Linköping University Medical Dissertations No. 1343     

Periodontitis and coronary artery disease 

Studies on the association between periodontitis and coronary artery disease  

              Carin Starkhammar Johansson 

       Division of Cardiovascular Medicine 

Department of Medical and Health Sciences Linköping University, Sweden 

 

   

Centre for Oral Rehabilitation Public Dental Health Care 

County Council of Östergötland, Sweden  

  

 Linköping 2013 

 

   

 

                         © Carin Starkhammar Johansson, 2013   Cover picture/illustration: Greta Johansson   Published article was reprinted with the permission of the copyright holder.  Printed in Sweden by LiU‐Tryck, Linköping, Sweden, 2013.    ISBN 987‐91‐7519‐748‐7 ISSN 0345‐0082  

 

       

With love to Pelle, Greta and Olle                   

”Utan tvivel är man inte klok.”         Tage Danielsson, 1928‐1985 

   

Contents 

CONTENTS

ABSTRACT .................................................................................................................. 1 

POPULÄRVETENSKAPLIG SAMMANFATTNING......................................... 3 

PREFACE ...................................................................................................................... 5 

ABBREVIATIONS AND DEFINITIONS .............................................................. 6 

INTRODUCTION....................................................................................................... 9 

Historical perspective.......................................................................................... 9 Periodontitis........................................................................................................ 11 

Complexity of oral microflora..................................................................... 12 Host response in periodontitis.................................................................... 14 

Atherosclerosis ................................................................................................... 15 Normal histology of the arterial ................................................................. 15 Atherosclerosis,  a consequence of inflammation and immune response ......................... 17 Wound healing process................................................................................ 19 

Periodontitis‐CAD association........................................................................ 21 Possible explanatory factors for the periodontitis‐CAD association .... 32 Periodontal treatment effect on systemic inflammation......................... 35 Shared risk factors – confounders .............................................................. 36 Rationale for the studies .............................................................................. 40 

OBJECTIVES ............................................................................................................. 41 

HYPOTHESES........................................................................................................... 42 

MATERIAL ................................................................................................................ 43 

Contents 

 

METHODS................................................................................................................. 45 

RESULTS .................................................................................................................... 50 

DISCUSSION............................................................................................................ 58 

CONCLUSIONS ....................................................................................................... 66 

ACKNOWLEDGEMENTS...................................................................................... 67 

REFERENCES ............................................................................................................ 69 

 

Abstract 

ABSTRACT

Periodontitis  and  coronary  artery  disease  (CAD)  are  highly  prevalent  in Sweden’s  population;  both  diseases  have  complicated  pathogeneses  and clinical  manifestations  due  to  immune‐system  triggered  inflammation. Research  in  recent  years  reported  that  inflammation  is  a  significant  active participant  in  many  chronic  diseases.  The  literature  described  a  CAD‐periodontitis  association,  but  underlying  mechanisms  are  not  fully understood.  It  is  important  to  acquire  knowledge  about  how  periodontitis might influence CAD, which is one of the major causes of illness and death in western countries. Because periodontitis can be treated, this knowledge, when complemented  with  more  knowledge  about  the  CAD‐periodontitis association, could lead to CAD prevention.   The overall aim of  studies  reported  in  this  thesis were  to  investigate  the CAD‐periodontitis  association,  and  specifically,  to:  (i)  compare  periodontal conditions  in patients with CAD and  subjects without a history of CAD;  (ii) study whether or not periodontal status  influences outcomes  in known CAD over an 8‐year period; (iii) study whether or not concentrations and biological activity of hepatocyte growth factor (HGF) in serum from patients with severe CAD  are  different    –  depending  on  whether  or  not  the  subjects    had periodontitis;  and  (iv)  study  concentrations  and  biological  activity  of hepatocyte  growth  factor  in  serum,  saliva,  and  gingival  crevicular  fluid  in healthy subjects with or without periodontitis. Here is a brief summary:   In  study  I,  161  patients  with  CAD  and  162  controls  were  compared regarding  periodontal  disease  prevalence  and  severity.  CAD  patients  had significant  coronary  stenosis  and  underwent  percutaneous  coronary intervention (PCI) or coronary artery by‐pass grafts (CABG). Healthy controls were  recruited  from  Sweden’s population database. Twenty‐five per  cent of the CAD patients had severe periodontitis, compared to 8% of the controls. In a multiple logistic regression analysis (controlled for age and smoking), severe periodontitis indicated an odds ratio of 5.74 (2.07–15.90) for CAD.  

Study II: Periodontal status was re‐examined in 126 CAD patients and 121 controls  from  the  initial  sample  after  8  years. Periodontal  status  at  baseline was analysed and related  to CAD endpoints  (i.e., myocardial  infarction, new PCI or CABG or death due to CAD) recorded from patients’ medical records and  from  the death  index maintained  by  the National Board  of Health  and Welfare. The difference  in periodontitis prevalence and severity between  the 

  1

Abstract 

 

two groups remained unchanged during the 8‐year follow up. No significant differences were found regarding CAD endpoints during follow‐up in relation to baseline periodontal status in the CAD‐patient group.  

In  study  III,  higher HGF  serum  concentrations  (p<0.001) were  found  in CAD  patients,  compared  to  healthy  blood  donors,  which  reflects  chronic inflammation.  In  CAD  patients  without  periodontitis,  HGF  concentrations increased  significantly  24  hours  after  PCI  –  in  parallel with  increased HGF biological activity. In CAD patients with periodontitis, only small fluctuations were  seen  in  HGF  values,  i.e.,  concentration  and  biological  activity.  HGF biological  activity was  temporarily  elevated  after  PCI  but  only  in  patients without  periodontitis.  Thus  chronic  inflammation  related  to  periodontitis might reduce HGF biological activity.   

In study IV, HGF concentration and biological activity in saliva, in gingival crevicular  fluid  (GCF),  and  serum  were  compared  between  30  generally healthy  subjects with  severe untreated periodontitis  and  30 healthy  subjects without  periodontitis.  Compared  to  periodontally  healthy  controls, periodontal  patients  showed  higher  HGF  concentrations  in  saliva  p<0.001, gingival  crevicular  fluid  p<0.0001,  and  in  serum  p<0.001.  HGF  biological activity  (measured as  the binding affinity  to  its HSPG and c‐MET  receptors) was significantly reduced  in saliva  (p<0.0001) and GCF samples (p<0.0001  for HSPG and p<0.01 for c‐MET) from periodontitis patients. The only significant difference in serum samples was an increases in c‐MET binding three minutes after subgingival debridement  in periodontitis patients  (p<0.05), which might reflect that patients had active bursts of periodontitis. 

In conclusion, CAD patients more often showed severe periodontitis but there were no differences  in CAD endpoints during  the eight‐year  follow‐up in relation to baseline periodontal status. Periodontitis seems to influence HGF concentration and biological activity  in CAD patients, but  studies on  factors that  cause  lower  HGF  biological  activity  are  necessary  –  to  find  out  if periodontal  treatment  influences  HGF  biological  activity.  Healthy periodontitis patients had higher HGF concentrations locally and systemically, but biological activity was reduced. This might indicate that periodontitis can influence wound healing and tissue repair in other body parts. 

Populärvetenskaplig sammanfattning 

POPULÄRVETENSKAPLIG SAMMANFATTNING

Parodontit  (tandlossningssjukdom)  och  kranskärlssjukdom  är  vanligt förekommande  i  befolkningen.  Båda  sjukdomarna  har  ett  komplicerat sjukdomsförlopp med bakgrund  i  inflammation. Kranskärlssjukdom är en av de dominerande orsakerna  till  för  tidig död. Ett  samband mellan parodontit och  kranskärlssjukdom  har  visats  men  man  känner  bara  delvis  till  de bakomliggande  mekanismerna.  Det  är  viktigt  att  öka  kunskapen  om  hur parodontit skulle kunna påverka kranskärlssjukdom. Eftersom parodontit går att  behandla,  skulle  denna  kunskap  kunna  ha  betydelse  för  prevention  av kranskärlssjukdom.  

Målet med denna avhandling var att jämföra parodontala förhållanden hos patienter med kranskärlssjukdom med friska individer, samt att studera påverkan av parodontit på kranskärlssjukdom under längre tid. Dessutom studerades koncentration och biologisk aktivitet av ett protein viktigt för sårläkning och vävnadsreparation, hepatocyte growth factor (HGF), som har föreslagits som markör för både parodontit och kranskärlssjukdom.  

Avhandlingen baseras på fyra studier.  I studie I jämfördes förekomst och grad av parodontit hos 161 kranskärlssjuka patienter med  162 matchade kontrollindivider utan kranskärlssjukdom. Alla patienter  med  kranskärlssjukdom  hade  genomgått  kranskärlsröntgen  som visade  omfattande  förträngningar  i  kranskärlen  vilka  behandlades  med ballongutvidgning  eller  by‐pass  operation.  25  %  av  patienterna  hade  grav parodontit  jämfört med  8 %  procent  av  kontroll  individerna  vilket  var  en statistiskt  säkerställd  skillnad.  Studie  II:  Efter  8  år  undersöktes  ånyo  126 kranskärlssjuka  patienter  och  121  friska  kontroll  individer  från  den  första studien. Kranskärlssjuka patienter som drabbades av nya hjärtkomplikationer (hjärtinfarkt, behov av ny ballongutvidgning eller by‐pass operation eller död till  följd av kranskärlssjukdom)  identifierades   genom patienternas  journaler från  hjärtkliniken  samt  Socialstyrelsens  dödregister.    Inga  signifikanta korrelationer noterades mellan parodontit vid ursprungs undersökningen och incidensen  av nya hjärtkomplikationer.  I hela den ursprungliga gruppen på 323  individer såg vi en  tendens  till  fler hjärthändelser hos  individer som vid första undersökningen hade uppvisat grav parodontit, men denna tendens var inte statistiskt säkerställd. 

  3

Populärvetenskaplig sammanfattning 

 

Studie III visade statistiskt säkerställd högre koncentration av HGF i serum hos  36  patienter med  kranskärlssjukdom  jämfört med  56  friska  blodgivare. Hos kranskärlssjuka patienter utan parodontit ökade koncentrationen av HGF 24 timmar efter ballongutvidgning parallellt med att den biologiska aktiviteten av HGF ökade. Hos kranskärlssjuka patienter med parodontit kunde vi endast se mindre förändringar. Detta kan tyda på att kronisk inflammation i form av parodontit försämrar den biologiska aktiviteten av HGF.  

I studie IV jämfördes koncentration av HGF i saliv, gingival vätska (från tandköttsfickor) och serum hos 30 friska individer med grav parodontit och 30 friska personer utan parodontit. Parodontitpatienterna hade statistiskt säkerställd högre koncentrationer av HGF i saliv, gingival vätska och serum. Hos patienter med parodontit hade HGF statistiskt säkerställd lägre biologisk aktivitet i saliv, i vätska från tandköttsfickor och i serum efter depuration (rengöring av tandköttsfickor).  

Sammanfattningsvis: Patienter med kranskälssjukdom hade oftare allvarligare parodontal sjukdom men 8 års uppföljning kunde inte påvisa någon ökad förekomst av hjärtkomplikationer (hjärtinfarkt, förnyat behov av ballongutvidgning eller by‐pass operation eller hjärtdöd) hos patienter med parodontit . Parodontit tycktes påverka den biologiska aktiviteten av HGF hos kranskärlssjuka patienter. Bland i övrigt friska patienter med parodontit fann vi höga koncentrationer av HGF men den biologiska aktiviteten var lägre än hos individer utan parodontit. Detta kan tyda på att parodontit, eller faktorer som är delaktiga i parodontitprocessen, inverkar negativt på sårläkning och vävnadsnybildning. Nya undersökningar behövs för att studera om den lägre biologiska aktiviteten av HGF har betydelse för parodontit och/eller kranskärlsjukdom och sambandet dem emellan.   

List of studies 

PREFACE

The thesis reports on these original studies, which are referred to in the text by their Roman numerals.  

I. Starkhammar Johansson C, Richter A, Lundström Å, Torstensson H, 

Ravald N. Periodontal conditions in patients with coronary heart 

disease: a case–control study. Journal of Clinical Periodontology, 2008; 

35: 199–205. 

 

II. Starkhammar Johansson C, Ravald N, Pagonis C, Richter A. 

Periodontitis in patients with coronary artery disease: An 8‐year 

follow‐up. Submitted for publication. 

 

III. Lönn J, Starkhammar Johansson C, Kälvegren H, Brundin L, 

Skoglund C, Garvin P, Särndahl E, , Ravald N, Richter A, Bengtsson 

T, Nayeri F. Hepatocyte growth factor in patients with coronary 

artery disease and its relation to periodontal condition. Results in 

Immunology, 2012; 2: 7‐12. 

 

IV. Lönn J, Starkhammar Johansson C, Sridhar S , Bengtsson T, Nayeri F,  

Ravald N. High concentrations of hepatocyte growth factor but low 

biological activity in patients with periodontitis. In manuscript. 

 

  5

Abbreviations and definitions 

ABBREVIATIONS AND DEFINITIONS

Abbreviations ACS  acute coronary syndrome A. actinomycetem‐comitans 

Aggregatibacter actinomycetemcomitans 

AL  attachment level AMI  acute myocardial infarction BOP  bleeding on probing c‐MET  mesenchymal epithelial transition factor cMTI  carotid intima media thickness CABG  coronary artery by‐pass graft CAD  coronary artery disease CD  cluster of differentiation cIMA  carotid intima‐media area  cIMT  carotid intima‐media thickness CVD  coronary vascular disease HDL  high‐density lipoproteins HGF  hepatocyte growth factor hs‐CRP  high‐sensitivity serum C‐reactive protein HSP  heat shock proteins HSPG  heparan sulfate proteoglycan ICAM‐1  inter‐cellular adhesion molecule‐1 IL  interleukin IMT  carotid artery intima‐media thickness LDL   low‐density lipoproteins LPS  lipopolysaccharide MI  myocardial infarction MHC  major histocompatibility complex MMP  matrix metalloproteinase MPC‐1  monocyte chemoattractant protein‐1 non‐STEMI  non‐ST segment elevation myocardial infarction OR  odds ratio P. gingivalis  Porphyromonas gingivalis PCI  percutaneous coronary intervention PCTA  percutaneous transluminal coronary angioplasty PD  pocket depth 

 

Abbreviations and definitions 

PDGF  platelet derived growth factor PGE2  prostaglandin E2 PPD  probing pocket depth PMN  polymorphonuclear leukocytes RANKL  receptor activator of nuclear factor kappa B ligand RR  risk ratio SPR  surface plasmon resonance SR  scavenger receptor SRP  scaling and root planning STEMI  ST segment elevation myocardial infarction TNF‐α  tumour necrosis factor α TNF‐ β  tumour necrosis factor β TLR  toll‐like receptor VCAM‐1  vascular endothelial adhesion molecule‐1  Definitions Acute coronary syndrome. Atherosclerotic plaques rupture that leads to thrombus formation in coronary arteries (coronary thrombosis). Clinical manifestations are myocardial infarction (STEMI or non‐STEMI) or instable angina.   

Acute myocardial infarction. Blood supply interruption to a heart section that causes cell death at the myocardium.  

Angina pectoris. Chest pain due to ischemia of the heart muscle.  

Atherosclerosis. Artery wall thickness due to plaques.  

Coronary artery bypass graft. Surgical method used to graft a healthy artery or vein to a blocked coronary artery.   

Coronary artery disease. Conditions in which plaques build in the coronary arteries due to atherosclerosis.  

Cardiovascular disease. Diseases that affect the cardiovascular system, the term is usually used for diseases related to atherosclerosis.  

Ischemic heart disease. Reduced blood supply to the heart muscle, usually due to atherosclerosis in coronary arteries. Clinical manifestations include acute myocardial infarction, stable angina, unstable angina, or sudden death.  

  7

Abbreviations and definitions 

 

Percutaneous coronary intervention. Non‐surgical widening procedure to treat narrowed coronary arteries; synonymous with percutaneous transluminal coronary angioplasty.  Non‐STEMI. A type of heart attack in which thrombus partially blocks the coronary artery; characteristic changes of the negative T wave or ST segment depressions on electrocardiography occur.   

STEMI  A type of heart attack in which the coronary artery is completely blocked; characteristic changes of ST segment elevations on electrocardiography (ECG) occur.   

Introduction 

INTRODUCTION

As a dentist and periodontics consultant, I treat patients with severe periodontal disease. These patients suffer from chronic inflammatory disease that (i) leads to destruction of tooth periodontium and (ii) results in tooth loss. The pathogenesis of periodontitis is complex; it includes several risk factors such as neglected oral hygiene,  tobacco  and  smoking  habits  impaired  general  health,  and  genetic susceptibility  (Heitz‐Mayfield  et  al.,  2005;  Persson,  2008;  Stabholz  et  al.,  2010). Consequently, patients with severe periodontitis may have one or several general diseases, including coronary artery disease (hereafter, CAD).  

CAD,  a  consequence  of  inflammatory  and  immunological  reactions  in  the coronary  arteries,  is  a multi‐factor  disease with many  underlying  risk  factors; several are known but not explained in all cases. CAD is one of the main reasons for premature deaths in industrial countries. In Europe, 40% of deaths are caused by cardiovascular disease, i.e., about 2 million deaths annually.1 

During the past decade, the literature described growing evidence for a CAD‐periodontitis  association.  It  is  reasonable  to  believe  that  periodontitis  has  an influence on processes involved in CAD or might even be a risk factor. Work that led to this thesis intended to (i) contribute to this research area, (ii) focus on the epidemiological  relationship  between  CAD  and  periodontitis,  (iii)  study  the connection  between  the  two diseases  and  to  study  one  systemic  inflammatory factor, Hepatocyte growth factor (HGF),  involved  in systemic  inflammation and wound healing.  

Historical perspective

Impact of oral health on general health has been discussed  for centuries.  In  the past, there was a belief that bad teeth could promote general diseases, especially those with unknown aetiology. 

                                              1 http//ec.europa.eu/health‐eu/health_problems/cardiovascular diseases   

  9

Introduction 

In  1900, William Hunter  introduced  the  oral  sepsis  term. He  suggested  that poisoning  from  oral  diseases,  such  as  pyorrhea  alveolaris,  could  be  particularly detrimental to general health, especially from infectious   diseases caused by pus organisms, e.g.,  ulcerative endocarditis (Hunter, 1900).  

In 1930, Billings further developed the theory of focal infection and suggested that  pathogens  from  one  local  primary  foci,  under  appropriate  circumstances, could  spread  via  the  blood  and  lymph  fluid  thus  causing  disease  elsewhere. Rheumatic, heart, and kidney diseases were some of the possible targets (Billings 1930). Rosenow, Billings’s research associate, injected strains of streptococci from patients with chronic diseases, e.g., arthritis,  in animals and concluded  that  the animal tended to develop lesions (Rosenow, 1930). 

Focal  infection was  suggested as a  factor  that  contributed  to  several general diseases,  especially  in  joints  and  cardiac  valves  (Cecil,  1934).  Unfortunately, Rosenow’s  recommendations  led  to  new  strategies  among dentists, namely,  to extract  teeth  rather  than  preserving  them  to  avoid  possible  focus  of  infection. Over  time,  evidence  against  focal  infection  theory was  presented  and  special attention was paid to an article by Cecil  in 1940. Patients with the same disease did not always show signs of  focal  infection and elimination of  the  foci did not always  favour  disease  outcomes.  In  the  1950s,  focal  infection  theory  was abandoned. 

Theories  that oral health  could  influence general diseases  regained  interest when   Mattila  et al.  (1989) described an association between dental health and myocardial  infarction  in a Finnish population. Overall dental  infections  (caries, periodontitis,  endodontic  lesions,  and  pericoronitis) were  compared  in  a  case‐control  study  of  100  patients with  acute myocardial  infarction  (AMI)  and  100 randomly  chosen  subjects without  AMI.  Dental  caries  and  periodontitis were more prevalent among patients with AMI than among controls. These differences remained  significant  even  after  adjusting  for known  risk  factors  for CAD,  e.g., age, diabetes, and smoking. These published results became a starting point for a new era of interest for research on the CAD‐periodontitis association. 

    

  10

Introduction 

Periodontitis

Periodontitis  is  the pathological manifestation  of  the host  response  against  the bacterial challenges from the dental biofilm at the tooth and the gingival interface (Sanz and van Winkelhoff, 2011).  

Due  to  inflammation  and  immune  response,  destructive  processes  involve the  tooth’s  supportive  tissues:  alveolar  bone,  root  cementum,  periodontal ligament, and gingiva. If untreated, this destruction proceeds over time, until the final consequence is tooth loss. The disease could be localised or wide spread in the dentition.  

Bacterial plaques at  the gingival margin  initiate a classic  inflammation with swelling, redness, and bleeding at the gingival margin with these clinical signs of gingivitis appearing in a time period of about seven days (Löe et al., 1965). When the bacterial plaque extends into the gingival sulcus, the connection between the junctional  epithelium  and  the  root  surface  disrupts  and  a  pocket  epithelium occurs. A deepened pocket  reflects an environmental change  from an aerobe  to an anaerobe environment;  the consequence  is a shift  in  the microbial plaques – from  a  predominant  gram  positive  flora  that  consists  of  various  cocci  and lactobacilli – to a subgingival flora that consists of gram negative rods and motile species (Listgarten and Hellden, 1978).   

Products from the biofilm – a community of various anaerobe and facultative aerobe  species  surrounded  by  gingival  crevicular  fluid  –  affect  the  pocket epithelium and the underlying connective tissue. Endothelial cells  increase their expression  of  adhesion molecules  and  an  inflammatory  infiltrate  occurs  in  the subepithelial connective  tissue. Products, such as prostaglandin and destructive enzymes  derived  from  bacteria  or  produced  by  cells  in  tissues,  destroy  the alveolar bone and with this bone destruction, the periodontal lesion is manifested (Page and Kornman, 1997). Löe et al. (1965) found that periodontitis did not affect every subject, even though gingivitis, as an effect of neglected plaque control on tooth surfaces, developed in all  subjects.  Optimal  oral  plaque  control  that  totally  prevents  gingivitis  can’t occur  in  the  total  population.  But  improvement  in  oral  hygiene  has  been described  in studies  from  Jönköping County, Sweden  (Hugoson and Norderyd, 2008). In 1973, mean plaque occurrence in the adult population (ages 20–70) was about 40% of  the  total number of available  tooth  surfaces, with  slightly higher 

  11

Introduction 

occurrence among the oldest adults. Thirty years later, occurrence was less than 20%. Corresponding values were found for gingivitis.  

Despite oral hygiene improvements, there were no or only minor changes in periodontitis prevalence. Moderately advanced periodontitis occurred  in 28% of the  population  in  2003  and  seemed  to  be  unchanged  over  time.  Severe periodontitis was found in 11% of the population; this reflects a slight reduction compared  to  the  13%  prevalence  1973  (Hugoson  et  al.,  2008).  Although, periodontitis prevalence in Sweden in 2003 was comparable to prevalence found in  studies  of  subjects without  regular dental  care  and with  high plaque  levels (Baelum et al., 1986; Löe et al., 1986). 

Recent data on periodontitis prevalence in Europe are inconsistent. König et al.  (2010)  concluded  that  actual  epidemiological  data  on  periodontal  disease prevalence in epidemiological studies are heterogeneous and absent from several European countries. Eke et al. (2012) reported moderate periodontitis prevalence in 30% and severe periodontitis in 8.5% of the U.S. adult population in 2010. The number  of  studies  that  provide  data  on  periodontitis  prevalence  over  time  is limited. From available data, Hugoson and Norderyd (2008) suggested that there might  be  a  positive  trend  toward  slightly  decreasing  severe  periodontitis prevalence – at least in the Scandinavian countries.  

Complexity of oral microflora

The oral cavity can be colonised by at least 600 bacteria species (Dewhirst et al., 2010) with a number exceeding 150 species in one subject. A healthy tooth pocket harbours  a  magnitude  of  103  microbes;  a  deep  periodontal  pocket  with subgingival bacterial plaques harbours about 109. These bacteria act together in a complex  community  surrounded  by  extracellular  bacterial  polymers  and products derived from saliva and gingival exudates in a bio film (Darveau et al., 1997; Bernimoulin  et  al.,  2003). Various  species  adhere  to  a  surface  or  to  each other. Nutrient products secreted by one species diffuse into the biofilm and can be  useful  for  other  species.  A  diffusion  gradient  for  oxygen  allows  aerobe conditions  on  the  surfaces  and  anaerobe  in  the deeper part  of  the pocket. The biofilm protect microbes  against  the host defence  and  antimicrobial  substances such as antibiotics.   

  12

Introduction 

Several bacterial species have been closely associated with periodontitis, e.g., P.  gingivalis, A.  actinomycetemcomitans,  Prevotella  intermedia,  Bacteriodes  forsythus and spirochetes such as Treponema denticola (Socransky et al., 2002). Several other species  are  considered  to  be  pathogens  but  their  virulence  factors  are  less pronounced:  Fusobacterium  nucleatum,  Campylobacter  rectus,  Eikenella  corrodens, Selemonas and Eurobacterium subspecies. 

Many  species,  such  as  P.  gingivalis,  can  be  detected  (although  in  low numbers)  in periodontally healthy  subjects  and  subjects with  gingivitis  but no alveolar bone loss (Tanner et al., 1998). In a group of periodontally untreated men (Preus et al., 1995), 5% of all sites with periodontal health or gingivitis harboured P. gingivalis. Corresponding values  for sites with 4‐5 mm and  ≥6 mm PPD were 28%  and  40%,  respectively.  A.  actinomycetemcomitans  was  not  detectable  in healthy sites but were equally distributed in sites with gingivitis and moderately advanced or  advanced periodontitis  (10%). Prevalence of P.  gingivalis  seems  to increase  with  age,  while  A.  actinomycetemcomitans  is  more  prevalent  among young subjects (Rodenburg et al., 1990). It has been showed that microbial species related  to  periodontitis  decrease  after  periodontal  treatment  (Socransky  and Haffajee, 1993; Haffajee et al., 1996). 

P.  gingivalis  is  a  gram‐negative,  anaerobe,  sackarolythic  rod  with  several pathogenic characteristics;  it has been associated with CAD  (Andriankaja et al., 2011;  Yakob et al., 2011). Endotoxin (the lipopolysaccharide [LPS] component of gram‐negative bacterial cell walls) plays a key  role  in pathogenesis. LPS blocks expression  of  the  e‐selectin  receptor  on  endothelial  cells  and  thus  inhibits leukocyte  migration  from  the  bloodstream  into  tissue.  LPS  (i)  inhibits  other bacterial species  that can stimulate e‐selectin expression and  (ii) seems  to block protein‐1 chemotaxis and IL‐8, an anti‐inflammatory cytokine (Jain and Darveau, 2010). 

P. gingivalis produces several factors, such as fibrinolysin and phospholipase A – plus enzymes that stimulate bone resorption, e.g., matrix metalloproteinases (MMPs). Arginine cysteine protease activity increases vascular permeability with increased  inflow  of  exudates, which  results  in  nutrients  for  biofilm.  In  active periodontal  lesions,  P.  gingivalis  prevalence  increases  and  elevates  levels  of antibodies  against P.  gingivalis;  antibodies  can  be measured  in  saliva  in  serum (Bostanci and Belibasakis, 2012).    

  13

Introduction 

Host response in periodontitis

Kinane et al. (2011) describe complex cellular and molecular mechanisms of host‐microbial interactions. As a response to pathogenic subgingival micorbiota, both innate  and  adaptive  immune  responses  are  activated  (Figure  1).  In  the  innate defence, mast  cells  activation,  fibroblasts,  and  endothelial  and  epithelial  cells results in unregulated cytokine secretion. 

  

  

Figure 1. Host‐response in periodontitis; modified from Kinane et al. 2011.  

  14

Introduction 

Il‐8,  Il‐1β,  TNF‐α,  and  ICAM‐1  promote  vascular  changes  and  due  to  Il‐8, PGE2, and chemokines, polymorphonuclear leukocytes (PMNs) are activated and start  to migrate.  PMNs  primarily  have  a  protective  role,  but  they  can  trigger production  that  drive  tissue  destruction,  e.g.,  production  of  reactive  oxygen species and various collagenases and proteases. 

Il‐1β, TNF‐α, Il‐6, and PGE2 stimulate the receptor activator of nuclear factor kappa‐B ligand (RANKL), which is a member of the tumour necrosis factor (TNF) cytokine  family, which  is  a  ligand  for  osteoprotegerin  (aka  osteoclastogenesis inhibitory factor) – a key factor for osteoclast recruitment and activation. 

In  the  adaptive  immune  response,  antigen‐presenting  cells  (such  as Langerhans  cells,  macrophages  and  dentritic  cells)  activate  native  T  cells. Depending on the type of presented pathogen, the immune system via a suitable cytokines profile reacts with cell‐mediated immunity or antibody response. 

INF‐γ, IL‐12, and IL‐18 promote TH1 cells and by regulation of INF‐γ, IL‐5, and IL‐13, this promotes cell‐mediated immunity as the effect. IL‐4 is capable to activate TH2 cells. Expression of IL‐4, IL‐21, and IL‐13 promotes B‐cell antibody production.  T‐regulatory  cells  regulate  the  processes,  and  TGF‐β  and  Il‐10 suppress the immune response.  

Atherosclerosis

Normal histology of the arterial

Arteries  are  categorized  as  per  size  and  characteristics:  large  (elastic  arteries, medium or muscular and small (arterioles) with well‐defined lumen surrounded by a three‐layer coat (tunicas) that maintains vessel wall muscularity (Figure 2).  

In  tunica  intima,  the  endothelium  rests  on  a  thin  basal  lamina.  The subendothelial  space  contains  proteoglycans  and  elastic  collagenous  fibres. Longitudinally  oriented  smooth  muscle  cells  form  a  relatively  thick  band  of elastic fibres.  

The  tunica  media  is  the  thickest  layer  with  about  40  layers  of  circularly arranged  smooth muscle  cells with  collagenous  and  reticular  fibres  –  and  no fibroblasts. The number of lamellae increases with age and with hypertension.  

  15

Introduction 

The  tunica  adventitia  is  a  rather  thin  connective  tissue  layer  that  contains collagenous and elastic fibres. Fibroblasts constitute the main cell type, and many macrophages are present. Collagen in the adventitia prevents elastic arteries from stretching past their physiological limit during systole. 

  

  

Figure 2. Atherosclerosis stages, modified from Ross (1999). 

  16

Introduction 

Histopathological  atherosclerosis  stages  are  characterised  by  fatty  streaks, fibrofatty  lesion, and fibrous plaque. Ross (1999) described atherosclerosis as an inflammatory disease. It progresses in steps over time – or more likely in bursts (Bruschke et al., 1989). Due  to  the chronic  inflammatory  response, a cascade of events results  in migration and proliferation of arterial smooth muscle cells and increases accumulation of lipid and lipoproteins beneath the endothelium. In the first step, endothelial dysfunction leads to monocyte migration and development of  early  intimal  lesion with  fatty  streaks.  If  the  offending  agent  continues,  the inflammatory  response  results  in  cytokines  production  from  leukocytes  that initiate migration  and  proliferation  of  smooth muscle  cells.  These  produce  an extracellular matrix, and the lesion expands to an intermediate, fibrofatty lesion, with multiplication of smooth muscle cells, connective tissue, macrophages, and T  lymphocytes.  Remodelling  processes  result  in  the  advanced  lesion  with formation of  a  fibrous  cap  that has many  smooth muscle  cells, which produce extracellular  matrix  proteins,  elastic  fibres,  and  proteoglycans.  As  the  lesion enlarges,  it  intrudes  into  the vessel wall and  the arterial  lumen narrows. Blood flow decreases, which may  lead  to clinical symptoms.  In stable cases, plaque  is stabilised, and  the atheroma  (with  its  lipid‐rich  core)  is  covered by a  relatively thick, firm, fibrous cap with preserved vessel lumen. In vulnerable plaque, a large lipid  pool  (with  many  inflammatory  cells)  is  covered  by  a  thin  fibrous  cap. Changes in the surface of this fibrous cap could cause erosions or ruptures, which (i) leads to formation of thrombus that compromises blood flow at a local site and (ii) in the worst case, causes sudden death (Figure 2). 

Atherosclerosis, a consequence of inflammation and immune response

The  atherosclerosis  pathogenesis  is  complicated.  It  involves  a  series  of inflammatory  action  in  the  innate  and  adaptive host  immune  response  (Libby, 2002). Under normal conditions (when blood passes through the arterial vessel), the  endothelium  resists  leukocyte  adhesion. This  condition  changes when pro‐inflammatory  risk  factors  for atherosclerosis occur  (e.g., hypertension and high cholesterol levels – especially modified LDL and hyperglycaemia). 

Recruitment of  inflammatory cells  from  the blood  stream  is one of  the  first steps  in  the  normal  artery  transition  to  an  early  atherosclerotic  lesion. An up‐

  17

Introduction 

regulation of various adhesion molecules on the endothelial cells (where VCAM‐1  plays  a  major  role)  promotes  leukocyte  binding  to  the  endothelium.  In  a directed  migration,  the  leukocytes  enter  the  intima  of  the  vessel  wall  by diapedesis  between  the  endothelial  cells  at  their  junctions.  Chemoattractant cytokines  (chemokines)  (e.g.,  MPC‐1  that  is  produced  by  vascular  cells  as  a response  to  modified  lipoproteins)  stimulate  monocytes  recruitment.  During diapedesis, monocytes release matrix metalloproteinase (MMP‐9), which degrade collagen  type  IV,  and  this  enables monocytes  to  enter  into  the  atherosclerotic lesion.  Resident  in  the  intima,  monocytes  change  morphologically  into macrophages.  Expression  of  the  SRA  and  CD36  scavenger  receptors  (on  their surfaces) is enhanced in presence of antigens, e.g., oxidized LDL and heat shock proteins  (HSP). Modified  lipoproteins  are  taken  up  into  the macrophages  and accumulated in cytoplasmic drops in the macrophage, which leads to lysosomal degeneration. Cholesterol esters accumulation in the cytoplasm morphologically transforms  macrophages  into  foam  cells,  which  are  characteristic  for  early atherosclerotic lesions with fatty streaks (Libby, 2002).  

Monocytes  in  atherosclerotic  plaques  express  toll‐like  receptors  on  their surfaces  as  a  response  to  several  molecules,  e.g.,  HSP  and  oxidized  LDL. Inflammatory  responses  are  activated when monocytes  secrete  growth  factors and cytokines –  including  tumour necrosis  factor‐α  (TNF‐α) and  interleukin‐1β (Il‐1 β). 

Secreted cytokines initiate migration and proliferation of smooth muscle cells. The monocytes, which originated from the innate immune response, are the most plentiful  leukocytes  in  all  atherosclerosis  stages. Mast  cells  can  populate  the adventia  but  appear  in  fewer  numbers. They deregulate  and  release  cytokines and  proteases  such  as MMPs. Activated mast  cells  can  induce  endothelial  cell death (Libby et al., 2009). 

T cells dominate the adaptive immune response in atherosclerosis (Packard et al.,  2009).  They  enter  the  intima  by  binding  to  adhesion molecules,  including VCAM‐1, as a response to a chemoattractant (in the same way as monocytes). In the arterial  intima,  the T cells encounter antigens; one of  them  is oxidised LDL. The most frequently occurring T cells in the atherosclerotic lesion are cytotoxic T cells  (Th1 CD4+). Antigen‐presenting  cells  (as  dentritic  cells  or  B‐lymphocytes with MHC class II molecules on their surfaces) present the antigen.  

Macrophages  are  activated  in  the  TH1  pathway.  Phagocytosis  (including release  of  MMPs  and  gelatinases)  causes  collagen  breakdown  and  thus  a weakened  fibrous  cap  that  covers  atherosclerotic plaque. Extracellular  antigens 

  18

Introduction 

enhance  the TH2 pathway  and  activate  the B‐lymphocytes  to produce  specific antibodies against, for example, oxidized LDL. 

Plaque disruption

Libby (2002) describes three types of physical plaque disruption: 1. Fracture of the plaque’s fibrous cap. In athermanous plaque, an over‐expression 

of  collagens  (MMP‐1,‐8,  and  ‐13)  seems  to  degrade  the  fibrous  cap. When plaque ruptures, extracellular matrix components are exposed  to cells  in  the circulatory system where they get in contact with coagulation proteins in the blood stream.  

 2. Superficial erosions. Collagen and the von Willebrand factor activate platelets, 

and the wound‐healing cascade is triggered. Often, a limited mural thrombus forms. In the healing process, resorption of the thrombus response leads to an inflammatory  response  with  release  of  anti‐inflammatory  cytokines  and growth factors such as PDGF. Deposition of smooth muscle cells and collagen forms a more fibrous cap. Mechanisms of superficial erosions in microscopic areas  of  the  thin  endothelial  layer  also  occur.  In  these  areas,  subepithelial collagen  is exposed. When  the von Willebrand  factor activates  this collagen, platelet  adhesion  and  activation  is  stimulated,  which  results  in  platelet thrombus.  

 3. Disruption  of  newly  formed  micro  vessels  in  the  atherosclerotic  plaques.  These 

newly  formed  vessels  are  fragile  and  easily disrupted  in  the  lesion, where they  cause  thrombosis  inside  the  lesion. This  leads  to  thrombin  generation and  cleaving  of  fibrin  that  is  caused  by  secretion  of  TGF‐β  from  activated platelets, which  trigger  proliferation  and migration  of  smooth muscle  cells that synthesize interstitial collagen.  

Wound healing process

Wound  healing  is  a  non‐linear  process,  which  integrates  with  dynamic, interactive  processes  that  involve  soluble mediators,  extracellular matrix,  and cells  (Clark, 1996). Wound healing starts with  inflammation.  In areas of  injured 

  19

Introduction 

tissue,  blood  vessels  rupture.  The Hageman  factor  increases  permeability  and bradykinin  increases  vessel  dilation.  By  activation  of  the  complement  system, neutrophiles  and  monocytes  are  recruited  and  releases  active  products. Histamine  and  leucotrienes  are  released  from  mast  cells.  Platelets  adhere  to connective  tissue,  and  an  aggregate  of  platelets  blocks  injured  vessel  walls. Varying  proteins  and  soluble  factors  are  released  from  platelet  granules,  e.g., PDGF and TGF‐β; both  initiate  chemotaxis of  fibroblasts. Re‐epithelialisation  is promoted  by  TGF‐β  and  TGF‐α  within  hours  after  an  injury.  Epithelial  cells change  their  phenotype  and  become motile  due  to  loss  of  their  desmosomes. When the barrier is restored, then the original phenotype is established.  

Fibrin  and  integrins  facilitate  cell‐to‐cell  contact  and  act  as  a  reservoir  for cytokines. Neovascularisation  is complex. Cells  in  the  tissue, e.g., macrophages, produce  factors  that  stimulate  endothelial  cells  to  release  plasminogen  and procollagenase, which promotes endothelial migration.  

In  the  last  wound‐healing  stage,  tissue  is  modulated  to  scar  tissue. Connective  tissue  gradually  replaces  granulation  tissue.  Fibroblast  apoptosis transforms the tissue into denser connective tissue with fewer cells.  

Hepatocyte growth factor

The  hepatocyte  growth  factor  (HGF)  is  a  protein  involved  in wound  healing. Mesenchymal  cells  secrete  HGF,  which  regulates  angiogenesis,  vascular permeability,  cell  migration,  reepithelialisation,  and  other  wound  healing processes (Conway et al., 2006).  

HGF was  initially  filtrated  from  rat  serum  and  found  to  initiate growth of hepatocytes  (Nakamura et al., 1984).  In  the 1990s,  it was  found  to  influence cell growth and cell mortality for various epithelial cells and to play a key role as a mediator  via  an  epithelial‐mesenchymal  interaction  in  wound  healing,  tissue regeneration, and morphogenesis (Nakamura, 1991).  

Bussolino, et al.  (1992) described angiogenic  factors and regenerative effects from HGF. Over  time, HGF was  found  to  be  structurally different  from  other growth factors.  

The mesenchymal epithelial transition (MET) factor  is the receptor for HGF, and the HGF‐MET pathway plays key roles in epithelial morphogenesis. Almost all  epithelial,  endothelial, and  erythroid progenitor  cells  express  the  c‐MET, an HGF receptor (Nakamura et al., 2011).  

  20

Introduction 

c‐MET expression seems to be higher in acute wounds (compared to chronic), while  the HGF  is  similar, which  indicates  a more  active  role  in  acute wound healing (Conway et al., 2007).  

Elevated HGF  serum  levels were associated with acute  coronary  syndrome (ACS)  (Matsumori et al., 1997; Sato et al., 1999; Shimada et al., 2002; Lenihan et al., 2003). Susen et al.  (2005) proposed  that HGF serum  level  is an  independent predictor of clinical outcome after percutaneous coronary intervention (PCI). The HGF was associated with periodontitis. HGF levels in saliva were correlated with number of deep pockets (Ohshima et al., 2002, Wilczynska‐Borawska et al., 2006) and  HGF  levels  in  gingival  crevicular  fluid  were  higher  in  periodontally compromised sites (Nagaraja and Pradeep, 2007). In vitro, cystein proteinase – an arginine‐specific  gingipain  from  P.  gingivalis  –  stimulates  human  gingival fibroblasts that secrete HGF (Uehara et al., 2005). 

Periodontitis-CAD association

A  large number of epidemiological studies describe an association between oral health and cardiovascular disease (CVD). In this thesis, Table (1‐4): 1. Displays associations between number of teeth and CVD.  2. Describes studies that report the oral health‐CVD association.  3. Lists studies that reported clinical periodontal variables (gingivitis, bleeding 

on probing [BOP], and probing pocket depth [PPD]) associated with CVD.  4. Presents studies on the alveolar radiographic bone level‐CVD association.   The studies’ varying designs make them suitable for various research purposes. 

  21

Introduction 

Table 1. Studies one number of teeth ‐ CVD.  CVD variable

Tooth variable

p-value Adjustment Author Yr Design

Stroke/ TIA

TLN 0.0016 Age, smoking, HT, diabetes, cholesterol Elter et.al ‘03 Cross-sectional

Cartoid artery plaque

NLT 0.05 Age, gender, diabetes, systolic BP, serum cholesterol, race-ethnicity, education

Desvarieux et al. ‘03 Cross-sectional

Cartoid artery plaque

NT 0.05 Age, gender, diabetes, systolic BP, serum cholesterol race-ethnicity, education

Desvarieux et. al ‘04 Cross-sectional

MI NLT - Age, smoking, hypertension, social factors Paunio et al. ‘03 Cross-sectional

CAD ≤16 teeth - Age, smoking, HT, diabetes, serum cholesterol, BMI

Elter et al. ‘04 Cross-sectional

MI, self-reported

NT 0.03 Age, gender, smoking Holmlund et al. ‘06 Cross-sectional

Cartoid artery IMT

NT 0.016 Age, sex, smoking, BMI, blood glucose, triglycerides, cholesterol, C-reactive protein, leukocyte count, BP, Framingham risk score

Holmlund et al. ‘12 Cross-sectional

CAD NT 0.02 Age, diabetes, smoking, BMI, education Buhlin et al. ‘05 Case- control

ACS NLT 0.02 Age, gender, smoking, diabetes, HT, and BMI Buhlin et al. ‘11 Case- control

CAD incidence

TLN - Age, gender, diabetes, smoking, serum cholesterol, HT

Morisson et al. ‘99 Longi- tudinal

CVD Incidence

Missing ≥9 teeth

0.024 Age gender, smoking, BMI, systolic BP, socioeconomic status

Tu et al. ‘07 Longi- tudinal

CAD NT <0.0001 Age, gender, smoking Holmlund et al. ‘10 Longi- tudinal

MI NT at baseline

0.03 Age, smoking Joshipura et al. ‘96 Longi- tudinal

CAD TLN ns Age, gender, social status, smoking, alcohol, BP, cholesterol, diabetes, physical activity, psychological factors

Hujoel et al. ‘01 Longi- tudinal

intima‐media thickness = IMT; transient ischemic attack = TIA; toothlessness  = TLN; number of teeth = NT; number of lost teeth = NLT; blood pressure = BP;  hypertension = HT  

  22

Introduction 

Table 2. Studies on tooth infection/oral health ‐ CVD.  

CVD Tooth-related variable

p-value Adjustments Author Yr Design

CAD Overall tooth infections

<0.001 Age, serum cholesterol, smoking, hypertension, BMI,

Mattila et. al ‘93 Cross-sectional

CAD Overall tooth infections

ns Age, social factors, smoking, hypertension, serum lipids

Mattila et al. ‘00 Case- control

MI Over all dental infections

<0.01 Age, smoking, hypertension, diabetes, education, social class, BMI cholesterol, glucose.

Montebugnoli et al. ‘04 Case- control

CAD death

Overall dental infections

0.053 Age, smoking, BMI, diabetes, hypertension, education level

Karhunen et al. ‘06 Case- control

MI Overall tooth infections

- Age, gender, socioeconomic status, smoking, hypertension, previous MIs, diabetes, BMI serum lipids

Mattila et al. ‘95 Longitu- dinal

 

  23

Introduction 

Table 3. Studies on the clinical periodontal variables ‐ CVD.  

CVD

Periodontal variable p-value Adjustments Author Yr Design

S-R heart attack

AL ≥3 mm 0.02 Age, smoking, HT, serum cholesterol, BMI, social factors

Arbes et. al ‘99 Cross-sectional

IMT ≥ 1mm AL ≥3 mm ≥30% of sites 0.001 Hypertension, serum cholesterol, diabetes, smoking

Beck et al. ‘01 Cross-sectional

CVD S-R gingival inflammation 0.0017 Age, smoking, diabetes, social status

Buhlin et al. ‘01 Cross-sectional

TIA/stroke N sites AL ≥3 mm 0.003 Age, smoking, HT, diabetes, serum cholesterol

Elter et al. ‘03 Cross-sectional

CAD AL ≥3 mm ≥10% of sites 0.0001 Age, smoking, HT, diabetes, serum cholesterol, BMI

Elter et al. ‘04 Cross-sectional

Coronary artery calcification

AL ≥3 mm ≥10% of sites ns Age, smoking, HT, diabetes, serum cholesterol, BMI

Nakib et al. ‘04 Cross-sectional

Cartoid artery plaque

% sites attachment level ≥4 mm

0.05 Sex, age, diabetes, systolic BP, serum cholesterol race-ethnicity, education

Desvarieux et. al ‘04 Cross-sectional

ACS % teeth cal ≥5 mm 0.002 Age, smoking, diabetes, family history of CAD

Gotsman et al. ‘07 Cross-sectional

CAD-related death

Periodontal status (no disease/gingivitis/ PD 4-6 mm/PD>6 mm)

ns Age, gender, education level, smoking, HT, hyper-cholesterolemia, diabetes

Tuominen et al. ‘03 Longi- tudinal

Angina pectoris/MI

≥5 mm PPD 0.0001 Age, gender, smoking, alcohol intake, diet, HT, hyperlipidemia, physical activity, diabetes

Geerts et al. ‘04 Case-control

intima‐media thickness = IMT; transient ischemic attack = TIA; self‐reported = S‐R; attachment loss = AL; blood pressure = BP; hypertension = HT  

…. Table 3 continued on next page. 

  24

Introduction 

Table 3 continued …   CVD

Periodontal variable p-value Adjustments Author Yr Design

AMI Proportion ≥6 mm PPD 0.05 Age, gender, diabetes, cholesterol

Persson et al. ‘03 Case- control

AMI BOP 0.01 Age, gender, social status

Renvert et al. ‘04 Case- control

cMTA/

IMT

≥5 mm PPD 0.003/

0.004

Age, gender, smoking, BMI, diabetes, hyper-tension, plasma cholesterol

Söder et al. ‘05 Case- control

CAD No. of ≥4 mm PPD 0.006 Age, gender, smoking, diabetes, cholesterol

Buhlin et al. ‘05 Case- control

CAD ≥4 mm PPD

BOP

0.047

0.01

Perfect matched Tabrizi et al. ‘07 Case- control

CAD/ACS ≥6 mm PPD 0.049 Age, gender, smoking, diabetes, HT, BMI

Buhlin et al. ‘11 Case- control

CAD Periodontal index score - Age, gender, race, social factors, smoking, alcohol, systolic BP, total cholesterol, diabetes, BMI, physical activity

deStefano et al. ‘93 Longi- tudinal

CAD Gingivitis - Age, gender, province, diabetes, smoking, serum cholesterol, HT

Morrison et al. ‘99 Longi- tudinal

MI/CVD death S-R periodontitis ns Age, smoking, HT, BMI, cigarette & alcohol use, physical, parental MI history

Howell et. al ‘01 Longi- tudinal

intima‐media thickness = IMT; transient ischemic attack = TIA; self‐reported = S‐R; attachment loss = AL; blood pressure = BP; hypertension = HT 

  25

Introduction 

Table 4. Studies on the radiographic alveolar bone loss ‐ CVD.  CVD Tooth-related variable p-

value Adjustments Author Yr Study design

Cartoid plaque thickness

Overall ≥50% bone loss 0.003 Age, gender, smoking, diabetes, hypertension, cholesterol

Engbertson et al. ‘05 Cross- sectional

AMI Bone loss ≥4 mm in ≥50% of the teeth

0.01 Age, gender, diabetes, cholesterol

Persson et al. ‘03 Case- control

AMI Proportion bone loss ≥4 mm

<0.001 Smoking Renvert et al. ‘04 Case- control

CAD Vertical bone defects 0.06 Age, gender, smoking, diabetes, cholesterol

Buhlin et al. ‘05 Case- control

CAD Mean alveolar bone level 0.003 Age, smoking, diabetes Geismar et al. ‘06 Case- control

CAD/ACS ABL 0.025 Age, gender smoking, diabetes, hypertension, BMI

Buhlin et al. ‘11 Case- control

ACS recurrence

Extent of bone loss ≥4 mm

0.001 Age Renvert et al. ‘10 Longitudinal

acute coronary syndrome = ACS; acute myocardial infarction = AMI; alveolar bone level = ABL 

  26

Introduction 

Cross-sectional studies

A cross‐sectional study design  is observational;  it describes a subset of  the  total population  at  a  specific  time  point  –  prospective  or  retrospective.  This  design provides values that indicate disease prevalence and is suitable for studying co‐variations of two diseases in a population. Associated risk factors can be studied, but cross‐sectional study designs cannot prove cause‐related factors.  An  association  between  CAD  and  tooth  health  in men was  first  described  in Finnish  studies  reported  in  the  1990s.  Atherosclerosis  found  on  coronary angiography was more  common  among  patients who  had dental  infections  of various  kinds  that were  diagnosed  on  panoramic  radiographs  (Mattila  et  al., 1993). Patients with angina pectoris or who had myocardial infarction (MI), had fewer teeth than healthy subjects (Paunio et al., 1993). 

In the US, a subset of the National Health and Nutrition Examination survey (NHANES  III)  Arbes  et  el.  (1999)  reported  an  increased  OR  for  self‐reported heart‐attack with higher numbers of sites with attachment loss ≥ 3 mm.  

The Atherosclerotic  Risk  in  Communities  study  investigated  the  aetiology and natural history of atherosclerosis and CVD in four US communities. Several studies  reported  results  from  the  subsets with more  than 6000  subjects  (female and male). Beck et al.  (2001)  found an odds ratio  (OR) of 1.3  for having carotid artery intima thickness of ≥1 mm if having severe periodontitis that was defined as ≥3 mm attachment loss at ≥30% of the sites. An OR of 1.3 was found for stroke and transient ischemic attack and an OR of 1.4 for edentulous (Elter et al., 2003). The  combination  of  high  attachment  loss  and  less  than  16  natural  teeth  gave elevated odds for prevalent CAD (Elter et al., 2004), although Nakib et al. (2004) did not find coronary artery calcification associated with periodontitis.  

The  Oral  Infections  and  Vascular  Disease  Epidemiology  study  is  a population‐based cohort study on  random subjects  (female and male)  living on Manhattan  without  stroke  history  or  MI.  Desvarieux  et  al.  (2003)  reported subclinical atherosclerosis measured on high‐resolution ultrasound, significantly associated with tooth loss. An association between tooth loss, high percentage of sites  with    attachment  level  (AL)  ≥4 mm  and  subclinical  atherosclerosis  was found  in men but not  in women (Desvarieux et al., 2004). Overall alveolar bone loss  ≥50%  on  panoramic  radiographs  was  associated  with  carotid  plaque thickness  (OR  3.64),  compared  to  subjects  experiencing  less  bone  loss 

  27

Introduction 

(Engebretson  et  al.,  2005).  The  overall  burden  of  pathogens  associated  with periodontitis was related to carotid intima media thickness (cIMT) (Desvarieux et al., 2005).  

For  CAD  patients  in  Israel,  the  percentage  of  teeth with  a  ≥5 mm  clinical attachment  level was associated with CAD  severity  in  terms of multiple vessel disease  –  compared  to  one  vessel disease  (Gotsman  et  al.,  2007),  although  the study  failed  to  prove  any  association  between  various  periodontitis  severity levels and CAD – probably because almost all patients had severe periodontitis.  

Cross‐sectional studies in Sweden reported data similar to US data. Buhlin et al. (2002) found self‐reported gingival inflammation associated with CVD in both sexes (OR of 1.6). Number of teeth was associated with MIs and self‐reported MIs that  were  associated  with  clinically  diagnosed  periodontitis  and  bone  level measured via  radiographs  (Holmlund  et  al., 2006). Later,   Holmlund  and Lind (2012)  suggested  that  (i)  there  is  a  exposure‐response  relationship  between number of teeth and cIMT and (ii) tooth loss is a good cIMT predictor.   

Case-control studies

Case‐control  studies  retrospectively  identify  patients  with  CAD  and  compare them to control subjects without CAD. The results reflect the investigated group, although  there  is  risk  of misinterpretations when  transferring  results  to  other populations.  But  if  inclusion  criteria  are  correct  and  if  controls  are  randomly chosen  and  well‐matched  and  properly  checked  for  confounders,  then  case‐control studies provide valuable information.  

 Results  from  the Mattila  (1989)    case‐control  study were  followed up with another  study  (Mattila  et  al.,  2000)  that  compared  subjects with  and without clinically and angiographically diagnosed CAD. This  study  failed  to prove any relation  between  periodontitis  and  CAD,  possibly  due  to  selection‐bias concerning  various  ages  in  the  group.  But  in  another  study  (Karhunen  et  al., 2006), poor oral health due to dental infections (e.g., periodontal vertical pockets and  furcation  involvements, caries, and periapical  lesions  that were determined post mortem with panoramic  tomography) was associated with sudden cardiac death diagnosed via autopsy. Dental infections were associated with risk of death due to CAD – especially in men < 50 years. 

 Periodontitis  classified  according  to  alveolar  bone  level  on  radiographs, number  of  deep  periodontal  pockets,  and  clinical  periodontal  variables  were 

  28

Introduction 

related  to  CVD,  although  the  definition  for  periodontitis  varies.  Geerts  et  al. (2004) reported severe periodontitis correlated with angina pectoris and MI (OR 6.5).    Montebugnoli  et  al.  (2004)  found  these  factors  associated  with  overall periodontal variables:  (i) acute myocardial  infarction  (AMI)  less  than six month before  the  study  and  (ii)  at  least  50%  stenosis  in  at  least  one  of  the  coronary arteries. These  findings  are  aligned with   Buhlin  et  al.  (2005) who  reported  an associations between CAD and periodontitis in females with severe CAD. In this study,  ≥10  sites  with  >4 mm  PPD,  number  of  teeth,  number  of  vertical  bone defects,  and overall mean marginal bone  level on  radiographs were  associated with CAD. The association remained after adjustment for CAD risk factors.  

The ultimate case‐control study should be a  twin study, but  it  is difficult  to find sufficient subjects  for such a study. Tabrizi et al.  (2007) reported one study that included 10 monozygotic twin pairs. Presence of CAD within the twin pairs was associated with periodontitis. Twins with CAD had significantly more BOP and  ≥4 mm  PPD. An OR  of  1.17  for  a  twin  to  belong  to  the CAD  group was reported,  although  a  logistic  regression  may  not  be  a  favourable  statistical analysis method in such a small group. 

Söder et al.  (2005)  suggested  that periodontitis  is an  independent predictor for (i) carotid intima‐media thickness (cIMT), with an OR of 4.64, and for (ii) the carotid intima‐media area (cIMA), with an OR of 5.2.  

Evidence of bone loss around several teeth was suggested as a valuable factor for predicting  future AMI  (Persson et al., 2003) and CAD  (Geismar et al., 2006). Risk  of having AMI  and periodontitis  increased with percentage  of  teeth with bone loss of >4 mm. In older patients, no associations were found. Renvert et al. (2004) reported that the combination of bone loss of ≥4 mm on ≥50% of the teeth and  clinical periodontal  variables had  the highest  association with AMI  in  the total  sample,  but  on  an  individual  level,  radiographically measured  bone  loss seemed to be the best parameter.  

Longitudinal cohort studies

In  longitudinal  prospective  cohort  studies,  groups  of  individuals  are  followed over time; they receive repeated examinations. Consequently, disease progression can be followed over time. These results are usually more valid and reliable than results from case‐control studies. 

  29

Introduction 

Mattila  et  al.  (1995)  found  poor  oral  health  associated with  new  fatal  and nonfatal cardiac events in a group of 214 CAD patients, who were followed more than 7 years.  

de Oliveira  et  al.  (2010)  reported  increased  risk of  cardiovascular  events  in subjects  with  poor  oral  hygiene  (self‐reported  tooth  brushing  habits).  In  this eight‐year  follow  up,  subjects  who  responded  with  never/rarely  brushing  teeth (n=538 of total 11869 subjects) had a hazard ratio of 1.7 for CVD – compared with subjects who responded with brushing teeth once or twice a day. 

In a classic study by DeStefano et al.  (1993), a sample of 9760 subjects  from the previously described NHANES was  followed over 8–11 years. Periodontitis was  found as an  increased  risk  for CAD with  relative  risk  (RR) of 1.72  in men ages <50 and RR of 1.25 in the total sample. Renvert et al. (2010) reported that an additional ACS event was associated with periodontitis (OR of 3.6).  

In a study of 1147 CAD and healthy subjects, who were followed more than 8 years,  (Beck  et  al.,  1996)  associated  alveolar  bone  level  at  baseline  with cumulative  incidence  of  CAD,  with  an  OR  of  1.5  for  total  CAD  events  (i.e., angina,  non‐fatal MI,  and  CAD‐related  death).  No  adjustment  was made  for smoking habits.  

The number of teeth was associated with CAD in several longitudinal studies (Morrison et al., 1999; Joshipura et al., 2003; Tu et al., 2007).  

Morrison et al. (1999) found edentulousness associated with CAD with RR of 1.90  (and  gingivitis with RR  of  2.15)  in  a  retrospective  design  that  included  a baseline sample of 10,368 subjects without self‐reported CAD, where cumulative CAD incidence was followed up after 20 years. 

In  a  Joshipura  et  al.  (2003)  study,  self‐reported  number  of  teeth  was associated with  fatal or nonfatal MI and sudden death. RR  for CAD was 1.76  if having 10 or fewer teeth, compared to 25 teeth or more; here, 44,119 men without previously diagnosed CAD at baseline were  followed up after  four years. Since revascularisation  procedures  (PCI  and  CABG)  were  excluded  as  endpoints (outcomes), this ought to have had an impact on results.  

Tu et al. (2007) report on an exceptionally long, 57‐year follow‐up. Tooth loss, a  categorical variable, was associated with death  from CVD, with an  increased risk  for CVD  and  a  hazard  ratio  (HR)  of  1.35  –  if missing  9  or more  teeth  at baseline.  The  study  population  consisted  of  students  ages  ≤30  (n=12,223)  at baseline.  Over  time,  509  deaths  due  to  CVD  (405  of  those  from  CAD)  were reported.  

  30

Introduction 

Holmlund and Lind (2011) described a dose‐dependent relationship between the number of teeth and CAD‐related mortality. Causes of mortality over 12 years were  studied  in  a  sample  of  7688  patients, who were  referred  for  periodontal treatment at a specialist clinic, and 886 randomly selected subjects from the same area  in  Sweden.  The  number  of  remaining  teeth  was  significantly  related  to mortality due to CVD and CAD. The authors suggested that the number of teeth could be used as an indicator for oral health in association with CVD. 

Some  studies,  however,  failed  to  prove  a  CAD‐periodontitis  association (Howell  et  al.,  2001; Hujoel  et  al.,    2001;  Tuominen  et  al.,  2003).  Self‐reported periodontal  disease was  not  an  independent  predictor  of  CAD  over  12  years (Howell  et  al.,  2001)  and  long‐term  elimination  of  all  dental  infections,  about toothlessness did not reduce CAD risk compared to subject with periodontitis in a retrospective 17 years follow up study by (Hujoel et al., 2001). Tuominen et al. (2003)  found  no  association  between  death  in  CAD  and  periodontal  status  (4 groups;  no  disease,  gingival  inflammation,  4‐6 mm  PPD,  <6 mm  PPD)  over  12 years  (6527  subjects  30‐60  years  at  baseline).  Confounding  factors  (especially cigarette smoking) were proposed to explain associations found in other studies.  

Meta-analysis

Meta‐analysis is considered to have high evidence value. The study design offers a  review of  original  studies  included  after distinct  criteria,  aiming  to  conclude results.  Bahekar  et  al.  (2007)  reported  that  CAD  prevalence  and  incidence increase in subjects with periodontitis. Periodontitis increased the risk for CAD in cohort studies with a RR of 1.14 (1.074–1.213) and in case‐control studies with an OR of 2.22 (1.59‐3.117). Patients with <10 teeth had increased risk for CAD by 1.24 (1.14‐1.36).   Cross‐sectional  studies  showed higher CAD prevalence  in  subjects with periodontitis –  compared  to periodontally healthy  subjects with an OR of 1.59 (1.329‐1.907), CI 95%. 

In  conclusion,  epidemiological  studies  suggested  an  association  between CVD  and  CAD  and  number  of  teeth  and  periodontal  disease  in  terms  of  (i) clinical periodontal variables and (ii) bone loss on radiographs. While the studies suggested an association, they did not prove case‐related factors.

  31

Introduction 

Possible explanatory factors for the periodontitis-CAD association

Systemic impact from oral microflora

In  a  meta‐analysis,  Mustapha  et  al.  (2007)  studied  the  association  between periodontal  disease  and  elevated  systemic  bacterial  exposure  and  CAD. Periodontal disease was  strongly  associated with CAD  –  compared  to  subjects without  periodontitis,  with  an  OR  of  1.75.  The  authors  suggested  that periodontitis‐related, systemic, bacterial, exposure levels could be one biological explanation for the role of periodontitis in atherosclerosis.  

Pathogens  associated  with  periodontitis  were  found  in  atherosclerotic plaques (Haraszthy et al., 2000). In 50 endarterectomies, from 50 men with carotid stenosis,  44%  of  the  atheromas  were  positive  for  one  or  more  periodontal‐associated  species,  namely,  Tanerella  forsythia  (T.  forsythia;  previously  Tanerella fosrynthenis,  previously  Bactorides  forsythys)  was  found  in  30%;  P.gingivalis,  in 26%; A. actimomycetemcomitans, in 18%; and Prevotella intermedia, in 14%.    Figuero et al. (2011) examined 42 atheromatous plaques and reported:  • 78% prevalence of P. gingivalis • 67% prevalence of A. actinomycetemcomitans  • 62% prevalence of T. forsythia  • 55% prevalence of Eikenella corrodens • 50% prevalence of Fusobacterium nucleatum  • 9% prevalence of Campylobacter rectus 

Renvert et al. (2006) found that the oral bacterial load of several periodontitis‐related  pathogens  (including  P.  gingivalis,  T.  forsythia,  and  Treponema  detincola) was  associated with ACS  in  161 patients  and  in  161 matched  control  subjects. Spahr  et  al.  (2006)  showed  that  the  total  periodontal  pathogen  burden  was associated with risk of CAD with an OR of 1.92 in a sample of 263 patients with angiographically  confirmed  stable  CAD  and  526  population‐based  age‐  and gender‐matched  controls  without  a  CAD  history.  The  number  of  A. actinomycetemcomitans yielded an OR for CAD risk of 2.7.  

  32

Introduction 

Several authors (Stein et al., 2009; Andriankaja et al., 2011) suggested that P. gingivalis might  be  a  possible  link  between  oral  health  and  atherosclerosis.  In case‐control  studies, P.  gingivalis was  found  to  be  (i)  a  significant  predictor  of AMI with an OR of 13.6 (Stein et al., 2009) and (ii) associated with increased risk for MI with an OR of 1.62 (Andriankaja et al., 2011). Holmlund et al. (2011) found antibody  level  against  P.  gingivalis  related  to  MI  in  100  patients  with  MI  – compared to 100 matched controls. MI patients had impaired oral health in terms of  >4 mm PPD,  >20% BOP,  and periodontal  bone  loss  scores  on  full‐mouth X‐rays. The authors suggested that P. gingivalis might be a link between oral health and CVD.  

Yakob et al. (2011) demonstrated a relationship between periodontitis and the carotid intima‐media area (cIMA). In this case‐control study, exploratory factors for  the  increased  cIMA  values  were:  male  gender,  hypertension,  body  mass index, lower socioeconomic status, and periodontitis (OR of 4.2)  Prevalence of P. gingivalis (OR of 7.6) and of Prevotella nigrescens (OR of 4.1) was also associated with cMCA.  

In  a  study  of  20  periodontitis  and  20  atherosclerosis  patients,  Choi  et  al. (2011)  indicated  that periodontitis  (as  an  infectious disease)  could be  linked  to atherosclerosis  as  an  autoimmune  disease.  Immunoreactive  epitopes  of  P. gingivalis and heat shock protein (HSP60) were found in all 20 CAD patients (all had  signs  of  periodontitis)  who  underwent  surgical  intervention  for atheromatous plaques, compared to 30% of the 20 periodontitis patients without CAD.   

Thrombocytes activation

Bacteria can bind to the receptors of the platelets, directly or via bridging ligands. A cascade of signal leads to platelet activation and aggregation, via binding to fibrinogen in plasma. This capacity was demonstrated for bacteria such as Helicobacter pylori, Chlamydia pneumonia, and P. gingivalis, which are described most often (Fitzgerald et al., 2006). P. gingivalis causes in vitro platelet aggregation in mice (Sharma et al., 2000). P‐selectin (a marker of activated endothelial cells and thrombocytes) is enhanced in periodontitis patients. In vitro stimulation with P.gingivalis and A. actinomycetemcomitans results in P‐selectin expression on surfaces of platelets and endothelial cells (Assinger et al., 2011). The platelet‐activating factor in serum was shown to be higher in subjects with 

  33

Introduction 

periodontitis and in subjects with CAD, compared to healthy controls (Chen et al., 2010). 

Endothelial dysfunction

Higashi et al. (2008) suggested that systemic inflammation, maintained by chronic periodontitis, may be one cause of endothelial dysfunction that fosters CAD.  Compared to healthy controls, male periodontitis patients, but without known risk factors for CVD, showed endothelial dysfunction. The association between periodontitis and endothelial dysfunction was further assessed in a case‐control study that compared CAD patients with periodontitis and CAD patients without periodontitis (Higashi et al., 2009). The authors speculated that the observed difference in enhanced endothelial dysfunction in CAD patients with periodontitis may be caused by decreased nitric oxide production, which leads to impaired nitric oxide bioavailability. Mechanisms behind the observed association between endothelial function are not fully understood (Li et al., 2011). 

Systemic inflammation markers

An elevated pre‐operative CRP >3 mg/l, is a risk factor for long‐term cardiac morbidity and non‐fatal MI (Padayachee et al., 2009). C‐reactive protein (CRP) is an acute‐phase protein that is mainly synthesized by the liver in response to inflammation. CRP is a pattern recognition molecule that binds to specific molecular configurations exposed on cells during cell death or found on the surfaces on pathogens. CRP has ability to bind to phosphocoline on microbes and thus assists complement binding and phagocytosis by macrophages, as part of the innate immune response. Increasing plasma concentrations of IL‐6 (predominantly produced by macrophages) result in increased CRP levels as a response (Black et al., 2004).  

Elevated  plasma  in  systemic  inflammation  markers  (including  CRP,  Il‐6, circulating leukocytes, and neutrophils) were associated with periodontitis (Loos, 2000; Loos et al., 2005). Noack et al. (2001) found >3 mm clinical attachment loss associated with CRP ≥3 mg/l – compared to periodontally healthy controls (AL ≤2 mm) with  an  OR  of  4.0.  Accordingly,  increased  IL‐18  levels  (OR  of  6.6)  and fibrinogen (OR of 8.7) were significantly associated with periodontitis (Buhlin et 

  34

Introduction 

al., 2009). In a Monteiro et al. (2009) study, leukocyte and neutrophile counts and IL‐6  were  higher  in  periodontal  patients  than  in  controls.  In  contrast,  high‐sensitivity  serum  C‐reactive  protein  (hs‐CRP)  was  not  related  to  periodontal status in patients with MI (Persson et al., 2005). But in a systematic review from 2008 (Paraskevas et al., 2008), the authors concluded that CRP plasma levels are elevated  in  subjects with  periodontitis  –  compared  to  control  subjects without periodontitis. 

Serum lipid levels

A  higher  cholesterol  level  was  suggested  as  a  link  between  CAD  and periodontitis.  Katz  et  al.  (2001)  reported  an  association  between  severe periodontitis and hypercholesterolemia in patients with angiographic evidence of CAD or MI. Griffiths and Barbour (2010) suggested a more proatherogenic lipid profile  in  periodontitis  patients, which  consequently  promotes  increased  lipid peroxidation  and  thus  atherosclerosis.  Ligature‐induced  periodontitis  in  a  rats increased lipid peroxidation in serum (Ekuni et al., 2009). Higher serum antibody levels  against  oxLDL  occurred  in  periodontitis  patients,  compared  to  healthy controls (Monteiro et al., 2009). But in subjects with low HDL, a relationship was found between presence of deep pockets and subclinical atherosclerosis (Ylöstalo et  al.,  2010). A population‐based  study  (that  consisted  of never  smokers  only), failed  to  prove  an  association  between  serum  lipid  levels  and  periodontal infections  in normal‐weight  subjects. But  low HDL  levels were associated with periodontitis in obese subjects (Saxlin et al., 2008). 

Periodontal treatment effect on systemic inflammation

Many epidemiological studies reported a positive CAD‐periodontitis association. Inflammation  factors  related  to  CAD  are  found  in  serum  from  periodontitis patients. If this association is causal, it is conceivable that periodontitis treatment could  reduce  risk  of  CAD  or/and  risk  of  recurrence  of  CAD.  In  systematic reviews,  authors  concluded  that  periodontal  treatment  results  in  moderate reduction  of  CRP  serum  levels  (Paraskevas  et  al.,  2008)  and  that  periodontal treatment  in  systemically healthy  subjects  improves  systemic  inflammation and endothelial dysfunction (Tonetti, 2009). 

  35

Introduction 

Elevated  IL‐6,  TNF‐α,  E‐selectin,  and  D‐dimers  (a  decomposition  product from  fibrin) serum  levels could be measured between one and seven days after scaling  and  root  planning  in  patients  with  severe  periodontitis,  which demonstrates  that  periodontal  treatment  influenced  inflammation,  endothelial function, and coagulation (DʹAiuto et al., 2007).  

In a group of 18 men with AMI, oral hygiene and subgingival scaling were performed  to  measure  changes  in  systemic  inflammation  after  three  months (Montebugnoli  et  al.,  2005). A decrease was  found  for CRP  and  oxLDL  serum levels.  

Accordingly, extraction of all teeth due to severe periodontitis reduced CRP serum  levels  and  fibrinogen plus blood  cell  and platelets  counts  (Taylor  et  al., 2006). Buhlin et al.  (2009) showed an effect on several  inflammation  factors one year after successful treatment of severe periodontitis. An increased HDL serum level occurred as well as a decrease  in LDL and  lower  IL‐18 and  INF‐γ  levels. Secondary  prevention  regarding  periodontal  treatment  in  patients with  earlier CAD  events  (Offenbacher  et  al.,  2009)  reduced  high‐sensitivity  CRP  (hs‐CRP) levels in non‐obese patients with hs‐CRP >3 mg/l levels.  

Shared risk factors – confounders

CAD  and  periodontitis  share  many  risk  factors,  and  these  are  possible confounders to the association between the diseases. This fact must be considered when  evaluating  the  association  between  two  diseases.  Table  5  summarises known risk  factors  for CAD and periodontitis. Many studies support a positive correlation between CAD  and periodontitis  –  even  after  controlling  for known risk  factors. When  evaluating  validity  of  the  studies’  designs,  inclusion  and exclusion criteria are crucial.          

  36

Introduction 

Table 5. Risk factors or risk indicators associated with atherosclerosis and periodontitis.  

Risk factor Atherosclerosis Periodontitis Non- modifiable Age + + Gender + + Family history + + Race + + Modifiable Hyperlipidemia + + Obesity + + Hypertension + Dental plaque + Cigarette smoking + + Diabetes + + Infections + Psychological stress + +

 Tobacco smoking is particularly discussed, and it is known to be a causal factor 

in CAD (Bucerius et al., 2011) and periodontitis (Bergström, 2004; Martinez‐Canut et al., 1995).  

Compared  to non‐smokers,  smokers had a 2.95 higher RR  for non‐fatal MI. Risk decreased gradually over  time  in  former smokers but remained more  than 20  years  after  smoking  cessation  (Teo  et  al.,  2006).  The  observed  RR  from smoking  on periodontitis was  reported  to  be  2–4,  compared  to non‐smokers  – depending  on  numbers  of  cigarettes  per  day  (Grossi  et  al.,  1994).  Risks  for periodontitis increase if subjects smoke more than 10 cigarettes per day. Smokers tend  to  have  a  more  severe  and  wide‐spread  attachment  loss  with  deeper periodontal pockets  (Haffajee  and  Socransky,  2001).  Several possible  biological explanations  were  suggested  to  explain  the  impact  of  tobacco  smoking  on periodontitis, i.e., changed inflammatory cytokine profiles (de Heens et al., 2009) and  a  shift  toward  a  more  Th2  response  (de  Heens  et  al.,  2009).  Although smoking  is  a  shared  risk  factor,  the  CAD‐periodontitis  association  remains  in most published studies, even after controlling for the effect of smoking or in the few studies that include never smokers only. 

Diabetes  triples  the risk  for CAD  (Stamler et al., 1993) and poorly controlled diabetes  doubles  the  risk  for  periodontitis  (Grossi  et  al.,  1994).  Severe periodontitis is more prevalent in subjects with long‐duration diabetes, especially if  the  diabetes  has  caused  complications  (Thorstensson  and  Hugoson,  1993). Several  mechanisms  for  this  relationship  were  proposed.  Diabetes  affects function  of  immune  cells  such  as  neutrophiles, monocytes,  and macrophages. Chemotaxis  and phagocytosis may be  impaired,  and  an  effect of  this  could be 

  37

Introduction 

inability of the  immune response to deal with subgingival bacteria (Mealey and Oates,  2006).  Periodontitis  may  have  an  impact  on  the  metabolic  control  of diabetes, and a  correlation between periodontal health and glycemic  control  in type‐2 diabetes has been shown. In type‐1 diabetes, this is more controversial and not yet proven (Lakschevitz et al., 2011). 

Obesity and overweight constitute a considerable risk factor for CAD (Eckel and Krauss, 1998). An overall OR of 1.35 was reported for obesity as a risk factor for periodontitis (Chaffee and Weston, 2010). In a meta‐analysis (Suvan et al., 2011), odds ratios in relation to body mass index categories were: • Obesity, an OR of 1.81 • Overweight, an OR of 1.27  • Combination of obesity and overweight, an OR of 2.13.  Falagas  and  Kompoti  (2006)  suggested  that  adipose  tissue  has  an  impact  on immune  response  in  several  immune  mediators,  which  makes  subjects  more susceptible to infections.

CAD  prevalence  increases  with  age  (Ferrari  et  al.,  2012).  Periodontitis prevalence increases with age due to accumulated attachment loss over time and effects  of  aging.  In  a  group  of  well‐functioning  elderly  (ages  80+),  severe periodontitis was found in more than half of the subjects (Holm‐Pedersen et al., 2006).  It  seems  that  tooth  loss  and  bone  loss  severity  increase  with  age, independent of frequency of visits to dentists (Renvert et al., 2011). 

Male gender is a risk factor for CAD (Bucerius et al., 2011). A gender difference in  periodontitis  prevalence was  reported,  although  the  effect  is  comparatively small  compared  to other  risk  factors  (Shiau and Reynolds, 2010a). A biological explanation why men are slightly more susceptible to periodontitis than women could  be  an  effect  from  sex  steroids  on  various  immunological  parameters involved  in  inflammation,  i.e.,  inflammatory  cytokines  levels  (Shiau  and Reynolds, 2010b).  

Psychological  factors,  such  as  stress  and  coping  behaviours,  may  have  an impact on CAD and periodontitis. Anxiety has been related to recurrent events in CAD  (Grewal et al., 2011). Monteiro da Silva et al.  (1996) reported  that reduced general  immune  response  is  an  effect of  chronic psychological  stress. Negative life events, depression, and anxiety seem to be over‐represented in periodontitis patients  (Monteiro  da  Silva  et  al.,  1996; Axtelius  et  al.,  1998;  Johannsen  et  al., 2005;). Socransky and Haffajee  (1992) suggested  that psychological  factors have an effect on environmental factors that favour bacteria related to periodontitis – via the impact of psychological stress on microcirculation in gingival tissues. 

  38

Introduction 

  39

A possible  explanation  for  the  co‐existents between CAD and periodontitis may  be  a  common  underlying  genetic  background.  Polymorphism  of  the  pro‐inflammatory  cytokine  IL‐l  gene was  associated with  severe  periodontitis  and CAD  (Geismar  et  al.,  2008; Goteiner  et  al.,  2008). A  described  shared  genetic susceptibility locus on human chromosome 9p21.3 may be a start to understand the complexity of why periodontitis and CAD seems to co‐vary in the population (Schaefer et al., 2009). 

 

Rationale for the studies 

Rationale for the studies

The literature and contemporary studies suggest a CAD‐periodontitis association when  it  comes  to  clinical  and  radiological  periodontal  parameters  and inflammation,  although  at  present  the  exact  mechanisms  are  not  fully understand.  This  thesis  reports  on  studies  of  associations  between  CAD  and periodontitis.  

  40

Objectives 

OBJECTIVES

General aim The overall aim of  studies described  in  this  thesis was  to  investigate  the CAD‐periodontitis association.  Specific aims  Specific aims of the studies were to:  

• Compare periodontal conditions in patients with CAD and subjects without a history of CAD. 

 • Study whether or not periodontal status influences outcomes in known 

CAD over an 8‐year period.  

• Study whether or not concentrations and biological activity of hepatocyte growth factor in serum from patients with severe CAD differs depending on occurrence of periodontitis.  

 • Study concentrations and biological activity of hepatocyte growth factor in 

serum, saliva, and gingival crevicular fluid in healthy subjects with or without periodontitis. 

  41

Hypotheses 

HYPOTHESES

The studies’ hypotheses were:  

• Periodontal  disease  is  more  prevalent  in  patients  with  coronary  artery disease compared to subjects without CAD (I). 

 • Patients  with  CAD  and  periodontal  disease  have  worse  heart  disease 

outcomes  over  time  –  compared  to  patients without  periodontal disease (II). 

 • The biological activity of HGF is reduced in patients with CAD (III). 

 • The biological activity of HGF is reduced in patients with periodontal  disease (IV)  

  42

Material 

MATERIAL

Ethical considerations

The University of Linköping  ethics  committee  approved  the  studies’ protocols. [Dnr]  00‐103  (I),  2011/429‐32  (II),  98‐426  (III)  and  2010/307‐31  (IV).  Participants were  assured  confidentiality  of  the  collected  data  and  given  opportunities  to withdraw  from  the  studies  at  any  time.  All  participants  provided  written, informed consent. 

Selection of patients and controls

Table  6  presents  an  overview  of  the  subjects  (I–IV).  CAD  patients  (I‐III) were recruited  from  consecutive  patients  referred  to  the Department  of Cardiology, University Hospital,  Linköping,  Sweden,  for  coronary  angiography  because  of known  or  suspected  angina  pectoris  between  2000  and  2004.  Patients  were inhabitants in Östergötland or Jönköping counties with a total population about 760,000.   Table 6. Patients and controls in studies I‐IV.  Sty Patients (n) & inclusion Controls (n) & inclusion Mean age, SD

cases/controls Female (n) cases/controls

I 161. Significant coronary stenosis, who underwent PCI or CABG at cardiac clinic, University Hospital.

162. Randomly selected with no CAD history, recruited from Sweden’s population register. Matched for age, gender, community.

61± 8.9/62 ±8.8 29/29

II 126. From study I. 121. From study I. 68± 8.9/69 ± 9.0 24/20 III 36. Significant coronary stenosis

who underwent PCI. 56. Healthy blood donors, matched for age and gender.

60±7.4/59±7.3 10/15

IV 30. Severe periodontitis, systemically healthy referred to Periodontology Dept.

30. Systemically healthy, age- and gender-matched subjects without periodontitis.

55±11.6/55 ±11.8 13/13

percutaneous coronary intervention = PCI; coronary artery by‐pass graft = CABG 

  43

Material 

  44

 Exclusion  criteria  were  diabetes  mellitus,  rheumatoid  arthritis,  malignant 

diseases,  acute  infections,  and  concurrent medication with  glucocorticoids. All patients – ages ≤75, who had significant coronary stenosis,   ≥50% stenosis in the coronary  artery  lumen  in  one  or  several  of  the  coronary  arteries,  and  who subsequently underwent percutaneous  coronary  intervention  (PCI) or  coronary artery by‐pass graft (CABG)– were included consecutively.  

Control subjects (I, II) were recruited from the Swedish population database. Each control subject was matched by age, gender, and community  to one CAD patient. Controls were excluded if they had CAD or if any of the other exclusion criteria were present; the same applied to the study group. In study III, age‐ and gender‐matched healthy blood donors were  recruited as  controls  regarding  the blood analysis.  

Patients with severe periodontitis (IV) were recruited from consecutive patients referred to the Department of Periodontology, Centre for Oral Rehabilitation, Folktandvården, Östergötland, Sweden.  

Inclusion criteria were healthy subjects with chronic periodontitis. Patients were included if (i) bone loss displayed on radiographs exceeded loss of 1/3 of the root length on most teeth and (ii) deep pockets with bleeding on probing were present. They should not have received periodontal treatment at a specialist clinic.  

The control group (IV) consisted of healthy active or retired co‐workers at the Centre for Oral Rehabilitation without any signs of periodontitis – matched for age and gender.   

Methods 

METHODS

Clinical periodontal examination

Studies  I‐IV. Periodontal conditions were determined as per Lindhe and Nyman (1975). These clinical parameters were recorded: • Number of remaining teeth – number of teeth, excluding third molars. • Dental plaque – presence or absence of visible plaque at  the gingival margin 

on  four  surfaces  (buccal,  lingual,  mesial,  and  distal)  of  each  tooth corresponding to scores 2 and 3 of the plaque index system of Silness & Löe (1964), calculated in per cent of the total number of available sites (PlI%).  

• Probing pocket depth – the distance from the gingival margin to the bottom of the probed pocket, determined using a manual periodontal probe (HuFriedy PCP 11). Depth was determined to the nearest whole mm at four surfaces on each tooth. Pockets were recorded if they were 3 mm or deeper at buccal and lingual sites and 4 mm or deeper at mesial and distal sites as per Lindhe & Nyman (1975).  

• Bleeding on probing – presence of bleeding after probing at the bottom of the pocket. The percentage of the total number of sites that bled was recorded. 

Radiographic examination and periodontal disease severity rating

Studies  I‐IV.  A  set  of  full‐mouth  intra‐oral  radiographs  (I  ,II,  IV)  including bitewing  projections, was  taken  for  each  subject  using  a  standardised  parallel technique  (Eggen,  1969).  This  included  an  individualised  number  of  intra‐oral radiographs  taken with an Eggenhållare. Extra oral panoramic radiographs were taken  on  all  included CAD  patients  in  study  III.  The  alveolar  bone  level was measured (I, II) at all proximal sites in millimetres along the root surface from the cemento‐enamel  junction  (or  from  the  most  apical  part  of  an  interfering restoration)  to  the most  coronal  level  at  which  the  width  of  the  periodontal ligament space was considered normal.  

  45

Methods 

In study: I.         Two  calibrated  periodontists  took  all measurements;  the  periodontists  

  were  blinded.  Measurements  were  then  compared,  and  in  cases  of    disagreement, consensus was reached.  

  II‐IV.    The author of this thesis took all measurements   A  classification  as  per  severity  of  the  periodontal  disease  experience was 

made (I‐IV) on each subject based on clinical and radiographic findings. Criteria include a modification, including all remaining teeth, of the index by Hugoson & Jordan (1982), namely, Group:  1. Healthy or almost healthy gingival units, normal alveolar bone height, and 

≤12 bleeding units in the molar‐premolar regions.  2. Gingivitis, normal  alveolar bone height,  and  >12 bleeding gingival units  in 

the molar‐premolar regions.  3. Alveolar  bone  loss  around most  teeth,  not  exceeding  1/3  of  normal  bone 

height. 4. Alveolar bone loss around most teeth, ranging between 1/3 and 2/3 of normal 

bone height. 5. Alveolar bone  loss around most  teeth, exceeding 2/3 of normal bone height 

and presence of angular bony defects and furcation defects. 

Questionnaire

Studies  I‐IV. All subjects  filled  in a questionnaire  that covered a wide variety of items related to oral factors, general health,  lifestyle, and social environment. In study II, several questions regarding CAD were added; they are based on work by Rose et al. (1977): • Pain or discomfort in your chest (yes/no)? • Do you get this pain or discomfort when you walk uphill or hurry (yes/no)?  • Do you get this pain or discomfort when you walk at an ordinary pace on the 

level (yes/no)?  • When you get any pain or discomfort in your chest what do you do (stop or 

slow down/continue at the same pace/take nitro‐glycerine)?  

  46

Methods 

Data from hospital medical records

Studies  I‐III. Baseline data  concerning CAD diagnosis  and  treatment modalities among  CAD  patients were  taken  from medical  records  at  the  Cardiac  Clinic, University  Hospital  Linköping  (studies  I–III).  In  study  II,  data  on  the  cardiac endpoints in terms of MI or revascularisation procedures (PCI/CABG) or cardiac death  during  the  eight  years  between  baseline  periodontal  examination  and periodontal  re‐examination were  collected.  These  data  in  the medical  records were noted: chest pain, angina pectoris, non‐STEMI, STEMI, cardiac failure, new coronary  angiography,  and  treatment  with  PCI  or  CABG  or  no  invasive treatment. 

Cause of death

Study  II. After ethical approval  from the National Board of Health and Welfare, Stockholm,  cause  of  death  was  obtained  from  Sweden’s  death  index  for  all deceased subjects when death was due to CAD. 

Subgingival plaque

Studies  III and  IV. Subgingival microbial samples were collected  from  four sites, the  deepest, which  bleed  on  probing  in  each  quadrant,  or  in  healthy  subjects, from all mesial sites at  the  first premolars. Supragingival plaque was  removed, and the root surface dried by air. The bacterial sample was collected by insertion of a sterile endodontic study point into the periodontal pocket for 20 seconds and then transferred to a sterilised test tube. In study III, the presence of P. gingivalis was analyzed by PCR (Slots et al., 1994). In study IV, samples were processed in the  Department  of  Oral  Microbiology  and  Immunology,  University  of Gothenburg, Sweden and analysed for their content of 18 bacterial species, using  checkerboard DNA‐DNA hybridisation technology (Socransky et al., 1994) (IV).  

  47

Methods 

Blood, saliva, and gingival crevicular fluid samples

Studies  III  and  IV.  Peripheral  venous  blood was  collected    from CAD  patients (study III) before and after angiography and PCI (24 hours, 1 month, 6 month, 12 months) and from healthy blood donors in one occasion (controls in study III).  

In study IV, peripheral venous blood from healthy periodontitis patients and from periodontally healthy controls was collected before, three minutes after, and 20 minutes after subgingival debridement (IV). Blood samples were centrifuged, and  the  serum was collected and  stored on  ice until  frozen. Before  subgingival debridement,  five ml  of  non‐stimulated whole  saliva was  collected  (study  IV). Gingival  crevicular  fluid  (GCF) was  collected  from  four  sites  and  selected  the same way as  for  the  subgingival plaque  samples  (study  IV). The volumes were measured using  the Periotron 8000  (Oraflow  Inc, New York, U.S.A.), calibrated after the protocol as per Chapple et al. (1999).  

HGF concentration

Studies  III  and  IV. The HGF  concentration was determined using  an ELISA  kit (Quantikine Human HGF immunoassay, minimum detectable limit: 0.04 ng/mL; R&D  Systems,  Minneapolis,  MN)  as  per  manufacturer’s  instructions.  The measurements of  the  samples were performed  in duplicate at 450 nm using an ELISA reader (Expert 96; Asys Hitech GmbH, Eugendorf, Austria), and calibrated using  the  recombinant human HGF  reference  samples and  standards  that were provided in the ELISA kit. 

HGF activity

Studies  III  and  IV.  The  biological  activity  of  HGF  was  analysed  with  surface plasmon resonance (SPR) an optical technology that can determine the affinity of a  protein  for  ligands  or  epitopes  (Liedberg  et  al.,  1995,  Nayeri  et  al.,  2005). Biological activity was assessed by measuring binding affinity to HSPG (Sigma‐Aldrich,  St.  Louis,  MO,  USA)  and  the  binding  to  c‐MET  (R&D  Systems, Minneapolis, MN, USA). SPR‐based assessment of the binding profile of HGF to HSPG  may  sensitively  distinguish  HGF  variants  with  different  biological activities  and has  been used  for  evaluation  of  the  quality  of  endogenous HGF 

  48

Methods 

  49

(Nayeri  et  al.,  2008). SPR measurements  and  ligand  immobilisation procedures were  conducted  in  a  fully  automatic  Biacore  1000  instrument  (GE‐Healthcare GmbH, Uppsala, Sweden).  

Statistical analysis

The  student  T‐test  determined  significant  differences  in  normally  distributed quantitative data between  two  independent groups  (II,  IV). The Mann–Whitney test  (I,  III,  IV) was used when criteria  for T‐test was not  fulfilled. The Kruskal‐Wallis  (III,  IV) was used  to  compare means between more  than  two groups. A significance  test,  for  comparing  two  proportions  with  inclusion  of  continuity correction, evaluated differences in proportions between two groups (I, II). Data in  study  III  were  normally  distributed  after  logarithmation  and  analysed  by repeated measures  of ANOVA,  followed  by  the Neuman‐Keuls  Post Hoc  test. The  chi‐square  test determined  if  there was  an  association between  categorical variables,  i.e.,  CAD‐related  endpoints  and  periodontal  disease  experience  at baseline  (II).  Stepwise  logistic  regression  analysis  (I)  evaluated  differences between  test  and  control  groups  based  on  predictor  variables.  Results  are reported as means ± standard deviation (SD) or as medians. A p‐value <0.05 was considered to be statistically significant. To determine the number of participants in the test and control groups necessary for giving the study results significance, a power analysis with 80% power at a 5%  significance  level was performed  in pre‐study planning (I). Intra‐ and inter‐examiner reliability studies were done (I).  

SPSS® 13.0  (I,  III) or 18.0  (II,  IV) software package  (SPSS  for Windows NT 4.0, SPSS Inc., Chicago, IL) and Graph Pad Prism® V 5 (San Diego, CA) (III, IV) were used for calculations and statistical analyses.  

 

Results 

RESULTS

Study I

We  compared  periodontal  conditions  in  CAD  patients  and  healthy  matched control subjects. CAD patients had significantly fewer teeth, lower alveolar bone level,  and higher PlI%, number of  4‐6 mm PPD  and BOP%. No difference was found regarding >6 mm PPD.  Table 7. Clinical parameters for CAD patient group (n=161) and control group (n=162) at baseline and  re‐examination:  number  of  remaining  teeth, %  surfaces with  visible  plaque  at  gingival margin, BOP, number of PPDs, and mean bone level. Standard deviation noted in brackets.  Variable CAD patients,

Mean (SD) Range

Control, mean (SD)

Range p-value

No. of teeth 22.7 (5.5) 5-28 24.6 (4.1) 8-28 0.002

Plaque % 46.0 (26.0) 0-100 39.0 (21.5) 0-90 0.05 BOP % 27.0 (19.6) 0-100 21.0 (16.3) 0-68 0.009 4-6 mm PPD 14.0 (12.4) 0-68 10.7 (10.3) 0-49 0.007

>6 mm PPD 0.6 (1.7) 0-16 0.4 (1.0) 0-6 0.328 Bone level (mm) 3.0 (1.0) 1.1-7.6 2.6 (0.8) 1.0-5.9 0.0001

   Prevalence  of  severe  periodontitis  was  higher  in  patients  with  CAD  – 

compared to healthy control subjects. Twenty‐five per cent of CAD patients were categorised into periodontal disease experience groups 4 & 5, compared to 8% of controls  (Figure  3).  Percentages  without  bone  loss  (groups  1  &  2)  were  the opposite, 24% among CAD patients and 40% among controls.  

  50

Results 

Figure 3. Distribution of CAD patients and healthy controls as per periodontal disease experience group (Hugoson & Jordan 1982). 

CAD   Controln=161   n=162

8% 25%  24% 

40% 

52% 

 Groups. 1: Healthy or almost healthy gingival units, normal alveolar bone height, and ≤12 bleeding units in molar-premolar regions. 2: Gingivitis, normal alveolar bone height, and >12 bleeding gingival units in molar-premolar regions. 3: Alveolar bone loss around most teeth not exceeding 1/3 of normal bone height. 4: Alveolar bone loss around most teeth ranging between 1/3 and 2/3 of normal bone height. 5: Alveolar bone loss around most teeth exceeding 2/3 of normal bone height and presence of angular bony defects and furcation defects.

Study II

We  investigated  if periodontal status at baseline  influenced differences  in  long‐term CAD‐related outcomes. Differences in periodontal variables between the re‐examined  126 CAD patients  and  the  121  control  subjects  remained during  the eight‐year observation period. Refer to Table 8.  

CAD‐related  endpoints  (i.e., MI,  PCI,  CABG  or  death) were  found  in  26 CAD patients. Three control subjects had CAD endpoint during the observation period.  In  the  group  of  161 CAD  patients  included  at  baseline,  no  significant differences were  found regarding CAD‐related endpoints  in relation  to baseline periodontal disease experience group  (p=0.7). In  the  total sample of 323 subjects (161 CAD patients  and  162  controls)  a higher  correlation  existed, however not statistically significant (p=0.052), between periodontal disease experience groups at baseline and experienced CAD related endpoints.  Refer to Table 9.  

51% 

Group 1 + 2Group 3Group 4 + 5

  51

Results 

Table 8. Clinical parameters for CAD patient group (n=126) and control group (n=121) at baseline and re‐examination: number of remaining teeth, % surfaces with visible plaque at gingival margin, BOP scores, number of PPDs, and bone level. Standard deviation noted within brackets.   CAD baseline

n=126 Control baseline n=121

CAD re-exam n=126

Control re-exam n=121

Variable Mean (SD)

Range Mean (SD)

Range p- value*

Mean (SD)

Range Mean (SD)

Range p- value*

No. teeth 23.3 (5.2)

5–28 24.7 (4.1)

8–28 0.018 22.3 (5.8)

1-28 24.2 (4.4)

4-28 0.006

Plaque (%)

43.2 (23.7)

0–100 37.6 (21.5)

0–90 0.054 31.0 (21.0)

1-87 24.4 (18.5)

0-93 0.01

BOP (%) 24.3 (17.1)

0–82 21.0 (16.0)

0–68 0.125 12.1 (14.8)

0-69 6.6 (10.9)

0-69 0.001

4-6 mm PPD

14.2 (12.2)

0–59 10.3 (10.3)

0–49 0.008 12.7 (12.0)

0-59 9.2 (10.6)

0-70 0.016

>6 mm PPD

0.5 (1.7)

0–16 0.4 (1.0)

0–6 0.595 0.7 (2.9)

0-29 0.4 (1.8)

0-17 0.321

Bone level mm

3.0 (1.0)

1.1–6.5

2.5 (0.8)

1.0–5.9

0.001 3.0 (1.0)

1.1-5.5 2.5 (0.9)

1.0-6.5

0.042

*Student t‐test (CI 95%)  

 Table 9. Subject distribution in the periodontal disease experience index‐based groups when accounting for CAD‐related endpoints between baseline and re‐examination in (i) 26 CAD patients out of 161 at baseline and (ii) 29 subjects out of a total baseline sample of 323 subjects (161 CAD patients and 162 controls).    

Index-based groups 1 & 2 3 4 & 5 p-value*

CAD endpoints** (i)

Not CAD endpoints

5 (19.2)

33 (24.4)

14 (53.8)

75 (55.6)

7 (26.9)

27 (20.0)

ns

CAD endpoints**(ii)

Not CAD endpoints

5 (17.2)

96 (32.8)

15 (51.7)

152 (51.9)

9 (31.0)

45 (15.4)

0.052

 *The  association  between  endpoint  status  and  periodontal  disease  experience  is  tested with  Chi‐square.    Percentages of subjects are noted in parentheses/brackets.  **Coronary  artery  disease  (CAD),  myocardial  infarction  (MI),  percutaneous  coronary intervention (PCI), and coronary artery bypass graft (CABG) 

  52

Results 

Study III

We  investigated  HGF  concentration  and  biological  activity  in  relation  to periodontal  conditions  in  CAD  patients.  Before  PCI,  HGF  concentrations  in serum  were  significantly  higher  in  CAD  patients  compared  to  controls  (i.e., healthy blood donors), 1.11±0.37 ng/ml compared to 0.78±0.29 ng/ml (p<0.001). In patients  without  periodontal  bone  loss  (gingivitis  group),  HGF  concentration increased  24  hours  after  PCI,  in  parallel  with  increased  biological  activity, measured as the binding capacity to HSPG measured in response units (Figure 4). One month after PCI, biological activity peaked and thereafter, the concentration decreased  to  values  near  initial  values.  In  CAD  patients  with  periodontitis (moderate  or  severe),  only  small  fluctuations  occurred  in HGF  values,  in  the concentration and the biological activity. Observed differences in HGF biological activity between CAD patients with or without periodontitis one month after PCI was  statistically  significant,  p<0.05. No differences  in HGF  concentrations were found  among  CAD  patients  with  varying  periodontal  status  or  with positive/negative prevalence of P. gingivalis. 

  53

Results 

Figure 4. Serum concentration (HGF ng/ml) and biological activity (HSPG RU) of HGF patients with CAD before (pre), 24 hours, 1 month, 6 and 12 months after PCI intervention in relation to 

periodontal status and prevalence or no prevalence of P. gingivalis (response units=RU). Repeated ANOVA measurements were used for statistical analysis; data reported as mean ± SD. 

 

 

Pre 24 h 1 m 6 m 12 m2.2

2.4

2.6

2.8

3.0

Log

(HSP

G (R

U))

P_gingivalis neg P_gingivalis pos

Pre 24 h 1 m 6 m 12 m-0.2

0.0

0.2

0.4

Log

(HG

F (n

g/m

L))

P_gingivalis neg P_gingivalis pos

Pre 24 h 1 m 6 m 12 m-0.3

-0.2

-0.1

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Log

(HG

F (n

g/m

L))

Gingivitis Moderate periodontitis Severe periodontitis

Pre 24 h 1 m 6 m 12 m2.0

2.2

2.4

2.6

2.8

3.0

3.2

3.4

Log

(HSG

P (R

U))

Gingivitis Moderate periodontitis Severe periodontitis

  54

Results 

Study IV

We  investigated  the  concentration  and  biological  activity  of HGF  in medically healthy  subjects  with  periodontitis.  Periodontal  patients  showed  increased concentrations  of HGF  (compared  to  periodontally  healthy  controls)  in  saliva (p<0.001), in GCF (p<0.0001), and in serum (p<0.001) samples.  

The  serum  concentration  of HGF  did  not  differ  between  sampling  times (collected before, 3 minutes, and 20 minutes after subgingival debridement).  

The biological activity of HGF measured as the binding affinity to HSPG and c‐MET was significantly reduced in saliva (p<0.0001) and GCF samples (p<0.0001 for HSPG and p<0.01 for c‐MET) from the periodontitis patients, compared to the healthy controls. In serum samples, no significant differences were found  in the binding affinity to HSPG, while the c‐MET binding were increased in the patient group (p<0.05) 3 minutes after subgingival debridement.  

Figure  5  displays  an  overview  of HGF  concentrations  (HGF  (ng/ML)  and biological activity via HSPG binding (RU) and c‐MET binding (RU). 

The  amount  and  frequency  distribution  of  periodontal  pathogens  were higher  in patients with  severe periodontitis –  compared  to healthy  subjects  (p< 0.01).  

All  patients  (100%)  had  one  or  several  of  the  12  studied  bacteria  species associated  to  periodontitis  that  were  analysed  from  subgingival  plaques  – compared  to 60% of  the healthy controls. No differences were  found  regarding HGF  concentration  and  the  binding  affinity  to  c‐MET  and  HSPG  as  per prevalence of the 12 studied periodontal pathogens.  

  55

Results 

Figure 5. HGF concentrations (HGF ng/ml) and HGF biological activity, HSPG (HSPG (RU) and c‐MET binding (c‐MET (RU)); in serum, saliva and gingival crevicular fluid in patients with 

severe periodontitis (n=30) and periodontally healthy controls (n=30). 

Serum 

HG

F (n

g/m

l)

before

3 min

20 m

in0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4 healthypatients

*** ** **

HSP

G b

indi

ng (R

U)

before

3 min

20 m

in0

50

100

150

200 healthy controlspatients

c-M

et b

indi

ng (R

U)

before

3 min

20 m

in0

100

200

300

400 *

 Saliva 

HG

F (n

g/m

l)

health

y

patien

ts0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0***

HSP

G b

indi

ng (R

U)

health

y

patien

ts0

100

200

300

400****

c-M

et b

indi

ng (R

U)

contro

ls

patien

ts0

100

200

300

****

... Figure 5 continued on next page. 

  56

Results 

Figure 5 continued . . .  Gingival crevicular fluid 

HG

F (n

g/m

l)

health

y

patien

ts0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

****

HSP

G b

indi

ng (R

U)

health

y

patien

ts0

20

40

60

80

100

****

c-M

et b

indi

ng (R

U)

health

y

patien

ts0

20

40

60

80

100

**

  The concentration of HGF (ng/ml)  in   saliva (A), gingival crevicular fluid (GCF) (B) and serum (C) measured with  ELISA,  and  the  binding  affinity  to  the HGF  receptors  heparan  sulphate proteoglycan  (HSPG)  (D,  E  and  F)  and  c‐Met  (G,  H  and  I)  analysed  by  surface  plasmon resonance  (RU)  in patients with  severe periodontitis  (patients)  and healthy  controls  (control). Kruskal‐Wallis and Mann‐Whitney U‐test was used for statistical analysis and the medians are presented. 

****p<0.0001, ***p<0.001, **p<0.01, * p<0.05. 

  57

Discussion 

DISCUSSION

The  main  findings  reported  in  this  thesis  support  the  CAD‐periodontitis association. There is a significant difference in CAD between individuals with and without periodontitis. However, high prevalence of  severe periodontitis in CAD patients unchanged during an eight year follow‐up, did not influence CAD  outcomes  (I,  II).  One  factor  involved  in  wound  healing  and  tissue regeneration,  namely,  the  hepatocyte  growth  factor  (HGF)  seems  to  be  of importance  in  these  patient  categories  (III,  IV).  As  in  other  chronic inflammations  (Nakamura  and  Mizuno,  2010),  HGF  concentrations  were higher  in CAD  patients  (III)  and  in  patients with  severe  periodontitis  (IV). HGF‐reduced biological activity in CAD patients with periodontitis (III) might indicate  that periodontitis  and/or CAD have  an  impact on healing potential and  could  be  one  of  the  mechanisms  in  the  association  between  the  two diseases.  

In study I, CAD patients had severe periodontitis more often compared to subjects  without  CAD;  this  is  aligned  with  findings  in  other  case‐control studies  (Geerts  et  al.,  2004; Montebugnoli  et  al.,  2004;  Renvert  et  al.,  2004; Buhlin et al., 2005; Geismar et al., 2006; Buhlin et al., 2011), and it strengthens the epidemiological finding that CAD and periodontitis seem to be covariates in the population. In study I, 25% of the CAD patients had severe periodontitis compared  to  8%  of  the  controls,  which  in  the  CAD‐group  is  a  higher prevalence compared to the reported prevalence of periodontitis in the general Swedish population ages 40+ (Hugoson et al., 2008). The relative low number of  subjects  with  severe  periodontitis  among  control  subjects  in  study  I, compared  to  prevalence  reported  in  another  study  (Hugoson  et  al.,  2008), might reflect the effect from chance but could also reflect the inclusion criteria.  Subjects  in  study  I  had  to  be  free  from  a  history  of  CAD  and  from  other inflammation‐related  diseases.  The  exclusion  criteria were  selected  to  avoid confounding from diseases known to have impact on CAD and periodontitis. The study I control group could be seen as medically healthier than the general population  in  the  same age  category because  exclusion  criteria  in  the group were  (i)  diabetes,  rheumatoid  arthritis,  malignancy,  and  (ii)  intakes  of corticosteroid  drugs.  This might  explain why  these  subjects  also  had  better periodontal  health  compared  to  the  general  Swedish  population.  Periodontitis, however, might have a larger impact on CAD‐related disease if the CAD patients also have diabetes.  

  58

Discussion 

We did not exclude smokers (I, II, III, IV), although smoking is one of the major risk factors for CAD and periodontitis (Bucerius et al., 2011; Bergström, 2004). The power analysis (I) was based on CAD and periodontitis prevalence in  the  general  population,  including  smokers.  A  study  on  never  smokers would  have  been preferable  but  in  that  case,  the  time period  for  recruiting subjects would  have  to  be  longer  than  the  actual  three  years  and  a  larger sample size would be required.  

Effects  from severe periodontal disease on CAD patients were studied  in logistic regression analysis adjusted for age and smoking. An OR of 5.74 (2.07‐15.90) was  found  for  CAD  patients  –  compared  to  controls  in  periodontal disease  groups  4  and  5,  which  indicates  that  severe  periodontitis  at  least doubles risk for CAD. This finding is aligned with an overall OR of 2.22 (1.59‐3.117) reported  for case‐control studies (Bahekar et al., 2007), and  it supports the relevance of studying periodontitis in relation to CAD. 

Results  from  study  I  (case‐control design)  apply only  to  the  investigated groups, so comparison with other groups is problematic. However, study I has strength. All CAD patients had documented significant stenosis with at  least 50% occlusion of the coronary artery (confirmed by coronary angiography). A specialist  in  cardiology  recruited  the  patients.  Two  experienced  calibrated periodontists  did  the  periodontal  examinations  and  ratings,  and  an  inter‐examiner  study  (I)  showed  kappa  values  by  87%  and  intra‐examiner  high reproducibility over 90% (I). 

Periodontal  disease  severity  was  based  on  alveolar  bone  level  on radiographs and on clinical periodontal variables. These  findings are aligned with  other  studies  (Renvert  et  al.,  2004; Buhlin  et  al.,  2005):    higher  overall alveolar bone loss, higher numbers of 4‐6 mm periodontal pockets and higher BOP scores among CAD patients.  

The observed differences in periodontal disease prevalence and severity in study I was consistent over time (II). If the follow‐up period had been longer, CAD  outcome might  have  been  different,  because  periodontitis  cases most often progresses slowly. Reduced plaque and gingivitis  levels might  indicate that all examined  subjects were  informed about  their periodontal  status and that recommendations about suitable treatments were given. 

The  number  of  teeth  (or  number  of  lost  teeth)  has  been  suggested  as  a predictor associated with CAD (Buhlin et al., 2005; Holmlund et al., 2006; Tu et al., 2007; Holmlund et al., 2010).  In studies  I and  II, a difference  in number of teeth was  observed  between  CAD  patients  and  controls  at  baseline  and  at eight‐year, follow‐up examinations (p=0.002 in study I and p=0.006 in study II). 

  59

Discussion 

But  the number of  teeth was not related  to CAD  in  the multivariate analysis (I).  

In  study  I,  subjects had higher numbers  of preserved  teeth  compared  to findings  in  cross‐sectional  studies  that  reported  an  association  with  CAD (Morrison et al., 1999; Elter et al., 2004;  Tu et al., 2007). 

Holmlund et al.  (2010)  investigated whether or not oral parameters were associated with future CVD death (median follow‐up time of 12 years). Their study  included  subjects with periodontal disease  and  random  subjects  from the general population (ages 20–89), which is a wider range than study I. 

The  dose‐dependent  association  between  number  of  teeth  and  overall death  and CAD‐related death  reported by Holmlund  et  al.  (2010)  remained significant  after  adjustment  for  age,  gender,  and  smoking,  although  no association was  found  in  terms of periodontal variables.   Loss of  teeth might be  an  effect  of  periodontitis,  but  tooth  loss  can  obviously  occur  for  other reasons, e.g., caries and related complications. A  low number of  teeth on  the individual level might be due to socioeconomic and lifestyle factors or perhaps subjects do not have equal preventive dental care opportunities. 

The main purpose  of  study  II was  to  investigate CAD‐related morbidity and mortality  in  terms of myocardial  infarction,  revascularisation  treatments or CAD‐related death (CAD endpoints) and periodontal disease. Results from study  II did not  show  significant association  in  the CAD patient group with baseline periodontal status and CAD‐related endpoints, which is in contrast to results reported by Renvert et al. (2010). The finding in our study might reflect a  result  from  successful  treatment  of  CAD  and  CAD  prevention  and  an improved periodontal health. 

In study II, death due to CAD was confirmed from data in Sweden’s death index. MI, PCI, and CABG events that afflicted the re‐examined subjects were recorded  from medical  records  from  the  cardiac  clinics. Out  of  the  baseline sample of 161 CAD patients and 162 control subjects, 126 CAD patients and 121  control  subjects were  periodontally  re‐examined.  These  are  fairly  high proportions considering the follow‐up occurred eight years after baseline and a subject could be up  to age 75 at  inclusion. The overall number of deceased subjects  at  the  time  for  re‐examination was  35  (mean  age  at death was  66.7 years,  range 51–75).  Interestingly, 30 out of  the 35 deceased subjects showed periodontitis at baseline: 23 (66%) had moderately advanced periodontitis and 7 (20%) had severe periodontitis.  

Subjects, who withdrew from study II, did not attend re‐examinations for a range  of understandable  reasons,  e.g., work,  travel,  or  illness not  related  to 

  60

Discussion 

CAD. Even so,  the withdrawals could have  influenced  results. With a  larger sample size or a longer follow‐up period, results might have been different.    

Interestingly,  a  tendency  was  found  in  CAD‐related  endpoints  and periodontal  disease  in  the  total  baseline  sample  of  323  subjects  (161  CAD patients  and  162  control  subjects  (p=0.052).  I.e.,  quite  many  subjects  with severe  periodontitis  (groups  4  and  5)  were  afflicted  by  a  CAD‐related endpoint,  compared  to  subjects who had moderate or no periodontitis. This might indicate that periodontal disease might be used as a predictor for CAD in the future. In Sweden, a high proportion of the population regularly visits a dentist, so one could speculate that diagnosis of periodontitis might be used as a  marker  for  increased  CAD  risk.  If  future  studies  definitely  prove  that periodontitis is a true risk factor for CAD, the periodontitis treatment may be a part in CAD prevention. 

Studies  have  reported  a  CAD‐periodontitis  association  (Bahekar  et  al.,  2007)  but  understanding  of  the mechanisms  behind  it  is  only  in  a  nascent phase.   We might  speculate  on ways  in which  periodontitis might  trigger CAD.  Inflammatory  response  to  subgingival  microbiota  is  a  defence  and wound‐healing mechanism.  In  periodontitis  patients,  these  responses  vary, compared to subjects without periodontitis, because tissue destruction exceeds regeneration  (Kinane  et  al.,  2011). CAD pathogenesis  is  complex  and  in  the worst cases,  inflammatory processes cause  ruptures of  the  fibrofatty plaques or superficial erosion in the walls of the coronary arteries (Libby, 2008).  

Studies III and IV studied HGF, a multifunctional healing factor involved in repair and regeneration of various tissues and organs (Nakamura et al., 2011). HGF  is  also  associated  with  CAD  (Soeki  et  al.,  2000).  CAD  patients  (III) showed  higher  serum  concentrations  of HGF  compared  to  age‐  and‐gender matched healthy blood donors  (p<0.001), which  is aligned with other studies (Watanabe et al., 2001). High concentration of HGF is known to reflect chronic inflammation  (Funakoshi  and  Nakamura,  2003)  but  the  HGF  must  be biologically active  to  induce healing. HGF  is produced as an  inactive single‐chain molecule  that  is  subsequently  converted  into  a  two‐chain, biologically active heterodimer (Mars et al., 1993). This  is most essential because only the biologically activated HGF induces, e.g., mitogenesis and motility of the target cells.  In addition,  the biological activity of HGF depends on HGF  interaction with  its  c‐MET  receptor,  through  binding  to  the  heparan  sulphate proteoglycan  (HSPG)  co‐receptor  (Rubin  et al., 2001). The  c‐MET  receptor  is expressed on epithelial, endothelial, and mesenchymal cells (Nakamura et al.,  2011), and HSPG is present on the cell surface in essentially all tissues and in 

  61

Discussion 

the  extracellular matrix  (Nakamura  et  al.,  1986).  So  analysing  the  binding affinity to HSPG and c‐MET reflects the biological activity of HGF.  

In study III, the binding affinity to HSPG (one month after PCI) increased in  CAD  patients  without  alveolar  bone  loss  but  was  unchanged  in  CAD patients with  periodontitis  (moderately  advanced  or  severe).  This  indicates that CAD patients with periodontitis had high concentration of HGF but that the biological activity as a response to PCI was lower.  This might indicate that in chronic inflammatory conditions (here, periodontitis), the binding affinity to HSPG is decreased, possibly via proteolytic cleavage and thus inactivation of HGF. When  the  interaction with  the  receptor  is  disabled,  then  this  causes elevated circulatory HGF levels (Liu et al., 1997). The PCI performed in CAD patients  (III) might  temporarily  open  the  occluded  vessel  and  improve  the blood flow but might not change the  inflammatory process of atherosclerosis in the vessel wall. These observations support the role of chronic inflammation in CAD pathophysiology.   

Since HGF concentrations were higher – but the biological activity tended to be lower in patients with CAD and periodontitis compared to CAD patients without periodontitis – we studied  the effect on HGF  from periodontitis per se,  in  otherwise medically healthy  subjects  (study  IV). The  concentrations  of HGF were  significantly  higher  in  saliva  (p<0.001),  gingival  crevicular  fluid (GCF)  (p<0.0001),  and  serum  (p<0.001)  in  periodontal  patients  compared  to control  subjects  without  periodontitis.  The  high  concentrations  of  HGF  in saliva and gingival crevicular fluid are aligned with results from other studies (Rudrakshi et al., 2011). The high serum concentrations of HGF might reflect the systemically inflammatory impact from periodontitis. Subjects in study III were  included  only  if  having  no  of  the  diseases  and  medications  in  the exclusion  criteria  i.e.  diabetes  mellitus  or  rheumatoid  arthritis,  and  this support the observed differences.    Although  the  concentration  of  HGF  was  increased  in  periodontitis patients, the binding affinity to HSPG and c‐MET in saliva (p<0.0001) and GCF samples  (p<0.0001  for HSPG  and  p<0.01  for  c‐MET) was  reduced  (IV).  This ought to negatively influence wound healing and regeneration, at least locally in the periodontal tissues but may also have a systemic effect. Because healing is  essential  in  periodontitis  patients,  one  might  expect  that  periodontitis patients should have higher biological activity of HGF in serum. Interestingly, no significant differences were found in the binding affinity of HSPG between subjects with or without periodontitis, although a difference between patients and controls in the c‐MET binding (as a response to subgingival debridement) was measured 3 minutes after debridation  (p<0.05). This  indicates an  instant 

  62

Discussion 

systemic  response  to  this  treatment.  Future  research  needs  to  find  out  if periodontitis  treatment  has  an  impact  on  the  biological  activity  of HGF  in terms  of  increasing  the  activity  and  thereby  improving wound  healing  and tissue  regeneration.  This might  be  of  importance  in  the  CAD‐periodontitis association.   Periodontitis  causes  a  systemic  inflammation,  in  terms  of  inflammatory increased serum levels of inflammatory factors such as CRP, Il‐1, Il‐6, TNF‐ γ etc. (Tonetti, 2009) as a response to subgingival micorbiota. This might have an impact  on CAD‐related  inflammatory processes. High HGF  levels  in  serum (III,  IV)  might  be  an  effect  from  locally  produced  HGF  and/or  produced systemically,  because  bacteria  and  bacterial  products  associated  with periodontitis  induce  inflammatory  mediators  (Teles  and  Wang,  2011). Periodontal  patients  (IV)  had  higher  prevalence  of  periodontitis‐associated microbes than periodontally healthy control subjects. This was not unexpected because  the  patient  group  consisted  of  subjects  with  untreated  severe periodontitis with deep periodontal pockets.  Subgingival plaque  samples  in our study were collected from the deepest pocket with bleeding on probing in each  quadrant  and  the  samples  were  pooled.  We  had  expected  higher proportions of some of the analysed species. P. gingivalis was found in 53% of the  periodontal  patients.  This  is  equal  to  the  prevalence  reported  for  P. gingivalis on site level (Preus et al., 1995).  

Presence  of  P.  gingivalis  in  the  subgingival  samples  in  study  III  was analysed using PCR (Slots et al., 1995) – a technology with high sensitivity. In study IV, prevalence of 12 periodontal pathogens and 6 complementary species were  analysed  using  checkerboard  DNA‐DNA  hybridisation  technology (Socransky et al., 1994), a method that uses DNA probes for multiple species.  This method  is  reported  to give high  sensitivity but  the  specificity might be impaired due  to cross‐reactions between species  (Socransky et al., 2004). The selected methods may  detect  prevalence  of  included  species  and  thus  the found prevalence might be correct, although the results are confusing. 

No differences  in serum HGF concentration were  found  in CAD patients with  or  without  P.  gingivalis  (study  III).  Nor  did  the  concentration  or  the binding affinity  to c‐MET and HSPG differ according  to prevalence of  the 12 studied periodontal pathogens in subjects with or without periodontitis (study IV). Uehara  et  al.  (2005)  proposed  P.  gingivalis  gingipain  to  stimulate HGF production  from gingival  fibroblasts but  in our  studies, P. gingivalis did not differentiate HGF  concentrations  found  in  saliva  and GCF  (study  IV)  or  in serum (studies III, IV). Other factors from periodontitis or other species and/or complexes  of  species  not  studied  might  have  a  higher  impact  on  HGF 

  63

Discussion 

concentrations  and  biological  activity  than  P.  gingivalis.  In  larger  study populations, effects from P. gingivalis or other species or complexes of species, may also be more distinct.  

In  all  our  studies,  tobacco  use  is  a  confounding  factor  that  should  be considered.  Smoking  habits  (including  previous  smoking)  were  more prevalent  among  CAD  patients  (I,  II)  and  among  periodontal  patients  (IV) compared  to  subjects  in  the  control  groups,  and  this  might  influence  the results.  HGF  concentrations  have  been  positively  associated  with  smoking (Yamamoto et al., 2001; Lieb et al., 2009), but the impact from smoking on the biological  activity  of  HGF  remains  unclear.  Other  factors  reported  to  be associated with HGF  concentrations  are  age,  female  sex,  diastolic  BP,  anti‐hypertensive  treatment,  diabetes,  triglycerides,  BMI,  and  an  inverse association with HDL  cholesterol  (Lieb  et  al.,  2009).  Subjects with  diabetes were excluded from the study populations (I‐ IV). In study III, higher numbers of CAD patients were male. In studies I, II and IV, the included subjects were matched  for  age  and gender  and  thus  influence  from  these  factors ought  to have had lower impact. Factors not analysed in our studies, such as BMI and serum  cholesterol  levels,  might  have  had  an  impact  on  the  results.  CAD patients (I, II, III) were almost all put on statins as a routine treatment before PCI, but it would have been most valuable if serum cholesterol levels had been measured before the start of this medication.  

Another  shortcoming  in  study  I  and  II was  that general health  status  in control subjects was self‐reported. To confirm no CAD in the control group, it would have been preferable to do coronary angiography, but this could not be done  for practical and ethical  reasons. Analysing  inflammatory mediators  in serum  samples  from CAD patients and  controls  in  study  I would have been most valuable, but  the  study was designed  in 2000, when knowledge of  the CAD‐periodontitis association was more limited.   The results reported in this thesis support a CAD‐periodontitis association. CAD  patients  demonstrated  significantly  higher  periodontal  disease prevalence  and  severity  than  individuals  without  CAD,  but  there  was  no significant association between periodontal disease‐CAD outcomes during the eight‐year  follow‐up.  The  impact  from  periodontitis  on HGF  and  its HSPG and  c‐MET  receptors,  and  the  effect  of  periodontal‐associated  bacteria  on biological activity of HGF and  the proposed  effect on CAD must be  further studied. Nevertheless,  our  results may  have  an  impact  on  future  strategies when  it  comes  to  CAD  diagnosis,  evaluation,  prevention,  and  treatment. Studies that strive to acquire more knowledge about CAD – one of the major causes  of  disease  and  premature  death  in  the  industrial world  –  are  very 

  64

Discussion 

  65

important,  because  known  risk  factors  cannot  explain  all  cases  and  thus knowledge of the potential role that periodontitis plays is crucial. Just  like  other  inflammation‐related diseases,  periodontal disease  should  be considered a factor in CAD development. The oral cavity is an important part of the human body, and oral health should be accounted for in CAD research. The  importance  of  healthy  periodontal  tissues  and  effects  from  periodontal treatment  on  systemic  inflammation  and  its  effect  on CAD must  be  further studied.  

Conclusions 

CONCLUSIONS

Main conclusions from the studies were: • CAD patients appears more often  to have severe periodontitis when  it 

comes  to  deep  pockets,  bleeding  after  pocket  probing,  and  on radiographs, overall alveolar bone loss that exceeds one‐third of the root length  –  compared  to  subjects without  CAD.  Subjects without  CAD‐related complaints were more often periodontally healthy (I). 

 • In  the  long  run,  periodontitis  is more prevalent  in CAD  patients. No 

differences in CAD endpoints in relation to baseline periodontal status, was observed among the CAD patients during the eight‐year follow‐up (II). 

 • CAD patients with periodontitis had higher HGF serum concentrations 

compared to CAD patients without periodontitis. A tendency was found for  lower HGF  biological  activity  in CAD  patients with periodontitis, which indicates that periodontitis has a systemic effect (III). 

 • Healthy  subjects  with  severe  periodontitis  had  higher  HGF 

concentrations in serum, saliva, and gingival crevicular fluid, compared to  healthy  subjects  without  periodontitis,  which  indicates  that periodontitis triggers local and systemic effects. HGF biological activity was decreased  in  saliva  and  gingival  crevicular  fluid  in  subjects with periodontitis (IV).  

  66

Acknowledgments 

ACKNOWLEDGEMENTS

I express my sincere gratitude to all who supported and helped me during the years of work with this thesis. In particular, I thank:  Arina  Richter, Associate  Professor, my  supervisor,  and  true  friend without whom this work would not have been possible. Thank you for giving me the opportunity  to  participate  in  the  research  field,  for  introducing me  to  the medical world of CAD, for guiding me thorough science, and for sharing your great knowledge at any time during the day.  Nils  Ravald,  Odont  Dr,  my  co‐supervisor,  role  model  within  the  field  of periodontology, and my true friend. Thank you for your patience, carefulness, for wise  scientific  guidelines,  and  for  always  having  time  for  inspiring  and pleasant discussions.   Johanna  Lönn,  my  co‐author  and  dear  friend.  Thank  you  for  excellent, pleasant  collaboration  in  studies  III  and  IV.  I  look  forward  to  future collaboration.  Åsa Lundström and Helene Thorstensson, Associate Professor, co‐writers and my  female periodontitis colleagues and  friends  for  inspiring collaboration  in study I.   Torbjörn Bengtsson, Professor and Faribah Nayeri, Associate Professor, my co‐ authors –  for your sources of  inspiration  in  studies  III and  IV.  I  learned a  lot from you.  Christos Pagonis, Hanna Kälvegren, Ph.D., Caroline Skoglund, Ph.D., my co‐authors for inspiring collaboration in various medical field areas.  Gun Nilsson, my dental nurse, research patient co‐ordinator, and dear friend for your loyalty and excellent way of recruiting and taking care of the patients.   All patients who participated in the studies.    

  67

Acknowledgements 

  68

Raimo  Pälverinne,  head  of  Folktandvården  Östergötland  for  giving  the opportunity and encouragement to pursue research.  All  my  colleagues  and  friends  at  the  Centre  for  Oral  Rehabilitation Östergötland  for  support and encouragement. To Simon Dahlgren, my boss, for giving me time to work with this thesis and to Kerstin Cannerborg, Centre co‐ordinator for administrative help.  Birgit Ljunquist, Ph.D., for excellent statistical analysis and advises, I  learned so much from you.  Judy Petersen, Ph.D., for rigorous copy editing.  Pernilla Larsson Gran, Odont Dr, my soul‐sister, for supporting me, giving me advice in the research area, and most of all, for your true friendship.   My  friends  in Vadstena and Motala  throughout  the years: Families Carlund, Ingman, Nordström, Svensson, and Wennman for all time we spent together.  My brothers, Mats and Magnus, always there.  My parents, Lars and Ulla for your love and support throughout life.  My family Pelle, my husband and  life companion, for your  love and patience during all my  years  of  education.  I  look  forward  to meeting  the  spring with  you  in Eneby.  Greta, for being such a lovely daughter and for your excellent assistance with the illustrations in this thesis.  Olle, for being such a lovely son and for your honest interest in my research. 

References  

  

69

REFERENCES

Andriankaja  O,  Trevisan  M,  Falkner  K,  Dorn  J,  Hovey  K,  Sarikonda  S,  et  al. Association  between  periodontal  pathogens  and  risk  of  nonfatal  myocardial infarction. Community Dent Oral Epidemiol 2011; 39: 177‐185.  Arbes  SJ,  Jr.,  Slade  GD,  Beck  JD.  Association  between  extent  of  periodontal attachment loss and self‐reported history of heart attack: an analysis of NHANES III data. J Dent Res 1999; 78: 1777‐1782.  Assinger  A,  Buchberger  E,  Laky  M,  Esfandeyari  A,  Brostjan  C,  Volf  I. Periodontopathogens  induce  soluble  P‐selectin  release  by  endothelial  cells  and platelets. Thromb Res 2011; 127: 20‐26.  Axtelius B,  Söderfeldt B, Nilsson A, Edwardsson  S, Attström R. Therapy‐resistant periodontitis. Psychosocial characteristics. J Clin Periodontol 1998; 25: 482‐491.  Baelum  V,  Fejerskov  O,  Karring  T.  Oral  hygiene,  gingivitis  and  periodontal breakdown in adult Tanzanians. J Periodontal Res 1986; 21 :221‐232.  Bahekar AA, Singh S, Saha S, Molnar  J, Arora R. The prevalence and  incidence of coronary heart disease is significantly increased in periodontitis: a meta‐analysis. Am Heart J 2007; 154: 830‐837.  Beck  J,  Garcia  R,  Heiss  G,  Vokonas  PS,  Offenbacher  S.  Periodontal  disease  and cardiovascular disease. J Periodontol 1996; 67(Suppl 10): 1123‐1137.  Beck JD, Elter JR, Heiss G, Couper D, Mauriello SM, Offenbacher S. Relationship of periodontal disease to carotid artery intima‐media wall thickness: the atherosclerosis risk in communities (ARIC) study. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2001; 21: 1816‐1822.  Bergström  J.  Tobacco  smoking  and  chronic  destructive  periodontal  disease. Odontology 2004; 92: 1‐8.  Bernimoulin  JP.  Recent  concepts  in  plaque  formation.  J Clin  Periodontol  2003;  30 (Suppl 5): 7‐9.  Billings F. Focal Infection as the Cause of General Disease. Bull N Y Acad Med 1930; 6: 759‐773.  

References 

 

  70

Black S, Kushner I, Samols D. C‐reactive Protein. J Biol Chem 2004; 279: 48487‐48490.  Bostanci  N,  Belibasakis  GN.  Porphyromonas  gingivalis:  an  invasive  and  evasive opportunistic oral pathogen. FEMS Microbiol Lett 2012; 333: 1‐9.  Bruschke AV, Kramer  JR,  Jr., Bal  ET, Haque  IU, Detrano RC, Goormastic M.  The dynamics of progression of coronary atherosclerosis studied in 168 medically treated patients who underwent coronary arteriography  three  times. Am Heart  J 1989; 117: 296‐305.  Bucerius  J, Duivenvoorden  R, Mani V, Moncrieff C,  Rudd  JH, Calcagno C,  et  al. Prevalence  and  risk  factors  of  carotid vessel wall  inflammation  in  coronary  artery disease patients: FDG‐PET and CT imaging study. JACC Cardiovasc Imaging 2011; 4: 1195‐1205.  Buhlin  K,  Gustafsson  A, Ahnve  S,  Janszky  I,  Tabrizi  F,  Klinge  B. Oral  health  in women with coronary heart disease. J Periodontol 2005; 76: 544‐550.  Buhlin  K,  Gustafsson  A,  Håkansson  J,  Klinge  B.  Oral  health  and  cardiovascular disease in Sweden. J Clin Periodontol 2002; 29: 254‐259.  Buhlin  K,  Hultin  M,  Norderyd  O,  Persson  L,  Pockley  AG,  Pussinen  PJ,  et  al. Periodontal  treatment  influences  risk markers  for  atherosclerosis  in  patients with severe periodontitis. Atherosclerosis 2009; 206: 518‐522.  Buhlin K, Hultin M, Norderyd O, Persson L, Pockley AG, Rabe P, et al. Risk factors for atherosclerosis in cases with severe periodontitis. J Clin Periodontol 2009; 36: 541‐549.  Buhlin K, Mäntylä P, Paju S, Peltola JS, Nieminen MS, Sinisalo J, et al. Periodontitis is associated with angiographically verified coronary artery disease. J Clin Periodontol 2011; 38: 1007‐1014.  Bussolino  F,  Di  Renzo MF,  Ziche M,  Bocchietto  E,  Olivero M,  Naldini  L,  et  al. Hepatocyte growth factor is a potent angiogenic factor which stimulates endothelial cell motility and growth. J Cell Biol 1992; 119: 629‐641.  Cecil RL. Focal Infection‐Some Modern Aspects. Cal West Med 1934; 40: 397‐402.  Cecil  RL. Gold  Therapy  in  Rheumatoid Arthritis.  Trans Am  Clin  Climatol Assoc 1940; 56: 187‐98.  

References  

  

71

Chaffee  BW,  Weston  SJ.  Association  between  chronic  periodontal  disease  and obesity: a systematic review and meta‐analysis. J Periodontol 2010; 81: 1708‐1724.  Chapple IL, Landini G, Griffiths GS, Patel NC, Ward RS. Calibration of the Periotron 8000 and 6000 by polynomial regression. J Periodontal Res 1999; 34: 79‐86.  Chen H, Zheng P, Zhu H, Zhu  J, Zhao L, El Mokhtari NE, et al. Platelet‐activating factor  levels  of  serum  and  gingival  crevicular  fluid  in  nonsmoking  patients with periodontitis and/or coronary heart disease. Clin Oral Investig 2010; 14: 629‐636.  Choi  J, Lee  SY, Kim K, Choi BK.  Identification  of  immunoreactive  epitopes  of  the Porphyromonas gingivalis heat shock protein  in periodontitis and atherosclerosis.  J Periodontal Res 2011; 46: 240‐245.  Clark. The Molecular and Cellular Biology of wound repair. New York and London: Plenum Press; 1996. p. 3‐49.  Conway K, Price P, Harding KG,  Jiang WG. The molecular  and  clinical  impact  of hepatocyte growth  factor,  its  receptor, activators, and  inhibitors  in wound healing. Wound Repair Regen 2006; 14: 2‐10.  Conway  K,  Ruge  F,  Price  P,  Harding  KG,  Jiang WG.  Hepatocyte  growth  factor regulation: an  integral part of why wounds become  chronic. Wound Repair Regen 2007; 15: 683‐692.  DʹAiuto F, Parkar M, Tonetti MS. Acute effects of periodontal therapy on bio‐markers of vascular health. J Clin Periodontol 2007; 34: 124‐129.  Darveau  RP,  Tanner  A,  Page  RC.  The  microbial  challenge  in  periodontitis. Periodontol 2000 1997; 14: 12‐32.  de Heens GL, Kikkert R, Aarden LA, van der Velden U, Loos BG. Effects of smoking on the ex vivo cytokine production in periodontitis. J Periodontal Res 2009; 44: 28‐34.  de  Oliveira  C,  Watt  R,  Hamer  M.  Toothbrushing,  inflammation,  and  risk  of cardiovascular disease: results from Scottish Health Survey. BMJ 2010; 340: c2451.  DeStefano F, Anda RF, Kahn HS, Williamson DF, Russell CM. Dental disease  and risk of coronary heart disease and mortality. BMJ 1993; 306: 688‐691.  Desvarieux M, Demmer RT, Rundek T, Boden‐Albala B,  Jacobs DR,  Jr., Papapanou PN,  et  al. Relationship  between periodontal disease,  tooth  loss,  and  carotid  artery 

References 

 

  72

plaque:  the  Oral  Infections  and  Vascular  Disease  Epidemiology  Study  (INVEST). Stroke 2003; 34: 2120‐2125.  Desvarieux M, Demmer RT, Rundek T, Boden‐Albala B, Jacobs DR, Jr., Sacco RL, et al.  Periodontal microbiota  and  carotid  intima‐media  thickness:  the Oral  Infections and Vascular Disease Epidemiology Study (INVEST). Circulation 2005; 111: 576‐582.  Desvarieux M,  Schwahn C, Volzke H, Demmer RT, Ludemann  J, Kessler C,  et  al. Gender differences  in  the  relationship between periodontal disease,  tooth  loss, and atherosclerosis. Stroke 2004; 35: 2029‐2035.  Dewhirst FE, Chen T, Izard  J, Paster BJ, Tanner AC, Yu WH, et al. The human oral microbiome. J Bacteriol 2010; 192: 5002‐5017.  Eckel RH, Krauss RM. American Heart Association call to action: obesity as a major risk  factor  for coronary heart disease. AHA Nutrition Committee. Circulation 1998; 97: 2099‐2100.  Eggen  S.  [Simplification  and  standardization  of  intraoral  radiography  technics]. Quintessenz 1969; 20: 109‐112.  Eke PI, Dye BA, Wei L, Thornton‐Evans GO, Genco RJ. Prevalence of Periodontitis in Adults in the United States: 2009 and 2010. J Dent Res 2012; 91: 914‐920.  Ekuni D, Tomofuji T, Sanbe T,  Irie K, Azuma T, Maruyama T, et al. Periodontitis‐induced  lipid peroxidation  in  rat descending  aorta  is  involved  in  the  initiation  of atherosclerosis. J Periodontal Res 2009; 44: 434‐442.  Elter  JR,  Champagne  CM,  Offenbacher  S,  Beck  JD.  Relationship  of  periodontal disease and tooth loss to prevalence of coronary heart disease. J Periodontol 2004; 75: 782‐790.  Elter  JR, Offenbacher S, Toole  JF, Beck  JD. Relationship of periodontal disease and edentulism to stroke/TIA. J Dent Res 2003; 82: 998‐1001.  Engebretson SP, Lamster  IB, Elkind MS, Rundek T, Serman NJ, Demmer RT, et al. Radiographic measures  of  chronic  periodontitis  and  carotid  artery  plaque.  Stroke 2005; 36: 561‐566.  Falagas ME, Kompoti M. Obesity and infection. Lancet Infect Dis 2006; 6: 438‐446.  Ferrari R, Abergel H, Ford I, Fox KM, Greenlaw N, Steg PG, et al. Gender‐ and age‐related  differences  in  clinical  presentation  and  management  of  outpatients  with 

References  

  

73

stable  coronary  artery  disease.  Int  J  Cardiol  2012;  Sep  15  doi: 10.1016/j.ijcard.2012.08.013  Figuero  E,  Sanchez‐Beltran  M,  Cuesta‐Frechoso  S,  Tejerina  JM,  Del  Castro  JA, Gutierrez  JM,  et  al. Detection  of  periodontal  bacteria  in  atheromatous  plaque  by nested polymerase chain reaction. J Periodontol 2011; 82: 1469‐1477.  Fitzgerald JR, Foster TJ, Cox D. The interaction of bacterial pathogens with platelets. Nat Rev Microbiol 2006; 4: 445‐457.  Funakoshi H, Nakamura  T. Hepatocyte  growth  factor:  from  diagnosis  to  clinical applications. Clin Chim Acta 2003; 327: 1‐23.  Geerts SO, Legrand V, Charpentier J, Albert A, Rompen EH. Further evidence of the association  between  periodontal  conditions  and  coronary  artery  disease.  J Periodontol 2004; 75: 1274‐1280.  Geismar  K,  Enevold  C,  Sorensen  LK,  Gyntelberg  F,  Bendtzen  K,  Sigurd  B,  et  al. Involvement of  interleukin‐1 genotypes  in  the association of coronary heart disease with periodontitis. J Periodontol 2008; 79: 2322‐2330.  Geismar K, Stoltze K, Sigurd B, Gyntelberg F, Holmstrup P. Periodontal disease and coronary heart disease. J Periodontol 2006; 77: 1547‐1554.  Goteiner D, Ashmen R, Lehrman N, Janal MN, Eskin B. Presence and significance of interleukin‐1 polymorphism in patients who present with acute coronary syndrome, angina, and chronic periodontitis: an epidemiologic pilot study.  J Periodontol 2008; 79: 138‐143.  Gotsman  I,  Lotan  C,  Soskolne WA,  Rassovsky  S,  Pugatsch  T,  Lapidus  L,  et  al. Periodontal destruction  is  associated with  coronary artery disease  and periodontal infection with acute coronary syndrome. J Periodontol 2007; 78: 849‐858.  Grewal  K,  Gravely‐Witte  S,  Stewart  DE,  Grace  SL.  A  simultaneous  test  of  the relationship  between  identified  psychosocial  risk  factors  and  recurrent  events  in coronary artery disease patients. Anxiety Stress Coping 2011; 24: 463‐475.  Griffiths  R,  Barbour  S.  Lipoproteins  and  lipoprotein  metabolism  in  periodontal disease. Clin Lipidol 2010; 5: 397‐411.  Grossi SG, Zambon JJ, Ho AW, Koch G, Dunford RG, Machtei EE, et al. Assessment of  risk  for periodontal disease.  I. Risk  indicators  for attachment  loss.  J Periodontol 1994; 65: 260‐267. 

References 

 

  74

 Haffajee AD,  Socransky  SS. Relationship  of  cigarette  smoking  to  attachment  level profiles. J Clin Periodontol 2001; 28: 283‐295.  Haffajee AD, Socransky SS, Dibart S, Kent RL, Jr. Response to periodontal therapy in patients with high or  low  levels of P. gingivalis, P.  intermedia, P. nigrescens and B. forsythus. J Clin Periodontol 1996; 23: 336‐345.  Haraszthy  VI,  Zambon  JJ,  Trevisan  M,  Zeid  M,  Genco  RJ.  Identification  of periodontal pathogens in atheromatous plaques. J Periodontol 2000; 71: 1554‐1560.  Heitz‐Mayfield  LJ.  Disease  progression:  identification  of  high‐risk  groups  and individuals for periodontitis. J Clin Periodontol 2005; 32 (Suppl 6): 196‐209.  Higashi  Y, Goto  C, Hidaka  T,  Soga  J, Nakamura  S,  Fujii  Y,  et  al. Oral  infection‐inflammatory pathway, periodontitis,  is a  risk  factor  for endothelial dysfunction  in patients with coronary artery disease. Atherosclerosis 2009; 206: 604‐610.  Higashi Y, Goto C, Jitsuiki D, Umemura T, Nishioka K, Hidaka T, et al. Periodontal infection  is  associated  with  endothelial  dysfunction  in  healthy  subjects  and hypertensive patients. Hypertension 2008; 51: 446‐453.  Holm‐Pedersen  P,  Russell  SL,  Avlund  K,  Viitanen  M,  Winblad  B,  Katz  RV. Periodontal disease in the oldest‐old living in Kungsholmen, Sweden: findings from the KEOHS project. J Clin Periodontol 2006; 33: 376‐384.  Holmlund A, Hedin M, Pussinen PJ, Lerner UH, Lind L. Porphyromonas gingivalis (Pg) a possible link between impaired oral health and acute myocardial infarction. Int J Cardiol 2011; 148: 148‐153.  Holmlund  A,  Holm  G,  Lind  L.  Severity  of  periodontal  disease  and  number  of remaining  teeth  are  related  to  the  prevalence  of  myocardial  infarction  and hypertension in a study based on 4,254 subjects. J Periodontol 2006; 77: 1173‐1178.  Holmlund A, Holm G,  Lind  L. Number  of  teeth  as  a  predictor  of  cardiovascular mortality  in a cohort of 7,674 subjects  followed  for 12 years.  J Periodontol 2010; 81: 870‐876.  Holmlund A, Lind L. Number of Teeth  is Related  to Atherosclerotic Plaque  in  the Carotid Arteries in an Elderly Population. J Periodontol 2012; 83: 287‐291.  

References  

  

75

Howell TH, Ridker PM, Ajani UA, Hennekens CH, Christen WG. Periodontal disease and  risk  of  subsequent  cardiovascular  disease  in U.S. male  physicians.  J Am Coll Cardiol 2001; 37: 445‐450.  Hugoson  A,  Jordan  T.  Frequency  distribution  of  individuals  aged  20–70  years according  to severity of periodontal disease. Com Dent Oral Epidem 1982; 10: 187–192.  Hugoson A, Norderyd O. Has  the prevalence of periodontitis  changed during  the last 30 years? J Clin Periodontol 2008; 35(Suppl 8): 338‐345.  Hugoson  A,  Sjödin  B,  Norderyd  O.  Trends  over  30  years,  1973‐2003,  in  the prevalence and severity of periodontal disease. J Clin Periodontol 2008; 35: 405‐414.  Hujoel PP, Drangsholt M, Spiekerman C, Derouen TA. Examining the  link between coronary heart disease and  the elimination of chronic dental  infections.  J Am Dent Assoc 2001; 132: 883‐889.  Hunter W. Oral Sepsis as a Cause of Disease. Br Med J 1900; 2: 215‐216.  Jain S, Darveau RP. Contribution of Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide to periodontitis. Periodontol 2000 2010; 54: 53‐70.  Johannsen A, Åsberg M,  Söder  PO,  Söder  B. Anxiety,  gingival  inflammation  and periodontal disease  in non‐smokers and smokers  ‐ an epidemiological study.  J Clin Periodontol 2005; 32: 488‐491.  Joshipura KJ, Hung HC,  Rimm  EB, Willett WC, Ascherio A.  Periodontal  disease, tooth loss, and incidence of ischemic stroke. Stroke 2003; 34: 47‐52.  Karhunen  V,  Forss  H,  Goebeler  S,  Huhtala  H,  Ilveskoski  E,  Kajander  O,  et  al. Radiographic  assessment  of  dental  health  in middle‐aged men  following  sudden cardiac death. J Dent Res 2006; 85: 89‐93.  Katz  J,  Chaushu G,  Sharabi  Y. On  the  association  between  hypercholesterolemia, cardiovascular disease and  severe periodontal disease.  J Clin Periodontol  2001;  28: 865‐868.  Kinane DF, Preshaw PM, Loos BG. Host‐response: understanding  the  cellular  and molecular  mechanisms  of  host‐microbial  interactions‐‐consensus  of  the  Seventh European Workshop on Periodontology. J Clin Periodontol 2011; 38 (Suppl 11): 44‐48.  

References 

 

  76

König J, Holtfreter B, Kocher T. Periodontal health in Europe: future trends based on treatment needs  and  the provision of periodontal  services‐‐position paper  1. Eur  J Dent Educ 2010; 14 (Suppl 1): 4‐24.  Lakschevitz  F,  Aboodi  G,  Tenenbaum  H,  Glogauer M.  Diabetes  and  periodontal diseases: interplay and links. Curr Diabetes Rev 2011; 7: 433‐439.  Lenihan DJ, Osman A, Sriram V, Aitsebaomo J, Patterson C. Evidence for association of coronary sinus  levels of hepatocyte growth factor and collateralization  in human coronary disease. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2003; 284: 1507‐1512.  Li  X,  Tse  HF,  Jin  LJ.  Novel  endothelial  biomarkers:  implications  for  periodontal disease and CVD. J Dent Res 2011; 90: 1062‐1069.  Libby P. Inflammation in atherosclerosis. Nature 2002; 420: 868‐874.  Libby  P.  The  molecular  mechanisms  of  the  thrombotic  complications  of atherosclerosis. J Intern Med 2008; 263: 517‐527.  Libby  P,  Ridker  PM,  Hansson  GK.  Inflammation  in  atherosclerosis:  from pathophysiology to practice. J Am Coll Cardiol 2009; 54: 2129‐2138.  Lieb W,  Safa  R,  Benjamin  EJ,  Xanthakis  V,  Yin  X,  Sullivan  LM,  et  al.  Vascular endothelial growth factor, its soluble receptor, and hepatocyte growth factor: clinical and genetic correlates and association with vascular  function. Eur Heart  J 2009; 30: 1121‐1127.  Liedberg B, Nylander C, Lundström I. Biosensing with surface plasmon resonance‐‐how it all started. Biosens Bioelectron 1995; 10: i‐ix.  Lindhe J, Nyman S. The effect of plaque control and surgical pocket elimination on the  establishment and maintenance of periodontal health. A  longitudinal  study on periodontal therapy in cases of advanced disease. J Clin Periodontol 1975; 2: 67‐79  Listgarten MA, Hellden L. Relative distribution of bacteria at clinically healthy and periodontally diseased sites in humans. J Clin Periodontol 1978; 5: 115‐132.  Liu  KX,  Kato  Y,  Kato M,  Kaku  TI,  Nakamura  T,  Sugiyama  Y.  Existence  of  two nonlinear elimination mechanisms for hepatocyte growth factor in rats. Am J Physiol 1997; 273: 891‐897.  

References  

  

77

Löe H, Ånerud A, Boysen H, Morrison E. Natural history of periodontal disease  in man. Rapid, moderate and no loss of attachment in Sri Lankan laborers 14 to 46 years of age. J Clin Periodontol 1986; 13: 431‐445.  Löe H, Theilade E, Jensen SB. Experimental gingivitis in man. J Periodontol 1965; 36: 177‐187.  Loos BG. Systemic markers of  inflammation  in periodontitis.  J Periodontol 2005; 76 (Suppl 11): 2106‐2115.  Loos  BG,  Craandijk  J,  Hoek  FJ,  Wertheim‐van  Dillen  PM,  van  der  Velden  U. Elevation  of  systemic markers  related  to  cardiovascular diseases  in  the peripheral blood of periodontitis patients. J Periodontol 2000; 71: 1528‐1534.  Mars WM, Zarnegar R, Michalopoulos GK. Activation of hepatocyte growth  factor by the plasminogen activators uPA and tPA. Am J Pathol 1993; 143: 949‐958.  Martinez‐Canut P, Lorca A, Magan R. Smoking and periodontal disease  severity.  J Clin Periodontol 1995; 22: 743‐749.  Matsumori A, Furukawa Y, Hashimoto T, Yoshida A, Ono K, Shioi T, et al. Plasma levels of  the monocyte chemotactic and activating  factor/monocyte chemoattractant protein‐1 are elevated in patients with acute myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol 1997; 29: 419‐423.  Mattila KJ, Asikainen S, Wolf J, Jousimies‐Somer H, Valtonen V, Nieminen M. Age, dental infections, and coronary heart disease. J Dent Res 2000; 79: 756‐760.  Mattila KJ, Nieminen MS, Valtonen VV, Rasi VP, Kesäniemi YA,  Syrjälä  SL,  et  al. Association between dental health and acute myocardial  infarction. BMJ 1989; 298: 779‐781.  Mattila KJ, Valle MS, Nieminen MS, Valtonen VV, Hietaniemi KL. Dental infections and coronary atherosclerosis. Atherosclerosis 1993; 103: 205‐211.   Mattila KJ, Valtonen VV, Nieminen M, Huttunen JK. Dental infection and the risk of new coronary events: prospective study of patients with documented coronary artery disease. Clin Infect Dis 1995; 20: 588‐592.  Mealey  BL,  Oates  TW.  Diabetes mellitus  and  periodontal  diseases.  J  Periodontol 2006; 77: 1289‐1303.  

References 

 

  78

Montebugnoli  L,  Servidio D, Miaton RA,  Prati C,  Tricoci  P, Melloni C.  Poor  oral health is associated with coronary heart disease and elevated systemic inflammatory and haemostatic factors. J Clin Periodontol 2004; 31: 25‐29.  Montebugnoli  L,  Servidio  D,  Miaton  RA,  Prati  C,  Tricoci  P,  Melloni  C,  et  al. Periodontal  health  improves  systemic  inflammatory  and  haemostatic  status  in subjects with coronary heart disease. J Clin Periodontol 2005; 32: 188‐192.  Monteiro AM, Jardini MA, Alves S, Giampaoli V, Aubin EC, Figueiredo Neto AM, et al. Cardiovascular disease parameters  in periodontitis.  J Periodontol  2009;  80:  378‐388.  Monteiro da Silva AM, Oakley DA, Newman HN, Nohl FS, Lloyd HM. Psychosocial factors and adult onset rapidly progressive periodontitis. J Clin Periodontol 1996; 23: 789‐794.  Morrison HI, Ellison LF, Taylor GW. Periodontal disease and risk of  fatal coronary heart and cerebrovascular diseases. J Cardiovasc Risk 1999; 6: 7‐11.  Mustapha  IZ,  Debrey  S,  Oladubu  M,  Ugarte  R.  Markers  of  systemic  bacterial exposure in periodontal disease and cardiovascular disease risk: a systematic review and meta‐analysis. J Periodontol 2007; 78: 2289‐2302.  Nagaraja C, Pradeep AR. Hepatocyte growth factor levels in gingival crevicular fluid in health, disease, and after treatment. J Periodontol 2007; 78: 742‐747.  Nakamura  T.  Structure  and  function  of  hepatocyte  growth  factor.  Prog  Growth Factor Res. 1991; 3: 67‐85.  Nakamura T, Mizuno S. The discovery of hepatocyte growth  factor  (HGF)  and  its significance for cell biology, life sciences and clinical medicine. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci 2010; 86: 588‐610.  Nakamura  T,  Nawa  K,  Ichihara  A.  Partial  purification  and  characterization  of hepatocyte growth factor from serum of hepatectomized rats. Biochem Biophys Res Commun 1984; 122: 1450‐1459.  Nakamura  T,  Sakai K, Matsumoto K. Hepatocyte  growth  factor  twenty  years  on: Much more than a growth factor. J Gastroenterol Hepatol 2011; 6 (Suppl 1): 188‐202.  Nakamura T, Teramoto H, Ichihara A. Purification and characterization of a growth factor  from  rat platelets  for mature parenchymal  hepatocytes  in primary  cultures. Proc Natl Acad Sci U S A 1986; 83: 6489‐6493. 

References  

  

79

 Nakib  SA,  Pankow  JS,  Beck  JD, Offenbacher  S,  Evans  GW,  Desvarieux M,  et  al. Periodontitis  and  coronary  artery  calcification:  the  Atherosclerosis  Risk  in Communities (ARIC) study. J Periodontol 2004; 75: 505‐510.  Nayeri F, Aili D, Nayeri T, Xu  J, Almer  S, Lundström  I,  et  al. Hepatocyte growth factor  (HGF)  in  fecal samples:  rapid detection by surface plasmon  resonance. BMC Gastroenterol 2005; 5: 13.  Nayeri  F,  Nayeri  T,  Aili  D,  Brudin  L,  Liedberg  B.  Clinical  impact  of  real‐time evaluation  of  the  biological  activity  and  degradation  of  hepatocyte  growth  factor. Growth Factors 2008; 26: 163‐171.  Noack  B,  Genco  RJ,  Trevisan M, Grossi  S,  Zambon  JJ, De Nardin  E.  Periodontal infections contribute to elevated systemic C‐reactive protein level. J Periodontol 2001 ; 72: 1221‐1227.  Offenbacher S, Beck JD, Moss K, Mendoza L, Paquette DW, Barrow DA, et al. Results from  the  Periodontitis  and  Vascular  Events  (PAVE)  Study:  a  pilot multicentered, randomized,  controlled  trial  to  study effects of periodontal  therapy  in a  secondary prevention model of cardiovascular disease. J Periodontol 2009; 80: 190‐201.  Ohshima M, Fujikawa K, Akutagawa H, Kato T, Ito K, Otsuka K. Hepatocyte growth factor in saliva: a possible marker for periodontal disease status. J Oral Sci 2002; 44: 35‐39.  Packard  RR,  Lichtman  AH,  Libby  P.  Innate  and  adaptive  immunity  in atherosclerosis. Semin Immunopathol 2009; 31: 5‐22.  Padayachee L, Rodseth RN, Biccard BM. A meta‐analysis of the utility of C‐reactive protein  in  predicting  early,  intermediate‐term  and  long  term mortality  and major adverse cardiac events in vascular surgical patients. Anaesthesia 2009; 64: 416‐424.  Page RC, Kornman KS. The pathogenesis of human periodontitis: an  introduction. Periodontol 2000 1997; 14: 9‐11.  Paraskevas S, Huizinga  JD, Loos BG. A systematic review and meta‐analyses on C‐reactive protein in relation to periodontitis. J Clin Periodontol. 2008; 35: 277‐290.  Paunio K, Impivaara O, Tiekso J, Mäki J. Missing teeth and ischaemic heart disease in men aged 45‐64 years. Eur Heart J 1993; 14  (Suppl K) :54‐56.   

References 

 

  80

Persson GR. Perspectives on periodontal risk factors. J Int Acad Periodontol 2008; 10: 71‐80.  Persson GR, Pettersson T, Ohlsson O, Renvert S. High‐sensitivity  serum C‐reactive protein  levels  in  subjects with  or without myocardial  infarction  or periodontitis.  J Clin Periodontol 2005; 32: 219‐224.  Persson GR, Ohlsson O, Pettersson T, Renvert S. Chronic periodontitis, a significant relationship with acute myocardial infarction. Eur Heart J 2003; 24: 2108‐2115.  Preus HR, Ånerud A, Boysen H, Dunford RG, Zambon JJ, Löe H. The natural history of periodontal disease. The  correlation of  selected microbiological parameters with disease severity in Sri Lankan tea workers. J Clin Periodontol 1995; 22: 674‐678.  Renvert S, Ohlsson O, Persson S, Lang NP, Persson GR. Analysis of periodontal risk profiles  in  adults  with  or  without  a  history  of  myocardial  infarction.  J  Clin Periodontol 2004; 31: 19‐24.  Renvert S, Ohlsson O, Pettersson T, Persson GR. Periodontitis: a future risk of acute coronary syndrome? A follow‐up study over 3 years. J Periodontol 2010; 81: 992‐1000.  Renvert S, Persson RE, Persson GR. A history of frequent dental care reduces the risk of tooth loss but not periodontitis in older subjects. Swed Dent J 2011; 35: 69‐75.  Renvert  S,  Pettersson  T, Ohlsson O,  Persson GR.  Bacterial  profile  and  burden  of periodontal  infection  in  subjects with  a  diagnosis  of  acute  coronary  syndrome.  J Periodontol 2006; 77: 1110‐1119.  Rodenburg  JP,  van Winkelhoff  AJ, Winkel  EG,  Goene  RJ,  Abbas  F,  de  Graff  J. Occurrence  of  Bacteroides  gingivalis,  Bacteroides  intermedius  and  Actinobacillus actinomycetemcomitans  in  severe  periodontitis  in  relation  to  age  and  treatment history. J Clin Periodontol 1990; 17: 392‐399.  Rose G, McCartney P, Reid DD. Self‐administration of a questionnaire on chest pain and intermittent claudication. Br J Prev Soc Med 1977; 31: 42‐48.  Rosenow EC. Elective localization of streptococci. Br Med J 1930; 1: 1100‐1101.  Ross R. Atherosclerosis‐‐an  inflammatory disease. N Engl  J Med 1999 14; 340: 115‐126.  Rubin JS, Day RM, Breckenridge D, Atabey N, Taylor WG, Stahl SJ, et al. Dissociation of heparan sulfate and receptor binding domains of hepatocyte growth factor reveals 

References  

  

81

that  heparan  sulfate‐c‐met  interaction  facilitates  signaling.  J  Biol  Chem  2001;  276: 32977‐32983.  Rudrakshi C, Srinivas N, Mehta DS. A comparative evaluation of hepatocyte growth factor  levels  in gingival  crevicular  fluid and  saliva and  its  correlation with  clinical parameters in patients with and without chronic periodontitis: A clinico‐biochemical study. J Indian Soc Periodontol 2011; 15: 147‐151.  Sanz M, van Winkelhoff AJ. Periodontal  infections: understanding  the  complexity‐consensus of the Seventh European Workshop on Periodontology. J Clin Periodontol 2011; 38 (Suppl 11): 3‐6.  Sato T, Yoshinouchi T, Sugimoto T, Sakamoto T, Fujieda H, Murao S, et al. Prognostic value of serum hepatocyte growth factor in patients with acute coronary syndromes. Jpn Circ J 1999; 63: 583‐588.  Saxlin  T,  Suominen‐Taipale  L, Kattainen A, Marniemi  J, Knuuttila M,  Ylöstalo  P. Association between serum lipid levels and periodontal infection. J Clin Periodontol 2008; 35: 1040‐1047.  Schaefer AS, Richter GM, Groessner‐Schreiber B, Noack B, Nothnagel M, El Mokhtari NE,  et  al.  Identification  of  a  shared  genetic  susceptibility  locus  for  coronary heart disease and periodontitis. PLoS Genet 2009; 5: e1000378.  Sharma  A,  Novak  EK,  Sojar  HT,  Swank  RT,  Kuramitsu  HK,  Genco  RJ. Porphyromonas gingivalis platelet aggregation activity: outer membrane vesicles are potent activators of murine platelets. Oral Microbiol Immunol 2000; 15: 393‐396.  Shiau  HJ,  Reynolds  MA.  Sex  differences  in  destructive  periodontal  disease:  a systematic review. J Periodontol 2010a; 81: 1379‐1389.  Shiau HJ, Reynolds MA. Sex differences in destructive periodontal disease: exploring the biologic basis. J Periodontol 2010b; 81: 1505‐1517.  Shimada  Y,  Yoshiyama  M,  Jissho  S,  Kamimori  K,  Nakamura  Y,  Iida  H,  et  al. Hepatocyte growth factor production may be related to the inflammatory response in patients with acute myocardial infarction. Circ J 2002; 66: 253‐256.  Silness  J,  Löe,  H.  Periodontal  disease  in  pregnancy.  II.  Correlation  between  oral hygiene and periodontal condition. Acta Odont Scan 1964; 22: 112–135.  

References 

 

  82

Slots  J,  Ashimoto  A,  Flynn MJ,  Li  G,  Chen  C.  Detection  of  putative  periodontal pathogens  in subgingival specimens by 16S  ribosomal DNA amplification with  the polymerase chain reaction. Clin Infect Dis 1995; 20 (Suppl 2): 304‐307.  Socransky SS, Haffajee AD. The bacterial etiology of destructive periodontal disease: current concepts. J Periodontol 1992; 63 (Suppl 4): 322‐331.  Socransky SS, Haffajee AD. Effect of therapy on periodontal infections. J Periodontol 1993 Aug; 64 (Suppl 8): 754‐759.  Socransky SS, Haffajee AD, Smith C, Martin L, Haffajee  JA, Uzel NG, et al. Use of checkerboard DNA‐DNA hybridization to study complex microbial ecosystems. Oral Microbiol Immunol 2004; 19: 352‐362.  Socransky  SS,  Smith  C, Haffajee AD.  Subgingival microbial  profiles  in  refractory periodontal disease. J Clin Periodontol 2002; 29: 260‐268.  Socransky SS, Smith C, Martin L, Paster BJ, Dewhirst FE, Levin AE. ʺCheckerboardʺ DNA‐DNA hybridization. Biotechniques 1994; 17: 788‐792.  Söder PO, Söder B, Nowak  J,  Jogestrand T. Early carotid atherosclerosis  in subjects with periodontal diseases. Stroke 2005; 36: 1195‐1200.  Soeki T, Tamura Y, Shinohara H, Tanaka H, Bando K, Fukuda N. Role of circulating vascular  endothelial  growth  factor  and  hepatocyte  growth  factor  in  patients with coronary artery disease. Heart Vessels 2000; 15: 105‐111.  Spahr A, Klein E, Khuseyinova N, Boeckh C, Muche R, Kunze M, et al. Periodontal infections and coronary heart disease: role of periodontal bacteria and importance of total pathogen burden in the Coronary Event and Periodontal Disease (CORODONT) study. Arch Intern Med 2006; 166: 554‐559.  Stabholz A,  Soskolne WA,  Shapira  L. Genetic  and  environmental  risk  factors  for chronic  periodontitis  and  aggressive  periodontitis.  Periodontol  2000  2010;  53:  138‐153.  Stamler J, Vaccaro O, Neaton JD, Wentworth D. Diabetes, other risk factors, and 12‐yr cardiovascular mortality for men screened in the Multiple Risk Factor Intervention Trial. Diabetes Care 1993; 16: 434‐444.  Stein JM, Kuch B, Conrads G, Fickl S, Chrobot J, Schulz S, et al. Clinical periodontal and  microbiologic  parameters  in  patients  with  acute  myocardial  infarction.  J Periodontol 2009; 80: 1581‐1589. 

References  

  

83

 Susen S, Sautiere K, Mouquet F, Cuilleret F, Chmait A, McFadden EP, et al. Serum hepatocyte  growth  factor  levels  predict  long‐term  clinical  outcome  after percutaneous coronary revascularization. Eur Heart J. 2005; 26: 2387‐2395.  Suvan  J,  DʹAiuto  F,  Moles  DR,  Petrie  A,  Donos  N.  Association  between overweight/obesity and periodontitis in adults. A systematic review. Obes Rev 2011; 12: 381‐404.  Tabrizi F, Buhlin K, Gustafsson A, Klinge B. Oral health of monozygotic twins with and without coronary heart disease: a pilot study.  J Clin Periodontol 2007; 34: 220‐225.  Tanner A, Maiden MF, Macuch PJ, Murray LL, Kent RL,  Jr. Microbiota  of  health, gingivitis, and initial periodontitis. J Clin Periodontol 1998; 25: 85‐98.  Taylor BA, Tofler GH, Carey HM, Morel‐Kopp MC, Philcox S, Carter TR, et al. Full‐mouth  tooth  extraction  lowers  systemic  inflammatory  and  thrombotic markers  of cardiovascular risk. J Dent Res 2006; 85: 74‐78.  Teles  R, Wang  CY. Mechanisms  involved  in  the  association  between  periodontal diseases and cardiovascular disease. Oral Dis 2011; 17: 450‐461.  Teo KK, Ounpuu S, Hawken S, Pandey MR, Valentin V, Hunt D, et al. Tobacco use and risk of myocardial infarction in 52 countries in the INTERHEART study: a case‐control study. Lancet 2006; 368: 647‐658.  Thorstensson H, Hugoson A. Periodontal disease experience  in adult  long‐duration insulin‐dependent diabetics. J Clin Periodontol 1993; 20: 352‐358.  Tonetti MS.  Periodontitis  and  risk  for  atherosclerosis:  an  update  on  intervention trials. J Clin Periodontol 2009; 36 (Suppl 10): 15‐19.  Tu YK, Galobardes B, Smith GD, McCarron P, Jeffreys M, Gilthorpe MS. Associations between  tooth  loss  and mortality  patterns  in  the Glasgow Alumni  Cohort. Heart 2007; 93: 1098‐1103.  Tuominen R, Reunanen A, Paunio M, Paunio  I, Aromaa A. Oral health  indicators poorly predict coronary heart disease deaths. J Dent Res 2003; 82: 71371‐8.  Uehara  A,  Muramoto  K,  Imamura  T,  Nakayama  K,  Potempa  J,  Travis  J,  et  al. Arginine‐specific gingipains from Porphyromonas gingivalis stimulate production of 

References 

 

  84

hepatocyte  growth  factor  (scatter  factor)  through  protease‐activated  receptors  in human gingival fibroblasts in culture. J Immunol 2005; 175: 6076‐6084.  Watanabe K, Fukuda H, Sueda S, Funada  J, Kitakaze M, Sekiya M. Metabolism of hepatocyte  growth  factor  in  the  heart  in  patients  with  coronary  artery  disease: implication for coronary arteriosclerosis. Cardiovasc Drugs Ther 2001; 15: 147‐153.  Wilczynska‐Borawska M, Borawski  J, Kovalchuk O, Chyczewski L,  Stokowska W. Hepatocyte growth factor in saliva is a potential marker of symptomatic periodontal disease. J Oral Sci 2006; 48: 47‐50.  Yakob  M,  Söder  B,  Meurman  JH,  Jogestrand  T,  Nowak  J,  Söder  PO.  Prevotella nigrescens  and  Porphyromonas  gingivalis  are  associated  with  signs  of  carotid atherosclerosis in subjects with and without periodontitis. J Periodontal Res 2011; 46: 749‐755.  Yamamoto  Y,  Kohara  K,  Tabara  Y, Miki  T.  Association  between  carotid  arterial remodeling  and  plasma  concentration  of  circulating  hepatocyte  growth  factor.  J Hypertens 2001; 19: 1975‐1979.  Ylöstalo P, Anttila S, Rajala U, Päivänsalo M, Keinänen‐Kiukaanniemi S, Sakki T, et al.  Periodontal  infection  and  subclinical  atherosclerosis:  the  role  of  high‐density lipoprotein as a modifying factor. J Clin Periodontol 2010; 37: 617‐624.