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PCR in situ
PCR Hotstart
Disciplina de Biologia Molecular
Profª. Fabiana Seixas
Graduação em Biotecnologia - UFPel
Bruno Matos e Júlia Cougo
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PCR in situ
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- É a técnica de PCR usada diretamente numa lâmina de tecido ou células isoladas. Para essa técnica, é adicionada a Taq Polimerase diretamente na lâmina e realizada uma ciclização diferente, em termocicladores adaptados.
- A PCR in situ combina a sensibilidade da Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) com a especificidade e versatilidade do imunoensaio.
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São usadas técnicas de detecção do produto da PCR para análise das amplificações. Um exemplo é a PCR in situ servir para detecção da presença de cargas de DNA em tecidos ou células que se acredite estarem infectadas.
Ex: detecção de vírus por PCR in situ (amplificando o DNA do vírus) e posterior identificação do vírus. Para tanto, o DNA procurado já deve ser conhecido.
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Vantagens:
- Possibilidade de identificação de patógenos desconhecidos:
Muitas doenças têm desenvolvimento de seus patógenos lento, mas apresentam sintomas. Portanto a PCR in situ é uma saída para a amplificação e identificação de DNA estranho em tecidos e células e conhecimento de que tipo de doença está ocorrendo.
- A PCR permite a correlação direta dos resultados com as características histológicas e citológicas da amostra.
- A identificação de quantidades ínfimas de DNA, bem como de células que possuam genes específicos.
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Desvantagens:
- O tempo é maior que o da PCR convencional (1 ciclo leva 15 minutos, enquanto o da PCR comum leva 1 minuto).
- Não permite a análise molecular do produto da PCR, pois poderia ocorrer degradação do DNA amplificado no momento da extração das células da lâmina (por conta da fixação).
- O tempo de espera para o DNA alongar-se é maior, pois há a barreira da própria célula retendo o DNA no meio intracelular.
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Etapas:
1) Preparação das lâminas
Os procedimentos de preparação do tecido ou das
células a serem submetidas à PCR in situ diferem de
acordo com a origem do tecido e seu estado após a
manipulação, mas em geral, tecidos animais passam
pelos processos normais de preparação de lâminas (em
micrótomo) e tecidos vegetais passam por processos de
secagem para irem às lâminas.
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Protocolo de preparação de folhas de cana de açúcar:
- Corte as folhas em pedaços pequenos (mm máx 5x2).
- Fixação em FAA, a 4 ° C durante 24 h.
- Desidratação do tecido duas vezes, durante 30 min em 70% EtOH, seguida de 30 min de EtOH a 100%.
- Transferência para Estisol puro duas vezes durante 30 min.
- Incorporação dos tecidos em parafina ou paraplast.
- Corte de secções de 8-10 μm.
- Secagem mínima de 24 h a 40 ° C.
- Retirada da parafina em xileno (ou Histoclear) durante 5 minutos seguido por 5 min em EtOH a 100%.
- Secagem à temperatura ambiente.
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2) Fixação
Substâncias que aumentam a aderência do material à lâmina.
- Fixadores:
- FAA
- Paraformaldeído
3) Degradação celular
- Pectinase (plantas)
- Pepsina (animais)
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4) Adição dos componentes e da Taq Polimerase:
- Para cada lâmina, preparar 25 μl de solução:
- 2.5 μl de PCR buffer
- 4.5 μl de MgCl2 (25 mM de solução estoque)
- 4.0 μl de solução dNTP (200 mM concentração final de cada nucleotídeo)
- 1.0 μl de albumina de sorobovino 2% (BSA)
- 0.4 μl de solução dUTP digoxigenina (1 mM solução estoque)
- 1 μl de cada um dos primers: primer 1 and primer 2 (20 μM)
- 11 μl de água
- 0.5 μl de Taq polimerase
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5) Termociclização e PCR em si
6) Detecção
A detecção da amplificação pode ocorrer de duas maneiras diferentes:
- Direta: marcadores (ex: Biotina) são incorporados pelo produto da PCR e na seqüência detectados por Imunohistoquímica.
- Indireta: hibridização in situ de uma sonda de DNA (radiomarcada ou não) no produto da PCR, também seguida de Imunohistoquímica.
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Artigos:
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PCR Hot Start
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Hot Start PCR é uma forma modificada da Reação em
Cadeia da Polimerase (PCR), que evita a amplificação
não específica de DNA por inativar a Taq polimerase a
baixas temperaturas, ou por utilizar uma polimerase
especifica que necessita de um meio de ativação.
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Vantagens:
Esse procedimento aumenta a especificidade da PCR, pois a DNA polimerase contém um anticorpo, que se desnatura e ativa a enzima ao atingir a temperatura de 94°C.
Outro exemplo é o da AmpliTaq Gold, que é uma enzima que atinge sua forma ativa apenas se permanecer 10 minutos em temperatura de 94ºC.
Ao mesmo tempo em que as enzimas estão sendo ativadas, o DNA está sofrendo desnaturação, portanto a enzima irá trabalhar em temperatura ideal e no momento correto (aumento da especificidade).
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Desvantagens:
- Como se trata de um processo manual, há risco de
contaminação mais alto.
- No caso da compra de enzimas especiais prontas,
sejam as conjugadas ou especiais, o processo
encarece.
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Formas de ativação das polimerases:
1 – Cápsula de cera: quando degradada permite a ativação enzimática.
2 – Degradação do anticorpo conjugado à enzima.
3 – Adicionar a enzima em temperatura ideal (risco de contaminação e erro)
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A ativação da enzima e a desnaturação do DNA ocorrem na mesma fase, levando a polimerase a trabalhar em temperatura ótima na fase seguinte.
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Referências:
http://www.bv.fapesp.br/pt/auxilios/23819/aplicacao-tecnica-rt-pcr-situ/
http://www.pcrstation.com/in-situ-pcr/
http://www.bi.ku.dk/staff/BoJ/insitupcr.htm
http://www.pcrlinks.com/variants/insitu_pcr.htm
http://www.pcrlinks.com/variants/hotstart.htm
http://en.wikipedia.org/wiki/Hot_Start_PCR
http://www.uniscience.com/polimerases/item/1478-biotium-polimerases---pcr-hot-start
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Gratos pela atenção!
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PCR In Situ
e Hot Start
PCR Camila Caldeira Simões
Priscila Silveira dos Santos
Pelotas, 30 de janeiro de 2013.
Universidade Federal de Pelotas
Graduação em Biotecnologia
Disciplina: Biologia Molecular
Profª.: Fabiana Seixas
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PCR
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PCR In Situ
Reação da cadeia polimerase que ocorre
dentro da célula, além de poder ser
realizado na superfície da lâmina.
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Variações
PCR In Situ
RT In Situ PCR
PCR Hibridização In Situ
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RT- PCR In
Situ
É a combinação entre a PCR In Situ e a
transcrição reversa.
Ela difere da PCR In Situ normal em dois
passos: na digestão com DNase e na
etapa de transcrição reversa.
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PCR- Hibridização In Situ
PCR In Situ –15 ciclos a 94ºC em 1 min.
PCR Hibridização In Situ –Sondas e 35
ciclos a 94ºC em 1 min.
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Aplicações
Identificação de marcadores celulares;
Localização de sequências de células específicas dentro das populações de células;
Detectar RNAs que ocorrem em um número de cópias relativamente elevado;
É mais indicada para diagnóstico viral.
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Protocolo
Preparação de cortes de tecidos e
amostras de células
Digestão protease
DNase Digestão (para RT-PCR In Situ)
RT
PCR
Detecção
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Vantagens
Permite a localização do sinal amplificado dentro da estrutura do tecido
Detectar DNA viral, proviral, rearranjos do DNA e translocações.
Pode detectar quantidades pequenas de DNA
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Desvantagens
A barreira física de uma célula fixada
aumenta o tempo de alongamento do
DNA.
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Artigo Objetivo: detecção molecular de uma pandemia de gripe A (H1N1) 2009 cepas
é possível no material de arquivo, como parafinizado pulmonares.
Métodos: RT-PCR in situ.
Resultados: Detectamos 100% de transcritos de neuraminidase das amostras
diagnosticados A (H1N1)-positivas. Nenhuma expressão foi detectada em dois
paciente (H1N1)-negativas. In situ os níveis de transcrição estão relacionados
com os resultados obtidos in vitro realizados com RT-PCR. . Análise da
sequência mostrou similaridade de 98% com o vírus da gripe relatados
anteriormente em outros lugares.
Conclusões: Foi amplificado com sucesso as sequências especificas da gripe
A e Neuraminidase, usando o material das amostras. Os resultados sugerem
que esta estratégia poderia ser útil quando as amostras clínicas de RNA são
em quantidade limitada, ou quando é de má qualidade. Porque é um método
muito sensível, que detecta o RNA viral neuraminidase em amostras de
pulmão de pacientes que morreram de pneumonia causada pelo surto de
Influenza A (H1N1) na Cidade do México.
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Hot-Start
PCR
Variação do PCR, onde a reação de
amplificação é iniciada à temperaturas
elevadas.
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Protocolo
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Aplicações
Testes genéticos;
Diagnóstico clínico;
Exames de sangue;
Forense;
Biodefesa.
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Vantagens
Aumenta a especificidade, a sensibilidade
e a rentabilidade do produto;
Ideal para ensaios Quantitativos
Ensaios Multiplex
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Sem Hot-start Com Hot-start
Vantagens
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Desvantagens
Maior risco de contaminação
Trabalho intensivo
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Artigo Objetivo: detectar a Babesia bigemina e Babesia bovis em bovinos de
Moçambique, utilizando dois métodos distintos de PCR.
Métodos: Para este estudo, amostras de sangue foram coletadas em uma fazenda. As amostras de DNA foram analisadas usando o PCR nested e o hot start PCR. Os primers foram selecionados para o hot start PCR baseado no suposto gene de uma protease aspártica, a babesipsin, presente em ambos Babesia bovis e Babesia bigemina.
Resultados: A combinação da hot start e primers longos (29-31 pb) foram determinantes neste estudo para o sucesso da amplificação e detecção, além de que sensibilidade foi aumentada. O babesipsin no hot start PCR foi mais sensível do que a PCR nested. Um total de 117 amostras de campo foram testadas, 104 foram positivas para Babesia bigemina (90%), 97 foram positivas para Babesia bovis (82%), 86 foram infecções mistas (52%) e apenas 2 foram negativas para ambas as espécies de Babesia (1,7%).
Conclusão: Os resultados confirmam que esta doença deve ser considerada como uma ameaça para o gado importado.
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Bibliografia http://www.pcrstation.com/in-situ-pcr/
http://www.cabdirect.org/abstracts/19950101840.html
http://182.48.17.65/img/pcr/pcr_guide_gbl.pdf#page=12
http://omega.rc.unesp.br/mauricio/curso/bibliografia/8/220/PCR.pdf
http://sci.odu.edu/impa/files/hotstartPCR.pdf
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1517-83822007000300004&lang=pt
http://www.molecularstation.com/wiki/PCR
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20301005
http://www.uniscience.com.br/polimerases/phusion-hot-start-flex-dna-polymerase
http://pt.scribd.com/doc/72789166/PCR-apresentacao-e-PCR-em-tempo-real-aula
http://www.uniscience.com.br/polimerases/phusion-hot-start-flex-dna-polymerase
http://biology.clc.uc.edu/fankhauser/labs/genetics/pcr/pcr_protocol.htm
http://www.pcrstation.com/hot-start-pcr/
http://www.science-protocols.com/2007/10/in-situ-pcr_17.html
http://genome.cshlp.org/content/4/4/S151.full.pdf
http://www.readcube.com/articles/10.1186/1477-3155-1-3
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Obrigada!!!