pcr em tempo real
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PCR em Tempo Real. RT- PCR em Tempo Real. PCR quantitativo. PCR em Tempo Real. Cada vez que é sintetisada uma nova fita há aumento da intensidade da emissão de um fluorescente. PCR em Tempo Real. Quantificação em gel x Real-Time PCR: - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
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PCR em Tempo Real PCR em Tempo Real PCR em Tempo Real PCR em Tempo Real
RT- PCR em Tempo Real RT- PCR em Tempo Real
PCR quantitativoPCR quantitativo
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PCR em Tempo Real PCR em Tempo Real PCR em Tempo Real PCR em Tempo Real
Cada vez que é sintetisada uma nova fita há aumento da intensidade da emissão de um fluorescente
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PCR em Tempo Real PCR em Tempo Real
Quantificação em gel x Real-Time PCR:Quantificação em gel x Real-Time PCR:
““Relação quantitativa entre quantidade de DNA Relação quantitativa entre quantidade de DNA
inicial e a quantidade de produto durante a fase inicial e a quantidade de produto durante a fase
exponencial de um programa de ciclagem”exponencial de um programa de ciclagem”
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Detector de sequências a laser, totalmente automatizado
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Requerimentos específicos da técnicaRequerimentos específicos da técnica
Equipamento de leitura da amplificação;Equipamento de leitura da amplificação;
Química específica de fluorescência na reação;Química específica de fluorescência na reação;
Método matemático de correlação;Método matemático de correlação;
Uso de soluções-padrão ou genes de referência.Uso de soluções-padrão ou genes de referência.
PCR em Tempo Real PCR em Tempo Real
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PCR em Tempo Real PCR em Tempo Real
ExperimentaçãoExperimentação
reação em branco, (Hreação em branco, (H22O);O);
diluição serial (10diluição serial (10-1-1, 10, 10-2-2, 10, 10-3-3, 10, 10-4-4, 10, 10-5-5););
amostrasamostras
primers: gene de interesse x gene de referênciaprimers: gene de interesse x gene de referência
em triplicatas !!!em triplicatas !!!
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PCR em Tempo Real PCR em Tempo Real
Baseline Ct- linha basal: não houve clivagem suficente do corante-repórter para que se possa detectar a fluorescência
- fase log: a quantidade de amplicon dobra a cada ciclo
- fase platô: não há mais aumento no número de amplicons
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Piso de Fluorescência: Piso de Fluorescência: threshold cyclethreshold cycle
CtCtThreshold cycle (Ct) - Fluorescencia atinge mais do que um threshold da fluorescencia do background.
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CtCtNo ponto referido como Ct a fluorescência aumenta acima
da linha basal, de forma exponencial. Amostras mais concentradas (com maior no de templates iniciais) mostram valores menores de Ct.
Esse fenômeno criou um novo paradigma para quantificação por PCR: é avaliado o momento de aparecimento do sinal, e não quanto sinal é gerado após um dado número de ciclos.
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Curva de diluição Curva de diluição
Uso como referência absoluta (se for o caso);Uso como referência absoluta (se for o caso);
Cálculo de eficiência da reação de PCR;Cálculo de eficiência da reação de PCR;
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TMEM_10-6 21,086 63000 4,799341TMEM_10-6 20,6472 63000 4,799341TMEM_10-6 20,7712 63000 4,799341TMEM_10-7 24,8432 6300 3,799341TMEM_10-7 25,1673 6300 3,799341TMEM_10-7 24,8378 6300 3,799341TMEM_10-8 28,4401 630 2,799341TMEM_10-8 28,5971 630 2,799341TMEM_10-8 28,0928 630 2,799341TMEM_10-9 32,2972 63 1,799341TMEM_10-9 31,326 63 1,799341
Curva de diluição Curva de diluição
logng/ulCt
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Genes de referência Genes de referência (housekeeping)
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Curva de desnaturação Curva de desnaturação ((melt curvemelt curve))
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Químicas de Fluorescência em Tempo Químicas de Fluorescência em Tempo RealReal
especificidade requeridaespecificidade requerida
escala de aplicaçãoescala de aplicação
custocusto
experiência do laboratórioexperiência do laboratório
leitura do aparelholeitura do aparelho
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Químicas de Fluorescência em Tempo RealQuímicas de Fluorescência em Tempo Real
Sybr-GreenSybr-Green
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Químicas de Fluorescência em Tempo Químicas de Fluorescência em Tempo RealReal
TaqManTaqMan
Sonda FRETSonda FRET::FluorescentFluorescentResonanceResonanceEnergyEnergyTransferTransfer
Quencher (repressor)Quencher (repressor)
Atividade 5’ Atividade 5’ exonuclease da DNA exonuclease da DNA polimerasepolimerase
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O sistema de quantificação em tempo real tem tido as seguintes aplicações:
1 - Análise da expressão gênica - RNA total (RT-PCR)2 - Identificação de alelos em DNA genômico3 - Análise de seqüências virais, bacterianas ou de protozoários a partir de várias fontes4 - Análise de patógenos em alimentos5 - Análise de produtos transgênicos, etc....
O sistema permite a detecção simultânea de até 3 fluorocromos diferentes, de modo que o controle interno ou externo pode ser
analisado simultaneamente à analise da molécula alvo.
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RotorGene 3000 (Corbett)RotorGene 3000 (Corbett)
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Mede o aumento do sinal de fluorescencia proporcional a qtidadeDNA produzido durante cada ciclo da PCR
Threshold cycle (Ct) - Fluorescencia atinge mais do que um threshold da fluorescencia do background.
Real Time PCR
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Sequenciamento de DNA
Sanger, 1977
Gel radioativo Dideoxinucleotídeos A C G T