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1
PCR
Prof. Dr. Fábio GregoriLaboratório de Biologia Molecular Aplicada e Sorologia
VPS-FMVZ-USP
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2
BANDA → DNA (amplificado) → DNA → Agente infeccioso → POSITIVO
BANDA→ DNA (amplificado) → DNAc→ RNA → Agente infeccioso → POSITIVO
Amplificação in vitro de DNA
Reação em Cadeia pela Polimerase
Estrutura do DNA
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3
Estrutura do DNA
Desnaturação e Renaturação do DNA
▪ As duas fitas da dupla hélice podem ser reversivelmente
separadas quando as PONTES DE HIDROGÊNIO são rompidas:
Melting Point
A separação das fitas é denominada “FUSÃO” da molécula deDNA - “MELTING”
MELTING POINT:
TEMPERATURA NA QUAL É DESFEITA METADE DA ESTRUTURA
EM HÉLICE DO DNA
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Estrutura do DNA
Tm e % de GC
Quanto maior a
porcentagem de
pares GC, mais
difícil é a
desnaturação
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5
PCR é um processo iterativo, consistindo de três elementos:
- Desnaturação do DNA por aquecimento
- Pareamento dos inciadores à sequência alvo fita única
- Extensão dos iniciadores pela DNA polimerase termoestável
Melting
Annealing
Extension
PCR
Termocicladores
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6
Extração Ácido Nucleico
“Mix” de reagentes
PCR
Deoxinucleosídeostrifosfato (dNTPs)
Cátion divalente(Mg2+ )
DNA polimerasetermoestável
Primers
Tampão paramanter o pH
Template de DNA
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7
Observação do sinal
Eletroforese em Gel de Agarose + Brometo de etídeo + Transiluminador UV
SYBR-Safe, Gel RedSYBR-Safe, Gel Red
Sinal
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Animação
Marcadores moleculares
alta variabilidade X baixa variabilidade
não-conservadas X conservadas
virulência, rastreamento geográfico, rastreamento de hospedeiro (ex. zoonoses / transmissão inter-espécies), antigenicidade / imunogenicidade, resistência,
caracterização de variantes (ex. localização errática), diagnóstico ...
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5’3’
Fita senso
Fita anti-senso
Primer senso
Primer anti-senso
A especificidade da reação → hibridização dos primers→ tamanho do fragmento gerado
Primers X Anticorpos
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10
Alinhamento gene codificador proteína capsídeo
Isolados de Calicivírus felino
Região de alta variabilidade
Primers/Bases degeneradas
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Desenho de primers
Primer dimer
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Primer dimer
Primer dimer
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Primer dimer
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Especificidade da reação de PCR
Controle de amplificação interno (IAC), NTC e Controle de processamento +
Ta = 0.3 x Tm(primer) + 0.7 Tm (product) – 14.9
Inibidores, relação primer-template, diluição da amostra, “nested”
Especificidade da reação de PCR
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Variações da técnica
NST1 NST2
Nested PCR
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• Sistema baseado na detecção e quantificação (ABSOLUTA e RELATIVA) deDNA (e RNA) através de um sinal fluorescente
Real-Time PCR (qPCR)
• Dados das amostras são coletados em cada ciclo
▪ Resultados por vezes subjetivos (bandas muito fracas)
▪ Não automatizado - tempo
▪ Baixa precisão em ensaios quantitativos
▪ Contaminação (brometo) e por material genético amplificado
PCRPCR x Real-Time PCR
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manualCT desvio padrão 0,64
robotizadoCT desvio padrão 0,12
5 µL volume reação, 18 replicatas
Pipetagem
▪ Sistema óptico
▪ Termociclador
▪ Hardware
▪ Software
Equipamentos
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Rotor-Gene 6000
EquipamentosEquipamentos
▪Exponencial: Dobro do produto é acumulado em cada ciclo (eficiência da reação ~100%). Reação específica e precisa.
▪Linear: Alta variabilidade (consumo dos componentes da reação).
▪Platô: Detecção por gel para os métodos tradicionais. Produtos não são mais produzidos e começam ser degradados.
PCR - Fases
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Ethidium-Gel detection
PCR convencional
NTC
Fase de platô
Fase Log-linear
Curva de amplificação do Real-Time PCR
PCR - Fases
Detecção
- No ponto Ct a fluorescência aumenta acima da linha basal, de forma exponencial.
- As amostras mais concentradas (maior número de templates iniciais) mostram valoresmenores de Ct
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Detecção
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Corante que se intercala na dupla fita de DNA
fitas duplas proporcinal da intensidade de fluorescência
• Ligação não específica
• Necessidade da curva de melting
• Sinal forte com amplificações longas
SYBR - Green
Primer dimer
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SYBR - Green
Quenchers: TAMRA, NFQ
Reporters: FAM e VIC
Fluorófoross
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A Tm da probe (sonda) deve ser 10ºC acima da Tm do primer
A sonda não pode ser muito longa
E se ela é curta a Tm é baixa... a solução pode ser MGB.
Produtos < 150 bp
TaqMan®s
Sugestão de leitura
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RFLP
RFLP
▪ Restriction Fragment Lenght Polymorphism
▪ Polimorfismo do tamanho de fragmento de restrição
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RFLP