LAPORAN PRAKTIKUMPembiakan Bakteri Agrobakterium tumefaciens, Transformasi GenolehAgrobacterium tumefaciens, dan Inokulasi

OlehMuhammad Faridz Fathurrohman20120210017

PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGIFAKULTAS PERTANIANUNIVERSITAS MUHAMMADIYAH YOGYAKARTA2013/2014I. PENDAHULUANAgrobacterium tumefaciensadalahbakteri patogenpada tanaman yang banyak digunakan untuk memasukkan gen asing ke dalam sel tanaman untuk menghasilkan suatutanaman transgenik. Secara alami,A. tumefaciensdapat menginfeksi tanamandikotiledonmelalui bagian tanaman yang terluka sehingga menyebabkan tumor mahkota empedu (crown gall tumor).Bakteri yang tergolong ke dalamgram negatifini memiliki sebuahplasmidbesar yang disebutplasmid-Tiyang berisi gen penyandifaktor virulensipenyebabinfeksi bakteriini pada tanaman.Untuk memulai pembentukan tumor,A. tumefaciensharus menempel terlebih dahulu pada permukaan sel inang dengan memanfaatkanpolisakaridaasam yang akan digunakan untuk mengkoloniasi/menguasai sel tanaman.Selain tanaman dikotiledon, tanamanmonokotiledonsepertijagung,gandum, dantebu telah digunakan untuk memasukkan sel asing ke dalam genom tanaman. Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri patogen pada tanaman yang banyak digunakan untuk memasukkan gen asing ke dalam sel tanaman untuk menghasilkan suatu tanaman transgenik.Sebagian besar genus Agrobacterium menyebabkan tumor pada tanaman dikotil. Species Agrobacterium tergolong bakteri gram negatif yang tergolong bakteri aerob dan mampu hidup baik sebagai saprofit maupun parasit. Agrobacterium berbentuk batang, berukuran 0,6 1,0 m sampai 1,5 3,0 m, dalam bentuk tunggal atau berpasangan. Agrobacterium merupakan bakteri yangmudah bergerak (motile) dan memiliki 1-6 flagelaperitrichous serta merupakan bakteri tak berspora. Suhu optimal pertumbuhan bakteri ini adalah 25-28C. Kumpulan bakteri ini biasanya berbentuk cembung, bulat, lembut, dan takberpigmen.Agrobacterium diisolasi dari tanaman yang terinfeksi Crown Gall. TumorCrown Gall adalah jaringan tanaman yang pertumbuhannya tidak terdiferensiasi akibat adanya interaksi antara tanaman-tanaman yang rentan dengan strain virulen Agrobacterium tumefaciens.

II.PEMBAHASAN2.1Agrobacterium dan Peranannya dalam Transfer GenTransformasi gen adalah proses dimana DNA asing dimasukkan kedalam sel tanaman, dimanapara pemuliatanamandapatmemasukkan gen asing kedalam sel atau jaringan tanaman, baik secara langsung maupun tak langsung tanpa merujuk kepada tingkat hubungan genetik atau kompatibelilitas suatu jenis.Teknologi pemindahan gen atau transfer gen dapat dibedakan menjadi dua, yaitu langsung dan tidak langsung. Contoh transfer gen secara langsung adalah perlakuan pada protoplas tanaman dengan eletroporasi atau denganpolyethyleneglycol(PEG. Sedangkan teknik pemindahan gen secara tak langsung dilakukan dengan bantuan bakteriAgrobacterium.Dari banyak teknik transfer gen yang berkembang, teknik melalui media vektorA. tumefacienspaling sering digunakan untuk metransformasi tanaman, terutama tanaman kelompok dikotil. Bakteri ini mampu mentransfer gen kedalam genom tanaman melalui eksplan baik yang berupa potongan daun(leaf disc) atau bagain lain dari jaringan tanaman yang mempunyai potensi beregenerasi tinggi.Gen yang ditransfer terletak pada plasmid Ti (tumor inducing). Segmen spesifik DNA plasmid Ti disebut T-DNA (transfer DNA ) yang berpindah dari bakteri ke inti sel tanaman dan berintegrasi kedalam genom tanamn. KarenaA. tumefaciensmerupakan patogen tanaman makaAgrobacteriumsebagai vektor yang digunakan untuk transformasi tanaman adalah bakteri dari jenis plasmid Ti yang dilucuti virulensinya (disarmed), sehingga sel tanaman yang ditransformasi olehAgrobacteriumdan yang mampu beregenerasi akan membentuk suatu tanaman sehat hasil rekayasa genetik. Teknik transformasi melalui media vektorAgrobacteriumpada tanaman dikotil telah berhasil dengan baik tetapi sebaliknya tidak umum digunakan pada tanaman monokotil. Namun beberapa peneliti telah melaporkan bahwa beberapa strainAgrobacteriumberhasil metransformasi tanaman monokotil seperti jagung dan padi.

2.2Pembiakan Bakteri Agrobacterium tumefaciensPembiakan Agrobacterium tumefaciens dilakukan dengan cara menanam dalam media LB padat dalam agar miring, LB padat dalam petridish, LB cair dalam erlenmeyer dan kemudian di amatai setiap hari selama 3 hari.Pada praktikum kali ini, memiliki tujuan untuk melakukan pembiakan Agrobakterium tumefaciens di biakan pada media Luriar Bertani (LB) padat dan cair. Dua tabung reaksi dan satu petridish diisi dengan media padat, serta satu media cair pada botol suntik. Untuk pembiakan pada media padat dan media cair diamati setiap hari selama 3 hari pengamatan sebanyak 3 kali. Media LB padat miring pada tabung reaksi dan LB padat pada petridish diamati pertumbuhan bakteri pada permukaan media. Sedangkan media cair pada botol suntik diamati tingkat kekeruhannya.Dari hasil pengamatan diperoleh hasil bahwa pada hari pertama belum terjadi perkembangan, baik itu pada LB padat miring dan petridish dan LB cair hal ini dikarenakan perkembangan bakteri membutuhkan waktu untuk bisa tumbuh. Pada hari kedua, didapatkan hasil yaitu telah terjadi pertumbuhan bakteri dengan baik, baik dari media padat maupun cair. Hal tersebut ditandai mulai adanya kumpulan koloni berwarna putih pada media padat, baik tabung reaksi maupun cawan petridish, sedangkan pada media cair, menjadi agak keruh. Pada hari kedua ini semua media ditandai dengan simbol (+) pada masing-masing tempat perbanyakan. Sedangkan pada hari ketiga terjadi perbanyakan bakteri lebih banyak dari hari sebelumnya yaitu ditandai dengan symbol (+++) pada semua medium. Pada pembiakan medium padat yaitu tabung reaksi dan petridish ditumbuhi bakteri lebih banyak dari pada sebelumnya sedangkan medium cair, tingkat kekeruhan menjadi semakin tinggi daripada hari kedua, hal ini membuktikan bahwa bakteri tersebut tumbuh dengan baik.

2.3Transformasi Gen olehAgrobacterium tumefaciensDasar dari transformasi genetik oleh Agrobacterium adalah transfer dan integrasi T-DNA ke dalam genom di dalam inti sel tanaman. T-DNA adalah suatu bagian pada tumor inducing (Ti) plasmid yang terdapat di dalam sel Agrobacterium.Proses transformasi dimulai dengan melekatnya Agrobacteriumpada seltanaman. Kejadian awal ini dimediasi oleh gen-gen yang berlokasi pada kromosom bakteri. Langkah berikutnya adalah terinduksinya gen-gen pada vir-region oleh suatu signal yang spesifik didalam selbakteri sehingga dihasilkan produk dari expresi gen-gen virulen untuk memprosesT-DNA dan mentransfernya dari dalam sel bakteri. Prosesing dan transfer T-DNA dimediasi oleh berbagai protein yang dikode pembentukannya oleh gen-gen virulen. Prosesing T-DNA dimulai dari suatu kejadian memproduksi T-DNA untai tunggal yang ditransfer ke dalam sel tanaman.Pada praktikum yang dilakukan transformasi dilakukan di dalam ruang inokulasi dengan menggunakan LAF (Laminar Air Flow). Pada transformasi ini, bakteri A. tumefaciens mampu mentransfer gen ke dalam genom tanaman melalui eksplan yang berupa potongan daun(leaf disc)krisan. Daun dilukai terlebih dahulu pada bagian jaringan tulang daun hal ini dilakukan agar bakteri bisa masuk kejaringan eksplan untuk menginfeksi sel daun krisan.Pada hasil pengamatan yang dilakukan diperoleh hasil daun krisan mengalami imbibisai dan berlendir. Dari hasil tersebut dapat dipastikan daun atau sel daun sudah terinfeksi, karena salah satu ciri-ciri daun atau sel daun yang sudah terinfeksi adalah dengan permukaan daun akan mengeluarkan lendir dari A. tumefaciens. Dengan hasil ini, maka dapat dipastikan bakteri A. tumefaciens sudah menginfeksi daun krisan. Untuk selanjutnya dengan hasil ini, daun kemudian dapat di inokulasikan ke dalam media yang telah diberikan antibiotik.

2.4InnokulasiPenanaman eksplan atau biasa disebut juga inokulasi adalah pekerjaan memindahkan eksplan dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Untuk melakukan penanaman eksplan (inokulasi) terlebih dahulu diusakan agar semua alat yang ada dalam hubungannya dengan medium agar tetap steril, hal ini agar menghindari terjadinya kontaminasi (Dwijoseputro, 1998). Inokulasi bisa dilakukan di dalam Laminar Air Flow (LAF) udara yang lewat dalam kotak tersebut dilewatkan saringan melalui suatu jalan agar tekena sinar ultraviolet. Dalam melakukan penanaman eksplan kawat ini terlebih dahulu dipijarkan sedangkan sisanya tungkai cukup dilewatkan nyala api saja setelah dingin kembali kawat itu disentuhkan lagi dalam nyala (Pelczar, 1986). Daun krisan yang telah terinfeksi Agrobacterium tumefaciens yang ditandai dengan lender atau imbibisi berarti sudah bisa ditanam atau di inokulasikan ke media.Pada praktikum kali ini, proses yang dilakukan yaitu inokulasi daun krisan hasil transformasi ke dalam media. Dari hasil pengamatan yang dilakukan selama 6 hari dengan lima kali pengamatan. Pada pengamatan pertama sampai ke dua keadaan eksplan belum mengalami perubahan yang menyebabkan perubahan warna. Hal ini disebabkan karena satu sampai dua hari merupakan waktu yang masih terlalu singkat bagi eksplan untuk metabolisme. Ada kemungkinan eksplan belum mengalami masa diferensiasi maupun pembelahan sel karena waktu yang singkat. Namun pada hari ketiga eksplan mengalami degradasi warna dari hijau menuju ke hijau kecoklatan. Hingga sampai hari ke enam eksplan tanaman krisan tersebut terus mengalami degradasi warna menuju warna hijau kecoklatan.Dari hasil pengamatan tersebut dapat kami lihat bahwa eksplan daun krisan tersebut mengalami plasmolisis, namun belum browning. Plasmolisis adalah proses dimana cairan diluar dinding sel masuk kedalam sel. Hal tersebut bisa jadi dikarenakan tekanan uap, dan konsentrasi zat terlarut di dalam sel lebih pekat daripada diluar sel. Sehingga cairan di diluar sel masuk ke dalam sel-sel daun. Apabila hal tersebut terus terjadi maka akan menyebabkan terjadinya browning pada eksplan tersebut. Browning adalah proses teroksidasinya senyawa fenolik yang terdapat pada sayatan bekas luka.

III.KESIMPULAN Agrobacterium tumefaciensadalahbakteri patogenpada tanaman yang banyak digunakan untuk memasukkan gen asing ke dalam sel tanaman untuk menghasilkan suatutanaman transgenik. Secara alami,A. tumefaciens dapat menginfeksi tanaman dikotiledon melalui bagian tanaman yang terluka sehingga menyebabkan tumor mahkota empedu (crown gall tumor). Metode transformasi yang diperantarai oleh Agrobacterium tumefaciens. Bakteri Agrobacterium tumefaciens dapat menginfeksi tanaman secara alami karena memiliki plasmid Ti, suatu vektor (pembawa DNA) untuk menyisipkan gen asing. Di dalam plasmid Ti terdapat gen yang menyandikan sifat virulensi untuk menyebabkan penyakit tanaman tertentu. Setelah DNA asing menyatu dengan DNA tanaman maka sifat-sifat yang diinginkan dapat diekspresikan tumbuhan. Pada praktikum yang dilakukan pertumbuhan bakteri pada medium padat belum terlihat pada hari pertama sedangkan pada hari kedua dan ketiga bakteri sudah tumbuh. Bakteri yang tumbuh pada hari ketiga lebih banyak dari pada hari kedua. Pada medium cair hari pertama belum terlihat kekeruhan sedangkan pada hari kedua dan ketiga sudah menjadi keruh, tingkat kekeruhan paling tinggi terjadi pada hari ketiga hal ini membuktikan bahwa Agrobacterium tumefaciens tersebut tumbuh dengan baik. Bakteri Agrobakterium tumefaciens mampu mentransfer gen kedalam genom tanaman melalui eksplan yang berupa potongan daunkrisan. Hasil dari praktikum yaitu terjadi imbibisi dan keluar lendir dari daun krisan sehingga eksplan ini sudah dapat dikatakan berhasil terinfeksi oleh Agrobakterium tumefaciens. Pengamatan dilakukan selama 6 hari. Pada pengamatan pertama sampai pengamatan hari kedua, eksplan belum terjadi gejala-gejala perubahan. Sedangkan pada pengamatan ketiga hingga keenam eksplan mengalami plasmolisis. Di era transformasi genetik sekarang ini, peran Agrobacterium sangat besar dalam menghasilkan tanaman yang dimodifikasi untuk mendapatkan sifat yang diinginkan.

DAFTAR PUSTAKA