physalis ixocarpa) por cromatografía de líquidos de alta...

Cuantificación de los diferentesfolatos presentes en tomatillo

(Physalis ixocarpa) porcromatografía de líquidos

de alta resoluciónQuantification of folatesin Physalis ixocarpaby high pressure liquidchromatography

JOSÉ LUIS IBAVE GONZÁLEZ* Y M. OCHOA

ResumenEn este estudio se identificaron y determinaron las diferen-tes especies de folatos por medio de cromatografía liquidade alta resolución en fase reversa, con detección de fluores-cencia, aunado a un tratamiento trienzimático. Ladeconjugación de las cadenas de glutamatos en los folatosse realizó mediante una columna de afinidad a folatos. Lacantidad promedio de folatos fue de 1.2 µM/100 gramos depeso fresco. La composición de las principales estructurasde folatos presentes en Physalis correspondió a 5-metil-tetrahidrofolato, tetrahidrofolato y 5-formil-tetrahidrofolato. Lavaloración de estos importantes metabolitos dentro de la dietase ha soslayado debido a la dificultad implícita en su análi-sis. Es evidente que la falta de esta vitamina está implicadaen el riesgo de defectos del tubo neural y anencefalia, princi-palmente en embarazos no deseados, donde no se consumeuna dieta adecuada de suplementos antes de la concepción.Este problema puede ser disminuido con la ingesta de fuen-tes de folatos en la dieta como Physalis ixocarpa.Palabras clave: tomatillo, folatos, HPLC.

__________________________________* Profesor-Investigador de la Facultad de Ciencias Agrotecnológicas, Universidad Autónoma de Chihuahua, Campus

1. Chihuahua, Chihuahua, México, 31310. Tel. (614) 4391844 y 45. [email protected]

AbstractAn efficient quantification method by HPLC wasimplemented for folates analysis in Physalisixocarpa (husk tomato). A trienzymatic treatmentwas used for the initial extraction of folates fol-lowed by glutamate deconjugation by a folate af-finity column. The average amount of folates was1.2 µM/100 grams of fresh weight. The majorfolate structures present in Physalis were identi-fied as 5-methyl-tetrahydrofolate, tetrahydrofolateand 5-formyl-tetrahydrofolate. The importance ofthe methodology stresses the fact that the diffi-culty implied in the analysis was overcome. Sincethis vitamin is involved in several new born dis-orders such as neural tube defects and anen-cephaly, it is of great importance to provide suchelements in the diet and Physalis ixocarpa rep-resents an excellent source of folates.Keywords: green tomato (husk tomato), folates,HPLC.

Alimentos

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Introducción

l tomatillo (Physalis ixocarpa) es de amplio uso para la preparaciónde salsas y platillos en la cocina mexicana y es una fuente importantepara el suministro de cantidades suficientes de folatos. Los folatos per-tenecen a las vitaminas del grupo B y son de gran importancia nutricionalE

para el ser humano. Están compuestos de tres partes fundamentales: la uterina,con diferentes estados de oxidación, que es una molécula de pABA, y final-mente de residuos de glutamato, los cuales imparten su estabilidad dentro dela célula. Estos compuestos son necesarios para prevenir enfermedadescardiovasculares, defectos del tubo neural, anencefalia (Berry et al., 1999;Czeizel y Dudas, 1992) y cáncer (Giovannucci et al., 1995) por medio de ladonación de un grupo metilo (llamado el ciclo de C1), necesario para la fabri-cación de purinas y pirimidinas en la biosíntesis de metionina y homocisteína(Giovannucci et al, 1995). Su consumo es vital para una adecuada divisióncelular y mantener la homeostasis (Wagner, 1995).

Las diferentes coenzimas in vivo depen-den de la cantidad y la biodisponibilidad al in-gerir folatos y después de la pérdida por víaurinaria, fecal y rutas catabólicas (Mason, 1995;Boushey, 1995). Estudios recientes estipulanque el ácido fólico tiene la capacidad de pre-venir defectos del tubo neural, particularmenteal aumentar el sustrato disponible para lareductasa termolábil (5,10- methylenetetra-hydrofolato), lo que resulta en un aumento en laconversión de los aminoácidos homocisteína ymetionina, y por lo tanto elimina o reduce el ries-go de que no cierre el tubo neural (Fohr et al.,2002). Los folatos están relacionados con laincidencia de anemia megaloblástica maternal,bajo peso del bebé (Sauberlich, 1995) y alum-bramiento prematuro (School y Jonson, 2000).El consumo adecuado de alimentos ricos enfolatos (aproximadamente 392 mg/día) estáasociado con la disminución de un 22% de losniveles de homocisteína en el cuerpo (Van Oartet al., 2003). La sensibilidad a la luz, calor y oxí-geno de esta molécula la hacen susceptible alos métodos empleados en la preparación delos alimentos, ya que se pierde gran cantidad allixiviarse en el agua de cocción, puesto que esuna vitamina hidrosoluble. El mayor aporte defolatos en la dieta es por medio del consumode verduras.

Lo anterior sustenta la determinación dela concentración de folatos presente en los ali-mentos, que es crítica para la división celular,principalmente en mujeres embarazadas du-rante las horas iniciales de la concepción y losprimeros tres meses de formación del feto.Adecuados niveles de folatos previenen pro-blemas de anencefalia y defectos del tuboneural. Es determinante asegurar una cantidadadecuada de estos compuestos en la ingestade las mujeres en gestación para evitar ries-gos al embrión, ya que los folatos son precur-sores de las bases nucleicas implicadas en labiosíntesis del ácido desoxirribonucleico.

El objetivo de esta investigación fue iden-tificar y cuantificar los diferentes tipos de folatosbiológicamente activos en los tejidos de toma-tillo (Physalis ixocarpa) mediante un método es-tandarizado y efectivo por cromatografía de lí-quidos de alta resolución.

Materiales y métodosEn este estudio se utilizó un cromatógrafo delíquidos de alta resolución (HPLC) de marca HPmodelo 1050 Agilent Instruments modelo 1100,equipado con una bomba cuaternaria, auto-muestreador, arreglo de diodos (DAD) condegasificación por helio y un detector de fluo-rescencia (FLD), y con una columna Nucleosil

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C-18 de 25 mm, 4.6, y 5mM. El HPLC es con-trolado por una PC con software HPChemStation; además de una centrífugaEppendorf con temperatura controlada, unespectrómetro UV/Vis Cary-Varian y un ShakerNew Brunswick modelo CX, Thermolyne 1100.

Para el desarrollo del estudio fueron utiliza-dos los siguientes materiales: 5-metil-tetrahidrofolato, tetrahidrofolato, ácido fólico,5-formil-tetrahidrofolato, dihidrofolato (Sigma-Aldrich, St. Louis MO.), affi-gel 10 (bio-rad), áci-do trifluoroacético, folate binding protein (FBP,Sigma-Aldrich), azida de sodio, acetonitrilo gra-do HPLC, ácido acético, DL-dithiotreithol(Sigma-Aldrich) fosfato de potasio monohidrata-do, fosfato de potasio dihidratado, agua gradoHPLC, á-amilasa (Aspergillus oryzae, Sigma-Aldrich), proteasa (Streptomyces griseus,Sigma-Aldrich) y conjugasa pancreática de po-llo tipo 1 (Sigma-Aldrich).

Todos los compuestos empleados fueronde la mas alta pureza y las soluciones fueronfiltradas a través de un filtro de nylon 0.22 µm(Sigma-Aldrich).

La preparación de la columna se realizóde acuerdo a Gregory y Toth (1988) y Selhubet al., (1980), con algunas modificaciones. Setomaron 9.3 ml de agarosa Biorad Affi-Gel 10,se colocaron en una cápsula de porcelana, sehizo lavado con 3 volúmenes de cama con aguaa 4 ºC, se pasaron a un matraz Erlenmeyer de

Figura 1. Tomatillo (Physalis ixocarpa)en diferentes estadíos fenológicos.

50 ml y se colocaron en un agitador a 4 ºC y a150 rpm. La proteína folate binding protein(FBP) se disolvió en un amortiguador defosfatos pH 7 y después se añadió la agarosa,agitándose durante cuatro horas para formaruna buena unión entre ellas. Luego se sacó yse lavó con buffer de KAc 0.05 M a pH 4.9 tresveces; posteriormente se empacó y se enjuagócon KAc 0.05 M en tres ocasiones, para un fi-nal con tres volúmenes de cama con buffer defosfatos.

Para la preparación de análisis de los fru-tos de tomatillo, se adquirieron éstos en dife-rentes centros comerciales del estado deChihuahua. La extracción de la muestra se lle-vó a cabo de acuerdo al método de Selhub etal., (1980) y con las menores modificacionespropuestas por Gregory y Toth (1988), bajo luzamarilla de baja intensidad para impedir lafotodegradación de los compuestos a deter-minar. A cada frasco de extracto se le agregóel buffer de extracción pH 7 y se calentó a bañomaría por 10 min a 100 ºC, mientras se agitabaa 50 rpm durante 10 min. Posteriormente y deforma inmediata se puso en baño con hielo parabajar la temperatura y se aplicó una corrientede nitrógeno para desplazar el oxígeno y evitarla oxidación. Se centrifugó por 20 min a unafuerza relativa de 13000 x g a 4ºC, separandoel sobrenadante y redisolviéndose el residuoagitando de nuevo y centrifugándose por 10


min a 13000 x g a 4 ºC. Se juntaron lossobrenadantes y se aforó a 50 ml con bufferde extracción, lavándose nuevamente con ni-trógeno. Se tomaron 5 ml del sobrenadante yse pasaron a través de la columna de FBP an-tes estabilizada con buffer de extracción de 10ml y enjuagada con buffer de fosfatos 0.025Mcon 1M de NaCl a pH 7. Enseguida se lavó nue-vamente con buffer de extracción a un flujo de0.43 ml/min. por gravedad, fluyéndose 0.02M(TFA)-0.02M (DTT) y lavados consecutivos0.025M de buffer de fosfatos, conteniendo 1Mde NaCl y de nuevo con buffer de extracción.La columna de FBP se almacenó con azida desodio 0.02 % en buffer de extracción.

El tratamiento trienzimático en los alimen-tos es necesario para determinar la cantidadde folatos total presente (Martín y Eintenmiller,1990). No todos los alimentos se comportanigual en el tratamiento trienzimático, ya que notienen un pH de actividad definida (Tamura etal., 1997) y son usados para eliminar almidón yproteínas, que puedan causar interferencia endiferentes alimentos y por lo tanto incrementarla cantidad de folatos presentes (Cerna y Kas,1983; Tamura, 1998). Es por esto que todasestas técnicas se realizan bajo luz amarilla paraeliminar la fotodegradación. La preparación dela á-amilasa fue a una concentración de 20 mg/ml, añadiéndose 2 ml a la muestra por 5 horasy 37 ºC, mientras que la concentración de laproteasa fue de 10 mg/ml, añadiéndose 1 mlpor 0.30 g de muestra liofilizada ó 5 g de mues-tra fresca, preparándose con 0.1M de buffer defosfatos a 4.1, ajustando el pH con fosfatodibásico 0.1M y 57mM de ácido ascórbico por 6horas a 37 ºC. La conjugasa pancreática (5 mg/ml) se preparó de acuerdo a Rader et al., (1998)y Gregory (1984), disolviéndose por 3 horas a37 ºC en 1.42% de buffer fosfatos, conteniendo1% de ácido ascórbico a pH de 7.8. Despuésse calentó en baño maría por 5 min., con elobjeto de desnaturalizar las enzimas y separarpor filtración en un filtro de nylon 0.22 µm.

Para la detección de folatos se utilizó ungradiente binario en sistema de cromatografíade alta resolución en fase reversa, columna C18nucleosil (150 x 4.6mm x 5 µm) y dos detecto-res UV y fluorescencia. Todas las solucionesse prepararon con agua grado HPLC. El extracto

se colocó en fase isocrática con buffer defosfatos, con concentración de 30 mM, pH 2.2y en una relación del 90% de buffer y 10% deacetonitrilo, seguido de una disminución de ésteúltimo a 85% y 15% respectivamente en los si-guientes 8 minutos, para volver al estado inicialen los siguientes 3 minutos. Se utilizó un flujode 0.8 ml/min y una longitud de onda de 290 nmen UV para ácido fólico, mientras que las con-diciones para el detector de fluorescencia fue-ron 290 nm de emisión y 356 nm de excitaciónpara dihidrofolato, tetrahidrofolato y 5-metil-tetra-hidrofolato. En el caso de 5-formil-tetrahidrofo-lato se usó una excitación de 360 y 460 nm deemisión, respectivamente. La fase móvil con unpH ácido tiende a tener pobres identificacionespara el 10 formil–tetrahidrofolato, por la conver-sión a 5-10 metenil-tetrahidrofolato y la reduc-ción del dihidrofolato a tetrahidrofolato (DíazDe la Garza et al., 2004; Robinson, 1971).

Resultados y discusiónEn una gran cantidad de reportes científicosse ha tratado de optimizar la preparación de lamuestra y las condiciones cromatográficas parala obtención de una mayor cantidad de folatosde los diferentes materiales bajo estudio; sinembargo, a pesar de todos estos esfuerzos,sólo se ha llegado a tratar de optimizar la canti-dad de muestra a extraer, dependiendo de lacapacidad de detección de los aparatos emplea-dos. Es por ello que al emplear Physalis comomaterial para cuantificar los niveles de folatospresentes se tuvo que trabajar en la adecua-ción del método para garantizar la precisión dela medición, por medio de la elucidación de lacantidad mínima a detectar, llegándose a unaconclusión fundamental respecto a la cantidadmínima de muestra necesaria para lograrreproducibilidad del método y detectar las con-centraciones de las diferentes estructuras re-lacionadas a folatos. Esta situación arrojó quecon un tamaño de muestra de 5 g es suficientepara estar por encima de los límites de detec-ción.

La capacidad de las columnas con FBP semidió con ácido fólico y se obtuvo en promedioun 92% de recuperación de esta vitamina, conuna desviación estándar de 6.2% y un flujo porgravedad entre 0.37-0.42 ml/min. Estos valo-


res se utilizaron como factor de corrección parala cuantificación precisa de los folatos en to-matillo y determinar la aportación de este im-portante complejo vitamínico en la dieta.

Los folatos de la matriz del tomatillo ex-traídos mediante calor tienen unainterconversión del 10-formil-tetrahidrofolato a5-formil-tetra-hidrofolato. Es por eso que enocasiones no se detecta, ya que depende dela actividad y cantidad que tenga en cada ali-mento, o las sustancias que se emplean paraevitar oxidación, como el 2-mercaptoetanol. Eneste estudio se detectó una elevación del con-tenido de ácido fólico como resultado de la oxi-dación del dihidro-folato; además, la importan-cia del uso de la combinación de dosantioxidantes (2% w/v ácido ascórbico y 2mMde 2-mercaptoetanol) da la estabilidad y con-vierte una cantidad de los folatos presentes ensu forma dihidrofolato a tetrahidrofolato, abrien-do la posibilidad de identificar y cuantificar lasdiferentes derivados de folatos y sus formasde estados de oxidación. Lo anterior se llevó acabo a pH de 4.1 para realizar la reducción del5-metil-dihidrofolato a 5-metil-tetrahidrofolato,así como de dihidrofola-to a tetrahidrofolato,lográndose una mayor detección en fluores-cencia (Wilson y Horne, 1984; Gregory et al.,1990; Vahteristo et al., 1996). Estas formas sonde las que se han reportado como de mayoractividad dentro de las plantas y animales (fi-gura 2).

Durante la extracción se tiene que prever

la cantidad de proteína y almidón, ya que in-terfieren en la cuantificación. Asimismo es ne-cesario tener una aproximación de la concen-tración posible de folatos que pueden estar pre-sentes, con el número adecuado de repeticio-nes para optimizar el tiempo de extracción.Para lograr la digestión de las proteínas y al-midones y liberar los folatos unidos a ellos, sedeterminó que los tiempos para cada enzimafueron como sigue: á-amilasa, 6 horas;proteasa, 2 horas; ã-carboxilasa, 4 horas. Conestos tratamientos fue posible evitar la degra-dación térmica de los folatos a pesar de lostiempos tan largos para la digestibilidad.

La cantidad de folatos medidos usando elmétodo trienzimático resultó en una precisiónsuperior al 132% con respecto a la cuantifica-ción de estos compuestos a través de la ac-ción exclusiva de la conjugasa, por lo que sedemuestra que los folatos en tomatillo se en-cuentran retenidos en la matriz celular del teji-do del alimento.

Para la identificación y la cuantificación delos folatos fue necesario determinar la longi-tud de onda apropiada para cada compuesto,ya que no todos pueden ser identificados a lamisma longitud, por ejemplo, la señal de de-tección por fluorescencia para dihidrofolato esmuy baja en comparación con las diferentesformas de tetrahidrohidrofolato.

En los resultados cromatográficos (figuras3 y 4) se tomó la mezcla racémica de cadafolato como un solo compuesto, ya que es muy

Figura 2. Principales derivados activos de folatos y las diferentes rutas metabólicasen las cuales están implicados (Ravanel et al., 2001).


complicado hacer la separación de losisómeros bajo la metodología empleada.

A pesar de la gran dificultad para la detec-ción y cuantificación de estos metabolitos comoresultado del pH propio del alimento y que afec-ta la estabilidad de los mismos, fue posibleobtener una excelente reproducibilidad delmétodo y buenos resultados en la cuantifica-ción total de folatos (1.21 µmol/100g, en base apeso fresco), por lo que se ha podido elucidarque Physalis ixocarpa es una fuente adecuadapara proporcionar cantidades de folatos impor-tantes en la dieta.

En el cuadro 1 se muestran las diferentesformas cuantificadas de folatos en tomatillo,que presenta niveles importantes del metabolito5-metil-tetrahidrofolato, el cual se considera elde mayor significancia biológica. Si asumimosque la ingesta per capita alcanza niveles de 3.5kg/año (SAGARPA, 2001), es necesario intro-ducir campañas para promover su consumo,porque representa una fuente importante defolatos. Hay que recordar todos los problemasasociados con mujeres en edad fértil(Sauiberlich, 1971; Scholl et al., 2000).

El impacto positivo que tiene el tomatilloen la dieta, por desconocimiento, se ha igno-rado, ya que siempre se asocia como produc-to típico de la comida mexicana. Se analizaronsus potenciales basándose en la prevención dedefectos de tubos neurales y anencefalia, prin-cipalmente en embarazos no planeados, me-diante la cuantificación del aporte de folatos pre-sentes en este producto.

El uso de la extracción trienzimática fueefectivo, obteniendo niveles más altos que elempleo de una sola enzima, la conjugasa. En

el método trienzimático se obtuvieron nivelesde folatos hasta de 1.8 veces por encima de laconjugasa, debido principalmente a la interfe-rencia causada por la presencia de polímeros(almidón y proteínas) que atrapan a este tipode compuestos. Sin embargo, su potencial ra-dica en la prevención de defectos del tuboneural.

Para una adecuada detección de folatosen concentración reducida, que es lo que ocu-rre comúnmente en los alimentos, se requiereutilizar métodos de separación e identificacióncon técnicas de alta sensibilidad (Vahteristo etal., 1996), empleando cromatografía de líqui-dos de alta resolución con detección de fluo-rescencia, con límites inferiores que oscilanentre 0.03 a 2.3 pmol/100µL en el punto de in-yección (Gregory et al., 1984). Además de serun método rápido en comparación con el co-múnmente empleado (que se basa en una prue-ba microbiológica), también permite determi-nar las diferentes especies de folatos presen-tes como monoglutamatos y poliglutamatos, asícomo sus estados de oxidación.

Figura 4. Identificación de diferentes especiesderivada de folatos como monoglutamatos con

detector de UV y arreglo de diodos ( ë 290 nm) enPhysalis ixocarpa.

Figura 3. Análisis con detector de fluorescenciapara la identificación de diferentes especies deriva-

das de folatos como monoglutamatos (exitación290, emisión 356) en Physalis ixocarpa.

Cuadro 1. Cantidades de los diferentesestructuras derivadas de los folatos

presentes en tomatillo (Physalis ixocarpa).

Compuesto

Ácido Fólico5 formil-tetrahidrofolatoDihidrofolatoTetrahidrofolato5 metil-tetrahidrofolatoTotal

Cantidad µmol/100 g(media)0.1850.4152———0.09120.52261.2114


La más alta concentración de folatos selogró al tratar las muestras a pH de 4.1, ya queinhibió la actividad de la enzima conjugasaendógena contenida en la matriz del alimentoy por lo tanto afectó la extracción de este tipode compuestos (Gregory et al., 1990). A estepH se optimizó la actividad de la proteasa yamilasa para la extracción completa de losfolatos del tejido del tomatillo. Es probable quealgunos de ellos se encuentren atrapados enproteínas y carbohidratos y, por consiguiente,tienen que ser sometidos a un proceso de di-gestión para su liberación y correcta cuanti-ficación en el alimento.

Al terminar el proceso de extracción de losfolatos se recomienda inmediatamente inyec-tarlos, ya que al ser almacenados a bajas tem-peraturas se reduce su concentración, debidoal deterioro y destrucción por exposición a laluz.

El total de las formas de folatos antes deltratamiento trienzimático es significativamentediferente después del tratamiento trienzimático(Nehmatallah, 2003), o se incrementa la con-centración de compuestos, principalmente deconversión de dihidrofolatos a tetrahidrofolatos,ya sea por conversión como resultado de la tem-peratura, extracción ácida y el uso deantioxidantes (Lucock et.al., 1995). De formasimilar, empleando como fluyente de la colum-na el ácido trifluoroacético y DL-dithiotreithol, sepueden perder derivados del folato como 5-HCO-THF, que tiene una gran inestabilidad apH bajos y puede convertirse parcialmente a5,10 metenil THF (Robinson, 1971).

ConclusionesEste es el primer reporte en la literatura endonde se ha trabajado con tomatillo (husktomato), que resulta ser una excelente fuentede folatos, por lo que su consumo o introduc-ción en la dieta, sobre todo en mujeres con po-tencial de gestación, representa un alimentoideal para evitar o reducir el índice de defectosdel tubo neural y anencefalias en recién naci-dos. Se ha establecido una metodología parala identificación y cuantificación de los diferen-tes folatos presentes en Physalis ixocarpaempleando una modificación en la metodolo-gía por HPLC, basada en un detector de fluo-

rescencia que ofrece rapidez y precisión, su-perando lo reportado en donde se emplean en-sayos microbiológicos, que muchas veces noson tan sensibles en la cuantificación por sercantidades muy pequeñas de folatos en losalimentos. Aunado a lo anterior, se cuenta conuna excelente técnica de extracción de folatosde la matriz por el método trienzimático y laafinidad de folatos en columnas con proteínasinmovilizadas para la purificación de la mues-tra.

Durante la extracción se dio una variaciónde los resultados con una desviación estándarde 6.2%, debido a que se compraron tomatillosen diferentes tiendas y diferentes fechas (entrefebrero y abril), que pueden cambiar en su com-posición debido a factores bióticos y abióticosteniendo variaciones en la cantidad de folatos obien expresándose más algunos folatos debidoa su actividad interna en el tomatillo.

Los niveles de folatos encontrados enPhysalis permiten elucidar su importancia comoalimento constitutivo en una dieta que ayude apreparar balanceos nutrimentales entre los ti-pos de alimentos que debemos consumir, prin-cipalmente para mujeres en edad reproductiva.

Literatura citadaBERRY, R.J., Z. Li, D. Erickson, S. Li, C.A. Moore, H. Wang,

J. Mulinare, P. Zhao, L.C. Wong, J. Gindler, S. Hong, A.Correa. 1999. Prevention of neural-tube defects withfolic acid in China. N. Engl. J. Med. 341:1485-1490.

B IRKTOFT , J.J., K. Bredman. 1994. Glutamylendopeptidases. Methods in Enzymology 244: 114-126.

BOUSHEY, C.J., S.A.A. Beresford, G.S. Omenn and A.G.Motulsky. 1995. A quantitative assessment of plasmahomocysteine as a risk factor for vascular disease.Probable benefits of increasing folic acid intakes. J.Am. Med. Ass. 274: 049-1057.

CERNA, L. and J. Kas. 1983. New conception of folacinassay in starch or glycogen containing food samples.Nahrung 10:957-964.

CZEIZEL, A. and I. Dudas. 1992. Prevention of the firstoccurrence of neural tube defects by periconceptionalvitamin supplementation. N. Engl. J. Med. 327:1832-1835.

DÍAZ DE LA GARZA, R., E.P. Quinlivan, M.J. Klaus, J.C. Basset, J.F. III Gregory and A.D. Hanson. 2004. Folatebiofortification in tomatoes by engineering the pteridinebranch of folate synthesis. Proc. Nat. Ac. Sci. 101(38):13720-13725.

FOHR, I., R. Prinz-Langenohl, A. Bronstrup, A. Bohlmann,H. Nau, H. Berthold and K. Pietrzik. 2002. 5,10-Methylenetetrahydrofolate reductase genotype deter-


reactions. Methods Enzymol. 18B:716-725.SAUBERLICH, H.E. 1995. Folate status of U. S. population

groups. In: Folate in Health and Disease. Lynn Bailey(ed.). Marcel Dekker, NY. pp 171-194.

SCHOLL, T.O. and W. G. Johnson. 2000. Folic Acid: influenceon the outcome of pregnancy. Am. J. Clin. Nut. 71:1295-1303.

SELHUB, J., O. Ahmad and I.H. Rosenberg. 1980. Preparationand use of affinity columns with bovine milk folate-bindingprotein covalently linked to Sepharose 4B. MethodsEnzymol. 66:686-690.

TAMURA, T., Y. Mizuno, K.E. Johnson and R.A. Jacob. 1997.Food folate assay with protease a-amylase and folateconjugase treatments. J. Agr. Food Chem. 45:135-139.

TAMURA, T. 1998. Determination of food folate. Nutr. Biochem.9: 285-293.

VAN OART, F., A. Boonstre, I. Brower, R. Clarke, C. West, M.Katan and P. Verhoef. 2003. Folic acid and reduction ofplasma homocysteine concentration in older adults, adose response study. Am. J. Clin. Nut. 77 (5):1318-1323.

VAHTERISTO, L. T., V. Ollilainen, E. K. Pekka and P. Varo. 1996.Improvements in the analysis of reduced folatemonoglutamates and folic acid in food by high-perfor-mance liquid chromatography. J. Agr. Food Chem.44:477–482.

WAGNER, C. 1995. Biochemical role of folate in cellularmetabolism. In: Folate in health and disease. Lynn Bailey(ed.). Marcel Dekker, NY 23-42.

Recibido: Marzo 24, 2006/Aceptado: Agosto 19, 2006

mines the plasma homocysteine-lowering effect ofsupplementation with 5-methyltetrahydrofolate or folicacid in healthy young woman. Am. J. Clin. Nut. 75(2):275-282.

GIOVANNUCCI, E., E.B. Rimm, A. Ascherio, M.J. Stampfer,G.A. Colditz and W.C. Willett. 1995. Alcohol, low-methionine-lowfolate diets, and risk of colon cancerin men. J. Nat. Cancer Inst. 87:265-273.

GREGORY, J.F., R. Engelhardt, S.D. Bhandari, D.B. Sartainand S.K. Gustafson.1990. Adequacy of extractiontechniques for determination of folate in foods andother biological materials. J. Food Comp. An. 3:134-144.

GREGORY, J.F., D.B. Sartain and B.P.F. Day. 1984.Fluorometric determination of folacin in biologicalmaterials using higher performancechromatography. J. Nutrition. 14:341–353.

GREGORY, J.F. and J.P. Toth. 1988. Chemical synthesisof deuterated folate monoglutamate and in vivoassessment of urinary excretion of deuterated folatesin man. Anal. Biochem. 170:94-104.

JASTREBOVA, J., C. Witthoft, A. Grahn, U. Svensson and M.Jägerstad. 2003. HPLC determination of folates inraw and processed beetroots. Food Chem. 80(4):579-588.

LUCOCK, M.D., M. Green, I. Priestnall, M. Daskalakis, I.Levene and R. Hartley. 1995. Optimization ofchromatographic conditions for the determination offolates in foods and biological tissues for nutritionaland clinical work. Food Chem. 53:329-338.

MARTIN, J.I., W.O. Jr. Landen, A. G. Soliman and R. R.Eitenmiller. 1990. Application of a tri-enzymeextraction for total folate determination in foods. J.Ass. Off. Anal. Chem. 73:805-808.

MASON, J. 1995. Folate status: effects oncarcinogenesis. In: Folate in Health and Disease.Lynn Bailey (ed.). Marcel Dekker, New York, N.Y. pp.329-361.

NEHMATALLAH, N.J. 2003. Capillary electrophoresis andhigh performance liquid choromatographydetermination of polyglutamyl folates in citrusproducts. In: IFT Annual Meeting. Chicago.

PEÑA, L.A. 2001. Situación actual y perspectivas de laproducción y mejoramiento genético de tomate decáscara (Physalis ixocarpa Brot.) en México. Memo-ria del XXIV Congreso Nacional de Fitogenética. 4-9 de octubre. UAAN.

RADER, J.I., C.M. Weaver and G. Angyal. 1998. Use of amicro-biological assay with tri-enzyme extraction formeasurement of pre-fortification levels of folates inenriched cereal-grain products. Food Chem.62(4):451-465.

RAVANEL, S., H. Cherest, S. Jabrin, D. Grunwald, Y. Surdin-Kerjan, R. Douce and F. Rébeillé. 2001.Tetrahydrofolate biosynthesis in plants: Molecularand functional characterization of dihydrofolatesynthetase and three isoforms of folylpolyglutamatesynthetase in Arabidopsis thaliana. Proc. Nat. Ac. Sci.98(26):15360-15365.

ROBINSON, D.R. 1971. The nonenzymatic hydrolysis ofN5 N10-methenyltetrahydrofolic acid and related


physalis ixocarpa) por cromatografía de líquidos de alta...

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