PCRPCRPolymerase Chain Polymerase Chain

ReactionReaction

Marie Černá, Markéta Čimburová, Marianna Romžová

PCRPCR (Polymerase Chain (Polymerase Chain Reaction)Reaction)

PrimeryPrimery

krátké oligonukleotidykrátké oligonukleotidy

(18 – 30 nukleotidů) (18 – 30 nukleotidů) přímý primer x zpětný primerpřímý primer x zpětný primer jsou komplementární k sekvencímjsou komplementární k sekvencím

na 3´konci odpovídajícího řetězce,na 3´konci odpovídajícího řetězce,

ohraničujícím cílovou oblast DNA,ohraničujícím cílovou oblast DNA,

kterou chceme amplifikovatkterou chceme amplifikovat

Anelační teplotaAnelační teplota

TTmm = = [4 x (G+C) + 2 x (A+T)][4 x (G+C) + 2 x (A+T)]

TTanneal. anneal. = [4 x (G+C) + 2 x (A+T) -5]= [4 x (G+C) + 2 x (A+T) -5]

5´ GAGACTCAAGAGAACCTA 3´ 5´ GAGACTCAAGAGAACCTA 3´

TTanneal.anneal. = ? = ?

Počet kopií Počet kopií

požadované oblasti DNApožadované oblasti DNA

A = 2A = 2nn

n = počet cyklůn = počet cyklů

Modifikace PCRModifikace PCR

nested PCRnested PCR

multiplex PCR multiplex PCR

se sekvenčně specifickými se sekvenčně specifickými primery primery

Analýza PCR produktuAnalýza PCR produktu

PCR s obecnými primery :PCR s obecnými primery : HybridizaceHybridizace SekvenováníSekvenování RFLP (Restriction Fragment LengthRFLP (Restriction Fragment Length

Polymorphism)Polymorphism) RT-PCR (kvantitativní PCR)RT-PCR (kvantitativní PCR)

RNARNA => cDNA=> cDNA