pcr tradicional y tiempo real
TRANSCRIPT
Mecanismo de formación de un gen de fusión y expresión de una proteína quimérica como
consecuencia de una traslocación cromosómica
Gen de fusión
Proteína
quiméricaBCR-ABL
mRNA
DNAGen A
mRNA
Proteína
normal
BCR
DNAGen B
Proteína
normal
mRNA ABL
Kurzrock, R. et. al. Ann Intern Med 2003;138:819-830
Frecuencia del cromosoma Philadelphia, p210Bcr-Abl y
p190Bcr-Abl
La traslocación tienelugar en la zona no codificante (intrones)
La traslocación tienelugar en la zona no codificante (intrones)
PROTEINA DE FUSIONBCR-ABL
Es diferente paracada paciente
Se forma la mismaproteína anómala
Es una zona demasiada grande
para su análisis por PCR
Copia de RNA a DNA (transcripción reversa RT)
CELULAS
Extracción
RNA
Reacción
de PCR
Detección
del productoamplificado
Oligo region Oligo regiónBCR ABL
RT-PCR
cDNABCR-ABL
mRNABCR-ABL
ProteínaBCR-ABL
Transcripción
Traducción
NO ES DE UTILIDAD PARA EL ANÁLISIS DE ENFERMEDAD MINIMA
RESIDUAL
Es un proceso cualitativo
No es cuantitativo
PCR
Baseline
Δ
Fluorescence
PCR a tiempo Real o PCR cuantitativa
Área detección
PCR
a tiempo
real
PCR tradicional
Threshold es
el punto
de detección
Cycle Threshold
(Ct) Ciclo en la que la muestra
cruza
el threshold
R. Hematologica
R. Citogenética
R. Molecular
Respuesta óptima
3-6 meses RHC
6-12 meses RCiC
12!!-18 meses RMM
Tiempo AlertasRespuestaSubóptima
Fracaso
DxAlto riesgo LMC
Del 9q+ACA en células Ph+
- -
3 meses < RHC No RH
6 meses < RCiP< RHCNo RCi
12 meses < RMoM < RCiC < RCiP
18 meses < RMoM < RCiC
En cualquier momento
BCR-ABL ratioACA en células Ph-
ACA en células Ph+Pérdida de RMoM
Mutaciones
Pérdida de RHCPérdida de RCiC
Mutaciones
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
6 9 12 183 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54
% o
f pa
tien
ts
57 60
≥
4 log drop
undetectable BCR-ABL (≥
4.5 log)
≥
3 log drop (MMR)
Cortesy of T. Hughes 2006
Respuesta Molecular a Imatinib
Mecanismos de resistencia a Imatinib
BCR/ABL-dependiente:
- Mutaciones Puntuales
- Amplificación / sobreexpresión
BCR/ABL-independiente:
- Evolución Clonal (p53 loss ...)
- quinasas de la familia Src
- Expresión diferente de proteínas implicadas
en el transporte de proteínas
- Barreras farmacológicas(e.g., CYP450)
- Niveles plasmáticos bajos de IM
Resistencia aImatinib
sobreexpresión
BCR-ABL
Otros defectos genéticos
Mutaciones BCR-ABL
Amplificación BCR-ABL
Evolucion Clonal
Fallo Primario (%)Pérdida Respuesta a los 3 años (%)
FC precoz FC tardía FA (600 mg)
CB (600 mg)
0
25
50
75
100
47
20
4
24
6066
93
Frecuencia de resistencia a Imatinib a los 3 años
Perc
ent
Hochhaus and La Rosée Leukemia. 2004
Mas de 40 mutaciones diferentes se han descrito !
Mutaciones de Abl
Phospate-binding site
P-loop
Imatinib-binding site
Catalitic site Activation Loop
G250E
Q252R/HY253F/H
E255K/VT315I/S
F317L
M351T
E355G/DF359V/I
V379I
L387M/F
H396R/P
F311L/I
M343T
F382LS417Y/F
E459K/Q
V289A
D276GT277A
A380T
E279K
E281A/K
E292V
V299L
L364I
L384M
E453G/K
M244V
L248V
F486S
carboxy terminal
0123456789
10111213141516171819202122
no.
of m
utat
ions
M244
VL2
48V
G250
EQ2
52R/
HY2
53F/
HE2
55K/
VD2
76G
T277
AP2
96H
F311
L/I
T315
IF3
17L
M343
TM3
51T/
VE3
55G/
DF3
59V/
IV3
79I
A380
TF3
82L
L387
F/M
H396
R/P
S417
YE4
59K/
QF4
86S
(Soverini
et
al, Clin
Cancer
Res 2006)
7 mutaciones (M244V, G250E, Y253H, E255K, T315I, M351T, F359V) corresponden al 85% de todas las mutaciones asociadas a resistencia
Frecuencia de las mutaciones
P-loop
Nuevos Inhibidores
Se une a la conformación inactiva Se une a la conformación inactiva
Se une a la conformación activa e inactiva
Nilotinib
O'Hare et al. Cancer Res 2005
Dasatinib (BMS-354825) y Nilotinib (AMN107) son mas efectivos que Imatinib en inhibir la proliferación de células
Ba/F3 que presentan el gen Bcr-Abl o con mutaciones exceptuando la T315I
Copyright ©2005 American Association for Cancer Research
BCR-ABLImatinib IC50 (nM)
bioquimica celular
WT 300 260-500
M244V 380 2000
L248V n.a. 1500
G250E 1500 3900
Q252H n.a. 1200-2800
Y253F >5000 3475
Y253H >5000 >10000
E255K 2800 4400-8400
E255V >5000 >5000
D276G n.a. 1500
F311L 775 480
T315I >5000 >10000
F317L 900 810-1500
M351T 820 930
E355G n.a. 400
F359V 4700 1200
V379I 800 1630
A380T 340 2450
L387M 1500 1100
L387F n.a. 1100
H396P 340-800 850-4200
H396R 1950 1750
F486S 1230 2800
Mutaciones que pueden
superarse aumentando
dosis de Imatinib
P-LO
OP
ACT
IVATIO
N
LOOP
CATALY
TIC
DOM
AIN
BCR-ABLImatinib IC50 (nM)
biochemical cellular
WT 300 260-500
M244V 380 2000
L248V n.a. 1500
G250E 1500 3900
Q252H n.a. 1200-2800
Y253F >5000 3475
Y253H >5000 >10000
E255K 2800 4400-8400
E255V >5000 >5000
D276G n.a. 1500
F311L 775 480
T315I >5000 >10000
F317L 900 810-1500
M351T 820 930
E355G n.a. 400
F359V 4700 1200
V379I 800 1630
A380T 340 2450
L387M 1500 1100
L387F n.a. 1100
H396P 340-800 850-4200
H396R 1950 1750
F486S 1230 2800
P-LO
OP
ACT
IVATIO
N
LOOP
CATALY
TIC
DOM
AIN
Mutaciones que confieren una
gran resistencia a Imatinib
T315I- Mutación con mayor trascendencia clínica:
- Resistencia TOTAL a Imatinib- Resistencia a los nuevos inhibidores (Nilotinib y Dasatinib)
T315I
SECUENCIACIÓN DIRECTA
- Amplificación de BCR-ABL por PCR- 2ª Amplificación de ABL- Purificación producto de PCR- Reacción de secuenciación
Sensibilidad limitada 25-40%
Screening
Método de elección o estándar
100%T315I
50%T315I
25%T315I
10%T315I
5%T315I
1%T315I
Diluciones de Baf3-T315I en K562
DETECCIÓN DE LA MUTACION T315I MEDIANTE SECUENCIACIÓN
Cortesía de X. Agirre, A. Jiménez y J. Román.
T C A T T G A G TT C A C T G A G TCC C
T C A T T G A G TT C A C T G A G TCC C
T C A T T G A G TT C A C T G A G TCC C
T C A T T G A G TT C A C T G A G TCC C
T C A T T G A G TT C A C T G A G TCC C
T C A T T G A G TT C A C T G A G TCC C
PCR específica de secuencia (ASO-PCR)
CGTAGGTCATGAACTCAAGCATCCAGTACTTGAGTT …………………………………TGAGGTCTGACAGGTGTCGTA
ACTCCAGACTGTCCACAGCAT
BCR
ABLDISEÑO DE CEBADORES ESPECÍFICOS PARA LA SECUENCIA CON LA MUTACIÓN
Elevada Sensibilidad (1 / 100.000)
Falsos positivos en niveles altos de sensibilidad.
No Screening
semi-CUALITATIVA o CUALITATIVA
MUTACIÓN
Willis et al. Blood 2005
Pueden detectarse mutaciones antes del tratamiento con inhibidores pero no se correlaciona con resistencia clinica.
Debe realizarse el screening mutacional en pacientes no tratados?
NONO
El hecho que las mutaciones se detecten en una pequeña proporción de pacientes en RCC y que sean transitorias se considera UN TRABAJO INUTIL a no ser que haya un aumento de 10 veces en el nº de cópias del gen BCR-ABL.
Debe realizarse el screening mutacional en pacientes en RCC?
NONO
¿Cuándo realizar un estudio mutacional?
•NO es necesario al Diagnóstico
RESISTENCIA PRIMARIA•No respuesta hematológica a los 3 meses•No respuesta citogenética a los 12 meses (RMC, RCC)
RESISTENCIA ADQUIRIDA•Ante una pérdida de respuesta hematológica•Ante una pérdida de respuesta citogenética•¿Ante un incremento en los niveles de BCR-ABL?
•Según el grupo de Adelaida ante un > de 2 veces el valor anterior•Lo recomendable es ante un > de 10 veces (1 log) y esaconsejable demostrar el > en dos muestras consecutivas
•Progresión a FA o CB
Indicaciones para screening de mutaciones
Cuando debe realizarse el estudio mutacional?
Pacientes en la 2nda generacíon de TKIs:
•En TODOS los pacientes, el ESTUDIO MUTACIONAL deberia realizarse al inicio y a intervalos regulares para analizar la cinética de las mutaciones existentes o las que emergen de nuevo
Shah NP, Skaggs BJ, Branford S, Hughes TP, Nicoll JM, Paquette RL, Sawyers CL. Sequential ABL kinase inhibitor therapy selects for compound drug-resistant BCR-ABL mutations with altered oncogenic potency. J Clin Invest. 2007 Sep;117(9):2562-9.
• La cuantificación de la enfermedad residual y el estudio mutacional son herramientas básicas para realizar un tratamiento racional en los pacientes afectos de LMC.
• Casi la mitad de los pacientes que son resistentes a imatinib presentan mutaciones en el dominio kinasa ABL.
• Las mutaciones son responsables de >90% de resistencias y pueden beneficiarse del tratamiento con la 2nda generación de TKIs.
Conclusiones
Centros 46 laboratorios- Unificar la técnica de cuantificación del gen BCR-ABL mediante RQ- PCR.-Unificar el sistema deexpresar los resultados comoel ratio de copiasBCR-ABL/gen control %.-Detectar problemasmetodológicos.-Realizar un programa de control de calidad.
AGRADECIMIENTOS: Grupo de Biologia Molecular de la Asociación Española de Hematologia y Hemoterapia y NOVARTIS