Pharmacogenetics &

Pharmacogenomics:New tools for individualized drug therapy

R.Krishnamoorthy

INSERM

If it were not for the

genetic variations among individuals

environmental differences they

encounter

Life style habits they practice

Medical practice will be much more straight forward

Almost identical but

small difference matters

The remaining 0.1 % matters for phenotype

What does mean this 0.1% difference ?

This translates into 3 million separate “spelling” differences (polymorphisms) in our genome book

Some/many of these differences predict inter individual variations

a) in disease susceptibility

b) in Clinical expression

c) in drug response

Why do Why do peoplepeople respond differently to respond differently to drugs?drugs?

Drug/drug/environment/genotype interactions

Drug receptor genotype

Drug transporter genotype

Drug metabolism genotype

Because of variability in

Present Scenario in Drug therapy

• Schizophrenia: 30 % do not respond

• Hypertension: Only 27 % adequately controlled

• ADR & under-dosage: 100 thousand patients/yr die in USA.

Cost: $ 100 billion per year

• Optimal therapy for major illness: Still elusive

• Cost of Drug Development : $ 500 – 700 million for

each drug .. 80% fails in clinical trial

Xénobiotiques:

substances étrangères à l’organisme de faible P.M.

- Médicaments (pharmacologie, toxicologie)

- Polluants (environnement)

- Aliments (nutrition)

PHARMACOGENETICS

Is the study of genetic variation underlying differentialresponse to drugs/xenobiotics

Hypothesis-driven plausible candidate gene approach

Variability may concern :

the behaviour (Pharmacokinetics) of the drug

the action (Pharmacodynamics) of the drug

both

....

0

20

40

60

80

100

120

10

Fast metabolizers

ultra-fastmetabolizers

slowmetabolizers

Log Debrisoquine / 4OH debrisoquine: RM0.1 1 100

Bertilsson and Dahl 1996

12.6Nu

mb

ero

f i

nd

ivid

ual

s

( )n

What is Pharmacogenomics?

Study of all genes in the genome that

may determine drug response.

It takes into account of genes controlling

drug metabolising enzymes, transporters,

receptors, numerous proteins, entire

signaling network etc.

Pharmacogénétique :

• connaissance du génome• développement des méthodes de génotypage à haut débit• analyse globale des transcriptomes

Pharmacogénomique

• dosage et molécule adaptés au patient

• développement de nouveaux médicaments

Variabilité interindividuelle du métabolisme des médicaments et des xénobiotiques

Prescription personnalisée du médicament

Lariboisière 99

Ultimate Goal of Pharmacogenomics ?

Giving the Right DrugAt Right Dose

To the Right Patient

At the Right Time

Patient specific selection of medication and their dosage

PHASE I

Oxydation

Réduction

Hydrolyse

PHASE II

Conjugaison

Métabolisme des médicaments et des xénobiotiques

RH RHO ROX

O2 XOH

RH : Substrat hydrophobe ROX : produits hydrophiles éliminésdans la bile ou les urines

Lariboisière 99

Lariboisière 99

ENZYME DE LA PHASE I

Co-substrat : H2OEpoxyde hydrolasesCarboxy-ester hydrolasesAmidasesCholinestérases*Arylésterases*

Co-substrats : H2AzoréductasesNitroréductasesN-oxydoréductases

Co-substrats : O2Monoamine-oxydasesAldéhydes déshydrogénases*Flavoprotéines monooxygénases*S-oxydases*P450 monooxygénases*

ENZYME DE LA PHASE II

Co-substrat : Acide glucoroniqueUDP-Glucoronosidetransferases*

Co-substrat : sulfateSulfotransférases*

Co-substrats : Acides aéminésN-acétyltransférases

Co-substrat : CH3CO-N-acétyltransférases*

Co-substrat : CH3-O-méthyltransférasesN- méthyltransférases*S- méthyltransférases*

Co-substrat :GSTS-Glutathiontransférases*

PHASE I PHASE II(fonctionnalisation) (conjugaison)

Substrathydrophobe

RH

ROHSubstrat

hydrophileROX

Polymorphisme

FAMILLEShomologie < 40%

CYP2

SOUS FAMILLES45%-60% homologie

CYP3A3CYP3A4CYP3A5

StéroïdesRifampicine

CYP1A1CYP1A2

A. B. C. D. E.

Hydrocarburesaromatiques

CYP2C8CYP2C9CYP2C19 Méphénytoïne

CYP2D6 Débrisoquine

EthanolPhénobarbital

Superfamille des cytochromes P450(Nebert et al, 1991)

Inducteur

Lariboisière 99

Phase - I enzymes known to show polymorphism

• CYP1A6: Nicotine

• CYP2C9 : Phenytoin, warfarin, NSAIDs etc

• CYP2C19: Omeprazole, proguanil, diazepam etc

• CYP2D6 : More than 60 drugs

• CYP2E1 : Ethanol

• DPD : Flurouracil

Phase II enzymes known to show polymorphism

• NAT2 : Isoniazid, hydralazine,

• GST : D-Penicillamine

• TPMT : Azathioprine, 6-MP

• Pseudocholinesterase: Succinyl choline

• UGT1A1 : Irinotecan

Relative abundance of P450 isoenzymes in human liver

CYP2E11%

CYP3A51%

CYP1A25%

CYP2C19%

CYP2D624%

Relative contribution of P450 isoenzymes to drug metabolism

Les médicaments utilisant une même voie métaboliquesont nombreux et divers dans leur nature

Exemple : Voie du CYP2D6

- Médicaments CardiovasculairesAntiarythmiques, β - Bloquants, Antihypertenseurs

- Médicaments PsychotropesNeuroleptiques, Antidépresseurs tricycliques Inhibiteurs de la MAO

- Dérivés de la morphineCodéine, Dextrométhorphane

- AutresPhenformine, Perhrexiline, Méthoxyamphétamine

Lariboisière 99

Pharmacogénétique : conséquences

Médicament = drogue ou prodrogue

métabolisme in vivodrogue métabolite inactif

enzyme(s) de transformation

Chez un sujet déficitaire en enzyme de transformation (métaboliseur lent), la drogue s'accumule

risque d'accident toxique

Lariboisière 99

Potential consequences of polymorphic drug metabolism

• Extended pharmacological effect • Adverse drug reactions • Lack of prodrug activation • Drug toxicity • Increased effective dose • Metabolism by alternative, deleterious pathways • Exacerbated drug-drug interactions

What is Genetic Polymorphism?

A genetic polymorphism is any mutant or variant allele that occurs with a frequency of more than 1% in the normal population

Molecular mechanisms that can alter drug metabolism

Polymorphic effects on drug action

time

Dru

g co

nce

ntr

atio

n

0

100

100

10030

65

99

24hr

wt/wt

wt/mut

mut/mut

Polymorphism in drug metabolising enzyme results in increased circulating drug concentrations in heterozygotes and homozygotes

Drug metabolism genotypes

From Evans and Relling, Science 286 (1999) 487

POLYMORPHISM

RECEPTORS:

For ACE : Captopril, enalapril

β2 receptor: salbutamol

5-HT2A : Clozapine

OTHERS:

P-glycoprotein – drug transporter

APOE ε4 – tacrine

Ethnic Differences in Poor Metabolizers of CYP2 enzymes

2.1

15 - 23

0 – 1

Orientals (%)

8 - 10

2.5 - 6

5 - 10

CYP2C9

CYP2C19

CYP2D6

Cauacasians (%)Enzyme

CYP2D6 – Implications for Poor metabolisers

Decreased elimination of parent compound

Beta blockers: metoprolol, timololTricylic antidepressants: nortriptyline, clomipramine

Decreased prodrug activation: Codeine, encainide

Decreased elimination of active metabolite: imipramine

Decreased elimination of parent compound &

active metabolite: Amitriptyline & nortriptyline

CYP2D6 Vs Starting dose of nortriptyline

Normal CYP2D6 : 150 mg/day

Mutant CYP2D6 : 10-20 mg/day

Why diazepam metabolism is slower in Asians compared to Caucasians?

Because Asians have high frequency of mutant alleles CYP2C19

84 hoursCYP2C19 *2/*2PM

20 hoursCYP2C19 *1/*1EM

Diazepam t1/2AlleleGenotype

CYP2C19 Vs Treatment of H.Pylori

Genotype Allele Cure rate

Wild type CYP2C19 *1/*1 29 %

Htz Mutant CYP2C19 *1/*2 60 %

Hmz Mutant CYP2C19 *2/*2 100 %

Due to higher concentration of omeprazole

Omeprazole 20 mg/day and amoxicillin 2gm/day

CYP2C9 Vs Phenytoin maintenance dose

Genotype Mean dose (mg/d)

CYP2C9 *1/*1 314 mg/d

CYP2C9 *1/*2 193 mg/d

CYP2C9 *2/*3 150 mg/d

(Source: Pharmacogenetics, 2001, 11, 287-291)

Quelques exemples actuels d'application

• Polymorphisme des NAT et traitement par l'isoniazide

• Polymorphisme de la TPMT et traitement des leucémies de l'enfant par la 6-mercaptopurine

• Megaprescription d'antidépresseurs chez les métaboliseurs ultra rapides CYP2D6

• Polymorphisme des apolipotrotéines E et traitement de la maladie d'Alzheimer

• Facteur V Leiden et pilule contraceptive

Lariboisière 99

THIOPURINE METHYL-TRANSFERASE (TPMT) :METABOLISME DE L’AZATHIOPRINE

AZATHIOPRINE

6-MERCAPTOPURINETPMT

HGPRT XO

6-MMP

6-THIOGUANINES

ACIDE THIOURIQUE

ACTIFSTOXIQUES

ACTIVITE TPMT : DISTRIBUTION TRIMODALE

5 10 15 20

Activité TPMT, Unités/ml GR

Nb

d’in

divi

dus,

%

M/M

M/Wt

Wt/Wt

Public health issue

Antivitamin K treatments

17 000 hospitalisations / year

First cause of

iatrogenic drug accident

400 000 à 580 000 treated patients

3000 death / year

Observance du traitement

Alimentation (vit. K)

Situation physiopathologique

Interactions médicamenteuses

Facteurs génétiques

Risque

hémorragique

VARIABILITE DANS LA REPONSE

Risque

thrombotique

Nbde

patients

Doses de warfarine (mg/semaine)

HYPERSENSIBILITE RESISTANCE

CONCLUSION

CYP2C9*3 + VKORC1 G-1639A = 50% de la variabilité

Variabilité dans la réponse pharmacologique de l’acénocoumarol

CYP2C9

VKORC1

POIDS

INCONNUE

4%

14%

37%

Gene UGT1A1

Irinotecan (CPT-11):Toxicity Prediction

Abacavir

Anti-HI, analogue non nucléosidique (Ziagen®)5% réaction d ’hypersensibilité quelques rares cas---> mort200 individus suivis

- HLA B5701, C4A6, -DR7, -DR3 67 % des intolérants ont cet haplotype0% des tolérants ont cet haplotypeOR 117

- HLA B570178 % des intolérants2,4 % des tolérants

Valeur prédictive positive 100% et négative 97%

Détermination haplotype avant traitement devrait permettre de réduire de 50%les réactions d’hypersensibilité.

Mellal et coll. Lancet 2002, Hetherington et coll. Lancet 2002, Martin 2004

Current methods for genetic testing

Phenotyping: requires use of a probe drug

Genotyping: DNA based assay

PCR / Restriction Fragment Length Polymorphism

Automated fluorescence based allele discrimination (e.g. Taqman assay)

DNA Chips: High throughput assays

PhenotypingAdvantages:

It reveals• Drug-drug interactions

• Defects in the overall process of drug metabolism

Disadvantages:Complicated protocols of testing

Risks of adverse drug reactions

Interaction of co-administered drugs

Confounding effects of disease itself

– Small amount of blood or tissue– Not affected by underlying disease– Independent of co-administered therapy– Specific and sensitive – Results within 4 -72 hours (rapid intervention).

Genotyping Advantages

Pre-requisite:

Phenotype and Genotype correlation needs to be established

Genotyping arrays

Lipshutz et al, Nature Genetics 1999, 21:20-24

Allele A

Allele B

MismatchPrefect matchMismatchPrefect match

GenotypeA/A B/B A/B

Tokyo 99

1

2

3

4

A

B

C

D

1

2

3

4

A

B

D

C

1

3

4

A

B

C

D

2

Drugmetabolismpathway

Diseasepathway

Patient A Patient B Patient C

Responder Non responder Non responder

Drugmetabolismpathway is deficient Disease

pathwayisdifferent

Tokyo 99

Du fait de la diversité génétique ......le métabolisme des médicaments varie d'un

individu à l'autredéfinition individuelle de la posologie

Parce que la base physiopathologique de la plupart des maladies implique différentes étapes ...

...l'étape affectée chez deux individus présentant les mêmes symptômes peut être différente

choix personnalisé du médicament

Vers une médecine personnalisée

Lariboisière 99

L'analyse des variations du transcriptome

avec et sans drogue doit permettre

- de valider la cible supposée- d'identifier la "signature" transcriptionnelle- d'identifier des voies accessoires- de cribler de nouvelles molécules produisant

la même "signature"

entre un tissu normal et un tissu pathologique

et donc participer - à la découverte de nouvelles cibles - à l'identification et la validation de nouvelles drogues

Perspectives • Génomique structurale : génotypage à haut débit

- profil pharmacogénétique individuel- typage élargi :

polymorphisme des enzymes du métabolismepolymorphisme de leur inductionpolymorphisme de l'absorption, transport, cible...drogue spécifique de populations

• Génomique fonctionnelle : analyse des transcriptomes- validation des nouvelles drogues- identification des réseaux fonctionnels et voies alternes- identification de nouvelles cibles

Homme et micro-organismesLariboisière 99

Patient requires Treatment

Examination by the Physician

Genomic testing Traditional investigations

Bio-informatics system

Decision making by Physician, assisted by an Expert System (interactive interpretation)

Prescribes individualized drug treatment

Ethical considerations in pharmacogenetics and pharmacogenomics

• ethnicity

• selection of patients for clinical trial

• families versus populations

• privacy & confidentiality

• data storage and retrieval

• discrimination

• reduction in potential drug market & economic considerations

Un espoir...... et des questions

Quelle sera la puissance exacte des marqueurs de génotypage par rapport aux facteurs nutritionnels et d'environnement, à l'âge et à l'état général du sujet,

paramètres qui participent tous à la variabilité d'efficacité des traitements ?

Lariboisière 99

Contraintes et limites du phénotypage• prise du médicament• influence de l'état hépatique, rénal, nutritionnel...• interférence avec d'autres médicaments• difficulté à distinguer les hétérozygotes• difficulté à étudier une enzyme hépatique

Lariboisière 99

Avantages du génotypage• méthode non invasive• détection directe de la mutation et de sa nature exacte• rapide (PCR)• à l'abris des interférences

Pharmacogénétique : défauts moléculaires

• Les mêmes que dans les maladies génétiques : mutations ponctuelles, délétions (insertions), reéarragements géniques

• polymorphisme de l'induction ?

Mais

• dans une maladie génétique, la mutation s'exprime en fonction de son mode spécifique de transmission et produit un phénotype anormal

• en pharmacogénétique, l'expression de la mutation est conditionnelle à l'étatde base, le phénotype est normal et un phénotype anormal n'apparaît qu'en présence d'un agent extérieur xénobiotique - médicament (ex. déficit en G6PD)

génétique environnementLariboisière 99

Réponse

Dose

Importance particulière lorsque :- la pente de la courbe dose-réponse est forte- la fenêtre thérapeutique est étroite

Lariboisière 99

Polymorphisms

Single nucleotide polymorphisms

……..G G T A A C T T G …...

……..G G C A A C T T G …...

Incidence 1 per 300 - 600bp3 billion base pairs in a haploid cell

Estimated cost of DNA testing in USA

Cost of DNA testing may be offset by:A reduction in costs associated with toxic episodes or therapeutic failure and subsequent intervention; Insurance claims

• Simple PCR for 1 mutation: $ 10

• For 50 mutations: $ 150

• By Chip for 20 mutations: $ 70

• By Chip for 100 mutations: $ 250

PHARMACOGENETICS

Is the study of genetic variation underlying differentialresponse to drugs/xenobiotics

Hypothesis-driven plausible candidate gene approach

Variability may concern :

the behaviour (Pharmacokinetics) of the drug

the action (Pharmacodynamics) of the drug

both

What is Pharmacogenomics?

Study of all genes in the genome that

may determine drug response.

It takes into account of genes controlling

drug metabolising enzymes, transporters,

receptors, numerous proteins, entire

signaling network etc.

PHARMACOGENOMICS(structural)

Involves large – scale systematicgenomics (genome-wide DNAgenotyping) to discover drugresponse markers

Overall search for drug pathways(drug targets, receptors, metabolism)

Prediction of drug effects

LINKAGE STUDIES

Genotyping in families withMultiallelique microsatellite markers

Correlate inheritance of a particularChromosomal region with inheritance ofDisease.

A large linkage study (exaggerated situation)- 1000 family members- 500 microsatellite markers- 500 000 genotypes

LINKAGE STUDIES

Are not practical for pharmacogenomicstudies

Drug response data (phenotype) canrarely be obtained from multiplemembers of a family

Association studies ofunrelated individuals in a

given population is apractical choice forPharmacogenomics.

ASSOCIATION STUDIES

Genotyping of unrelated individualsof a given population

Correlate the presence of a chromosomal region and a trait(phenotype: disease /drug response)

A large association study:- 1000 unrelated individuals- 100 000 markers (which?)- 100 million genotypes

SINGLE NUCLEOTIDEPOLYMORPHISMS (SNPs)

Simple base-pair substitutions withinand outside genes

Less polymorphic than microsatellites(commonly biallelic)

Occur much more frequently(approximately every 300bp)

Amenable to large scale automatedgenotyping

Genome-wideLinkage studies

Shared chromosomalregions are long (tens ofmillions of bases) withinfamily members

Few hundreds of evenlyspaced markers aresufficient to locatea particular region

Genome-wideAssociation studies

Shared chromosomalregions are small (lessthan 100kb) amongunrelated individuals ofan open population (distantcommon ancestry)

More than 100 000markers are required(dense map)

MULTIFACTORIALDISORDERS

(eg: cancer, atherosclerosis,Neurodegenerative disorders)

Are much more common thanmonogenic disorders

Each represent a collection of differinggenetic conditions with a similar clinicalphenotype

Hence distinct etiologies

Hence distinct responses to therapies

Pharmacogenomics

differential expression analysis

(Functional)

Cell Cell

drug

mRNA mRNA

cDNA cDNA

ValidateValidate by quantitative by quantitative PCRPCR

Relative expression Relative expression levelslevels

Fluorescent Fluorescent visualizationvisualization

FunctionalFunctional genomicsgenomics

OncogenomicsOncogenomics

DifferentialDifferential genegene structure (structural structure (structural genomicsgenomics))

DifferentialDifferential genegene functionfunction ((functionalfunctional genomicsgenomics))