliche organische Substanz DOC engl. dissolved organic carbon, deutsch: gelöster organischer Kohlenstoff EC10 10-prozentiger Effekt des Toxizitätskriteriums gegenüber der Kontrolle EC50 50-prozentiger Effekt des Toxizitätskriteriums gegenüber der Kontrolle EPA Environmental Protection Agency HPLC High Performance Liquid Chromatography kDa Kilo Dalton = 1000 Dalton OECD Organisation of Economic Cooperation and Development PAK Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe PCB Polychlorierte Biphenyle PSM Pflanzenschutzmittel NOEC no observed effect concentration, Konzentration,

bei der noch kein Effekt, bzw. bis zu 10 % Effekt sichtbar ist. XAD-8 ein hydrophobes, aromatisches Methylmethacrylat-Copolymer Harz

der Fa. Amberlite

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Verzeichnis der Abbildungen Abbildung 1: Schema der DOM-Fraktionierung nach Leenheer (1981)................................ 27 Abbildung 2: Beispiel von 3-D Fluoreszenzspektren als Fingeabdrücke (a) Stroh, (b)

Grünlandboden, (c) Leitungswasser ................................................................ 28 Abbildung 3: Schema des Fluoreszenz-Emissionsspektrums ................................................ 29 Abbildung 4: 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure "2,4-D", Strukturformel.................................... 31 Abbildung 5: 1,1'-Dimethyl-4,4'-bipyridylium-dikation, "Paraquat", Strukturformel............. 31 Abbildung 6: Naphthalin, Strukturformel .............................................................................. 32 Abbildung 7: Schematische Darstellung der Keimungsphase (a) und des

Pflanzenwachstumstests (b)............................................................................. 36 Abbildung 8: Pflanzentest in Hydrokultur: a) Start der Keimung, b) Ende der

Keimungsphase (Brassica rapa ssp. rapa) und c) Start des Pflanzenwachstumstests .................................................................................. 37

Abbildung 9: Konzentrations-Wirkungskurven für 6 Testpflanzen mit 2,4-D ...................... 39 Abbildung 10: Konzentrations-Wirkungskurven für 6 Testpflanzen mit Paraquat.................. 39 Abbildung 11: Phytokopien Herbstrübe (Brassica rapa ssp. rapa).................................... 40 Abbildung 12: Phytokopien Kresse (Lepidium sativum) .................................................... 41 Abbildung 13: Kombinationswirkung ermitellt durch (a) Isobologramm und (b)

Wirkungsdiagramm ......................................................................................... 42 Abbildung 14: Dynamisches Quenching von Naphthalin durch Grünlandboden-DOM

(25.07.01),........................................................................................................ 46 Abbildung 15: Statisches Quenching von Naphthalin durch Stroh-DOM (25.07.01), ............ 46 Abbildung 16: Dynamisches Quenching von Naphthalin durch Stroh-DOM (19.07.01), ....... 47 Abbildung 17: Statisches Quenching von Grünlandboden-DOM durch Paraquat (19.07.01) . 48 Abbildung 18: Statisches Quenching von Grünlandboden-DOM durch 2,4-D (19.07.01),..... 48 Abbildung 19: Statisches Quenching von Stroh-DOM durch Paraquat (18.07.01), ................ 49 Abbildung 20: Statisches Quenching von Stroh-DOM durch 2,4-D (18.07.01), ..................... 49 Abbildung 21: Quenching von Grünlandboden-DOM durch Paraquat (15.12.00), ................. 50 Abbildung 22: Quenching von Grünlandboden-DOM durch 2,4-D (15.12.00),...................... 50 Abbildung 23: Fluoreszenz von Grünlandboden-DOM oberes Spektrum und Fluoreszenz von

Leitungswasser unteres Spektrum (9.04.01).................................................... 51 Abbildung 24: Fluoreszenz von Stroh-DOM oberes Spektrum und Fluoreszenz von

Leitungswasser unteres Spektrum (18.07.01).................................................. 51 Abbildung 25: Konzentrations-Wirkungskurven für die Prüfsubstanzen ................................ 52 Abbildung 26: DOM-Wirkungen in den Kombinationstests.................................................... 54 Abbildung 27: Einflußfaktoren auf die Kombinationswirkungen............................................ 60 Abbildung 28: Beprobung Lamspringe, Acker "Sackkuhle" entlang Talwegerosion Nr. 5,

siehe Karte vom 18.05.97 (aus: Isringhausen et al. 1999)............................... 62 Abbildung 29: Vergleich der DOM-Wirkung auf die Pflanzensproßbiomasse (Lamspringe). 64 Abbildung 30: DOC-Werteverteilung (Lamspringe), .............................................................. 64 Abbildung 31: Korrelation (nach Pearson) DOC-Werte und Sproßgewichte, "Sackkuhle" .... 65 Abbildung 32: Monatlicher Niederschlag April-Dezember 1998 (Lamspringe) ..................... 65 Abbildung 33: Niederschlagsereignisse im September 1998 (Lamspringe) ............................ 66 Abbildung 34: Effekte der DOM-Verdünnung auf die Pflanzensproßbiomasse (Lamspringe)68 Abbildung 35: Kombinationswirkungen der Herbizide Paraquat (a) und 2,4-D (b) mit Stroh-

und Grünlandboden-DOM............................................................................... 71 Abbildung 36: Kombinationswirkung des PAK Naphthalin mit Stroh- und Grünlandboden-

DOM................................................................................................................ 72

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Verzeichnis der Tabellen Tabelle 1: DOM-Gewinnungsmethoden (nach Maxin 1992) .................................................... 8 Tabelle 2: Qualitative Zusammensetzung verschiedener DOM-Quellen nach der XAD-8-

Fraktionierung.................................................................................................. 30 Tabelle 3: Übersicht über die chemisch-physikalischen und toxischen Eigenschaften der

ausgewählten organischen Xenobiotika .......................................................... 32 Tabelle 4: Alterungsversuch von Grünlandboden-DOM bei 5 °C........................................ 43 Tabelle 5: Variabilität von Grünlandboden-DOM und Stroh-DOM-Extrakten.................... 44 Tabelle 6: EC10 und EC50-Werte, angegeben in mg L-1 für die Prüfsubstanzen, getestet an

Herbstrübe (Brassica rapa ssp. rapa).............................................................. 53 Tabelle 7: Kombinationswirkung, ermittelt durch das Wirkungsdiagramm (vgl. Abb. 35+36)

......................................................................................................................... 55 Tabelle 8: Einzelwirkung von DOM in den Kombinationstests (vgl. Tab. 7) ...................... 56 Tabelle 9: Prozentualer Anteil der Kombinationswirkungen von DOM mit 2,4-D, Paraquat

und Naphthalin................................................................................................. 57 Tabelle 10: Einflußfaktoren am Kombinationseffekt (in %), Korrelationen von Xenobiotika-

Konzentration und DOM-Wirkung (2-faktorielle Varianzanalyse), ............... 59 Tabelle 11: XAD-8 Fraktionierung der Bodenlösungen (Lamspringe) .................................. 66

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1 Problemstellung Die Folgen der Anwendung von Pflanzenschutzmitteln und der Anreicherung luftbürtiger aromatischer Xenobiotika (z.B. PAK1) sind lange Zeit als durch Bindung an Humus oder Tonmineralien unschädlich gemachtes Problem betrachtet worden. Bereits Anfang der 70er Jahre vermuteten Ogner & Schnitzer (1970a) und Ballard (1971), dass Huminstoffe an der Mobilisierung der organischen Xenobiotika beteiligt sind. Mitte der 70er Jahre konnten, durch die Einführung der HPLC2, Spuren von Herbiziden und andere organischen Xenobiotika in Oberflächengewässern und Grundwasser nachgewiesen werden. Es stellte sich also die Frage, warum diese Stoffe nicht im Boden gebunden blieben und wie sie ins Wasser gelangen konnten. Ein Jahrzehnt später konnten dann Gjessing & Berglind (1981), Caron et al. (1985) und McCarthy & Zachara (1989) beweisen, dass gelöste organische Substanz als Lösungsmittel fungiert, gebundene Xenobiotika mobilisieren und transportieren kann. Im geringer gepufferten aquatischen Ökosystem traten die Schädigungen durch Xenobiotika am deutlichsten zutage. Die Forschung des toxikologischen Einflusses von DOM im aquatischen Bereich hat deshalb auch mit inzwischen über 50 Jahren die längste Tradition (Tipping 1990, Petersen 1991 zitiert in Campbell et al. 1997). Bisher wurde auch nach dieser enormen Zeit, bis auf den Nachweis, dass gebundene hydrophobe Xenobiotika die Toxizität vermindern können, wenig über die Wirkungsweise von DOM mit organischen Xenobiotika herausgefunden. Im terrestrischen Bereich wurden solche Untersuchungen bisher nur in geringem Umfange von der Arbeitsgruppe von Elisabetta Loffredo (1994-1997) mit extrahierten Humin- und Fulvosäuren jedoch nicht mit DOM durchgeführt. Das Ziel dieser Arbeit ist eine Annäherung an die systematischen Wirkungsweisen von DOM in der terrestrischen Ökotoxikologie organischer Xenobiotika. Da DOM seinen Ursprung im Boden hat und dort auch die Xenobiotika gespeichert sind, versucht diese Arbeit eine Antwort zu finden, wie sich verschiedene DOM-Quellen auf die Toxizität unterschiedlich geladener und ungeladener Xenobiotika auswirken und welchen Einfluß deren Bindung an DOM hierbei hat. Das komplizierte Zusammenwirken verschiedener Komponenten im Boden macht es unmöglich eine Wirkung von DOM im Boden direkt nachzuweisen. Um das Problem der Bindung und Wechselwirkungen mit anderen Bodenkomponenten zu unterbinden, wurden die Tests daher in Bodenlösungen durchgeführt. Damit konnte eine relativ3 statische Beziehung zwischen Pflanzen und Bodenlösung hergestellt werden, um die Wechselwirkung von DOM mit verschiedenen Xenobiotika isoliert betrachten zu können. Als Testorganismen für terrestrische Ökotoxikologie wurden Gefäßpflanzen ausgewählt, weil sie die quantitativ größten Primärproduzenten terrestrischer Ökosysteme sind. Mikroorganismen sind zwar unmittelbare Folgekonsumenten, haben aber den großen Nachteil, dass für sie ein nur schwer bestimmbarer Anteil an DOM eine direkte C-Quelle, also Nährstoff zur Reproduktion sein kann. Somit ist bei positiven Wechselwirkungen von Xenobiotika mit DOM nicht eindeutig zu klären, ob sie auf mikrobiell verwertbares DOM, oder auf den Einfluß von DOM auf ein schädlich wirkendes Xenobiotikum zurückzuführen sind.

1 PAK polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe 2 HPLC High Performance Liquid Chromatography 3 Die Beziehung ist deshalb nur relativ statisch, weil die Pflanze durch Exsudate Einfluß auf die Bodenlösung

ausübt.

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2 Stand der Forschung 2.1 Gelöste organische Substanz (DOM4) 2.1.1 Definition Die gelöste organische Substanz ist definiert als die Summe aller natürlichen (regen)wasserlöslichen Substanzen, die im Boden, in Niederschlag und Gewässern nachweisbar sind. Natürlich vorkommende mittlere Konzentrationen liegen im Bereich von 0-60 mg L-1 DOC. Diese Werte werden nur im Stammabflußwasser, bzw. in Torfböden nach lang anhaltenden Trockenperioden deutlich überschritten (Dalva & Moore 1991). Um die in echter Lösung befindlichen Anteile zu erfassen, ist eine Filterung der Lösung durch Membranen mit 0,45 µm Porengröße vorgeschrieben (Malcolm & McKinley 1972). Allerdings werden damit nicht alle Kolloide ausgeschlossen (Aiken & Cotsaris 1995). Kolloidgrößen streuen im Bereich von 0,01-10 µm (Sposito 1998). Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigen, dass Huminsäuren in den kolloidalen Bereich fallen, jedoch nicht alle Fulvosäuren (Stevenson 1982). Der fließende Übergang von Fulvo- zu Huminsäuren stellt auch ein Kontinuum dar von gelösten Partikeln über hydrophile kolloidale Partikel hin zu hydrophoben unlöslichen Makromolekülen (Buffle 1977). Kohlenstoffverbindungen, die nach der 0,45 µm Filterung erfaßt werden, sind einerseits chemisch definierte Verbindungen, wie Mono- und Polysaccharide, Phenole (Mc Claugherty 1983, Kuiters & Sarink 1986, Marschner 1991, Tadano et al. 1992) und Polyphenole (Candler et al. 1988, Guggenberger 1988), aliphatische Säuren, aromatische Aminosäuren und deren Polymerisationsprodukt, die Peptide (Sposito 1998) und andererseits chemisch undefinierbare organische Säuren (Humin- und Fulvosäuren, vgl. Kap. 3.1.3 und 3.1.4) (Thurman 1985a). Zudem beinhaltet diese künstlich festgelegte "gelöste" Phase auch Biota, wie Bakterien und Viren (Suffet et al. 1994). Grundsätzlich kann man DOM nicht generell charakterisieren, weil sie abhängig von Herkunft, Zeitpunkt der Gewinnung und Konzentration ist (Devitt & Wiesner 1998). Boden-DOM besteht zu rund 50 % aus Huminstoffen, der Rest aus chemisch definierbaren Verbindungen (Herbert & Bertsch 1995). In Oberflächengewässern macht der Huminstoffanteil 60-80 % aus (Boggs et al. 1985, zitiert in Matthews et al. 1995) in limnischen Klargewässern rund 50 % (Malcolm 1985), im Pazifischen Ozean 90 % (Buffle 1977), wobei im Pazifischen Ozean nur ein geschätzter Anteil von 0,7 % DOM terrestrischen Ursprungs ist (Opsahl & Benner 1997). Nach Martin-Mousset et al. (1997) machen die Fulvosäuren 90 % des Huminstoffanteils von DOM in Oberflächengewässern aus. McKnight et al. (1992) fanden an verschiedenen Orten eines Flusses Anteile von 85-88 % Fulvosäuren an den Huminsstoffen. Den Rest stellen die Huminsäuren. Quellen von DOM sind lösliche Stoffe aus den Humusstoffen im Boden, Pflanzenexsudate5, lösliche Stoffe aus der verrottenden Streuauflage des Böden, durch Insekten freigelegte und durch Regenwasser ausgewaschene Pflanzensäfte (Moore 1989), sowie Exkrete der Bodenfauna und lysierte Nekrobiomasse (Zsolnay 1996). Die Zusammensetzung von DOM 4 DOM dissolved organic matter 5 Bei Pflanzenexsudaten handelt es sich überwiegend um hydrophile Saccharide, Aminosäuren, niedermolekulare

organische Säuren, Fettsäuren, Enzyme (Curl & Truelove 1986); aber auch um hydrophobe Phenole (Wittenmayer & Gransee 1992). Bei den Wurzelspitzen-Mucilagen sind es überwiegen lipophilen Polysaccharide (Curl & Truelove 1986). Bei ozeanischen Algen wurden ebenfalls überwiegend hochmolekulare Polysaccharide als Exsudate nachgewiesen, mit Molekularegrößen >10 kDa (Amon & Benner 1994, Vieira et al. 1998).

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hängt sehr stark vom Ausgangsmaterial des Humus, also der Vegetationsdecke ab. Rostad & Leenheer (1997) haben in Untersuchungen am Mississippi festgestellt, dass durchschnittlich 24 % des Gewässer-DOM aus kolloidem Material bestand, welches aufgrund seines C/N-Verhältnis deutlich mikrobiellen Ursprungs ist. Quantifiziert wird DOM als DOC (dissolved organic carbon). Dieser Parameter wurde von Malcolm et al. (1973) eingeführt. Nach Raber (1996) besteht DOM aus Böden nur zu 30-50 % aus DOC. Sowden et al. (1977) beziffern den Anteil an Protein im Humus auf maximal 40 %. Cortez & Schnitzer (1979) wiesen einen Stickstoffgehalt der Humin- und Fulvosäuren verschiedener Böden von 1,2 %-24 % nach (zitiert in Stevenson 1982). 2.1.2 Gewinnung Es gibt eine Reihe verschiedener Verfahren zur Gewinnung von DOM. Sie ergeben grundsätzlich unterschiedliche Mengen, Konzentrationen und Zusammensetzungen. Sie lassen sich untergliedern in Feld- und Labormethoden (Tab. 1):

Tabelle 1: DOM-Gewinnungsmethoden (nach Maxin 1992)

Feldgewinnung Laborgewinnung

• Lysimeter (Haines et al. 1982) • Perkolation (Hantschel et al. 1986)

• Saugkerzen (Haines et al. 1982) • Zentrifugieren (Adam 1974, Gillmann 1976)

• Hydraulische Bodenpressung (Manheim 1966)

• Gleichgewichtslösung (Ulrich 1966, Ulrich et al. 1979)

Je nach Fragestellung sind unterschiedliche Verfahren zu bevorzugen. Im Lysimeter wird DOM während der Passagestrecke durch den Boden gelöst und teilweise wieder an Bodenpartikeln sorbiert. Damit liefert dieses Verfahren Aussagen über Konzentrationen und Zusammensetzung von DOM verschiedener Bodenschichten. Die Perkolation entspricht dem Lysimeterverfahren, wird jedoch im Labor durchgeführt. Vorteil ist in diesem Zusammenhang die Möglichkeit, die Temperatur und Feuchtigkeit stabil zu halten und somit deren Einfluß zu untersuchen. Saugkerzen extrahieren nur das DOM-haltige Wasser, das mit der jeweils eingesetzten Saugspannung erfaßt werden kann (Zsolnay 1996). DOM-Konzentrationen sind hier abhängig von der Bodenfeuchte. Je trockener der Boden, desto konzentrierter ist die DOM. Außerdem ergibt sich bei Saugkerzen ein Materialproblem. Keramiksaugkerzen sorbieren bis zu 50 % des DOM (Guggenberger & Beudert 1989, Guggenberger & Zech 1992, Wessel-Bothe et al. 2000). Zentrifugieren und Bodenpressung sind im Ergebnis ähnliche Verfahren. Mit ihnen werden die höchsten DOM-Konzentrationen erzielt. Sie haben den Nachteil, dass sie Bodengefüge

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und -strukturen zerstören, sowie Mikroorganismen lysieren können (Maxin 1992). Dies führt zu einer veränderten qualitativen Zusammensetzung des DOM, als dies in situ der Fall wäre. Bodengleichgewichtslösungen6 haben den Vorteil, dass sie, unabhängig vom Niederschlag, in reproduzierbaren Konzentrationen hergestellt werden können. Ihr Nachteil ist, dass sie eher zu potentiellen als zu realen in situ DOM-Konzentrationen führen. 2.1.3 Charakterisierung von DOM Zur Charakterisierung von DOM wurden bisher Methoden eingesetzt, die die physikalisch-chemischen Eigenschaften der DOM-Komponenten, deren Molekulgröße sowie den Anteil funktionaler Gruppen bestimmen. Die molekulare Zusammensetzung von DOM wird mittels Ultrafiltration (Spitteler 1987) oder Gleichgewichts-Dialyse (Homann & Grigal 1992) ermittelt. Die Bestimmung funktioneller Gruppen geschieht mittels: • Kernmagnetischer Resonanzspektroskopie (13C-NMR Nuclear magnetic resonance

(Candler et al. 1988, Novak et al. 1992)) • Elektronenspinresonanz (ESR Electron Spin Resonance (Gressel et al. 1995)) • Ionisierung und Massenspektrometrie (FI/MS Field Ionization Mass Spectrometry)

(Hempfling & Schulten 1990) oder photometrisch durch: • Fluoreszenzspektroskopie (Almgren et al. 1975, Visser 1983)

Synchronous Scan Fluorescence Spectroscopy (Shotyk & Sposito 1990) oder • Infrarotspektrometrie (Lawrence 1980, Carpenter & Smith 1984)

FTIR Fourier Transform Infrared Spectrometry (Gressel et al. 1995). Die spektroskopischen Methoden haben grundsätzlich den Vorteil weder manipulative Veränderungen des zu untersuchenden Materials für eine Analyse zu benötigen, noch destruktiv zu sein und sie benötigen nur geringe Probenmengen (Stevenson 1982). Das trifft jedoch für die FTIR-Methode nach Gressel et al. (1995) nicht zu. Bei diesem Verfahren wird DOM auf AgCl-Plättchen aufgetragen und im Ofen bei 105°C für 30 Minuten getrocknet. Eine Säulenfraktionierung in homogene Gruppen ähnlicher Polarität (hydrophob, hydrophil) und ionischer Eigenschaften (sauer, basisch, neutral) geschieht mittels Adsorberharzen (nichtionischer, wie Amberlite-XAD und Ionenaustauschern, wie Bio-Rad AG-MP 50 + Duolite A-7) (Leenheer & Huffman 1976; Leenheer 1981, Malcolm & MacCarthy 1992, Aiken et al. 1992). Die bis hierhin zitierte Literatur dieses Kapitels bezieht sich nur auf Arbeiten, die mit natürlichem DOM durchgeführt wurden. Methoden, die ausschließlich mit naßchemisch extrahierten Humin- und Fulvosäuren durchgeführt wurden, wurden nicht berücksichtigt. Daneben wird wassergelöstes DOM auch in Humin- und Fulvosäuren fraktioniert. Die Extratkionsmethode stammt von Odén (1919), wird heute im allgemeinen durch eine von der

6 Gleichgewichts lösung: Lösungen, die nach dem Zeitpunkt gewonnen werden, bei dem sich ein Gleichgewicht

zwischen gelöster und sorbierter Phase erreicht wurde.

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IHSS7 empfohlene Methode (Thurman 1985b) durchgeführt. Eine Extraktion der Säuren erfolgt mittels Natronlauge. Eine darauffolgende Ansäuerung mit Salzsäure führt zur Ausfällung von "Huminsäuren". Huminsäuren sind definitionsgemäß organische Säuren, die im basischen Bereich gelöst und im sauren Bereich ausgefällt werden. Der in Lösung verbleibende Rest wird als "Fulvosäuren" bezeichnet. Fulvosäuren verbleiben definitionsgemäß sowohl im basischen, als auch im saurem Bereich in Lösung. Sie weisen eine größere Gesamtazidität auf als Huminsäuren, was vor allem an ihrem größeren Gehalt an Carboxyl-Gruppen liegt (Sposito 1998). Derzeit wird immer häufiger bezweifelt, dass so gewonnene Humin- und Fulvosäuren noch die gleichen chemischen Eigenschaften besitzen, wie die hochmolekularen organischen Säuren, aus denen sie gewonnen wurden (Herbert et al. 1993, Maxin & Kögel-Knabner 1995, Raber et al. 1998). Diese Zweifel hatten allerdings auch schon Bremner & Lees (1949). Die Natronlauge, mit der die Extraktion der Huminstoffe erfolgt, führt sowohl zu Hydrolyse und Autooxidation als auch zur Kondensation von Aminosäuren (Tinsley & Salam 1961 zitiert in Stevenson 1982). Williams (1914 zitiert nach Stevenson 1982), der diese drastischen Extraktionsmethoden ebenfalls kritisierte, untersuchte Huminstoffe deshalb nur in Lysimeterwasser (Stevenson 1982). Williams kann damit als Pionier der DOM-Untersuchungen gelten. 2.1.4 Ökologische Bedeutung Im Gegensatz zu naß chemisch gewonnenen Humin- bzw. Fulvosäuren ist DOM ein Extrakt, der in der Natur durch Regenwasser entsteht. DOM ist die mobile organische Bodenfraktion. Die Wasserlöslichkeit von DOM ist auf den hohen Gehalt von Sauerstoff in den funktionalen Gruppen (Suffet et al. 1994), also insbesondere der Carboxylgruppen zurückzuführen (Raber 1996). In der bereits sehr umfangreichen Literatur zum Thema DOM wird anstatt DOM häufig aus Gewässern oder Boden gewonnene Huminsäure (Wershaw et al. 1969, Carter & Suffet 1982, Caron et al. 1985, Hassett & Milicic 1985, Melcer et al. 1987, Melcer et al. 1989, Lee & Farmer 1989, Jota & Hassett 1991, Ravichandran et al. 1998, Temminghoff et al. 1998, Granier et al. 1999) oder Aldrich Huminsäure als Modellsubstanz verwendet (McCarthy & Jimenez 1985b, McCarthy 1989, McCarthy et al. 1985, McCarthy et al. 1989, Malcolm & MacCarthy 1986, Black & McCarthy 1988, Servos et al. 1989, Day 1991, Ortego & Benson 1992, Steinberg et al. 1992, Schlautman & Morgan 1993, Steinberg et al. 1993, Lee et al. 1993, Temminghoff et al. 1997, Hinedi et al. 1997, Kim et al. 1999). In keinem Fall entspricht diese Modellsubstanz natürlichem DOM (MacCarthy & Malcolm 1989, Schulten & Gleixner 1999), das zu maximal 5 % aus Huminsäuren besteht (Martin-Mousset et al. 1997). Generell besteht das Problem, dass DOM weder eine chemisch definierte Substanz, noch eine Substanz mit grundsätzlich gleichen chemisch-physikalischen Eigenschaften ist. Die physikalischen Eigenschaften der Huminstoffe nach Buffle (1977) definieren sich durch den aromatischen Anteil, die chemischen Eigenschaften durch den Anteil an phenolischen und alkoholischen Hydroxylgruppen (-OH) und Carboxylgruppen (COOH-). Es lassen sich also in keinem Fall grundsätzliche Regeln von Untersuchungen an nur einer DOM-Quelle ableiten. Das umfangreiche Wissen über das Verhalten von Fulvo- und Huminsäuren ist hingegen unerläßlich, um das Verhalten von DOM zu vestehen. Dies gilt trotz der Veränderung der

7 IHSS International Humic Substances Society

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Eigenschaften der Huminstoffe durch Alkali-Extraktion. Hierbei werden Wasserstoffbrückenbindungen und eventuell auch Esterbindungen zerstört (Stevenson 1982). Fulvo- und Huminsäuren haben den für Experimente so wichtigen Vorteil relativ statisch zu reagieren. Anders ausgedrückt könnte man aber auch sagen, sie haben ihre natürliche Flexibilität verloren. Suffet et al. (1994) sind der Meinung, dass es besser ist das organische Material so zu untersuchen wie es vorliegt, anstatt es vorher zu isolieren, weil man damit näher an der Realität bleibt. Der Anteil des DOM, der mikrobiell verfügbar ist, befindet sich im ständigem Kreislauf und damit in ständiger chemischer Veränderung. Bakterien und Pilze können sich als einzige Organismen ausschließlich von DOM ernähren und reproduzieren (Robertson et al. 1999). Bakterioplankton kann den mikrobiell verfügbaren DOM-Anteil bis zu zweimal am Tag erneut in Umlauf bringen (Findlay & Sinsabaugh 1999). Hascoët et al. (1986) betrachteten potentiell die molekulare Fraktion zwischen 1000 und 5000 Dalton, bearbeitet durch Exoenzyme, als mikrobiell verfügbar. Die Fraktion zwischen 300 und 1000 Dalton ist dagegen schlechter oxidierbar und somit keine wichtige Energiequelle für Mikroorganismen. Auch Schinner & Sonnleitner (1996) hielten die Fraktion kleiner 5.500 Dalton für die mikrobiell bevorzugte C-Quelle. Sun et al. (1997) konstatieren dagegen, dass man die Molekulargröße nicht als Kriterium für die Bioverfügbarkeit benutzen könne, da Amon & Benner (1994) festgestellt haben, dass das höher molekulare ozeanische DOM (>1000 Dalton) eher biologisch verfügbar war, als das niedermolekulare. Dasselbe stellten auch Martin-Mousset et al. (1997) fest. Volk et al. (1997) konnten die Bioverfügbarkeit von 33 bis 45 % der DOM-Fraktion >100 kDa aus einem Fluß nachweisen. Boyer & Groffman (1996) stellten fest, dass der Huminsäureanteil in DOM eher bioverfügbar ist, als der Fulvosäureanteil. Piccolo (1998) stellte die Hypothese auf, dass es sich bei Huminstoffen eher um assoziierte Aggregate, als um Makromoleküle handele, weshalb für die Bioverfügbarkeit nicht das Molekulargewicht relevant ist. Amon & Benner (1994) fanden heraus, dass es sich bei dem höher molekularen DOM (>1000 Da) im ozeanischen Oberflächenwasser überwiegend um algenbürtige Polysaccharide handelte, während es bisher nicht möglich war, die Fraktion < 1000 Dalton stofflich näher zu charakterisieren. Grundsätzlich ist DOM aus frischen Pflanzenteilen oder Exsudaten mikrobiell schneller verfügbar, als aus Dung, Klärschlamm, verwelktem Laub oder Stroh (Qualls & Haines 1991, Ohno & Crannell 1996, Yano et al. 2000, Zhou & Wong 2000). Eine Erklärung für die schlechte Bioverfügbarkeit von DOM aus Laub könnte das von Gregorich et al. (1996) festgestellte hohe C/N-Verhältnis in Laub liefern (C/N=35 bei Ahorn; C/N=56 bei Mais). Hopkinson et al. (1998) fanden in einer groß angelegten Ökosystemstudie heraus, dass Bakterien Proteine eher konsumieren als Kohlenhydrate und Polysaccharide, was auch Schuster et al. (1998) bestätigten. Turco et al. (1990) stellten fest, dass sich Mikroben vor allem von den Carboxylgruppen ernähren. Daldorph & Thomas (1990) stellten fest, dass Bakterien beim anaeroben Abbau toter organischer Materie kurzkettige Carboxylsäuren (C2-C5) ausscheiden, was die Entdeckung von Turco et al. (1990) bestätigt. Sun et al. (1997) und Hopkinson et al. (1998) fanden eine Korrelation zwischen dem Anteil an aliphatischem Kohlenstoff und der Bioverfügbarkeit. DOM ist in seiner Molekülgrößenzusammensetzung dynamisch. Aggregierung von DOM zu größeren Molekülen nimmt mit abnehndem pH-Wert (Chen et al. 1977, Underdown et al. 1981) und zunehmender Elektrolytkonzentration zu (Buffle 1988 zitiert nach Marschner 1997). Bei fallendem pH-Wert sind die organischen Moleküle weniger negativ geladen, die organische Substanz wird also hydrophober, auch intramolekulare Abstoßungskräfte lassen

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nach und führen zu stärkerer Bindung der Molekule (Schnitzer 1980, Ghosh & Schnitzer 1980, Murphy et al. 1994, Shen 1999). Eine Zunahme der Elektrolytkonzentration von 4 x 10-4 M bis 1 M führte zu einer Potenzierung der Aufwicklung von Huminsäuren. Das geladene ausgestreckte Molekül wird unpolar und rollt sich auf (Cornel et al. 1986). Das Gleiche geschieht bei niedrigem pH-Wert, der pH-Effekt ist bei höheren Elektrolytkonzentrationen weniger auffällig (Cornel et al. 1986). Aho & Lehto (1984) beobachteten an DOM aus Seewasser eine Abnahme der Molekülgrößen bei zunehmender DOM-Konzentration. Morehead et al. (1986) und Lara & Ernst (1989) fanden eine abnehmende Bindung von PAK bzw. PCB8 bei steigenden Fluß- und Seewasser-DOM-Konzentrationen, was für eine Abnahme des hydrophoben, meist hochmolekularen Anteils an DOM spricht. Carballeira et al. (1999) untersuchten aus Boden extrahierte Fulvosäuren (10 mg C L-1 und 30 mg C L-1) und fanden genau das Gegenteil heraus, bei zunehmender Konzentration aggregierten oder polymerisierten die Moleküle. DOM bindet anorganische (Dudley et al. 1986, Neal & Sposito 1986, Pohlman & McColl 1988, McCarthy 1989) und organische Stoffe (McCarthy 1989, Kukkonen et al. 1990, Deschauer & Kögel-Knabner 1992) und wird selber gebunden, vor allem in eisen- und aluminiumoxidhaltigen B-Horizonten von Böden (Dawson et al. 1978, Tipping 1981, McDowell & Wood 1984, Cronan & Aiken 1985, Jardine et al. 1989, Dahlgren & Marrett 1991, Moore et al. 1992, Vance & David 1992, Day et al. 1994, Gu et al. 1994, Marschner 1997, Kaiser & Zech 1997). DOM spielt insoweit auch eine wichtige Rolle bei pedogenen Prozessen, wie der Podsolierung (Simonson 1959, McDowell & Wood 1984, Dahlgren & Marrett 1991, Kaiser et al. 1997, Guggenberger et al. 1998). Die Bindung von DOM an Mineraloberflächen erfolgt durch Ligandenaustausch9 zwischen den Carboxylgruppen des DOM und Hydroxylgruppen der Fe- und Al-Oxide unter Abgabe von Protonen (Tipping 1981, Davis 1982, Tipping & Woof 1990, Gu et al. 1994, 1995, 1996). Es findet dabei eine Fraktionierung statt. Selektiv werden die hydrophoberen und höher molekularen Anteile gebunden und somit findet sich im DOM der B-Horizonte ein größerer Anteil hydrophiler und niedermolekularer DOM (Dunnivant et al. 1992, Guggenberger & Zech 1993, McCarthy et al. 1993, Herbert & Bertsch 1995, Kaiser & Zech 1997). Die Adsorption von DOM an den Boden ist stark pH-abhängig. Die stärkste Sorption findet bei pH-Werten von 4-5 statt und fällt mit steigendem pH-Wert (Shen 1999). Es besteht zudem eine Abhängigkeit der Bindung von der Elektrolytkonzentration, was vermutlich in der makromolekularen Konfiguration von DOM begründet liegt. Fällt die Elektrolytkonzentration, steigt die Ladung der funktionalen Gruppen im Molekül untereinander und es streckt sich. In dieser Form benötigen die Moleküle einen größeren Raum, folglich können nur weniger Moleküle gebunden werden. Bei hoher Elektrolytkonzentration hingegen sind die Moleküle stark aufgerollt, benötigen somit eine geringere Sorptionsfläche und folglich können mehr Moleküle auf der gleichen Fläche sorbiert werden (Shen 1999). Shen (1999) konnte auch nachweisen, dass bei Verringerung der Humusgehalte von 2,95 % auf 0,29 % und von 3,5 % auf 0,41 % im Boden die Adsorption von DOM um 30 % anstieg. Fehlen im Boden die wirksamen Absorbenten, also insbesondere die Sesquioxide, wird die Sorptionskapazität für organische Säuren erheblich reduziert. Es können dann im Grund- und Oberflächenwasser hohe DOC-Konzentrationen auftreten

8 PCB polychlorierte Biphenyle 8 Als Liganden werden die assoziierten Ionen OH- oder H+ bezeichnet, die durch ein Zentralion, z.B. einem

Metallatom, angezogen werden.

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(Huang et al. 1977, Moore & Jackson 1989, Guggenberger 1992, Nelson et al. 1993 zitiert in Kalbitz 1996). DOM kann durch Bindung von Schwermetallen und Radionukleiden zur deren Mobilisierung beitragen (König et al. 1986, Newell & Sanders 1986, 1989 Berggren et al. 1990, Schiff & Aravena 1990, Kuiters & Mulder 1992, Außendorf & Deschauer 1993, Virchenko & Agapkina 1993, Tegen & Dörr 1996). Cu und 90Sr werden vorwiegend an kleineren organischen Moleküle (Sr an 320-340 Dalton-DOM) und Pb, Fe und 137Cs überwiegend an größere Moleküle (Cs an 9-10 kDa-DOM) gebunden (König et al. 1986, Dietze & König 1988, Neite 1989, Kuiters & Mulder 1992, Virchenko & Agapkina 1993). Guggenberger et al. (1994) fanden heraus, dass die hydrophile DOM-Fraktion, die Schwermetalle 2-8x stärker bindet, als die hydrophobe DOM-Fraktion. Kalbitz & Wennrich (1998) konnten eine Korrelation von DOM und Cr-, Hg-, Cu- und As-Gehalten nachweisen, wogegen Cd- und Zn-Gehalte keine Korrelation zu DOM zeigten. Cadmium wird auch nur ca. 10fach geringer an DOM gebunden wird im Verhältnis zu Kupfer (Morel & Hering 1993, Alberts & Giesy 1983). Bindungsformen sind physikalische Adsorption, wie die Wasserstoffbrückenbindung und chemische Adsorption, wie die Komplexbildung10 (Kördel et al. 1997). Die Wasserstoffbrückenbindung ergibt hydrophile, die Donor-Akzeptor Komplexierung, kurz Komplexbildung, hingegen hydrophobe Komplexe (Rouchaud et al. 1996). Die Metallbindung nimmt mit zunehmendem pH-Wert zu (Machesky 1993). Die Stabilität der Metall-organischen Komplexe in Bodenlösungen nimmt in folgender Reihenfolge ab: Fe3+ >Hg 2+>Al3+ >Cu2+ >Ni2+ >Co2+ >Mn2+ >Ca2+ (Virchenko& Agapkina 1993). Carlsen et al. (1996) stellten fest, dass das Metall Europium an DOM-Moleküle geringerer Größe mehr bindet als an größere, dies stimme überein mit der größeren Anzahl funktionaler Gruppen bei abnehmender Molekülgröße. DOM kann hydrophobe organische Xenobiotika mobilisieren (Caron et al. 1985) und ihre Löslichkeit in Wasser erhöhen (Ogner & Schnitzer 1970b, Gjessing & Berglind 1981, Chiou et al. 1986, Kile & Chiou 1989). Rav-Acha & Rebhun (1992) entwickelten ein Modell, um vorherzusagen, ob ein organisches Xenobiotikum durch gelöste Huminsäuren in seiner Löslichkeit erhöht, oder gebunden wird: Ist der Verteilungskoeffizient zwischen gelöster und gebundener Phase (Kp) des organischen Xenobiotikums niedriger, als der der Huminsäure, so wird er gebunden; ist der Kp höher als der der Huminsäure, wird das Xenobiotikum gelöst. Die Bindung hydrophober organischer Xenobiotika an DOM kann durch chemische Komplexbildung oder physikalische Bindung, wie van-der-Waals'sche-Kräfte11 und die Bildung von Wasserstoffbrücken erfolgen (Chiou 1989, Hassett & Banwart 1989 zitiert in Raber 1996). Raber & Kögel-Knabner (1997) konnten nachweisen, dass der Zusammenhang zwischen der Hydrophobizität von DOM und der Bindung hydrophober organischer Xenobiotika abhängig ist von der Herkunft des DOM, während generell ein Zusammenhang zu der molekularen Größe hergestellt werden konnte. Je höher molekular das DOM, desto größer ist die Bindungskapazität für hydrophobe organische Xenobiotika (Raber & Kögel-Knabner 1997, Williams et al. 1999). Haitzer et al. (1999) fanden heraus, dass wenn der Anteil hydrophober Bestandteile in DOM gering ist, die Bindungsprozesse erst nach Tagen abgeschlossen sind. Johnsen et al. (1989) berichteten, dass diese langsam sich bildenden Verbindungen irreversibel sind.

9 Bei der Komplexbildung (Donor-Akzeptor-Komplexe) werden Moleküle durch ein gemeinsam benutztes

Elektronenpaar, das nur von einem Molekül zur Verfügung gestellt wird, verbunden. 10 Van-derWaals'sche Kräfte bezeichnet die Anziehungskraft zwischen den Molekülen, in Abhängigkeit ihrer

Molekülgröße. Je größer die Moleküle, desto stärker die Kräfte. Im Vergleich zu Atom- und Ionenbindung sehr schwache Kräfte.

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Bei steigender Elektrolytkonzentration steigt die Bindungsaktivität hydrophober Substanzen zu DOM, zu festen Humusbestandteilen und auch von DOM zur Bodenmatrix (Carter & Suffet 1982, Jota & Hassett 1991, Kögel-Knabner et al. 2000). Weber et al. (1983) fanden einen stärkeren Einfluß zweiwertiger (Mg2+ , Ca2+) gegenüber einwertigen Kationen (Na+, K+) auf die Bindung hydrophober Xenobiotika durch Fulvo- und Huminsäuren. Zudem nehme das Bindungsgleichgewicht und die Menge der gebundenen Kationen bei fallendem pH-Wert zu. Wobei der pH-Einfluß bei zunehmender Elekrolytkonzentration abnimmt (Cornel et al. 1986). Schlautman & Morgan (1994) fanden einen geringeren Einfluß von Ca2+ auf die Bindungsstärke von Fulvosäuren gegenüber dem von Huminsäuren bei der Aluminiumoxidbindung. Kögel-Knaber et al. (2000) fanden heraus, dass bei abnehmender Elekrolytkonzentration eine Desorption von Benzo(a)pyren, Pyren und DOM stattfand. Pavlostathis & Jagal (1991) fanden dagegen keinen Enfluß der Ionenstärke bei der Desorption des relativ wasserlöslichen Trichlorethylens mit einer eigen-Ionenstärke von < 1 mM. Es wird auch darüber spekuliert, ob DOM durch seinen amphoteren12 Charakter Micellstrukturen bildet und sich dadurch wie ein Tensid verhält, also gebundene Stoffe aus der Bodenmatrix löst (Kononova 1966, Wershaw 1989, Maxin 1992, Raber 1996). Im Labor konnte dies für Humin- und Fulvosäuren nachgewiesen werden (Carter & Suffet 1982, Chiou et al. 1986 zitiert in Raber 1996). Die Micellbildung geschieht bei Huminsäuren in geringeren Konzentrationen als bei Fulvosäuren (Kördel 1997). Abhängig von der Herkunft des DOM konnten Barriuso et al. (1992) eine Desorption von Pflanzenschutzmitteln auch durch DOM in Böden feststellen. DOM kann die chemisch-physikalischen Eigenschaften von Xenobiotika verändern. DOM kann den photochemischen Abbau von organischen Xenobiotika in Gewässern, in Abhängigkeit von seiner Herkunft und damit seiner Zusammensetzung fördern, aber auch verlangsamen (Gjessing & Gjerdahl 1981, Zepp et al.1985, Mills & Schwind 1990, Wang et al. 1995, Sanlaville et al. 1996). Park et al. (2000) wiesen eine nach Herkunft der Huminsäuren unterschiedlich starke Mineralisierung organischer Xenobiotika nach, die bis zu einer DOM-Konzentration von 10 mg L-1 zunahm. Es wurde auch festgestellt, dass DOM die Flüchtigkeit bestimmter Xenobiotika verringert (Gschwend & Wu 1985, Hassett & Milicic 1985). Zum Verstänis der Wirkung von DOM, muß man sich vor Augen führen, dass die ökologische Funktion von DOM als mobile Phase des Bodens die eines Nährstofftransporters und Nährstofffreisetzers ist. Wenn man dort ansetzt, begreift man, dass die widersprüchlichen Eigenschaften, die diesem Parameter innewohnen, notwendig sind. Humus, die Hauptquelle von DOM, dient als Nährstoffproduzent für Pflanzen, für die Hauptnährstoffe Stickstoff und Phosphat und Schwefel. Zur Mikroorganismen-Reproduktion steuert Humus zu 10 bis 70 % als Kohlenstoffquelle bei (Stevenson 1982). Mikroorganismentätigkeit ist untrennbar mit Humus verbunden. Die mobile Humus-Phase, also DOM, muß aktiv werden, um Nährstoffquellen in Lösung zu bringen, wenn diese gebraucht werden. DOM muß sorbiert und inaktiv bleiben, wenn überschüssige Nährstoffe zur Verfügung stehen, damit diese nicht ausgewaschen werden können. DOM muß Stoffe während des Transportes binden, aber auch die Fracht wieder "abgeben" können. Bestandteile in DOM, z.B. die Phenolsäuren, Aminosäuren, und einfache aliphatische Säuren sind dabei ebenfalls aktiv an der Mobilisierung und am Transport beteiligt (Stevenson 1982).

11 Amphoter bedeutet sich teils als Säure, teils als Base verhaltend.

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Die Regulierung der Nährstoffspeicherung und Freisetzung funktioniert durch das Zusammenwirken von Metallen mit den Huminstoffen. Steigen die Konzentrationen von Metallen und organischer Substanz in der Bodenlösung an, führt das zu einer steigenden Komplexierung der beiden Komponenten, die dann, in Abhängigkeit von der Ionenstärke (I), vom pH-Wert und der Wertigkeit der beteiligten Metalle (je höher die Wertigkeit, desto stärker die Komplexierung) zu einer kontinuierlichen Umwandlung von Fulvosäuren in Huminsäuren und von Huminsäuren in Humine führen (Ong & Bisque 1968, Stevenson 1982). Die Metalle werden im Verlauf dieses Prozess der Molekülaggregierung später wieder freigesetzt. Dies geschieht einerseits durch die Abnahme der Ladung, die insbesondere die Metall-Sauerstoff-Verbindung schwächt und somit zur Freisetzung der Metalle führt. Andererseits führt die Komplexierung der gelösten Substanz zu einer Verringerung der freien Metallionen in Lösung. Gleichgewichtsreaktionen fördern daher wiederum eine Lösung von Metallen. Auch die Nährstoff-Freisetzung ist abhängig von der Fähigkeit, insbesondere der niedermolekularen organischen Säuren, zur Komplexierung von Metallen. Die Komplexierung der Metalle hat dann einem Ligandenaustausch von Sulfat und Phosphat mit Hydroxylgruppen zur Folge. Ein weiterer Mechanismus zur Freisetzung von Nährstoffen ist der des Herauslösens der Nährstoffe durch Anlösen von Mineraloberflächen. Diese Mechanismen sind insbesondere für Phosphat nachgewiesen worden. Unterstützt werden diese Mechanismen dadurch, dass durch Metall-Phosphat-Komplexierung in der Bodenlösung die Bindungsenergie des Bodens für den Nährstoff aber auch die Ladungsaktivität von Phosphat in Lösung verringert wird (Fox 1995). Fulvosäuren und Huminsäuren sind auch nicht chemisch spezifisch verschiedene Produkte, sondern die Grenzen zwischen ihnen sind fließend. Sie sind bedingt durch die Neutralisierung oder die Abspaltung saurer funktioneller Gruppen, insbesondere der Carboxylgruppe (Waksman 1936). Sposito (1998) beschreibt die besonderen Fähigkeiten von Huminstoffen allgemein wie folgt: "Polyfunktionalität", nämlich die Fähigkeit durch verschiedene funktionelle Gruppen eine variables Potential an Reaktionsvermögen zu sichern, "Makromolekulare Ladung", die Entwicklung eines anionischen Charakters mit Auswirkung auf die molekulare Anordnung des makromolekularen Gerüsts, "Hydrophilität", die Fähigkeit polare funktionelle Gruppen, wie die Carboxylgruppe (-COOH) und die Hydroxylgruppe (-OH) zu lösen und starke Wasserstoffbrücken mit Wassermolekülen einzugehen, sowie die "Strukturelle Labilität", dies bedeutet, in Abhängigkeit von pH-Wert, Redoxverhältnissen, Elektrolytkonzentrationen und der Bindungsart der funktionellen Gruppen, sich intermolekular zu verbinden und die molekulare Anordnung zu verändern. Huminstoffe agieren also wie ein Schwamm: Durch Bindung von Metallkationen an Huminstoffe vergrößern sich die Moleküle und weiten sie sich durch Entladung. So bieten sie dann noch mehr Speicherplatz. Ab einer bestimmten Neutralisierung der Ladung kommt es jedoch wieder zur Abgabe von Kationen und somit zum Zusammenschrumpfen der Huminstoffe durch Ladungsunterschiede innerhalb der Huminstoffe, ähnlich des Auswringens eines Schwammes. Die Oberfläche verringert sich und es werden Kationen abgegeben. Komplexieren Huminstoffe Metalle, findet ein Ligandenaustausch von Hydroxylgruppen und Nährstoffe statt, durch den Nährstoffe freigesetzt werden. Zsolnay (1996) vermutet, man könne DOM als ökologischen Bodenindikator benutzen: In einem 'gesunden' Ökosystem sollte die DOM-Konzentration möglichst niedrig sein. Dies wird von den Beobachtungen von Moore & Dalva (2001) gestützt, die besagen, dass aus stärker humifiziertem Material weniger DOM freigesetzt wird, als aus frischer organischer Substanz.

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Auch Boyer & Groffman (1996) stellten fest, dass ein gestörtes Ökosystem, wie das eines Ackers mehr DOM produziert, als ein Waldökosystem auf dem selben Boden. Grundsätzlich sind die DOC-Konzentrationen in der Bodenlösung im Sommer höher als im Winter (Collier et al. 1989, Dalva & Moore 1991, Chittleborough et al. 1992, Federer & Sticher 1994, Heikkinen 1994, Guggenberger & Zech 1994, Liechty et al. 1995, Tegen & Dörr 1996, Scott et al. 1998, McDowell et al. 1998, Guggenberger et al. 1998, Tipping et al. 1999). Lu et al. (2000) konnten nachweisen, dass die DOC-Gehalte im Boden wesentlich von den Pflanzenexsudaten bestimmt werden. Diese sind wiederum entscheidend abhängig vom Pflanzenwachstum. DOC-Werte steigen beim Austreiben an und erreichen ihren Höhepunkt kurz nach dem Aufblühen der Pflanze. Außerdem werden Menge und Zusammensetzung der Pflanzenexsudate entscheidend durch die Art der Düngung beeinflußt (Marschner 1996). Ammonium und Phosphat-Dünger führen zu erhöhten DOM-Konzentrationen in der Bodenlösung, wobei Ammonium im Verhältnis zu Phosphat zu noch deutlicheren DOM-Erhöhungen führte (Giordano et al. 1971; Myers & Thien 1988). Ammonium-Stickstoff erhöht gegenüber Nitrat-Stickstoff das DOC im Pflanzenexsudat (Lu et al. 2000). Ebenso erhöht ein niedriger Phosphat-Status des Bodens die Menge der Pflanzenexsudate (Lu et al. 1999). Bei pH-Werten unter pH 2 (David et al. 1989) und über pH 8 wurden erhebliche Freisetzungen von DOM nachgewiesen (Schnitzer 1980). Extreme pH-Werte sind durch das Puffervermögen der Böden allerdings kaum relevant. Auch Elektrolytkonzentration und das dominierende Anion bestimmen die Menge der freigesetzten DOM (Herbert & Bertsch 1995). Evans et al. 1988 stellten fest, dass DOC-Konzentration bei steigenden Elektrolykonzentrationen von 0,20-1,1 mmol L-1 kontinuierlich abnahmen. Das Sulfat-Anion (SO4

2-) löst im Vergleich zum Chlorid- (Cl-) und Nitrat-Anion (NO3-) mehr DOM (Evans et

al. 1988, Vance & David 1989). DOM beeinflußt die Ökotoxizität von organischen Xenobiotika. Dies wurde bisher vor allem an aquatischen Organismen untersucht (Kukkonen & Oikari 1987, McCarthy & Jimenez 1985a, Carlberg et al. 1986, Landrum et al. 1987, Lorenz et al. 1996). Der Einfluß von DOM auf aquatische Organismen wurde bereits vor mehr als 50 Jahren erkannt (Tipping 1990, Petersen 1991 zitiert in Campbell et al. 1997). Bisher wird im allgemeinen von einer Ökotoxizitätsabnahme eines Xenobiotikums durch die Bindung an DOM ausgegangen (McCarthy et al. 1985, Johnson et al. 1989, Kukkonen & Oikari 1987, Kukkonen et al. 1989, Day 1991, Versteeg & Shorter 1992, Steinberg et al. 1993). Hydrophobe, also lipophile Xenobiotika werden mit steigendem Anteil ihrer eigenen hydrophoben aromatischen Strukturen stärker an die ebenfalls hydrophobe, meistens höher molekulare Fraktion von DOM gebunden (Gauthier et al. 1987, McCarthy et al. 1989). Die Bindung eines Xenobiotikums mit DOM führt in diesem Fall zu einer Molekülvergrößerung und zu einer zu starken Ladung, so dass eine Membranpassage verhindert wird (Landrum et al. 1987, Kukkonen & Oikari 1991, Suffet et al. 1994). Signifikant wird eine Verringerung der Biokonzentration dieser hydrophoben Xenobiotika durch Bindung an DOM erst bei einem Kow

13-Wert der Xenobiotika von 104 (McCarthy 1989). Johnsen et al. (1989) stellten allerdings fest, dass auch gebundene Xenobiotika noch durch die Zellwände in Organismen eindringen. Dafür spricht auch die Studie von Kukkonen et al. (1989) in der eine höhere Biokonzentration von Benzo(a)pyren in Daphnia magna bei den niedrigsten Konzentrationen von DOM (0.5 mg DOC L-1) im Vergleich zur huminfreien Kontrolle gefunden wurde. Haitzer et al. (2001) konstatierten jedoch, dass die Hydrophobizität nicht die einzige

13 Kow=Pow Verteilungskoeffizient eines lipophilen Stoffes an Oktanol/Wasser

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Einflußgröße für die Stärke der Bindung von hydrophoben Xenobiotika mit DOM ist, sondern offensichtlich der Bindungsmechanismus für das jeweilige Xenobiotikum ebenso entscheidend ist. Aus dem Kow eines hydrophoben organischen Schadstoffes alleine läßt sich seine Ökotoxizität folglich nicht ablesen. Hodge et al. (1993) stellten fest, dass die molekulare Fraktion >10 kDa von DOM die Toxizität des Pyrethroids Fenvalerat erhöht. Dies war auf eine Adhäsion von DOM an die Fibrillen des Wasserflohs (Daphnia magna) zurückzuführen. Muir et al. (1994) fanden ebenfalls erhöhte Biokonzentrationswerte der Pyrethroide Fenvalerate und Permitrin und p,p'-DDT durch Seewasser-DOM bei Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss). Servos et al. (1989) wiesen eine erhöhte Biokonzentration von polychlorierten Dibenzo-p-Dioxinen (PCDD's) bei Regenbogenforellen durch Seewasser-DOM nach. Kukkonen et al. (1990) und Kukkonen & Oikari (1991) erzielten erhöhte Biokonzentration von Naphthalin durch die Zugabe verschiedener Gewässer-DOM bei Daphnia magna. Auch bei hydrophilen organischen Xenobiotika wie Paraquat und zwei schwachen phenolischen Säuren, wurde eine Toxizitätserhöhung bei Daphnia magna in Anwesenheit von DOM festgestellt (Oikari et al. 1992). Untersuchungen mit kationischen Tensiden zeigten (vgl. den amphoteren, tensidischen Charakter von DOM s.o. in diesem Kapitel), dass deren Toxizität vor allem von dessen Fähigkeit herrühre, sich an negativ geladene Oberflächen von lebenden Organismen, sowie den Fibrillen der Wasserflöhe und den Kiemen bestimmter Fische anzuheften (Vallés et al. 2000). Dies wurde auch in einem Toxizitätsvergleich zwischen Photobacterium phosphoreum, verschiedenen Mikroalgen und Daphnien und Regenbogenforellen deutlich. Letztere zeigten mit Abstand die höhere Sensibilität gegenüber kationischen Tensiden. Ähnliches dürfte, wegen des tensidischen Charakters von DOM auch für die Ökotoxizität von DOM gelten. Haitzer et al. (1999) stellten in einer vergleichenden Literaturstudie fest, dass DOM verschiedener aquatischer Ökosysteme in niedrigen Konzentrationen unter 10 mg L-1 von DOM zu hoher Biokonzentration von Schadstoffen führt. Das bedeutet, dass DOM in niedrigen Konzentrationen besser in der Lage ist Stoffe zu binden, als in hohen Konzentrationen. Gewässer-DOM ist in niedrigen Konzentrationen hydrophober und sorbiert damit hydrophobe organische Schadstoffe stärker (vgl. Absatz zum Molekulargewicht in Abhängigkeit der DOM-Konzentration, weiter oben). Für die Ökotoxizitätserhöhung durch DOM wurden bisher nur Theorien entwickelt: 1. Membranpermeabilitätserhöhung der Zellwände durch Interaktion des Xenobiotikums mit DOM oder durch DOM selbst verursacht (Stewart 1984, Steinberg et al. 1997, Campbell et al. 1997) und 2. Veränderung der Xenobiotika-Eigenschaften durch Interaktion mit DOM (Stewart 1984, Oikari et al. 1992). Park et al. (2000) fanden heraus, dass in Anwesenheit von DOM, die Mineralisierung von Xenobiotika erhöht wird. Im Fall einer höheren Ökotoxizität der Abbauprodukte, würde dies eine Toxizitätserhöhung erklären. Campbell et al. (1997) konnten nachweisen, dass es durch den amphoteren Charakter des DOM zu direkten Interaktionen der Zellmembranen von Organismen durch DOM kommt. Es könnte somit auch direkt durch veränderte Membrandurchlässigkeit auf die Toxizität einwirken. DOM fördert oder hemmt, den Abbau von organischen Xenobiotika durch photochemische Prozesse (Wang et al. 1995) oder durch Mineralisierungsverstärkung (Park et al. 2000), in Abhängikeit seiner Zusammensetzung. Es kann somit die Toxizität dieser Stoffe, in

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Abhängigkeit der Toxizität ihrer Metaboliten, vermindern oder verstärken. Sanlaville et al. 1996 stellten fest, dass aus Boden extrahierte Huminsäuren die Photolyse von Terbuthylazin, einem s-Triazin-Herbizid, durch Dealkylierung förderte, wogegen Fulvosäuren aus einem Oberflächengewässer den gegenteiligen Effekt hatten. 2.2 Phytotoxizität 2.2.1 Definition Phytotoxizität bezeichnet die Schadwirkung von chemischen Stoffen auf Pflanzen. Der Begriff entstammt der Ökotoxikologie. Diese Wissenschaft versucht anhand von Tests an ausgewählten Modell-Ökosystemen, Organismen oder an Zellkulturen das Schadpotential einer Substanz in der Umwelt zu charakterisieren (Streit 1994). Der Begriff Ökotoxikologie wurde 1969 erstmals durch Truhaut geprägt (Moriarty 1988). Toxizität ist ein Begriff aus der Medizin, der das Maß für die gesundheitsschädigende Wirkung einer Substanz oder einer physischen Einwirkung bezeichnet. Die Ökotoxikologie erweitert den primär auf den Menschen als Erkenntnis- und Schutzziel gerichteten Anspruch der Toxikologie um die Objekte der Biologie insgesamt (Rudolph & Boje 1986). Die erste Rechtssprechung, die eine Untersuchung der ökotoxikologischen Effekte forderte, war der 'Toxic Substances Control Act (TOSCA)' in den USA 1976 (Moriarty 1988). In Deutschland kam ein äquivalentes Gesetz, nämlich das 'Gesetz zum Schutz vor gefährlichen Stoffen' (Chemikaliengesetz - ChemG) am 1.1.1981 heraus. Es sieht ökotoxikologische Testverfahren zur Zulassung neuer Stoffe vor. Wichtig für die Beurteilung der Toxizität einer Substanz ist die Festlegung eines objektiven Toxizitätskriteriums. Als solches wird in der ökotoxikologischen Praxis oft der Tod des Testorganismus herangezogen, der dann die Letaldosis (LD) bestimmt. Ökologisch bedeutsamer sind hingegen Hemmungen physiologischer Leistungen, wie z.B. das Zellwachstum (Streit 1994). 2.2.2 Testmethoden Als absolute Kriterien zur Feststellung von Phytotoxizität gelten Sproß- und Wurzellänge sowie Sproß- und Wurzelgewicht, Keimungsrate und das Nichterreichen zeitentsprechender Entwicklungstadien. Weitere Kriterien stellen visuell wahrnehmbare Deformationen, Chlorosen14 und Nekrosen15 (EPPO 1997) dar, aber auch der Chlorophyll-Gehalt (Adedipe et al. 1972, Teisseire et al. 1999) und die Enzymaktivität (Gwozdz et al. 1997). Es existieren international standardisierte Pflanzentests für terrestrische Pflanzen. Der des OECD (1984) beruht auf einem deutschen Entwurf der 'Ad hoc Arbeitsgruppe der Biologischen Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft zur Entwicklung ökotoxikologischer Testverfahren im terrestrischen Bereich'. Für Deutschland hat die Biologische Bundesanstalt Berlin (1984) eine eigene Methode entwickelt, die etwas von der OECD-Methode abweicht. 13 Chlorosen=gebleichte Blätter 14 Nekrosen=vertrocknete Blattstellen

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Beide Testmethoden nehmen als maßgebendes Toxizitätskriterium das Biomassegewicht der Pflanzen, die unter konstanten klimatischen Bedingungen in definiertem Boden (pH 5-7,5; max. 1,5 % C; max. 3 % Corg; Feinpartikel (<10µm) 10-20 %; Körnung < 0,5 cm) aus Samen für 14 Tage gekeimt werden. Die deutsche Richtlinie hat anstatt des Gesamtgewichtes nur noch das Sproßgewicht als Kriterium. Es hat sich herausgestellt, dass die Frischgewichte wegen der bereits geringen Masse der Pflanzen meist zuverlässiger sind, als die Trockengewichte. Bei den Wurzelgewichten wirkt ein Zufallsfaktor mit, nämlich die Menge verbleibenden Wassers an den Wurzeln, die entweder im Wasser standen, oder von Erde mittels Wasser befreit werden mußten. Seit 1993 existiert auch der in Teil 1 des Internationalen Standards ISO16 11269-1 zur Bodenqualitätskontrolle (Soil quality - Determination of the effects of pollutants on the soil flora -) beschriebene "Wurzellängentest mit Gerste (Hordeum vulgare L.)". Hierbei gilt als Kriterium die längste Wurzel jeder Pflanze. 36-48 Stunden nach der Keimung werden die Gerstensprossen in Sand, Referenzboden und den zu testenden Boden gepflanzt und nach 5 Tagen gemessen. 1995 kam der Teil 2: Wachstumstest für höhere Pflanzen heraus. Auch er ist abgeleitet vom deutschen Entwurf für die OECD und den Richtlinien für das Chemikaliengesetz von 1984. Die vorgesehenen Teile 3 "Keimtest" und Teil 4 "Freilandpflanzentest" sind bisher noch nicht erschienen. Ebing und Mitarbeiter (1984) hatten einen Entwurf für die OECD für ein standardisiertes Testverfahren mit Pflanzenzellkulturen vorgeschlagen, der in nur zwei Tagen Ergebnisse bringt. Als Kriterium gilt hier die Aufnahme des Xenobiotikums durch die Zellen. Der Nachweis geschieht mittels radioaktiv markierter Xenobiotika. Dieser Entwurf konnte sich offensichtlich nicht durchsetzen. Neben der Pflanzenzellkultur mit radioaktivem Nachweis wurden auch andere Nachweise zur Zellaufnahme entwickelt. Zum Beispiel die Elektrolytmessung zum Nachweis der Zellwandschädigung durch Toxine (O'Brien & Prendeville 1978, Schweiger 1983, Lüttge et al. 1984, Kwon et al. 1996). Eine weitere Methode zur Kontrolle der Zellpassage ist die des Färbens mit Fluoreszein-Diacetat (Widholm 1972, Hetherington et al. 1998, Li et al. 1999). In den USA ist 1996 von der Umweltbehörde (U.S. EPA 1996) ein Keim- und Wurzellängentest (Seed Germination/Root Elongation Toxicity Test) für Kulturpflanzen (vorgeschlagene Spezies: Tomate, Gurke, Salat, Soja, Kohl, Hafer, Weidelgras, Zwiebel, Karotte und Mais) veröffentlicht worden, der seither Pflicht für die Zulassung von Pflanzenschutzmitteln ist. Hierbei werden die oben genannten, oder andere Kulturpflanzen, mindestens 10 verschiedene Spezies, auf Quarzsand in Petrischalen, im Keimschrank gelagert, bis wenigstens 65 % der Samen gekeimt haben und die Wurzeln 20 mm Länge erreicht haben. Durch "range-finding-tests" werden die zu testenden Konzentrationen ermittelt. Mindestens 6 Konzentrationen und 3 Wiederholungen mit mindestens 10 Samen werden getestet, um die EC10 und EC50-Werte für jeden Schadstoff und jede Kulturpflanze zu ermitteln.

16 ISO International Organization for Standardization

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2.2.3 Statistische Auswertung Die statistische Auswertung von Biotests ist eine schwierige Aufgabe. Es bedarf einiger Erfahrung und einigen Aufwands, um die Individualität der Testindividuen (oder "biologische Varianz") zu reduzieren. Durch die Auswahl homogener Sprößlinge, dass heißt zu große und zu kleine Testpflanzen müssen eleminiert werden und durch die Mittlung der Werte von Pflanzen aus einem Topf, werden die Meßwerte homogenisiert (vergl. dazu auch Moewus 1949). In der Regel liegt die Sensitivitätsschwelle zwischen 10 und 30 %, insbesondere im Bereich der NOEC17 (Moore & Caux 1997), in Abhängigkeit von der Anzahl der Wiederholungen und der Anzahl der getesteten Konzentrationen. Dies ist insbesondere auch ein Problem der unbehandelten Kontrollen, die im Regelfall eine deutlich höhere Varianz aufweisen, als die eindeutig toxisch wirkenden Xenobiotika-Konzentrationen. Ein Mittel zur Erreichung signifikant unterschiedlicher Daten wäre daher die Erhöhung der Wiederholungen auf deutlich über 20 (Pestemer & Günther 1993). Die Konzentrations-Wirkungskurven und die Effekt-Konzentrationen der Xenobiotika werden mittels nichtlinearer Regression ermittelt. Oft angewendet wird die, eine symmetrische sigmoide Kurve beschreibende Regression, von Streibig (1980), wobei Biomasse mit der log(Konzentration) in Verbindung gesetzt wird. 2.3 Kombinationswirkungen Kombinationswirkungen werden als "additiv", "antagonistisch" oder "synergistisch" beschrieben. Als "additiv" bezeichnet man die Wirkung, wenn durch die Kombination von Xenobiotika die negative Wirkung jedes Xenobiotikums einfach addiert werden kann. Als antagonistisch beschreibt man eine Kombinationswirkung, bei der die Wirkung der Xenobiotika vermindert wird. Ein synergistischer Effekt, beschreibt eine Verstärkung des Effektes, der durch Addition der Einzelsubstanzwirkungen entstehen würde. Altenburger et al. (1993) werteten die Literatur der letzten 10 Jahre zu Kombinationswirkungen im aquatischen Bereich aus. Dabei stellten Sie fest, dass die Kombinationswirkung hauptsächlich mit drei verschiedenen Methoden ausgewertet wurde: den "Mixture Toxicity Index" (MTI= 1-log S/ (log S - log(max(ci/ECi))) (Könemann 1981); die "Toxic Unit Summation" (S=c1/EC1+c2/EC2) Summierung toxischer Einheiten, bei der

die individuelle Konzentration eines Xenobiotikums (ci) im Kombinationsversuch durch die Effektkonzentration (ECi) dividiert wird, die beim Schadstoff im Einzelversuch die gleiche Wirkung erzielt hat (S=Summe der toxischen Einheiten). Ist S=1, ist die Wirkung additiv, ist sie kleiner als 1, antagonistisch und wenn sie größer als 1 ist, synergistisch (Sprague 1970); und

die "Multiple Regressionsanalyse", die eine lineare Beziehung der Einzelwirkstoffe und eine Normalverteilung aller Variablen voraussetzt. Letztere benutzten auch Teisseire et al. (1999) in ihrer Studie über die Kombinationswirkung von Diuron mit Kupfer bzw. Folpet (N-[(trichloromethylthio)phtalimide]) an Lemna minor.

17 NOEC no observed effect concentration

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Neben den oben genannten Verfahren wird oft auch die Isobolographie nach Loewe & Muischnek (1926) verwandt, die jedoch auf die Kombination von zwei Stoffen ähnlicher Wirkungsweise beschränkt ist. Greco et al. (1992) legten in einem Konsens einer interdisziplinären internationalen Arbeitsgruppe fest, dass nur das Konzept der sogenannten "Konzentrations-Additivität" (Loewe & Muischnek 1926, Sprague 1970) und das der sogenannten "Unabhängigen Wirkung" (Bliss 1939, Plackett & Hewlett 1948, Colby 1967) nach dem Stand der Forschung allgemein gültig sind. Hierbei beschreibt das Konzept der Konzentrations-Additivität das Phänomen, dass sich eine Substanz in bezug auf den untersuchten Wirkparameter wie die Verdünnung einer anderen verhält (Grimme et al. 1998). Dies ist nur dann der Fall, wenn die untersuchten Xenobiotika ähnliche Wirkungsweisen haben. Umstritten ist, ob dieses Konzept auch für Xenobiotika unähnlich wirkender Substanzen Validität hat (Greco et al. 1992). "Unähnliche Wirkung" wird definiert als eine primäre Interaktion mit verschiedenen Wirkorten und die Auslösung eines gemeinsamen Effektes über unterschiedliche Wirkketten. Unter diesen Bedingungen bleibt der relative Effekt einer Substanz in Gegenwart einer zweiten Substanz unverändert. Mathematisch ausgedrückt hieße das: Wird die Population durch eine Substanz halbiert, durch die zweite unabhängig wirkende auch, ergibt sich eine Erhöhung der Wirkung um 25 % auf 75 %. Grimme et al. (1998) kritisierten die oben genannten konservativen Begriffe der Kombinationswirkung wie "additiv", "antagonistisch" und "synergistisch" als uneindeutig. Da sie nur die lineare Wirkungsweise ähnlich wirkender Xenobiotika als, entsprechend der Erwartung (additiv), geringer als erwartet (antagonistisch) oder größer als erwartet (synergistisch) beschreiben kann. Würde man die Begriffe auf die "Unabhängige Wirkung" anwenden, würden die gleichen Begriffe Unterschiedliches beschreiben. Synergistisch im Sinne der "Unabhängigen Wirkung" wäre möglicherweise "antagonistisch" im Sinne der "Konzentrations-Additivität". Deshalb setzte sich im Konsens der internationalen Arbeitsgruppe, zusammengefaßt von Greco et al. (1992) die Begriffsbestimmung "Loewe additivity" für die Konzentrations-Additivität und "Bliss independence" für die unabhängige Wirkung durch. Wenn von Antagonismus oder Synergismus geredet wird, dann als "Bliss Antagonismus" oder "Loewe Antagonismus" und entsprechend für Synergismus. Grimme et al. (1998) faßten die Ergebnisse in einer Studie zu eben dieser Problematik der Kombinationswirkungen zusammen: "Der toxische Gesamteffekt eines Stoffgemisches ist im Regelfall größer, als der jeder Mischungskomponente allein. Auch wenn jeder Einzelstoff in einer Konzentration vorliegt, die im Experiment keine signifikanten Effekt erkennen läßt, kann die Gesamtbelastung dennoch zu einem deutlich meßbaren Schaden führen. Dieser Sachverhalt gilt für multiple Gemische aus ähnlich wirkenden Substanzen, wie auch für Gemische aus Substanzen mit unähnlichen Wirkungsmechanismen." 2.4 Wirkung von DOM auf Pflanzen Literatur, die sich speziell mit der Wirkung von DOM auf Pflanzen beschäftigt, ist rar. Grimvall et al. (1991) und Brunner et al. (1996) befaßten sich mit dem Thema und fanden heraus, dass vor allem die hochmolekulare Fraktion negative Wachstumseffekte hervorruft. Stevenson (1982) hingegen beschreibt, dass insbesondere Phenolsäuren, die dem chemisch definierten Anteil im DOM angehören und andere Lipide phytotoxisch wirken können. Pflugmacher et al. (1999) fanden eine Reduktion der Photosynthese der aquatischen

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Makrophyte Ceratophyllum demersum schon bei Konzentrationen von 0,25-1,0 mg L-1 DOM, sowie eine Beeinflussung der detoxifizierenden Enzyme Guajacol Peroxidase und Glutathion S-Tranferase bei derselben. Stolte & Graneli (2000) fanden eine Reduktion der Zellanzahl bei der Meeresalge Prymnesium petelliferum durch Behandlung mit DOM aus Flußwasser mit einem Molekulargewicht größer 1000 Dalton. Hingegen wurde die Wirkung von Huminstoffen intensiv untersucht. Die Forschung auf diesem Gebiet faßten Chen & Aviad (1990) zusammen. Generell läßt sich feststellen, dass Pflanzen auf Huminstoffe mit Wachstumsstimulation reagieren. Die Wasseradsorption, Respiration, Photosynthese und Keimungsrate und die Wurzelbildung erhöhen sich in Anwesenheit von Huminstoffen. Wurzellänge, Anzahl der Lateralwurzeln und Wurzelbiomasse erhöhen sich noch stärker als die Sproßbiomasse. Huminstoffe haben auch eine Wirkung durch Blattbesprühung, dort sogar bei 100x geringerer Dosierung, als bei der Aufnahme durch die Wurzeln. Auf sehr hohe Dosierungen reagieren die Pflanzen jedoch mit Biomasseverlusten. Angaben über die Dosierungen variieren allerdings erheblich, vermutlich wegen der Differenzen ihrer Zusammensetzung bzw. Herkunft. In Agarmedium bewirkte bereits eine Dosis von 100 mg L-1 Huminsäure eine Biomassereduktion von Mais (Ivanova 1965). Mylonas & McCants (1980a, b) berichteten von Biomasseeinbußen bei Konzentrationen von 1000 mg L-1. Tan & Nopamornbodi (1979) fanden negative Effekte erst bei 3200 mg L-1, während Dosierungen von 1600 mg L-1 noch positive Effekte erzielten. Goenadi & Sudharama (1995) beobachteten ein vermindertes Wachstum bereits bei 400 mg L-1 Huminsäuren, während David et al. (1994) negative Effekte erst bei 2560 mg L-1 feststellten und bei einer Konzentration von 1280 mg L-1 die Effekte noch positiv waren. Für die Fulvosäuren fanden Lulakis & Petsas (1995) eine Sproßlängenverkürzung von Tomatenpflanzen bei 2000 mg L-1, die Zahl der Wurzeln nahm bereits mit 1000 mg L-1 Fulvosäuren ab, die Länge der Wurzeln blieb jedoch unberührt. Die Wirkung der Huminstoffe wird zurückgeführt auf ihre Fähigkeit Nährstoffe in Lösung zu bringen, insbesondere Phosphat, aber auch die anderen Makronährstoffe, wie Stickstoff, Kalium, Calcium und Magnesium und Mikronährstoffe, wie Eisen, Zink und Mangan. Auf der anderen Seite binden sie auch toxische Elemente, wie z.B. Kupfer oder auch Cadmium. Sie wirken darüber hinaus auch auf die Enzymsynthese und Enzymaktivität (z.B. Phosphatase, Invertase, Cholinesterase und Peroxidase) (Chen & Aviad 1990). 2.5 Wechselwirkungen von DOM und organischen Xenobiotika auf Pflanzen Auf diesem Gebiet findet nach meinem derzeitigen Kenntnisstand keine Forschung statt. Einzig die Arbeitsgruppe von Loffredo arbeitet mit Humin- und Fulvosäuren aus verschiedenen Quellen und hat dazu einige Arbeiten veröffentlicht (Senesi & Loffredo 1994, Loffredo et al. 1995a, b, c, Loffredo et al. 1997). Sie untersuchten Huminsäuren extrahiert aus einer Terra rossa (0-10 cm), demselben Boden mit Klärschlamm gedüngt und aus dem Klärschlamm direkt. Diese Huminsäuren kombinierten sie mit Alachlor, Imazethapyr und Rimsulfuron. Die Kombinationswirkung war in der Variante mit der Huminsäure aus Klärschlamm synergistisch negativ verstärkt. In dem Einzeltest der Huminsäure aus Klärschlamm (Loffredo et al. 1995a) ergab sich bei 10 mg L-1

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Huminsäure eine positive Wirkung, während bei 100 mg L-1 die Wirkung nicht signifikant zur Kontrolle war. Die Kombinationswirkung mit allen oben genannten Herbiziden ergab jedoch eine synergistisch negative Wirkung. In einem anderen Versuch wurden die Huminsäuren in einer Konzentration von 200 mg L-1 getestet (Loffredo et al. 1995c, 1997). In dieser Konzentration hatte die Huminsäure aus Klärschlamm negative Wirkung, Huminsäure aus Boden und Huminsäure aus mit Klärschlamm gedüngtem Boden jedoch nicht. In der Kombination mit den Herbiziden wirkten die Huminsäuren aus dem Boden und aus dem mit Klärschlamm gedüngten Boden antagonistisch, d.h. sie glichen die negativen Reaktionen der Pflanzenschutzmittel mehr oder weniger aus. Huminsäure aus Klärschlamm hatte signifikant negative Wirkung in Kombination mit den Herbiziden, bis auf die Kombination mit Imazethapyr. Dort hatte sie positiv gewirkt. Auch Laegreid et al. (1983) fanden einen Zusammenhang zwischen der Herkunft des DOM und der Kombinationswirkung mit Cadmium bei der Alge Selenastrum capricornutum (Printz), nicht jedoch mit der absoluten Menge von DOM. Sie vermuten, dass bestimmte niedermolekulare Huminstoffe die Metallaufnahme fördern und damit die Toxizität erhöhen. 2.6 Wirkung von Paraquat, 2,4-D und Naphthalin auf Pflanzen Die Wirkung der beiden Herbizide Paraquat und 2,4-D ist größtenteils geklärt. Wenig Literatur gibt es zu der Wirkung von polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAK), zu denen Naphthalin gehört, auf Pflanzen. Chaîneau et al. (1997) untersuchten die Wirkung von Dieselbenzin-PAK auf Pflanzen und fanden heraus, dass diese am stärksten auf leicht aromatische PAK und Naphthaline reagieren. Sie untersuchten dabei Salat (Lactuca sativa L.), Gerste (Hordeum vulgare L.), Weizen (Triticum aestivum L.), Klee (Trifolium repens L.), Mais (Zea mays L.), Bohne (Phaseolus vulgaris L.) und Sonnenblume (Helianthus annuus L.) nach den von der AFNOR18 standardisierten Keim- und Wachstumstests. Wild & Jones (1992) untersuchten die Aufnahme von PAK aus Klärschlamm gedüngten Böden durch Karotten (Daucus carota) und fanden ebenfalls eine deutliche Präferenz der Aufnahme niedermolekularen PAK, Naphthalin, Ace/Fluoren und Phenanthren. Diese Erkenntniss wird von zahlreichen Autoren gestützt, die über erhöhte Toxizität der PAK durch Photoreduktion berichten (Schoeny et al. 1988, Warshawsky et al. 1995, Arfsten et al. 1996, Ren et al. 1996, Huang et al. 1997, Marwood et al. 1999). Die höher-kondensierten PAK, ab 3 Phenolringen, dagegen werden offensichtlich zwar von den Pflanzen aufgenommen, insbesondere über Luftdeposition (Peklo et al. 1999), schädigen die Pflanzen nicht (Chaîneau et al. 1997), da sie metabolisiert werden (Harms & Kottutz 1992). Paraquat (1,1 Dimethyl-4,4'-bipyridylium-dichlorid) ist ein Vertreter der Bipyridiliumsalze und wird auch Methylviologen genannt. Es ist ein sogenanntes Kontaktherbizid, das heißt, es wirkt auf das Blatt, auf das es aufgesprüht wird. Paraquat hemmt die Photosynthese im ersten Photosystem. Es dirigiert den Elektronenfluß in die falsche Richtung anstatt Ferrodoxin und NADP (Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat) werden Methylviologene vom Photosystem I reduziert. Lichtabhängig enstehen dann aus den Methylviologenen hochtoxische freie Sauerstoffradikale (O2

-). Einer der ersten sichtbaren Effekte von Paraquat auf die Pflanzenzelle ist der Abbau zellulärer Membranen, insbesondere von Tonoplast und

18 AFNOR Association Française de NORmalisation, französischer Normungsverband

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Plasmalemma (Hock & Elstner 1995). Sáenz et al. (1993) fanden EC50-Werte von 0,047-1,95 mg L-1 bei der Alge Scenedesmus acutus, in Abhängigkeit von der Expositionsdauer (24-96 h). 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, kurz "2,4-D" genannt, ist ein Herbizid mit Auxinwirkung. Ihr wesentlicher Unterschied zu den natürlichen Auxinen, Wachstumshormonen, ist, dass das synthetische Auxin in den Pflanzen schlecht oder gar nicht inaktiviert werden kann. Vermutlich blockiert es dadurch den Auxinrezeptor (Hock & Elstner 1995). Kratky & Warren (1971) erreichten Biomassereduktionen von 50 % und mehr mit Konzentrationen von 1 mg L-1 2,4-D bei Sorghum, Hafer und Gurke. 3 Experimentelle Arbeit 3.1 Materialien und Methoden 3.1.1 Extraktion von DOM Zur Extraktion von DOM wurde die Bodengleichgewichtslösung gewählt, weil sie von allen in Kapitel 3.1.2 erläuterten Methoden, die am besten reproduzierbaren Ergebnisse liefert und immer in der gleichen DOC-Konzentration gehalten werden kann. Bodenproben wurden im Verhältnis 1:2, Weizenstroh und Kompost im Verhältnis 1:10 mit Leitungswasser angesetzt, in Anpassung an die unterschiedlichen Kohlenstoffgehalte der Ausgangsubstanzen. Leitungswasser wurde anstelle von destilliertem Wasser gewählt, weil die Leitfähigkeit einen entscheidenen Einfluß auf die Zusammensetzung von DOM hat. Extraktionen mit destilliertem Wasser führen zu höheren DOM-Konzentrationen. Die Leitfähigkeit von Regenwasser ist ca. zwei Potenzen höher als die von Regenwasser, hat aber eine ähnliche chemische Zusammensetzun (vgl. auch Maanen et al. 2001). Durch seine hohe Leitfähigkeit ist Leitungswasser ein mildes Extratkionsmittel. Auf Rühren wurde verzichtet, um möglichst naturnahe Bedinungen zu erreichen. Das Gefäß wurde nur geschwenkt, um das Material vollständig zu benetzen. Nach 24 Stunden, nachdem erfahrungsgemäß ein Gleichgewicht zwischen fester und flüssiger Phase erreicht ist, wurde das DOM durch eine 45µm-Filterung gewonnen. Grünlandboden für die Kombinationsversuche wurde an vier verschiedenen Terminen von der gleichen Stelle am Institut entnommen und zwar am 20.11.97, am 5.03.98, am 15.05.99 und am 7.06.00. Der Boden wurde dann bis zum Gebrauch tiefgefroren gelagert. Das Leitungswasser (Trinkwasser aus Beelitzhof) hat eine Karbonathärte von 10,9-12,9 und einen pH-Wert von 7,4-7,5. Dominierendes Kation ist Natrium mit 43-61 mg L-1, als Anion dominiert Sulfat mit 87-90 mg L-1 (Berliner Wasserbetriebe 1999, 2000, 2001). 3.1.2 Bestimmung von DOC (dissolved organic carbon) Der Gehalt an gelösten organischem Kohlenstoff wurde mittels Shimadzu TOC-Analyser ermittelt. Hierbei findet eine katalytische Oxidation bei 680 °C statt, um den anorganischen Kohlenstoff freizusetzen. Es wurde die Meßmethode des nicht ausblasbaren organischen Kohlenstoffes, als die zuverlässigere Methode zur Bestimmung des DOC, ausgewählt. Die

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Probe wird hierfür erst einmal mit Salzsäure (HCl) auf pH 2 angesäuert und mit synthetischer, d.h. CO2-freier Luft ausgeblasen. Der Meßbereich des benutzten "normalsensitiven" Katalysators aus Platin auf Aluminiumoxid-Kügelchen liegt bei 1-5000 mg L-1. 3.1.3 Charakterisierung von DOM Zur Charakterisierung von DOM wurden mehrere Methoden benutzt. Es wurde eine Gleichgewichtsdialyse zur Bestimmung der molekularen Zusammensetzung; eine Adsorberharz-Fraktionierung nach Leenheer (1981) zur Bestimmung der Polarität und der ionischen Eigenschaften, sowie eine Fluoreszenzspektroskopie zur qualititiven Charakterisierung eingesetzt. Für die Fraktionierung in vier Molekülgruppen, Fraktion 1 < 1000 Dalton, Fraktion 2 > 1000 und < 10.000 Dalton, Fraktion 3 > 10.000 und < 100.000 Dalton und Fraktion 4 größer 100.000 Dalton, wurden drei Dialyse-Schläuche aus Cellulose-Ester (Spectra/Por) verschiedener Porengröße, 1000 Dalton, 10.000 Dalton und 100.000 Dalton, benutzt. Die Dialyse-Schläuche wurden mit destilliertem Wasser vorgereinigt und wegen möglicher Bindung mit DOM vorher mit der einzufüllenden DOM innen durchgespült. Die DOM in der eluierten Konzentration, wurden mit konzentrierter Salzsäure (HCl) auf einen pH-Wert von 2,0 angesäuert. Jeweils 5 ml der angesäuerten DOM wurden in einen Schlauch gegeben, der mit Klammern verschlossen wurden. Der mit DOM gefüllte Schlauch wurde dann in einen mit 200 ml NaCl-Lösung gefüllten Erlenmeyerkolben gehängt. Es wurde soviel NaCl zugefügt, bis das destillierte Wasser die gleiche Leitfähigkeit der extrahierten DOM erreicht hatte. Die Dialyse fand dann unter Rühren für 24 Stunden bei 20 °C statt. Die Fraktionierung geschieht durch das Bestreben der Lösung ein Konzentrationsgleichgewicht herzustellen. Es dringt Wasser in die konzentrierte Lösung und der dadurch ansteigende osmotische Druck presst dann die Teilchen, die durch die jeweiligen Poren dringen können zurück in die Lösung mit niedrigerer Konzentration. Die Adsorberharz-Fraktionierung wurde zunächst nach Leenheer (1981) durchgeführt (siehe Abb. 1) mit drei verschiedenen Makroporharzen (Amberlite-XAD-819, Bio-Rad AG-MP-5020 und Duolite A-721). XAD 8 ist ein ungeladenes Harz, Bio-Rad AG-MP-50 ein Kationen-Austauschharz und Duolit A-7 ein Anionen-Austauscherharz. Die Fraktionierungen liefen mit jeweils fünf Parallelen. Jeweils 80 mL, auf pH 2 eingestellte DOM, wurde dafür mittels einer Pumpe mit 1 mL min-1 durch die mit den Harzen gefüllten Glassäulen geschickt. Die zugelassene höchste DOC Konzentration beträgt 15 mg L-1. Aufbau und Vorbehandlung der Säulen: Die 10 cm langen und 7 mm dünnen Glassäulen wurden unten mit Glaswolle verschlossen und mit den mit bidestilliertem Wasser aufgeschwämmten Harzen (Ausnahme XAD-8, dieses wurde mit Methanol aufgeschwämmt) zu 4/5 gefüllt (Ausnahme Duolite A-7, hier wurde die Säule nur zu 2/3 gefüllt). Die Verbindungsschläuche zwischen den Säulen bestanden aus Silikon, die Absperrventile aus Teflon. Die Säulen wurden in Methanol gelagert und zur Fraktionierung vorher über Nacht mit bidestilliertem Wasser mit einer Durchflußrate von 1

19 hydrophobes, aromatisches Methylmethacrylat-Copolymer Harz mit durchschnittlich 25 nm Porengröße 20 sulfoniertes, stark saures Polystyrolharz 21 schwach basisches Phenol-Formaldehyd-Kondensationsprodukt

25

mL min-1 gespült. Danach wurden die Harze vor der Analyse nochmals einzeln mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 4 mL min-1 gespült und zwar: XAD-8 1.) 20 mL Methanol 2.) 100 mL bidest. H2O 3.) 100 mL 0,1 M HCL 4.) 100 mL bidest. H2O 5.) 100 mL 0,1 M NaOH 6.) 100 mL bidest. H2O AG-MP-50 1.) 100 mL 0,1 M HCl 2.) 100 mL bidest. H2O Duolite A-7 1.) 100 mL 0,1 M HCl 2.) 100 mL bidest. H2O Nach der Reinigung wurde bidestilliertes Wasser durch die Säulen geschickt und Proben für die Blindwerte entnommen. Die so ermittelten DOC-Blindwerte wurden von den Werten der DOM-Proben abgezogen. Alle Glasbehälter wurden mit 0,1 M HCl und anschließend mit bidestilliertem Wasser im Ultraschallbad gereinigt. 80 mL DOM wurden für die Fraktionierung verwendet. Die ersten 50 mL wurden durch alle Säulen geschickt und verworfen. Die nächsten 10 mL wurden durch alle Säulen geschickt und entnommen (hydrophile Neutrale, Fraktion 1), die nächsten 10 mL wurden nur noch durch die oberen zwei Säulen geschickt (hydrophile Säuren+hydrophile Neutrale, Fraktion 2) und die nächsten 10 mL nur noch durch die oberste Säule (Summe: Hydrophile, Fraktion 3). Für die Extraktion der hydrophoben Säuren, die an das XAD-8 binden, wurden 50 mL 0,1 M NaOH durch die XAD-8 Säule geschickt und die Konzentration von DOC in den 50 mL NaOH gemessen (Fraktion 4). Während dieses Elutionsvorgangs erhöht sich der pH-Wert von 2 auf 13. Die verschiedenen Fraktionen wurden wie folgt ermittelt: hydrophile Säuren = Fraktion 2-Fraktion 1 (80 mL/1000 mL) mg L-1 hydrophile Neutrale = Fraktion 1 (80 mL/1000 mL) mg L-1 hydrophile Basen = Fraktion 3-Fraktion 2 (80 mL/1000 mL) mg L-1 hydrophile Säuren = Fraktion 4 (50 mL/1000 mL) mg L-1 Wegen der starken Schwankungen der Parallelen in den Unterfraktionen (Basen, Säuren und Neutrale), wurde in der Folge nur noch mit XAD-8 in hydrophile und hydrophobe Anteile fraktioniert. Die durch XAD-8 gebundene Fraktion wird mit dem Huminstoffanteil, also Fulvo- und Huminsäuren gleichgesetzt (Thurman & Malcolm 1981). Der Anteil der Fulvosäuren beträgt von den Huminstoffen rund 90 %, jedenfalls in Gewässern, der Rest sind Huminsäuren (Martin-Mousset et al. 1997).

26

Amberlite XAD-8 Adsorberharz

hydrophobe Säuren, von der Säule wieder

heruntergelöst

0,1 N NaOH

hydrophile Basen

hydrophile Säuren

hydrophile Neu

Probe auf pH 2 angesäuert mit HCl

AG MP-50 Kationenaustauscherharz

z

2. Schritt

1. Schritt

Abbildung 1: Schema der DOM-Fraktionierun

27

Duolite A-7 Anionenaustauscherhar

trale

g nach Leenheer (1981)

Die Fluoreszenzspektroskopie wird in der Charakterisierung von Huminstoffen erst rund 10 Jahre eingesetzt (Shotyk & Sposito 1990). Es gibt derzeit im Verhältnis zu allen anderen spektroskopischen Methoden noch wenig Literatur über die Peaks bestimmter organischer Stoffgruppen. Fluoreszieren können nur sogennante chromophore Verbindungen, die mindestens drei konjugierten Doppelbindungen besitzen (Klages 1961). Dazu gehören grundsätzlich alle Aromate. Somit läßt sich die unterschiedliche Aromatizität von DOM durch veränderte Fluoreszenzintensität nachweisen (Senesi 1990). Insbesondere die 3-D- Fluoreszenzkonturenspektren geben eine Art Fingerabdruck (vgl Abb. 2). Blaser et al. (1999) versuchten bereits, trotz dünner Informationslage, bestimmte Peaks von Synchron-Scan-Konturen-Spektren bestimmten organischen Verbindungen zuzuordnen. a) b) c)

a) b) c)

Abbildung 2: Beispiel von 3-D Fluoreszenzspektren als Fingeabdrücke (a) Stroh, (b) Grünlandboden, (c) Leitungswasser

Die Einstellungen zur Fluoreszenspektroskopie waren für die Emissionsmessung eine Spalteinstellung von 2,5 nm für die Anregung und von 10 nm für die Emission bei einer Scan-Geschwindigkeit von 30.000 nm min-1 und einer Anregungsstrahlung von 254 nm. Für die 3-D Konturenspektren wurde eine Spalteinstellung von 2,5 nm sowohl für Anregung als auch für die Emission, sowie ein Scan-Bereich von 200-500 nm für die Anregung und 200-600 nm für die Emission gewählt. Gemessen wurde mit einem Hitachi F-4500 Fluoreszenzsprektrometer. Die frischen Proben wurden vor der Spektroskopie 5 min lang mit N2-Gas ausgeblasen, um Sauerstoff, einen der häufigsten Auslöscher (Quencher) von Fluoreszenz, so niedrig wie möglich zu halten. Zum Verständnis der Spektren siehe Abb. 3.

28

Abbildung 3: Schema des Fluoreszenz-Emissionsspektrums Die Y-Achse beschreibt die Intensität der Fluoreszenz, die in willkürlichen Einheiten angegeben wird. Die Y-Achse wurde deshalb im Folgenden weggelassen, wird aber immer im gleichen Maßstab angegeben. Der erste und vierte Peak ergeben sich aus dem Streulicht, der zweite und fünfte Peak stellen den Raman-Effekt dar. Er entsteht durch die sogenannte Rayleigh-Streuung, einer sekundären Streuung durch von Molekülen reemittierte längerwellige Strahlung. Die eigentliche Fluoreszenz beschreibt der dritte Peak, der bei den nur schwach aromatischen Boden-DOM typischerweise keinen echten Peak zeigt (vgl. Zsolnay et al. 1999).

29

3.1.4 Kriterien zur Auswahl der verwendeten DOM-Quellen In Vorversuchen wurden DOM aus sieben verschiedenen Quellen mittels XAD-8 Fraktionierung charakterisiert. Dies waren Grünlandboden (0-10 cm), Acker (0-10 cm), Nadelwaldboden (0-10 cm), Laubwaldboden (0-10 cm), Kompost, Schweinegülle und Weizenstroh. Die landwirtschaftlichen Flächen sind nachweislich seit 1969 nicht mit Pflanzenschutzmitteln behandelt worden. Das Weizenstroh entstammte einem ökologischen Landbau-Betrieb. Die Fraktionierung ergab, dass die Extrakte „Grünlandboden“ und „Weizenstroh“ die gegensätzlichsten Zusammensetzungen aufweisen (siehe Tab. 2). Für die weiteren Versuche wurden daher Grünlandboden-DOM und Weizenstroh-DOM verwendet. Beim Grünlandbodenextrakt dominieren die hydrophoben Bestandteile (56,7 %). Bei Weizenstroh dominieren die Hydrophilen (75,4 %). Als Modellsubstanzen wurde einerseits nicht humifiziertes organisches Material (Weizenstroh) und auf der anderen Seite gut humifiziertes Material (Grünlandboden) miteinander verglichen und ihre Auswirkungen untersucht. Damit wurde die Bandbreite der in der landwirtschaftlich genutzten Flächen auftretenden DOM abgedeckt. Klärschlamm wurde explizit nicht verwendet, weil dieser erhebliche Mengen an Xenobiotika und damit potentielle Pflanzentoxine beinhaltet, die eine Betrachtung der DOM-Wirkung an sich unmöglich gemacht hätten.

Tabelle 2: Qualitative Zusammensetzung verschiedener DOM-Quellen nach der XAD-8-Fraktionierung Angaben in (%), Standardabweichung in Klammern unter den Werten (n=5)

Grün-

land-

boden

Nadel-

wald-

boden

Kompost Schweine-

gülle

Acker-

boden

Laub-

wald-

boden

Weizen-

stroh

mg DOC L-1 17,8 18,7 46,2 222 9,4 18,3 1.749

Hydrophile 43,3

(4,8)

47,0

(1,04)

47,0

(2,4)

51,3

(1,4)

51,7

(4,3)

55,7

(29,2)

75,4

(1,8)

Hydrophobe 56,7

(4,8)

53,0

(1,04)

53,0

(2,4)

48,7

(1,4)

48,3

(4,3)

44,3

(29,2)

24,622

(1,8) 22 Elementarzusammensetzung von einer aus Weizenstroh gewonnener Fulvosäure: C 550,0 g kg-1

O 357,0 g kg-1

H 52,0 g kg-1

N 8,5 g kg-1 S 4,6 g kg-1 P <1,0 g kg-1

COOH 5,5 mmol charge g-1 -OH 0,7 mmol charge g-1 (Grossl & Inskeep 1992)

30

Die Bodenproben für die Grünlandboden-DOM wurden an vier verschiedenen Probenahmeterminen vom selben Standort gezogen (20.11.97, 5.03.98, 15.05.99 und 7.06.00).

3.1.5 Kriterien zur Auswahl der organischen Xenobiotika Da das Ziel dieser Arbeit ist, systematische Wirkungsweisen von DOM auf die Ökotoxizität organischer Xenobiotika herauszufinden, wurden die Xenobiotika nach ihren chemischen Eigenschaften ausgesucht. Hierbei war es wichtig, Xenobiotika mit möglichst konträren chemischen Eigenschaften auszusuchen. Paraquat wurde als Vertreter eines zweifach positiv geladenenen, basischen Xenobiotikums, 2,4-D als Vertreter einer Säure und Naphthalin als unpolares Xenobiotikum, das phytotoxische Auswirkungen hat, ausgewählt. PAK gehören zu den am häufigsten getesteten Umweltgiften deren Kombinationswirkung mit DOM untersucht wurde (Haitzer et al. 1998). Höher molekularere, unpolare Xenobiotika als Naphthalin, sind nicht mehr phytotoxisch und konnten somit nicht in die Tests mit einbezogen werden. 2,4-D (Strukturformel siehe Abb. 4) gehört neben Mecoprop und Dichlorprop zu den am häufigsten verwendeten Herbiziden (Gintautas et al. 1992). Es wurde im Grundwasser in den USA (Gintautas et al. 1992) und Europa (Fielding et al. 1992) nachgewiesen. Es wird in Dosierungen von ca. 1,5 kg Reinwirkstoff ha-1 angewendet.

Abbildung 4: 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure "2,4-D", Strukturformel Paraquat (Strukturformel siehe Abb. 5) ist mit Anwendungsbeschränkung in Deutschland zugelassen. Seine Anwendungsgebiete sind die Vernichtung von ein- und zweikeimblättrigen Kräutern durch Austrocknen der Blätter, im Weinbau, Mais- und Zuckerrübenanbau und in der Baumschulsaat sowie die Ernteerleichterung von Gräsern (BBA 2001). Die Anwendungsdosierung liegt bei ca. 1 kg Reinwirkstoff ha-1. Es gilt, im Gegensatz zu 2,4-D, als nicht mobil und damit nicht Grundwasser gefährdend (Helling 1971, Matthess 1994). In Grundwasser ist Paraquat bisher auch nicht nachgewiesen worden.

Abbildung 5: 1,1'-Dimethyl-4,4'-bipyridylium-dikation, "Paraquat", Strukturformel Naphthalin (Strukturformel siehe Abb. 6) wird als Mottenschutz- und Gerbmittel verwendet, entsteht aber auch bei der Verbrennung fossiler Brennstoffe und von Polystyrol und ist deshalb ein weit verbreitetes organisches Xenobiotikum (Streit 1994). Naphthalin ist von 20 ausgewählten weit verbreiteten PAK zu 89,8 % für die PAK-Konzentration von Kohlefeuerung und zu 55,6 % für die PAK-Konzentrationen von Benzinabgasen verantwortlich (Khalili et al. 1995). Es steht deshalb auf der Liste der wichtigsten Xenobiotika der amerikanischen Umweltbehörde (EPA). Sein Hauptmetabolit Naphthol ist

31

Hauptkomponent vieler Pflanzenschutzmittel, so auch des Herbizids Napropamid und des Insektizids Carbaryl (Chen et al. 1992). Die Humantoxizität der ausgewählten Xenobiotika nimmt in der Reihenfolge: Paraquat > 2,4-D > Naphthalin ab (vgl. Tab. 3, NIOSH 1994).

Abbildung 6: Naphthalin, Strukturformel

Tabelle 3: Übersicht über die chemisch-physikalischen und toxischen Eigenschaften der ausgewählten organischen Xenobiotika

chemische

Bezeich-

nung

CAS.-Nr. Summen-

formel

Mole-

kular-

gewicht

Siede-

punkt

°C

Dampf-

druck bei

20°C

Löslichkeit

in Wasser

bei 20°C

Ver-

teilungs-

koeffizient

chem.

Charakter

im pH-

Bereich

von Böden

akute

Human-

toxizität

bei Ein-

atmung

(g/mol) (Pa) (g L-1) (log Pow) (mg pro

m³)23

Paraquat 1,1'-

Dimethyl-

4,4'-bi-

pyridylium

4685-14-7 [C12H14N2 ]2+ 186,26 300 10-3 sehr gut - zwei-

wertiges

Kation

1

2,4-D 2,4-

Dichlor-

phenoxy-

essigsäure

94-75-7 C8H6Cl2O3 221,04 160 <10-5 0,57 0,11 Anion,

Säure

100

Napthalin Naphthalin 91-20-3 C10H8 128,18 218 7,2 0,026 3,36 neutral 1310

Es wurde Naphthalin der Fa. Fluka mit einem Reinheitsgrad von 99,0 %, 2,4-D der Fa. Fluka mit einem Reinheitsgrad von ~95 % und Paraquat der Fa. Aldrich mit einem Reinheitsgrad von 98 % verwendet.

23 IDLH (Immidiately Dangerous to Life and Health) Konzentrationen des National Institutes for Occupational

Safety and Health (NIOSH) der USA

32

3.1.6 Kriterien zur Auswahl der zu testenden Konzentrationen Zur Ermittlung der Effektkonzentrationen wurden Konzentrations-Wirkungstests24 mit 5 Konzentrationen pro verwendeter Substanz und jeweils 5 Parallelen durchgeführt. Statistisch bedingt entspricht der aus den Konzentrations-Wirkungskurven ermittelte EC50

25 mit der höchsten Wahrscheinlichkeit einer realistischen Toxizitätsbewertung, gegenüber allen anderen Effekt-Konzentrationen. Deshalb sollten die Xenobiotika aber auch Stroh-DOM in EC10

26, der mit dem NOEC27 gleichzusetzen ist (Pestemer & Pucelik-Günther 1997) und EC50-Konzentrationen getestet werden, um so herauszufinden, ob sich durch den Einfluß von DOM diese Toxizitätsstufen ändern. Nur so ist eine echte Kombinationswirkung ermittelbar. Für Grünlandboden-DOM konnte kein Effekt ermittelt werden, weil die gewonnenen Konzentrationen zu keiner Wirkungskurve führte. 3.1.7 Bindungstests von DOM mit organischen Xenobiotika Die Tests zur Bindung von DOM an die verwendeten Xenobiotika wurden mittels Gleichgewichtsdialyse (Dialyseschlauchporenweite 1000 Dalton) nach der Methode Govi et al. (1996) und mittels Fluoreszenzquenching durchgeführt (vgl. auch Kap. 3.1.3). Fluoreszenzquenching wurde hierbei nur als qualitative Methode eingesetzt, nicht als quantitative. Fluoreszenzqueching ist eine Methode zum Nachweis von physikalisch-chemischen Reaktionen zwischen Stoffen und Substanzen, von denen mindestens eine(r) fluoresziert. Durch die Interaktion zwischen diesen Substanzen kommt es zu einer Verringerung der Fluoreszenz, dem Quenching28. Es wird zwischen dynamischem und statischem Quenching unterschieden. Beim dynamischen Quenching gibt es eine Interaktion zwischen den Substanzen nur während der Dauer der Anregung. Sobald der ursprüngliche, nicht angeregte Zustand erreicht ist, ist auch die Interaktion beendet. Beim statischen Quenching kommt es zu einer Komplexierung der Substanzen, durch die auch nach Erreichung des Ausgangszustandes eine verminderte Fluoreszenz nachzuweisen ist. Eine Unterscheidung der beiden verschiedenen Quenching-Reaktionen ist am sichersten durch die Messung der Lebenszeit der Fluoreszenz nachzuweisen. Eine solche Messung ist allerdings bei Stoffgemischen fast unmöglich. Deshalb wurde dynamisches Quenching und statisches Quenching hier über die Auswirkung der Temperatur auf die Fluoreszenz unterschieden. Dynamisches Quenching nimmt durch zunehmende Temperatur zu, da die Diffusion, durch die das dynamische Quenching hervorgerufen wird durch höhere Temperatur zunimmt. Statisches Quenching wird hingegen bei höhere Temperaturerhöhung verringert, weil dadurch die Komplexierung der Substanzen destabilisiert werden (Lakowicz 1999).

24 Es wird hier der Begriff Konzentrations-Wirkungskurve und nicht Dosis-Wirkungskurve verwendet, da nicht

klar ist, welche Dosis von den Pflanzen aufgenommen wird. 25 EC50=Effektkonzentration, bei dem eine Reduktion des Toxizitätskriteriums um 50 % erreicht ist 26 EC10=Effektkonzentration, bei dem eine Reduktion des Toxizitätskriteriums um 10 % erreicht ist 27 NOEC (=no observed effect concentration) Konzentrationsbereich, in dem keine Reduktion des

Toxizitätskriteriums sichtbar ist. 28 Quenching=Auslöschen von Fluoreszenz

33

3.1.8 Pflanzentestdesign Es wurde ein Pflanzentest entwickelt. Das hohe Bindungspotential von DOM schloß den Einsatz von Boden aus. Es wurde deshalb nur in Hydrokultur gearbeitet. Üblicherweise wurden Keimung und Wachstumstest in zwei unterschiedlichen Systemen durchgeführt. Als Vereinfachung dieses Prinzips wurde ein schwimmendes Keimstadium für die Pflanzen entwickelt, die das umständliche Einsetzen der normalerweise auf Petrischalen vorgekeimten Pflanzen in die Testlösung überflüssig macht (Abb. 7+8). Vorreiter dieser Idee war der Wurzellängentest von Lüssem & Rahman (1980). Ein Methode, die der hier entwickelten sehr ähnelt wurde auch von Brunner et al. (1996) entwickelt, die allerdings noch sehr viel größeren Arbeitsaufwand beinhaltete und damit zeitaufwendiger und kostspieliger ist. Testaufbau: In einem Vorversuch wurde die Dauer zum Aufbrauchen der Samenreservestoffe nach Pestemer (1976) ermittelt. Zu diesem Zweck wurden die Samen auf destilliertem Wasser gezogen und täglich auf ihre Vitalität überprüft. Durch die Vorkeimung wurde eine mögliche verringerte Sensibilität der Pflanzen ausgeschlossen, die sich im Keimstadium noch vollständig von ihrer eigenen Substanz ernähren können. Auf mit 200 ml destilliertem Wasser gefüllten 250 ml Bechergläsern wurde eine Schicht von 300 mg Styroporkügelchen mit einem Durchmesser von 3-6 mm, auf das Wasser verteilt. Darauf wurde Mull (der Fa. Hartmann, 8 cm breit, Nr. 304134/5) aufgelegt, in einer Größe, die das Becherglas überspannen kann. Auf den Mull wurden möglichst regelmäßig 20 Samen verteilt, mit einem Uhrenglas abgedeckt (Abb. 7a+8a oben) und diese im Fall der ausgewählten Rübe (Brassica rapa ssp. rapa) 8 Tage im Klimaschrank vorgekeimt. Die Samen wurden vorher gründlich mit destilliertem Wasser gespült, um sie von Pilzsporen zu befreien. Der Klimaschrank wurde auf einen Tag-Nacht-Rhythmus von 16 Stunden Beleuchtung von 20.000 Lux bei 22 °C und 8 Stunden Dunkelheit bei 16 °C eingestellt. Sowohl die Keimung als auch die Wachstumsperiode wurden unter denselben Bedingungen durchgeführt. Nach der Vorkeimung wurden die nicht gekeimten Samen aussortiert und die Anzahl der Pflanzen auf 12 reduziert (siehe Abb. 8b). Dabei wurde darauf geachtet, die größten und kleinsten Keimlinge zu eliminieren. Die Pflanzen hatten inzwischen die Wurzeln durch das Mullgewebe in das Wasser ausgestreckt. Mit dem Mull wurden sie dann von der Oberfläche des destillierten Wassers abgehoben und auf Bechergläser mit den Testlösungen (300 mL pro 250 mL Becherglas) aufgesetzt, mit einem Gummiband über das Becherglas gespannt und mit einer Keimglocke abgedeckt (siehe Abb. 7b und 8c oben). Das Abdecken der Gläser ist nur notwendig, wenn die Luftfeuchtigkeit nicht bei 65-80 % gehalten werden kann, um eine Verdunstung und somit eine mögliche Austrocknung der Pflanzen zu verhindern. Mullgewebe als Trägerobjekt für Pflanzen in Hydrokultur benutzte bereits Šmídová (1960), aber auch sie benutzte, wie immer noch allgemein üblich, Petrischalen zum Vorkeimen. Die Testdauer betrug fünf Tage, damit konnte auf die Auswechslung der Testlösung verzichtet werden, die aus hygienischen Gründen mindestens wöchentlich stattfinden müßte. Eine Belüftung der Wurzeln findet durch einen Freiraum zwischen dem Mull und der Testlösungsoberfläche statt (vgl. Günther et al. 1993 und Abb. 7b).

34

Um Nährstoffmangel auszuschließen und auch die Leitfähigkeit auf dem Niveau der DOM-Ausgangslösungen zu halten, wurde eine Hoagland-Nährlösung (Hoagland & Arnon 1939) in einer Konzentration von 400 mL L-1 zu den Testlösungen dazu gegeben. Die Leitfähigkeit wurde damit auf einem Niveau von 780-800 µS gehalten. Nährlösung Hoagland & Arnon (1939): 10 L Wasser + 100 mL Lösungen 1,2,3,4 + 5 mL Lösung 5 Lösung 1: 51 g KNO3 L-1 Lösung 2: 118 g CaNO3 x 4 H2O L-1 Lösung 3: 14 g KH2PO4 L-1

Lösung 4: 24 g MgSO4 L-1

(Lösung 5: 30 g FeSO4 L-1

2 g NO2B4O7 x 10 H2O L-1 4 g MnSO4 x 4 H2O L-1 2 g CuSO4 x 5 H2O L-1

1 g ZnSO4 x 7 H2O L-1 1 g Na4Mo7 x 4 H2O L-1)

Die Lösung 5 der Hoagland&Arnon-Nährlösung wurde im Laufe der Versuche eleminiert, da die ausgewählte Testpflanze, Herbstrübe (Brassica rapa ssp. rapa), mit Nekrosen auf diese Spurenelementlösung reagierte. Als Kontrollen wurden die Nährlösung in einer Konzentration von 400 mL L-1 alleine, sowie die Xenobiotika, jeweils mit Nährlösung der selben Konzentration einzeln angesetzt. Die DOM-Kontrollen wurden ohne Nährlösung mit Leitungswasser angesetzt. Als Parameter zur Überprüfung der Ökotoxizität diente das Biomassefrischgewicht der Sprosse.

35

- - Keimglocke Testpflanzen Uhrenglas 1 cm Wurzel- belüftung Samen Mull Styropor- Becher- kügelchen glas destilliertes H2O Testlösung a b

Abbildung 7: Schematische Darstellung der Keimungsphase (a) und des Pflanzenwachstumstests (b)

36

a b c

a b c

Abbildung 8: Pflanzentest in Hydrokultur: a) Start der Keimung, b) Ende der Keimungsphase (Brassica rapa ssp. rapa) und c) Start des Pflanzenwachstumstests

37

3.1.9 Kriterien zur Auswahl der Testpflanzen Zunächst wurden Vorversuche ("range-finding-tests") zur Ermittlung der relevanten Konzentrationen für die Erstellung von Wirkungskurven durgeführt. Von sechs Pflanzen, Kresse (Lepidium sativum), Senf (Sinapis alba), Hafer (Avena sativa), Chinakohl (Brassica rapa ssp. pekinensis), Herbstrübe (Brassica rapa ssp. rapa) und Hirse (Sorghum vulgare) sollte eine Spezies ermittelt werden, die am sensibelsten auf das jeweilige Xenobiotikum reagiert, mit der eine statistisch optimale Wirkungskurve zu erzielen und in der Handhabung für den Versuch praktikabel ist. Streibig (1992) betont, dass die steilsten Wirkungskurven statistisch gesehen den präzisesten EC50-Wert ergeben. Gegenüber 2,4-D erwies sich die Kresse am mit Abstand am sensibelsten, gefolgt von Chinakohl und Herbstrübe (siehe Abb. 9). Die Wirkungskurve von Kresse war relativ flach und zeigte nicht die optimale sigmoide Kurve, weshalb der EC50-Wert statistisch unsicherer ist. Chinakohlkeimlinge brechen sehr leicht und sind daher nicht geeignet für das hier gewählte Testdesign. Bei Paraquat reagierte die Herbstrübe am sensibelsten. Kresse zeigte hierbei die sicherste, weil steilste Kurve, reagierte aber erst bei Konzentrationen ab ca. 0,1 mg L-1 (siehe Abb. 10). Es wurde deshalb, wegen der gut absicherbaren EC50-Werte und der guten Sensibilität die Herbstrübe für die Kombinationstest ausgewählt. Zwecks Einheitlichkeit wurden dann auch die "range-finding"-Tests mit Naphthalin und den beiden DOM mit Herbstrübe durchgeführt. Es wurde ein Minimum von 5 Konzentrationen getestet, bei mindestens 4 Wiederholungen. Für die Pflanzenwachstumstests an mit Pflanzenschutzmitteln behandelten Ackerboden-DOM (siehe Exkurs Kap. 3.3) wurde Kresse (Lepidium sativum) ausgewählt. Bei der Kresse werden die Seitenwurzeln erst gegen Ende der Pflanzentestsdauer ausgebildet. Daher ist sie als Testpflanze noch besser geeignet, weil sie einfacher aus dem Mull zu ziehen ist als die Herbstrübe (vgl. Abb. 11 und 12). Die Kresse zeigte neben Chinakohl und Herbstrübe gute Sensibilität gegenüber den beiden getesteten Pflanzenschutzmitteln und in dem vorliegenden Fall konnte zudem bei der Pflanzenauswahl auf kein spezifisches Pflanzenschutzmittel optimiert werden, da hier viele verschiedene zur Anwendung gekommen waren.

38

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0,000001 0,00001 0,0001 0,001 0,01 0,1 1 10 100 1000

mg L-1 2,4-D

% K

ontr

olle

Rübe

Hafer

ChinakohlSenf

Hirse

Kresse

Abbildung 9: Konzentrations-Wirkungskurven für 6 Testpflanzen mit 2,4-D

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0,00001 0,0001 0,001 0,01 0,1 1 10 100 1000 10000

mg L-1 Paraquat

% K

ontr

olle

Rübe

Hafer

Chinakohl

Kresse

Hirse

Senf

Abbildung 10: Konzentrations-Wirkungskurven für 6 Testpflanzen mit Paraquat

39

Abbildung 11: Phytokopien Herbstrübe (Brassica rapa ssp. rapa)

Versuchsbeginn Versuchsende ohne Paraquat

0,1 mg L-1 Paraquat 1,0 mg L-1 Paraquat 10 mg L-1 Paraquat

40

Abbildung 12: Phytokopien Kresse (Lepidium sativum)

Versuchsbeginn Versuchsendeohne Paraquat

0,1 mg L-1 Paraquat 1,0 mg L-1 Paraquat 10 mg L-1 Paraquat

41

3.1.10 Kombinationspflanzentest von DOM und organischen Xenobiotika Die Xenobiotika und Stroh-DOM wurden in den Kombinationsversuchen im ermittelten Vertrauensbereich der EC10- und EC50-Konzentrationen verwendet. Die Kombinationstests wurden mit jeweils 5 Wiederholungen durchgeführt. Ein signifikanter Effekt auf den Pflanzenwachstum konnte bei Grünlandboden-DOM in den in der Gleichgewichtslösung erreichten Konzentrationen nicht nachgewiesen werden. Grünlandboden-DOM wurde aus mischtechnischen Gründen in einer etwa 50 %igen Konzentration verwendet. Da es sich bei DOM um kein spezifisches Xenobiotikum mit genau definierter chemischer Struktur handelt, war es unmöglich Kombinationswirkungen, wie unter Kap. 2.3 beschrieben zu errechnen. Zur Ermittlung der Kombinationswirkung, ob additiv, antagonistisch oder synergistisch, wurde das Wirkungsdiagramm entwickelt (vgl. auch Abb. 35+36), das eine Ableitungen des Isobologramms von Loewe & Muischnek (1926) darstellt (siehe Abb. 13a).

0

0

antangon.

synergist. positiv

antagon.

-

synergist. negativ

additiv

+

EC50

EC50

additiv

antagonistisch

synergist.

a) b)

Abbildung 13: Kombinationswirkung ermitellt durch (a) IsoboWirkungsdiagramm

Im Isobologramm (siehe Abb. 13a) werden auf beide Koordinaten jeXenobiotika-Konzentrationen aufgetragen. Die EC50-Wirkung werden verbunden. Die Diagonale beschreibt die "additive" Wirkung. Die addefiniert als ein statisches Verhältnis der Toxizität der einen zur anderVerdünnung der einen Substanz entspricht der Toxizität der stärkewirkenden Substanz. Liegt der EC50 der Kombinationswirkungen unterPrüfsubstanzen und damit unter der additiven Diagonale, ist diese "sliegt sie über der Diagonale ist sie "antagonistisch". Im Wirkungsdiagramm (siehe Abb. 13b) werden die Einzelwikombinierten Substanzen jeweils auf eine 0-Achse eingetragen. "Additivsich auf den 0-Achsen bis zu deren Schnittpunkt. Sie umfassen d"synergistisch negativen" Wirkungen. Additive Wirkung wird hier defidie der Einzelwirkung der stärker negativ wirkenden Substanz entsprichAbweichung gegenüber der Einzelwirkung der anderen Substanz. Kombinationswirkung, die eine positivere Wirkung als die beider Subssich diese im oberen rechten Quadrat wieder, der Region der "synKombinationswirkung. Die Quadrate links oben und unten rec"antagonistischen" Kombinationswirkungen,also eine KombinationswirkEinzelwirkung beider Substanzen liegt. Unterhalb der 0-Achsen im li

42

+

logramm und (b)

weils aufsteigend die durch eine Diagonale ditive Wirkung wird

en Substanz, bzw. die r wirkenden ähnlich den EC50-Werten der ynergistisch" negativ,

rkungen der beiden e" Wirkungen finden as Quadrat mit den

niert als die Wirkung, t und einer negativen Bei einer positiven

tanzen bewirkt, findet ergistisch positiven"

hts beschreiben die ung die zwischen der

nken unteren Quadrat

finden sich die "synergistisch negativen" Kombinationswirkungen. Hier sind Kombinationswirkungen zu finden, die stärker negativ wirken als die der stärker negativ wirkenden Substanz. 3.1.11 Statistische Auswertung Die Konzentrations-Wirkungskurven wurden mittels des Logfit-Programmes (Wosniok & Drescher, Universität Bremen 1986) aus Tests mit fünf in den Voruntersuchungen ermittelten relevaten Konzentrationen (vgl. 3.1.6) errechnet, wie bei Pestemer & Günther (1997) beschrieben. Für die Auswertung der Kombinationstests wurden zunächst die Varianten mittels Komolgorov-Smirnov-Test auf Normalverteilung überprüft. Nach der Feststellung der Normalverteilung wurde dann eine einfaktorielle Varianzanalyse durchgeführt, gefolgt von multiplen Vergleichstests nach Bonferroni. Hiermit wurde die Signifikanz der Kombinationswirkung gegenüber der Xenobiotikum-Einzelwirkung ermittelt. Außerdem wurde eine zweifaktorielle ANOVA29 durchgeführt, um den prozentualen Einfluß der Faktoren: Xenobiotikakonzentration, DOM und die Kombination beider Faktoren auf die Kombinationswirkung zu ermitteln. Die ANOVAs wurden mittels SPSS 9.0 Programm errechnet. 3.2 Ergebnisse 3.2.1 Charakterisierung von DOM Ein Alterungstest mit Grünlandboden-DOM im Kühlschrank ergab auch nach vier Wochen Lagerungszeiten stabile Ergebnisse für die XAD-8 Fraktionen. Drei Monate später war dann eine sehr geringe Abnahme der hydrophoben Bestandteile zu beobachten (siehe Tab. 4). Der Anteil an Hydrophoben, also Fulvo- und Huminsäuren in den getesteten DOM kann als relativ konstant angesehen werden (siehe Tab. 5). Die Standardabweichung liegt insgesamt bei 3,8 % (siehe Tab. 5).

Tabelle 4: Alterungsversuch von Grünlandboden-DOM bei 5 °C (XAD-8 Fraktonierung) (grau unterlegt sind die Ausgangswerte, die 9 Tage nach der Extraktion ermittelt wurden)

DOM-Extraktion vom 21.04.1997

Anteile in % Hydrophile Hydrophobe SD (n=5)

30.04.1997 43,3 56,7 0,4

7.05.1997 43,7 56,3 1,3

29.08.1997 46,9 53,1 2,5

25.11.1997 48,1 51,9 3,1 SD = Standardabweichung n=Anzahl der Wiederholungen

29 ANOVA Analysis Of VAriance

43

Tabelle 5: Variabilität von Grünlandboden-DOM und Stroh-DOM-Extrakten in der XAD-8-Fraktionierung

Grünlandboden-DOM Stroh-DOM

Hydrophile % Hydrophobe % SD Hydrophile % Hydrophobe % SD

53,5 46,5 2,2 (n=2)

75,4 24,6 1,8 (n=4)

43,3 56,7 0,4 (n=4)

64,5 35,5 1,9 (n=5)

58,4 41,6 1,8 (n=4)

68,3 31,7 0,4 (n=5)

46,9 53,1 2,5 (n=4)

66,4 33,6 0,4 (n=5)

54,2 45,8 1,1 (n=5)

66,8 33,2 0,4 (n=5)

51,6 48,4 2,3 (n=5)

insgesamt durchschnittlich:

51,3 48,7 4,9 (n=6)

68,3 31,7 3,8 (n=5)

Erfolgreich zur Charakterisierung waren insbesondere die 3-D Fluoreszenz-Konturenspektren. Sie ergaben einen Art Fingerabdruck für jede DOM. Eine Bibliothek für solche Fluoreszenzspektren mit den dazugehörigen organischen Substanzen wäre für die Auswertung dieser Spektren von großer Bedeutung. Solche Spektren erlauben aber bereits heute eine sofortige Aussage über die Verschiedenartigkeit von DOM derselben Quelle (siehe Abb. 2 und Anhang 2), Veränderungen während des Kombinationstests und den Einfluß der Testbedingungen und Pflanzen (siehe Anhang 2). Dort kann man sehen, dass eine deutliche Abnahme der Fluorophore nach fünf Tagen eintritt. Licht hat eine stärkere Abnahme zur Folge, während die Pflanze das Niveau der Fluoreszenz auf dem Effekt ohne Lichteinfluß hält. Aber wie in den 3-D-Konturenspektren (Anhang 2, S. 80ff.) deutlich zu sehen, führte die Herbstrübe, sowohl bei Stroh, als auch bei Grünlandboden-DOM zu einer charakteristischen Veränderung der Zusammensetzung von DOM. Im Stroh-DOM führte die Herbstrübe daneben auch noch zu einem enormen Anstieg der Fluorophoren, also aromatischen Fraktion. Eine Charakterisierung von DOM durch Dialyse-Fraktionierung war nicht möglich. Die Ausgangsvolumina der DOM in den Schläuchen veränderten sich während der Fraktionierung. Teils nahmen die Volumina zu, teils nahmen sie ab. Durch Diffusion veränderten sich die Konzentration in den Schläuchen und die Konzentration der Außenlösung. Offensichtlich konnte kein Druckausgleich stattfinden. Teilweise fanden sich in den Außenlösungen extrem hohe DOM-Werte, die auf eine bakterielles Wachstum schließen ließen. Die Ergebnisse waren daher nicht verwertbar. Da Antibiotika (Natriumazid oder Quecksilbernitrit) mit DOM komplexieren und deren Eigenschaften verändern, wurde auf

44

ihren Einsatz verzichtet. Kögel-Knabner et al. (2000) bestätigten, dass alle derzeit zur Verfügung stehenden Mittel zur Sterilisation zu chemischen und physikalischen Veränderungen von DOM führen. Eine Kühlung während der Dialyse konnte nicht durchgeführt werden. Diese Vorgehensweise ist, wie die Ergebnisse zeigen, nicht akzeptabel. Die Hydrophilie der DOM führte teilweise zu einem so hohem osmotischem Druck, daß die Dialyse-Schläuche diesem nicht standhalten konnten und platzten. Teilweise waren die Schläuche vermutlich durch Bakterien angegriffen. 3.2.2 Bindungstests von DOM mit organischen Xenobiotika Die Bindung der Xenobiotika an DOM konnte mittels Fluoreszenzquenching nachgewiesen werden. Quenching, oder 'Auslöschung' von Fluoreszenz weist auf die Komplexierung eines Fluorophors hin, die Restfluoreszenz stammt von nicht komplexierten Fluorophoren. Statisches Quenching weist eine echte Bindung nach, während es sich beim dynamischen Quenching um das sogenannte "kollisionale" Quenching handelt, einer vorübergehenden Elektronenbindung während der Anregung. Dynamisches Quenching erzeugt bei höheren Temperaturen potentiell noch stärkeres Quenching (vgl. Abb. 14 und 16). Statisches Quenching läßt sich indirekt durch erhöhtes Quenching bei niedrigerer Temperatur nachweisen (hier: 4 °C im Vergleich zu 20 °C), da höhere Temperaturen die Stabilität der Komplexe herabsetzt (vgl. Abb. 15 und 17-20) (Lakowicz 1999). Eine Komplexierung, also Bindung des Xenobiotikums an DOM, konnte im Fall von Paraquat und auch für 2,4-D, allerdings in sehr viel geringerem Maße, sowohl mit Grünlandboden-DOM als auch mit Stroh-DOM durch statisches Quenching nachgewiesen werden (Abb. 17-20). Bei Naphthalin, das selber stärker fluoresziert als DOM selbst, konnte durch Kombination mit Stroh-DOM einmal statisches (25.07.01, Abb. 15) und einmal dynamisches Quenching (19.7.01, Abb. 16) nachgewiesen werden. In Kombination mit Grünlandboden-DOM wurde nur dynamisches Quenching festgestellt (25.07.01, Abb. 14). Somit kann also nicht von einer grundsätzlichen Bindung von Naphthalin an DOM ausgegangen werden. Nicht alle Bindungstests mittels Fluoreszenzspektroskopie wurden mit Temperaturunterschied durchgeführt. Deshalb können nicht für alle Tests Aussagen zur Art des Quenching gemacht werden (vgl. Abb. 21 und 22). Der Einfluß des Leitungswassers zur Herstellung von DOM auf die Fluoreszenz der DOM war sehr groß (siehe Abb. 23+24). Dies bestätigt auch Zsolnay (1993). Nur wenn die Konzentrationen von DOM nahe der optischen Dichte von 0,05 gehalten wurden (das war bei einer Verdünnung von 1:2 bei Grünlandboden-DOM (vgl. Abb. 23) und einer Verdünnung von 1:300 bei Stroh-DOM der Fall (vgl. Abb. 24)), konnte überhaupt eine Erhöhung der Fluoreszenz nachgewiesen werden. Es sind folglich aromatische Verbindungen, bzw. Stoffe mit konjugierten Doppelbindungen im Leitungswasser vorhanden.

45

Abbildung 14: Dynamisches Quenching von Naphthalin durch Grünlandboden-

DOM (25.07.01), oberes Spektrum: Fluoreszenz von Naphthalin mittleres Spektrum: Fluoreszenz der Kombination Napthalin mit Stroh-DOM bei 4 °C unteres Spektrum: Fluoreszenz der Kombination Napthalin mit Stroh-DOM bei 20 °C

Abbildung 15: Statisches Quenching von Naphthalin durch Stroh-DOM (25.07.01), oberes Spektrum: Fluoreszenz Naphthalin mittleres Spektrum: Fluoreszenz der Kombination Naphthalin mit Stroh-DOM bei 20 °C unteres Spektrum: Fluoreszenz der Kombination Naphthalin mit Stroh-DOM bei 4 °C

46

Abbildung 16: Dynamisches Quenching von Naphthalin durch Stroh-DOM (19.07.01),

oberes Spektrum: Fluoreszenz von Naphthalin mittleres Spektrum: Fluoreszenz der Kombination von Naphthalin und Stroh-DOM bei 4 °C unteres Spektrum: Fluoreszenz der Kombination von Naphthalin und Stroh-DOM bei

20 °C

47

Abbildung 17: Statisches Quenching von Grünlandboden-DOM durch Paraquat (19.07.01)

oberes Spektrum: Fluoreszenz von Grünlandboden-DOM mittleres Spektrum: Fluoreszenz von der Kombination von Grünlandboden-DOM und

Paraquat bei 20 °C unteres Spektrum: Fluoreszenz von der Kombination von Grünlandboden-DOM und

Paraquat bei 4 °C

Abbildung 18: Statisches Quenching von Grünlandboden-DOM durch 2,4-D (19.07.01),

oberes Spektrum: Fluoreszenz von Grünlandboden-DOM mittleres Spektrum: Fluoreszenz der Kombination von Grünlandboden-DOM und 2,4-D bei

20 °C unteres Spektrum: Fluoreszenz der Kombination von Grünlandboden-DOM und 2,4-D bei

4 °C

48

Abbildung 19: Statisches Quenching von Stroh-DOM durch Paraquat (18.07.01), oberes Spektrum: Fluoreszenz von Stroh-DOM mittleres Spektrum: Fluoreszenz von der Kombination von Stroh-DOM und Paraquat

bei 20 °C unteres Spektrum: Fluoreszenz von der Kombination von Stroh-DOM und Paraquat

bei 4 °C

Abbildung 20: Statisches Quenching von Stroh-DOM durch 2,4-D (18.07.01),

oberes Spektrum: Fluoreszenz von Stroh-DOM mittleres Spektrum: Fluoreszenz der Kombination von Stroh-DOM und 2,4-D bei 20 °C unteres Spektrum: Fluoreszenz der Kombination von Stroh-DOM und 2,4-D bei 4 °C

49

Abbildung 21: Quenching von Grünlandboden-DOM durch Paraquat (15.12.00), oberes Spektrum: Fluoreszenz von Grünlandboden-DOM oberes mittleres Spektrum: Fluoreszenz der Kombination von Grünlandboden-DOM und Paraquat

nach der Mischung unteres Spektrum: Fluoreszenz der Kombination von Grünlandboden-DOM und Paraquat

nach 24 Stunden

Abbildung 22: Quenching von Grünlandboden-DOM durch 2,4-D (15.12.00), oberes Spektrum: Fluoreszenz von Grünlandboden-DOM oberes Spektrum, mittlere Spektrum: Fluoreszenz der Kombination von Grünlandboden-DOM und 2,4-D

nach der Mischung unteres Spektrum: mittleres Spektrum, nach 24 Stunden

50

Abbildung 23: Fluoreszenz von Grünlandboden-DOM oberes Spektrum und Fluoreszenz von Leitungswasser unteres Spektrum (9.04.01)

Abbildung 24: Fluoreszenz von Stroh-DOM oberes Spektrum und Fluoreszenz von Leitungswasser unteres Spektrum (18.07.01)

51

Nach Aussagen der Berliner Wasserbetriebe sind Pflanzenschutzmittel und PAK nur in Konzentrationen von <0,00005 mg L-1 im Trinkwasser vorhanden, organische Chlorverbindungen allerdings in Konzentrationen von <0,005 mg L-1. In Regenwasser wurden viele niedermolekulare Säuren, in Tokio auch eine niedermolekulare aromatische Säure nachgewiesen, die Benzoesäure (Ribeiro de Souza & Franco de Carvalho 2001). Es ist durchaus möglich, dass niedermolekulare Säuren, deren hohes Bindungspotential bekannt ist (Fox 1995), bei den Bindungsprozessen der Xenobiotika einen großen Einfluß hatten. Es wurde ein Bindungstest mittels Gleichgewichtsdialyse durchgeführt. Das nach Methodendefinition ungebundene Xenobiotikum findet sich in der den Dialyseschlauch umgebenden Lösung. Die photometrische Bestimmung des ungebundenen Xenobiotikums bereitete durch das anwesende DOM < 1.000 Dalton Probleme, das durch die Dialysemembran in die Xenobiotikalösungen eindringen konnte. Auch ist nicht auszuschließen, dass ionischen Xenobiotika durch niedermolekulares DOM gebunden wird. Die Bindungstests fielen hierbei negativ aus, sind allerdings wenig aussagekräftig. 3.2.3 Konzentrations-Wirkungskurven der Prüfsubstanzen mit Herbstrübe (Brassica rapa

ssp. rapa) Abb. 25 zeigt, dass im Vergleich der Prüfsubstanzen die Herbstrübe auf 2,4-D bereits bei geringen Dosierungen reagiert, gefolgt von Paraquat, Naphthalin und Stroh-DOM. Die Reaktionen auf Naphthalin beginnen erst bei einer Konzentration 0,8 mg L-1, bei Stroh-DOM verzögert sich die Reaktion auf Konzentrationen ab rund 20 mg L-1.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0,00001 0,0001 0,001 0,01 0,1 1 10 100 1000 10000

mg L-1

% K

ontr

olle

Napthalin

2,4-D

Paraquat

Stroh-DOM

Abbildung 25: Konzentrations-Wirkungskurven für die Prüfsubstanzen Naphthalin hat eine Löslichkeit von nur 26 mg L-1, der EC90 wurde allerdings auch schon bei einer Konzentration von 9 mg L-1 erreicht und lag damit nur noch knapp über dem EC90-Wert von 2,4-D, der bei 2,2 mg L-1 liegt.

52

In Tabelle 6 sind die aus den Konzentrations-Wirkungstests ermittelten EC10 und EC50-Werte mit den jeweiligen Vertrauensbereichen angegeben. Die Kombinationsversuche wurden mit mehreren Konzentrationen im Vertrauensbereich dieser EC-Konzentrationen durchgeführt. Für Grünlandboden-DOM konnte wegen der geringen Konzentration der Extrakte keine Wirkung festgestellt werden.

Tabelle 6: EC10 und EC50-Werte, angegeben in mg L-1 für die Prüfsubstanzen, getestet an Herbstrübe (Brassica rapa ssp. rapa)

Substanzen EC10 Vertrauensbereich EC50 Vertrauensbereich

2,4-D 0,0004 0-0,002 0,03 0-0,06

Paraquat 0,001 0-0,006 0,3 0-0,65

Naphthalin 0,8 0,35-1,2 2,6 2,1-3,2

(Stroh 1,8 0,6-3,0 122 93-150)*

*Die Werte der Konzentrations-Wirkungskurve von Stroh wurden in Klammern gesetzt, weil trotz mehrmaliger Wiederholung der Konzentrations-Wirkungskurve, in den Kombinationsversuchen jedoch dann in drei Versuchen auch positive Wirkungen bei Konzentrationen, die deutlich über dem hier ermittelten EC10-Wert lagen, auftraten. 3.2.4 Kombinationspflanzentests von DOM und organischen Xenobiotika Aus dem gleichen Ausgangsmaterial gewonnenes Stroh-DOM wirkte in den Kombinationsversuchen sowohl positiv, als auch negativ (siehe Abb. 26). Die Effekte waren in einer Konzentration von 12 mg L-1 dreimal positiv, einmal sogar signifikant (1.03.99), in zwei Versuchen wirkte es negativ. Die Konzentration von 120 mg L-1 wirkte hingegen immer negativ, wobei diese Wirkung nur bei zwei Versuchen auch statistisch abzusichern war (2.04.01 und 17.07.01). Das Stroh-DOM, das in gleicher Konzentration wie das Grünlandboden-DOM getestet wurde, hemmte das Pflanzenwachstum geringfügig, nicht absicherbar. Auffällig ist, dass von den vier Bodenproben nur die Grünlandboden-DOM vom 20.11.97, die für Versuche vor dem 5.03.98 verwendet wurden, positive Wirkung zeigte, während die anderen Grünlandboden-DOM nicht absicherbare geringe Hemmwirkung hatten. Insgesamt läßt sich feststellen, dass die DOM-Konzentrationen geringere Auswirkungen auf die Phytotoxizität hatten, als offensichtlich die Zusammensetzung der DOM (vgl. Abb. 26). So waren negative Wirkungen von DOM in geringen Konzentrationen teils stärker als die Effekte bei einer Konzentration von 120 mg L-1 (Abb. 26, Versuch vom 25.09.00).

53

Abweichungen der DOM-Wirkung von der Kontrolle

19,0

-6,6

-0,5

-6,6-5,4 -6,3

-8,3

9,4 9,5

0,6

-5,6

-1,9-4,0

-15,1

-8,4

-30,0

-20,0

-10,0

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

1Spro

ßgew

icht

(mg)

5,22 mg/L GL 26.01.99

5,22 mg/L GL 05.12.00

5,22 mg/L GL 18.12.00

5,22 mg/L GL 21.05.01

5,22 mg/L ST 16.01.01

5,22 mg/L ST 31.01.01

5,22 mg/L ST 05.06.01

12 mg/L 01.03.99

12 mg/L 22.03.99

12 mg/L 28.02.01

12 mg/L 19.03.01

12 mg/L 19.06.01

120 mg/L 25.09.00

120 mg/L 02.04.01

120 mg/L 17.07.01

Abbildung 26: DOM-Wirkungen in den Kombinationstests (angegeben als Median-Abweichungen von der Kontrolle mit Standardabweichung GL= Grünlandboden-DOM ST=Stroh-DOM, alle unbezeichneten sind Stroh-DOM-Konzentrationen rote Sternchen markieren die signifikanten Wirkungen von DOM)

Die folgenden Begriffe "antagonistisch", "synergistisch" und "additiv" beziehen sich auf eine sogenannte unabhängige Wirkungen nach Bliss ('Bliss independence', vgl. Kap. 2.3), da es sich hier um die Kombination "unähnlich"30 wirkender Stoffe handelt. Mittels der Wirkungsdiagramme (vgl. Kap. 3.1.10 Abb. 13b) wurden die Kombinationswirkungen ausgewertet. Die Einzelergebnisse wurde in der Tabelle 7 dargestellt. Synergistisch negative Wirkungen traten grundsätzlich nur dann auf, wenn bereits die DOM-Wirkung alleine negativ war (vgl. Tab. 8). Synergistisch positive Wirkungen ergaben sich im gesamten Spektrum der DOM-Einzelwirkungen sowohl bei signifikant positiver DOM-Einzelwirkung (5,22 mg L-1 GL-DOM+0,001 mg L-1 2,4-D und 12 mg L-1 Stroh-DOM+0,01 mg L-1 Paraquat), als auch bei signifikant negativer DOM-Einzelwirkung (120 mg L-1 Stroh-DOM+0,333 mg L-1 Naphthalin). Antagonistische Wirkungen wurden ebenfalls sowohl bei positiven, als auch bei negativen DOM-Einzelwirkungen festgestellt. Additive Wirkungen von DOM auf die Wirkung der Xenobiotika traten bei fünf negativen DOM-Einzelwirkungen und drei signifikant negativen DOM-Einzelwirkungen auf.

54

30 "Unähnliche" Wirkung wird definiert als eine primäre Interaktion mit verschiedenen Wirkorten und die

Auslösung eines gemeinsamen Effektes über unterschiedliche Wirkketten.

Tabelle 7: Kombinationswirkung, ermittelt durch das Wirkungsdiagramm (vgl. Abb. 35+36)

(grau unterlegt sind die signifikanten Kombinationswirkungen gegenüber der Wirkung des Xenobiotikums alleine) Xenobiotikum-Konzentration mg L-1

5,22 mg L-1 Grünland-boden-DOM

5,22 mg L-1 Stroh-DOM

12 mg L-1

Stroh-DOM 120 mg L-1

Stroh-DOM

2,4-D 0,001 X (+) X (+) X (+) X (-) 0,002 ° X (-) X (+) X (-) 0,02 + + + X (-) 0,035 + X (-) + ° 0,04 + ° + X (-) 0,06 X (+) X (-) + X (-) Paraquat 0,001 + X (+) X (+)

(0,01 mg L-1) °

0,04 X (-) X (-) ° X (-) 0,05 + X (-) + X (-) 0,2 + ° X (-) X (-) 0,4 X (-) + X (-) X (-) 0,7 + ° + X (-) Naphthalin 0,333 X (-) X (-) X (-) X (+) 0,667 X (-) X (-) X (-) + 1,333 + + X (-) + 2,0 X (-) X (+) X (-) X (-) 2,5 + + + X (-) 3,0 ° + + + Zeichenerläuterung: "°" = additiv "+" = antagonistisch "X (+)"= synergistisch posititv "X (-)" = synergistisch negativ

55

Tabelle 8: Einzelwirkung von DOM in den Kombinationstests (vgl. Tab. 7) (grau unterlegt sind die signifikanten Wirkungen gegenüber der Kontrolle) Xenobiotikum-Konzentration mg L-1

5,22 mg L-1 Grünland-boden-DOM

5,22 mg L-1 Stroh-DOM

12 mg L-1

Stroh-DOM 120 mg L-1

Stroh-DOM

2,4-D 0,001 + - + - 0,002 - - + - 0,02 - - + - 0,035 + - + - 0,04 - - + - 0,06 - - + - Paraquat 0,001 + - + - 0,04 - - - - 0,05 + - + - 0,2 - - - - 0,4 - - - - 0,7 - - - - Naphthalin 0,333 - - - - 0,667 - - - - 1,333 - - - - 2,0 - - - - 2,5 - - - - 3,0 - - - - Zeichenerläuterung: "+" = positiv "-" = negativ

56

Bei dem basisch wirkenden zweiwertigen Kation Paraquat konnten vier signifikante Kombinationswirkungen ermittelt werden. Bei alle diesen Kombinationstests lag eine signifikant positive DOM-Einzelwirkungen vor (vgl. Tab. 8). Drei dieser Kombinationswirkungen waren antagonistisch, nur bei der Kombination von 0,01 mg L-1 war eine synergistisch positive Wirkung erzielt worden (vgl. Tab. 7). Mit der Säure 2,4-D ergaben die Versuche fünf signifikante Kombinationswirkungen in der gesamten Bandbreite der DOM-Einzelwirkung. Absicherbar waren synergistisch positive Kombinationswirkungen bei der niedrigsten Dosierung von 0,001 mg L-1. In der Kombination von 12 mg L-1 Stroh-DOM mit 0,02 mg L-1 2,4-D gab es eine signifikant antagonistische Wirkung und in Kombination mit 120 mg L-1 Stroh-DOM ließen sich zwei synergistisch negative Wirkungen absichern. Das neutrale, PAK Naphthalin wirkte nur einmal signifikant, in Kombination von 120 mg L-1 Stroh-DOM und 1,333 mg L-1 Naphthalin und zwar antagonistisch. Gehäuft synergistisch positive, vier nicht abgesicherte Kombinationswirkungen, konnten in Kombination mit 5,22 mg L-1 Stroh-DOM festgestellt werden, bei allen Versuchen war die DOM-Wirkung alleine negativ gewesen. Erstaunlicherweise konnte auch in Kombination mit dem durchweg negativ wirkenden Stroh-DOM in einer Konzentration von 120 mg L-1 eine synergistisch positive, allerdings nicht absicherbare Kombinationswirkung festgestellt werden (120 mg L-1 Stroh-DOM+0,333 mg L-1 Naphthalin). Zusammenfassend lassen sich die Kombinationswirkungen prozentual wie folgt auswerten (vgl. Tab. 9): Es dominieren die antagonstischen Wirkungen mit durchschnittlich 42%, vor den synergistisch negativen mit durchschnittlich 38%. Gefolgt von den synergistisch positiven mit durchschnittlich 12% und den additiven mit durchschnittlich 10%. Nur bei Paraquat verhielt sich diese Reihenfolge anders. Dort folgten die additiven Kombinationswirkungen vor den synergistisch positiven.

Tabelle 9: Prozentualer Anteil der Kombinationswirkungen von DOM mit 2,4-D, Paraquat und Naphthalin

2,4-D Paraquat Naphthalin Durchschnitt synergistisch positiv 17 % 8 % 12 % 12 % additiv 8 % 17 % 4 % 10 % antagonistisch 43 % 42 % 42 % 42 % synergistisch negativ 38 % 33 % 42 % 38 % Insgesamt gesehen ist aus Tabelle 7 ersichtlich, dass man, weder nach Herkunft der DOM noch nach dessen Konzentration bis einschließlich des EC50-Bereiches, Tendenzen ablesen kann. Ganz offensichtlich ist eine, in dieser Arbeit nicht charakterisierte, spezifische Zusammensetzung der DOM für die Kombinationswirkung verantwortlich. Gerade bei dem hydrophoben Naphthalin wäre, nach dem Literaturstudium zu erwarten gewesen, dass sich die Grünlandboden-DOM wegen ihres höheren Gehaltes an hydrophoben Stoffen mit entsprechend höherem Bindungspotential, eine deutlich positivere Wirkung auf

57

die Phytotoxizität hat, als Stroh-DOM. Diese Wirkungsweise konnte mit diesen Versuchen nicht bestätigt werden. Dieses Ergebnis läßt sich auch anhand des mit einer zweifaktoriellen Varianzanalyse errechneten Einflusses von Xenobiotika-Konzentration, DOM-Wirkung und der Kombination beider Faktoren ablesen (siehe Tab. 10). In der Abbildung 27 werden die Ergebnisse zwecks leichterer Erfassung graphisch dargestellt. Die Unterscheidung der Kombinationstests in (a) und (b) in Abbildung 27 gibt Parallelversuche zu verschiedenen Terminen an, die sich, wie man dort sehen kann, erheblich unterscheiden. Der Einfluß der Kombination aus Xenobiotika-Konzentration und DOM-Wirkung ist minimal, der Einfluß von DOM ist gerade bei den Herbiziden sehr unterschiedlich, je nach DOM-Extrakt. Der Einfluß der Xenobiotika-Konzentration ist bei den Herbizidkombinationstests ebenfalls sehr schwankend, in Abhängigkeit der DOM-Wirkung, so scheint es. Nur bei Naphthalin ist die DOM-Wirkung bis auf die höchste Konzentration fast irrelevant. Bei den Kombinationstest mit Naphthalin ist der ein ungeklärter Einfluß auf die Kombinationswirkung am höchsten. Bei in der Einzelwirkung signifikant wirkendem DOM lag der Einflussfaktor von DOM in der Kombinationswirkung mit 50,6 %, 60,4 % und 64 % am höchsten (siehe Tab. 10). Beim Versuchstermin 22.03.99, bei dem ebenfalls eine positive Wirkung erzielt wurde, die aber nicht mehr absicherbar war (P=0,992), war der Einfluß von DOM immerhin noch mit 48 % beteiligt. Der letzte Versuchstermin mit nicht abgesicherter positiver DOM-Einzelwirkung am 28.02.01 (P=1,000) zeigte jedoch nur noch eine Beteiligung von 12 % des DOM an der Kombinationswirkung. Dieser Einfluß jedoch war hochsignifikant (P=0,000). Bei signifikant negativer Einzelwirkung von DOM lag der Einfluß von DOM an der Kombinationswirkung bei 20,8 %, 21,3 % und 39,8 % und war durchgängig signifikant (siehe Tab. 10). Für die restlichen Kombinationswirkungen, bei denen DOM in der Einzelwirkung durchweg nicht absicherbar negativ gewirkt hatte, spielt der Einflußfaktor DOM keine signifikante Rolle mehr (0,1 %-1,6 %) (siehe Tab. 10). Die Xenobiotika-Konzentrationen spielten in alle Kombinationswirkungen signifikant mit hinein (17,7 %-75,2 %), mit Ausnahme der Versuchstemine (vgl. Tab. 10) 22.03.99, bei der die DOM-Einzelwirkung nicht signifikant positiv war, und 26.01.99, bei dem die DOM-Einzelwirkung signifikant positiv war. In beiden Fällen war DOM die stärkste Einflußgröße. Ein signifikanter Einfluß der Kombination beider Einflußgrößen, sowohl der Herbizidkonzentration als auch des DOM war bei allen Versuchen mit 2,4-D nachweisbar, mit Ausnahme des Versuches vom 22.03.99 (siehe vorheriger Absatz). Der Einfluß dieses Kombinationseffektes lag bei 5,2 %-10,5 %. Bei den Kombinationsversuchen mit Paraquat war der Einfluß eines Kombinationseffektes nicht nachweisbar. Bei Naphthalin nur im Versuch mit Grünlandboden-DOM und mit 12 mg L-1 Stroh-DOM. Zusammenfassend läßt sich sagen, in Zusammenhang mit Naphthalin spielt DOM in der Kombinationswirkung keine Rolle. Nur bei der Konzentration von 120 mg L-1 Stroh-DOM ergibt sich ein absicherbarer Effekt von DOM. Wie bei den Versuchen festgestellt wurde, trübte die Versuchlösung mit dieser Konzentration schon nach Stunden ein und führte zu Fäule der Wurzeln.

58

Tabelle 10: Einflußfaktoren am Kombinationseffekt (in %), Korrelationen von Xenobiotika-Konzentration und DOM-Wirkung (2-faktorielle Varianzanalyse),

(grau bzw.stärker grau unterlegt sind die signifikanten Effekte) Versuch mit Versuchs-

termin DOM- Einzel- wirkung

ungeklärte Faktoren

Kombinationswirkung

Xenobiotoka-Wirkung DOM-Wirkung

Effekt % Effekt % Signifikanz Effekt % Signifikanz Effekt % Signifikanz 2,4-D 5,22 mg/l GL-DOM 26.1.99 + 26,2 2,6 0,327 20,6 0,001** 50,6 0,000** 5,22 mg/l GL-DOM 05.12.00 - 21,5 8,7 0,007** 68,2 0,000** 1,6 0,088 5,22 mg/l ST-DOM 16.01.01 - 19,1 5,2 0,029* 75,2 0,000** 0,5 0,214 12 mg/l ST-DOM 22.03.99 - 41 5 0,242 6 0,189 48 0,000** 12 mg/l ST-DOM 28.02.01 - 31,7 6,5 0,026* 60,8 0,000** 12 0,000** 120 mg/l ST-DOM 25.09.00 - 26,7 10,5 0,045* 27,6 0,002** 35,2 0,000** 120 mg/l ST-DOM 02.04.01 - 8,9 9,8 0,018* 60 0,000** 21,3 0,000** Paraquat 5,22 mg/l GL-DOM 26.01.99 + 25,2 4 0,174 6,8 0,057 64 0,000** 5,22 mg/l GL-DOM 18.12.00 - 49,8 3,4 0,664 46,7 0,000** 0,1 0,808 5,22 mg/l ST-DOM 31.01.01 - 25,9 3,4 0,299 70,6 0,000** 0,1 0,676 12 mg/l Stroh-DOM. 01.03.99 + 19,3 1,8 0,298 18,5 0,000** 60,4 0,000** 5,22 mg/l GL-DOM 19.03.01 - 13,4 5,4 0,092 49,9 0,000** 31,3 0,000** 120 mg/l Stroh-DOM 25.09.00 - 36,3 1,9 0,561 38,8 0,001** 23 0,001** 120 mg/l Stroh-DOM 02.04.01 - 31,7 6,1 0,190 22,4 0,013* 39,8 0,000** Naphthalin 5,22 mg/l GL-DOM 21.05.01 - 43,2 11 0,040* 44,8 0,000** 1,0 0,251 5,22 mg/l ST-DOM 05.06.01 - 66,5 9,1 0,284 22,9 0,009** 1,5 0,267 12 mg/l ST-DOM 19.06.01 - 41 10,3 0,043* 47,2 0,000** 1,5 0,156 120 mg/l ST-DOM 17.07.01 - 60,6 0,9 0,843 17,7 0,014* 20,8 0,029*

ST= Stroh GL=Grünlandboden

59

60

Abbildung 27: Einflußfaktoren auf die Kombinationswirkungen ((a) und (b) bezeichnen Versuche verschiedener Termine)

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Versuche mit Paraquat

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

5,22 m

g/l G

L-DOM+P

araqu

at(a)

5,22 m

g/l G

L-DOM+P

araqu

at(b)

5,22 m

g/l ST-D

OM+Para

quat

12 m

g/l ST-D

OM+Para

quat(

a)

12 m

g/l ST-D

OM+Para

quat(

b)

120 m

g/l ST-D

OM+Para

quat(

a)

120 m

g/l ST-D

OM+Para

quat(

b)

Einf

luß

ungeklärte Faktoren

Herbizidkonzentration+DOM

DOM���

Herbizidkonzentration

Herbizidkonzentration

Naphthalinkonzentration

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Versuche mit 2,4-D

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

5,22 m

g/l G

L-DOM+2

,4-D(a)

5,22 m

g/l G

L-DOM+2

,4-D(b)

5,22 m

g/l ST-D

OM+2,4-

D

12 m

g/l ST-D

OM+2,4-

D(a)

12 m

g/l ST-D

OM+2,4-

D(b)

120 m

g/l ST-D

OM+2,4-

D(a)

120 m

g/l ST-D

OM+2,4-

D(b)

Einf

luß

ungeklärte Faktoren

Herbizidkonzentration+DOM

DOM���

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������������������������������������������������������������������ �����������

Versuche mit Naphthalin

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

5,22 m

g/l G

L-DOM+N

aphth

alin

5,22 m

g/l ST-D

OM+Nap

hthali

n

12 m

g/l ST-D

OM+Nap

hthali

n

120 m

g/l ST-D

OM+Nap

hthtal

in

Einf

luß

ungeklärte Faktoren

Naphthalinkonzentration+DOM

DOM���

In Zusammenhang mit den ionischen Herbiziden dominiert entweder das Herbizid oder DOM die Kombinationswirkung, in Abhängigkeit der DOM-Zusammensetzung und nicht der Konzentration, wie die Versuchswiederholungen ergaben (vgl. jeweils (a) und (b) Versuche bei 2,4-D und Paraquat). 3.3 Exkurs: Pflanzentests an mit Pflanzenschutzmitteln behandelter Ackerboden-

DOM 3.3.1 Problemstellung, Material und Methoden Zur Abschätzung der Bedeutung von DOM unter natürlichen Bedingungen wurden Pflanzentests mit DOM aus konventionellen Ackerflächen von dem Klostergut Lamspringe, Acker "Sackkuhle" durchgeführt. Dieser Versuch konnte im Rahmen von Untersuchungen der Biologischen Bundesanstalt Berlin durchgeführt werden. Dort wurden für eine Studie zu Pflanzenschutzmittelrückständen in Oberflächengewässern (Reese-Stähler et al. 2001) u.a. Wetterdaten erhoben sowie wöchentlich Wasserproben entnommen. Die Wasserproben stammten aus dem Drainageabfluß und der Lamme selbst, dem an die Ackerflächen angrenzenden Bach. Diese Proben wurden auf DOC und Pflanzenschutzmittel untersucht. Auf dem Acker war vom 20.3.98 bis 19.10.98 Zuckerrübe im Strohmulchverfahren angebaut, am 20.10.98 sowie 30.10.98 erfolgte dann die Aussaat von Winterweizen. Es wurden drei Beprobungen (11.06.98; 24.09.98 und 22.12.98) des Oberbodens (0-10 cm) an drei Standorten (Berg, Mitte, Tal) entlang einer Erosionsrinne mit Akkumulation von Bodenmaterial am Standort "Tal" vorgenommen (siehe Abb. 28). Die Probennahmen wurden anhand der Erosionskartierung von 1997 durchgeführt. Die Kartierung des Probejahres 1998 (Abb. 28 unten) zeigt, dass diese Erosionsrinne im Oktober 1998 nicht mehr existent war. Für die Proben wurden 10 Einstiche mit einem Zylinder gewonnen und zu einer Mischprobe vereinigt. Die Hypothese, mit der diese Untersuchungen durchgeführt wurden, war, dass Pflanzenschutzmittel, auch wenn sie in DOM eingschlossen sind (vgl. Tensid-Wirkung von DOM in Kap. 2.1.4 und Engebretson & Wandruszka 1994) oder gebunden in DOM vorliegen und somit nicht analytisch nachweisbar sind, doch eine Wirkung auf Pflanzen haben können. Wie auch bei den vorherigen Versuchen, wurden Bodengleichgewichtslösungen im Verhältnis Boden:Wasser 1:2 mit Leitungswasser angesetzt. Als Testpflanze wurde hier Kresse (Lepidium sativum) benutzt (vgl. auch 4.1.9). Diese wurde 6 Tage vorgekeimt und die Keimlinge für fünf Tage in die DOM eingesetzt. Als Kontrolle diente wieder eine mit destilliertem Wasser verdünnte Nährlösung (400 mL L-1) nach Hoagland & Arnon (1939). Die Versuche wurden mit 10 Pflanzen pro Becherglas und 5 Wiederholungen durchgeführt, wie unter Kap. 3.1.8 beschrieben. Zur Feststellung einer eventuellen Toxizität der Bodenlösung wurde diese in drei verschiedenen Konzentrationen getestet (100 %, 50 % und 25 %). Daneben wurde zur Charakterisierung von DOM eine Adsorberharzfraktionierung mit XAD-8 und fluoreszenzspektroskopische Messungen (vgl. auch unter Kap. 3.1.3) durchgeführt. Zur Auswertung wurde die in Kap. 3.1.11 beschriebene Statistik angewendet. Außerdem wurde eine Korrelationsanalyse (nach Pearson) durchgeführt mittels SPSS 9.0 Package.

61

Abbildung 28: Beprobung Lamspringe, Acker "Sackkuhle" entlang Talwegerosion

Nr. 5, siehe Karte vom 18.05.97 (aus: Isringhausen et al. 1999)

Bodenprobenentnahmestellen Sackkuhle Tal, Mitte, Berg (T, M, B)

TM

B

62

3.3.2 Ergebnisse Die Biomassegewichte der in den DOM-Extrakten gewachsenen Sproße streuten um die Kontrollwerte. Nur die Sproßgewichte der Pflanzen, die mit der Bodenlösung aus der Probe "Tal" vom 24.09.98 getestet wurden, lagen signifikant unter denen der Kontrolle (P=0,005**) und unterschieden sich ebenfalls signifikant von Berg (P=0,013*) und Mitte (P=.0,022*) (siehe Abb. 29). In Abb. 30 sind die DOC-Werten der Bodenlösungen und die der Lamme abgebildet. Die DOC-Werte der Lamme enstammen akkumulierten Wasserproben von 7 Tagen bis zum Probenahmedatum. Der für den 22.12.98 eingetragene DOC-Wert von 53,8 mg L-1 für die Lamme ist der DOC-Wert aus dem in die Lamme entwässernden Drainagerohr. Aus technischen Gründen konnten in dieser Woche die Messung in der Lamme nicht stattfinden. Er entspricht aber ziemlich dem Wert, der in der Lamme eine Woche später ermittelt wurde, von 49,9 mg L-1 DOC. Die Sproßbiomassen der Pflanzen zeigen zu den DOC-Werten in den Bodenlösungen keine Korrelation (r=0,099) (vgl. Abb. 31). Die eindeutige phytotoxische Wirkung des Ackerboden-DOM, Standort "Tal" vom 24.09.98 ist vermutlich auf Akkumulation des letzten am 20.05.98 aufgebrachten Herbizids MCPA31 (600 g Wirkstoff / ha) und des bereits am 18.04.98 angewendeten Herbizids Fluroxypyr32 (108 g Wirkstoff / ha) zurückzuführen. In der Drainageentwässerung zur Lamme wurde nur in den Wasserproben vom 30.07.98, vom 27.08.98 und vom 18.09.98 MCPA nachgewiesen. Das Herbizid Fluroxypyr, das bereits am 18.04.98, also vor MCPA angewendet worden war, wurde lediglich zweimal nachgewiesen, erstmals am 27.08.98 in der Drainagewasserprobe mit 0,92 µg L-1 nachgewiesen und letztmalig (Beprobungen fanden bis Mai 1999 statt) in den Proben vom 18.09.98 mit einer Konzentration von 0,08 µg L-1. Es ist mithin davon auszugehen, dass durch die Akkumulation dieser beiden Herbizide am Fuße des Hanges ein phytotoxischer Effekt durch die Bodenlösungen ausgelöst wurde. Ein solcher Effekt trat am 22.12.98 nicht mehr auf. DOM vom Standort "Berg" wirkte nicht auf das Pflanzenwachstum. In der Auswertung von Verdünnungsreihen der DOM (100 %, 50 %, 25 %) konnte man jedoch erkennen, dass der Standort "Berg" deutliche positive Wuchseffekte mit zunehmender Verdünnung zeigte. Bei diesem Standort ließ sich am 11.6.98 sogar ein hoch signifikanter Unterschied zwischen 100 % und 25 % nachweisen (P=0,001**) (vgl. Abb. 34). Bei dem signifikant negativen Effekt im "Tal" am 24.9.98 waren die Verdünnungen ebenfalls deutlich weniger wuchshemmend. Der toxische Effekt nahm jedoch nicht kontinuierlich ab, was möglicherweise mit konzentrationsabhängiger verschiedener Aggregierung des DOM zusammenhängt (vgl. Kap. 2.1.4.).

31 MCPA, chemisch (4-Chlor-2-methylphenoxy)-essigsäure, CAS-Nr. 94-74-6, Löslichkeit 300 mg L-1 in Wasser

(25°C) 32 Fluroxypyr, chemisch (4-Amino-3,5-dichlor-6-fluor-2-pyridinyl)oxyessigsäure, CAS-Nr. 69377-81-7,

Löslichkeit 0,09 g L-1 in Wasser (20°C)

63

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-14

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

Berg Mitte Tal

Spro

ßgew

icht

(mg)

���11.06.98 24.09.98

���22.12.98

Abbildung 29: Vergleich der DOM-Wirkung auf die Pflanzensproßbiomasse (Lamspringe) (angegeben als Mittelwerte mit Standardabweichung)

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0

10

20

30

40

50

60

Berg Mitte Tal Lamme

mg

L-1

����11.06.98 24.09.98 22.12.98

Abbildung 30: DOC-Werteverteilung (Lamspringe), links Acker "Sackkuhle", rechts in der Lamme

64

5,5

6

6,5

7

7,5

8

8,5

9

9,5

10

25 30 35 40 45 50 55

Sproßgewichte

DO

C m

g/l r=0,099

Abbildung 31: Korrelation (nach Pearson) DOC-Werte und Sproßgewichte, "Sackkuhle"

Es fällt auf, dass Fluroxypyr, dessen Wasserlöslichkeit bei 90 mg/l liegt und dessen Halbwertzeit von 50 Tagen angegeben wird (Perkow & Ploss 1996), erst nach 4 und 5 Monaten nach Applikation in der Drainage nachweisbar war. MCPA, als Essigsäure gut wasserlöslich (300 mg/l), angegeben mit einer Wirkungsdauer von 3-4 Monaten (Perkow & Ploss 1996), wurde erstmalig im 2. Monat nach seiner Aufbringung im Drainagewasser, aber auch noch im 3. und 4. Monat nach der Ausbringung als Ausgangsstoff nachgewiesen. Diese Befunde sprechen dafür, dass diese Stoffe vor mikrobiellen Abbau geschützt waren, zum Beispiel eingeschlossen in Poren von Huminstoffmolekülen.

Monatlicher Niederschlag April-Dezember 1998

0

50

100

150

200

250

April

MaiJu

ni Juli

Augus

t

Septem

ber

Oktobe

r

Novem

ber

Dezem

ber

mm

FluroxypyrApplikation

MCPAApplikation

Abbildung 32: Monatlicher Niederschlag April-Dezember 1998 (Lamspringe) (Fluroxypyr wurde am 18.4.98 (108 g Wirkstoff ha-1) und MCPA am 20.5.1998 (600 g Wirkstoff ha-1) appliziert)

65

0

5

10

15

20

25

2.9.98

3.9.98

4.9.98

5.9.98

7.9.98

9.9.98

11.9.

98

12.9.

98

14.9.

98

15.9.

98

16.9.

98

17.9.

98

18.9.

98

20.9.

98

27.9.

98

30.9.

98

mm

Abbildung 33: Niederschlagsereignisse im September 1998 (Lamspringe) Die Niederschlagsdaten für Lamspringe zeigen, dass für die negative Wirkungen von DOM, wie sie in der Talprobe vom 24.9.98 beobachtet wurde, nicht die absoluten Niederschlagsmengen ausschlaggebend sind (vgl. Abb. 32), sondern der Zeitpunkt des Niederschlags vor der Probenahme (vgl. Abb. 33) und die Stärke des Niederschlags. So fiel der Niederschlag am 18.9.98, sechs Tage vor der Bodenprobenahme, als erosiver Niederschlag (vgl. Schwertmann et al. 1990) und transportierte somit Sediment hangabwärts, was vermutlich zur Akkumulierung von Pflanzeschutzmitteln am Standort "Tal" führte. Im Oktober, als es zu gehäuften erosiven Ereignissen kam, wäre der Effekt möglicherweise noch stärker gewesen. Da aber in diesem Monat keine Bodenproben genommen wurden, war der Effekt im Dezember, als zum letzten Mal beprobt wurden, nicht mehr sichtbar. Die Adsorberharz-Fraktionierung mit XAD-8 (vgl. Tab. 11) ergab erhebliche Differenzen der Fraktionen in Abhängigkeit der Jahreszeit. Diese aufwendige Fraktionierung wurde nur an den Proben aus des Standortes "Tal" durchgeführt.

Tabelle 11: XAD-8 Fraktionierung der Bodenlösungen (Lamspringe) 11.6.98 24.9.98 22.12.98

% mg L-1 SD % mg L-1 SD % mg L-1 SD

Hydrophile 41,4 2,02 1,0 50,0 3,42 1,8 46,7 3,05 1,7

Hydrophobe 58,6 5,39 (n=5) 50,0 3,42 (n=5) 53,3 3,49 (n=5)

66

Wahrscheinlich ist, dass der hohe Anteil hydrophober DOM auf Pflanzenschutzmittelanwendung zurückzuführen ist. Dafür spricht, daß am 24.9.98 der hydrophobe Anteil wieder deutlich (um 8,6 %) abgenommen hatte. Die letzte Anwendung von Pflanzenschutzmitteln fand auf dem Schlag "Sackkuhle" in Lamspringe am 9.6.98 statt, also zwei Tage vor der ersten Bodenprobenahme. Leider wurden die Bodenlösungen nicht auf Pflanzenschutzmittel untersucht. Allerdings waren während des gesamten Projektes in keiner Bodenprobe Pflanzenschutzmittel nachweisbar. Ursache hierfür könnte der Einschluß oder die Bindng anorganische Substanz sein. Die DOC-Werte im Vorfluter, der Lamme zeigen deutlich höhere Werte als die Bodenproben mit durchschnittlich 7 mg L-1, mit Ausnahme der Probe vom 24.9.98 (siehe Abb. 30). Dies spricht daher eher dafür, dass die hohen DOC-Werte auf gelöste, bzw. an oder in DOM transportierte Pflanzenschutzmittel zurückzuführen ist, anstatt auf gelösten Bodenhumus.

67

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Bodenproben vom 11.06.98

-10

-5

0

5

10

15

20

25

Berg Mitte Tal

Spro

ßgew

icht

sabw

eich

ung

(mg)

von

der

Kon

trol

le ������100% 50% 25%

�������������������������� ������������� ������������

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Bodenproben vom 24.09.98

-15

-10

-5

0

5

10

Berg

Mitte Ta

l

Spro

ßgew

icht

sabw

eich

ung

(mg)

von

der

Kon

trol

le ������ 100% 50% 25%

��������������������������

������������������������������������������������

Bodenproben vom 22.12.98

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

12

14

Berg Mitte Tal

Spro

ßgew

icht

sabw

eich

unge

n (m

g) v

on d

er K

ontr

olle ��� 100% 50% 25%

Abbildung 34: Effekte der DOM-Verdünnung auf die Pflanzensproßbiomasse (Lamspringe)

68

4 Diskussion 4.1 Bindung von DOM an organische Xenobiotika Die Bindung galt bisher als einzige nachweisbare Erklärung für eine Toxizitätsminderung durch DOM in der Kombination mit hydrophoben Xenobiotika (McCarthy et al. 1985, Johnsen et al. 1989, Kukkonen & Oikari 1987, Kukkonen et al. 1989, Day 1991, Versteeg & Shorter 1992, Steinberg et al. 1993). Suffet et al. (1994) werteten die bestehenden Methoden zur Feststellung der Bindung von Xenobiotika und DOM aus. Sie konstatierten, wie auch schon Seitz (1981), dass sämtliche Methoden, die auf vorherige Trennung von gebundenem und ungebundenem Xenobiotikum angewiesen sind, zu mehr oder weniger großen Fehlerquoten führen. Bei der Dialysemethode ist man auf die spezifische Filtergröße des Schlauches angewiesen. Es müssen dann die Ungenauigkeiten durch an Partikel gebundene Anteile, die kleiner als die Filterporen sind, in Kauf genommen werden. Eine Dialysemethode wurde auch zum Bindungsnachweis von radioaktiv markiertem DDT u.a. an Gewässer-DOM (Carter & Suffet 1982) und von PAK an Aldrich-Huminsäure (McCarthy & Jimenez 1985a) verwendet. Die einzigen direkten Meßmethoden, die Fluoreszenzspektroskopie und die sogenannten "Headspace"-Methoden (Hassett & Milicic 1985; Yin & Hassett 1986), die ungebundene Xenobiotika an der Übergangszone von Flüssigkeit zu Luft messen, müssen allerdings noch weiterentwickelt werden (Suffet et al. 1994). Die Notwendigkeit, die Selbstauslöschung ("inner filter effect") durch Verdünnung der DOM zu verhindern, macht es auch beim Fluoreszenzquenching schwierig, eine Bindung nachzuweisen. Eine Verdünnung von DOM hat ja leider auch eine mögliche Molekülgrößenveränderung zur Folge (vgl .Kap. 2.1.4). In dieser Studie konnte mittels Fluoreszenzquenching eine Bindung von Paraquat und in geringem Umfang auch von 2,4-D durch Grünlandboden-DOM und Stroh-DOM nachgewiesen werden. Interaktionen zwischen 2,4-D und Moor-Na-Humaten und -Fulvaten konnten Spark & Swift (1994) mittels Fluoreszenzquenching nicht nachweisen. In Studien mit Fulvo- und Huminsäuren war stets über Bindung von Paraquat berichtet worden (Maqueda et al. 1989, Maqueda et al. 1993, Cserháti 1993, Spark & Swift 1994, Govi et al. 1996). Nur in einer Ökotoxizitätsstudie mit Daphnia magna (Oikari et al. 1992) wurde berichtet, dass im Vergleich zu Fenvalerat, Lindan und Cadmium, Paraquat keine Toxizitätsverminderung im Zusammenwirken mit huminreichem Wasser zeigte. Für Naphthalin und dessen Metabolit 1-Naphthol war einmal dynamisches Quenching in Kombination mit aus Boden isolierter Huminsäure nachgewiesen worden (Morra et al. 1990). Einmal war für 1-Naphthol statisches Quenching und somit Interaktion zwischen DOM und 1-Naphthol (Chen et al. 1994) beobachtet worden. Auch in dieser Studie konnte sowohl dynamisches als auch statisches Quenching mit Naphthalin nachgewiesen werden. McCarthy & Jimenez (1985b) fanden heraus, dass Naphthalin nur durch Interaktion mit hohen Konzentrationen (130-320 mg L-1) von Aldrich-Huminsäure einen höheren Bindungskoeffizienten hatte. Die Bindung ist eine indirekte ökotosxizitätsmindernde Wirkung von DOM (Campbell et al. 1997). Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass Bindung nur ein Aspekt der Wirkung von DOM auf die Phytotoxizität ist, denn die Kombinationswirkungen waren bei allen

69

Xenobiotika in etwa gleich verteilt, unabhängig vom Nachweis ihrer Bindung (vgl. Abb. 35+36). 4.2 Kombinationspflanzentests von DOM und organischen Xenobiotika DOM zeigte in der Einzelwirkung sowohl positive als auch negative Effekte auf das Wachstum von Pflanzensproßen. Absicherbare positive Wirkungen waren bei den beiden niedrigeren Konzentrationen von 5,22 mg L-1 und 12 mg L-1 nachweisbar. Nur die Konzentration von 120 mg L-1 Stroh-DOM wirkte durchweg negativ. In drei von fünf Fällen ließ sich diese Wirkung statistisch absichern. Hoch dosiertes Stroh-DOM trübte bereits binnen Stunden ein, was auf mikrobiellen Wachstum schließen läßt. Das mikrobielle Wachstum führte in der Folge zu anaeroben Verhältnissen, und damit zur Fäulnisbildung an den Wurzeln. Von negative Wirkungen von Fulvosäuren auf Pflanzen wurden erst bei viel höheren Konzentrationen berichtet. Rauthan & Schnitzer (1981) fanden eine Reduktion von Biomasse und Längenwachstum bei Gurken (Cucumis sativus) bei Konzentrationen ab ≥ 500 mg L-1, während Lulakis & Petsos (1995) noch bei 2000 mg L-1 aus Weintrester gewonnenen Fulvosäuren keine negativen Effekte des Längen- und Wurzelwachstums von Tomatenpflanzen feststellen konnten. Nopamornbodi (1977) fand negative Wachstumseffekte erst bei 3200 mg L-1. Das liegt vermutlich daran, dass der Anteil an direkt mikrobiell verwertbarem DOM bei den Huminstoffen viel niedriger liegt, als bei Stroh-DOM, die zu ca. 70 % aus hydrophilen, chemisch definierbaren Bestandteilen besteht. Hieraus ergibt sich, dass auch bei sehr hohen Humistoffkonzentrationen ein vergleichbares mikrobielles Wachstum, wie das bei 120 mg L-1 Stroh-DOM nicht vorkommt. Die leicht negativen Effekte in den niedrigeren DOM-Konzentrationen mögen einerseits an etwas geringerer Nährstoffverfügbarkeit als in den Nährstofflösung-Kontrollen gelegen haben. Die DOM-Kontrollen wurden, um die Leitfähigkeit stabil zu halten, ohne Nährlösung angesetzt. Neben einem indirekten positiven Einfluß von DOM durch Bindung von toxisch wirkenden Xenobiotika, könnte ein direkter positiver Einfluß durch wachstumsfördernde enzymatische Wirkung von DOM (Hillitzer 1932, Cacco & Dell'Agnola 1994) in Kombinationswirkungen entscheidend sein. Nardi et al. (2000), die Untersuchungen zu dem Zusammenhang von qualitativer Zusammensetzung von Huminstoffen und Pflanzenwachstum durchführten, stellten fest, dass in niedermolekularen Huminstoffen (Fulvosäuren) die Fraktion mit hohem Carboxylgehalt und hohem Anteil aromatischer Strukturen und bei hochmolekularen Stoffen (Huminsäuren) ein großer Anteil an Pectid und Kohlenhydrat-Kohlenstoff die metabolischen Parameter von Pinus mugo- und Pinus sylvestris am stärksten beeinflußten, wobei es artenspezifische Unterschiede gab. Anhaftung von DOM-Molekülen an Zellmembranen (Vaughan & Ord 1981, Campbell et al. 1997) können für verbesserten Nährstofftransport in die Zellen durch Interaktion mit den Membranen sorgen (Chen & Aviad 1990), aber auch für einen negativer Einfluß verantwortlich sein. Zellmembranen bestehen aus einer Doppelschicht von Phospholipiden mit darin enthaltenen globulären hydrophilen Transportproteinen, die als "Pförtner" den Transport von Stoffen in die Zelle überwachen. Wasser und niedermolekulare lipophile Moleküle werden durch die Phospholipidschicht durchgelassen. Anorganische Ionen diffundieren durch die Proteinporen oder werden durch Tunnelproteine aktiv ins Zellinnere transportiert. Die Poren können durch Bindung von Metallen oder organischen Stoffen an die Transportproteine vergrößert werden (Lüttge et al. 1984), wodurch Toxine ins Zellinnere gelangen und damit zum Zelltod führen könnten. Huminstoffe können sich durch ihren

70

amphoteren Charakter wie Tenside verhalten. Es ist lange bekannt, das solche oberflächenaktiven Stoffe, die wie die Membranen selbst, aus einer hydrophoben Kohlenwasserstoffkette mit einem hydrophilen "Kopf" bestehen, mit Membrankomponenten in Wechselwirkung treten und somit ihre Eigenschaften verändern können (Helenius & Simons 1975). Campbell et al. (1997) konnten nachweisen, dass Fulvo- und Huminsäuren an Zellwände von Phytoplankton anhaften. Vigneault et al. (2000) fanden heraus, dass die Veränderung der Membranendurchlässigkeit durch den Einfluß aquatischer Fulvo- und Huminsäuren auf die Phospholipidschicht zurückzuführen war, nicht auf den Einfluß auf die Transportproteine. Führ & Sauerbeck (1966) stellten fest, dass Sonnenblumenwurzeln Abbauprodukte von Stroh aufnehmen. DOM könnte die Mineralisierung der Xenobiotika erhöhen (Park et al. 2000), ihren photolytischen Abbau beschleunigen (Wang et al. 1995, Sanlaville et al. 1996, vgl. auch Kap. 3.1.4) und dabei sowohl zur Detoxifizierung als auch zur Erhöhung der Toxizität der Xenobiotika beitragen. Über die Phytotoxizität der Abbauprodukte der hier getesteten Xenobiotika liegen, nach meinem Erkenntnisstand, keine Angaben vor, bis auf 1-Naphthol, dem Metabolit von Naphthalin. Seine phytotoxische Wirkung ist stärker als die von Naphthalin, weshalb dieser Stoff als Basis des Herbizids Napropamid (vgl. Kap. 3.1.6) verwendet wird.

Wirkungsdiagramm

-20

0

20

-20 0 20

Abweichungen von der 2,4-D-Wirkung

Abw

eich

unge

n vo

n de

r DO

M-W

irkun

g

antagonistisch synergistischpositiv

synergistischnegativ antagonistisch

Wirkungsdiagramm

-20

0

20

-20 0 20

Abweichungen von der Paraquat-Wirkung

Abw

eich

unge

n vo

n de

r DO

M-W

irkun

g

synergistischnegativ

synergistischpositiv

antagonistisch

antagonistisch

b) a)

Abbildung 35: Kombinationswirkungen der Herbizide Paraquat (a) und 2,4-D (b) mit Stroh- und Grünlandboden-DOM (die 0-Koordinaten, die bis zu ihrem Schnittpunkt das Quadrat "synergistisch negativ" begrenzen, markieren die "additiven" Kombinationswirkungen)

In aquatischen Ökosystemen wurden immer wieder auch Biokonzentrationserhöhungen durch DOM festgestellt, die aber wegen Erklärungsmangel als statistisch nicht absicherbare experimentelle Fehler abgestempelt wurden (Haitzer et al. 2001). Diese Negierung von Ergebnissen erscheint wenig schlüssig, da durch die natürliche Biodiversität innerhalb einer Spezies statistische Absicherung von ökotoxischen Wirkungen grundsätzlich schwierig ist. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen die Unmöglichkeit, mit den gleichen Ausgangsmaterialien und Methoden identische DOM zu verschiedenen Zeitpunkten

71

herzustellen. Die Charakterisierung von DOM mittels XAD-8 Fraktionierung in hydrophile und hydrophobe Anteile läßt keine Interpretation der Kombinationswirkung zu. Der quantitative Anteil an hydrophoben Substanzen in DOM, der mit Huminstoffen gleichgesetzt wird, hat also keinen alleinigen Einfluß auf die Kombinationswirkung. Es ist bei der Diskontinuität der Ergebnisse anzunehmen, dass die Erklärung für die Kombinationswirkung mit DOM sich aus mehreren, völlig unterschiedlichen Wirkungsfaktoren zusammensetzt. Die spezifische Zusammensetzung der DOM, scheint eher ausschlaggebend für die Kombinationswirkung zu sein. Die Fraktionierung in Basen, Säuren und Neutrale, wie von Leenheer (1981) vorgeschlagen, schlug fehl, wegen der hohen Variabilität der Basen und Neutralen in den Parallelen in der identischen DOM (vgl. Kap. 3.1.3).

Wirkungsdiagramm

-20

0

20

-20 0 20

Abweichungen von der Naphthalin-Wirkung

Abw

eich

unge

n vo

n de

r DO

M-W

irkun

g

synergistischnegativ antagonistisch

antagonistisch synergistisch positiv

Abbildung 36: Kombinationswirkung des PAK Naphthalin mit Stroh- und Grünlandboden-DOM (die 0-Koordinaten, die bis zu ihrem Schnittpunkt das Quadrat "synergistisch negativ" begrenzen, markieren die "additiven" Kombinationswirkungen)

Der in dieser Studie gewählte systematische Ansatz ökotoxikologischer Auswertung des Zusammenwirkens von organischen Xenobiotika spezifischer chemischer Eigenschaften mit DOM beweist, wie in den Abb. 35+36 und Tab. 7 ersichtlich, dass es keine systematischen Regeln für phytotoxische Auswirkungen organischer Schadstoffe in Zusammenwirken mit DOM geben kann, da DOM in seinen chemisch-physikalischen Eigenschaften zu variabel ist. Wie die Abb. 35+36 zeigen, ist die Verteilung der Kombinationswirkungen bei allen hier getesteten chemisch unterschiedlichen Xenobiotika relativ gleichverteilt (vgl. auch Tab. 9), egal ob basisch (Paraquat), sauer (2,4-D) oder hydrophob (Naphthalin). Außerdem ist bisher noch nicht geklärt, welche ökotoxikologisch relevanten Auswirkungen DOM bereits alleine auf die Pflanzen haben kann, wie z.B. die Veränderung der Membranporengröße. 4.3 Bedeutung der Ergebnisse für natürliche Bedingungen Die Ergebnisse dieser Studie haben gezeigt, dass es für die Wechselwirkungen von organischen Xenobiotika mit DOM kein einfaches Erklärungsmuster gibt. Kombinationswirkungen können nicht durch den quantitativen Anteil an Huminstoffen an

72

DOM prognostiziert werden. Es ist davon auszugehen, dass es auch zu synergistisch negativen phytotoxischen Effekten organischer Xenobiotika mit DOM kommen könnte, was in dieser Studie nur bei der höchsten DOM-Konzentration nachweisbar war. Die Versuche mit Ackerboden-DOM aus konventionellem Anbau zeigen, dass Xenobiotika, die an die Bodenmatrix gebunden werden, nicht dauerhaft inaktiv bleiben, sondern Boden und witterungsabhängig in ihrer Ausgangsform erhalten bleiben, und nach starken Regenfällen, vermutlich mittels DOM, mobilisiert werden können, dann ökotoxisch wieder aktiv und dem mikrobiellen Abbau ausgesetzt sind. Die Theorie, dass Substanzen innerhalb von Hohlräumen der natürlichen organischen Substanz eingeschlossen werden können, wurde von Puchalski et al. (1992) eingebracht, von Engebretson & von Wandruszka (1994) bekräftigt und von Schulten & Schnitzer (1997) bestätigt. Schulten & Schnitzer (1997) konstatieren, dass die Hohlräume im Humus fähig sind, organische und anorganische Substanzen aufzunehmen. Die Substanzen sind in den Hohlräumen nicht nur eingeschlossen sondern auch durch funktionale Gruppen fixiert, z.B. durch Wasserstoffbindung im Falle von Sacchariden. Es bleibt zu klären, wie lange die "Gefangenschaft" von organischen Xenobiotika im Humus anhalten kann. Die Bedeutung der Ergebnisse dieser Studie für natürliche Bedingungen besteht in der Erkenntnis, dass durchaus Wirkungsverstärkungen der Xenobiotika durch DOM auftreten können und dass der Wirkungszeitraum nach der Applikation von Pflanzenschutzmittel durchaus nicht berrechenbar ist, sondern in Abhängigkeit von Boden und Witterung unterschiedlich lange sein kann. 5 Ausblick Wenn bisher in der aquatischen Ökotoxikologie das Augenmerk vor allem auf eine Reduzierung von Biokonzentration und Ökotoxizität durch die Bindung lipophiler aromatischer Xenobiotika an gelöste Huminstoffe gerichtet wurde, muß nach dieser Studie folgendes festgehalten werden: Es scheint, dass die quantitative Zusammensetzung von DOM in Bezug auf den Anteil an hydrophober organischer Substanz, also an Huminstoffen, relativ stabil ist. Dieser Fakt hatte jedoch keinen dominanten Einfluß auf die Phytotoxizität. Folglich ist das Erklärungsmuster, dass wegen der Bindung der hydrophober organischen Xenobiotika an Huminstoffe die Ökotoxizität abnimmt, so nicht haltbar. Für die Biokonzentration mag hingegen durchaus zutreffen, dass je hydrophober ein Xenobiotikum, desto höher seine Biokonzentration ist, da insbesondere hydrophobe Xenobiotika an Fettgewebe angelagert werden. Vielmehr erscheint es nach den Ergebnissen dieser Studie sinnvoll, für zukünftige Versuche zusätzlich zu den quantitativen Analysen des DOM qualitative Untersuchungen durchzuführen und zwar auch im Bereich der niedermolekularen chemisch bestimmbaren Bestandteile von DOM, insbesondere die niedermolekularen organischen Säuren, die durchaus phytotoxische Bedeutung haben können. Forschungsbedarf besteht darüber hinaus im Hinblick auf phytotoxische Wirkungsweisen von DOM, in Abhängigkeit unterschiedlichen Jahreszeiten und unterschiedlicher Standorte (Klima, Boden) für alle genutzten Flächen, wie Acker, Grünland und Forst.

73

Die vorliegenden Untersuchungen lassen vermuten, dass der Einfluß der chemischen Zusammensetzung von Regenwasser, vor allem organische Partikel, von großer Bedeutung für die Zusammensetzung und damit für die Eigenschaften von DOM sind. Insbesondere sind hierbei die Hauptanionen und die Leitfähigkeit zu berücksichtigen, die nachgewiesenermaßen Einfluß auf die Konzentrationen des extrahierten DOM haben (vgl. Herbert & Bertsch 1995). Zum besseren Verständnis der Wirkungsweise von DOM und der Kombinationswirkungen mit DOM erscheint es wichtig die biologische Membranen, als potentielle Wirkorte der tensidisch wirkenden gelösten Huminstoffe, elektronenmikroskopisch zu betrachten.

74

Anhang 1 Physikalische und chemische Eigenschaften der Böden und des Leitungswassers Physikalische und chemische Eigenschaften des Grünlandbodens (Institut) Boden pH C

(CaCl2) org

(%) N (mg g-1))

KAK cmol z-1 kg-1

Ton (%)

Schluff (%)

Sand (%)

Ca2+

(mg kg -1) K+

(mg kg -1) Mg 2+

(mg kg -1) Na+

(mg kg -1) Parabraunerde Ah

6,6 1,8 1,10 10,2 7,3 17,0 75,7 16,4 0,5 0,7 0,5

Physikalische und chemische Eigenschaften Leitungswasser (Beelitzhof) Leitfähigkeit (µS cm-1)

pH Gesamt-härte (°dH)

Ca2+ Mg2+ Na+ K+ Fe ges. NH4+ NO3

- NO2- Cl- SO4

2- PO43- F- PAK PSM

720 7,5 15,4 96 8,4 43 3,5 <0,03 <0,05 3,5 <0,03 58 87 0,09 0,18 <0,0005 <0,0005Quelle: Berliner Wasserbetriebe (2000) Physikalische und chemische Eigenschaften Ackerboden Lamspringe Boden pH Carbonat

(%) Corg (%)

N (mg g-1)

Ton (%)

Schluff (%)

Sand (%)

Braunerde Ap

7,6 0,3 1,11 0,99 32,6 64,1 2,1

Quelle: Duttmann R, Mosimann T, Thiem W (1999) Partikelgebundene Stofftransporte in Agrargebieten (Lößbecken im Niedersächsischen Berg- und Hügelland). Mitteilungen der deutschen Bodenkundlichen Gesellschaft, Bd. 90, 437-457; (Tab. 5, S. 453)

75

Anhang 2 Fluoreszenzspektren

76

Leitungswasser

18.07.01 25.07.01

18.07.01 25.07.01

19.07.01 09.04.01

19.07.01 20.12.00 09:41

77

Grünlandboden-DOM

15.12.00 19.07.01

20.12.00 19.07.01

09.04.01 25.07.01

10.04.01 25.07.01

78

Stroh-DOM

15.12.00

18.07.01

09.04.01 18.07.01

10.04.01 19.07.01

20.12.00 19.07.01

79

09.04.01 11:08

Grünlandboden-DOM zu Beginn des Tests

09.04.01 11:05

80

09.04.01 12:52

09.04.01 12:50

09.04.01 12:00

09.04.01 11:58

Grünlandboden-DOM nach 5 Tagen ohne Pflanze, mit Licht, Parallelgläser a) und b)

81

09.04.01 13:01

09.04.01 12:58

09.04.01 12:07

09.04.01 12:05

Grünlandboden-DOM nach 5 Tagen ohne Pflanze, ohne Licht, Parallelgläser a) und b)

82

09.04.01 12:44

09.04.01 12:42

09.04.01 11:52

09.04.01 11:50

Grünlandboden-DOM nach 5-tägigem Wachstum von Rübe, Parallelgläser a) und b)

83

09.04.01 11:15

09.04.01 11:17

Stroh-DOM zu Beginn des Tests

84

09.04.01 12:24

09.04.01 12:22

09.04.01 11:35

09.04.01 11:33

Stroh-DOM nach 5 Tagen ohne Pflanze, mit Licht, Parallelgläser a) und b)

85

09.04.01 12:33

09.04.01 12:30

09.04.01 11:44

09.04.01 11:42

Stroh-DOM nach 5 Tagen ohne Pflanze, ohne Licht, Parallelgläser a) und b)

86

09.04.01 12:15

09.04.01 12:13

09.04.01 11:26

09.04.01 11:24

Stroh-DOM nach 5-tägigem Wachstum von Rübe, Parallelgläser a) und b)

87

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Lebenslauf geboren am 15.01.1961 in Montevideo / Uruguay März 1967 Einschulung in die Norte-Goethe-Schule, Buenos Aires / Argentinien Nov. 1968 Umzug nach Deutschland 1980 Abitur am Landrat-Lucas-Gymnasium Opladen

1980-1981 Praktika in Schlosserei, Tischlerei und Kunststoffverarbeitung

1981-1984 Studium Innenarchitektur und Möbeldesign,

(Staatliche Akademie der bildenden Künste, Stuttgart)

1985-1991 Studium und Diplom der Landschaftsplanung

(Technische Universität Berlin)

1992-1993 Landschaftsplanerin im Büro "Landschaftsplaung und Stadtökologie"

(Dr. Axel Auhagen), Berlin

1993-1994 Master of Science in Environmental Sciences

(Trinity College Dublin, Rep. Irland)

1995 wissenschaftliche Mitarbeiterin im Institut für Landschaftsnutzung, Zentrum

für Agrarlandschafts- und Landnutzungsforschung, ZALF e.V.,

Müncheberg

seit Okt. 1995 wissenschaftliche Mitarbeiterin am Fachgebiet "Abfallbelastung der

Landschaft", Institut für Ökologie, TU Berlin

1998 Geburt meiner Tochter Helen Solvig

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